WO2014080676A1 - 高感染価のパルボウイルスの生産方法 - Google Patents

高感染価のパルボウイルスの生産方法 Download PDF

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WO2014080676A1
WO2014080676A1 PCT/JP2013/073906 JP2013073906W WO2014080676A1 WO 2014080676 A1 WO2014080676 A1 WO 2014080676A1 JP 2013073906 W JP2013073906 W JP 2013073906W WO 2014080676 A1 WO2014080676 A1 WO 2014080676A1
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parvovirus
culture
virus
cells
cell
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PCT/JP2013/073906
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恒一郎 柳田
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旭化成メディカル株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14351—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a high infectious titer parvovirus in a culture supernatant and a high infectious titer parvovirus solution obtained by the method.
  • Viruses infect and amplify many animals and plants and microorganisms including humans. Some are DNA viruses having DNA as a genome, and some are RNA viruses having RNA as a genome, and each virus has a different growth mechanism. Many viruses cause viral infections when they infect animals such as humans. Viruses cannot increase alone, but can infect cells of other animals, plants, and microorganisms, and increase by using the capacity of the cells. A cell that is capable of growing upon infection with a virus is called the “host cell” of the virus. The types of host cells that can be infected and propagated by viruses are determined for each type of virus.
  • Parvovirus is a small single-stranded DNA virus, which is a small icosahedral virus with a diameter of about 20 nm and has no envelope (Non-patent Document 1). Parvovirus causes disease by infecting animals. Such diseases include infectious erythema, anemia and arthritis caused by B19 parvovirus in humans, anemia caused by simian parvovirus (SPV), cat enteritis / leukopenia / schizophrenia caused by feline parvovirus (FPV), dog parvo Virus (CPV) canine enteritis / myocarditis, porcine parvovirus (PPV) stillbirth, bovine parvovirus (BPV) cattle enteritis, goose parvovirus (GPV) goose enteritis / myocarditis, mouse micro Known are enterocolitis and hepatitis in mice caused by viruses (MVM) (Non-patent Documents 2 and 3).
  • Parvoviruses are important as pathogens that cause disease in human animals such as dogs and cats. It is known that when a dog is infected with canine parvovirus, enteritis is caused as described above, severe diarrhea and vomiting occur, and death occurs (Non-patent Document 3). When cats are infected with parvovirus, they can cause acute enterocolitis and leukopenia, which can lead to death from secondary infections, and when infected with fetuses and neonates, the central nervous system and thymus are damaged, resulting in ataxia. May cause death or death.
  • Patent Documents 1 and 2 In order to prevent parvovirus infection, research on a parvovirus vaccine has been conducted (Patent Documents 1 and 2). These studies require the production and use of viruses. Many viruses can be propagated and produced by culturing host cells and infecting them with the virus. Vaccine production with attenuated or inactivated virus can also be achieved by the same procedure as virus production.
  • virus clearance removal performance of manufacturing processes is evaluated to ensure that biologic drugs such as genetically modified drugs (biopharmaceuticals) and antibody drugs are not contaminated with viruses (virus safety).
  • viruses virus safety
  • the virus clearance of each process is measured by adding a virus to the pharmaceutical intermediate product before each process and quantifying the amount of virus before and after the process.
  • ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use
  • ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use
  • Non-patent Document 4 In order to produce viruses, there are a method using experimental animals, a method using chicken eggs, and a method using tissue culture / cultured cells (Non-patent Document 4). The method using laboratory animals and eggs has the disadvantage of high cost. An alternative method is a method using cultured cells (Non-patent Document 5). Parvovirus is also produced by a method using cultured cells (Patent Document 1).
  • a method is generally used in which a host cell culture system is infected with a seed virus, and the virus is propagated and recovered.
  • the seed virus referred to here is a name that refers to a small amount of virus used as an initial seed for virus propagation.
  • the timing at which a host cell is infected with a seed virus is usually the stage when the host cell reaches confluence and forms a monolayer (Non-patent Document 4, Patent Documents 3 to 6).
  • Non-patent Document 4 the host cell is in stationary phase and does not grow any further. Therefore, in the prior art, after completing the host cell growth culture process, virus infection is started in a culture environment where no further cell growth occurs, and the virus is cultured simultaneously with the death of the host cell due to virus infection. It was to produce in the supernatant. Such a method is not an exception even in parvovirus, and virus production is performed by infecting confluent cells (Non-patent document 6, Non-patent document 7).
  • the infectivity titer of the obtained parvovirus is 10 5. ⁇ 10 7 TCID 50 / mL.
  • parvovirus is added to the host cell in a confluent state where the number of cells is the largest, and the added parvovirus grows in the host cell and increases with the death of the host cell. .
  • the parvovirus solution having the highest infectivity can be recovered.
  • the parvovirus obtained in the culture supernatant by this method is naturally recovered in a suspended state in a medium used for cell culture.
  • impurities are removed from the parvovirus solution obtained as described above.
  • impurities such as cell debris are removed by low-speed centrifugation.
  • cesium chloride density gradient ultracentrifugation and sucrose density gradient ultracentrifugation technology using ultracentrifugation technology are also known (Non-patent Document 8).
  • the virus clearance test of the virus removal filter for the evaluation is carried out in a model process in which the actual production process is scaled down.
  • the first requirement for this virus clearance test is that the filter is clogged.
  • the addition amount of the virus suspension is such that it does not occur, and secondly, the addition amount can indicate that the logarithmic removal rate (LRV), which is the virus clearance value of the step to be evaluated, is 4 or more.
  • LUV logarithmic removal rate
  • the parameters including the flow rate of the process must be the same as the actual production process (WHO Technical Report, Series No.924, 2004 162-165). There is a need to.
  • LRV 1% or less, preferably 0.1% or less by volume ratio
  • four or more processes are considered robust and effective and reliable processes for virus removal (A Robust, effective and reliable process steps) (WHO Technical Report, Series No.924, 2004 163-164) It is necessary to set the amount of virus added so that 4 or more can be obtained as a result. Thus, it is necessary to show that LRV is 4 or more as virus removal performance, and the amount of virus suspension added to the intermediate product is 1% or less, preferably 0.1% in volume ratio.
  • the purified and purified virus has extremely high purity, and the virus infectivity titer (TCID 50 / mL) and impurity protein concentration (ng / mL) is 10000 or more: 1 and there is a problem that virus particles tend to aggregate due to the small amount of impurities. If virus particles aggregate, virus clearance is overestimated in virus clearance evaluation in the manufacturing process of biologics, because the virus is separated and removed even with a pore size filter that would normally pass the virus. There's a problem.
  • ultracentrifugation techniques such as cesium density gradient ultracentrifugation and sucrose density gradient ultracentrifugation require skillful techniques that are extremely complicated and difficult to operate.
  • volume of the centrifuge tube of a general-purpose ultracentrifuge is limited, it is difficult to scale up, so generally it can only be performed on a small scale, and it is not realistic to incorporate these purification processes in the industry. Absent.
  • the present inventors have cultivated parvovirus host cells, inoculated with parvovirus seed virus, and various conditions (initial host cell density) in a culture system in which parvovirus is propagated.
  • host cells having a very low specific range of cell density which had not been conventionally used, have a low specific range of MOI.
  • a method for producing a parvovirus having a high infectivity of 10 8 TCID 50 / mL or more in a culture supernatant by culturing host cells and a parvovirus seed virus in a culture substrate (A) a step of separately calculating beforehand the doubling time of the logarithmic growth phase of the host cell in the culture and the cell density of the host cell when confluently proliferated; (B) a parvovirus containing the host cell having a cell density of 1/500 to 1/20 of the cell density of the host cell when proliferated in confluence calculated in advance in step (a) and a medium; Inoculating the seed virus with a multiplicity of infection (MOI) of 0.0001 to 0.1; (C) culturing the culture containing the host cell and parvovirus in step (b) for a period of 5 to 11 times the doubling time calculated in advance in step (a); (D) recovering the culture supernatant containing
  • MOI multiplicity of infection
  • the parvovirus is porcine parvovirus (PPV), canine parvovirus (CPV), mouse microvirus (MVM), rat virus (RV), H-1 virus (H-1), feline parvovirus (FPV), goose
  • the culture substrate comprising a host cell and a medium having a cell density of 1/300 to 1/30 of the cell density of the host cell when proliferated to confluence calculated in advance in the step (a)
  • the culture substrate comprising a host cell and a medium having a cell density of 1/200 to 1/40 of the cell density of the host cell when proliferated in confluence calculated in advance in the step (a)
  • the multiplicity of infection (MOI) is 0.003 to 0.01.
  • a parvovirus having an infectivity titer of 10 8 TCID 50 / mL or more, and a ratio between the infectivity titer of the parvovirus (TCID 50 / mL) and the impurity protein concentration (ng / mL) is 10: 1 to 5000: 1
  • a parvovirus solution having a high infectious titer of 10 8 TCID 50 / mL or more can be obtained simply and efficiently in cell culture, and the adverse effects caused by the lack of infectious titer when using parvovirus can be eliminated. become.
  • the present embodiment a mode for carrying out the present invention (hereinafter referred to as “the present embodiment”) will be described in detail.
  • this invention is not limited to the following embodiment, It can implement by changing variously within the range of the summary.
  • This embodiment is a method for producing a parvovirus having a high infectivity of 10 8 TCID 50 / mL or more in a culture supernatant by culturing host cells and a parvovirus seed virus in a culture substrate.
  • A a step of separately calculating beforehand the doubling time of the logarithmic growth phase of the host cell in the culture and the cell density of the host cell when confluently proliferated;
  • C culturing the culture containing the host cell and parvovirus in step (b) for a period of 5 to 11 times the doubling time calculated in advance in step (a);
  • D recovering the culture supernatant containing parvovirus obtained by the culture in
  • the host cell can be propagated by subculture.
  • Parvovirus is a small linear single-stranded DNA virus.
  • a DNA virus is a virus having DNA as a genome, and synthesizes mRNA from genomic DNA using RNA polymerase of a host cell, and synthesizes protein based on the mRNA and propagates.
  • Most DNA viruses are double-stranded DNA viruses, but parvoviruses have linear single-stranded DNA as a genome. Since the virus cannot grow in the state of single-stranded DNA, parvovirus has a unique growth mechanism of growing through the state of double-stranded DNA using DNA polymerase in addition to the RNA polymerase of the host cell.
  • the Parvoviridae virus has three genera belonging to the Parvoviridae subfamily, namely, the Parvoorivirus genus that does not require a helper virus for virus replication but grows autonomously in the host cell (Parvorivirus), and requires a helper virus Dependovirus, erythrovirus genus that specifically infects red blood cells, three genera belonging to the subfamily of Densovirus, Densovirus genus that infects insects, Iteravirus And the genus Aedes aegypti densovirus.
  • “Parvovirus” in the present embodiment refers to a virus belonging to the genus Parvovirus. Since parvovirus viruses have a similar growth mechanism, the method of this embodiment can be used in common.
  • the parvovirus (Parvovirus genus virus) in this embodiment is not limited, but is a porcine parvovirus (PorcineorParvovirus PPV), canine parvovirus (Canine Parvovirus CPV), mouse microvirus (Minute Virus of Mice MVM) , Rat virus (Rat Virus RV), H-1 virus (H-1 Virus H-1), feline parvovirus (Feline Parvovirus FPV), goose parvovirus (Goose Parvovirus GPV), bovine parvovirus (Bovine Parvovirus BPV) included. These viruses have similar sizes, genome structures, virus particle structures, and propagation mechanisms, and all of them can be suitably used in the method of this embodiment.
  • the “host cell” in the present embodiment is not limited to the type as long as it is a cell sensitive to the above parvovirus (that can be infected with parvovirus).
  • Examples of cells sensitive to parvovirus include PK-13 cells, PK-15 cells, LCC-PK1 cells, ESK (embryonic swine kidney) cells, SK cells, ST (swine testes) sensitive to porcine parvovirus.
  • a cell that undergoes cytopathicity by infection can be preferably used.
  • porcine kidney cells can be used in the case of porcine parvovirus, and canine kidney cells in the case of canine parvovirus.
  • the present invention is not limited thereto, and is sensitive to parvovirus as described above. It is preferably applicable to cells that cause cell degeneration.
  • the “host cell” an animal cell having infinite proliferation ability can be used, and what is generally called a “cell line” can be used.
  • the host cell is preferably an adhesion-dependent cell.
  • Adhesion-dependent cells are cells that cannot survive or proliferate unless attached to a culture substrate, such as muscle cells and organ cells. Adhesion-dependent cells are cultured while being attached to the bottom surface / wall surface of a culture substrate such as a culture flask or a carrier called a microcarrier. Flasks and petri dishes are generally used for small scale culture. Culturing using a microcarrier has the advantage that it can be easily scaled up sequentially (Japanese Patent No. 3982843, a method for sequentially culturing animal cells using a porous carrier). In this embodiment, suspension cells can also be used.
  • Floating cells grow in a floating state, and are cultured in a state of being suspended or suspended in a medium. In suspension cells, it is difficult to exchange the medium before collecting the culture supernatant. Therefore, it is desirable to culture the suspension cells by attaching them to a microcarrier, for example.
  • the type of “culture substrate” is not limited, and includes any culture substrate commonly used in cell culture, such as a culture vessel, a culture flask, a petri dish, a roller bottle, or a culture plate. .
  • the culture temperature can be a temperature suitable for host cell growth. Parvovirus host cells are known to grow in the range of 33 ° C to 39 ° C ("Introduction to Animal Cell Culture (Biochemical Experimental Method 29), Masatoshi Matsutani / Academic Publishing Center" p.14-15 ) Preferably, the culture temperature can be 33 ° C. or higher and 39 ° C. or lower, for example, about 37 ° C.
  • a medium containing animal serum containing cell growth factor (fetal calf serum, calf serum, horse serum, etc.) at a ratio of 10% or less. Since the amount of virus production is reduced in a serum-free medium, it is also possible to employ a technique in which the medium is replaced with a serum-free medium before the virus is recovered after cell growth is performed in the serum medium.
  • the “infection titer” is a unit indicating the virus infectivity titer. It is synonymous with "Titer” often used in the virus industry. Since viruses cannot be seen using an optical microscope, the density (number / volume) cannot be measured with a microscope like biological cells. Therefore, in the case of viruses, the infectivity titer utilizing the infectivity to host cells is used as a unit, and the amount and concentration are substituted. For example, when a virus suspension diluted at an appropriate magnification is added to a monolayer of host cells, the number of viruses is detected as plaque and the infectious titer is measured as plaque forming unit (pfu) / mL it can.
  • pfu plaque forming unit
  • the dilution of the liquid containing the virus proceeds, and the infectivity is 50% infectious dose (TCID 50 ) / mL at a concentration at which the rate of positive infection of host cells becomes 50%.
  • TCID 50 50% infectious dose
  • both parvoviruses used are able to measure infectious titer as TCID 50 / mL, it referred to the infectivity titer as TCID 50 / mL.
  • the infectious titer of parvovirus may be expressed by other units such as pfu / mL. In a parvovirus that can measure the infectious titer in other units, conversion between different units can be easily performed by measuring the infectious titer of the same parvovirus suspension in both units simultaneously.
  • the “doubling time in the logarithmic growth phase” is the time required for the host cells to double in the logarithmic growth phase.
  • the cell growth curve transitions to the logarithmic growth phase, stationary phase, and death phase.
  • cells proliferate by repeating cell division at a constant rate.
  • the doubling time varies depending on cell conditions, medium conditions such as serum concentration, and culture conditions such as culture temperature.
  • the number of cells eventually reaches the upper limit in the culture vessel. This is the period when growth stops due to nutrient deficiency, waste accumulation, pH drop, etc., and is called the stationary phase. At this time, the adhesion-dependent cells are in a dense state covering the surface of the culture container, and this state is called “confluent”. To obtain the number of cells (concentration) when they reach confluence, after inoculating the cells in the culture vessel, collect the cells every 24 hours and measure the number of cells. (Density) may be obtained.
  • the cell number or cell density when the host cell proliferates confluently is defined as follows. First, after inoculating host cells on a culture substrate such as a culture flask, subculture is performed, the number of cells is measured every 24 hours, and the doubling time for each 24 hours is calculated. Measurement of the number of cells every 24 hours is completed until the day after the doubling time is 5 times longer than the doubling time in the logarithmic growth phase, but it is also measured when the number of cells decreases for two consecutive days. End. Then, the average value of the data on the day when the number of cells becomes the largest and the total of three days before and after that day is defined as the number of cells or the cell density at confluence.
  • Some types of cells maintain a stationary phase for a long time after reaching the stationary phase, rather than shifting to the death phase.
  • the day when the doubling time is more than 5 times longer is taken as the confluence arrival date, and the average value of the number of cells on that day and the next day is the confluent cell number or cell density.
  • the culture substrate used for counting the number of cells every 24 hours is to be measured on separate culture substrates that have been cultured under the same conditions at the same time, and the cells are once again returned to the culture substrate on which the number of cells has been measured. Do not use for next day measurement. This is to avoid the influence of the growth lag time due to the cell recovery operation.
  • the cell number or cell density at confluence varies depending on the culture conditions such as the culture substrate, medium, cell type, culture temperature and the like. Therefore, it is necessary to measure by the above-mentioned method for every culture condition.
  • the cells die due to nutrient depletion or the like. This is called the death period.
  • Passaging is generally performed in the late stage of the logarithmic growth phase in a state of 60% to 80% confluence. When reaching confluence, the growth of adhesion-dependent cells stops, so before reaching confluence. It is necessary to perform subculture (Hideki Koyama, Cell Culture Lab Manual, Springer Fairlark Tokyo, 1999 51-52). Repeated passages after reaching confluence may weaken cells or change their properties. In the case of suspension cells, the cells can be subcultured by diluting the cells in a fresh medium and planting them.
  • the host cells are detached from the culture vessel with a proteolytic enzyme such as trypsin, a chelating agent such as EDTA, or a mixture thereof, and the number of cells is diluted and transferred to a new culture vessel. Be born. Subculture is usually performed 2 to 3 times a week, diluted 2 to 12 times.
  • the canine parvovirus host cell MDCK canine kidney cell
  • passaged 2 to 6 times every 2 to 3 days is diluted and passaged 2 to 6 times every 2 to 3 days (Toru Akiyama et al. Cell and Medium Utilization Handbook Yodosha 2008 45-46).
  • the seed virus of parvovirus is inoculated so that the multiplicity of infection (MOI) is 0.0001 to 0.1.
  • a culture comprising a host cell and a medium having a cell density of 1/500 to 1/20 of the cell density of the host cell when proliferated to confluence calculated in advance in step (a). It is necessary to prepare a substrate.
  • the culture substrate is preferably a cell having 1/300 to 1/30, more preferably 1/200 to 1/40 of the cell density of the host cell when proliferated to confluence calculated in advance in step (a). Contains a density of host cells.
  • the infection is started at a predetermined cell density as extremely low as 1/500 to 1/20 of the cell density of the host cell when confluently proliferated.
  • parvovirus in the method of infecting confluent host cells, which is a common sense of conventional virus production methods, no growth of the host cells is observed, and the host cells continue to die through cytopathy due to infection.
  • the present invention succeeded in simultaneously achieving host cell growth and virus growth by initiating infection at a very low host cell density in this embodiment. While not being bound by theory, it is thought that this host cell growth and virus growth occur simultaneously due to the growth mechanism unique to parvovirus.
  • the parvovirus is a DNA virus that moves into the nucleus in the host cell and replicates DNA, and unlike other viruses that can grow in the cytoplasm, it grows slowly and therefore kills infected cells rapidly. Therefore, it is considered that cell growth as a whole culture system was allowed. In the infection in the confluent state, which is the prior art, the host cells have entered the stagnation phase after having completed the logarithmic growth phase, and even if parvovirus growth is slow, cell growth was not accompanied.
  • a host cell and a virus are propagated simultaneously by using a parvovirus-specific growth mechanism, “simultaneous progress time of host cell growth and parvovirus growth”
  • a parvovirus having a high infectivity value can be provided.
  • the seed virus is then infected at an appropriate host cell density for the purpose of ensuring such a sufficiently long propagation time.
  • the host cell density at the time of infection is too high, the host cell density reaches confluence in a short period of time and cell growth stops, making it difficult to ensure a sufficiently long growth time.
  • step (a) the cell density of the host cell when confluently grown is calculated and measured in advance. Then, the cell density of the host cell when inoculating the seed virus of parvovirus in step (b) is defined by the ratio to the cell density of the host cell when grown to confluence calculated in step (a).
  • the simultaneous propagation time is too short, as described above, the amount of parvovirus multiplication becomes insufficient, and a parvovirus having a high infectivity value cannot be obtained.
  • the simultaneous growth time is longer than necessary, it is not bound by theory, but parvovirus growth exceeded host cell growth, and the entire host cell was killed and released from the cell. Parvovirus is inactivated due to the influence of protease, etc., and the infectivity titer decreases.
  • the culture is collected at an appropriate timing to bring the simultaneous growth time to an appropriate range, and a very high 10 8 TCID 50 / mL or more in the culture supernatant. Infectious titer of parvovirus can be obtained.
  • the multiplicity of infection (MOI) of the parvovirus seed virus is 0.0001 to 0.1 on the culture substrate containing the above-mentioned host cells having a low cell density and a medium. Inoculate as follows.
  • “multiplicity of infection” is the ratio of the added amount of virus to the number of host cells, and is expressed as virus infectivity / number of host cells.
  • the seed virus inoculation with the parvovirus may be inoculated with the seed virus so that the MOI is 0.0001 to 0.1 simultaneously with inoculation of the host cell having the above-mentioned predetermined cell density on the culture substrate.
  • Host cell culture may be started at a lower cell density, and seed virus may be inoculated so that the MOI is 0.0001 to 0.1 when the above cell density is reached.
  • Parvovirus multiplicity of infection is preferably in the range of 0.001 to 0.03, more preferably in the range of 0.003 to 0.01.
  • a host cell having a predetermined low cell density is inoculated with a seed virus so as to have a multiplicity of infection (MOI) of 0.0001 to 0.1 and infection is started
  • MOI multiplicity of infection
  • the progression of virus infection begins slowly, and the total number of cells initially increases while the total amount of parvovirus also increases.However, at a certain point in time, the growth rate of parvovirus exceeds the growth rate of the host cells, and the Infectious titer virus is produced.
  • the seed virus infected with the host cell replicates itself in the host cell with the function of the host cell and is released outside the cell or remains inside the cell. Cells infected with viruses have a pattern that causes cytopathy and a pattern that does not.
  • Viruses that cause cell degeneration are pathologically toxic, but viruses that do not cause pathogenicity cause persistent infection without showing pathogenicity. Cell degeneration causes cell death. In the present embodiment, cells that cause cytopathy are preferred because of the high virus production, but the present invention is not limited to this.
  • the culture time is 5 to 11 times, more preferably 6 to 9 times, and further preferably 7 to 8 times the doubling time of the host cell.
  • the culture temperature can be a temperature suitable for the growth of the host cell, and can be preferably 33 ° C. or higher and 39 ° C. or lower, for example, about 37 ° C.
  • the doubling time of the logarithmic growth phase of the host cell and the cell density of the host cell when confluently grown in step (a) are determined in advance. It is desirable to set the culture temperature at the same level as the calculated culture temperature.
  • the serum medium When a serum medium is used as the medium, the serum medium is replaced with a serum-free medium immediately before or before the collection time of the culture supernatant in the following step (d), and the serum-free medium is further cultured,
  • the culture may be performed for the predetermined time as a whole. This makes it possible to eliminate serum-derived impurities in the recovered virus suspension.
  • the serum-free medium volume after the medium exchange can be adjusted as necessary.
  • the timing of the medium exchange is preferably 1 to 3 days before the day of collecting the culture supernatant, more preferably 1 to 2 days before.
  • a conventional method there is a method in which the infected host cell is destroyed by repeated freezing and thawing, etc., and the virus is recovered, but since a large amount of impurities inside the host cell is generated at that time, even if the highly infected Even if a virus having a valence of 1 is obtained, since the impurity concentration is relatively high, a miscellaneous operation such as ultracentrifugation purification is required when using the virus.
  • a parvovirus solution (culture supernatant and impurity removal) of 10 8 TCID 50 / mL, preferably 10 8.3 TCID 50 / mL or more, more preferably 10 8.5 TCID 50 / mL or more. Including later viral suspensions).
  • the resulting high infectious titered parvovirus culture supernatant of 10 8 TCID 50 / mL or higher can be subjected to low-speed centrifugation under known conditions in order to remove impurities such as free host cells and host cell debris. You can hang it.
  • impurities can be removed by membrane filtration with a pore size of 0.1 to 0.5 ⁇ m, preferably 0.2 to 0.45 ⁇ m.
  • impurities such as free host cells and host cell debris can be removed by a peg precipitation method using known polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the PEG gradually precipitates from those having a large molecular weight. For example, by adding PEG 6000 to 10% and sodium chloride to 0.5 M, leaving at 4 to 30 ° C. for 4 to 40 hours with stirring, and then centrifuging at 9000 to 12000 g for 20 to 60 minutes, Parvovirus can be precipitated. At this time, since the protein of impurities is collected in the supernatant fraction, impurities and parvovirus can be separated and purified.
  • PEGs other than PEG6000 can be used for PEG precipitation.
  • An anion exchange base material can also be suitably used for the separation and purification of parvovirus. Since parvovirus having a negative charge on the surface is adsorbed to the anion exchange substrate, impurities and parvovirus can be separated by eluting the adsorbed parvovirus with an elution buffer having a high salt concentration.
  • the ratio of parvovirus infectivity (TCID 50 / mL) to impurity protein concentration (ng / mL) is 10: 1 to 5000: 1, preferably 40 A parvovirus solution (including virus suspension after removal of impurities) of 1 to 3000: 1 is obtained.
  • impurities include free host cells and host cell debris, proteins derived from host cells and serum components, etc., but free host cells and host cell debris are large in size. Since it can be easily removed by a known method such as filtration, in the present invention, the protein concentration is used as an index indicating the abundance of impurities.
  • a parvovirus solution having a high infectious titer of 10 8 TCID 50 / mL or more can be obtained, and it is possible to eliminate the adverse effects caused by various infectious titer deficiencies when using parvovirus.
  • the following description will be made in relation to three typical applications.
  • the presence of impurities may adversely affect the intended reaction. Therefore, a virus having an infectivity higher than the virus infectivity actually used for the test is produced, and diluted to such an extent that impurities are not affected, and used for research.
  • a virus having an infectivity higher than the virus infectivity actually used for the test is produced, and diluted to such an extent that impurities are not affected, and used for research.
  • it In order to be able to measure a high virus inhibitory activity, it must be subjected to a test with a high virus infectivity value. Therefore, it is necessary to produce a virus with a higher infectivity value. That is, it is desirable that the infectivity of the virus obtained by cell culture is higher.
  • a parvovirus solution having a high infectivity value of 10 8 TCID 50 / mL or more can be obtained, so that it can be used as research material after being diluted in antiviral drug research using parvovirus. It is possible to reduce unexpected reactions and interference caused by impurities.
  • the points required for this virus clearance test are firstly the amount of virus suspension added so that clogging of the filter does not occur, and secondly, the virus clearance value of the process to be evaluated.
  • the logarithmic removal rate (LRV) is an addition amount that can be shown to be 4 or more. In order to be LRV4 or higher, the virus must be added to the intermediate product subjected to the virus removal filter process so that the virus infection is 10 4 TCID 50 / mL.
  • a virus so as to be 10 5 TCID 50 / mL or more in consideration of a loss in a prefilter for removing an aggregate of virus particles.
  • the original virus suspension needs to be 10 8 TCID 50 / mL or more.
  • a parvovirus solution having an appropriate purity of 10 8 TCID 50 / mL or higher and a high infectivity titer can be obtained. Therefore, the problem of filter clogging due to impurities derived from the parvovirus solution can be solved.
  • the higher infectivity of virus produced in cell culture is advantageous for production because the load on the subsequent virus vaccine purification process is reduced. If the virus infectivity value is low, the impurity concentration is relatively high, which imposes a load on the purification process and is disadvantageous for production. According to this embodiment, since a parvovirus solution having a high infectivity of 10 8 TCID 50 / mL or more is obtained, the amount of vaccine in the purified raw material is remarkably increased even in parvovirus vaccine production. It becomes possible to carry out the process more efficiently and at low cost.
  • Example shown here is a representative example, and this invention is not limited to this Example.
  • PK-13 cells purchased from ATCC were used as porcine parvovirus (PPV) host cells, which were called DMEM medium (hereinafter referred to as “serum medium”) supplemented with 10% fetal bovine serum. )
  • serum medium DMEM medium
  • lask tissue culture flask having a 75 cm 2 bottom area and a volume of 15 mL
  • the number of host cells in this flask was measured every 24 hours, and the doubling time in the logarithmic growth phase was 17 hours.
  • the average value of the number of cells on the day when the number of cells was the highest and the days before and after that was measured as the cell density of the host cells at confluence it was 2.0 ⁇ 10 7 cells / flask.
  • the seed virus When infected in the culture vessel as described above, the seed virus was infected and incorporated into the host cells within 2 hours. At this time, the parvovirus disappeared from the culture and entered the so-called dark period (Eclipse). At this time, some cells were infected with parvovirus. Since then, some cells have been killed by parvovirus infection, but the total number of cells has surprisingly increased.
  • the culture supernatant was collected for each flask.
  • the collected culture supernatant was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, and the supernatant fraction was filtered with a 0.45 ⁇ m filter (Nalgen).
  • the PPV infectivity titer was measured by a TCID 50 method using a 96-well plate by an infection determination method using a hemagglutinin reaction.
  • the 50% infectivity titer was calculated by the Reed-Muench method (medical virology, 2000. Nanedo. 171-172).
  • the results are shown in Table 1.
  • the infectivity titer of the virus obtained was found to be a high infectious titer of 10 8 TCID 50 / mL or more.
  • the numerical values in Table 1 indicate the infectious titer as a logarithmic value. For example, 8.1 indicates 10 8.1 TCID 50 / mL).
  • the impurity protein concentration was measured with a protein assay reagent (Bradford method) manufactured by BioRad, and the ratio between the PPV infectivity (TCID 50 / mL) and the impurity protein concentration (ng / mL) was determined. The results are shown in Table 2.
  • the culture supernatant was collected for each flask.
  • the collected culture supernatant was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, and the supernatant fraction was filtered with a 0.45 ⁇ m filter (Nalgen).
  • PPV infectivity was measured in the same manner as in Example 1 using a 96-well plate. The results are shown in Table 3. As shown in Table 3, the infectivity titer did not exceed 10 8 TCID 50 / mL under any condition.
  • the culture supernatant was collected for each flask after 119 hours (7 times the doubling time), 136 hours (8 times), 153 hours (9 times), and 187 hours (11 times) after the start of infection. .
  • the collected culture supernatant was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, and the supernatant fraction was filtered with a 0.45 ⁇ m filter (Nalgen).
  • PPV infectivity was measured in the same manner as in Example 1 using a 96-well plate. The results are shown in Table 5. As shown in Table 5, in any MOI, the infectivity titer of the obtained virus was found to be a high infectivity titer of 10 8 TCID 50 / mL or more.
  • PPV infectivity was measured in the same manner as in Example 1 using a 96-well plate. The results are shown in Table 7. As shown in Table 7, it was found that the virus infectivity titer was as high as 10 8 TCID 50 / mL or more.
  • serum-free medium DMEM medium without serum
  • the serum-free PPV infectivity titer was measured in the same manner as in Example 1 using a 96-well plate. The results are shown in Table 9. As shown in Table 9, the virus infectivity titer was found to be as high as 10 8 TCID 50 / mL or higher under any condition.
  • ESK cells (Vet. Microbiol. 1984.9 (2): 187-92., Microbiologica. 1987.10 (3): a cell line derived from porcine kidney that is commonly used as a host cell for porcine parvovirus (PPV): 301-9., Nippon Juigaku Zasshi. 1988.50 (3): 803-8, Nippon Juigaku Zasshi. 1990.52 (2): 217-24, J.Vet.Med.Sci.1992.54 (2): 313-8) Subculture was performed under the same culture conditions as in Example 1 except that the cells were used instead of -13 cells. The doubling time and the cell density at confluence were measured and found to be 3.0 ⁇ 10 7 cells / flask, respectively, for 20 hours.
  • the culture supernatant was collected for each flask.
  • the collected culture supernatant was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, and the supernatant fraction was filtered with a 0.45 ⁇ m filter (Nalgen).
  • the PPV infectivity titer was measured by the same method as in Example 1. The results are shown in Table 11. As shown in Table 11, the virus infectivity titer was found to be as high as 10 8 TCID 50 / mL or higher under any condition.
  • PK-13 cells were subcultured in the same manner as in Example 1, and the doubling time and the cell density at confluence were measured.
  • host cells with a cell density of 1/40 (5 ⁇ 10 5 cells / flask) of confluent cell density were dispensed with 15 mL of serum medium in 4 flasks for each cell density condition.
  • the culture supernatant was collected one flask at a time after culturing for 51 hours (3 times the doubling time), 68 hours (4 times the same), 204 hours (12 times the same), and 238 hours (14 times the same). .
  • the collected culture supernatant was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, and the supernatant fraction was filtered with a 0.45 ⁇ m filter (Nalgen).
  • PPV infectivity was measured in the same manner as in Example 1 using a 96-well plate. The results are shown in Table 13. As shown in Table 13, the infectivity titer did not exceed 10 8 TCID 50 / mL under any condition.
  • PK-13 cells were subcultured in the same manner as in Example 1, and the doubling time and the cell density at confluence were measured.
  • host cells with a cell density of 1/40 (5.0 ⁇ 10 5 cells / flask) of confluent cell density were dispensed with 15 mL of serum medium in 6 flasks for each cell density condition.
  • the culture supernatant was collected for each flask.
  • the collected culture supernatant was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, and the supernatant fraction was filtered with a 0.45 ⁇ m filter (Nalgen).
  • PPV infectivity was measured in the same manner as in Example 1 using a 96-well plate. The results are shown in Table 15. As shown in Table 15, the infectivity titer did not exceed 10 8 TCID 50 / mL under any condition.
  • PPV infectivity was measured in the same manner as in Example 1 using a 96-well plate. The results are shown in Table 17. As shown in Table 17, the infectivity titer did not exceed 10 8 TCID 50 / mL under any condition.
  • a high-infectivity parvovirus solution having an appropriate purity of 10 8 TCID 50 / mL or more can be obtained.
  • This can be used for preparation of virus research materials such as antiviral drug search, preparation of viruses used for virus clearance safety evaluation in the manufacturing process of biologics (pharmaceuticals), and vaccine production.

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Abstract

高感染価のパルボウイルスを安定かつ容易に生産する方法を提供する。コンフルエントに増殖したときの細胞密度の１／５００～１／２０の細胞密度の宿主細胞と培地とを含む培養基材に、感染多重性が０．０００１～０．１となるようにパルボウイルスのシードウイルスとを接種し、宿主細胞の倍加時間の５～１１倍の時間培養し、培養上清を回収する工程を含む、培養上清中に１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルスの生産する方法により上記課題を解決する。

Description

高感染価のパルボウイルスの生産方法
　本発明は、培養上清中に高感染価のパルボウイルスを生産する方法及び当該方法によって得られる高感染価のパルボウイルス溶液に関する。
　ウイルスはヒトを含め多くの動植物や微生物に感染し増幅する。あるものはＤＮＡをゲノムとして有するＤＮＡウイルスであり、またあるものはＲＮＡをゲノムとして有するＲＮＡウイルスであり、各ウイルスは、それぞれに異なる増殖機構をする。ヒトなどの動物に感染した場合に、ウイルス感染症を引き起こすウイルスも多い。ウイルスは単独では増えることができず、他の動物・植物・微生物の細胞に感染して、その細胞の能力を利用して増えることができる。ウイルスが感染して増殖しうる細胞を、そのウイルスの「宿主細胞」と呼ぶ。ウイルスが感染・増殖し得る宿主細胞の種類はウイルスの種類ごとに決まっている。
　パルボウイルスは小型の一本鎖ＤＮＡウイルスであり、直径約２０ｎｍと小さな正２０面体ウイルスでエンベロープを持たない（非特許文献１）。パルボウイルスは、動物に感染することにより疾患を引き起こす。当該疾患としては、Ｂ１９パルボウイルスがヒトに引き起こす伝染性紅斑や貧血、関節炎のほか、サルパルボウイルス（ＳＰＶ）による貧血、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）による猫の腸炎・白血球減少・失調症、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）による犬の腸炎・心筋炎、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）による豚の死産、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）による牛の腸炎、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）によるガチョウの腸炎・心筋炎、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）によるマウスの腸炎・肝炎などが知られている（非特許文献２、非特許文献３）。パルボウイルスは、犬や猫といった人間が飼う動物の病気の原因を引き起こす病原体として重要である。犬にイヌパルボウイルスが感染すると、前述のように腸炎を起こし、激しい下痢や嘔吐を生じ、死亡することが知られている（非特許文献３）。猫がパルボウイルスに感染すると、急性腸炎や白血球減少を起こすことがあり、二次感染で死亡する可能性もあり、また胎子や新生子に感染すると、中枢神経や胸腺が障害を受け、運動失調を起こすこともあれば、死亡してしまうこともある。
　パルボウイルス感染症を防ぐためにパルボウイルスのワクチンに関する研究が行なわれている（特許文献１、特許文献２）。これらの研究には、ウイルスを生産して使用する必要がある。多くのウイルスは、宿主細胞を培養し、これにウイルスを感染させることで、増殖させ、生産することができる。ウイルスを弱毒化あるいは不活化したワクチン生産も、ウイルス生産と同様の手順によって達成される。
　製薬業界においては、遺伝子組み換え医薬品（バイオ医薬品）や抗体医薬品など生物由来の医薬品がウイルスに汚染していないこと（ウイルス安全性）を保証するために、製造工程のウイルスクリアランス（除去性能）を評価する必要がある。そのために各工程の前の医薬品中間製品にウイルスを添加して工程前後のウイルス量を定量することにより、個々の工程が有するウイルスクリアランスの測定が行なわれている。特に、生物製剤の製造工程のウイルスクリアランス評価に使用されるウイルス種類の選択方法について定めたＩＣＨ（International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use：日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議）ガイドラインに記載された方法で実施される血漿分画製剤のウイルスクリアランス評価では、パルボウイルスの一種ブタパルボウイルス（ＰＰＶ：Porcine Parvovirus）が高頻度で使用され、バイオ医薬品のウイルスクリアランス評価では、パルボウイルスの一種マウス微小ウイルス（ＭＶＭ：Minute virus of mice）が高頻度で使用されている。このように、生物製剤の製造工程のウイルスクリアランス評価には高頻度でパルボウイルスが使用されている。
　ウイルスを生産するには、実験動物を用いる方法、鶏卵を用いる方法、組織培養・培養細胞を用いる方法がある（非特許文献４）。実験動物や鶏卵を用いる方法は高コストであるという欠点がある。それに代わる方法が培養細胞を用いる方法である（非特許文献５）。パルボウイルスの生産も、培養細胞を用いる方法で行なわれる（特許文献１）。
　パルボウイルスなどのウイルスを生産するためには、宿主細胞の培養系にシードウイルスを感染させて、ウイルスを増殖させて回収する方法が一般に行なわれる。ここで言うシードウイルスとは、ウイルス増殖の初期に用いる少量のウイルスを「種」にみたてた呼称である。従来のウイルス生産において、宿主細胞にシードウイルスを感染させるタイミングは、通常、宿主細胞がコンフルエントに到達し、単層状態を形成した段階である（非特許文献４、特許文献３～６）。すなわち、宿主細胞を培養容器に接種し、増殖させ、培養容器底面の全面に宿主細胞が増殖し広がった状態で、シードウイルスを接種するのが通常であるが、それは、感染しうる細胞が高密度に存在する状況が、より多くのウイルスを生産する場を提供する系だからである。宿主細胞を培養容器に接種してからこのコンフルエントの状態になるまでには、通常２～３日要する（非特許文献４）。このコンフルエント状態では、宿主細胞は定常期であり、それ以上増殖しない。したがって、従来技術は、宿主細胞の増殖培養工程を完了した後に、それ以上細胞増殖が起こらない培養環境下でウイルス感染を開始し、ウイルス感染により宿主細胞が死滅するのと同時進行でウイルスを培養上清中に生産するというものであった。このような方法は、パルボウイルスにおいても例外ではなく、コンフルエント状態の細胞に感染させる方法でウイルス生産が行なわれ（非特許文献６，非特許文献７）、得られるパルボウイルスの感染価は１０5～１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬであった。従来の培養系においては、最も細胞数が多い状態であるコンフルエントの状態で宿主細胞にパルボウイルスが添加され、添加されたパルボウイルスは宿主細胞内で増殖し、宿主細胞の死滅を伴って増加する。最もパルボウイルス感染価が高くなる時期に培養上清を回収することで、最も高感染価のパルボウイルス溶液を回収することができる。この方法で培養上清中に得られたパルボウイルスは、当然ながら細胞培養に供された培地中に懸濁した状態で回収される。
　また、上記のようにして得られたパルボウイルス溶液について、不純物を除去することも行われる。除去方法として、低速遠心分離によって細胞の破片などの不純物を除去することが行なわれる。また、より不純物を除去する方法として、超遠心分離技術を用いた、塩化セシウム密度勾配超遠心分離や、スクロース密度勾配超遠心分離技術も知られている（非特許文献８）。
ＷＯ２００７／１２５６０５号公報 特表平１０－５０８４８５号公報 特開２００９－２９７０３６号公報 特許第２６５５８７６号公報 特開昭５８－２２００８号公報 特開昭６１－２４３７０号公報
ウイルス・細菌感染ｎｅｗファイル　１９９７　永井美之・渡邊治雄編、羊土社：ｐ．６８ ウイルス学　１９９７　畑中正一編、朝倉書店：２２２－２２３ M.Azetaka et.al 1980 Jpn.J.Vet.Sci.43:243-255 ウイルス実験学総論　国立予防衛生研究所学友会編　１９７３：６１－１８０ Gregersen,J.P.Pharmazeutische Biotechnologie,Kayser及びMuller（編）2000 257-281 P.A.Bachmann 1972 Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(140)4:1369-1374 P.A.Bachmann et al. 1976 Zbl.Vet.Med.B. No.23:355-363 ウイルス実験学各論　１９７３　国立予防衛生研究所学友会・編　２２－２３
　上記のとおり、生物由来の医薬品のウイルス安全性評価やワクチン生産に使用するために、高い感染価のパルボウイルスを生産することが望まれている。
　また、上記で述べた生物製剤の製造工程のウイルスクリアランス評価でも、高い感染価のウイルスを生産することが望まれている。当該評価のためのウイルス除去フィルターのウイルスクリアランス試験は、実生産工程をスケールダウンしたモデル工程にて実施されるが、このウイルスクリアランス試験に要求される点は、第一に、フィルターの目詰まりが生じない程度のウイルス懸濁液添加量であることと、第二に、評価する工程のウイルスクリアランス数値である対数除去率（ＬＲＶ）が４以上であることを示せる添加量であることである。前者については、工程の流速を含めた諸パラメーターが実生産工程と同じでなければならない（WHO Technical Report, Series No.924, 2004 162-165）ため、ウイルス添加による目詰まりが生じない添加量にする必要がある。そのためには、体積比で１％以下、好ましくは０．１％以下の添加が望ましい。後者のＬＲＶについては、４以上ある工程が、ウイルス除去に関して堅牢性を持ち効果的で信頼性のある工程（A Robust, effective and reliable process step）であると見なされることから（WHO Technical Report, Series No.924, 2004 163-164）、４以上を結果として出すことができるウイルス添加量にする必要がある。このように、ウイルス除去性能としてＬＲＶが４以上であることを示す必要があり、また中間製品に添加するウイルス懸濁液の量は体積比で１％以下、好ましくは０．１％が望ましい。しかしながら、従来の培養法で得られる低い感染価のパルボウイルス（感染価は１０5～１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬ、パルボウイルスの感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比が１０未満：１）を１％又は０．１％添加した場合には、プレフィルターでのロスや、定量誤差の問題からＬＲＶが４以上であることを示すことが困難となってくる。このときＬＲＶが４以上であることを確実に示すためには、ウイルス添加体積を増やさねばならず、そうするとフィルターの目詰まりなどの弊害が起こりやすくなる問題がある。
　また、従来、このような問題を解決するために、密度勾配超遠心やスクロース密度勾配超遠心等の超遠心分離によってウイルスを沈殿させて濃縮する手法が可能であった。しかしながら、不純物も同時に濃縮されるため、実験の結果や、ウイルス除去フィルター濾過時に不純物の悪影響が生じてしまう問題がある。
　また、密度勾配超遠心やスクロース密度勾配超遠心等の超遠心分離を用いた場合、分離精製されたウイルスは純度が極めて高く、ウイルスの感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比が１００００以上：１となり、不純物が少ないことでウイルス粒子が凝集しやすい問題がある。もしウイルス粒子が凝集すると、生物製剤の製造工程のウイルスクリアランス評価においては、本来ウイルスが通過してしまうような孔径のフィルターでもウイルスが分離除去されてしまうために、ウイルスクリアランスを過大評価してしまう問題がある。
　さらに、セシウム密度勾配超遠心方法やスクロース密度勾配超遠心等の超遠心分離の技術は、操作が極めて煩雑で難しい熟練技術が要求される。さらに、汎用的な超遠心分離機の遠心管の体積に律速があるのでスケールアップが困難なため、一般には小規模の実験でしか行なえず、産業上これらの精製工程を取り入れることは現実的ではない。
　また、高感染価のウイルス懸濁液を得るために、感染細胞を回収して凍結融解を繰り返して細胞を強制的・物理的に破壊して、細胞内部に蓄積したウイルスを回収する方法も知られている。マウス微小ウイルスなどで通常行なわれているウイルス生産方法であるが、この方法では大量の宿主細胞内部の不純物が混入してしまうため、たとえ高感染価のウイルスが得られたとしても、相対的に不純物濃度が高くなるため、ウイルスを利用する際に、超遠心精製などの煩雑な操作が必要となってしまい、同上の問題がある。
　このように、従来のウイルス生産技術を採用することは極めて困難であり、超遠心分離などの複雑な操作を用いずに、より簡便で効率的に、適切な純度の高感染価のパルボウイルス溶液を得る方法が望まれている。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく、パルボウイルスの宿主細胞を培養して、そこにパルボウイルスのシードウイルスを接種し、パルボウイルスを増殖させる培養系における諸条件（初期宿主細胞密度や感染多重性（ＭＯＩ））とウイルス感染価との関係について鋭意検討した結果、驚くべきことに、従来採用されていなかった極めて低い特定範囲の細胞密度の宿主細胞に、特定範囲の低いＭＯＩでパルボウイルスのシードウイルスを感染させ、さらに、特定の期間宿主細胞を培養して培養上清を回収することで、パルボウイルス特有の増殖機構を利用して、従来法では得られなかった非常に高い感染価のパルボウイルス溶液が得られることを発見するに至った。
　すなわち、本発明は下記の通りである。
［１］
　培養基材中で宿主細胞とパルボウイルスのシードウイルスとを培養することにより、培養上清中に１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルスを生産する方法であって、
（ａ）前記培養における宿主細胞の対数増殖期の倍加時間及びコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度を事前に別途算出しておく工程と、
（ｂ）工程（ａ）において事前に算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／５００～１／２０の細胞密度の宿主細胞と培地とを含む前記培養基材に、パルボウイルスのシードウイルスを感染多重性（ＭＯＩ）が０．０００１～０．１となるように接種する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の宿主細胞とパルボウイルスとを含む培養物を工程（ａ）において事前に算出した倍加時間の５～１１倍の時間培養する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の培養により得られるパルボウイルスを含む培養上清を回収する工程とを含む、方法。
［２］
　前記宿主細胞が、接着依存性細胞である、［１］に記載の方法。
［３］
　前記宿主細胞が、パルボウイルスに感受性がある細胞である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　前記パルボウイルスが、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ラットウイルス（ＲＶ）、Ｈ－１ウイルス（Ｈ－１）、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、又はウシパルボウイルス（ＢＰＶ）である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
　前記工程（ｂ）において、工程（ａ）において事前に算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／３００～１／３０の細胞密度の宿主細胞と培地とを含む前記培養基材に、前記パルボウイルスのシードウイルスを感染多重性（ＭＯＩ）が０．０００１～０．１となるように接種する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　前記工程（ｂ）において、工程（ａ）において事前に算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／２００～１／４０の細胞密度の宿主細胞と培地とを含む前記培養基材に、前記パルボウイルスのシードウイルスを感染多重性（ＭＯＩ）が０．０００１～０．１となるように接種する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［７］
　前記感染多重性（ＭＯＩ）が、０．００１～０．０３である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
　前記感染多重性（ＭＯＩ）が、０．００３～０．０１である、［７］に記載の方法。
［９］
　前記培地が血清培地であるとき、工程（ｃ）において、前記血清培地を無血清培地に交換する工程を含む、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
　前記工程（ｃ）において、工程（ａ）において事前に算出した倍加時間の６～９倍の時間培養する、［１］～［９］のいずれかに記載のパルボウイルス生産方法。
［１１］
　前記工程（ｃ）において、工程（ａ）において事前に算出した倍加時間の７～８倍の時間培養する、［１０］に記載のパルボウイルス生産方法。
［１２］
　前記工程（ｃ）において、前記培養物を３３℃以上３９℃以下の温度で培養する、［１］～［１１］のいずれかに記載のパルボウイルスの生産方法。
［１３］
　前記工程（ｃ）において、前記宿主細胞と前記ウイルスが同時進行で増殖する、［１］～［１２］のいずれかに記載のパルボウイルスの生産方法。
［１４］
　前記工程（ｄ）において、前記培養上清に含まれる遊離の宿主細胞と宿主細胞の破片とを除去する工程を含む、［１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
　前記除去工程が、孔径０．２μｍ～０．４５μｍの膜濾過を用いて行われる、［１４］に記載の方法。
［１６］
　［１］～［１５］のいずれかに記載の方法によって得られる、１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の感染価のパルボウイルスを含む培養液。
［１７］
　１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の感染価のパルボウイルスを含み、かつ、前記パルボウイルスの感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比が１０：１～５０００：１である、細胞培養によって得られるパルボウイルス溶液。
　本発明により、細胞培養で簡便で効率的に、１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルス溶液が得られ、パルボウイルス使用時の感染価不足に起因する弊害を解消することが可能になる。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
　本実施形態は、培養基材中で宿主細胞とパルボウイルスのシードウイルスとを培養することにより、培養上清中に１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルスを生産する方法であって、
（ａ）前記培養における宿主細胞の対数増殖期の倍加時間及びコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度を事前に別途算出しておく工程と、
（ｂ）工程（ａ）において事前に算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／５００～１／２０の細胞密度の宿主細胞と培地とを含む前記培養基材に、パルボウイルスのシードウイルスを感染多重性（ＭＯＩ）が０．０００１～０．１となるように接種する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の宿主細胞とパルボウイルスとを含む培養物を工程（ａ）において事前に算出した倍加時間の５～１１倍の時間培養する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の培養により得られるパルボウイルスを含む培養上清を回収する工程とを含む、方法である。
　工程（ａ）：まず、パルボウイルス宿主細胞の対数増殖期の倍加時間及びコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度を事前に別途算出する。なお、宿主細胞は、継代培養によって増殖させることができる。
　パルボウイルスは小型の線状１本鎖ＤＮＡウイルスである。ＤＮＡウイルスは、ゲノムとしてＤＮＡを有するウイルスであり、宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼを利用してゲノムＤＮＡからｍＲＮＡを合成し、該ｍＲＮＡをもとにタンパク質を合成して増殖する。ＤＮＡウイルスのほとんどは、２本鎖ＤＮＡウイルスであるが、パルボウイルスは線状１本鎖ＤＮＡをゲノムとして有する。１本鎖ＤＮＡの状態ではウイルス増殖はできないため、パルボウイルスは、宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼに加えて、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡの状態を経て増殖するという特有の増殖機構を有する。
　パルボウイルス科（Parvoviridae）ウイルスは、パルボウイルス亜科に属する３つの属、すなわち、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属（Parvorivirus）、ヘルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属（Dependovirus）、及び赤血球特異的に感染するエリスロウイルス属（Erythrovirus）と、デンソウイルス亜科に属する３つの属、昆虫に感染するデンソウイルス属（Densovirus）、イテラウイルス属（Iteravirus）、及びブレビデンソウイルス属（Aedes aegypti densovirus）が知られている。本実施形態における「パルボウイルス」とは、パルボウイルス属のウイルスをいう。パルボウイルス属のウイルスは類似の増殖機構を有するため、本実施形態の方法が共通して利用できる。
　本実施形態におけるパルボウイルス（パルボウイルス属ウイルス）には、限定するものではないが、ブタパルボウイルス（Porcine Parvovirus PPV）、イヌパルボウイルス（Canine Parvovirus CPV）、マウス微小ウイルス（Minute Virus of Mice MVM）、ラットウイルス（Rat Virus RV）、Ｈ－１ウイルス（H-1 Virus H-1）、ネコパルボウイルス（Feline Parvovirus FPV）、ガチョウパルボウイルス（Goose Parvovirus GPV）、ウシパルボウイルス（Bovine Parvovirus BPV）が含まれる。これらのウイルスは、類似した大きさ、ゲノム構造、ウイルス粒子構造、増殖機構を有しており、すべて本実施形態の方法において好適に使用可能である。
　本実施形態における「宿主細胞」は、上記のパルボウイルスに感受性がある（パルボウイルスに感染できる）細胞であればその種類に限定されない。パルボウイルスに感受性がある細胞としては、例えば、ブタパルボウイルスに感受性があるPK-13細胞、PK-15細胞、LCC-PK1細胞、ESK（embryonic swine kidney）細胞、SK細胞、ST（swine testes）細胞及びMPK（Minipig kidney）細胞、イヌパルボウイルスに感受性があるMDCK（Mardin-Darby canine kidney）細胞、FEA（feline embryonic fibroblasts）細胞、CRFK（Crandell feline kidney）細胞及びFK-81細胞（embryonic feline kidney）、マウス微小ウイルスに感受性があるA9（mouse fibroblast）細胞及びC6（rat glial）細胞、ラットウイルスに感受性があるNRK（normal rat kidney）細胞、Ｈ－１ウイルスに感受性があるMolt-4（human T-cell）細胞、AV-1（human B-cell）細胞及びNC-37（human B-cell）細胞、ネコパルボウイルスに感受性があるCRFK細胞、Mya 1細胞、NLFK（Norden Laboratories Feline Kidney）細胞及びA72細胞、ガチョウパルボウイルスに感受性があるGEF（goose embryo fibroblast）細胞、ウシパルボウイルスに感受性があるBEK（bovine embryonic kidney）細胞、バッファロー肺腺維芽細胞及びEBTr（bovine embryonic trachea）細胞等が挙げられる。宿主細胞は、好ましくは、感染により細胞変性を起こす細胞が利用できる。例えば、ブタパルボウイルスの場合はブタの腎臓細胞、イヌパルボウイルスの場合はイヌ腎臓細胞を用いることができるが、これらに限定されるものではなく、上記のとおり、パルボウイルスに対して感受性があり、好適には細胞変性を起こす細胞であれば広く適用可能である。また、本実施形態において、「宿主細胞」としては、無限増殖能を持った動物細胞を用いることができ、一般に「細胞株（Cell line）」と呼ばれるものを用いることができる。
　本実施形態において、宿主細胞は、接着依存性細胞であることが好ましい。「接着依存性細胞」とは、筋細胞や臓器細胞のように培養基質に接着した状態でないと生存・増殖できない細胞である。接着依存性細胞は、培養フラスコなどの培養基材の底面・壁面や、マイクロキャリアと呼ばれる担体に付着させて培養される。フラスコやシャーレは一般に小スケール培養に用いられる。マイクロキャリアを用いた培養は、逐次スケールアップが容易である利点がある（特許第３９８２８４３号　多孔質担体を用いた動物細胞の逐次培養方法）。また、本実施形態において、浮遊性細胞を用いることもできる。「浮遊性細胞」は、浮遊状態で増殖し、培地中に懸濁させた状態で静置又は攪拌して培養される。浮遊性細胞では、培養上清を回収する前に培地交換を行なうことが困難となるため、例えばマイクロキャリアに付着させて培養することが望ましい。
　本実施形態において「培養基材」は、その種類が限定されるものではなく、培養容器、培養フラスコ、シャーレ、ローラーボトル、培養プレートなど、細胞培養で通常用いられる任意の培養基材が含まれる。
　培養は、好適にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）を用い、５％程度の二酸化炭素ガス環境下で行うことができるが、宿主細胞の増殖に適した環境培養条件であれば、これに限定されるものではない。培養温度は、宿主細胞の増殖に適した温度とすることができる。パルボウイルスの宿主細胞は３３℃～３９℃の範囲で増殖することが知られているため（「動物細胞培養法入門（生物化学実験法29）松谷 豊著／学会出版センター」p.14-15）、好ましくは、培養温度は３３℃以上３９℃以下、例えば約３７℃とすることができる。なお、細胞増殖因子を含む動物血清（牛胎児血清や子牛血清、馬血清など）を１０％以下の割合で含む培地を使用するのが望ましい。無血清培地ではウイルスの生産量が低下するので、血清培地で細胞の増殖が必要充分量行なわれた後に、ウイルス回収前に培地を無血清培地に交換する手法を採用することも可能である。
　本実施形態において、「感染価」とは、ウイルス感染力価を示す単位である。ウイルス業界でしばしば使用される「タイター（Titer）」と同義である。ウイルスは光学顕微鏡を用いても見ることができないため、生物細胞のように顕微鏡で密度（個数／体積）を計測することができない。従って、ウイルスの場合は宿主細胞への感染能を利用した感染力価を単位として、その量や濃度の代替とする。例えば、宿主細胞の単層に対し適当な倍率で希釈したウイルス懸濁液を添加すると、ウイルスの個数がプラークとして検出され、プラーク形成単位（plaque forming unit＝ｐｆｕ）／ｍＬとして感染力価を測定できる。あるいは、ウイルスが含まれている液体の希釈を進めていき、宿主細胞への感染陽性を生じる割合が５０％になる濃度を５０％感染量（tissue culture infectious dose＝ＴＣＩＤ５０）／ｍＬとして感染力価を測定できる。本実施形態において、使用するパルボウイルスはいずれもＴＣＩＤ50／ｍＬとして感染力価を測定でき、ＴＣＩＤ50／ｍＬとして感染力価を表記する。なお、ｐｆｕ／ｍＬなどの他の単位によってパルボウイルスの感染力価を表してもよい。他の単位で感染力価を測定できるパルボウイルスにおいては、同一のパルボウイルス懸濁液を同時に双方の単位で感染力価測定することによって、異なる単位間の換算を容易に実施しうる。
　本実施形態において、「対数増殖期における倍加時間」とは、対数増殖期に宿主細胞が２倍に増えるのに要する時間である。細胞の増殖曲線は対数増殖期・定常期・死滅期と推移する。対数増殖期では、細胞は一定の速度で細胞分裂を繰り返して増殖する。倍加時間は細胞の種類・血清濃度などの培地条件・培養温度などの培養条件によって異なる。対数増殖期における倍加時間は、培養時間をｔ、初期細胞数をＣ１、培養後細胞数をＣ２としたとき、下記式で算出することができる。
　　　　倍加時間（時間）＝０．３０１ｔ／ｌｏｇ１０［Ｃ２／Ｃ１］
　増殖が進むと、やがて細胞は培養容器内で細胞数が上限に達する。栄養分の不足や老廃物の蓄積、ｐＨの低下などによって増殖が停止する時期であり、定常期と呼ぶ。このとき、接着依存性細胞は培養容器表面を覆いつくす密集状態になり、この状態を「コンフルエント」と呼ぶ。コンフルエントに達したときの細胞数（密度）を求めるためには、培養容器に細胞を接種したのちに、２４時間ごとに細胞を回収して細胞数を計測し、上限に達したときの細胞数（密度）を得ればよい。
　本実施形態において、宿主細胞がコンフルエントに増殖したときの細胞数又は細胞密度は次のように定義する。まず、培養フラスコなどの培養基材に宿主細胞を接種した後、継代培養を行い、２４時間ごとに細胞数を測定し、各２４時間の倍加時間を計算する。２４時間ごとの細胞数測定は、対数増殖期の倍加時間より倍加時間が５倍以上に長くなった日の翌日まで測定して終了とするが、細胞数が２日連続で減少したときも計測終了とする。
そして最も多い細胞数となった日とその前後の計３日のデータの平均値をコンフルエント時の細胞数又は細胞密度と定義する。細胞の種類によっては、定常期に達したのち、なかなか死滅期に移行せずに定常期を長く維持するものがある。その場合は、対数増殖期の倍加時間と比較して、倍加時間が５倍以上に長くなった日をコンフルエント到達日とし、その日と翌日の細胞数の平均値をコンフルエントの細胞数又は細胞密度と定義する。この２４時間ごとの細胞数計測に用いる培養基材は、全て同時に同条件で培養を開始した別々の培養基材について測定することとし、一度細胞数を計測した培養基材に再び細胞を戻して翌日の計測に使用しない。これは、細胞回収操作による、増殖のラグタイムの影響を回避するためである。測定誤差や、培養容器ごとの誤差を極力なくすために、少なくとも一度に２つ（ｎ＝２）、好ましくは３つ（ｎ＝３）、さらに好ましくは４つ（ｎ＝４）以上の培養容器を一度に測定する。コンフルエント時の細胞数又は細胞密度は、培養基材、培地、細胞の種類、培養温度などの培養条件によって異なる。したがって、培養条件ごとに前述の方法で計測する必要がある。なお、コンフルエントに達する定常期ののち、細胞は養分枯渇等により死滅していく。これを死滅期と呼ぶ。
　「継代培養」は、一般に、対数増殖期の後期、６０％～８０％コンフルエントの状態で行なわれ、コンフルエントに到達すると、接着依存性細胞では増殖が停止してしまうため、コンフルエントに達する前に継代を行なう必要がある（小山秀機　細胞培養ラボマニュアル　シュプリンガー・フェアラーク東京　１９９９　５１－５２）。コンフルエントに達してからの継代を繰り返すと、細胞が弱ったり、性質が変化したりする。浮遊性細胞の場合、新鮮な培地に細胞を希釈して植え継ぐことで継代できる。接着依存性細胞の場合は、トリプシンなどの蛋白質分解酵素やEDTAなどのキレート剤又はその混合液で、宿主細胞を培養容器から剥がし、細胞数を希釈して新たな培養容器に植え継ぐことで継代される。継代培養は通常、週に２～３回、２～１２倍に希釈して行う。例えば、イヌパルボウイルスの宿主細胞であるＭＤＣＫ（イヌ腎臓細胞）では２～３日ごと、２～６倍に希釈継代する（秋山徹ら　細胞・培地活用ハンドブック　羊土社　２００８　４５－４６）。このように、ウイルスの宿主細胞の継代培養においては、コンフルエントの細胞数の６０～８０％に到達した時期に、コンフルエントの細胞数の１／２～１／１２の細胞数に希釈して継代することができる。この範囲内で、前述の継代頻度との兼ね合いで、細胞ごとに適切な細胞継代頻度と希釈倍率を定めて継代する。浮遊細胞培養においても基本的に同様である。
　工程（ｂ）：次いで、工程（ａ）において事前に算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／５００～１／２０の細胞密度の宿主細胞と培地とを含む培養基材に、パルボウイルスのシードウイルスを感染多重性（ＭＯＩ）が０．０００１～０．１となるように接種する。
　上記の通り、工程（ｂ）において、工程（ａ）において事前に算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／５００～１／２０の細胞密度の宿主細胞と培地とを含む培養基材を調製する必要があるが、ここでは、上記特定の細胞密度の宿主細胞を培地を含む培養基材に接種するか、あるいは上記特定の細胞密度となるように培地を含む培養基材中で宿主細胞を培養することにより調製する。また、培養基材は、好ましくは工程（ａ）において事前に算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／３００～１／３０、より好ましくは１／２００～１／４０の細胞密度の宿主細胞を含む。
　本実施形態では、上記のように、コンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／５００～１／２０という極めて低い所定の細胞密度で感染を開始することが重要な特徴である。パルボウイルスの場合、従来のウイルス生産方法の常識であるコンフルエント状態の宿主細胞にウイルスを感染させる方法では、宿主細胞の増殖は見られず、宿主細胞は感染による細胞変性を経て死滅への一途をたどるだけであったのに対し、本実施形態における極めて低い宿主細胞密度で感染を開始することよって、宿主細胞増殖とウイルス増殖とを同時進行で達成することに成功した。理論に束縛されるものではないが、このような宿主細胞増殖とウイルス増殖とが同時進行で起こるのは、パルボウイルス特有の増殖機構に起因すると考えられる。すなわち、パルボウイルスはＤＮＡウイルスであり、宿主細胞内で核内に移行してＤＮＡ複製を行なうため、細胞質内で増殖できるほかのウイルスと異なり増殖が遅いために、感染細胞を急速に死滅させることがなく、それゆえ培養系全体としての細胞増加を許容したものと考えられる。従来技術であるコンフルエントの状態での感染では、宿主細胞が対数増殖期を終えて停滞期に入っているため、パルボウイルスの増殖が緩やかだとしても細胞増殖を伴うことはなかった。一方、本実施形態においては、上記のように、パルボウイルス特有の増殖機構を利用し、宿主細胞とウイルスが同時進行で増殖する、「宿主細胞増殖とパルボウイルス増殖との同時進行時間」（以下、単に「増殖同時進行時間」とも言う。）を充分に長く確保することで、高い感染価のパルボウイルスを提供することができる。そして、そのような増殖同時進行時間を充分に長く確保することを目的として、適切な宿主細胞密度においてシードウイルスを感染させる。感染時の宿主細胞密度が高すぎる場合、短期間で宿主細胞密度がコンフルエントに到達して細胞増殖が停止するために、充分に長い増殖同時進行時間の確保が困難になる。感染時の細胞密度が低すぎる場合にも、宿主細胞増殖速度をパルボウイルス増殖速度が上回り細胞破壊が進むため充分に長い増殖同時進行時間の確保が困難になる。このように、本実施形態においては、単にウイルス感染後の宿主細胞の培養時間ではなく、上記の増殖同時進行時間に着目している。このような観点から、すでに説明したとおり、工程（ａ）において、コンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度を事前に算出測定する。そして、工程（ａ）で算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度に対する比をもって、工程（ｂ）においてパルボウイルスのシードウイルスを接種する際の宿主細胞の細胞密度を規定する。
　さらに、本実施形態において、増殖同時進行時間が短すぎると、上述のとおり、パルボウイルス増殖量が不十分となり、高い感染価のパルボウイルスが得られない。一方で、増殖同時進行時間が必要以上に長い場合、理論に束縛されるものではないが、パルボウイルスの増殖が宿主細胞の増殖を上回り、宿主細胞全体が死滅へと向かい、細胞から放出されたプロテアーゼの影響等を受けパルボウイルスは失活し、感染価は低下する。工程（ｃ）について下記に詳述するように、適切なタイミングで培養物を回収することにより、増殖同時進行時間を適切な範囲とし、培養上清中に非常に高い１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の感染価のパルボウイルスを得ることができる。
　また、工程（ｂ）において、上記の特定の低い細胞密度の宿主細胞と培地とを含む培養基材に、パルボウイルスのシードウイルスを感染多重性（ＭＯＩ）が０．０００１～０．１となるように接種する。ここで、「感染多重性」とは、宿主細胞数に対するウイルスの添加量の比率であり、ウイルス感染価／宿主細胞数で表される。パルボウイルスのシードウイルスの接種は、上記所定の細胞密度の宿主細胞を培養基材に接種するのと同時にＭＯＩが０．０００１～０．１となるようにシードウイルスを接種してもよいし、より低い細胞密度で宿主細胞培養を開始し、上記の所定の細胞密度になった時点でＭＯＩが０．０００１～０．１となるようにシードウイルスを接種させてもよい。パルボウイルスの感染多重性（ＭＯＩ）は、好ましくは０．００１～０．０３の範囲であり、より好ましくは０．００３～０．０１の範囲である。
　上記のとおり、上記所定の低い細胞密度の宿主細胞に対して、シードウイルスを感染多重性（ＭＯＩ）が０．０００１～０．１となるようにパルボウイルスを接種して感染を開始すると、パルボウイルス感染の進行がゆるやかに始まり、最初は総細胞数が増加しながら、総パルボウイルス量も増加していくが、ある時点を境にパルボウイルスの増殖速度が宿主細胞の増殖速度を上回り、高感染価のウイルスが生産される。なお、宿主細胞に感染したシードウイルスは、宿主細胞の中で、宿主細胞の機能を借りて自らを複製し、細胞外に放出され、あるいは細胞内に留まっている。ウイルスに感染した細胞は、細胞変性を起こすパターンと起こさないパターンがある。細胞変性を起こすウイルスは病毒性があるが、起こさないウイルスは病毒性を示さずに持続感染を起こす。細胞変性は細胞死を引き起こす。本実施形態では、ウイルスの生産量が多いとの理由から細胞変性を引き起こす細胞が好ましいが、これに限定されない。
　工程(ｃ）：パルボウイルスのシードウイルスの接種後、上記パルボウイルスと宿主細胞とを含む培養物を所定の時間培養する。工程（ｃ）において、宿主細胞とパルボウイルスが、同時進行で増殖する。培養時間は、宿主細胞の倍加時間の５～１１倍、より好ましくは６～９倍、さらに好ましくは７～８倍である。上記の所定の時間培養を行うと、上記のとおり、宿主細胞が細胞変性を示して死滅し、培養上清中に大量のパルボウイルスが培養上清中に放出されるので、その時期に培養上清を回収することにより、前記増殖同時進行時間を適切な範囲とし、高感染価のパルボウイルスの懸濁液が得られる。また、宿主細胞のほとんどが死滅していなくても培養上清中に高感染価のウイルスが放出される場合もあるが、本実施形態ではいずれの放出様式でもかまわない。培養温度は、宿主細胞の増殖に適した温度とすることができ、好ましくは３３℃以上３９℃以下、例えば約３７℃とすることができる。また、工程（ａ）における培養条件と同じ条件で培養することが望ましいことから、工程（ａ）において宿主細胞の対数増殖期の倍加時間及びコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度を事前に算出した際の培養温度と同程度の培養温度とすることが望ましい。
　なお、培地として血清培地を用いた場合、下記工程（ｄ）の培養上清の回収時期の直前又は事前に、当該血清培地を無血清培地に交換し、当該無血清培地をさらに培養して、全体で上記所定の時間培養してもよい。これにより、回収されるウイルス懸濁液中の血清由来の不純物を排除することが可能になる。培地交換を行なう際の交換後の無血清培地体積は、必要に応じて調整することができる。培地交換のタイミングは、培養上清を回収する日の１～３日前が好ましく、より好ましくは１～２日前である。
　工程(ｄ）：上記所定の時間培養した後、パルボウイルスを含む培養上清を回収する。なお、従来法として、感染宿主細胞を凍結融解の繰り返しなどで感染宿主細胞を破壊し、ウイルスを回収する方法があるが、その際に大量の宿主細胞内部の不純物が発生するため、たとえ高感染価のウイルスが得られたとしても、相対的に不純物濃度が高くなるため、ウイルスを利用する際に、超遠心精製などの雑多な操作が必要となってしまう。一方、本実施形態のように、培養上清を回収する方法でもウイルス感染によって崩壊した宿主細胞由来の不純物が混入するが、本実施形態では、不純物量は宿主細胞の凍結融解破壊を行った場合よりも顕著に少ない。したがって、本実施形態では、高い感染価でパルボウイルスが培養上清から得られ、簡便に回収することができる。
　上記の本実施形態の方法を行うことにより、１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ、好ましくは１０8.3ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上、より好ましくは１０8.5ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上のパルボウイルス溶液（培養上清及び不純物除去後のウイルス懸濁液を含む）を得ることができる。
　得られた１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルス培養上清は、遊離の宿主細胞や宿主細胞の破片などの不純物などを除去するために、既知の条件での低速遠心分離にかけることができる。あるいは／さらに、孔径０．１～０．５μｍ、好ましくは、０．２～０．４５μｍの膜濾過で不純物を除去することができる。
　さらに、既知のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いたペグ沈殿法によって、遊離の宿主細胞や宿主細胞の破片などの不純物を除去することもできる。ＰＥＧはその濃度を上げていくと、分子量の大きなものから徐々に沈殿させる。例えば、ＰＥＧ６０００を１０％、塩化ナトリウムを０．５Ｍとなるよう添加し、４～３０℃で静置又は攪拌しながら４～４０時間たった後に９０００～１２０００ｇで２０～６０分間遠心分離することで、パルボウイルスを沈殿させることができる。このとき不純物の蛋白質は上清画分にくるため、不純物とパルボウイルスとを分離精製することができる。ＰＥＧ沈殿には、ＰＥＧ６０００以外の各種ＰＥＧを利用できる。
　また、陰イオン交換基材もパルボウイルスの分離精製に好適に使用可能である。表面に陰荷電を持つパルボウイルスは、陰イオン交換基材に吸着するので、吸着したパルボウイルスを高塩濃度の溶出バッファーで溶出することにより、不純物とパルボウイルスとを分離することができる。
　上記のとおり、パルボウイルスの培養・回収を行うことにより、パルボウイルスの感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比が１０：１～５０００：１、好ましくは４０：１～３０００：１であるパルボウイルス溶液（不純物除去後のウイルス懸濁液を含む）が得られる。「不純物」としては、遊離の宿主細胞や宿主細胞の破片、宿主細胞や血清成分に由来する蛋白質などが挙げられるが、遊離の宿主細胞や宿主細胞の破片はサイズが大きく、上記の遠心分離や濾過等の既知の方法で容易に除去できるため、本発明では、蛋白質濃度を不純物の存在割合を示す指標として用いる。
　上記のとおり、本実施形態により１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルス溶液が得られ、パルボウイルス使用時の様々な感染価不足に起因する弊害を解消することが可能になる。以下、代表的な３つの用途に関連して述べる。
　１つ目の用途、すなわちウイルスを抗ウイルス薬探索等の研究用途に使用する場合、不純物の存在は、目的の反応を阻害する等の悪影響を及ぼす恐れがある。したがって、実際に試験に供するウイルス感染価よりも高い感染価のウイルスを生産しておき、不純物が影響しない程度にまで希釈して研究に使用することになる。高いウイルス阻害活性を測定できるようにするためには、高いウイルス感染価で試験に供さねばならないため、それよりも高い感染価のウイルスを生産しておく必要がある。つまり、細胞培養で得られるウイルスの感染価は高い方が望ましい。本実施形態により、１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルス溶液が得られることにより、パルボウイルスを用いた抗ウイルス薬研究において、希釈してから研究材料として供することが可能になり、不純物による予期せぬ反応や干渉を軽減することが可能になる。
　２つ目の用途、すなわち生物製剤の製造工程のウイルスクリアランスを評価するためにウイルスを生産する場合もウイルスの感染価は高いほうが望ましい。上記のとおり、このウイルスクリアランス試験に要求される点は、第一に、フィルターの目詰まりが生じない程度のウイルス懸濁液添加量であることと、第二に、評価する工程のウイルスクリアランス数値である対数除去率（ＬＲＶ）が４以上であることを示せる添加量であることである。ＬＲＶ４以上であるためには、ウイルス除去フィルター工程に供する中間製品にウイルス感染化が１０4ＴＣＩＤ50／ｍＬとなるようにウイルスを添加しなければならないが、実際には、ウイルス感染化の定量誤差や、ウイルス粒子の会合体を除去するプレフィルターでのロスを考慮して、１０5ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上となるようにウイルスを添加する必要がある。体積比で０．１％添加して、１０5ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上とするには、元のウイルス懸濁液は１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上であることが必要である。本実施形態により、適切な純度の１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルス溶液が得られることにより、各工程のパルボウイルスクリアランスを評価する際に、パルボウイルス溶液の添加を顕著に減らすことが可能になり、パルボウイルス溶液由来の不純物によるフィルターの目詰まりの問題を解消することができる。
　また、３つ目の用途、ワクチン生産でも、細胞培養で生産されるウイルスの感染価が高い方が、その後のウイルスワクチン精製工程への負荷が軽減し、製造にとって有利である。ウイルス感染価が低いと、相対的に不純物濃度が高くなるため精製工程への負荷がかかり、製造にとって不利になる。本実施形態により、１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルス溶液が得られることにより、パルボウイルスのワクチン生産においても、精製原料中のワクチン量が飛躍的に多くなるため、ワクチン精製工程をより効率的で低コストで実施することが可能になる。
　以下実施例、比較例に基づき、本発明をより詳細に説明する。なお、ここに示す実施例は代表例であり、本発明がこの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の宿主細胞としてＰＫ－１３細胞（ＡＴＣＣから購入）を用い、これを１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地（以下、「血清培地」と呼ぶ。後述の実施例でも同様。）で、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて、７５ｃｍ2底面積、容量１５ｍＬの組織培養用フラスコ（以下、「フラスコ」と呼ぶ。後述の実施例でも同様。）を用いて継代培養した。このフラスコ内での宿主細胞の細胞数を２４時間ごとに測定し、対数増殖期の倍加時間を計測したところ、１７時間であった。また最も多い細胞数となった日とその前後の日の細胞数の平均値をコンフルエント時の宿主細胞の細胞密度として計測したところ、２．０×１０7細胞／フラスコであった。
　次いで、上記フラスコからＰＫ－１３細胞を剥がし、新しいフラスコに、コンフルエント時の細胞密度の１／５００（４．０×１０4細胞／フラスコ）、１／２００（１．０×１０5細胞／フラスコ）、及び１／４０（５．０×１０5細胞／フラスコ）の細胞密度の宿主細胞を、１５ｍＬの血清培地とともに分注した。各細胞密度の条件につき６フラスコずつ分注した。次いで、当該各フラスコにＰＰＶをＭＯＩ＝０．０１となるよう接種し、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて培養した。培養容器内で上記のようにして感染させると、シードウイルスは２時間以内に宿主細胞に感染し取り込まれた。このときいったん培養液中からはパルボウイルスが姿を消し、いわゆる暗黒期（Eclipse）に入った。このとき一部の細胞がパルボウイルスに感染した状態であった。その後、一部の細胞はパルボウイルス感染により死滅へ導かれたものの、驚くべきことに全体の細胞数は増加していった。
　感染開始後、８５時間（倍加時間の５倍）、１０２時間（同６倍）、１１９時間（同７倍）、１３６時間（同８倍）、１５３時間（同９倍）、１８７時間（同１１倍）培養した時点で１フラスコずつ培養上清を回収した。回収した培養上清を、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清画分を０．４５μｍフィルター（ナルゲン製）で濾過した。
　ＰＰＶ感染価を、９６ウエルプレートを用いて、赤血球凝集素反応を利用した感染判定法でＴＣＩＤ50法で測定した。５０％感染価の計算は、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法（医科ウイルス学、２０００.南江堂.１７１－１７２）で行った。その結果を表１に示す。表１に示すように得られたウイルスの感染価は、１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高い感染価であることがわかった。（表１の数値は、感染価を対数値で表示している。例えば、８．１とは、１０8.1ＴＣＩＤ50／ｍＬのことを示す）。
　さらに、不純物蛋白質濃度をＢｉｏＲａｄ社のプロテインアッセイ試薬（ブラッドフォード法）で測定し、ＰＰＶ感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比を求めた。その結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［比較例１］
　実施例１と同様にしてＰＫ－１３細胞を継代培養し、倍加時間及びコンフルエント時の細胞密度を測定したところ、倍加時間＝１７時間、コンフルエント時の細胞密度＝２．０×１０7細胞／フラスコ）であった。次いで、新しいフラスコに、コンフルエントの細胞密度の１／２０００（１．０×１０4細胞／フラスコ）、１／４（５．０×１０6細胞／フラスコ）、１／２．６５（７．５×１０6細胞／フラスコ）、１／２（１．０×１０7細胞／フラスコ）、及び１／１（２．０×１０7細胞／フラスコ）の細胞密度の宿主細胞を、１５ｍＬの血清培地とともに、各細胞密度の条件につき６フラスコずつ分注した。次いで、当該各フラスコにＰＰＶをＭＯＩ＝０．０１となるよう接種し、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて培養した。感染開始後、８５時間（倍加時間の５倍）、１０２時間（同６倍）、１１９時間（同７倍）、１３６時間（同８倍）、１５３時間（同９倍）、１８７時間（同１１倍）培養した時点で１フラスコずつ培養上清を回収した。回収した培養上清を、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清画分を０．４５μｍフィルター（ナルゲン製）で濾過した。
　ＰＰＶ感染価を、９６ウエルプレートを用いて、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表３に示す。表３に示すように、いずれの条件下でも感染価１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上にはならなかった。
　さらに、実施例１と同様にしてＰＰＶ感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比を求めた。その結果を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例２］
　実施例１と同様にしてＰＫ－１３細胞を継代培養し、倍加時間及びコンフルエント時の細胞密度を測定したところ、倍加時間＝１７時間、コンフルエント時の細胞密度＝２．０×１０7細胞／フラスコであった。次いで、新しいフラスコに、コンフルエントの細胞密度の１／４０（５．０×１０5細胞／フラスコ）の細胞密度の宿主細胞を、１５ｍＬの血清培地とともに、各細胞密度条件につき４フラスコずつ分注した。次いで、当該各フラスコにＰＰＶをＭＯＩ＝０．０００１、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１となるよう接種し、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて培養した。感染開始後、１１９時間（倍加時間の７倍）、１３６時間（同８倍）、１５３時間（同９倍）、１８７時間（同１１倍）培養した時点で１フラスコずつ培養上清を回収した。回収した培養上清を、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清画分を０．４５μｍフィルター（ナルゲン製）で濾過した。
　ＰＰＶ感染価を、９６ウエルプレートを用いて、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表５に示す。表５に示すように、いずれのＭＯＩでも、得られたウイルスの感染価は１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高い感染価であることがわかった。
　さらに、実施例１と同様にしてＰＰＶ感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比を求めた。その結果を表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例３］
　実施例１と同様にしてＰＫ－１３細胞を継代培養し、倍加時間及びコンフルエント時の細胞密度を測定したところ、倍加時間＝１７時間、コンフルエント時の細胞密度＝２．０×１０7細胞／フラスコであった。次いで、新しいフラスコに、コンフルエントの細胞密度の１／６００（３．４×１０4細胞／フラスコ）、１／４００（５．０×１０4細胞／フラスコ）及び１／８０（２．５×１０5細胞／フラスコ）の細胞密度の宿主細胞を、１５ｍＬの血清培地とともに、各細胞密度条件につき１２フラスコずつに分注した。次いで、当該各フラスコを３７℃、５％ＣＯ2環境下にて１７時間培養し、細胞数が２倍に増えた時点で、ＰＰＶをＭＯＩ＝０．０１（６フラスコ）及び０．００３（６フラスコ）となるよう接種し、培養を継続した。感染開始後、８５時間（倍加時間の５倍）、１０２時間（同６倍）、１１９時間（同７倍）、１３６時間（同８倍）、１５３時間（同９倍）、１８７時間（同１１倍）培養した時点で１フラスコずつ培養上清を回収した。回収した培養上清を、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清画分を０．４５μｍフィルター（ナルゲン製）で濾過した。
　ＰＰＶ感染価を、９６ウエルプレートを用いて、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表７に示す。表７に示すように、ウイルス感染価は１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高い感染価であることがわかった。
　さらに、実施例１と同様にしてＰＰＶ感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比を求めた。その結果を表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例４］
　実施例１と同様にＰＫ－１３細胞を継代培養し、倍加時間及びコンフルエント時の細胞密度を測定したところ、倍加時間＝１７時間、コンフルエント時の細胞密度＝２．０×１０7細胞／フラスコであった。次いで、新しいフラスコに、コンフルエントの細胞密度の１／８０（２．５×１０5細胞／フラスコ）及び１／６０（３．４×１０5細胞／フラスコ）の細胞密度の宿主細胞を、１５ｍＬの血清培地とともに、各細胞密度条件につき２フラスコずつに分注した。次いで、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて１７時間培養し、細胞数が２倍に増えた時点で、ＰＰＶをＭＯＩ＝０．０１となるよう接種し、培養を継続した。感染開始後、４日後（９６時間後）に培養上清を除去し、フラスコ底面の細胞を、血清を加えていないＤＭＥＭ培地（以下、「無血清培地」という。）で洗浄したのち、１０ｍＬの無血清培地を添加し、さらに培養を行い、約１日後（感染開始から１１９時間後＝倍加時間の７倍）、又は約２日後（感染開始から１３６時間後＝同８倍）に１フラスコずつ上記無血清培地の培養上清を回収した。回収した無血清培養上清を、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清画分を０．４５μｍフィルター（ナルゲン製）で濾過した。
　無血清ＰＰＶ感染価を、９６ウエルプレートを用いて、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表９に示す。表９に示すように、いずれの条件でもウイルス感染価は１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高い感染価であることがわかった。
　さらに、実施例１と同様にしてＰＰＶ感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比を求めた。その結果を表１０に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［実施例５］
　ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の宿主細胞として汎用的に使用されているブタ腎臓由来の株化細胞であるＥＳＫ細胞（Vet.Microbiol. 1984.9(2):187-92.、Microbiologica.1987.10(3):301-9.、Nippon Juigaku Zasshi. 1988.50(3):803-8、Nippon Juigaku Zasshi. 1990.52(2):217-24、J.Vet.Med.Sci.1992.54(2):313-8）をＰＫ－１３細胞に代えて使用したことを除き、実施例１と同様の培養条件で継代培養した。倍加時間及びコンフルエント時の細胞密度を計測したところ、それぞれ２０時間、３．０×１０7細胞／フラスコであった。
　フラスコからＥＳＫ細胞を剥がし、新しいフラスコに、コンフルエントの細胞密度の１／５００（６．０×１０4細胞／フラスコ）、１／３００（１．０×１０5細胞／フラスコ）、１／２００（１．５×１０5細胞／フラスコ）、１／４０（７．５×１０5細胞／フラスコ）、１／３０（１．０×１０6細胞／フラスコ）、及び１／２０（１．５×１０6細胞／フラスコ）の細胞密度の宿主細胞を、１５ｍＬの血清培地とともに、各細胞密度条件につき６フラスコずつ分注した。次いで、当該各フラスコにＰＰＶをＭＯＩ＝０．０１となるよう接種し、実施例１と同様の培養条件で培養した。感染開始後、１００時間（倍加時間の５倍）、１２０時間（同６倍）、１４０時間（同７倍）、１６０時間（同８倍）、１８０時間（同９倍）、２２０時間（同１１倍）培養した時点で１フラスコずつ培養上清を回収した。回収した培養上清を、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清画分を０．４５μｍフィルター（ナルゲン製）で濾過した。
　ＰＰＶ感染価を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表１１に示す。表１１に示すように、いずれの条件でもウイルス感染価は１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高い感染価であることがわかった。
　さらに、実施例１と同様にしてＰＰＶ感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比を求めた。その結果を表１２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
［比較例２］
　実施例１と同様にしてＰＫ－１３細胞を継代培養し、倍加時間及びコンフルエント時の細胞密度を測定したところ、倍加時間＝１７時間、コンフルエント時の細胞密度＝２．０×１０7細胞／フラスコであった。新しいフラスコに、コンフルエントの細胞密度の１／４０（５×１０5細胞／フラスコ）の細胞密度の宿主細胞を、１５ｍＬの血清培地とともに、各細胞密度条件につき４フラスコずつ分注した。次いで、当該各フラスコにＰＰＶをＭＯＩ＝０．０００１、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１となるよう接種し、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて培養した。感染開始後、５１時間（倍加時間の３倍）、６８時間（同４倍）、２０４時間（同１２倍）、２３８時間（同１４倍）培養した時点で１フラスコずつ培養上清を回収した。回収した培養上清を、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清画分を０．４５μｍフィルター（ナルゲン製）で濾過した。
　ＰＰＶ感染価を、９６ウエルプレートを用いて、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表１３に示す。表１３に示すように、いずれの条件下でも感染価１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上にはならなかった。
　さらに、実施例１と同様にしてＰＰＶ感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比を求めた。その結果を表１４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
［比較例３］
　実施例１と同様にしてＰＫ－１３細胞を継代培養し、倍加時間及びコンフルエント時の細胞密度を測定したところ、倍加時間＝１７時間、コンフルエント時の細胞密度＝２．０×１０7細胞／フラスコであった。新しいフラスコに、コンフルエントの細胞密度の１／４０（５．０×１０5細胞／フラスコ）の細胞密度の宿主細胞を、１５ｍＬの血清培地とともに、各細胞密度条件につき６フラスコずつ分注した。次いで、当該各フラスコにＰＰＶをＭＯＩ＝０．００００１、１．０となるよう接種し、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて培養した。感染開始後、８５時間（倍加時間の５倍）、１０２時間（同６倍）、１１９時間（同７倍）、１３６時間（同８倍）、１５３時間（同９倍）、１８７時間（同１１倍）培養した時点で１フラスコずつ培養上清を回収した。回収した培養上清を、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清画分を０．４５μｍフィルター（ナルゲン製）で濾過した。
　ＰＰＶ感染価を、９６ウエルプレートを用いて、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表１５に示す。表１５に示すように、いずれの条件下でも感染価１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上にはならなかった。
　さらに、実施例１と同様にしてＰＰＶ感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比を求めた。その結果を表１６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
［比較例４］
　実施例５と同様にしてＥＳＫ細胞を継代培養し、倍加時間及びコンフルエント時の細胞密度を測定したところ、（倍加時間＝２０時間、コンフルエント時の細胞密度＝３．０×１０7細胞／フラスコであった新しいフラスコに、コンフルエントの細胞密度の１／２０００（１．５×１０4細胞／フラスコ）、１／４（７．５×１０6細胞／フラスコ）、１／２．６５（１．１×１０7細胞／フラスコ）、１／２（１．５×１０7細胞／フラスコ）、及び１／１（３．０×１０7細胞／フラスコ）の細胞密度の宿主細胞を、１５ｍＬの血清培地とともに、各細胞密度の条件につき６フラスコずつ分注した。次いで、当該各フラスコにＰＰＶをＭＯＩ＝０．０１となるよう接種し、実施例５と同様にして培養した。感染開始後、１００時間（倍加時間の５倍）、１２０時間（同６倍）、１４０時間（同７倍）、１６０時間（同８倍）、１８０時間（同９倍）、２２０時間（同１１倍）培養した時点で１フラスコずつ培養上清を回収した。回収した培養上清を、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清画分を０．４５μｍフィルター（ナルゲン製）で濾過した。
　ＰＰＶ感染価を、９６ウエルプレートを用いて、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表１７に示す。表１７に示すように、いずれの条件下でも感染価１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上にはならなかった。
　さらに、実施例１と同様にしてＰＰＶ感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比を求めた。その結果を表１８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　本発明の方法により、適切な純度の１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルス溶液が得られる。これは、抗ウイルス薬探索などのウイルス研究材料の調製や、生物製剤（医薬品）製造工程におけるウイルスクリアランス安全性評価に使用するウイルスの調製、またワクチン生産などに利用することができる。
　本出願は、２０１２年１１月２２日に出願された日本国特許出願第２０１２－２５６８０１号に基づく優先権を主張するものであり、この内容はここに参照として組み込まれる。

Claims (17)

  1. 　培養基材中で宿主細胞とパルボウイルスのシードウイルスとを培養することにより、培養上清中に１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のパルボウイルスを生産する方法であって、
    （ａ）前記培養における宿主細胞の対数増殖期の倍加時間及びコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度を事前に別途算出しておく工程と、
    （ｂ）工程（ａ）において事前に算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／５００～１／２０の細胞密度の宿主細胞と培地とを含む前記培養基材に、パルボウイルスのシードウイルスを感染多重性（ＭＯＩ）が０．０００１～０．１となるように接種する工程と、
    （ｃ）工程（ｂ）の宿主細胞とパルボウイルスとを含む培養物を工程（ａ）において事前に算出した倍加時間の５～１１倍の時間培養する工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）の培養により得られるパルボウイルスを含む培養上清を回収する工程とを含む、方法。
  2. 　前記宿主細胞が、接着依存性細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記宿主細胞が、パルボウイルスに感受性がある細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記パルボウイルスが、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ラットウイルス（ＲＶ）、Ｈ－１ウイルス（Ｈ－１）、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、又はウシパルボウイルス（ＢＰＶ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記工程（ｂ）において、工程（ａ）において事前に算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／３００～１／３０の細胞密度の宿主細胞と培地とを含む前記培養基材に、前記パルボウイルスのシードウイルスを感染多重性（ＭＯＩ）が０．０００１～０．１となるように接種する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記工程（ｂ）において、工程（ａ）において事前に算出したコンフルエントに増殖したときの宿主細胞の細胞密度の１／２００～１／４０の細胞密度の宿主細胞と培地とを含む前記培養基材に、前記パルボウイルスのシードウイルスを感染多重性（ＭＯＩ）が０．０００１～０．１となるように接種する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記感染多重性（ＭＯＩ）が、０．００１～０．０３である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記感染多重性（ＭＯＩ）が、０．００３～０．０１である、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記培地が血清培地であるとき、工程（ｃ）において、該血清培地を無血清培地に交換する工程を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記工程（ｃ）において、工程（ａ）において事前に算出した倍加時間の６～９倍の時間培養する、請求項１～９のいずれか１項に記載のパルボウイルス生産方法。
  11. 　前記工程（ｃ）において、工程（ａ）において事前に算出した倍加時間の７～８倍の時間培養する、請求項１０に記載のパルボウイルス生産方法。
  12. 　前記工程（ｃ）において、前記培養物を３３℃以上３９℃以下の温度で培養する、請求項１～１１のいずれか１項に記載のパルボウイルスの生産方法。
  13. 　前記工程（ｃ）において、前記宿主細胞と前記ウイルスが同時進行で増殖する、請求項１～１２のいずれか１項に記載のパルボウイルスの生産方法。
  14. 　前記工程（ｄ）において、前記培養上清に含まれる遊離の宿主細胞と宿主細胞の破片とを除去する工程を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記除去工程が、孔径０．２μｍ～０．４５μｍの膜濾過を用いて行われる、請求項１４に記載の方法。
  16. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法によって得られる、１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の感染価のパルボウイルスを含む培養液。
  17. 　１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の感染価のパルボウイルスを含み、かつ、前記パルボウイルスの感染価（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）と不純物蛋白質濃度（ｎｇ／ｍＬ）との比が１０：１～５０００：１である、細胞培養によって得られるパルボウイルス溶液。
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