KR101624089B1

KR101624089B1 - 고감염가의 파보바이러스의 생산 방법

Info

Publication number: KR101624089B1
Application number: KR1020157005524A
Authority: KR
Inventors: 고이치로 야나기다
Original assignee: 아사히 가세이 메디컬 가부시키가이샤
Priority date: 2012-11-22
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2016-05-24
Also published as: KR20150038568A; WO2014080676A1; CN104812893A; JPWO2014080676A1; EP2924114B1; SG11201503854UA; JP5980947B2; CN104812893B; US9809800B2; EP2924114A4; EP2924114A1; US20150299668A1

Abstract

고감염가의 파보바이러스를 안정적으로 또한 용이하게 생산하는 방법을 제공한다.
컨플루언트로 증식했을 때의 세포 밀도의 1/500∼1/20의 세포 밀도의 숙주 세포와 배지를 포함하는 배양 기재에, 감염 다중성이 0.0001∼0.1이 되도록 파보바이러스의 시드 바이러스를 접종하고, 숙주 세포의 배가 시간의 5∼11배의 시간 배양하고, 배양 상청을 회수하는 공정을 포함하는, 배양 상청 중에 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스를 생산하는 방법에 의해 상기 과제를 해결한다.

Description

고감염가의 파보바이러스의 생산 방법{METHOD FOR PRODUCING PARVOVIRUS HAVING HIGH INFECTIVITY TITER}

본 발명은, 배양 상청 중에 고감염가의 파보바이러스를 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 얻어지는 고감염가의 파보바이러스 용액에 관한 것이다.

바이러스는 인간을 포함하여 많은 동식물이나 미생물에 감염하여 증폭한다. 어떤 것은 DNA를 게놈으로서 갖는 DNA 바이러스이고, 또 어떤 것은 RNA를 게놈으로서 갖는 RNA 바이러스이고, 각 바이러스는, 각각에 상이한 증식 기구를 갖는다. 인간 등의 동물에 감염한 경우에, 바이러스 감염증을 야기하는 바이러스도 많다. 바이러스는 단독으로는 증가할 수 없고, 다른 동물·식물·미생물의 세포에 감염하여, 그 세포의 능력을 이용하여 증가할 수 있다. 바이러스가 감염하여 증식할 수 있는 세포를, 그 바이러스의 「숙주 세포」라고 한다. 바이러스가 감염·증식할 수 있는 숙주 세포의 종류는 바이러스의 종류마다 정해져 있다.

파보바이러스는 소형의 단일쇄 DNA 바이러스이고, 직경 약 20 nm로 작은 정20면체 바이러스로 엔빌로프를 갖지 않는다(비특허문헌 1). 파보바이러스는, 동물에 감염함으로써 질환을 야기한다. 상기 질환으로는, B19 파보바이러스가 인간에 야기하는 전염성 홍반이나 빈혈, 관절염 외에, 원숭이 파보바이러스(SPV)에 의한 빈혈, 고양이 파보바이러스(FPV)에 의한 고양이의 장염·백혈구 감소·실조증, 개 파보바이러스(CPV)에 의한 개의 장염·심근염, 돼지 파보바이러스(PPV)에 의한 돼지의 사산, 소 파보바이러스(BPV)에 의한 소의 장염, 거위 파보바이러스(GPV)에 의한 거위의 장염·심근염, 마우스 미소 바이러스(MVM)에 의한 마우스의 장염·간염 등이 알려져 있다(비특허문헌 2, 비특허문헌 3). 파보바이러스는, 개나 고양이 같은 인간이 기르는 동물의 병의 원인을 야기하는 병원체로서 중요하다. 개에게 개 파보바이러스가 감염되면, 상술한 바와 같이 장염을 일으키고, 심한 설사나 구토를 발생하고, 사망하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 3). 고양이가 파보바이러스에 감염되면, 급성 장염이나 백혈구 감소를 일으키는 경우가 있고, 2차 감염으로 사망할 가능성도 있으며, 또한 태자나 신생자에 감염되면, 중추 신경이나 가슴샘이 장해를 받아, 운동 실조를 일으키는 경우가 있는가 하면, 사망해 버리는 경우도 있다.

파보바이러스 감염증을 막기 위해 파보바이러스의 백신에 관한 연구가 이루어지고 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2). 이들 연구에서는, 바이러스를 생산하여 사용할 필요가 있다. 많은 바이러스는, 숙주 세포를 배양하고, 이것에 바이러스를 감염시킴으로써, 증식시켜 생산할 수 있다. 바이러스를 약독화 혹은 불활화한 백신 생산도, 바이러스 생산과 동일한 순서에 의해 달성된다.

제약 업계에서는, 유전자 재조합 의약품(바이오 의약품)이나 항체 의약품 등 생물 유래의 의약품이 바이러스에 오염되어 있지 않은 것(바이러스 안전성)을 보증하기 위해, 제조 공정의 바이러스 클리어런스(제거 성능)를 평가할 필요가 있다. 그 때문에 각 공정 전의 의약품 중간 제품에 바이러스를 첨가하여 공정 전후의 바이러스량을 정량함으로써, 개개의 공정이 갖는 바이러스 클리어런스의 측정이 행해지고 있다. 특히, 생물 제제의 제조 공정의 바이러스 클리어런스 평가에 사용되는 바이러스 종류의 선택 방법에 관해 정한 ICH(International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use : 일미 EU 의약품 규제 조화 국제 회의) 가이드라인에 기재된 방법으로 실시되는 혈장 분획 제제의 바이러스 클리어런스 평가에서는, 파보바이러스의 일종인 돼지 파보바이러스(PPV : Porcine Parvovirus)가 높은 빈도로 사용되고, 바이오 의약품의 바이러스 클리어런스 평가에서는, 파보바이러스의 일종인 마우스 미소 바이러스(MVM : Minute virus of mice)가 높은 빈도로 사용되고 있다. 이와 같이, 생물 제제의 제조 공정의 바이러스 클리어런스 평가에는 높은 빈도로 파보바이러스가 사용되고 있다.

바이러스를 생산하기 위해서는, 실험 동물을 이용하는 방법, 계란을 이용하는 방법, 조직 배양·배양 세포를 이용하는 방법이 있다(비특허문헌 4). 실험 동물이나 계란을 이용하는 방법은 고비용이라는 결점이 있다. 이를 대신하는 방법이 배양 세포를 이용하는 방법이다(비특허문헌 5). 파보바이러스의 생산도, 배양 세포를 이용하는 방법으로 행해진다(특허문헌 1).

파보바이러스 등의 바이러스를 생산하기 위해서는, 숙주 세포의 배양계에 시드 바이러스를 감염시키고, 바이러스를 증식시켜 회수하는 방법이 일반적으로 행해진다. 여기서 말하는 시드 바이러스란, 바이러스 증식의 초기에 이용하는 소량의 바이러스를 「씨」로 가정한 호칭이다. 종래의 바이러스 생산에 있어서, 숙주 세포에 시드 바이러스를 감염시키는 타이밍은, 통상, 숙주 세포가 컨플루언트(confluent)에 도달하여, 단층 상태를 형성한 단계이다(비특허문헌 4, 특허문헌 3∼6). 즉, 숙주 세포를 배양 용기에 접종하고, 증식시켜, 배양 용기 저면의 전면에 숙주 세포가 증식하여 퍼진 상태에서, 시드 바이러스를 접종하는 것이 통상적인데, 그것은, 감염할 수 있는 세포가 고밀도로 존재하는 상황이, 보다 많은 바이러스를 생산하는 장을 제공하는 계이기 때문이다. 숙주 세포를 배양 용기에 접종하고 나서 이 컨플루언트의 상태로 되기까지는, 통상 2∼3일을 필요로 한다(비특허문헌 4). 이 컨플루언트 상태에서는, 숙주 세포는 정상기이고, 그 이상 증식하지 않는다. 따라서, 종래 기술은, 숙주 세포의 증식 배양 공정을 완료한 후에, 그 이상 세포 증식이 일어나지 않는 배양 환경하에서 바이러스 감염을 개시하고, 바이러스 감염에 의해 숙주 세포가 사멸하는 것과 동시 진행으로 바이러스를 배양 상청 중에 생산한다는 것이었다. 이러한 방법은, 파보바이러스에 있어서도 예외가 아니며, 컨플루언트 상태의 세포에 감염시키는 방법으로 바이러스 생산이 이루어지고(비특허문헌 6, 비특허문헌 7), 얻어지는 파보바이러스의 감염가는 10⁵∼10⁷ TCID₅₀/mL였다. 종래의 배양계에서는, 가장 세포수가 많은 상태인 컨플루언트의 상태에서 숙주 세포에 파보바이러스가 첨가되고, 첨가된 파보바이러스는 숙주 세포 내에서 증식하고, 숙주 세포의 사멸을 수반하여 증가한다. 가장 파보바이러스 감염가가 높아지는 시기에 배양 상청을 회수함으로써, 가장 고감염가의 파보바이러스 용액을 회수할 수 있다. 이 방법으로 배양 상청 중에 얻어진 파보바이러스는, 당연히 세포 배양에 제공된 배지 중에 현탁된 상태로 회수된다.

또한, 상기한 바와 같이 하여 얻어진 파보바이러스 용액에 관해, 불순물을 제거하는 것도 행해진다. 제거 방법으로서, 저속 원심 분리에 의해 세포의 파편 등의 불순물을 제거하는 것이 행해진다. 또한, 보다 불순물을 제거하는 방법으로서, 초원심 분리 기술을 이용한, 염화세슘 밀도 구배 초원심 분리나, 수크로오스 밀도 구배 초원심 분리 기술도 알려져 있다(비특허문헌 8).

특허문헌 1 : WO2007/125605호 공보 특허문헌 2 : 일본 특허 공표 평10-508485호 공보 특허문헌 3 : 일본 특허 공개 제2009-297036호 공보 특허문헌 4 : 일본 특허 제2655876호 공보 특허문헌 5 : 일본 특허 공개 소58-22008호 공보 특허문헌 6 : 일본 특허 공개 소61-24370호 공보

비특허문헌 1 : 바이러스·세균 감염 new 파일 1997 나가이 요시유키·와타나베 하루오편, 요도샤 : p.68 비특허문헌 2 : 바이러스학 1997 하타나카 마사카즈편, 아사쿠라 서점 : 222-223 비특허문헌 3 : M. Azetaka et. al 1980 Jpn. J. Vet. Sci. 43 : 243-255 비특허문헌 4 : 바이러스 실험학 총론 국립 예방 위생 연구소 학우회편 1973 : 61-180 비특허문헌 5 : Gregersen, J. P. Pharmazeutische Biotechnologie, Kayser 및 Muller(편) 2000 257-281 비특허문헌 6 : P. A. Bachmann 1972 Proc. Soc. Exp. Biol. Med.(140)4 : 1369-1374 비특허문헌 7 : P. A. Bachmann et al. 1976 Zbl. Vet. Med. B. No.23 : 355-363 비특허문헌 8 : 바이러스 실험학 각론 1973 국립 예방 위생 연구소 학우회편 22-23

상기한 바와 같이, 생물 유래의 의약품의 바이러스 안전성 평가나 백신 생산에 사용하기 위해, 높은 감염가의 파보바이러스를 생산할 것이 요구되고 있다.

또한, 상기 서술한 생물 제제의 제조 공정의 바이러스 클리어런스 평가에서도, 높은 감염가의 바이러스를 생산할 것이 요구되고 있다. 상기 평가를 위한 바이러스 제거 필터의 바이러스 클리어런스 시험은, 실생산 공정을 스케일 다운한 모델 공정에서 실시되는데, 이 바이러스 클리어런스 시험에 요구되는 점은, 첫째로, 필터의 눈막힘이 생기지 않는 정도의 바이러스 현탁액 첨가량일 것과, 둘째로, 평가하는 공정의 바이러스 클리어런스 수치인 대수 제거율(LRV)이 4 이상인 것을 나타낼 수 있는 첨가량일 것이다. 전자에 관해서는, 공정의 유속을 포함한 여러 파라미터가 실생산 공정과 동일해야 하기(WHO Technical Report, Series No.924, 2004 162-165) 때문에, 바이러스 첨가에 의한 눈막힘이 생기지 않는 첨가량으로 할 필요가 있다. 그러기 위해서는, 체적비로 1% 이하, 바람직하게는 0.1% 이하의 첨가가 바람직하다. 후자의 LRV에 관해서는, 4 이상인 공정이, 바이러스 제거에 관해 견뢰성을 갖고 효과적이고 신뢰성이 있는 공정(A Robust, effective and reliable process step)인 것으로 간주되는 점에서(WHO Technical Report, Series No.924, 2004 163-164), 4 이상을 결과로서 낼 수 있는 바이러스 첨가량으로 할 필요가 있다. 이와 같이, 바이러스 제거 성능으로서 LRV가 4 이상인 것을 나타낼 필요가 있고, 또한 중간 제품에 첨가하는 바이러스 현탁액의 양은 체적비로 1% 이하, 바람직하게는 0.1%가 바람직하다. 그러나, 종래의 배양법으로 얻어지는 낮은 감염가의 파보바이러스(감염가는 10⁵∼10⁷ TCID₅₀/mL, 파보바이러스의 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비가 10 미만 : 1)를 1% 또는 0.1% 첨가한 경우에는, 프리필터에서의 손실이나, 정량 오차의 문제로부터 LRV가 4 이상인 것을 나타내기 어려워진다. 이 때 LRV가 4 이상인 것을 확실하게 나타내기 위해서는, 바이러스 첨가 체적을 증가시켜야 하고, 그렇게 하면 필터의 눈막힘 등의 폐해가 발생하기 쉬워지는 문제가 있다.

또한, 종래, 이러한 문제를 해결하기 위해, 밀도 구배 초원심이나 수크로오스 밀도 구배 초원심 등의 초원심 분리에 의해 바이러스를 침전시켜 농축하는 수법이 가능했다. 그러나, 불순물도 동시에 농축되기 때문에, 실험의 결과나, 바이러스 제거 필터 여과시에 불순물의 악영향이 생기는 문제가 있다.

또한, 밀도 구배 초원심이나 수크로오스 밀도 구배 초원심 등의 초원심 분리를 이용한 경우, 분리 정제된 바이러스는 순도가 매우 높고, 바이러스의 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비가 10000 이상 : 1이 되어, 불순물이 적음으로써 바이러스 입자가 응집되기 쉬운 문제가 있다. 만일 바이러스 입자가 응집되면, 생물 제제의 제조 공정의 바이러스 클리어런스 평가에 있어서는, 원래 바이러스가 통과하는 구멍 직경의 필터에서도 바이러스가 분리 제거되어 버리기 때문에, 바이러스 클리어런스를 과대 평가해 버리는 문제가 있다.

또한, 세슘 밀도 구배 초원심 방법이나 수크로오스 밀도 구배 초원심 등의 초원심 분리의 기술은, 조작이 매우 번잡하고 어려운 숙련 기술이 요구된다. 또한, 범용적인 초원심 분리기의 원심관의 체적에 율속이 있기 때문에 스케일 업이 곤란하므로, 일반적으로는 소규모의 실험에서밖에 행할 수 없고, 산업상 이들 정제 공정을 도입하는 것은 현실적이지 않다.

또한, 고감염가의 바이러스 현탁액을 얻기 위해, 감염 세포를 회수하고 동결 융해를 반복하여 세포를 강제적·물리적으로 파괴하여, 세포 내부에 축적된 바이러스를 회수하는 방법도 알려져 있다. 마우스 미소 바이러스 등에서 통상 행해지고 있는 바이러스 생산 방법이지만, 이 방법에서는 대량의 숙주 세포 내부의 불순물이 혼입되어 버리기 때문에, 가령 고감염가의 바이러스를 얻을 수 있다 하더라도, 상대적으로 불순물 농도가 높아지기 때문에, 바이러스를 이용할 때에, 초원심 정제 등의 번잡한 조작이 필요해져, 상기와 동일한 문제가 있다.

이와 같이, 종래의 바이러스 생산 기술을 채용하는 것은 매우 곤란하여, 초원심 분리 등의 복잡한 조작을 이용하지 않고, 보다 간편하고 효율적으로, 적절한 순도의 고감염가의 파보바이러스 용액을 얻는 방법이 요구되고 있다.

본 발명자들은, 상기한 과제를 해결하기 위해, 파보바이러스의 숙주 세포를 배양하고, 그곳에 파보바이러스의 시드 바이러스를 접종하여, 파보바이러스를 증식시키는 배양계에서의 여러 조건(초기 숙주 세포 밀도나 감염 다중성(MOI))과 바이러스 감염가의 관계에 관해 예의 검토한 결과, 놀랍게도, 종래 채용되지 않았던 매우 낮은 특정 범위의 세포 밀도의 숙주 세포에, 특정 범위의 낮은 MOI로 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염시키고, 또한, 특정 기간 숙주 세포를 배양하여 배양 상청을 회수함으로써, 파보바이러스 특유의 증식 기구를 이용하여, 종래법으로는 얻어지지 않은 매우 높은 감염가의 파보바이러스 용액이 얻어지는 것을 발견하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 하기와 같다.

[1]

배양 기재 중에서 숙주 세포와 파보바이러스의 시드 바이러스를 배양함으로써, 배양 상청 중에 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스를 생산하는 방법으로서,

(a) 상기 배양에서의 숙주 세포의 대수 증식기의 배가 시간 및 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도를 사전에 별도 산출해 두는 공정과,

(b) 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도의 1/500∼1/20의 세포 밀도의 숙주 세포와 배지를 포함하는 상기 배양 기재에, 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.0001∼0.1이 되도록 접종하는 공정과,

(c) 공정(b)의 숙주 세포와 파보바이러스를 포함하는 배양물을 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 배가 시간의 5∼11배의 시간 배양하는 공정과,

(d) 공정(c)의 배양에 의해 얻어지는 파보바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수하는 공정을 포함하는, 방법.

[2]

상기 숙주 세포가 접착 의존성 세포인, [1]에 기재된 방법.

[3]

상기 숙주 세포가, 파보바이러스에 감수성이 있는 세포인, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.

[4]

상기 파보바이러스가, 돼지 파보바이러스(PPV), 개 파보바이러스(CPV), 마우스 미소 바이러스(MVM), 래트 바이러스(RV), H-1 바이러스(H-1), 고양이 파보바이러스(FPV), 거위 파보바이러스(GPV), 또는 소 파보바이러스(BPV)인, [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[5]

상기 공정(b)에 있어서, 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도의 1/300∼1/30의 세포 밀도의 숙주 세포와 배지를 포함하는 상기 배양 기재에, 상기 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.0001∼0.1이 되도록 접종하는, [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[6]

상기 공정(b)에 있어서, 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도의 1/200∼1/40의 세포 밀도의 숙주 세포와 배지를 포함하는 상기 배양 기재에, 상기 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.0001∼0.1이 되도록 접종하는, [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[7]

상기 감염 다중성(MOI)이 0.001∼0.03인, [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[8]

상기 감염 다중성(MOI)이 0.003∼0.01인, [7]에 기재된 방법.

[9]

상기 배지가 혈청 배지일 때, 공정(c)에 있어서, 상기 혈청 배지를 무혈청 배지로 교환하는 공정을 포함하는, [1]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[10]

상기 공정(c)에 있어서, 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 배가 시간의 6∼9배의 시간 배양하는, [1]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 파보바이러스의 생산 방법.

[11]

상기 공정(c)에 있어서, 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 배가 시간의 7∼8배의 시간 배양하는, [10]에 기재된 파보바이러스의 생산 방법.

[12]

상기 공정(c)에 있어서, 상기 배양물을 33℃ 이상 39℃ 이하의 온도에서 배양하는, [1]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 파보바이러스의 생산 방법.

[13]

상기 공정(c)에 있어서, 상기 숙주 세포와 상기 바이러스가 동시 진행으로 증식하는, [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 파보바이러스의 생산 방법.

[14]

상기 공정(d)에 있어서, 상기 배양 상청에 포함되는 유리(遊離)의 숙주 세포와 숙주 세포의 파편을 제거하는 공정을 포함하는, [1]∼[13] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[15]

상기 제거 공정이, 구멍 직경 0.2 ㎛∼0.45 ㎛의 막여과를 이용하여 행해지는, [14]에 기재된 방법.

[16]

[1]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 감염가의 파보바이러스를 포함하는 배양액.

[17]

10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 감염가의 파보바이러스를 포함하며, 또한, 상기 파보바이러스의 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비가 10 : 1∼5000 : 1인, 세포 배양에 의해 얻어지는 파보바이러스 용액.

본 발명에 의해, 세포 배양으로 간편하고 효율적으로, 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스 용액이 얻어져, 파보바이러스 사용시의 감염가 부족에서 기인하는 폐해를 해소하는 것이 가능해진다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태(이하, 「본 실시형태」라고 함)에 관해 상세히 설명한다. 또, 본 발명은, 이하의 실시형태에 한정되지 않고, 그 요지의 범위 내에서 여러가지로 변형하여 실시할 수 있다.

본 실시형태는, 배양 기재 중에서 숙주 세포와 파보바이러스의 시드 바이러스를 배양함으로써, 배양 상청 중에 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스를 생산하는 방법으로서,

(d) 공정(c)의 배양에 의해 얻어지는 파보바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수하는 공정을 포함하는, 방법이다.

공정(a) : 우선, 파보바이러스 숙주 세포의 대수 증식기의 배가 시간 및 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도를 사전에 별도 산출한다. 한편, 숙주 세포는, 계대 배양에 의해 증식시킬 수 있다.

파보바이러스는 소형의 선형 단일쇄 DNA 바이러스이다. DNA 바이러스는, 게놈으로서 DNA를 갖는 바이러스이고, 숙주 세포의 RNA 폴리머라아제를 이용하여 게놈 DNA로부터 mRNA를 합성하고, 상기 mRNA를 바탕으로 단백질을 합성하여 증식한다. DNA 바이러스의 대부분은, 이중쇄 DNA 바이러스이지만, 파보바이러스는 선형 단일쇄 DNA를 게놈으로서 갖는다. 단일쇄 DNA의 상태에서는 바이러스 증식은 할 수 없기 때문에, 파보바이러스는, 숙주 세포의 RNA 폴리머라아제에 추가하여, DNA 폴리머라아제를 이용하여 이중쇄 DNA의 상태를 거쳐 증식한다는 특유의 증식 기구를 갖는다.

파보바이러스과(Parvoviridae) 바이러스는, 파보바이러스아과에 속하는 3가지의 속, 즉, 바이러스 복제에 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않고 숙주 세포 내에서 자율적으로 증식하는 파보바이러스속(Parvorivirus), 헬퍼 바이러스를 필요로 하는 디펜드 바이러스속(Dependovirus), 및 적혈구 특이적으로 감염하는 에리스로바이러스속(Erythrovirus)과, 덴소바이러스아과에 속하는 3가지의 속, 곤충에 감염하는 덴소바이러스속(Densovirus), 이테라바이러스속(Iteravirus), 및 브레비 덴소바이러스속(Aedes aegypti densovirus)이 알려져 있다. 본 실시형태에서의 「파보바이러스」란, 파보바이러스속의 바이러스를 말한다. 파보바이러스속의 바이러스는 유사한 증식 기구를 갖기 때문에, 본 실시형태의 방법을 공통적으로 이용할 수 있다.

본 실시형태에서의 파보바이러스(파보바이러스속 바이러스)에는, 한정하는 것은 아니지만, 돼지 파보바이러스(Porcine Parvovirus PPV), 개 파보바이러스(Canine Parvovirus CPV), 마우스 미소 바이러스(Minute Virus of Mice MVM), 래트 바이러스(Rat Virus RV), H-1 바이러스(H-1 Virus H-1), 고양이 파보바이러스(Feline Parvovirus FPV), 거위 파보바이러스(Goose Parvovirus GPV), 소 파보바이러스(Bovine Parvovirus BPV)가 포함된다. 이들 바이러스는, 유사한 크기, 게놈 구조, 바이러스 입자 구조, 증식 기구를 갖고 있고, 모두 본 실시형태의 방법에 있어서 적합하게 사용 가능하다.

본 실시형태에서의 「숙주 세포」는, 상기한 파보바이러스에 감수성이 있는(파보바이러스에 감염될 수 있는) 세포이면 그 종류에 한정되지 않는다. 파보바이러스에 감수성이 있는 세포로는, 예컨대, 돼지 파보바이러스에 감수성이 있는 PK-13 세포, PK-15 세포, LCC-PK1 세포, ESK(embryonic swine kidney) 세포, SK 세포, ST(swine testes) 세포 및 MPK(Minipig kidney) 세포, 개 파보바이러스에 감수성이 있는 MDCK(Mardin-Darby canine kidney) 세포, FEA(feline embryonic fibroblasts) 세포, CRFK(Crandell feline kidney) 세포 및 FK-81 세포(embryonic feline kidney), 마우스 미소 바이러스에 감수성이 있는 A9(mouse fibroblast) 세포 및 C6(rat glial) 세포, 래트 바이러스에 감수성이 있는 NRK(normal rat kidney) 세포, H-1 바이러스에 감수성이 있는 Molt-4(human T-cell) 세포, AV-1(human B-cell) 세포 및 NC-37(human B-cell) 세포, 고양이 파보바이러스에 감수성이 있는 CRFK 세포, Mya 1 세포, NLFK(Norden Laboratories Feline Kidney) 세포 및 A72 세포, 거위 파보바이러스에 감수성이 있는 GEF(goose embryo fibroblast) 세포, 소 파보바이러스에 감수성이 있는 BEK(bovine embryonic kidney) 세포, 버펄로 폐섬유 아세포 및 EBTr(bovine embryonic trachea) 세포 등을 들 수 있다. 숙주 세포는, 바람직하게는, 감염에 의해 세포 변성을 일으키는 세포를 이용할 수 있다. 예컨대, 돼지 파보바이러스의 경우는 돼지의 신장 세포, 개 파보바이러스의 경우는 개의 신장 세포를 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않고, 상기한 바와 같이, 파보바이러스에 대하여 감수성이 있고, 적합하게는 세포 변성을 일으키는 세포이면 널리 적용 가능하다. 또한, 본 실시형태에 있어서, 「숙주 세포」로는, 무한 증식능을 가진 동물 세포를 이용할 수 있고, 일반적으로 「세포주(Cell line)」라고 불리는 것을 이용할 수 있다.

본 실시형태에 있어서, 숙주 세포는, 접착 의존성 세포인 것이 바람직하다. 「접착 의존성 세포」란, 근세포나 장기 세포와 같이 배양 기질에 접착한 상태가 아니면 생존·증식할 수 없는 세포이다. 접착 의존성 세포는, 배양 플라스크 등의 배양 기재의 저면·벽면이나, 마이크로캐리어라고 불리는 담체에 부착시켜 배양된다. 플라스크나 샬레는 일반적으로 작은 스케일의 배양에 이용된다. 마이크로캐리어를 이용한 배양은, 축차 스케일 업이 용이한 이점이 있다(일본 특허 제3982843호 다공질 담체를 이용한 동물 세포의 축차 배양 방법). 또한, 본 실시형태에 있어서, 부유성 세포를 이용할 수도 있다. 「부유성 세포」는, 부유 상태로 증식하고, 배지 중에 현탁시킨 상태로 정치 또는 교반하여 배양된다. 부유성 세포에서는, 배양 상청을 회수하기 전에 배지 교환을 행하기 어려워지기 때문에, 예컨대 마이크로캐리어에 부착시켜 배양하는 것이 바람직하다.

본 실시형태에 있어서 「배양 기재」는, 그 종류가 한정되지 않고, 배양 용기, 배양 플라스크, 샬레, 롤러 보틀, 배양 플레이트 등, 세포 배양에서 통상 이용되는 임의의 배양 기재가 포함된다.

배양은, 적합하게는 둘베코 개변 이글 배지(DMEM 배지)를 이용하여, 5% 정도의 이산화탄소 가스 환경하에서 행할 수 있지만, 숙주 세포의 증식에 알맞은 환경 배양 조건이면, 이것에 한정되는 것은 아니다. 배양 온도는, 숙주 세포의 증식에 알맞은 온도로 할 수 있다. 파보바이러스의 숙주 세포는 33℃∼39℃의 범위에서 증식하는 것이 알려져 있기 때문에(「동물 세포 배양법 입문(생물 화학 실험법 29) 마츠타니 유타카저/학회 출판 센터」 p.14-15), 바람직하게는, 배양 온도는 33℃ 이상 39℃ 이하, 예컨대 약 37℃로 할 수 있다. 또, 세포 증식 인자를 포함하는 동물 혈청(소태아 혈청이나 송아지 혈청, 말 혈청 등)을 10% 이하의 비율로 포함하는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에서는 바이러스의 생산량이 저하되기 때문에, 혈청 배지에서 세포의 증식이 필요 충분량 행해진 후에, 바이러스 회수 전에 배지를 무혈청 배지로 교환하는 수법을 채용하는 것도 가능하다.

본 실시형태에 있어서 「감염가」란, 바이러스 감염 역가를 나타내는 단위이다. 바이러스 업계에서 종종 사용되는 「타이터(Titer)」와 동일한 의미이다. 바이러스는 광학 현미경을 이용해서도 볼 수 없기 때문에, 생물 세포와 같이 현미경으로 밀도(개수/체적)를 계측할 수 없다. 따라서, 바이러스의 경우는 숙주 세포에 대한 감염능을 이용한 감염 역가를 단위로 하여, 그 양이나 농도의 대체로 한다. 예컨대, 숙주 세포의 단층에 대하여 적당한 배율로 희석한 바이러스 현탁액을 첨가하면, 바이러스의 개수가 플라크로서 검출되고, 플라크 형성 단위(plaque forming unit=pfu)/mL로서 감염 역가를 측정할 수 있다. 혹은, 바이러스가 포함되어 있는 액체의 희석을 진행시켜 나가, 숙주 세포에 대한 감염 양성을 발생하는 비율이 50%가 되는 농도를 50% 감염량(tissue culture infectious dose=TCID₅₀)/mL로 하여 감염 역가를 측정할 수 있다. 본 실시형태에 있어서, 사용하는 파보바이러스는 모두 TCID₅₀/mL로서 감염 역가를 측정할 수 있고, TCID₅₀/mL로서 감염 역가를 표기한다. 또, pfu/mL 등의 다른 단위에 의해 파보바이러스의 감염 역가를 표시해도 좋다. 다른 단위로 감염 역가를 측정할 수 있는 파보바이러스에 있어서는, 동일한 파보바이러스 현탁액을 동시에 쌍방의 단위로 감염 역가 측정함으로써, 상이한 단위 사이의 환산을 용이하게 실시할 수 있다.

본 실시형태에 있어서 「대수 증식기에서의 배가 시간」이란, 대수 증식기에 숙주 세포가 2배로 증가하는 데 필요로 하는 시간이다. 세포의 증식 곡선은 대수 증식기·정상기·사멸기로 추이한다. 대수 증식기에서는, 세포는 일정한 속도로 세포 분열을 반복하여 증식한다. 배가 시간은 세포의 종류·혈청 농도 등의 배지 조건·배양 온도 등의 배양 조건에 따라 상이하다. 대수 증식기에서의 배가 시간은, 배양 시간을 t, 초기 세포수를 C1, 배양 후 세포수를 C2로 했을 때, 하기 식으로 산출할 수 있다.

배가 시간(시간)=0.301t/log10[C2/C1]

증식이 진행되면, 결국 세포는 배양 용기 내에서 세포수가 상한에 도달한다. 영양분의 부족이나 노폐물의 축적, pH의 저하 등에 의해 증식이 정지되는 시기로, 정상기라고 한다. 이 때, 접착 의존성 세포는 배양 용기 표면을 뒤덮는 밀집 상태가 되고, 이 상태를 「컨플루언트」라고 한다. 컨플루언트에 도달했을 때의 세포수(밀도)를 구하기 위해서는, 배양 용기에 세포를 접종한 후에, 24시간마다 세포를 회수하고 세포수를 계측하여, 상한에 도달했을 때의 세포수(밀도)를 얻으면 된다.

본 실시형태에 있어서, 숙주 세포가 컨플루언트로 증식했을 때의 세포수 또는 세포 밀도는 다음과 같이 정의한다. 우선, 배양 플라스크 등의 배양 기재에 숙주 세포를 접종한 후, 계대 배양을 행하고, 24시간마다 세포수를 측정하여, 각 24시간의 배가 시간을 계산한다. 24시간마다의 세포수 측정은, 대수 증식기의 배가 시간보다 배가 시간이 5배 이상으로 길어진 날의 다음날까지 측정하여 종료로 하지만, 세포수가 2일 연속으로 감소했을 때도 계측 종료로 한다.

그리고 가장 많은 세포수가 된 날과 그 전후의 합계 3일의 데이터의 평균치를 컨플루언트시의 세포수 또는 세포 밀도로 정의한다. 세포의 종류에 따라서는, 정상기에 도달한 후, 좀처럼 사멸기로 이행하지 않고 정상기를 길게 유지하는 것이 있다. 그 경우에는, 대수 증식기의 배가 시간과 비교하여, 배가 시간이 5배 이상으로 길어진 날을 컨플루언트 도달일로 하고, 그 날과 다음날의 세포수의 평균치를 컨플루언트의 세포수 또는 세포 밀도로 정의한다. 이 24시간마다의 세포수 계측에 이용하는 배양 기재는, 모두 동시에 동조건에서 배양을 개시한 따로따로의 배양 기재에 관해 측정하는 것으로 하고, 한번 세포수를 계측한 배양 기재에 다시 세포를 복귀시켜 다음날의 계측에 사용하지 않는다. 이것은, 세포 회수 조작에 의한, 증식의 랙타임의 영향을 회피하기 위해서이다. 측정 오차나, 배양 용기마다의 오차를 최대한 없애기 위해, 적어도 한번에 2개(n=2), 바람직하게는 3개(n=3), 더욱 바람직하게는 4개(n=4) 이상의 배양 용기를 한번에 측정한다. 컨플루언트시의 세포수 또는 세포 밀도는, 배양 기재, 배지, 세포의 종류, 배양 온도 등의 배양 조건에 따라 상이하다. 따라서, 배양 조건마다 상술한 방법으로 계측할 필요가 있다. 또, 컨플루언트에 도달하는 정상기 후, 세포는 양분 고갈 등에 의해 사멸해 간다. 이것을 사멸기라고 한다.

「계대 배양」은, 일반적으로, 대수 증식기의 후기, 60%∼80% 컨플루언트의 상태에서 행해지고, 컨플루언트에 도달하면, 접착 의존성 세포에서는 증식이 정지되어 버리기 때문에, 컨플루언트에 도달하기 전에 계대를 행할 필요가 있다(코야마 히데키 세포 배양 래버러토리 매뉴얼 Springer-Verlag Tokyo 1999 51-52). 컨플루언트에 도달하고 나서의 계대를 반복하면, 세포가 약해지거나, 성질이 변화되거나 한다. 부유성 세포의 경우, 신선한 배지에 세포를 희석하여 이어 심음으로써 계대할 수 있다. 접착 의존성 세포의 경우에는, 트립신 등의 단백질 분해 효소나 EDTA 등의 킬레이트제 또는 그 혼합액으로, 숙주 세포를 배양 용기로부터 박리하고, 세포수를 희석하여 새로운 배양 용기에 이어 심음으로써 계대된다. 계대 배양은 통상, 주에 2∼3회, 2∼12배로 희석하여 행한다. 예컨대, 개 파보바이러스의 숙주 세포인 MDCK(개 신장 세포)에서는 2∼3일마다, 2∼6배로 희석 계대한다(아키야마 테츠 등 세포·배지 활용 핸드북 요도샤 2008 45-46). 이와 같이, 바이러스의 숙주 세포의 계대 배양에 있어서는, 컨플루언트의 세포수의 60∼80%에 도달한 시기에, 컨플루언트의 세포수의 1/2∼1/12의 세포수로 희석하여 계대할 수 있다. 이 범위 내에서, 상술한 계대 빈도와의 균형에 의해, 세포마다 적절한 세포 계대 빈도와 희석 배율을 정하여 계대한다. 부유 세포 배양에 있어서도 기본적으로 동일하다.

공정(b) : 계속해서, 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도의 1/500∼1/20의 세포 밀도의 숙주 세포와 배지를 포함하는 배양 기재에, 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.0001∼0.1이 되도록 접종한다.

상기한 바와 같이, 공정(b)에 있어서, 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도의 1/500∼1/20의 세포 밀도의 숙주 세포와 배지를 포함하는 배양 기재를 조제할 필요가 있는데, 여기서는, 상기 특정한 세포 밀도의 숙주 세포를 배지를 포함하는 배양 기재에 접종하거나, 혹은 상기 특정한 세포 밀도가 되도록 배지를 포함하는 배양 기재 중에서 숙주 세포를 배양함으로써 조제한다. 또한, 배양 기재는, 바람직하게는 공정(a)에 있어서 사전에 산출한 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도의 1/300∼1/30, 보다 바람직하게는 1/200∼1/40의 세포 밀도의 숙주 세포를 포함한다.

본 실시형태에서는, 상기한 바와 같이, 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도의 1/500∼1/20이라는 매우 낮은 소정의 세포 밀도에서 감염을 개시하는 것이 중요한 특징이다. 파보바이러스의 경우, 종래의 바이러스 생산 방법의 상식인 컨플루언트 상태의 숙주 세포에 바이러스를 감염시키는 방법에서는, 숙주 세포의 증식은 보이지 않고, 숙주 세포는 감염에 의한 세포 변성을 거쳐 사멸로의 일로를 걸을 뿐이었던 반면, 본 실시형태에서의 매우 낮은 숙주 세포 밀도에서 감염을 개시함으로써, 숙주 세포 증식과 바이러스 증식을 동시 진행으로 달성하는 것에 성공했다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이러한 숙주 세포 증식과 바이러스 증식이 동시 진행으로 발생하는 것은, 파보바이러스 특유의 증식 기구에서 기인하는 것으로 생각된다. 즉, 파보바이러스는 DNA 바이러스이고, 숙주 세포 내에서 핵 내로 이행하여 DNA 복제를 행하기 때문에, 세포질 내에서 증식할 수 있는 다른 바이러스와 달리 증식이 느리기 때문에, 감염 세포를 급속히 사멸시키는 경우가 없고, 그렇기 때문에 배양계 전체로서의 세포 증가를 허용한 것으로 생각된다. 종래 기술인 컨플루언트 상태에서의 감염에서는, 숙주 세포가 대수 증식기를 끝내고 정체기에 들어가 있기 때문에, 파보바이러스의 증식이 느리다고 해도 세포 증식을 수반하는 경우는 없었다. 한편, 본 실시형태에 있어서는, 상기한 바와 같이, 파보바이러스 특유의 증식 기구를 이용하여, 숙주 세포와 바이러스가 동시 진행으로 증식하는, 「숙주 세포 증식과 파보바이러스 증식의 동시 진행 시간」(이하, 간단히 「증식 동시 진행 시간」라고도 함)을 충분히 길게 확보함으로써, 높은 감염가의 파보바이러스를 제공할 수 있다. 그리고, 그와 같은 증식 동시 진행 시간을 충분히 길게 확보하는 것을 목적으로 하여, 적절한 숙주 세포 밀도에 있어서 시드 바이러스를 감염시킨다. 감염시의 숙주 세포 밀도가 지나치게 높는 경우, 짧은 기간에 숙주 세포 밀도가 컨플루언트에 도달하여 세포 증식이 정지되기 때문에, 충분히 긴 증식 동시 진행 시간의 확보가 곤란해진다. 감염시의 세포 밀도가 지나치게 낮은 경우에도, 숙주 세포 증식 속도를 파보바이러스 증식 속도가 상회하여 세포 파괴가 진행되기 때문에 충분히 긴 증식 동시 진행 시간의 확보가 곤란해진다. 이와 같이, 본 실시형태에 있어서는, 단순히 바이러스 감염 후의 숙주 세포의 배양 시간이 아니라, 상기한 증식 동시 진행 시간에 주목하고 있다. 이러한 관점에서, 이미 설명한 바와 같이, 공정(a)에 있어서, 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도를 사전에 산출 측정한다. 그리고, 공정(a)에서 산출한 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도에 대한 비를 가지고, 공정(b)에 있어서 파보바이러스의 시드 바이러스를 접종할 때의 숙주 세포의 세포 밀도를 규정한다.

또한, 본 실시형태에 있어서, 증식 동시 진행 시간이 지나치게 짧으면, 상술한 바와 같이, 파보바이러스 증식량이 불충분해지고, 높은 감염가의 파보바이러스를 얻을 수 없다. 한편, 증식 동시 진행 시간이 필요 이상으로 긴 경우, 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 파보바이러스의 증식이 숙주 세포의 증식을 상회하여, 숙주 세포 전체가 사멸로 향하고, 세포로부터 방출된 프로테아제의 영향 등을 받아 파보바이러스는 실활되고, 감염가는 저하된다. 공정(c)에 관해 하기에 상세히 서술하는 바와 같이, 적절한 타이밍에 배양물을 회수함으로써, 증식 동시 진행 시간을 적절한 범위로 하여, 배양 상청 중에 매우 높은 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 감염가의 파보바이러스를 얻을 수 있다.

또한, 공정(b)에 있어서, 상기한 특정한 낮은 세포 밀도의 숙주 세포와 배지를 포함하는 배양 기재에, 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.0001∼0.1이 되도록 접종한다. 여기서, 「감염 다중성」이란, 숙주 세포수에 대한 바이러스의 첨가량의 비율로, 바이러스 감염가/숙주 세포수로 표시된다. 파보바이러스의 시드 바이러스의 접종은, 상기 소정의 세포 밀도의 숙주 세포를 배양 기재에 접종하는 것과 동시에 MOI가 0.0001∼0.1이 되도록 시드 바이러스를 접종해도 좋고, 보다 낮은 세포 밀도로 숙주 세포 배양을 개시하고, 상기한 소정의 세포 밀도가 된 시점에서 MOI가 0.0001∼0.1이 되도록 시드 바이러스를 접종시켜도 좋다. 파보바이러스의 감염 다중성(MOI)은, 바람직하게는 0.001∼0.03의 범위이고, 보다 바람직하게는 0.003∼0.01의 범위이다.

상기한 바와 같이, 상기 소정의 낮은 세포 밀도의 숙주 세포에 대하여, 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.0001∼0.1이 되도록 파보바이러스를 접종하여 감염을 개시하면, 파보바이러스 감염의 진행이 느리게 시작되고, 처음에는 총세포수가 증가하면서, 총파보바이러스량도 증가해 가지만, 어느 시점을 경계로 파보바이러스의 증식 속도가 숙주 세포의 증식 속도를 상회하여, 고감염가의 바이러스가 생산된다. 또, 숙주 세포에 감염한 시드 바이러스는, 숙주 세포 중에서, 숙주 세포의 기능을 빌어 스스로를 복제하고, 세포 밖으로 방출되거나, 혹은 세포 내에 머물러 있다. 바이러스에 감염된 세포는, 세포 변성을 일으키는 패턴과 일으키지 않는 패턴이 있다. 세포 변성을 일으키는 바이러스는 병독성이 있지만, 일으키지 않는 바이러스는 병독성을 나타내지 않고 지속 감염을 일으킨다. 세포 변성은 세포사를 야기한다. 본 실시형태에서는, 바이러스의 생산량이 많다는 이유에서 세포 변성을 야기하는 세포가 바람직하지만, 이것에 한정되지 않는다.

공정(c) : 파보바이러스의 시드 바이러스의 접종 후, 상기 파보바이러스와 숙주 세포를 포함하는 배양물을 소정 시간 배양한다. 공정(c)에 있어서, 숙주 세포와 파보바이러스가, 동시 진행으로 증식한다. 배양 시간은, 숙주 세포의 배가 시간의 5∼11배, 보다 바람직하게는 6∼9배, 더욱 바람직하게는 7∼8배이다. 상기한 소정 시간 배양을 행하면, 상기한 바와 같이, 숙주 세포가 세포 변성을 나타내어 사멸하고, 배양 상청 중에 대량의 파보바이러스가 배양 상청 중에 방출되기 때문에, 그 시기에 배양 상청을 회수함으로써, 상기 증식 동시 진행 시간을 적절한 범위로 하여, 고감염가의 파보바이러스의 현탁액을 얻을 수 있다. 또한, 숙주 세포의 대부분이 사멸되어 있지 않아도 배양 상청 중에 고감염가의 바이러스가 방출되는 경우도 있지만, 본 실시형태에서는 어느 방출 양식이든 상관없다. 배양 온도는, 숙주 세포의 증식에 알맞은 온도로 할 수 있고, 바람직하게는 33℃ 이상 39℃ 이하, 예컨대 약 37℃로 할 수 있다. 또한, 공정(a)에서의 배양 조건과 동일한 조건에서 배양하는 것이 바람직하다는 점에서, 공정(a)에 있어서 숙주 세포의 대수 증식기의 배가 시간 및 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도를 사전에 산출했을 때의 배양 온도와 동일한 정도의 배양 온도로 하는 것이 바람직하다.

또, 배지로서 혈청 배지를 이용한 경우, 하기 공정(d)의 배양 상청의 회수 시기의 직전 또는 사전에, 상기 혈청 배지를 무혈청 배지로 교환하고, 상기 무혈청 배지를 더욱 배양하여, 전체에서 상기 소정 시간 배양해도 좋다. 이에 따라, 회수되는 바이러스 현탁액 중의 혈청 유래의 불순물을 배제하는 것이 가능해진다. 배지 교환을 행할 때의 교환 후의 무혈청 배지 체적은, 필요에 따라 조정할 수 있다. 배지 교환의 타이밍은, 배양 상청을 회수하는 날의 1∼3일 전이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1∼2일 전이다.

공정(d) : 상기 소정 시간 배양한 후, 파보바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수한다. 또, 종래법으로서, 감염 숙주 세포를 동결 융해의 반복 등으로 감염 숙주 세포를 파괴하여, 바이러스를 회수하는 방법이 있지만, 그 때에 대량의 숙주 세포 내부의 불순물이 발생하기 때문에, 가령 고감염가의 바이러스가 얻어졌다 하더라도, 상대적으로 불순물 농도가 높아지기 때문에, 바이러스를 이용할 때에, 초원심 정제 등의 잡다한 조작이 필요해지게 된다. 한편, 본 실시형태와 같이, 배양 상청을 회수하는 방법에서도 바이러스 감염에 의해 붕괴된 숙주 세포 유래의 불순물이 혼입되지만, 본 실시형태에서는, 불순물량은 숙주 세포의 동결 융해 파괴를 행한 경우보다 현저히 적다. 따라서, 본 실시형태에서는, 높은 감염가로 파보바이러스가 배양 상청으로부터 얻어지고, 간편히 회수할 수 있다.

상기한 본 실시형태의 방법을 행함으로써, 10⁸ TCID₅₀/mL, 바람직하게는 10^8.3 TCID₅₀/mL 이상, 보다 바람직하게는 10^8.5 TCID₅₀/mL 이상의 파보바이러스 용액(배양 상청 및 불순물 제거 후의 바이러스 현탁액을 포함함)을 얻을 수 있다.

얻어진 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스 배양 상청은, 유리의 숙주 세포나 숙주 세포의 파편 등의 불순물 등을 제거하기 위해, 이미 알려진 조건에서의 저속 원심 분리에 가할 수 있다. 혹은/더욱, 구멍 직경 0.1∼0.5 ㎛, 바람직하게는 0.2∼0.45 ㎛의 막여과로 불순물을 제거할 수 있다.

또한, 이미 알려진 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용한 페그 침전법에 의해, 유리의 숙주 세포나 숙주 세포의 파편 등의 불순물을 제거할 수도 있다. PEG는 그 농도를 높여 가면, 분자량이 큰 것부터 서서히 침전시킨다. 예컨대, PEG6000을 10%, 염화나트륨을 0.5 M이 되도록 첨가하고, 4∼30℃에서 정치 또는 교반하면서 4∼40시간 지난 후에 9000∼12000 g로 20∼60분간 원심 분리함으로써, 파보바이러스를 침전시킬 수 있다. 이 때 불순물의 단백질은 상청 획분으로 오기 때문에, 불순물과 파보바이러스를 분리 정제할 수 있다. PEG 침전에는, PEG6000 이외의 각종 PEG를 이용할 수 있다.

또한, 음이온 교환 기재도 파보바이러스의 분리 정제에 적합하게 사용 가능하다. 표면에 음하전을 갖는 파보바이러스는, 음이온 교환 기재에 흡착하기 때문에, 흡착한 파보바이러스를 고염농도의 용출 버퍼로 용출시킴으로써, 불순물과 파보바이러스를 분리할 수 있다.

상기한 바와 같이, 파보바이러스의 배양·회수를 행함으로써, 파보바이러스의 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비가 10 : 1∼5000 : 1, 바람직하게는 40 : 1∼3000 : 1인 파보바이러스 용액(불순물 제거 후의 바이러스 현탁액을 포함함)을 얻을 수 있다. 「불순물」로는, 유리의 숙주 세포나 숙주 세포의 파편, 숙주 세포나 혈청 성분에서 유래되는 단백질 등을 들 수 있지만, 유리의 숙주 세포나 숙주 세포의 파편은 사이즈가 크고, 상기한 원심 분리나 여과 등의 이미 알려진 방법으로 용이하게 제거할 수 있기 때문에, 본 발명에서는, 단백질 농도를 불순물의 존재 비율을 나타내는 지표로서 이용한다.

상기한 바와 같이, 본 실시형태에 의해 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스 용액이 얻어져, 파보바이러스 사용시의 여러가지 감염가 부족에서 기인하는 폐해를 해소하는 것이 가능해진다. 이하, 대표적인 3가지 용도에 관련하여 서술한다.

첫번째 용도, 즉 바이러스를 항바이러스약 탐색 등의 연구 용도로 사용하는 경우, 불순물의 존재는, 원하는 반응을 저해하는 등의 악영향을 미칠 우려가 있다. 따라서, 실제로 시험에 제공하는 바이러스 감염가보다 높은 감염가의 바이러스를 생산해 두고, 불순물이 영향을 주지 않는 정도로까지 희석하여 연구에 사용하게 된다. 높은 바이러스 저해 활성을 측정할 수 있도록 하기 위해서는, 높은 바이러스 감염가로 시험에 제공해야 하기 때문에, 그보다 높은 감염가의 바이러스를 생산해 둘 필요가 있다. 즉, 세포 배양으로 얻어지는 바이러스의 감염가는 높은 쪽이 바람직하다. 본 실시형태에 의해, 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스 용액이 얻어짐으로써, 파보바이러스를 이용한 항바이러스약 연구에 있어서, 희석하고 나서 연구 재료로서 제공하는 것이 가능해져, 불순물에 의한 예기치 않은 반응이나 간섭을 경감하는 것이 가능해진다.

두번째 용도, 즉 생물 제제의 제조 공정의 바이러스 클리어런스를 평가하기 위해 바이러스를 생산하는 경우에도 바이러스의 감염가는 높은 쪽이 바람직하다. 상기한 바와 같이, 이 바이러스 클리어런스 시험에 요구되는 점은, 첫째로, 필터의 눈막힘이 생기지 않는 정도의 바이러스 현탁액 첨가량일 것과, 둘째로, 평가하는 공정의 바이러스 클리어런스 수치인 대수 제거율(LRV)이 4 이상인 것을 나타낼 수 있는 첨가량일 것이다. LRV 4 이상이기 위해서는, 바이러스 제거 필터 공정에 제공하는 중간 제품에 바이러스 감염화가 10⁴ TCID₅₀/mL가 되도록 바이러스를 첨가해야 하지만, 실제로는, 바이러스 감염화의 정량 오차나, 바이러스 입자의 회합체를 제거하는 프리필터에서의 손실을 고려하여, 10⁵ TCID₅₀/mL 이상이 되도록 바이러스를 첨가할 필요가 있다. 체적비로 0.1% 첨가하여, 10⁵ TCID₅₀/mL 이상으로 하기 위해서는, 원래의 바이러스 현탁액은 10⁸ TCID₅₀/mL 이상인 것이 필요하다. 본 실시형태에 의해, 적절한 순도의 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스 용액이 얻어짐으로써, 각 공정의 파보바이러스 클리어런스를 평가할 때에, 파보바이러스 용액의 첨가를 현저히 줄일 수 있게 되고, 파보바이러스 용액 유래의 불순물에 의한 필터의 눈막힘의 문제를 해소할 수 있다.

또한, 세번째 용도, 백신 생산에서도, 세포 배양으로 생산되는 바이러스의 감염가가 높은 쪽이, 그 후의 바이러스 백신 정제 공정에 대한 부하가 경감되어, 제조에 있어서 유리하다. 바이러스 감염가가 낮으면, 상대적으로 불순물 농도가 높아지기 때문에 정제 공정에 대한 부하가 가해져, 제조에 있어서 불리해진다. 본 실시형태에 의해, 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스 용액이 얻어짐으로써, 파보바이러스의 백신 생산에 있어서도, 정제 원료 중의 백신량이 비약적으로 많아지기 때문에, 백신 정제 공정을 보다 효율적이고 저비용으로 실시하는 것이 가능해진다.

실시예

이하 실시예, 비교예에 기초하여, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 또, 여기에 나타내는 실시예는 대표예이고, 본 발명이 이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

돼지 파보바이러스(PPV)의 숙주 세포로서 PK-13 세포(ATCC에서 구입)를 이용하여, 이것을 10% 소태아 혈청을 첨가한 DMEM 배지(이하, 「혈청 배지」라고 함. 후술하는 실시예에서도 동일함.)에서, 37℃, 5% CO₂ 환경하에서, 75 cm² 바닥 면적, 용량 15 mL의 조직 배양용 플라스크(이하, 「플라스크」라고 함. 후술하는 실시예에서도 동일함.)를 이용하여 계대 배양했다. 이 플라스크 내에서의 숙주 세포의 세포수를 24시간마다 측정하여, 대수 증식기의 배가 시간을 계측한 바, 17시간이었다. 또한 가장 많은 세포수가 된 날과 그 전후의 날의 세포수의 평균치를 컨플루언트시의 숙주 세포의 세포 밀도로서 계측한 바, 2.0×10⁷ 세포/플라스크였다.

계속해서, 상기 플라스크로부터 PK-13 세포를 박리하고, 새로운 플라스크에, 컨플루언트시의 세포 밀도의 1/500(4.0×10⁴ 세포/플라스크), 1/200(1.0×10⁵ 세포/플라스크), 및 1/40(5.0×10⁵ 세포/플라스크)의 세포 밀도의 숙주 세포를, 15 mL의 혈청 배지와 함께 나누어 주입했다. 각 세포 밀도의 조건에 관해 6플라스크씩 나누어 주입했다. 계속해서, 상기 각 플라스크에 PPV를 MOI=0.01이 되도록 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 환경하에서 배양했다. 배양 용기 내에서 상기한 바와 같이 하여 감염시키면, 시드 바이러스는 2시간 이내에 숙주 세포에 감염하여 도입되었다. 이 때 일단 배양액 중에서는 파보바이러스가 종적을 감추고, 소위 암흑기(Eclipse)에 들어갔다. 이 때 일부의 세포가 파보바이러스에 감염된 상태였다. 그 후, 일부의 세포는 파보바이러스 감염에 의해 사멸에 이르기는 했지만, 놀랍게도 전체의 세포수는 증가되어 갔다.

감염 개시 후, 85시간(배가 시간의 5배), 102시간(동 6배), 119시간(동 7배), 136시간(동 8배), 153시간(동 9배), 187시간(동 11배) 배양한 시점에서 1플라스크씩 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(날진 제조)로 여과했다.

PPV 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 적혈구 응집소 반응을 이용한 감염 판정법으로 TCID₅₀법으로 측정했다. 50% 감염가의 계산은, Reed-Muench법(의과 바이러스학, 2000. 난코도. 171-172)으로 행했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타내는 바와 같이 얻어진 바이러스의 감염가는, 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 높은 감염가인 것을 알 수 있었다(표 1의 수치는, 감염가를 대수치로 표시하고 있음. 예컨대, 8.1이란, 10^8.1 TCID₅₀/mL인 것을 나타냄).

또한, 불순물 단백질 농도를 BioRad사의 프로틴 아세이 시약(브래드퍼드법)으로 측정하여, PPV 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 2에 나타냈다.

[비교예 1]

실시예 1과 동일하게 하여 PK-13 세포를 계대 배양하고, 배가 시간 및 컨플루언트시의 세포 밀도를 측정한 바, 배가 시간=17시간, 컨플루언트시의 세포 밀도=2.0×10⁷ 세포/플라스크였다. 계속해서, 새로운 플라스크에, 컨플루언트의 세포 밀도의 1/2000(1.0×10⁴ 세포/플라스크), 1/4(5.0×10⁶ 세포/플라스크), 1/2.65(7.5×10⁶ 세포/플라스크), 1/2(1.0×10⁷ 세포/플라스크), 및 1/1(2.0×10⁷ 세포/플라스크)의 세포 밀도의 숙주 세포를, 15 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도의 조건에 관해 6플라스크씩 나누어 주입했다. 계속해서, 상기 각 플라스크에 PPV를 MOI=0.01이 되도록 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 환경하에서 배양했다. 감염 개시 후, 85시간(배가 시간의 5배), 102시간(동 6배), 119시간(동 7배), 136시간(동 8배), 153시간(동 9배), 187시간(동 11배) 배양한 시점에서 1플라스크씩 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(날진 제조)로 여과했다.

PPV 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타내는 바와 같이, 어느 조건하에서도 감염가 10⁸ TCID₅₀/mL 이상으로는 되지 않았다.

또한, 실시예 1과 동일하게 하여 PPV 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 4에 나타냈다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일하게 하여 PK-13 세포를 계대 배양하고, 배가 시간 및 컨플루언트시의 세포 밀도를 측정한 바, 배가 시간=17시간, 컨플루언트시의 세포 밀도=2.0×10⁷ 세포/플라스크였다. 계속해서, 새로운 플라스크에, 컨플루언트의 세포 밀도의 1/40(5.0×10⁵ 세포/플라스크)의 세포 밀도의 숙주 세포를, 15 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도 조건에 관해 4플라스크씩 나누어 주입했다. 계속해서, 상기 각 플라스크에 PPV를 MOI=0.0001, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1이 되도록 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 환경하에서 배양했다. 감염 개시 후, 119시간(배가 시간의 7배), 136시간(동 8배), 153시간(동 9배), 187시간(동 11배) 배양한 시점에서 1플라스크씩 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(날진 제조)로 여과했다.

PPV 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 5에 나타낸다. 표 5에 나타내는 바와 같이, 어느 MOI에서도, 얻어진 바이러스의 감염가는 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 높은 감염가인 것을 알 수 있었다.

또한, 실시예 1과 동일하게 하여 PPV 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 6에 나타냈다.

[실시예 3]

실시예 1과 동일하게 하여 PK-13 세포를 계대 배양하고, 배가 시간 및 컨플루언트시의 세포 밀도를 측정한 바, 배가 시간=17시간, 컨플루언트시의 세포 밀도=2.0×10⁷ 세포/플라스크였다. 계속해서, 새로운 플라스크에, 컨플루언트의 세포 밀도의 1/600(3.4×10⁴ 세포/플라스크), 1/400(5.0×10⁴ 세포/플라스크) 및 1/80(2.5×10⁵ 세포/플라스크)의 세포 밀도의 숙주 세포를, 15 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도 조건에 관해 12플라스크씩 나누어 주입했다. 계속해서, 상기 각 플라스크를 37℃, 5% CO₂ 환경하에서 17시간 배양하여, 세포수가 2배로 증가한 시점에서, PPV를 MOI=0.01(6플라스크) 및 0.003(6플라스크)이 되도록 접종하고, 배양을 계속했다. 감염 개시 후, 85시간(배가 시간의 5배), 102시간(동 6배), 119시간(동 7배), 136시간(동 8배), 153시간(동 9배), 187시간(동 11배) 배양한 시점에서 1플라스크씩 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(날진 제조)로 여과했다.

PPV 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7에 나타내는 바와 같이, 바이러스 감염가는 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 높은 감염가인 것을 알 수 있었다.

또한, 실시예 1과 동일하게 하여 PPV 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 8에 나타냈다.

[실시예 4]

실시예 1과 동일하게 PK-13 세포를 계대 배양하고, 배가 시간 및 컨플루언트시의 세포 밀도를 측정한 바, 배가 시간=17시간, 컨플루언트시의 세포 밀도=2.0×10⁷ 세포/플라스크였다. 계속해서, 새로운 플라스크에, 컨플루언트의 세포 밀도의 1/80(2.5×10⁵ 세포/플라스크) 및 1/60(3.4×10⁵ 세포/플라스크)의 세포 밀도의 숙주 세포를, 15 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도 조건에 관해 2플라스크씩 나누어 주입했다. 계속해서, 37℃, 5% CO₂ 환경하에서 17시간 배양하여, 세포수가 2배로 증가한 시점에서, PPV를 MOI=0.01이 되도록 접종하고, 배양을 계속했다. 감염 개시 후, 4일 후(96시간 후)에 배양 상청을 제거하고, 플라스크 저면의 세포를, 혈청을 가하지 않은 DMEM 배지(이하, 「무혈청 배지」라고 함)에서 세정한 후, 10 mL의 무혈청 배지를 첨가하여, 더욱 배양을 행하고, 약 1일 후(감염 개시로부터 119시간 후=배가 시간의 7배), 또는 약 2일 후(감염 개시로부터 136시간 후=동 8배)에 1플라스크씩 상기 무혈청 배지의 배양 상청을 회수했다. 회수한 무혈청 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(날진 제조)로 여과했다.

무혈청 PPV 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 9에 나타낸다. 표 9에 나타내는 바와 같이, 어느 조건에서도 바이러스 감염가는 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 높은 감염가인 것을 알 수 있었다.

또한, 실시예 1과 동일하게 하여 PPV 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 10에 나타냈다.

[실시예 5]

돼지 파보바이러스(PPV)의 숙주 세포로서 범용적으로 사용되고 있는 돼지 신장 유래의 주화 세포인 ESK 세포(Vet. Microbiol. 1984. 9(2) : 187-92., Microbiologica. 1987. 10(3) : 301-9., Nippon Juigaku Zasshi. 1988. 50(3) : 803-8, Nippon Juigaku Zasshi. 1990. 52(2) : 217-24, J. Vet. Med. Sci. 1992. 54(2) : 313-8)를 PK-13 세포 대신에 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 배양 조건에서 계대 배양했다. 배가 시간 및 컨플루언트시의 세포 밀도를 계측한 바, 각각 20시간, 3.0×10⁷ 세포/플라스크였다.

플라스크로부터 ESK 세포를 박리하고, 새로운 플라스크에, 컨플루언트의 세포 밀도의 1/500(6.0×10⁴ 세포/플라스크), 1/300(1.0×10⁵ 세포/플라스크), 1/200(1.5×10⁵ 세포/플라스크), 1/40(7.5×10⁵ 세포/플라스크), 1/30(1.0×10⁶ 세포/플라스크), 및 1/20(1.5×10⁶ 세포/플라스크)의 세포 밀도의 숙주 세포를, 15 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도 조건에 관해 6플라스크씩 나누어 주입했다. 계속해서, 상기 각 플라스크에 PPV를 MOI=0.01이 되도록 접종하고, 실시예 1과 동일한 배양 조건에서 배양했다. 감염 개시 후, 100시간(배가 시간의 5배), 120시간(동 6배), 140시간(동 7배), 160시간(동 8배), 180시간(동 9배), 220시간(동 11배) 배양한 시점에서 1플라스크씩 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(날진 제조)로 여과했다.

PPV 감염가를, 실시예 1과 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 11에 나타낸다. 표 11에 나타내는 바와 같이, 어느 조건에서도 바이러스 감염가는 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 높은 감염가인 것을 알 수 있었다.

또한, 실시예 1과 동일하게 하여 PPV 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 12에 나타냈다.

[비교예 2]

실시예 1과 동일하게 하여 PK-13 세포를 계대 배양하고, 배가 시간 및 컨플루언트시의 세포 밀도를 측정한 바, 배가 시간=17시간, 컨플루언트시의 세포 밀도=2.0×10⁷ 세포/플라스크였다. 새로운 플라스크에, 컨플루언트의 세포 밀도의 1/40(5×10⁵ 세포/플라스크)의 세포 밀도의 숙주 세포를, 15 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도 조건에 관해 4플라스크씩 나누어 주입했다. 계속해서, 상기 각 플라스크에 PPV를 MOI=0.0001, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1이 되도록 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 환경하에서 배양했다. 감염 개시 후, 51시간(배가 시간의 3배), 68시간(동 4배), 204시간(동 12배), 238시간(동 14배) 배양한 시점에서 1플라스크씩 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(날진 제조)로 여과했다.

PPV 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 13에 나타낸다. 표 13에 나타내는 바와 같이, 어느 조건하에서도 감염가 10⁸ TCID₅₀/mL 이상으로는 되지 않았다.

또한, 실시예 1과 동일하게 하여 PPV 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 14에 나타냈다.

[비교예 3]

실시예 1과 동일하게 하여 PK-13 세포를 계대 배양하고, 배가 시간 및 컨플루언트시의 세포 밀도를 측정한 바, 배가 시간=17시간, 컨플루언트시의 세포 밀도=2.0×10⁷ 세포/플라스크였다. 새로운 플라스크에, 컨플루언트의 세포 밀도의 1/40(5.0×10⁵ 세포/플라스크)의 세포 밀도의 숙주 세포를, 15 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도 조건에 관해 6플라스크씩 나누어 주입했다. 계속해서, 상기 각 플라스크에 PPV를 MOI=0.00001, 1.0이 되도록 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 환경하에서 배양했다. 감염 개시 후, 85시간(배가 시간의 5배), 102시간(동 6배), 119시간(동 7배), 136시간(동 8배), 153시간(동 9배), 187시간(동 11배) 배양한 시점에서 1플라스크씩 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(날진 제조)로 여과했다.

PPV 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 15에 나타낸다. 표 15에 나타내는 바와 같이, 어느 조건하에서도 감염가 10⁸ TCID₅₀/mL 이상으로는 되지 않았다.

또한, 실시예 1과 동일하게 하여 PPV 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 16에 나타냈다.

[비교예 4]

실시예 5와 동일하게 하여 ESK 세포를 계대 배양하고, 배가 시간 및 컨플루언트시의 세포 밀도를 측정한 바, 배가 시간=20시간, 컨플루언트시의 세포 밀도=3.0×10⁷ 세포/플라스크였던 새로운 플라스크에, 컨플루언트의 세포 밀도의 1/2000(1.5×10⁴ 세포/플라스크), 1/4(7.5×10⁶ 세포/플라스크), 1/2.65(1.1×10⁷ 세포/플라스크), 1/2(1.5×10⁷ 세포/플라스크), 및 1/1(3.0×10⁷ 세포/플라스크)의 세포 밀도의 숙주 세포를, 15 mL의 혈청 배지와 함께, 각 세포 밀도의 조건에 관해 6플라스크씩 나누어 주입했다. 계속해서, 상기 각 플라스크에 PPV를 MOI=0.01이 되도록 접종하고, 실시예 5와 동일하게 하여 배양했다. 감염 개시 후, 100시간(배가 시간의 5배), 120시간(동 6배), 140시간(동 7배), 160시간(동 8배), 180시간(동 9배), 220시간(동 11배) 배양한 시점에서 1플라스크씩 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을, 3000 rpm, 20분간 원심하고, 상청 획분을 0.45 ㎛ 필터(날진 제조)로 여과했다.

PPV 감염가를, 96웰 플레이트를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 17에 나타낸다. 표 17에 나타내는 바와 같이, 어느 조건하에서도 감염가 10⁸ TCID₅₀/mL 이상으로는 되지 않았다.

또한, 실시예 1과 동일하게 하여 PPV 감염가(TCID₅₀/mL)와 불순물 단백질 농도(ng/mL)의 비를 구했다. 그 결과를 표 18에 나타냈다.

산업상 이용 가능성

본 발명의 방법에 의해, 적절한 순도의 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 고감염가의 파보바이러스 용액을 얻을 수 있다. 이것은, 항바이러스약 탐색 등의 바이러스 연구 재료의 조제나, 생물 제제(의약품) 제조 공정에서의 바이러스 클리어런스 안전성 평가에 사용하는 바이러스의 조제, 또한 백신 생산 등에 이용할 수 있다.

본 출원은, 2012년 11월 22일에 출원된 일본 특허 출원 제2012-256801호에 기초한 우선권을 주장하는 것으로, 이 내용은 여기에 참조로서 도입된다.

Claims

배양 기재 중에서 숙주 세포와 파보바이러스의 시드 바이러스를 배양함으로써, 배양 상청액 중에 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 감염가의 파보바이러스를 생산하는 방법으로서,
(a) 상기 배양에서 숙주 세포의 대수 증식기의 배가 시간 및 컨플루언트(confluent)로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도를 사전에 별도 산출해 두는 공정과,
(b) 공정(a)에서 사전에 산출한 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도의 1/500∼1/20의 세포 밀도의 숙주 세포와 배지를 포함하는 상기 배양 기재에, 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.0001∼0.1이 되도록 접종하는 공정과,
(c) 공정(b)의 숙주 세포와 파보바이러스를 포함하는 배양물을 공정(a)에서 사전에 산출한 배가 시간의 5∼11배의 시간 배양하는 공정과,
(d) 공정(c)의 배양에 의해 얻어지는 파보바이러스를 포함하는 배양 상청액을 회수하는 공정을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주 세포가 접착 의존성 세포인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 숙주 세포가 파보바이러스에 감수성이 있는 세포인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 파보바이러스가 돼지 파보바이러스(PPV), 개 파보바이러스(CPV), 마우스 미소 바이러스(MVM), 래트 바이러스(RV), H-1 바이러스(H-1), 고양이 파보바이러스(FPV), 거위 파보바이러스(GPV), 또는 소 파보바이러스(BPV)인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공정(b)에 있어서, 공정(a)에서 사전에 산출한 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도의 1/300∼1/30의 세포 밀도의 숙주 세포와 배지를 포함하는 상기 배양 기재에, 상기 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.0001∼0.1이 되도록 접종하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공정(b)에 있어서, 공정(a)에서 사전에 산출한 컨플루언트로 증식했을 때의 숙주 세포의 세포 밀도의 1/200∼1/40의 세포 밀도의 숙주 세포와 배지를 포함하는 상기 배양 기재에, 상기 파보바이러스의 시드 바이러스를 감염 다중성(MOI)이 0.0001∼0.1이 되도록 접종하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 감염 다중성(MOI)이 0.001∼0.03인 방법.
제7항에 있어서, 상기 감염 다중성(MOI)이 0.003∼0.01인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지가 혈청 배지일 때, 공정(c)에 있어서, 상기 혈청 배지를 무혈청 배지로 교환하는 공정을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공정(c)에 있어서, 공정(a)에서 사전에 산출한 배가 시간의 6∼9배의 시간 배양하는 파보바이러스의 생산 방법.
제10항에 있어서, 상기 공정(c)에 있어서, 공정(a)에서 사전에 산출한 배가 시간의 7∼8배의 시간 배양하는 파보바이러스의 생산 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공정(c)에 있어서, 상기 배양물을 33℃ 이상 39℃ 이하의 온도에서 배양하는 파보바이러스의 생산 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공정(c)에 있어서, 상기 숙주 세포와 상기 바이러스가 동시에 증식하는 파보바이러스의 생산 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공정(d)에 있어서, 상기 배양 상청액에 포함되는 유리(遊離)의 숙주 세포와 숙주 세포의 파편을 제거하는 공정을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 제거 공정이 구멍 직경 0.2 ㎛∼0.45 ㎛의 막여과를 이용하여 행해지는 방법.
제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 10⁸ TCID₅₀/mL 이상의 감염가의 파보바이러스를 포함하는 배양액.
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