KR101645230B1 - 바이러스 증식 방법 및 그 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배양 배지에 바이러스의 증식을 향상시킬 수 있는 화합물을 첨가하여, 인플루엔자 바이러스에 감염된 배양 세포의 배양에 의하여 인플루엔자 바이러스를 증식하는 방법 및 이러한 방법을 이용하여 대량으로 증식된 인플루엔자 바이러스를 분리, 정제하여 인플루엔자 바이러스 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 간단한 공정으로 배양 세포에 감염된 인플루엔자 바이러스를 효율적으로 증식, 확보할 수 있으므로, 경제적인 공정으로 인플루엔자 바이러스에 대한 백신을 제조하는데 활용될 수 있다.

Description

바이러스 증식 방법 및 그 응용{PROCESS FOR VIRAL PROLIFERATION AND APPLICATION THEREOF}

본 발명은 바이러스를 증식하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 간단한 공정을 통하여 백신 제조를 위하여 배양 배지에서 인플루엔자 바이러스를 대량으로 증식하는 방법 및 그 응용에 관한 것이다.

독감을 일으키는 인플루엔자 바이러스(influenza virus)는 RNA 바이러스인 오르쏘믹소바이러스(orthomixovirus) 과에 속하는 병원성 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스는 주로 리보핵단백질로 규정하는 S항원의 혈청학적 특이성에 의해 A형, B형, C형으로 구분된다. 인플루엔자 바이러스의 게놈은 8개 분절(C형은 7개)로 구성되는 선형의 (-) 센스 단일 가닥 RNA을 갖는다. 인플루엔자 바이러스의 캡시드(capsid) 단백질은 비교적 다형성인 것으로 알려져 있지만, 인플루엔자 바이러스 입자(virion)의 외부 표면은 혈구응집소(hemagglutinin, HA 또는 H) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA 또는 N)이라는 2가지 유형의 주요 당단백질 스파이크를 만들어내는 지질 외피(lipid envelope)로 구성된다.

인플루엔자 바이러스 입자의 표면 단백질인 혈구응집소와 뉴라미니다아제로 규정되는 표면 항원에 근거하여 더욱 세분화된다. 예를 들어 인플루엔자 A형 바이러스는 16개 이상의 H 서브타입과 9개 이상의 N 서브타입이 알려져 있다. 특정 인플루엔자 바이러스주는 특정 바이러스 유형/최초로 분리된 지역/분리 번호, 분리 연도 및 HA 및 NA 서브타입에 따라 표준 명명법을 갖는다. 인플루엔자 바이러스의 숙주 세포로의 유입은, 말단의 N-아세틸 뉴라민산(NANA, 시알산) 그룹을 함유하는 점액 단백질에 대하여 인플루엔자 바이러스 표면의 HA 스파이크가 결합함으로써 일어난다. 숙주 세포에 부착한 후, 바이러스 입자는 세포내이입 소포(endocytotic vesicle)로의 피복된 피트(pit)를 통하여 세포내이입 과정에 의해 포식되어 최종적으로 엔도솜(endosome)이 된다. 이들은 숙주 세포에 의해 산성화되는데, HA 단량체가 엔도솜에서 트립신-유사 효소에 의해 절단되어 내재화(internalization)를 위해 활성화되고, 일단 내재화되면 인플루엔자 바이러스의 복제가 일어난다.

인플루엔자 바이러스는 인간을 비롯한 척추동물을 감염시키며, 매우 뛰어난 변신 능력을 가지고 있으며, A형과 B형은 일정 주기마다 지역적, 세계적인 규모로 유행한다. 특히 인플루엔자 A형 바이러스는 항원 소변이(antigenic drift)나 유전체 분절교환이라고도 일컬어지는 항원 대변이(antigenic shift)에 의하여 새로운 변이주가 출현하기 쉬운데, 인간집단 내에서 변이 항원에 대한 항체보유율이 낮으면 세계적으로 대유행을 일으킨다. 예를 들어 1918년의 스페인 독감이나, 1957년 아시아 독감, 1968년의 홍콩 독감, 1977년 러시아 독감으로 수백, 수천만 명이 사망한 것으로 보고되었다.

인플루엔자 바이러스는 그 변이 정도가 상당히 심하기 때문에 세계보건기구(WHO)가 매년 유행할 인플루엔자 바이러스 형태를 예측해 매년 2월-3월에 '올해의 독감'을 발표하면 제약회사들이 그에 맞는 예방 백신을 제조한다. 최근 생명공학 기술의 발전에 따라 인플루엔자 바이러스 백신을 제조하기 위한 약독화/불활성화된 바이러스 또는 재조합 바이러스는 세포 배양 시스템을 사용하여 제조된다. 하지만, 인플루엔자 바이러스 백신에 대한 예방 접종을 받더라도 2주가 경과하여야 해당 백신에 대한 항체에 생성되어 예방 효과를 기대할 수 있다. 따라서 다량의 인플루엔자 백신을 제조하기 위해서는 특정 인플루엔자 바이러스가 유행하기 전에 해당 인플루엔자 바이러스를 대량으로 증식할 필요가 있다.

인플루엔자 바이러스를 포함하여 바이러스 백신을 제조하는데 일반적으로 부화된 암탉의 계란을 이용하였다. 하지만 난 물질을 완전히 제거하기는 곤란하고, 난에서 제조된 바이러스의 항원성이 감소될 수 있으며, 이로 인하여 제조된 백신에 대한 감수성 저하가 야기될 수 있으며, 적합한 난을 대량으로 확보하기 곤란할 수 있다는 문제도 제기되고 있다. 이에 따라, 최근에는 세포 배양 배지에 숙주 배양 세포를 접종하고 원하는 바이러스를 이 배양 세포에 감염시키면, 배양 세포의 배양에 따라 바이러스를 증식하는 방법도 널리 사용되고 있다. 배양 배지에서 바이러스 백신용으로 사용되는 바이러스를 대량으로 증식하기 위한 하나의 방법으로서 적절한 배양 세포주를 채택하는 방법이 고려될 수 있다.

예를 들어, 대한민국등록특허 제10-1370512호에서는 무단백 배양배지에서 부유배양할 수 있는 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주(기탁번호 KCLRF-BP-00297)를 이용하여 다양한 바이러스를 증식하는 것을 개시하고 있다. 하지만, MDCK 유래의 세포주는 종양유발성(tumorigenicity)을 가지고 있거나, 세포 배양액에서 동물 혈청을 필요로 하거나 또는 백신으로 사용하기 위한 바이러스에 대하여 충분하지 않은 역가를 보이는 낮은 수율을 비롯한 하나 이상의 결함을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 일부 MDCK 세포주는 상대적으로 고가여서 이들 세포주를 사용하는 것은 경제적이지 못할 수도 있다.

따라서 특히 인플루엔자 바이러스에 대한 백신을 제조하는 것과 관련하여 대량으로 인플루엔자 바이러스 백신을 증식할 수 있는 방법에 대한 필요가 있다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 백신을 제조하기 위하여 인플루엔자 바이러스를 대량으로 증식, 확보할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 경제적이고 효율적인 공정에 의하여 백신으로 활용될 수 있는 인플루엔자 바이러스를 대량으로 증식시킬 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 공정에 따라 대량으로 증식된 인플루엔자 바이러스를 이용하여 인플루엔자 바이러스에 대한 백신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 갖는 본 발명은 (a) 배양 배지에 배양 세포를 접종시키는 단계; (b) 상기 접종된 배양 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계; (c) 상기 인플루엔자 바이러스에 감염된 배양 세포를 배양하는 단계; 및 상기 (b) 단계 이전, 상기 (b) 단계 이후 또는 상기 (b) 단계에서 상기 배양 배지에 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물, 이 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이 화합물의 가능한 이성체를 첨가하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스를 증식하는 방법을 제공한다.

(화학식 (Ⅰ)에서, R¹ 내지 R¹¹은 각각 독립적으로 수소, C₁-C₁₀의 알킬기, C₂-C₁₀의 알케닐기, C₁-C₁₀의 알콕시기, C₄-C₁₀의 사이클로알킬기 및 C₅-C₂₀의 아릴기로 구성되는 군에서 선택됨)

예를 들어, 상기 배양 세포를 접종시키는 단계에서 상기 배양 세포는 상기 배양 배지에 접종 가능한 배양 세포 밀도의 30 ~ 60%의 접종 밀도로 접종될 수 있다.

상기 화학식 (Ⅰ)에서 R¹ 내지 R¹¹은 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₅ 알킬기일 수 있다.

하나의 예시적인 실시예에서, 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물, 이 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이 화합물의 가능한 이성체는 하기 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물, 이 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이 화합물의 가능한 이성체를 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 배양 세포는 MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포주를 포함할 수 있다.

상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물, 이 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이 화합물의 가능한 이성체는 상기 배양 배지에 0.1 ~ 1000 μΜ의 농도로 첨가되는 것이 특히 바람직할 수 있다.

예를 들어, 증식 대상이 되는 상기 인플루엔자 바이러스는 A/H1N1형, A/H3N2형 및 B형 인플루엔자 바이러스를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 방법에 따라 얻어진 세포 배양물로부터 상기 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계; 및 상기 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계 이전 또는 이후에 상기 인플루엔자 바이러스를 약독화 또는 불활성화하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신을 제조하는 방법을 또한 제공한다.

본 발명에 따르면 무혈청 배양 배지에 접종된 숙주 배양 세포를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 증식할 때, 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물을 배양 배지에 첨가하면, 감염된 인플루엔자 바이러스에 대한 숙주 배양 세포의 항바이러스 활성이 저하된다는 점을 이용하여, 인플루엔자 바이러스를 대량으로 증식하였다.

본 발명에 따라 대량으로 신속하게 인플루엔자 바이러스를 확보할 수 있으므로, 확보된 인플루엔자 바이러스를 분리, 정제하고, 적절한 방법에 따라 증식된 인플루엔자 바이러스를 약독화 및/또는 불활성화하여, 신속하고 경제적인 방법으로 인플루엔자 바이러스 백신을 제조할 수 있다.

도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, 숙주 배양 세포인 MDCK 세포주에 각각 다른 타입의 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 뒤, 배양 배지에 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 물질을 첨가하여, 숙주 세포주의 배양 시간에 따른 인플루엔자 바이러스의 증식 정도를 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, 숙주 배양 세포인 MDCK 세포주에 인플루엔자 바이러스를 감염시키고, 배양 배지에 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 물질을 첨가, 처리한 뒤, 인플루엔자 바이러스의 HA 발현 정도를 Flow Cytometer를 사용하여 분석한 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, 각각 숙주 배양 세포인 MDCK 세포주에 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 뒤에 배양 배지에 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 물질로 처리(사후처리), 인플루엔자 바이러스에 감염시키기 전에 배양 배지에 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 물질로 처리(사전처리), 인플루엔자 바이러스의 감염과 동시에 배양 배지에 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 물질로 처리(동시처리)한 뒤, 숙주 세포주의 배양에 따른 인플루엔자 바이러스의 증식 정도를 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, 세포 배양액에 cAMP-억제제를 첨가한 뒤, 배양 배지에 인플루엔자의 증식을 유도하는 물질로 처리한 상태에서 배양 배지에서 인플루엔자 바이러스의 증식 정도를 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, 배양 배지에 첨가된 물질로 인하여 인플루엔자 바이러스의 유도된 증식과 관련한 영향을 알아보기 위하여 Microarray를 이용한 측정 결과를 도시한 사진이다.
도 6은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, Microarray 분석을 수행한 샘플에 대하여 인플루엔자 바이러스의 증식 정도를 측정한 그래프이다.
도 7a 내지 도 7o는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, Microarray 분석 결과를 토대로 qRT-PCR을 수행하여, 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 물질의 세포 배양액 첨가에 따라 인플루엔자 바이러스 nucleoprotein(NP) 및 항바이러스 반응에 관여하는 유전자의 발현 정도를 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 물질의 첨가에 따라 숙주 배양 세포로 사용된 MDCK 세포주의 증식 정도를 알아보기 위한 흡광도를 측정한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 물질의 첨가에 따라 숙주 배양 세포로 사용된 MDCK 세포주의 증식 정도를 측정한 사진이다.
도 10a 내지 도 10c는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, 숙주 배양 세포인 MDCK 세포주의 접종 밀도를 달리하여 각각 다른 타입의 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 뒤, 배양 배지에 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 물질을 첨가하여, 숙주 세포주의 배양 시간에 따른 인플루엔자 바이러스의 증식 정도를 측정한 그래프이다.

이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 배양 배지에 접종된 숙주 배양 세포가 인플루엔자 바이러스에 감염되었을 때, 숙주 배양 세포의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 감소시키는 화합물을 배양 배지에 첨가하여, 결과적으로 인플루엔자 바이러스의 증식을 향상시킬 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 대량으로 증식, 확보된 인플루엔자 바이러스를 배양 배지에서 분리, 정제하여 인플루엔자 바이러스에 대한 백신을 신속하고 경제적으로 제조할 수 있다.

본 발명에 따라 인플루엔자 바이러스에 감염된 숙주 세포(또는 배양 세포)의 증식을 향상시키는 화합물은 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물, 이 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이 화합물의 가능한 이성체이다.

(화학식 (Ⅰ)에서, R¹ 내지 R¹¹은 각각 독립적으로 수소, C₁-C₁₀의 알킬기, C₂-C₁₀의 알케닐기, C₁-C₁₀의 알콕시기, C₄-C₁₀의 사이클로알킬기 및 C₅-C₂₀의 아릴기로 구성되는 군에서 선택됨)

예를 들어, 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용되는 염으로는 약학적으로 허용되는 무기 및/또는 유기 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기성 염을 들 수 있다.

보다 구체적으로, 약학적으로 허용가능한 무기산 중에는 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 및 질산이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적으로 허용가능한 유기산 중에는 아세트산, 트리플루오로아세트산, 젖산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 퓨마르산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 벤조산, 아스코르브산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 2-히드록시에탄설폰산 및 캄포르산이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적으로 허용가능한 염기 중에는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민 및 tert-부틸아민이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 결합체는 염화수소 염 형태이다.

예를 들어, 산부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻을 수 있다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

예를 들어, 본 발명에 따른 화합물의 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 유도체를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 선택적으로, 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물 및 물(water) 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 약학적으로 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

한편, 화학식 (Ⅰ)의 화합물에 포함되어 있는 비대칭 탄소 원자는 각 탄소 원자로부터 독립적으로 R, S 또는 RS의 배위를 나타낼 수 있으며, 따라서 화학식 (Ⅰ)의 화합물은 순수한 거울상 이성질체(enantiomer) 또는 순수한 부분입체 이성질체(diastereoisomer)의 형태이거나, 또는 특히 라세미체(racemate)인 거울상 이성질체의 혼합물의 형태이거나, 또는 부분입체 이성질체의 혼합물의 형태일 수 있다. 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체의 분리는 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 기술, 특히 크로마토그래피에 의하여 수행될 수 있다.

뿐만 아니라, 한편, 화학식 (Ⅰ)의 고리에 연결되는 R¹ 내지 R¹¹ 각각의 치환기는 이들 치환기가 결합되는 고리로 각각 cis 및/또는 trans 위치를 가질 수 있기 때문에, 화학식 (Ⅰ)의 화합물은 cis 또는 trans 이성질체의 형태이거나 이들의 혼합물의 형태이다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 화학식 (Ⅰ)에서 R¹ 내지 R¹¹은 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₅ 알킬기이다. 특히 바람직한 실시형태에서, R¹, R², R⁶, R⁷, R⁸ 및 R⁹는 각각 수소 원자이고, R³, R⁴, R⁵, R¹⁰ 및 R¹¹은 C₁-C₅ 알킬기인 화합물이다. 하나의 예시적인 실시예에서, 배양 배지 중에 첨가되어 숙주 배양 세포의 항바이러스 활성을 감소시켜, 숙주 배양 세포를 감염시킨 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 화합물은 하기 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물, 이 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이 화합물의 가능한 이성체이다.

본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 예를 들어 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물을 적절한 숙주 배양 세포가 접종된 배양 배지에 첨가하면 숙주 배양 세포를 감염시킨 인플루엔자 바이러스의 증식이 크게 증가하였다(도 1a 내지 도 1c 참조). 실제로 이 화합물을 배양 배지에 첨가하였을 때, 숙주 배양 세포 표면에 발현된 인플루엔자 바이러스의 표면에 형성된 Influenza Hemagglutinin(HA)의 정량적인 분석을 위한 Flow cytometer 분석에 의해서도 화합물의 처리에 의하여 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질인 HA의 발현이 크게 증가하였다(도 2 참조). 따라서 예를 들어 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물의 처리에 의하여 인플루엔자 바이러스의 대량 증식이 가능하다는 것을 확인하였다.

인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하는 화합물은 인플루엔자 바이러스에 감염된 숙주 배양 세포가 실질적으로 배양되기 전에 임의의 단계에 배양 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 숙주 배양 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시킨 뒤에 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물을 배양 배지에 첨가하는 경우(사후처리), 숙주 배양 세포가 접종된 배양 배지에 이 화합물을 첨가한 뒤 인플루엔자 바이러스를 감염시키는 경우(사전처리), 인플루엔자 바이러스의 감염과 동시에 배양 배지에 첨가하는 경우(동시처리)에 모두 인플루엔자 바이러스의 증식을 크게 증가시킨다(도 3 참조).

한편, 생체 내에서 cAMP는 세포 내에서 다양한 신호 전달 메커니즘에서 세컨드 메신저(2nd messenger)로 기능한다. 본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 인플루엔자 바이러스를 증식시키기 위한 배양 배지에 cAMP-억제제(cAMP-inhibitor)인 SQ22,536을 처리하더라도, 예를 들어 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물을 배양 배지에 첨가하면 이 화합물을 첨가하지 않은 경우와 비교하여 인플루엔자 바이러스의 증식이 증가하였다(도 4 참조).

아울러, 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물을 인플루엔자 바이러스 증식을 위한 배양 배지에 첨가하였을 경우의 신호 전달 메커니즘과 관련한 마이크로어레이 분석에 따르면, 숙주 배양 세포의 항바이러스 반응(antiviral response)에 관여하는 유전자(IRF3, Viperin, MxA, OAS, HSP70 등) 및 선천성 면역 반응(innate immune response)에 관여하는 유전자(TLR3, RIG-I, MDA5, MyD88 등)들의 발현이 감소하고, MAPKinase pathway, 인플루엔자 Ribonucleoprtein과 결합하여 인플루엔자의 증식에 도움이 되도록 역할을 하는 유전자(Importin a5) 등의 발현이 증가하였으며(도 5), 마이크로어레이를 수행한 샘플에서의 인플루엔자 바이러스의 농도는 화학식 (Ⅱ)로 처리한 그룹에서 약 24배 증가하였다(도 6).

마이크로어레이 분석 결과에 더하여, 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물의 배양 배지 첨가에 의하여 숙주 배양 세포에 첨가하였을 때, 인플루엔자 바이러스의 NP의 발현량은 크게 증가한다. 하지만, 숙주 배양 세포의 항바이러스 반응 유전자(IRF3, IRF7, ISG15, Mx1, OAS2, PKR, AP-1)와 선천성 면역 시스템에서 주요한 역할을 담당하는 TLR(Toll-like receptor)의 하위 유전자(MyD88, DDX58, MDA5)의 발현도 크게 감소하고, 인플루엔자 바이러스의 Ribonucleoprotein(vRNP)이 숙주 세포 내 핵에서 export하지 못하도록 억제하는 단백질인 HSP70의 발현 역시 감소할 뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스의 budding out을 억제하는 viperin의 발현량 역시 감소하였다(도 7a 내지 도 7o 참조). 이러한 점에 비추어 볼 때, 본 발명에 따른 화합물을 무혈청 배양 배지에 첨가하면, 인플루엔자 바이러스에 감염된 숙주 배양 세포의 항바이러스 활성이 저하되고, 상대적으로 인플루엔자 바이러스의 증식이 활발하게 유도된다.

본 발명의 실험 결과를 종합해 볼 때, 배양 배지에 첨가된 숙주 세포인 배양 세포에 인플루엔자 바이러스를 감염시키기 이전이나 이후에 숙주 배양 세포 또는 인플루엔자 바이러스가 접종된 배양 배지에 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도하기에 충분한 농도로 화학식 (Ⅰ), 바람직하게는 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물을 첨가, 처리함으로써, 숙주 배양 세포의 증식에 따라 배양 세포에 감염된 인플루엔자 바이러스를 대량으로 확보할 수 있다.

따라서 본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 (Ⅰ), 바람직하게는 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물, 이들 화합물의 약학적으로 허용되는 염 또는 이 화합물의 가능한 이성체를 인플루엔자 바이러스를 증식시키는 데 사용되는 적절한 배양 배지에 첨가하여, 숙주 배양 세포를 감염시킨 인플루엔자 바이러스를 대량으로 증식, 확보하는 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명의 일 측면에 따른 인플루엔자 바이러스를 증식하는 방법은 (a) 배양 배지에 배양 세포를 접종시키는 단계; (b) 접종된 배양 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계; (c) 상기 인플루엔자 바이러스에 감염된 배양 세포를 배양하는 단계; 및 상기 (b) 단계 이전, 상기 (b) 단계 이후 또는 상기 (b) 단계에서 상기 배양 배지에 상기 화학식 (Ⅰ), 바람직하게는 상기 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물, 이들 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이들 화합물의 가능한 이성체를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 인플루엔자 바이러스를 증식하는데 사용되는 배양 배지는 선택적으로 20% v/v 이하의 소혈청과 같은 적합한 동물 혈청을 포함할 수 있다. 하지만, 소태아 혈청(FBS)과 같은 동물 혈청은 숙주 배양 세포의 성장을 위한 성장 인자는 물론이고, 예를 들어 배양 세포가 배양 용기의 세포 지지 표면에 부착되게 유도하는 인자를 포함한다. 따라서 배양 배지에 충분한 혈청을 부가하여 부착 세포를 성장시켜 단일층을 형성시킬 수 있다.

선택적인 실시형태에서, 배양 배지는 무혈청(serum-free) 배양 배지일 수 있다. 동물 혈청은 다른 병원성 물질을 함유할 수 있기 때문에, 세포 배양물로 제조된 백신에 의해 치료 또는 접종되는 인간 또는 동물에게 전달될 잠재적 위험성이 있으며, 특히 면역력이 약한 인간에게 치명적일 수 있다.

예를 들어 이 무혈청 배양 배지는 EMEM(Eagle's minimal essential media) 및 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등의 MEM 배지와 같이 잘 알려져 있는 세포 배양 배지를 사용하거나, 이들 세포 배양 배지에서 유래하거나 이들 세포 배양 배지를 변형한 것일 수 있다. 예를 들어 Gibco BRL/Life Technology에서 제조되는 VP-SFM과 같이 상업적으로 이용가능한 배양 배지를 사용할 수도 있다. 이들 배양 배지에서 유래된 배양 배지를 사용하여, 숙주 배양 세포의 계대 배양을 유도할 수 있다.

예를 들어, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 배양 배지는 옥수수, 완두, 대두, 맥아, 감자 및 소맥 중 하나 이상에서 얻어지는 식물 가수분해물; 콜레스테롤이나 포화 및/또는 불포화 지방산과 같은 지질 보충물; CuSO₄·5H₂O, ZnSO₄·7H₂O, 구연산철 등과 같은 미량 원소; 성장 인자와 같은 하나 이상의 호르몬; 푸트레신, 아미노산, 비타민, 불포화 지방산과 같은 지방산, 뉴클레오사이드, 중탄산나트륨, 글루코스와 같은 탄소원, 철분 결합 물질 등을 포함할 수 있다. 세포 배양 배지에 첨가될 수 있는 이들 성분들의 함유량은 당업계에 잘 알려져 있다.

인플루엔자 바이러스를 증식하기 위하여 인플루엔자 바이러스에 감염되는 숙주 배양 세포는 바이러스의 증식에 사용되는 임의의 세포주가 사용될 수 있다. 예를 들어, 원숭이 신장 세포에서 유래한 베로 세포나 BSC 세포, 개 신장 세포에서 유래한 Madin-Darby Canine Kidney(MDCK) 세포, 햄스터 신장 세포에서 유래한 BHK-21 세포, 사람 배아 신장 세포에서 유래한 HEK 세포를 사용할 수 있다. 하나의 실시예에서 인플루엔자 바이러스에 대한 민감도(susceptibility)가 높은 MDCK 세포주를 사용할 수 있지만, 본 발명에서 사용될 수 있는 숙주 배양 세포가 MDCK 세포주에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어, MDCK 세포주로서 ATCC CCL-34 세포주, ATCC PTA-7909 또는 PTA-7910에서 유래한 것을 사용할 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 대한민국 공개특허 제10-2012-0024464호에 개시되어 있는 ATCC CCL-34 유래의 MDCK Sky1023(DSM ACC3112), MDCK Sky10234(DSM ACC3114) 또는 MDCK Sky3851(DSM ACC3113) 세포주나 대한민국 등록특허 제10-1370512호에 개시되어 있는 MDCKS-MG 세포주(KCLRF-BP-00297)와 같은 MDCK 세포주를 사용할 수 있다. 특히 바람직하게는 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며 부착을 위한 별도의 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능하며, 종양유발성이 낮은 대한민국공개특허 제10-2012-0024464호에 개시된 MDCK 세포주이다.

예를 들어 숙주 배양 세포는 배양 배지에 1 X 10⁵ ~ 2 X 10⁶ cell, 바람직하게는 1.5 X 10⁵ ~ 1 X 10⁶ cell의 밀도로 접종될 수 있다. 예시적인 하나의 실시형태에서, 배양 세포는 배양 배지에 접종 가능한 배양 세포 밀도의 30 ~ 60%의 접종 밀도로 접종된다. 배양 세포의 접종 밀도가 전술한 범위 미만이거나 전술한 범위를 초과하는 경우에는 화학식 (Ⅰ)의 화합물, 바람직하게는 화학식 (Ⅱ)의 화합물을 배양 배지에 첨가하더라도, 인플루엔자 바이러스가 원하는 정도로 증식되지 않을 수 있다.

본 발명에 따라 증식 대상이 되는 인플루엔자 바이러스는 임의 타입의 인플루엔자 바이러스로서, 인플루엔자 A형, B형 또는 C형 중에서 선택될 수 있다. 예시적인 실시예에서는 A/H1N1, A/H3N2 및 B형 인플루엔자 바이러스를 사용하였으나, 본 발명에 따라 화학식 (Ⅰ)의 화합물, 바람직하게는 화학식 (Ⅱ)의 화합물을 배양 배지에 첨가하였을 때 증식될 수 있는 인플루엔자 바이러스가 이들 특정 타입의 인플루엔자 바이러스로 한정되지 않는다. 예를 들어 A/H1N1 타입으로서 A/California/4/09, A/WS/33, IVR-116, IVR-145 또는 IVR-148 등의 균주가 사용될 수 있고, A/H3N2 타입으로서 A/Mississippi/1/85, A/Hongkong/8/68, NYMC X-161B, NYMC X-157 또는 IVR-147 등의 균주가 사용될 수 있으며, B형 인플루엔자 바이러스로서는 B/Shandong/7/97, B/Lee/40, B/Malaysis/2506/2004, B/Florida/4/2006 또는 B/Brisbane/60/2008 등의 균주가 사용될 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 인플루엔자 바이러스는 대략 100 ~ 500, 바람직하게는 200 ~ 400 PFU의 투입량으로 배양 배지에 투여될 수 있다. 이 정도의 투여량으로, 배양 배지에 접종된 숙주 배양 세포를 충분히 감염시켜, 원하는 만큼의 인플루엔자 바이러스 증식을 기대할 수 있다.

한편, 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물, 바람직하게는 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물, 이들 화합물의 약학적으로 허용되는 염 또는 이들 화합물의 가능한 이성체는 배양 세포가 접종된 배양 배지에 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 뒤에 첨가하여도 되고, 배양 세포가 접종된 배양 배지에 인플루엔자 바이러스를 감염시키기 전에 첨가하여도 되며, 배양 세포가 접종된 배양 배지에 인플루엔자 바이러스를 감염시키는 것과 동시에 첨가할 수 있다. 바람직하게는 인플루엔자 바이러스를 감염시키기 전이나 감염시킨 후에 첨가할 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물, 바람직하게는 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물, 이들 화합물의 약학적으로 허용되는 염 또는 가능한 이성체는 배양 배지에 0.1 ~ 1000 μΜ, 바람직하게는 5 ~ 100 μΜ, 특히 바람직하게는 5 ~ 20 μΜ의 농도로 첨가될 수 있다. 이들 화합물의 농도가 전술한 범위 미만이면 인플루엔자 바이러스 증식 증대 효과를 기대하기 어렵고, 이들 화합물의 농도가 전술한 범위를 초과하더라도 인플루엔자 바이러스 증식 효과가 크게 증가하지 않기 때문이다.

한편, 인플루엔자 바이러스에 감염되고 화학식 (Ⅰ) 및/또는 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물이 첨가된 배양 배지에 접종된 숙주 배양 세포를 약 24 ~ 120 시간, 바람직하게는 24 ~ 72 시간 정도 배양하면, 충분히 증식된 인플루엔자 바이러스를 얻을 수 있다. 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니지만, 배양 배지의 pH는 대략 6.0 ~ 8.0, 바람직하게는 6.5 ~ 7.5를 유지하고, 배양 온도는 약 25 ~ 45℃, 바람직하게는 약 30 ~ 40℃를 유지하면, 숙주 배양 세포의 배양을 통하여 인플루엔자 바이러스를 대량으로 증식할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 방법을 통하여 대량으로 증식된 인플루엔자 바이러스가 함유된 세포 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하고, 선택적으로 정제된 인플루엔자 바이러스를 약독화 및/또는 불활성화하여 인플루엔자 바이러스 백신을 제조하는 방법을 제공한다.

세포 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 분리, 정제하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 하나의 실시형태에서, 인플루엔자 바이러스를 분리, 정제하기 위해서 인플루엔자 바이러스를 포함하는 세포 배양액을 세정, 정화하고, 이어서 세포 배양액을 농축 및/또는 버퍼 교환한 뒤, 크로마토그래피로 정제하고 다시 농축 및/또는 버퍼 교환한 뒤에 멸균 처리할 수 있다. 농축 및/또는 버퍼 교환과 관련해서는 투석, 한외여과(UF), 정밀여과와 같은 막 여과가 사용될 수 있으며, 농축 과정을 통하여 인플루엔자 바이러스는 예를 들어 2X 내지 10X 이상으로 농축될 수 있다. 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위한 크로마토그래피 공정으로서, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 수산화인회석(hydroxyapatite) 크로마토그래피가 특히 적용될 수 있다.

배양 배지에서 숙주 배양 세포를 배양하는 과정 및/또는 세포 배양물로부터 분리되어 정제된 인플루엔자 바이러스를 약독화 및/또는 불활성화하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 약독화된 생백신(attenuated live vaccine)을 제조하기 위해서, 배양 단계에서 숙주 배양 세포를 여러 번 계대 배양하고 바이러스의 냉각 적응(cold adapting)을 사용하여 숙주 배양 세포를 감염시킨 인플루엔자 바이러스의 약독화 변이를 유도할 수 있다. 선택적으로, 생물 유전학적으로 연관이 깊은 다른 종으로부터 이형 바이러스를 만들거나, 또는 온도에 예민한 바이러스 변종을 선택하거나, 또는 숙주 배양 세포내에서 2종류 이상의 모 바이러스(parental virus)를 동시에 감염시켜 상호간 유전자 재배열을 일으킨 일종의 돌연변이 유전자 재배열 바이러스(reassortant virus)를 선택하는 방법 등이 채택될 수 있다.

선택적으로, 유전자 재조합 기법을 사용하여 인플루엔자 바이러스의 병원성과 관련된 특정 염기 서열을 변환시키거나 또는 결손시키는 등의 방법으로 돌연변이시킨 후, 야생주(wildtype) 인플루엔자 바이러스의 유전자에 삽입하여 원하는 약독화된 바이러스주를 대량으로 생산하는 방법이 고려될 수도 있다. 예를 들어 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 중에서 HA1/HA2 절단 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 선택적으로 유전자 재조합을 이용한 또 다른 방법은 병원성이 거의 없는 것으로 알려진 바이러스를 운반체(vector, carrier)로 사용하여 운반체 바이러스 유전자에 면역성을 원하는 바이러스의 유전자를 삽입하는 방법을 사용할 수도 있다. 이러한 방법으로 약독화된 인플루엔자 바이러스를 분리한 뒤에 크로마토그래피와 같은 정제 공정을 사용하여, 약독화된 인플루엔자 바이러스를 분리, 정제할 수 있다.

다른 대안적인 실시형태에서, 정제된 인플루엔자 바이러스를 사백신(killed vaccine)의 형태로 불활성화하는 방안이 채택될 수 있다. 이른바 사백신 형태의 인플루엔자 바이러스 백신을 얻기 위하여 본 발명에 따라 대량으로 증식, 정제된 인플루엔자 바이러스에 대하여 생화학적 순화 과정과 물리적 불활성화 과정을 진행할 수 있다. 선택적으로 정제된 인플루엔자 바이러스에 불활성화된 톡소이드를 이용하거나, 얻어진 인플루엔자 바이러스의 표면 성분을 정제하여 다른 성분과 결합하는 방법이 채택될 수도 있다.

사백신을 얻기 위하여 수득된 인플루엔자 바이러스를 불활성화, 분할 및/또는 서브유닛(subunit) 백신 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 서브유닛 백신은 면역계를 활성화시키는 인플루엔자 바이러스의 부분만을 분리할 수 있다. 서브유닛 백신을 위하여 정제된 인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA를 사용할 수 있으며, 인플루엔자 바이러스 단백질의 혼합물을 이용하여 서브유닛 백신을 제조할 수 있다. 이를 위하여, 예를 들면 HA와 같은 인플루엔자 바이러스 단백질은 재조합 바이러스 형태로부터 추출되고, 서브유닛 백신은 WHO에 의해 권장되는 균주로부터의 이러한 바이러스 단백질의 혼합물을 함유하도록 제형화 될 수 있다.

분할 백신은 외피보유 인플루엔자 바이러스를 예를 들어 트리톤 X-100, 옥틸글루코시드, 디지토닌, 노나노일-N-메틸푸카미드(Mega 9), C12E8 등과 같은 비이온성 세제로 처리하여 그 안에 있는 HA 및/또는 NA를 가용화시켜 얻을 수 있다. 필요하다면, 가용화 처리 후에 포스파티딜콜린과 같은 지질 혼합물을 가하여 ISCOM 항원보강제와 같은 항원보강제를 첨가할 수 있다.

불활성화 백신은 수득된 인플루엔자 바이러스를 불활성화시키고, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 백신으로 사용하기 위하여 제조될 수 있다. 불활성화 공정, 서브유닛 백신의 정제 및/또는 분할은 전술한 정제 공정 전 또는 후에 수행될 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 불활성화를 위해서 수득된 인플루엔자 바이러스를 약독화하기에 유효한 양의 UV 조사, 포름알데히드, 글루타르알데히드, 2원성 에틸렌이민(BEI) 및 베타프로피오락톤 등으로 처리할 수 있다.

이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 발명으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 화학식 (Ⅱ) 화합물의 배지 첨가에 의한 인플루엔자 바이러스의 증식 증가

인플루엔자 바이러스를 배양할 때 숙주 배양 세포에 화학식 (Ⅱ)의 화합물을 처리하였을 때, 인플루엔자 바이러스의 증식 정도를 분석하였다. 숙주 배양 세포로서 사용되는 세포주는 인플루엔자 바이러스의 susceptibility가 높은 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell을 이용하였으며, 세포 배양을 통해 증식하고자하는 바이러스는 3가 인플루엔자 백신의 subtype인 H1N1, H3N2, 인플루엔자 B형으로 각 A/H1N1/California/4/09, A/H3N2/Mississippi/1/85, B/shandong/7/97을 사용하였다. 인플루엔자 바이러스를 배양하기 위해서 6-well plate를 이용하여 MDCK cell을 4 x 10⁵ cells/well로 접종한 뒤, 인플루엔자 바이러스를 300 pfu/well로 감염하였다. 인플루엔자 바이러스를 감염시키기 위하여, 배양 배지인 MEM media(Gibco, USA)에서 10% FBS(Hyclone, USA), 1% Antibiotic-Antimycotic(100X, Gibco, USA)을 제거한 뒤 1X PBS(10X PBS. bioworld technology, USA)를 이용하여 배양 세포를 세척하고, 희석한 인플루엔자 바이러스 100 ㎕를 처리하였다. 1시간 동안 37℃에서 incubation하고(MCO-15AC, sanyo, Japan), 대조군에는 무혈청 배지에 protease inhibitor인 TPCK(Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone)으로 처리한 트립신(Sigma, USA)을 1 ㎍/㎖의 농도로 첨가해준 뒤, 각 well에 인플루엔자 바이러스를 1 ㎖씩 분주하였다. 실험군에는 무혈청 배지에 TPCK-treated 트립신을 1 ㎍/㎖, 화학식 (Ⅱ)의 화합물(A.G scientific.Inc, USA)을 12.5 μM의 농도로 첨가 해준 뒤, 각 well에 1 ㎖씩 분주하였다. 각 그룹당 n수는 4~6으로 진행하고, 24 시간, 48 시간, 72 시간 배양한 뒤, scraper를 이용하여 배양 배지 내의 cell을 긁어내어 상층액과 함께 수집하였다. 5000 rpm에서 10분 원심분리(Micro 17R, 한일과학, Korea)를 한 뒤 상층액만 얻었다. 이 상층액을 이용하여 plaque assay를 통해서 인플루엔자 바이러스의 농도를 결정하였다.

인플루엔자 바이러스 Plaque assay는 다음과 같이 진행하였다. 실험 하루 전, MDCK cell을 6-well plate에 1 x 10⁶ cells/well로 접종하였다. 실험 당일, 인플루엔자 바이러스 sample을 10^-4, 10^-5으로 희석하여 준비하고, 전 날 준비한 숙주 배양 세포가 접종된 배지를 제거하고, PBS를 이용하여 한 차례 세척한 뒤, 희석하여 준비한 인플루엔자바이러스 sample을 각 well당 100 ㎕씩 처리하며 37℃에서 1시간동안 incubation하였다. 1시간 후, overlay media를 각 well당 3 ㎖ 분주하여 굳힌 후 37℃에서 3일 동안 배양하였다. overlay media 조성은 다음과 같다. 2% agarose gel(Seakem® GTG® Agarose, Lonza, switzerland), 2X DMEM media(powder, Gibco, USA), 0.25% Trypsin(Gibco, USA). 2% agarose gel과 2X DMEM을 1:1의 비율로 섞은 다음 0.25% Trypsin을 total volume의 0.4%가 되도록 넣어주었다. 결과적으로 1% agarose gel, 1X DMEM, 0.001% Trypsin이 되도록 하였다. 3일 후 고정액(methanol(Hayman, UK) : acetic acid(Duksan, Korea) = 3:1)을 각 well당 1 ㎖씩 넣어준 후 10분 이상 실온에서 incubation하고, 고정액을 버리고, overlay media을 syringe needle을 이용하며 제거하였다. 이 후 crystal violet(Sigma, USA) 용액을 각 well당 1 ㎖씩 넣어 cell이 충분히 염색될 때까지 10분 이상 실온에서 incubation하였다. tab water로 crystal violet을 씻어낸 후 형성된 Plaque의 개수를 세어 다음과 같이 계산하여 바이러스 농도를 결정하였다.

바이러스 농도 = plaque개수 x 희석배수 x 10(㎖/100 ㎕(infection volume)) pfu/ml

본 실시예에 따른 측정 결과가 도 1a 내지 도 1c에 도시되어 있다. 48 시간 배양에서 인플루엔자 바이러스의 농도가 가장 높았으며, 경우에 따라서 1.5배에서 30배까지 다양한 차이를 보였지만 화학식 (Ⅱ)의 물질을 배양 배지에 첨가한 실험군에서 인플루엔자 바이러스의 농도가 높게 계산되었다. 72 시간 배양에서는 인플루엔자 바이러스 농도가 약간 떨어지지만 여전히 실험군에서 높게 측정되었다.

실시예 2 : HA의 정량 분석을 위한 flow cytometer 분석

실시예 1에 따라 화학식 (Ⅱ)의 물질로 처리할 때, 인플루엔자 바이러스의 생산수율이 증가한다는 것을 증명하기 위해 인플루엔자 바이러스의 바이러스 budding out의 증가를 보기 위하여 MDCK cell 표면에 발현된 Hemagglutinin의 정량적인 분석을 위해 Flow cytometer 분석을 수행하였다. MDCK cell을 4 x 10⁵ cells/well로 seeding한 후, media를 제거하고 PBS를 이용하여 washing한 뒤, 인플루엔자 바이러스(A/California/4/09) 300 pfu/well로 처리하였다. 1시간 동안 37℃에서 incubation한 뒤, 대조군에는 무혈청 배지에 TPCK-treated Trypsin을 1 ㎍/㎖의 농도로 첨가해준 뒤, 각 well에 1 ㎖씩 분주하였고, 실험군에는 무혈청 배지에 에 TPCK-treated Trypsin을 1 ㎍/㎖의 농도, 화학식 (Ⅱ)의 물질을 12.5 μM의 농도로 첨가 해준 뒤, 각 well에 1 ㎖씩 분주하였다. 각 그룹의 n수는 3으로 하였으며, 24 시간, 48 시간 후에 Trypsin-EDTA(Gibco, USA)를 이용하여 cell을 plate에서 떼어내었다. 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한 뒤 wash buffer(3% FBS, 0.02% sodium azide(sigma, USA) in PBS)로 resuspension해준 뒤 같은 조건에서 원심분리하였다. Anti-influenza A HA(Thermo fisher scientific, USA)를 1:100으로 wash buffer에 희석하여 cell을 현탁시킨 뒤, ice에서 1시간 동안 incubation하였다. 이 후 1500 rpm에서 5 분 동안 원심분리한 뒤, wash buffer로 2회 세척하였다. 2차 항체로 FITC-Anti-rabbit IgG(Santa cruz biotechnology, USA)를 wash buffer에 1:200으로 희석해준 후, cell에 처리한 후, ice에서 30분 동안 incubation하였다. 30분 후 wash을 세 번 해준 후, 1% paraformaldehyde(sigma, USA)로 고정하였다. 이 후 flow cytometer(CantoⅡ, BD biosciences, USA)를 이용하여 분석하였다. 본 실시예에 따른 분석 결과는 도 2에 도시되어 있다. 분석 결과, 24 시간, 48 시간에서 실험군에서 인플루엔자 바이러스의 HA 발현이 증가하였음을 확인하였다.

실시예3 : 화학식 (Ⅱ) 물질 처리 시점에 따른 인플루엔자 바이러스 농도 변화 측정

화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물의 첨가 시점을 달리하여 배양 배지에 접종된 숙주 세포에게 어느 시점에서 영향을 미치는지 분석하였다. 숙주 배양 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시킨 뒤, 세포 배양액에 화학식 (Ⅱ) 화합물을 첨가하는 공정, 숙주 배양 세포에 화학식 (Ⅱ) 화합물을 첨가한 뒤 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 공정, 인플루엔자 바이러스와 함께 화학식 (Ⅱ) 화합물을 첨가하는 공정을 각각 사용하여 인플루엔자 바이러스의 농도 변화를 비교하였다. 화학식 (Ⅱ) 화합물의 처리시점으로 나눈 그룹은 다음과 같다. 1) 화학식 (Ⅱ) 화합물을 처리하지 않은 대조군(control), 2) 인플루엔자 바이러스 감염 후 배양액에 12.5 μM 농도의 화학식 (Ⅱ) 화합물로 처리(사후처리), 3) 인플루엔자 바이러스 감염하기 1시간 전 12.5 μM의 화학식 (Ⅱ) 화합물로 처리(사전처리), 4) 인플루엔자 바이러스 감염 시 바이러스를 희석한 배양액에 12.5μM의 화학식 (Ⅱ) 화합물로 처리하여 바이러스 감염과 동시에 처리함(동시처리).

바이러스 감염 후 모든 그룹의 배양액은 TPCK-treated trypsin(1 ㎍/㎖)을 포함하였다. 이후 48시간 동안 37℃에서 incubation한 후, cell을 scraper로 긁은 후 배양액과 함께 거둔 후, 5000 rpm, 10분의 조건으로 원심분리 후 상층액을 얻어 plaque assay를 통해 바이러스 농도를 결정하였다. n수는 4로 하였다. 인플루엔자 바이러스 Plaque assay는 실시예 1과 동일하게 진행하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과는 도 3에 도시되어 있다. 대조군과 비교하여, 화학식 (Ⅱ) 화합물로 처리한 세 개의 그룹에서 모두 인플루엔자 바이러스의 농도가 증가하였다. 대조군과 대비하여, 인플루엔자 바이러스의 농도가 사후처리군 3.9배, 사전처리군 3.8배, 동시처리군 2배 증가하였다. 이 실험 결과는 세포 배양액에 화학식 (Ⅱ) 화합물의 처리시점과 무관하게 인플루엔자 바이러스의 증식을 유도할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 4 : cAMP inhibitor 처리 후 화학식 (Ⅱ) 처리에 따른 바이러스 농도 변화 측정

본 실시예에서는 화학식 (Ⅱ) 화합물에 의해 인플루엔자 바이러스의 증식이 증가하는 기전이 cAMP의 level 증가에 의해서인지 확인하기 위해 adenylyl cyclase inhibitor인 SQ22,536(sigma, USA)을 처리하여 비교하였다. 그룹은 다음과 같이 설정하였다. 1) 화학식 (Ⅱ) 화합물과 SQ22,536 모두 처리하지 않은 그룹(대조군, control), 2) 인플루엔자 바이러스 감염 후, 화학식 (Ⅱ) 화합물 12.5 μM을 처리한 그룹(실험군), 3) 인플루엔자 바이러스 감염 전 SQ22536을 20 μM 처리하고, 1시간 후 SQ22535을 제거한 후 인플루엔자 바이러스를 감염시키고 이후 배양액에 화학식 (Ⅱ) 화합물 12.5 μM으로 처리한 그룹(억제제 처리군). 바이러스 감염 후 모든 그룹의 배양액은 TPCK-treated trypsin (1 ㎍/㎖)을 포함하였다. 이후 48 시간 동안 37℃에서 incubation한 뒤, 48시간 후 cell을 scraper로 긁은 후 배양액과 함께 수집하였다. 5000rpm, 10분의 조건으로 원심분리 후 상층액을 얻어 plaque assay를 통해 바이러스 농도를 결정하였다. n수는 4로 하였으며, 인플루엔자 바이러스 Plaque assay는 실시예 1과 동일한 절차로 진행하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과는 도 4에 도시되어 있다. 대조군과 비교해서 실험군에서 인플루엔자 바이러스의 농도는 3.9배 증가한 반면, 억제제 처리군에서 인플루엔자 바이러스의 농도는 대조군 대비 2.3배 증가하였으며, 실험군과 비교하여 1.7배 감소하였다. 실험 결과를 토대로, cAMP level이 인플루엔자 바이러스의 증식에 영향을 미친 것으로 보이며, 특히 cAMP level을 억제하는 경우, 화학식 (Ⅱ) 화합물에 의한 인플루엔자 바이러스의 증식 유도를 어느 정도 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 5 : 화학식 (Ⅱ) 물질 처리에 의한 바이러스 증식 증가의 기전 분석

(1) 마이크로어레이 분석

화학식 (Ⅱ) 물질의 첨가에 따른 인플루엔자 바이러스증식을 증가시키는데 미치는 영향을 알아보기 위해 Microarray를 수행하였다. Microarray를 수행하기 위한 sample은 다음과 같이 준비하였다. 6-well plate에 MDCK cell을 4 x 10⁵ cells/well로 준비한 뒤 인플루엔자 바이러스(A/California/4/09)를 300 pfu/well로 감염시켰다. 감염을 위해서, 세포 배지를 제거하고 PBS를 이용하며 세척한 뒤, 미리 희석한 인플루엔자 바이러스를 100 ㎕의 부피로 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 incubation하였다. 1시간 후, 대조군에는 무혈청 배지에 TPCK-treated Trypsin을 1 ㎍/㎖의 농도로 첨가해준 뒤, 각 well에 1 ㎖씩 분주하였다. 실험군에는 무혈청 배지에 TPCK-treated Trypsin을 1 ㎍/㎖의 농도, 화학식 (Ⅱ)의 물질을 12.5 μM의 농도로 첨가 해준 뒤, 각 well에 1 ㎖씩 분주하였다. 37℃에서 48시간 incubation한 뒤, cell scraper를 이용하여 cell을 긁어내 media와 함께 모은 뒤 5000rpm, 10분으로 원심분리하여 상층액은 새 tube로 옮긴 뒤, cell pellet은 trizol(RNAiso plus, Takara, Japan) 300 ㎕을 넣고 resuspension을 하고 5분 동안 incubation하였다. chloroform(sigma, USA) 80 ㎕을 넣고 voltex하고 10분 incubation한 뒤, 12500 rpm, 15분의 조건으로 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액에 glycoblue(Ambion®, USA) 1 ㎕, isoprophyl alcohol(Hayman, UK) 200 ㎕을 넣고 inverting한 후 상온에서 10분 incubation하였다. 이어서, 12500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 pellet을 확인한 후 상층액을 제거하였다. 75% ethanol in DEPC water(MPbio, USA) 을 이용하여 pellet을 씻었다. 9500 prm에서 5분 동안 원심분리하여 75% ethanol(absolute alcohol, Merck, USA)을 제거하였다. pellet을 완전히 건조한 후, DEPC water 20 ㎕을 사용하여 pellet을 녹였다. RNA sample을 이용하여 Microarray를 진행하였다. 이용한 Microarray chip은 Agilent사의 Agilent Canine 4x44K Microarray이고, 측정 결과는 도 5에 도시되어 있다.

Microarray결과, 인플루엔자 바이러스가 관여하는 신호전달기전 중, 바이러스에 대한 Host의 antiviral response(IRF3, Viperin, MxA, OAS, HSP70...), innate immune response(TLR3, RIG-I, MDA5, MyD88...) 에 관여하는 유전자들이 감소되어 있었으며, MAPKinase pathway, 인플루엔자 Ribonucleoprtein과 결합하여 인플루엔자의 증식에 도움이 되도록 역할을 하는 유전자(Importin α5)들의 발현이 증가되어 있었다.

(2) 샘플 분석

마이크로어레이를 수행한 sample의 인플루엔자 바이러스 농도를 결정하기 위하여 새 tube에 옮긴 상층액에 대하여 실시예 1과 동일한 plaque assay를 진행하여 바이러스 농도를 결정하였다. 본 실시예에 따라 인플루엔자 바이러스 농도 측정 결과는 도 6에 도시되어 있다. 대조군과 대비하여, 인플루엔자 바이러스 농도는 화학식 (Ⅱ)의 물질을 처리한 실험군에서 약 24배 증가하였다.

실시예 6 : 화학식 (Ⅱ) 물질의 처리에 의한 숙주 세포의 항바이러스 활성 분석

Microarray 분석 결과를 바탕으로 Quantitative Reverse transcription-PCR(qRT-PCR)을 진행하여 실제 유전자발현의 증감을 확인하였다. Microarray에 사용한 RNA sample의 일부를 cDNA로 합성함. 사용한 cDNA 합성 kit는 High capacity cDNA Reverse Transcription kit(applied biosystems, USA)이었다. qRT-PCR은 Syber green(SYBR® premix Ex Taq™ Ⅱ, Takara, Japan)을 사용하였으며, 각각의 유전자를 증폭시키기 위하여 사용된 primer가 표 1에 표시되어 있다.

본 실시예에 따른 분석 결과는 도 7a 내지 도 7o에 각각 도시되어 있다. 선천성 면역계(innate immune system)의 주요한 역할을 수행하는 Toll like recepter(TLR)의 하위 유전자인 MyD88(도 7a), DDX58(도 7b), MDA5(도 7c)의 경우 실험군에서 발현량이 감소하였다. 숙주 세포에서 항바이러스 반응에 관여하는 유전자인 IRF3(도 7d), IRF7(도 7e), Mx1(도 7g), OAS1(도 7h), OAS2(도 7i), ISG15(도 7j), AP-1(도 7l) 역시 실험군에서 발현량이 감소하였다. 또한, 인플루엔자 바이러스의 Ribonucleoprotein(vRNP)과 결합하여 숙주세포 내 핵으로부터 vRNP가 export하지 못하도록 억제하는 단백질인 HSP70(도 7m)의 발현도 실험군에서 감소하였으며, 인플루엔자 바이러스의 budding out을 억제하는 viperin(도 7n)의 발현양도 감소하였음. IFNβ는 유의미한 값은 보이지 않았지만 감소하는 경향을 보인다(도 7f). 반면, 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오단백질(nucleoprotein, NP)의 발현량은 대조군에 비하여 실험군에서 약 8.3 배 증가하였다.

qRT-PCR에 사용된 프라이머 서열(5'→3')

증폭 표적 유전자	정방향(Forward)	역방향(Reverse)
18S	CGGACAGGATTGACAGATTG	CAAATCGCTCCACCAACTAA
Influenza A NP (A/California/4/09)	CCAGATCAGTGTGCAGCC	CTTCTGGCTTTGCACTTT
IRF3	CAGTACCTCGGATACCCAGGAAG	GAATGGGGTCAAGACCATGTCAC
IRF7	TCAGCACGTTCTTCCGAGAGAT	TAGATGGTGTAGTATGGGGAGCC
Mx1	GAATCCTGTACCCAATCATGTG	TACCTTCTCCTCATATTGGCT
ISG15	TCTGTGCCCCTGGAGGACTTG	TGCTGCTTCAGCTCTGATGCCA
IFNβ	CCAGTTCCAGAAGGAGGACA	TGTCCCAGGTGAAGTTTTCC
Viperin	AAGATGGAGCAAGCCTTCAA	TGCATTATCGACGGATTTCA
MyD88	GCTTGATGATCCCTCAGGGCAAA	CGCTGGGGCAGTAGCAGAT
DDX58	CAGAATGATCCAAACCAGAGGCA	GTTAGAAGGAAGCACTTGCTACC
MDA5	TGCAGTGTGCTAGCCTGTTC	TAAGCCTTTGTGCACCATCA
AP-1	TCTATGTCCGTTCCGACTCC	GGTTGCTGGGCACAAGTATT
PKR	TGCTTTGGGGCTAATTCTTG	GTCGTTTCATGGGCTCAAGT
HSP70	TGCTGAGGATCATCAACGAG	CTTGAACTCCTCCACGAAG
OAS2	ACGGTCCTTGAGTTGGTCAC	CGGTAGCGTCTTTTGCTAGG

실시예 7: 화학식 (Ⅱ) 물질 처리에 의한 숙주 배양 세포의 증식 억제

본 실시예에서는 화학식 (Ⅱ) 물질 첨가로 인하여 숙주 배양 세포로 사용된 MDCK 세포주의 증식 정도를 확인하기 위하여 cell proliferation 실험을 진행하였다. cell proliferation 실험을 위해서 Cell counting kit-8(CCK8) 분석과 wound healing assay를 진행하였다.

(1) CCK8 분석

CCK8(dojindo, Japan) 을 진행하기 위해 하루 전날 96-well plate에 MDCK 세포주를 5000 cells/well로 접종하고, 24 시간 동안 37℃ incubator에서 pre-incubation하였다. 각 well에 CM MEM media(대조군)), EtOAc(음성대조군, NC)(sigma, USA), 화학식 (Ⅱ)의 화합물 6.25 μM, 12.5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM이 되도록 10 ㎕씩 처리하였다. 이후 37℃ incubator에서 incubation하면서 6, 12, 24, 48 시간마다 CCK8 solution을 10 ㎕씩 넣고 2시간 30분후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험 결과는 도 8에 도시되어 있다. 화학식 (Ⅱ)의 물질을 처리한 실험군에서 대조군과 음성대조군과 비교하여 12시간 이후부터 흡광도의 차이가 관찰되었다. 화학식 (Ⅱ)의 물질을 처리한 MDCK 세포주의 흡광도 값이 대조군 및 음성대조군보다 낮게 나타나 cell proliferation이 억제된 것을 알 수 있었다.

(2) wound healing assay

화학식 (Ⅱ) 물질 처리에 의한 MDCK cell의 proliferation 억제를 재확인하기 위하여 wound healing assay를 진행하였다. 실험 하루 전, 6-well plate에 MDCK cell을 1.5 x 10⁶ cells/well로 준비하였다. cell starvation을 위해 기존 media를 제거하고 PBS로 washing한 후, Serum Free media로 media를 2 ㎖/well로 넣어주었다. 6시간 정도 starvation한 후, media 제거 없이 멸균된 200 ㎕ tip을 이용하여 가로 3줄, 세로 3줄로 cell을 긁어냈다. 이후 media를 제거하고, PBS를 이용하여 떨어져나간 두 세 차례 cell debris가 완전히 제거될 때까지 세척하였다. 각 well에 CM media(mock), 화학식 (Ⅱ)의 물질 12.5 μM, 100 μM이 되도록 처리한 media를 넣은 후, 37℃ incubator에 18 시간 동안 incubation하였다. 18 시간 이후 cell을 긁어낸 부분에 cell이 차오른 모습을 관찰하였다. 관찰 결과는 도 9에 도시되어 있다. 대조군의 MDCK 세포에서는 긁어낸 부분이 거의 꽉 차오른 모습을 보였지만, 실험군의 MDCK 세포에서는 긁어낸 부분에서의 빈공간이 더 많이 보여, cell의 proliferation이 덜 된 것을 확인하였다.

실시예 8 : cell density에 따른 인플루엔자 바이러스 증식 비교

본 실시예에서는 MDCK-cell의 접종 밀도를 달리한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하여 인플루엔자 바이러스의 농도 증가를 결정하였다. MDCK 세포를 준비할 때, 6-well plate에 30% confluence(1.8 x 10⁵ cells/well), 60% confluence(3.6 x 10⁵ cells/well), 100%(7.2 x 10⁵ cells/well)로 준비하였다. 이후 48시간 동안 37℃ incubator에서 배양하여 바이러스를 수집한 뒤, 실시예 1과 동일한 절차로 plaque assay를 진행하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과는 도 10에 도시되어 있다. 특히, 30%의 접종 밀도 및 60%의 접종 밀도로 MDCK 세포를 접종하였을 때, 인플루엔자 바이러스의 농도가 크게 증가한 것을 확인하였다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 기술하였으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야의 평균적 기술자라면 상술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다 할 것이다. 그러나 그러한 변형과 변경은 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부하는 청구의 범위를 통하여 더욱 분명해질 것이다.

Claims (8)

1. (a) 배양 배지에 배양 세포를 접종시키는 단계;
   (b) 상기 접종된 배양 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계;
   (c) 상기 인플루엔자 바이러스에 감염된 배양 세포를 배양하는 단계; 및
   상기 (a) 단계와 상기 (b) 단계 사이, 상기 (b) 단계와 상기 (c) 단계 사이, 또는 상기 (b) 단계에서 상기 배양 배지에 하기 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물을 첨가하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스를 증식하는 방법.
   

   

   
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 배양 세포는 MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포주인 방법.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물은 상기 배양 배지에 0.1 ~ 1000 μΜ의 농도로 첨가되는 방법.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 A/H1N1형, A/H3N2형 및 B형으로 구성되는 군에서 선택되는 인플루엔자 바이러스인 방법.
   
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 따라 얻어진 세포 배양물로부터 상기 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계; 및
   상기 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계 이전 또는 이후에 상기 인플루엔자 바이러스를 약독화 또는 불활성화하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신을 제조하는 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

Images