KR102445388B1 - Mdck 세포의 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 마이크로 캐리어를 이용하여 배양하는 경우 확장배율이 4.5 이상을 나타내는 클론화 MDCK 세포 및 상기 MDCK 세포의 배양방법, 상기 MDCK 세포의 배양방법을 이용하여 바이러스를 증식하는 방법, 및 마이크로 캐리어를 이용하여 배양하는 경우 확장배율이 4.5 이상을 나타내는 클론화 MDCK 세포에 관한 것이다.

Description

MDCK 세포의 배양 방법
본 발명은, 마이크로 캐리어(microcarrier)를 이용한 MDCK 세포의 배양방법 및 마이크로 캐리어 배양에 적합한 MDCK 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 마이크로 캐리어를 이용하여 MDCK 세포를 배양하는 것에 의한, 바이러스의 증식방법에 관한 것이다.
본 출원은, 참조에 의해 여기에 원용되는 부분의 일본 출원, 특허 출원 2016-65251호 우선권을 청구한다.
최근, 의약품 생산 및 재생 의료 등 다양한 분야에서 세포, 조직, 미생물 등을 효율적으로 대량 배양하는 것이 요구되고 있다. 특히, 바이오 의약품 및 재생 의료의 실용화를 위해서는, 세포의 대량 배양 기술의 확립이 중요하다. 세포의 대량 배양은, 단클론 항체, 재조합 단백질, 막단백질, 바이러스 등의 생산 규모로의 이행을 가능하게 하고, 바이오 의약품 등의 실용화를 크게 추진시킬 것으로 기대된다.
접착성을 갖는 세포의 대량 배양 기술로는 마이크로 캐리어 배양법이 알려져 있다. 마이크로 캐리어 배양법은 배양용기 내에 세포, 배양액 및 세포의 접착 발판이 되는 마이크로 캐리어를 도입하고, 배양액을 간헐적으로 교반하여 부유한 세포 및 마이크로 캐리어를 접촉시킴으로써, 세포를 마이크로 캐리어의 표면에 접착시키는 방법이다. 이 방법에 의해, 세포는 마이크로 캐리어의 표면에서 증식한다. 마이크로 캐리어는, 체적비에 대해, 세포가 접착 및 증식하기 위한 매우 큰 표면적을 제공할 수 있으며, 세포의 대량 배양에 적합하다.
세포의 대량 배양 기술을 이용하는 분야의 하나로서, 백신 생산을 들 수 있다. 백신 제조에서는 대상이 되는 바이러스에 대해 감수성을 나타내는 숙주세포를 선택한 후, 배양하여 얻은 대량의 세포에 바이러스를 감염시키고 바이러스를 증식시켜 백신을 제조한다. 백신의 실용화를 위해서는 대량의 바이러스가 필요하기 때문에, 바이러스를 감염시키는 세포를 대량으로 준비할 필요가 있다.
인플루엔자는 매년 전 세계적으로 유행하는 전염병이며, 유행성(pandemic)의 우려도 있기 때문에 대량으로 인플루엔자 백신을 확보하는 것이 필요하다. 인플루엔자 백신의 제조에는, 발육계란을 이용하여 인플루엔자 바이러스를 증식시키는 방법이 이용되어 왔다. 발육계란을 이용한 제조방법은 원료조달 및 품질관리의 장애가 높기 때문에, 배양세포에서 인플루엔자 바이러스를 증식시켜 제조하는 방법이 실용화되고 있다. 그러나, 배양세포에서 바이러스의 증식성이 나쁘고, 신속하면서 충분한 양의 백신 공급에 제약이 생기는 것에 대해 문제시 되고 있다. 그래서 대량 및 신속하게 백신 생산을 수행할 수 있는 시스템의 구축이 급선무가 되고 있다.
인플루엔자 백신의 제조는, 인플루엔자 바이러스의 종자 바이러스(seed virus)를 분리하거나 만들어내는 단계, 종자 바이러스를 증식시키기 위한 발육계란이나 배양세포를 필요량 준비하는 단계, 및 얻어진 종자 바이러스를 발육계란이나 배양세포 등을 이용하여 증식시키는 단계로 구성된다. 배양세포는 각각의 단계에서 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신의 제조에 사용되는 전통적인 배양세포로써 마딩-더비(Madin Darby) 개의 신장 유래 세포(이하, MDCK 세포)와 아프리카 녹색 원숭이의 신장 유래 세포(이하, Vero 세포) 등을 들 수 있다. Vero 세포는 1962년에 아프리카 녹색 원숭이(Cercopithecus aethiops)의 신장 상피 세포에서 분리 및 수립된 소아마비 바이러스(poliovirus)와 일본 뇌염 바이러스 등의 감염에 대한 인간용 백신의 제조에 20년 이상 전부터 사용되어 왔다. Vero 세포는 다양한 바이러스에 대한 감수성을 가지고 인플루엔자 바이러스의 증식에 이용되고 있다. MDCK 세포는 1958년에 정상적인 수컷의 코커 스패니얼(cocker spaniel)의 신장에서 수립된 세포이며, 1968년에 Gaush들에 의해 인플루엔자 바이러스에 대한 감수성이 밝혀져 왔다. MDCK 세포의 배양액에 트립신, 포도당, 비타민 등을 첨가하여 인플루엔자 바이러스에 대한 감수성을 높이는 것이 각종 인플루엔자 바이러스 분리에 이용되어 왔다.
인플루엔자 바이러스를 증식시키는 단계에 사용되는 MDCK 세포에 대한 개발이 시도되고 있다. 예를 들어, 특허문헌 1에는 MDCK 세포주(ATCC CCL-34)를 무혈청 배지에 순화(acclimatization)시켜 현탁(부유) 배양이 가능한 MDCK-33016 주를 수립한 것이 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 2 및 특허문헌 3에는 저온 적합성 인플루엔자 바이러스를 복제할 수 있는 PTA-7909 주 및 PTA-7910 주를 MDCK 세포주(ATCC CCL-34)에서 클로닝한 것이 개시되어다. 한편, 바이러스에 감염된 MDCK 세포는 바이러스 증식을 억제하는 인터페론을 생산하기 때문에, 인터페론을 생산하지 Vero 세포와 비교하여 바이러스가 증식하기 어려운 성질도 있다.
마이크로 캐리어는 세포의 대량 배양에 이용되고 있지만, 마이크로 캐리어를 이용한 MDCK 세포의 대량 배양방법이 확립되어 있다고는 말하기 어렵다. MDCK 세포를 마이크로 캐리어에서 높은 증식 효율을 나타내기 위해서는, 세포와 마이크로 캐리어의 강한 접착력이 요구된다. 그러나, 배양조를 확장(scale-up)할 때 세포계대를 반복하여 세포와 마이크로 캐리어의 접착력이 약해지는 것이 과제가 되었다. 또한 마이크로 캐리어를 이용하여 MDCK 세포를 배양할 때는 교반을 수반하기 때문에 세포가 교반 날개와 배양조 벽 등과 자주 접촉함으로써 세포가 물리적 스트레스를 받는 것으로 생각된다. 이로 인해, 마이크로 캐리어를 이용한 MDCK 세포의 대량 배양시, 세포의 증식 효율의 저하가 문제가 되고 있다.
세포를 대량 배양할 때 일반적으로 소나 말 등의 동물 유래 혈청을 첨가한 배지를 사용한다. 혈청은 호르몬과 성장인자 등의 공급원이 되며, 배양 조작에 의한 물리적 스트레스 완화에 도움이 된다. 마이크로 캐리어를 이용하여 세포를 배양하는 경우, 배양의 효율화에 따른 세포의 대량 증식에 의해 다량의 호르몬과 성장인자 등의 공급이 요구된다. 그러나 혈청의 사용은 안전성이나 공장 규모 생산에서의 적응성에 대한 우려가 있다. 따라서 마이크로 캐리어를 이용한 세포 배양에 있어서, 혈청 배지에서 증식 가능한 세포가 요구되고 있다.
특허문헌 1 : 국제 공개 WO1997 / 037000 특허문헌 2 : 국제 공개 WO2008 / 105931 특허문헌 3 : 국제 공개 WO2010 / 036760
본 발명은 마이크로 캐리어를 이용한 배양에 적응하는 MDCK 세포 및 상기 MDCK 세포의 배양방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, 무혈청 배지에서 높은 세포 증식능 뿐만 아니라 마이크로 캐리어에 강한 접착력을 갖는 MDCK 세포 및 상기 세포를 이용한 배양방법이 마이크로 캐리어를 이용한 배양에 적합한 것으로 나타났다. 또한 상기 세포는 무혈청 배지에서의 배양에 있어서 마이크로 캐리어에서 높은 확장 배율을 갖는 것을 발견하고, 본 발명을 완성했다.
본 발명은, 즉 하기에 의한다.
1. 마이크로 캐리어(microcarrier)를 이용하여 배양할 때 확장 배율이 4.5 이상을 나타내는 클론화(cloning) MDCK 세포의 배양방법.
2. 클론화 MDCK 세포는, 20% 이하의 세포 부유율을 나타내는, 상기 1에 기재된 클론화 MDCK 세포의 배양방법.
3. 클론화 MDCK 세포의 확장 배율은, 클론화 MDCK 세포를 2.0×104 세포/cm2 이하의 세포 파종 밀도로 파종하여 배양한 경우의 것인, 상기 1에 기재된 클론화 MDCK 세포의 배양방법.
4. 클론화 MDCK 세포의 확장 배율은, 클론화 MDCK 세포를 48시간 이상 배양했을 경우의 것인, 상기 1 또는 3에 기재된 클론화 MDCK 세포의 배양방법.
5. 클론화 MDCK 세포는, MDCK 세포 집단을 무혈청 배지에 순화(acclimatization)시킨 후 클론화된 세포인, 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 MDCK 세포의 배양방법.
6. 수탁번호 NITE BP-02014에서 특정된 MDCK 세포를, 마이크로 캐리어를 이용하여 배양하는 것을 포함하는, MDCK 세포의 배양방법.
7. 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 MDCK 세포의 배양방법을 이용하여, 바이러스를 증식하는 방법.
8. MDCK 세포에, 바이러스를 감염시킨 후 인큐베이션(incubation)을 수행하는 것을 포함하는, 상기 7에 기재된 바이러스를 증식하는 방법.
9. 바이러스가, 인플루엔자 바이러스인, 상기 7 또는 8에 기재된 바이러스를 증식하는 방법.
10. 마이크로 캐리어를 이용하여 배양할 때의 확장 배율이 4.5 이상을 나타내는 클론화 MDCK 세포.
11. 클론화 MDCK 세포의 확장 배율은, 클론화 MDCK 세포를 2.0×104 세포/cm2 이하의 세포 파종 밀도로 파종하여 배양한 경우의 것인, 상기 10에 기재된 클론화 MDCK 세포.
12. 클론화 MDCK 세포의 확장 배율은, 클론화 MDCK 세포를 48시간 이상 배양한 경우의 것인, 상기 10 또는 11에 기재된 클론화 MDCK 세포.
13. 클론화 MDCK 세포는, MDCK 세포 집단을 무혈청 배지에 순화시킨 후 클론화된 세포인, 상기 10 내지 12 중 어느 하나에 기재된 클론화 MDCK 세포.
본 발명의 MDCK 세포 및 마이크로 캐리어에 의한 상기 세포의 배양방법에 의하면, 무혈청 배지에서의 배양에 있어서도 낮은 파종 밀도에서 MDCK 세포를 효율적으로 증식시키는 것이 가능해진다.
[도 1] 세포주 A, B 및 Pre Cloning Cell에 의한 인플루엔자 바이러스 증식성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. (실시예 1)
[도 2] 마이크로 캐리어를 이용하여 세포주 A, B 및 Pre Cloning Cell을 배양했을 때의 세포 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. (실시예 2)
[도 3] 마이크로 캐리어를 이용하여 세포주 A, B 및 Pre Cloning Cell을 배양했을 때의 배양액 중의 배지성분량 및 대사산물량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. (실시예 2)
[도 4] 마이크로 캐리어를 이용하여 세포주 A, B 및 Pre Cloning Cell을 배양했을 때의 배양액 중의 부유 전체 세포밀도 및 세포 부유 비율을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. (실시예 2)
[도 5] 마이크로 캐리어를 이용하여 세포주 A 및 Pre Cloning Cell을 배양했을 때의 확장 배율을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. (실시예 3)
MDCK 세포는 1958년에 정상적인 수컷의 코커 스패니얼의 신장으로부터 수립된 동물세포며, 다양한 용도에 이용되고 있다. 1968년 Gaush들에 의해 인플루엔자 바이러스에 대한 감수성이 밝혀졌으며, 인플루엔자 바이러스의 증식 및 복제에도 이용되고 있다.
본 발명의 클론화 MDCK 세포는 MDCK 세포 집단을 무혈청 배지에 순화시킨 후 싱글 셀 클로닝화(single cell cloning)를 수행한 세포이다. 본 발명의 클론화 MDCK 세포에는, 클론화된 세포를 증식 및/또는 계대함으로써 얻어진 세포도 포함한다. 일반적으로 싱글 셀 클론화되지 않은 세포는 다양한 특성을 가진 복수의 세포를 포함하는 세포 집단으로써 존재하고 있다. 본 명세서에서 MDCK 세포 집단은 싱글 셀 클론화되지 않은 세포를 의미한다. MDCK 세포 집단으로는, 어떠한 것을 사용할 수 있고, 세포은행으로부터 입수한 MDCK 세포 집단을 이용할 수도 있다. 예를 들어, ATCC CCL-34로 특정되는 세포를 사용할 수 있다.
MDCK 세포 집단은 특정 배지에 순화시킴으로써 상기 배지에서 안정적으로 배양할 수있게 된다. 동물세포 배양은 일반적으로 소나 말 등의 동물 유래 혈청을 첨가한 배지를 사용한다. 혈청은 호르몬과 성장인자의 공급원이 되며 배양 조작에 의한 물리적 스트레스 완화에도 도움이 된다. 그러나 혈청의 사용에는 많은 문제가 생긴다. 하나는 안전성에 대한 우려이다. 동물 유래의 혈청을 통해 바이러스나 세균, 마이코플라스마(mycoplasma), 소해면상뇌증(bovine spongiform encephalopathy : BSE)에서 문제가된 이상프리온 등이 혼입될 위험이 있다. 또 하나는 공업규모 생산에의 적응성에 대한 우려이다. 혈청은 배치간 품질 및 조성이 상이하다. 이러한 배치간 차이는 세포 증식에 영향을 미친다. 또한 공업규모 생산에서는 대량의 혈청이 필요하지만, 혈청은 매우 비싸고 공급이 안정되어 있지 않다. 이상으로부터, 동물세포를 공업규모로 배양하기 위해서는 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 무혈청 배지에서 안정적으로 배양 가능한 MDCK 세포의 클론화 MDCK 세포주를 효율적으로 선출하기 위해, 싱글 셀 클론화 전에 세포 집단을 무혈청 배지에 순화시켰다. 무혈청 배지에서의 증식에 적응한 세포 집단에서만 싱글 셀 클로닝을 수행함으로써, 무혈청 배지에서 증식 가능한 클론화 MDCK 세포주만을 선택적으로 얻을 수 있게 되었다. 싱글 셀 클로닝시 무혈청 배지에는 성장인자 및 미량원소가 포함되어 있을 수 있다. 배지에 포함된 성장인자는 세포 증식 시그널을 방출시킨다. 순화 공정에 있어서 배지의 성장인자의 종류는 세포의 형질에 영향을 미칠 것으로 생각된다. 순화 공정에서는 MDCK 세포 집단에 포함된 세포끼리 서로 영향을 주어 가면서, 무혈청 배지에서 증식 가능한 세포로 변경된다. 본 발명은, 싱글 셀 클론화 전에 MDCK 세포 집단을 무혈청 배지에 순화시킴으로써, 무혈청 배지에서 효율적으로 증식 가능한 세포를 선출할 수 있었던 것으로 생각된다.
무혈청 배지에 순화시킨 MDCK 세포 집단을 얻은 후, 싱글 셀 클론화를 수행한다. 싱글 셀 클론화에서는, 먼저 MDCK 세포 1개 마다 분리한다. 분리하는 방법으로는, 한계 희석법을 사용할 수 있다. 분리된 클론화 MDCK 세포주를 더욱 증식(confluent)할 때까지 무혈청 배지에서 배양하여 계대하고, 충분한 세포량을 얻는다. 그 후, 클론화 MDCK 세포주에 대한 특성을 평가하고 적합한 성질을 가지는 클론화 MDCK 세포주를 얻을 수 있다. 클론화 MDCK 세포주는 세포 증식능, 파종 밀도, 확장 배율, 바이러스에의 감수성 등에 대한 평가를 실시하여, 높은 세포 증식능을 가지고 여러 형태의 인플루엔자 바이러스에 감수성을 가지며 또한 마이크로 캐리어에 강한 접착력을 갖는 것을 특징으로 하는 클론화 MDCK 세포주를 선출할 수 있다. 세포 증식능, 바이러스 감수성 및 마이크로 캐리어에의 강한 접착력을 모두 겸비한 세포를 선출하는 것은 곤란하지만, 본 발명자들의 예의 검토에 의하여, 상기의 클로닝 방법에 의해 해당 세포를 선출 가능함을 발견했다. 또한, 세포 증식능 등의 구체적인 평가 방법으로는 후술하는 실시예에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 배양방법은, 마이크로 캐리어에의 접착력(부착력)이 강한 세포를 사용하는 것을 특징으로 한다. 세포의 마이크로 캐리어에 대한 접착력은 마이크로 캐리어를 포함하는 배양액 중에서 세포를 배양한 경우의 세포 부유율로 나타낼 수 있다. 본 발명의 배양방법은 세포 부유율이 20% 이하, 바람직하게는 15% 이하, 더욱 바람직하게는 10% 이하, 특히 바람직하게는 5% 이하를 나타내는 클론화 MDCK 세포를 사용하는 것을 특징으로 한다. 세포 부유율은, 마이크로 캐리어 존재 하에서 MDCK 세포를 일정 시간 배양한 후 부유 세포밀도를 파종 세포밀도로 나눈 값이며, 세포 부유율이 낮을수록, 마이크로 캐리어에의 접착력이 높은 것으로 나타난다. 본 발명의 클론화 MDCK 세포의 세포 부유율은 배양시간이 48시간 이하, 바람직하게는 24시간 이하, 바람직하게는 6시간 이하, 더욱 바람직하게는 1.5시간 이하, 특히 바람직하게는 0.5이하 경과한 시점의 것이다. 보다 구체적으로는 0.5시간 경과한 시점에서 세포 부유율이 20% 이하, 또는 1.5시간 경과한 시점에서 세포 부유율이 5% 이하를 나타내는 클론화 MDCK 세포를 이용하는 것이 바람직하다. 또한 세포 부유율은 세포의 파종 밀도에 따라 크게 달라지는 것은 없다고 추측된다.
본 발명의 배양방법은, 확장 배율이 4.5 이상, 바람직하게는 6.5 이상, 더욱 바람직하게는 8.5 이상을 나타내는 클론화 MDCK 세포를 사용하는 것을 특징으로 한다. 확장 배율은, 세포를 일정 시간 배양한 후 세포밀도를 파종한 세포밀도로 나눈 값이며, 증식의 용이성을 나타내는 지표가 되는 것이다. 본 발명의 클론화 MDCK 세포의 확장 배율은 마이크로 캐리어에 의해 배양된 경우의 것이며, 배양시간이 48시간 이상, 바람직하게는 60시간 이상, 더욱 바람직하게는 72시간 이상, 또한 144시간 이하 바람직하게는 120시간 이하, 더욱 바람직하게는 96시간 이하 경과한 시점의 것이다. 또한 본 발명의 확장 배율은 2.0×104 세포/cm2 이하, 바람직하게는 1.6×104 세포/cm2 이하, 바람직하게는 1.3×104 세포/cm2 이하, 더욱 바람직 1.0×104 세포/cm2 이하의 파종 밀도 또한 0.1×104 세포/cm2 이상, 바람직하게는 0.2×104 세포/cm2 이상, 더욱 바람직하게는 0.3×104 세포/cm2 이상, 특히 바람직하게는 0.6×104 세포/cm2 이상의 파종 밀도로 파종된 경우이다. 예를 들어, 후술하는 실시예 3에 기재된 방법을 이용하여 세포를 배양하여 확장 배율을 확인할 수 있다. 본 발명의 배양방법에 있어서는, 낮은 파종 밀도임에도 신속하게 세포를 증식시킬 수 있으며, 최대 규모의 시간과 비용을 절약할 수 있다는 장점이 있다. 또한 본 발명의 배양방법에 의하면, 세포가 대수 증식기에 옮길 때까지 시간 절약이 가능해진다. 보다 구체적으로는 0.6×104 세포/cm2 이상이고, 2.0×104 세포/cm2 이하의 파종 밀도로 파종된 경우에, 세포를 파종한 후 72 ~ 96시간 배양을 수행한 시점에서 세포 확장률이 4.5 이상을 나타내는 클론화 MDCK 세포를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 클론화 MDCK 세포는 상기 세포 부유율 및/또는 확장 배율을 갖는 것일 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 상기 클로닝 방법에 의해 선출된 세포를 증식 및/또는 계대하여 얻은 세포도 본 발명의 클론화 MDCK 세포에 포함된다. 세포의 계대는 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 마이크로 캐리어에 의한 세포배양 후는, 세포가 증식 한 결과, 마이크로 캐리어 표면상에 밀집해 접착하는 것이 된다. 계대에서는 밀집해 접착하고 있는 세포를 새로운 마이크로 캐리어 표면상으로 이동시킨다. 예를 들어, 트립신과 콜라게나아제와 같은 프로테아제를 이용하여 세포를 마이크로 캐리어에서 꺼내고, 다음으로 이들 세포를 세척 등을 수행하고, 마이크로 캐리어를 포함하는 배지에 희석하는 것으로부터 수행할 수 있다.
본 발명의 클론화 MDCK 세포는, 더 구체적으로는 국제기탁의 수탁번호 NITE BP-02014로 특정된 MDCK 세포이다. 관련 세포는 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허 미생물 기탁센터(우편번호 292-0818 일본 지바현 기사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8 122 호실)에 2015년 3월 4일에 수탁번호 NITE BP-02014로 국내 기탁된 후, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허 미생물 기탁센터에서 부다페스트 조약에 기반한 국제기탁으로 이관 청구되어 수탁번호 NITE BP-02014에 의해 수령된 것이다. 수탁번호 NITE BP-02014로 특정되는 MDCK 세포는 후술하는 실시예 1에 나타낸 바와 같이 MDCK 세포(ATCC CCL-34 유래)을 기반으로 하여, 한계 희석법에 의해 싱글 셀 클론화를 수행한 후, 선출된 것이다.
본 발명의 배양방법은 클론화 MDCK 세포를 마이크로 캐리어를 이용하여 배양하는 것을 포함한다. 마이크로 캐리어는 표면에 세포가 접착하여 세포배양할 수 있는 미립자이다. 마이크로 캐리어의 표면은 세포가 접착 가능한 재질이면 특별히 한정되는 것이 아니고, 본 발명에 사용되는 마이크로 캐리어는 특별히 한정되는 것은 아니다. 마이크로 캐리어의 재질로는 덱스트란, 젤라틴, 콜라겐, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리아크릴아미드, 유리, 셀룰로오스 등을 들 수 있다. 마이크로 캐리어의 재질로는 덱스트란이 바람직하다. 마이크로 캐리어의 형상은 구형(구슬), 원반 모양 등을 들 수 있다. 마이크로 캐리어의 형상은 구형이 바람직하다.
구형 마이크로 캐리어의 크기(직경)는 예를 들어 약 0.01 ~ 1 mm, 바람직하게는 약 0.05 ~ 0.5 mm, 보다 바람직하게는 약 0.1 ~ 0.3 mm이다. 마이크로 캐리어는 다공성일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 구형 마이크로 캐리어로는 예를 들어, Cytodex 1(상품명), Cytodex 3(상품명), Cytopore(상품명)(이상, GE Healthcare Life Science) 등을 들 수 있다. 원반 모양의 마이크로 캐리어로는 예를 들어, Cytoline 1(상품명), Cytoline 2(상품명)(이상, GE Healthcare Life Science) 등을 들 수 있다. 다공성 마이크로 캐리어로는 예를 들어, Cytopore(상품명), Cytoline 1(상품명), Cytoline 2(상품명)(이상, GE Healthcare Life Science) 등을 들 수 있다. 기타 상용 마이크로 캐리어로는 Biosilon(상품명)(NUNC), Hillex(상품명)(솔로힐), Corning(등록상표) 마이크로 캐리어 (코닝) 등을 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 마이크로 캐리어로는 특히 구형의 덱스트란제 마이크로 캐리어가 바람직하다. 구형의 덱스트란제 마이크로 캐리어로는 Cytodex 1(상품명), Cytodex 3(상품명) 및 Cytopore(상품명)이 바람직하며, 또한 Cytodex 1(상품명) 및 Cytodex 3(상품명)이 바람직하고, 특히 Cytodex 1(상품명)이 바람직하다.
본 발명의 배양방법의 클론화 MDCK 세포의 파종 밀도는 특별히 한정되는 않으며, 적절하게 조절이 가능하다. 예를 들어, 2.0×104 세포/cm2 이하, 바람직하게는 1.6×104 세포/cm2 이하, 바람직하게는 1.3×104 세포/cm2 이하, 더욱 바람직하게는 1.0×104 세포/cm2 이하의 파종 밀도로 MDCK 세포를 파종한 경우에도, 세포를 증식시키는 것이 가능하다. 또한 0.1×104 세포/cm2 이상, 바람직하게는 0.2×104 세포/cm2 이상, 더욱 바람직하게는 0.3×104 세포/cm2 이상의 파종 밀도로 파종하는 것이 바람직하다 . 본 명세서에서 파종 밀도(세포/cm2)란, 세포를 파종할 때의 배양 표면적 당 세포밀도를 의미한다. 또한 배지 중 세포의 밀도는 공지의 방법을 통해 확인할 수 있지만, 예를 들어 혈구 계산반(hemocytometer) 또는 자동 셀 카운터 등을 이용한 측정방법으로 확인할 수 있다. 본 발명은 마이크로 캐리어를 이용하여 배양을 수행하는 것으로부터, MDCK 세포는 마이크로 캐리어의 표면에 접착하여 증식한다. 본 명세서에서 파종 밀도는 세포를 파종할 때 마이크로 캐리어의 표면적 당 세포밀도이다. 2.0×104 세포/cm2 이하의 낮은 파종 밀도로 배양함으로써, 배양을 위해 준비하는 세포의 양을 소량으로 억제할 수 있기 때문에 비용을 절약할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 클론화 MDCK 세포를 배양하는 배지는 특별히 한정되지 않지만, 동물 유래의 혈청 첨가되지 않은 혈청 배지가 바람직하다. 무혈청 배지는 어떤 것을 사용해도 좋지만, 예를 들면 이글 MEM 배지(Eagle's minimal essential medium) (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), OptiPRO SFM(Thermo Fisher Scientific), VP-SFM(Thermo Fisher Scientific), EX-CELL MDCK(SAFC Biosciences), UltraMDCK(Lonza), ProVero 1(Lonza), BalanCD MDCK(Irvine Scientific) 등을 이용할 수 있다. 또한 마이크로 캐리어의 밀도, 교반 회전수 및 용존 산소 농도, 배양 온도 등의 배양 조건은 세포가 증식할 수 있는 것이면 좋고, 적절하게 조절 가능하다. 본 발명의 배양방법에 있어서는, 교반 회전수가 30 ~ 60 rpm 정도에서도, 세포가 마이크로 캐리어에 용이하게 접착하고 효율적으로 증식할 수 있다.
본 발명의 클론화 MDCK 세포는 MDCK 세포에 감염 가능한 바이러스를 증식시키는 방법이나, MDCK 세포에 의해 생산되는 대사산물 등의 물질을 생산하는 방법 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 MDCK 세포는, MDCK 세포에 감염 가능한 바이러스를 증식시키는 방법으로 사용할 수 있다. MDCK 세포에 감염 가능한 바이러스로는, MDCK 세포가 감수성을 나타내는 것이면 좋고, 예를 들어 오르토믹소 바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소 바이러스(Paramyxovirus), 라브도 바이러스(rhabdovirus) 및 플라비 바이러스(flavivirus)를 들 수 있다. 일례로 인플루엔자 바이러스의 경우를 예시하여 설명한다.
본 발명의 클론화 MDCK 세포가 감수성을 나타내는 인플루엔자 바이러스는 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 현재 알려진 모든 아형 및 앞으로 분리 및 동정되는 아형을 포함한다. A형 인플루엔자 바이러스의 경우, 그 HA 분자 및 NA 분자의 항원성에 따라 아형(즉 16종의 HA(H1 ~ H16) 아형 및 9종의 NA(N1 ~ N9) 아형)으로 분류되어 HA 아형 및 NA 아형과의 조합을 포함하는 인플루엔자 바이러스가 고려된다. B형 인플루엔자 바이러스의 경우 빅토리아 계통과 산형 계통과의 조합을 포함하는 인플루엔자 바이러스가 고려된다.
A형 인플루엔자 바이러스의 각 아형는, RNA 게놈의 변이성이 높기 때문에, 새로운 계통(strain)이 자주 발생하고 있다. 2009년 4월에 멕시코에서 유행이 인지된 후 세계적으로 유행했다고 하는 인플루엔자는, 신종 인플루엔자, 돼지 인플루엔자, 유행성 인플루엔자 A(H1N1), swine flu A/H1N1 pdm 등이 불리고 있다. 돼지 사이에서 유행했던 바이러스가 농장 등으로 돼지에서 사람으로 직접 감염하여 인간 사이에서 퍼졌다는 신종 인플루엔자는, 종전부터 존재한 계절성 A 소련형 인플루엔자(독감 A형 바이러스 H1N1 아형)와, A 홍콩형 인플루엔자(인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형)는 구별된다. 또한 RNA 게놈의 변이성이 높다는 점에서, 인플루엔자 A형 바이러스와 동일한 아형 중에서도, 단리된 시기와 장소에 따라 바이러스 계통을 구분하고 있다.
B형 인플루엔자 바이러스는, 비가역적인 항원 변이가 계속되고 있지만, A형 인플루엔자 바이러스의 변이보다 비교적 늦고, 유행의 주기는 2년 정도이다. B형 인플루엔자 바이러스는 1940년 뉴욕에서 중간 규모의 인플루엔자 유행 중 처음으로 분리된 이후, 종종 유행을 반복하고, 그에 따른 사망률의 상승도 기록되어 있다. 인간들 사이에서만 감염이 확인되고 있지만, 아형은 존재하지 않고, 산형 계통 및 빅토리아 계통이라는 두 계통 만이 존재한다.
본 발명에서 이용되는 인플루엔자 바이러스는, 상술한 바와 같이 생체에서 분리된 인플루엔자 바이러스 이외 인플루엔자 백신에 적용 가능하도록, 약독화, 계란증식 적합화, 세포배양증식 적합화, 온도 감수성표현 형질화, 점막투여 적합화 등의 개변을 더하여 창출한 재조합 바이러스일 수 있다. 또한 개변을 더하기 위한 수단으로, 인플루엔자 바이러스의 항원부위나 폴리머라제(polymerase) 부위 등의 8개의 RNA 분절에 변이를 도입하는 방법, 역유전학(reverse genetics)에 의해 증식 능력이 높은 계통의 RNA 분절과 목적의 항원성을 나타내는 RNA 분절을 재조직화하는 방법, 저온 계대에 의해 약독 바이러스를 만드는 방법, 바이러스 배양계에의 변이 유발 물질을 첨가하는 것에 의한 방법 등 다양한 방법이 있다.
클론화 MDCK 세포를, 마이크로 캐리어를 포함한 배양액 중에 상술한 파종 밀도로 파종한 후, 증식될 때까지 배양을 실시한 후, 새로운 마이크로 캐리어로 이행하여 확장할 수 있다. 본 발명의 배양방법의 클론화 MDCK 세포의 배양시간은 확장에 적합한 것이면 좋고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 배양시간은 48시간 이상, 바람직하게는 60시간 이상, 더욱 바람직하게는 72시간 이상, 또한 144시간 이하, 바람직하게는 120시간 이하, 더욱 바람직하게는 96시간 이하이다. 확장 단계는 계대와 같다.
본 발명의 배양방법에 있어서, 인플루엔자 바이러스를 클론화 MDCK 세포에 감염시키는 시기는 특별히 한정되지 않고, 실용상 적절한 시기이면 된다. 예를 들어, 확장 후 세포가 증식하게 된 시점에서 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 후 세포를 일정 시간 인큐베이션 하는 것이 바람직하다. 인큐베인션 시간은 특별히 한정되지 않는다. 인큐베이션은 세포를 일정 기간의 조건으로 유지하는 것을 의미하며, 인큐베이션에 의하여 세포가 증식할지 증식하지 않을지는 상관이 없다. 인큐베이션은 세포를 배양하는 것과 같은 조건으로 수행할 수도 있지만, 바람직하게는 감염시킨 바이러스의 적정 조건에서 실시한다. MDCK 세포를 감염시키는 인플루엔자 바이러스는 종자 바이러스로 불린다. 인플루엔자 바이러스는 생체에서 분리된 후, 또는 어떤 개변이 추가되어 작출된 후 계란과 각종 세포를 이용하여 계대되어 증식하고, 시드 바이러스가 된다. 본 발명에서 이용되는 시드 바이러스는 계란이나 각종 세포 중에서 계대된 것일 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는 MDCK 세포에 의해 계대하고 증식한 종자 바이러스를, 본 발명의 배양방법에 있어서 클론화 MDCK 세포에 감염시켜 인플루엔자 바이러스를 증식시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 배양방법에 의해 증식된 인플루엔자 바이러스는, 인플루엔자 백신의 제조에 사용된다. 인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에서 정제하는 공정은 공지의 방법 또는 향후 개발될 기술을 사용할 수 있다.
[실시예]
본 발명의 이해를 돕기 위해 하기 실시예를 통해 구체적으로 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 본 실시예에 한정되는 것은 아니다.
클론화 MDCK 세포의 작출 및 선출
1. 싱글 셀 클로닝
(1) 혈청 함유 배지에서 배양
ATCC에서 입수한 MDCK 세포(ATCC No. CCL-34, Lot 1166395, 계대 53)을 해동하고 10% 소태아 혈청(이하 FCS)를 포함하는 이글 MEM 배지(NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.)를 첨가하여 원심 분리하여 세정하였다. 이 펠렛에 10% FCS를 포함하는 이글 MEM 배지를 첨가하여 부유시킨 것을 T75 플라스크에서 배양하였다. 37℃±1℃에서 5일간 배양한 세포를 1 mM EDTA-4Na를 포함하는 PBS 용액으로 세척한 후 트립신을 첨가하여 세포를 배양기에서 박리시켰다. 10% FCS를 포함하는 이글 MEM 배지를 첨가하여 트립신을 중화하고 T225 플라스크에 계대했다. 이 세포를 37℃±1℃에서 4일간 배양한 후 동일한 방법으로 T225 플라스크에 계대했다. 37℃±1℃에서 6일간 배양한 세포를 트립신 처리하여 회수한 후, 10% FCS를 포함하는 이글 MEM 배지를 첨가하여 트립신을 중화했다. 원심에 의하여 세포를 분리하고 얻어진 펠렛을 셀 벙커-2(Nippon Zenyaku Kogyo)에 부유시켜 액체 질소 중에서 동결보존하였다(계대 수 56).
(2) ATCC 유래 MDCK 세포 집단의 무혈청 배지로의 순화
이어서, (1)에서 얻은 세포를 해동하고 무혈청 배지 OptiPRO SFM(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 T75 플라스크에서 배양하였다. 37℃±1℃에서 4일간 배양한 세포를 1 mM EDTA-4Na를 포함하는 PBS 용액으로 세척한 후 TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 배양기로부터 박리시켰다. 이 세포에 OptiPRO SFM을 가하여 원심 세정하고, 얻어진 펠렛 OptiPRO SFM을 가하여 부유시킨 것을 T75 플라스크에 옮기고 37℃±1℃에서 4일간 배양하였다. 이 세포를 TrypLE Select를 이용하여 회수하고 원심 세정하여 얻어진 펠렛을 셀 벙커-2에 부유시켜 -80℃의 프리저에서 동결보존하였다(계대 수 58).
(3) 무혈청 순화 MDCK 세포의 싱글 셀 클로닝
(2)에서 얻은 ATCC 유래 무혈청 순화 MDCK 세포 집단(이하 Pre Cloning Cell)을 한계 희석법에 의해 싱글 셀 클로닝을 수행하고, 세포 증식성이 뛰어나 형태가 균일한 세포주를 선출했다. 클로닝의 구체적인 절차는 다음과 같다. Pre Cloning Cell을 해동하고 무혈청 배지 OptiPRO SFM을 이용하여 T25 플라스크에서 배양하였다. 37℃±1℃에서 3일간 배양한 세포를 1 mM EDTA-4Na를 포함하는 PBS 용액으로 세척한 후 TrypLE Select를 첨가하여 배양기에서 박리시켰다. 이 세포에 OptiPRO SFM을 가하여 원심 세정하고, 얻어진 펠렛 OptiPRO SFM을 가하여 세포를 재부유시켰다. 이 세포 현탁액의 세포 수를 계수하고, 5 cells/mL의 세포 현탁액을 조정했다. 96 well plate의 각 well에 5 cells/mL의 세포 현탁액을 100 μL 씩 분주하여 1개의 세포만이 파종된 웰에 표시를 하여 배양하였다. 표시를 붙인 웰의 세포가 증식 완료(confluent)하면 TrypLE Select로 박리하여 24-well plate에 계대했다. 배지 중 TrypLE Select를 제거하기 위해 계대 다음날 well에서 배양액을 완전히 제외하고 신선한 배지로 교환하였다. 같은 방법으로 6-well plate, T75 플라스크로 계대를 거듭하여 충분한 세포량이 얻어진 시점에서 클론화 MDCK 세포주를 동결 보존하였다(계대 수 63).
2. 스크리닝(screening)
(1) 인플루엔자 바이러스의 증식성 평가
얻어진 클론화 MDCK 세포주에 대해 인플루엔자 바이러스 증식을 지표로 한 스크리닝을 실시했다. 또한 본 실시예에서는 인플루엔자 바이러스의 HA가 및 감염가의 확인은 국립 감염증 연구소 저서인 '인플루엔자 진단 가이드(제3판, 2014년 9월)'의 'Part IV'에 공개되는 방법에 따라 수행하였다.
(1-1) 1차 심사
먼저 모든 클론화 MDCK 세포주 및 Pre Cloning Cell을 동결하고 무혈청 배지 OptiPRO SFM을 이용하여 T75 플라스크에서 배양하였다(계대 수 64). 해동 후 증식된 클론화 MDCK 세포주를 6-well plate에 파종하여 37℃±1℃에서 배양한 후 인플루엔자 바이러스주를 m.o.i= 0.0001로 감염시켰다(계대 수 65). 클론화 MDCK 세포주의 바이러스 증식성을 평가하기 위해 바이러스 배양 상청의 HA가를 측정했다.
(1-2) 2차 스크리닝
Pre Cloning Cell 이상의 HA 가를 보여준 클론화 MDCK 세포주(전체의 30.2%)에 대해, 다른 인플루엔자 바이러스주의 증식성을 평가했다. 이전 시험과 동일한 방법으로 6-well plate에서 배양한 클론화 MDCK 세포주(계대 수 65)에 바이러스를 감염시킨 후 바이러스 배양 상청을 이용한 HA 가 측정 시험을 실시하여, 모든 바이러스주에 대해 Pre Cloning Cell 이상의 HA 가를 보여준 클론화 MDCK 세포주를 선정했다(전체의 2.8%).
(1-3) 3차 스크리닝
6-well plate를 이용한 스크리닝을 통해 선정된 클론화 MDCK 세포주에 대해, 추가로 T75 플라스크 규모에서 인플루엔자 바이러스 증식성을 확인했다. T75 플라스크에서 배양한 클론화 MDCK 세포주(계대 수 65)에 A/New Caledonia(H1N1), A/Hiroshima(H3N2) 등의 바이러스주를 각각 m.o.i= 0.0001로 감염시켰다. 바이러스 배양 상청의 HA 가를 확인하고 모든 바이러스주에서 Pre Cloning Cell과 동등 이상의 HA 가를 보여준 클론화 MDCK 세포주를 선정했다(전체의 0.6%).
(1-4) 4 차 스크리닝
T75 플라스크를 이용한 스크리닝을 통해 선정된 클론화 MDCK 세포주에 대해, 10대 이상 계대한 세포의 인플루엔자 바이러스 증식성을 확인했다. 클론화 MDCK 세포주를 해동하고 무혈청 배지 OptiPRO SFM을 이용하여 T75 플라스크에서 계대배양하였다. 계대 수 77대 ~ 80대가 된 세포에 A/New Caledonia(H1N1) 등의 바이러스주를 각각 m.o.i= 0.0001로 감염시켰다. 바이러스 배양 상청의 감염가를 측정한 결과, 어떠한 클론화 MDCK 세포주도 모든 바이러스주에 대해 7.0 log10TCID50/mL 이상의 감염가가 얻어졌다.
(2) 마이크로 캐리어에서의 세포 증식능의 평가
바이러스 증식성을 지표로 선정된 클론화 MDCK 세포주에 대해, 마이크로 캐리어 배양에의 적합성을 평가했다.
(3) 클론화 MDCK 세포주의 선출
상기의 평가 결과를 바탕으로, 무혈청 배지에서 배양할 수 있고 여러 아형의 인플루엔자 바이러스에 감수성을 가지며, 또한 마이크로 캐리어에 강한 접착력을 갖는 ATCC 유래 무혈청 순화 클론화 MDCK 세포주 A(이하 세포주 A)를 선출했다. 마이크로 캐리어는 Cytodex 1(GE Healthcare Life Science)을 사용했다. 한편, 마이크로 캐리어에의 접착력이 세포주 A보다 약하지만 나머지 성질은 세포주 A와 유사한 클론화 MDCK 세포주 B(이하 세포주 B)도 선출하여 비교대상으로 하였다.
또한, 세포주 A는 수탁번호 NITE BP-02014에 의해, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허 미생물 기탁센터(우편번호 292-0818 일본 지바현 기사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8 122 호실)에 기탁하여(수령일: 2015년 3월 4일), 독립 행정법인 제품평가기술기반기구 특허 미생물 기탁센터에서 부다페스트 조약에 의한 국제기탁으로 이관 청구되어 수탁번호 NITE BP-02014에 의해 수령되었다.
[규칙 26에 따른 보충 17.04.2017]
(4) 선출 한 클론화 MDCK 세포주의 인플루엔자 바이러스 증식성
T75 플라스크에서 세포주 A를 증식시켰다. 세포주 A가 증식된 시점에서 인플루엔자 바이러스를 세포에 접종했다. 세포의 배양 조건에 대한 각 매개변수 및 인플루엔자 바이러스주의 감염시 세포 수에 대한 각 매개변수는 다음과 같다.
세포 종류 계대 수 파종 밀도
(세포/mL)		 배양용기 배양조건
배양기간		 도달 세포수
(세포/flask)
Pre Cloning Cell P64 5 X 104 75cm2 벤트플라스크
(30mL 배양)		 37℃, 5% CO2,
3일		 1230 X 104
세포주 B P73 6 X 104 1135.5 X 104
세포주 A P74 4.5 X 104 1980 X 104
접종한 바이러스주는, 모두 국립 감염증 연구소에서 분배되어 MDCK 세포에서 5대 계대한 것이며, 각각 A/Ibaraki/N12073/2011(H1N1) pdm09(이하, TA-73), A/Ibaraki/N12232/2012(H3N2)(이하, TA-232), B/Ibaraki/N12322/2012(이하, TA-322), B/Ibaraki/N12336/2012(이하, TA-336)이라 한다. 접종량은 m.o.i= 0.001이다. 배양배지로는 4 mM 글루타민, 4.7 g/L 포도당, 20 mM 탄산수소나트륨 및 0.1×TrypLE Select를 첨가한 이글 MEM 배지를 이용하여 34℃, 5% CO2 조건에서 배양을 실시했다. 바이러스 감염 후, 배양 1일째부터 3일째까지 배양상청을 샘플링하여 HA가 및 감염가를 측정했다. HA가는 TA-73, TA-322 및 TA-336에 대해서는 0.5% 닭 적혈구를 이용하여 실온에서 1시간 반응, TA-232에 대해서는 1.0% 기니피그 적혈구를 이용하여 4℃에서 1.5시간 반응시켜 측정했다. 또한 감염가 단위는 log10TCID50/mL이다.
인플루엔자 바이러스 감염 후 1 ~ 3일(1 ~ 3dpi)에서, HA가의 결과를 하기 표 2, 감염가의 결과를 하기 표 3에 나타낸다. 또한 이러한 결과를 정리한 그래프를 도 1에 나타낸다. 도 1에서, 실선이 감염가, 점선이 HA가이다.
Figure 112021075402397-pct00001
Figure 112021075402397-pct00002
HA가 및 감염가의 추이로부터, 어떤 바이러스주에 대해서도 세포주 A에 증식시킨 경우에는 다른 세포주에서 증식시킨 경우보다 높은 인플루엔자 바이러스 증식성을 나타내는 경향이 확인되었다.
마이크로 캐리어를 이용한 클론화 MDCK 세포주의 배양
세포주 A를 4 mM 글루타민을 첨가한 무혈청 배지 OptiPRO SFM(Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다. 대조세포로는 세포주 B 및 Pre Cloning Cell을 사용하였다. 세포는 2.3×104 세포/cm2의 파종 밀도로 파종했다. 마이크로 캐리어는 Cytodex 1(GE Healthcare Life Science)을 3.5 g/L의 밀도로 사용하였다. 배양조건은 배양 48시간때까지 15 rpm, 48시간 이후는 30 rpm 교반속도에서 pH 7.0, 온도 37.0℃, 용존산소농도(DO) 3.00 ppm이었다. 통기는 다공성 튜브에 의해 수행되었다. 또한 배양용기로는 3 L 용량의 생물 반응기를 사용하였다.
배양액 중 세포 수는 배양액을 일부 채취하고, 마이크로 캐리어에 부착된 세포를 트립신을 이용하여 분산시키는 방법에 의해 확인되었다. 세포 수의 측정은 생사세포 자동분석기(BECKMAN COULTER)를 사용하였다. 또한 대사산물의 농도는 바이오 프로세스 분석기기 Cedex Bio(roche-diagnostics)을 이용하여 확인하였다.
각 세포주의 세포 증식능을 확인한 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에서 실선은 마이크로 캐리어에 부착되어 있는 세포의 수를 나타내고, 점선은 배양상청 중에 부유하고 있는 세포의 수를 나타낸다. 각 세포주는 부유한 상태에서는 증식하지 못하고 사멸한다. 세포주 A는 Pre Cloning Cell이나 세포주 B와 비교하여 상청 중에 부유하고 있는 세포의 수가 적기 때문에 마이크로 캐리어에 접착력이 강한 것으로 확인되었다.
세포주 A는 배양 3일째에 6.9×104 세포/cm2까지 성장했다. 한편 세포주 B 및 Pre Cloning Cell은 동일한 정도까지 성장하기까지 4일 걸렸다.
또한 배지 중에 존재하는 배지 성분 및 세포의 대사산물의 농도를 도 3에 나타낸다.
본 실시예의 배양 조건의 배양액에서, 상청에 부유하는 세포 수를 측정했다. 파종된 세포 중 상청에 부유하고 있는 세포의 비율을 하기의 계산식으로 산출하고, 세포 부유율로 하였다.
(각 배양시간의 부유 전체 세포밀도) ÷ (파종 세포밀도)×100 = 세포 부유율(%)
각 세포주의 부유 전체 세포밀도를 확인한 결과를 도 4, 각 세포주의 세포 부유율을 하기 표 4에 나타낸다. 세포주 A는 Pre Cloning Cell이나 세포주 B와 비교하여 세포 부유율이 낮기 때문에 마이크로 캐리어에 접착력이 강한 것으로 확인되었다. 또한 세포주 A는 배양 개시로부터 1.5시간 경과한 시점에서 파종된 세포의 거의 모든 마이크로 캐리어에 부착되어 있는 것으로 생각된다.
세포부유율
배양시간(hr) 0.5 1.5 4 6 24
Pre Cloning Cell 20.9 7.8 8.8 4.9 5.6
세포주 A 4.1 1.0 0.8 1.0 0.9
세포주 B 41.0 42.9 38.4 19.7 12.3
클론화 MDCK 세포주의 확장 배율의 확인
실시예 2와 동일한 방법으로, 하기의 a ~ d의 세포 파종 밀도에 의해 세포주 A를 파종하여 배양하였다. Pre Cloning Cell을 대조군으로 사용하였다.
a : 2.0×104 세포/cm2 (17.6×104 세포/mL)
b : 1.0×104 세포/cm2 (8.8×104 세포/mL)
c : 0.6×104 세포/cm2 (5.3×104 세포/mL)
d : 0.3×104 세포/cm2 (2.6×104 세포/mL)
또한, 배양 용량은 400 mL이며, 37.0℃, 5% CO2 존재 하, 60 rpm에서 교반 배양하였다. 마이크로 캐리어는 Cytodex 1을 사용하였다. 마이크로 캐리어의 밀도는 2.0 g/L이다.
결과를 도 5에 나타낸다. 그래프의 각 점 부근의 값은 각 시점의 확장 배율의 값을 나타낸다. 세포주 A는 배양 개시로부터 약 30 ~ 144시간 경과한 시점의 확장 배율이 Pre Cloning Cell에 비해 높고, 효율적으로 증식 가능하다는 것을 알 수 있었다. 또한 세포주 A는 세포 파종 밀도에 관계 없이 배양 개시로부터 약 72 ~ 96시간 경과한 시점의 확장 배율은 약 4.5 이상을 보여 Pre Cloning Cell에 비해 높은 값을 나타내는 것을 확인했다.
클론화 MDCK 세포주의 마이크로 캐리어 간의 이행
세포주 A를 하기의 조건에 따라 마이크로 캐리어에서 마이크로 캐리어로 이행시켰다. 또한 이행 후 인플루엔자 바이러스를 감염시켜 바이러스의 HA가 및 감염가를 실시예 1과 동일한 방법으로 측정했다.
(1) 마이크로 캐리어 간의 이행방법
세포주 A를 무혈청 배지에서 마이크로 캐리어로 Cytodex 1을 이용하여 2 L 스케일로 배양하여 증식시켰다. 그 후, 배양조건의 각 제어를 중지하고 마이크로 캐리어를 침몰시켰다. 그 후 배양상청을 분리하고 1 mM EDTA-4Na를 포함하는 PBS 용액을 첨가하여 37℃에서 30분간 세척하였다. 마이크로 캐리어를 다시 침전시킨 후 세포 세정액을 빼냈다. 트립신을 첨가하여 37℃에서 30분 정도 처리를 실시했다. 트립신 억제제를 첨가한 후, 20 L의 배양기에 세포 및 마이크로 캐리어를 전량 이주했다. 표 5에 세포 파종시 파종 매개변수를, 표 6에 세포배양 중의 증식 매개변수를 나타낸다.
[규칙 26에 따른 보충 17.04.2017]
파종 매개변수
검토 1회째 검토 2회째
수행 부피 2 L 20 L 2 L 20 L
마이크로 캐리어(MC) 농도 4.5 g/L 3.5 g/L 5.0 g/L 3.5 g/L
마이크로 캐리어의 양 9.0 g 70.0 g 10.0 g 70.0 g
파종밀도(세포/cm2) 1.31x104 2.19x104 1.82x104 1.71x104
증식 매개변수
수행 부피 2 L 20 L
교반 20~30 rpm 20~60 rpm
온도 37.0℃ 37.0℃
pH 7.4 이하 7.4 이하
(2) 마이크로 캐리어 간의 이행 후 클론화 MDCK 세포주의 바이러스 감수성
마이크로 캐리어 간 이행 후, MDCK 세포가 증식한 시점에서 인플루엔자 바이러스를 세포에 접종했다. 접종한 바이러스 변종은 TA-73이며, 접종량은 m.o.i= 0.001이다. 인플루엔자 바이러스 접종시 수행한 볼륨은 20 L, 살아 있는 세포밀도는 12.8×104 세포/cm2 ~ 16.0×104 세포/cm2이었다. 배지는 4 mM 글루타민, 3.6 g/L 포도당, 20 mM 탄산수소나트륨 및 0.1×TrypLE Select를 첨가한 이글 MEM 배지를 사용했다. 바이러스 접종 후 교반회전수 20 ~ 60 rpm, pH 7.0, 온도 34.0℃, 용존산소농도(DO) 3.00 ppm의 배양조건에 따라 배양하였다. 바이러스 감염 후 배양 4일째까지 매일 배양상청을 샘플링하여 감염가를 측정했다. 이 중 가장 높은 감염가의 값을 피크 감염가(log10TCID50/mL)로 했다. 감염가의 측정은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행했다.
피크 감염가는 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.
피크 감염가
바이러스주 검토 1회째 검토 2회째
TA-73 8.50 8.72
세포주 A는 마이크로 캐리어 배양에서 높은 세포 증식능을 나타내는 것으로부터 바이러스 배양 개시 시점에 대량의 세포를 준비할 수 있는 것, 마이크로 캐리어 이행 후에도 높은 바이러스 증식성을 나타내는 것을 확인했다.
이상 상술한 바와 같이, 본 발명의 배양방법에 의하면, 마이크로 캐리어를 이용하여 효율적으로 MDCK 세포를 증식시킬 수 있다. 또한 본 발명의 배양방법을 이용함으로써, 바이러스를 효율적으로 증식시킬 수 있기 때문에 효율적인 백신 생산을 가능하게 할 수 있고, 산업상 우수하다. 백신 제조에의 실용화에 있어서 대용량의 배양이 필수적이지만, 본 발명의 MDCK 세포 및 마이크로 캐리어에 의한 상기 세포의 배양방법에 의하면, 마이크로 캐리어 상에서 높은 확장 배율 및/또는 마이크로 캐리어에의 높은 접착력에 의해 확장의 비용 및 시간을 절약할 수 있다는 장점이 있다.
독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허 미생물 기탁센터 NITEBP-02014 20150304

Claims (13)

  1. 마이크로 캐리어(microcarrier)를 이용하여 배양할 때, 세포를 일정 시간 동안 배양한 후 세포 밀도를 파종한 세포밀도로 나눈 값인 확장 배율이 4.5 이상을 나타내는, 싱글 셀 클로닝(single cell cloning)을 수행한 MDCK 세포의 배양방법으로서, 상기 배양은 72 내지 96시간 동안 수행되고, 상기 파종한 세포밀도는 0.6×104 세포/cm2 내지 2.0×104 세포/cm2 이고, 상기 세포는 수탁번호 NITEBP-02014로 기탁된 MDCK 세포인 것을 특징으로 하는, MDCK 세포의 배양방법.
  2. 제 1항에 있어서, 싱글 셀 클로닝을 수행한 MDCK 세포는, MDCK 세포 집단을 무혈청 배지에 순화(acclimatization)시킨 후 싱글 셀 클로닝을 수행한 세포인 것을 특징으로 하는, MDCK 세포의 배양방법.
  3. 삭제
  4. 제 1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 기재된 배양방법에 의하여 배양되는 MDCK 세포에, 바이러스를 감염시킨 후 인큐베이션(incubation)하는 것을 특징으로 하는, 바이러스의 증식 방법.
  5. 삭제
  6. 제 4항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는, 바이러스의 증식 방법.
  7. 마이크로 캐리어를 이용하여 배양할 때, 세포를 일정 시간 동안 배양한 후 세포 밀도를 파종한 세포 밀도로 나눈 값인 확장 배율이 4.5 이상을 나타내는 것을 특징으로 하는 수탁번호 NITEBP-02014로 기탁된 MDCK 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 수탁번호 NITEBP-02014로 기탁된 MDCK 세포는 MDCK 세포 집단을 무혈청 배지에 순화시킨 후 싱글 셀 클로닝을 수행한 세포인 것을 특징으로 하는 수탁번호 NITEBP-02014로 기탁된 MDCK 세포.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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