CN108779438A - Mdck细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用微载体培养时的扩增倍率在4.5以上的克隆MDCK细胞及该MDCK细胞的培养方法、使用该MDCK细胞的培养方法使病毒增殖的方法。

Description

MDCK细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及使用微载体的MDCK细胞的培养方法以及适于微载体培养的MDCK细胞。另外，本发明也涉及通过使用微载体培养MDCK细胞而实现的病毒增殖方法。
本申请请求通过参考援引于此的日本申请特愿2016-65251号作为优先权。
背景技术
近年来，在医药品生产或再生医疗等各种领域中,要求高效大量地培养细胞、组织、微生物等。尤其是为了实现生物医药品或再生医疗的实用化，细胞的大量培养技术的建立很重要。细胞的大量培养使得单克隆抗体、重组蛋白、膜蛋白、病毒等向规模化生产的转变成为可能，从而大大推进生物医药品等的实用化，备受期待。
作为具有粘着性的细胞的大量培养技术，已知有微载体培养法。微载体培养法是将细胞、培养液以及作为细胞的粘着骨架的微载体导入培养容器内，并间歇性地搅拌培养液，使悬浮的细胞和微载体接触，从而使细胞粘着在微载体的表面上的方法。通过该方法，使细胞在微载体的表面上增殖。微载体相对于体积比能够提供非常大的表面积用于细胞的粘着和增殖，从而适于细胞的大量培养。
作为利用细胞的大量培养技术的领域之一，可以举出疫苗制造。在疫苗制造中，在选择对于对象病毒具有敏感性的宿主细胞之后，使培养得到的大量细胞感染病毒，并使病毒增殖从而制造疫苗。由于疫苗的实用化需要大量的病毒，因而必须准备大量感染病毒的细胞。
流感是每年都在全世界流行的传染病，而且存在大流行的可能性，因而必须确保大量的流感疫苗。在流感疫苗的制造中，一直使用利用鸡胚蛋使流感病毒增殖的方法。在利用鸡胚蛋的制造方法中，由于原料采购或品质管理的难度较大，因而利用培养细胞使流感病毒增殖进行制造的方法不断得到实用。但是，培养细胞中病毒的增殖性差，对于迅速供给足够量的疫苗存在制约，这一情况作为问题备受关注。因此，当务之急是构建能够大量且迅速生产疫苗的系统。
流感疫苗的制造包括如下阶段，即：分离或制备流感病毒的病毒种株的阶段、准备所需量的用于使病毒种株增殖的鸡胚蛋或培养细胞的阶段、以及使用鸡胚蛋或培养细胞等使得到的病毒种株增殖的阶段。培养细胞可以在各个阶段中使用。作为流感疫苗的制造中使用的传统的培养细胞，可以举出Madin-Darby狗肾细胞(以下称为MDCK细胞)、非洲绿猴肾细胞(以下称为Vero细胞)等。Vero细胞是1962年从非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)的肾脏上皮细胞分离和建立的，从20多年前开始用来制造针对脊髓灰质炎病毒或日本脑炎病毒等传染病的人用疫苗。Vero细胞对于大范围的病毒具有敏感性，也被使用于流感病毒的增殖中。MDCK细胞是1958年从正常的雄性可卡犬的肾脏建立的细胞，并在1968年由Gaush等人明确了其对于流感病毒的敏感性。通过向MDCK细胞的培养液中添加胰蛋白酶、葡萄糖、维生素等，其相对于流感病毒的敏感性提高，这一情况已被利用于各种流感病毒的分离中。
使流感病毒增殖的阶段中使用的MDCK细胞，正在尝试开发中。例如，专利文献1中公开了使MDCK细胞株(ATCC CCL-34)在无血清培养基中驯化，从而建立能够悬浮(浮游)培养的MDCK-33016株。另外，专利文献2和专利文献3中公开了从MDCK细胞(ATCC CCL-34)克隆能够复制低温适应性流感病毒的PTA-7909株和PTA-7910株。另一方面，经感染病毒的MDCK细胞会产生抑制病毒增殖的干扰素，因而与不会产生干扰素的Vero细胞相比，还具有不易使病毒增殖这一性质。
虽然微载体已被利用于细胞的大量培养，但很难说使用微载体的MDCK细胞的大量培养方法已建立。为了使MDCK细胞在微载体上呈现高增殖效率，要求细胞与微载体的粘着力要强。但是，通过在放大培养槽时反复进行细胞传代，细胞与微载体的粘着力变弱，这成为问题。进而，认为在使用微载体培养MDCK细胞时伴随着搅拌，因而细胞与搅拌叶片或培养槽壁等频繁接触，从而使细胞受到物理压力。由此，在使用微载体大量培养MDCK细胞时，细胞的增殖效率降低成为问题。
在大量培养细胞时，一般使用添加了源自牛或马等动物的血清的培养基。血清是激素或生长因子等的供给源，另外有助于减轻培养操作所带来的物理压力。在使用微载体培养细胞时，随着培养效率的提高而使细胞大量增殖，因而要求供给大量的激素或生长因子等。但是，血清的使用在安全性和工业规模生产的适应性方面存在担忧。因此，在使用微载体的细胞培养中，需要能够在无血清培养基中增殖的细胞。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：国际公开WO1997/037000
专利文献2：国际公开WO2008/105931
专利文献3：国际公开WO2010/036760
发明内容
本发明的课题在于，提供适于使用微载体培养的MDCK细胞以及该MDCK细胞的培养方法。
本发明的发明人们为了解决上述课题而反复专心研究后发现，不仅在无血清培养基中的细胞增殖能力强，而且与微载体具有强粘着力的MDCK细胞以及使用该细胞的培养方法适于使用微载体的培养。进而还发现该细胞在利用无血清培养基的培养中，在微载体上具有高扩增倍率，从而完成了本发明。
本发明的内容如下。
1.一种克隆MDCK细胞的培养方法，其中，使用微载体培养时的扩增倍率在4.5以上。
2.如前项1所述的克隆MDCK细胞的培养方法，其中，克隆MDCK细胞的细胞悬浮率在20％以下。
3.如前项1所述的克隆MDCK细胞的培养方法，其中，克隆MDCK细胞的扩增倍率是以2.0×104细胞/cm2以下的细胞接种密度接种克隆MDCK细胞并进行培养时的扩增倍率。
4.如前项1或3所述的克隆MDCK细胞的培养方法，其中，克隆MDCK细胞的扩增倍率是将克隆MDCK细胞培养48小时以上时的扩增倍率。
5.如前项1至4中任一项所述的MDCK细胞的培养方法，其中，克隆MDCK细胞是将MDCK细胞群在无血清培养基中驯化后进行克隆而得到的细胞。
6.一种MDCK细胞的培养方法，其包括使用微载体对于根据保藏编号NITE BP-02014确定的MDCK细胞进行培养。
7.一种病毒增殖方法，其使用前项1至5中任一项所述的MDCK细胞的培养方法使病毒增殖。
8.如前项7所述的病毒增殖方法，其中，包括在使MDCK细胞感染病毒后对其进行孵育。
9.如前项7或8所述的病毒增殖方法，其中，病毒是流感病毒。
10.一种克隆MDCK细胞，其使用微载体培养时的扩增倍率在4.5以上。
11.如前项10所述的克隆MDCK细胞，其中，克隆MDCK细胞的扩增倍率是以2.0×104细胞/cm2以下的细胞接种密度接种克隆MDCK细胞并进行培养时的扩增倍率。
12.如前项10或11所述的克隆MDCK细胞，其中，克隆MDCK细胞的扩增倍率是将克隆MDCK细胞培养48小时以上时的扩增倍率。
13.如前项10至12中任一项所述的克隆MDCK细胞，其中，克隆MDCK细胞是将MDCK细胞群在无血清培养基中驯化后进行克隆而得到的细胞。
(发明效果)
根据本发明的MDCK细胞以及使用微载体培养该细胞的培养方法，即使在利用无血清培养基的培养中，也能够以低接种密度高效地使MDCK细胞增殖。
附图说明
图1是表示使用细胞株A、B以及预克隆细胞(Pre Cloning Cell)的流感病毒增殖性的确认结果的图。(实施例1)
图2是表示使用微载体培养细胞株A、B以及预克隆细胞时的细胞增殖能力的确认结果的图。(实施例2)
图3是表示使用微载体培养细胞株A、B以及预克隆细胞时的培养液中的培养基成分量和代谢产物量的确认结果的图。(实施例2)
图4是表示使用微载体培养细胞株A、B以及预克隆细胞时的培养液中的悬浮全细胞密度和细胞悬浮率的确认结果的图。(实施例2)
图5是表示使用微载体培养细胞株A和预克隆细胞时的扩增倍率的确认结果的图。(实施例3)
具体实施方式
MDCK细胞是1958年从正常的雄性可卡犬的肾脏建立的动物细胞，被使用于各种用途中。1968年，由Gaush等人明确了MDCK细胞对流感病毒的敏感性，也被使用于流感病毒的增殖和复制中。
本发明的克隆MDCK细胞是将MDCK细胞群在无血清培养基中驯化后进行单细胞克隆而成的细胞。本发明的克隆MDCK细胞中也包含通过对克隆的细胞进行增殖和/或传代而得到的细胞。通常，未进行单细胞克隆的细胞以包含具有各种性质的多个细胞的细胞群的形式存在。在本说明书中，MDCK细胞群是指未进行单细胞克隆的细胞。MDCK细胞群可以使用任意的MDCK细胞群，也可以使用从细胞库获得的MDCK细胞群。例如，可以使用根据ATCCCCL-34确定的细胞。
MDCK细胞群通过在特定的培养基中进行驯化，能够在该培养基中稳定地进行培养。动物细胞的培养中一般使用添加了源自牛或马等动物的血清的培养基。血清是激素或生长因子的供给源，另外也有助于减轻培养操作所带来的物理压力。但是，血清的使用中也会产生许多问题。其中之一就是对于安全性的担忧。存在经由源自动物的血清而混入病毒、细菌、支原体、或者在牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy：BSE)中成为问题的异常朊病毒(prion)等的危险性。还有一个就是对于工业规模生产的适应性的担忧。不同批次的血清的品质或组分不同。这种批次差异会对细胞增殖造成影响。另外，工业规模的生产需要大量的血清，但血清的价格非常高昂，而且供给也不稳定。由以上可知，为了呈工业规模地培养动物细胞，最好使用不含血清的培养基。在本发明中，为了高效地选出能够在无血清培养基中稳定培养的MDCK细胞的克隆MDCK细胞株，在单细胞克隆之前使细胞群在无血清培养基中进行驯化。通过仅对于适于在无血清培养基中增殖的细胞群进行单细胞克隆，能够选择性地仅获得可在无血清培养基中增殖的克隆MDCK细胞株。在单细胞克隆时的无血清培养基中，也可以含有生长因子或微量元素。培养基中所含的生长因子释放出细胞增殖信号。认为驯化工序的培养基中的生长因子的种类会对细胞的性状造成影响。在驯化工序中，MDCK细胞群中包含的细胞在彼此相互影响的同时，被改变为能够在无血清培养基中增殖的细胞。在本发明中，认为通过在单细胞克隆之前使MDCK细胞群在无血清培养基中进行驯化，从而能够选出可以在无血清培养基中高效增殖的细胞。
得到在无血清培养基中进行了驯化的MDCK细胞群之后，进行单细胞克隆。在单细胞克隆中，首先使MDCK细胞一个一个地分离。作为分离方法，可以使用有限稀释法。进而，将分离后的克隆MDCK细胞株在无血清培养基中进行培养直到汇合(confluent)为止，并进行传代，从而获得足够量的细胞。然后，对克隆MDCK细胞株的性质进行评价，从而能够得到具有合适性质的克隆MDCK细胞株。对克隆MDCK细胞株的细胞增殖能力、接种密度、扩增倍率、对病毒的敏感性等进行评价，从而可以选出具有细胞增殖能力高、对多种类型的流感病毒具有敏感性、进而与微载体的粘着力强的特征的克隆MDCK细胞株。虽然很难选出同时具有细胞增殖能力、病毒敏感性以及与微载体的强粘着力的细胞，但本发明的发明人们通过专心研究后发现，利用上述克隆方法可以选出该细胞。另外，细胞增殖能力等的具体的评价方法，可以使用后述实施例中记载的方法。
本发明的培养方法的特征在于，使用与微载体的粘着力(附着力)强的细胞。细胞与微载体的粘着力可以利用在含有微载体的培养液中培养细胞时的细胞悬浮率进行表示。本发明的培养方法的特征在于，使用细胞悬浮率在20％以下、优选在15％以下、更优选在10％以下、尤其优选在5％以下的克隆MDCK细胞。细胞悬浮率是在微载体存在下将MDCK细胞培养一定时间后的悬浮细胞密度除以接种细胞密度所得的值，细胞悬浮率越低，则表示与微载体的粘着力越高。本发明的克隆MDCK细胞的细胞悬浮率是培养时间经过48小时以下、优选为24小时以下、优选为6小时以下、更优选为1.5小时以下、尤其优选为0.5小时以下时的细胞悬浮率。更为具体而言，优选使用经过0.5小时时的细胞悬浮率在20％以下、或者经过1.5小时时的细胞悬浮率在5％以下的克隆MDCK细胞。另外，推测细胞悬浮率不会根据细胞的接种密度而大幅变化。
本发明的培养方法的特征在于，使用扩增倍率在4.5以上、优选在6.5以上、更优选在8.5以上的克隆MDCK细胞。扩增倍率是将细胞培养一定时间后的细胞密度除以接种的细胞密度所得的值，且作为表示增殖的容易度的指标。本发明的克隆MDCK细胞的扩增倍率是使用微载体培养时的扩增倍率，且是培养时间经过48小时以上、优选为60小时以上、更优选为72小时以上，且在144小时以下、优选为120小时以下、更优选为96小时以下时的扩增倍率。另外，本发明中的扩增倍率是以2.0×104细胞/cm2以下、优选在1.6×104细胞/cm2以下、优选在1.3×104细胞/cm2以下、更优选在1.0×104细胞/cm2以下，且在0.1×104细胞/cm2以上、优选在0.2×104细胞/cm2以上、更优选在0.3×104细胞/cm2以上、尤其优选在0.6×104细胞/cm2以上的接种密度接种时的扩增倍率。例如，可以使用后述实施例3中记载的方法培养细胞，并确认扩增倍率。在本发明的培养方法中，具有即使在低接种密度下也能够快速地使细胞增殖，从而能够节约放大(scale up)的时间和成本这一优点。另外，根据本发明的培养方法，可以节约细胞转移至对数生长期为止的时间。更为具体而言，优选使用在以0.6×104细胞/cm2以上且2.0×104细胞/cm2以下的接种密度进行接种的情况下，在接种细胞后培养72小时～96小时时的细胞扩增率在4.5以上的克隆MDCK细胞。
本发明中的克隆MDCK细胞只要具有上述细胞悬浮率和/或扩增倍率即可，并无特别限定。对于通过上述克隆方法选出的细胞进行增殖和/或传代而得到的细胞，也包含在本发明的克隆MDCK细胞中。细胞的传代可以通过公知的方法进行。在使用微载体进行细胞培养之后，细胞增殖，由此细胞密集粘着在微载体表面上。在传代中，将密集粘着的细胞移至新的微载体表面上。例如，可以通过下述方式进行，即：使用胰蛋白酶或胶原酶等蛋白酶将细胞从微载体上取出，接着对这些细胞进行清洗等，并稀释至含有微载体的培养基中。
进一步具体而言，本发明中的克隆MDCK细胞是根据国际保藏的保藏编号NITE BP-02014确定的MDCK细胞。该细胞是2015年3月4日以保藏编号NITE P-02014在日本国内保藏于独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(邮政编码：292-0818，日本国千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8 122号室)之后，由独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心根据布达佩斯条约申请移交至国际保藏，并以保藏编号NITE BP-02014被接收的细胞。根据保藏编号NITE BP-02014确定的MDCK细胞，如后述实施例1所示，是以MDCK细胞(源自ATCC CCL-34)为基础，通过有限稀释法进行单细胞克隆后选出的细胞。
本发明的培养方法包括使用微载体培养克隆MDCK细胞。微载体是能够使细胞粘着在表面进行细胞培养的微粒。微载体的表面只要是能够粘着细胞的材质便无特别限定，本发明中使用的微载体无特别限定。作为微载体的材质，可以举出葡聚糖、明胶、胶原蛋白、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯酰胺、玻璃、纤维素等。微载体的材质优选为葡聚糖。作为微载体的形状，可以举出球状(beads)、圆盘状等。微载体的形状优选为球状。
球状的微载体的大小(直径)例如约为0.01mm～1mm，优选约为0.05mm～0.5mm，更优选约为0.1mm～0.3mm。微载体也可以为多孔性。本发明中使用的球状的微载体，可以举出例如Cytodex 1(商品名)、Cytodex 3(商品名)、Cytopore(商品名)(以上由GE医疗生命科学公司生产)等。作为圆盘状的微载体，可以举出例如Cytoline 1(商品名)、Cytoline 2(商品名)(以上由GE医疗生命科学公司生产)等。作为多孔性的微载体，可以举出例如Cytopore(商品名)、Cytoline 1(商品名)、Cytoline 2(商品名)(以上由GE医疗生命科学公司生产)等。作为其他市售的微载体，可以举出Biosilon(商品名)(NUNC公司生产)、Hillex(商品名)(SoloHill公司生产)、Corning(注册商标)微载体(Corning公司生产)等。本发明中使用的微载体，尤其优选为球状的葡聚糖制微载体。作为球状的葡聚糖制微载体，优选为Cytodex1(商品名)、Cytodex 3(商品名)以及Cytopore(商品名)，进而优选为Cytodex 1(商品名)和Cytodex 3(商品名)，尤其优选为Cytodex 1(商品名)。
本发明的培养方法中的克隆MDCK细胞的接种密度无特别限定，可以适当地进行调节。例如，即使在以2.0×104细胞/cm2以下、优选为1.6×104细胞/cm2以下、优选为1.3×104细胞/cm2以下、更优选为1.0×104细胞/cm2以下的接种密度接种MDCK细胞的情况下，也能够使细胞增殖。另外，理想的是以0.1×104细胞/cm2以上、优选为0.2×104细胞/cm2以上、更优选为0.3×104细胞/cm2以上的接种密度进行接种。本说明书中的接种密度(细胞/cm2)是指接种细胞时的每一培养表面积的细胞密度。另外，培养基中的细胞的密度可以通过公知的方法进行确认，例如可以通过使用血球计数板或自动细胞计数器等的测量方法进行确认。本发明由于是使用微载体进行培养，因而MDCK细胞粘着在微载体的表面上进行增殖。本说明书中的接种密度是接种细胞时的微载体的每一表面积的细胞密度。通过以2.0×104细胞/cm2以下这样的低接种密度进行培养，能够将为了培养而准备的细胞量抑制至少量，因而具有能够节约成本这一优点。
另外，用于培养本发明的克隆MDCK细胞的培养基无特别限定，但优选为没有添加源自动物的血清的无血清培养基。无血清培养基可以使用任意的无血清培养基，例如可以使用Eagle MEM培养基(日水制药)、OptiPRO SFM(Thermo Fisher Scientific)、VP-SFM(Thermo Fisher Scientific)、EX-CELL MDCK(SAFC Biosciences)、UltraMDCK(Lonza)、ProVero 1(Lonza)、BalanCD MDCK(Irvine Scientific)等。另外，微载体的密度、搅拌转速、溶氧浓度以及培养温度等培养条件，只要是细胞能够增殖的条件即可，可以适当地进行调节。在本发明的培养方法中，即使搅拌转速为30rpm～60rpm左右，细胞也能够良好地粘着在微载体上，从而能够高效地增殖。
本发明的克隆MDCK细胞可以使用于使MDCK细胞能够感染的病毒增殖的方法、或者生产通过MDCK细胞产生的代谢产物等物质的方法等中。优选本发明的MDCK细胞可以使用于使MDCK细胞能够感染的病毒增殖的方法中。作为MDCK细胞能够感染的病毒，只要是MDCK细胞具有敏感性的病毒即可，可以举出例如正粘病毒、副粘病毒、棒状病毒以及黄病毒。作为其中一例而列举流感病毒的情况进行说明。
本发明的克隆MDCK细胞具有敏感性的流感病毒无特别限定。例如，包括目前已知的所有亚型以及将来分离和确定的亚型。在A型流感病毒的情况下，根据它们的HA分子和NA分子的抗原性分类为亚型(即，十六种HA(H1～H16)亚型和九种NA(N1～N9)亚型)，可以考虑包含HA亚型与NA亚型的组合的流感病毒。在B型流感病毒的情况下，可以考虑包含维多利亚(Victoria)系统与山形系统的组合的流感病毒。
关于A型流感病毒的各亚型，由于RNA基因组的变异性高，因而频繁产生新的毒株。2009年4月在墨西哥流行而被认知后在全世界流行的流感被称为新型流感、猪流感、大流行性流感A(H1N1)、swine flu、A/H1N1pdm等。在猪之间流行的病毒在农场等处从猪直接传染至人后在人与人之间扩散的新型流感与从前就存在的季节性的A苏联型流感(流感A型病毒H1N1亚型)或A香港型流感(流感A型病毒H3N2亚型)被区别开来。另外，由于RNA基因组的变异性高，因而即使在流感A型病毒的同一亚型中，病毒株也根据分离的时期或场所的不同而存在区别。
B型流感病毒虽然持续发生不可逆的抗原变异，但与A型流感病毒中的变异相比较慢，流行周期为两年左右。B型流感病毒自从在1940年纽约的中等规模的流感流行中首次被分离以来，经常反复流行，从记录来看其所引起的死亡率在上升。已确认仅在人与人之间传染，但不存在亚型，仅存在山形系统和维多利亚系统这两种系统。
本发明中使用的流感病毒，除了上述从生物体分离的流感病毒之外，也可以是为了能够适用于流感疫苗而实施了减毒、鸡蛋增殖适应化、细胞培养增殖适应化、温度敏感性表型转化、粘膜给药适应化等改变而制成的重组病毒。另外，作为实施改变的方法，可以举出：向流感病毒的抗原部位或聚合酶部位等八条RNA片段导入变异的方法、通过反求遗传学(reverse genetics)将增殖能力强的毒株的RNA片段和呈目标抗原性的RNA片段重组的方法、通过低温传代制备弱毒病毒的方法、向病毒培养系统中添加诱变剂的方法等各种方法。
可以通过在将克隆MDCK细胞以上述接种密度接种至含有微载体的培养液中之后，对其进行培养直到汇合，然后将其转移至新的微载体上，从而进行放大。本发明的培养方法中的克隆MDCK细胞的培养时间，只要适于放大即可，并无特别限定。例如，培养时间在48小时以上、优选在60小时以上、更优选在72小时以上，且在144小时以下、优选在120小时以下、更优选在96小时以下。放大的步骤与传代相同。
在本发明的培养方法中，使克隆MDCK细胞感染流感病毒的时期并无特别限定，只要是在实用上合适的时期即可。例如，优选在放大之后细胞汇合时使其感染流感病毒，然后将细胞孵育一定时间。孵育时间并无特别限定。孵育是指将细胞在某种条件下维持一定时间，不限是否通过孵育使细胞增殖。孵育也可以在与培养细胞时相同的条件下进行，优选在所感染的病毒的最佳条件下进行。MDCK细胞所感染的流感病毒被称为病毒种株(seedvirus)。流感病毒在从生物体分离之后、或者在被实施某些改变而制成之后，使用鸡蛋或各种细胞进行传代使其增殖，从而成为病毒种株。本发明中使用的病毒种株可以是使用鸡蛋或各种细胞中的任意一种进行传代的病毒种株，并无特别限定。在本发明的培养方法中，更优选使克隆MDCK细胞感染通过MDCK细胞进行传代增殖而成的病毒种株，从而使流感病毒增殖。
另外，通过本发明的培养方法增殖后的流感病毒，被使用于流感疫苗的制造中。关于从MDCK细胞纯化流感病毒的工序，可以使用公知的方法或今后开发的任意方法。
实施例
为了有助于理解本发明，以下列举实施例具体对本发明进行说明，但本发明并不限定于本实施例。
(实施例1)克隆MDCK细胞的制备和选择
1.单细胞克隆
(1)利用含血清培养基的培养
解冻从ATCC获得的MDCK细胞(ATCC No.CCL-34、Lot 1166395、传代数53)，加入含10％胎牛血清(以下称为FCS)的Eagle MEM培养基(日水制药)并进行离心清洗。向该团块(pellet)中加入含10％FCS的Eagle MEM培养基使其悬浮，并将其在T75烧瓶内进行培养。在使用含有1mM EDTA-4Na的PBS溶液对于在37℃±1℃下培养了五天的细胞进行清洗之后，添加胰蛋白酶使细胞从培养器剥离。添加含有10％FCS的Eagle MEM培养基中和胰蛋白酶，并在T225烧瓶中进行传代。将该细胞在37℃±1℃下培养四天之后，同样在T225烧瓶中进行传代。通过胰蛋白酶处理将在37℃±1℃下培养了六天的细胞回收之后，添加含有10％FCS的Eagle MEM培养基中和胰蛋白酶。通过离心分离细胞，使得到的团块悬浮在CELLBANKER 2(日本全药工业生产)中，并在液氮中冷冻保存(传代数56)。
(2)源自ATCC的MDCK细胞群在无血清培养基中的驯化
接下来，将(1)中得到的细胞解冻，并使用无血清培养基OptiPRO SFM(ThermoFisher Scientific)在T75烧瓶内进行培养。使用含有1mM EDTA-4Na的PBS溶液对于在37℃±1℃下培养了四天的细胞进行清洗之后，添加TrypLE Select(Thermo FisherScientific)使细胞从培养器剥离。向该细胞中加入OptiPRO SFM进行离心清洗，向得到的团块中加入OptiPRO SFM使其悬浮，并将其转移至T75烧瓶中，在37℃±1℃下培养四天。使用TrypLE Select回收该细胞，并使离心清洗后得到的团块悬浮在CELLBANKER 2中，在-80℃的冷冻柜中冷冻保存(传代数58)。
(3)无血清驯化MDCK细胞的单细胞克隆
通过有限稀释法对于(2)中得到的源自ATCC的无血清驯化MDCK细胞群(以下称为“预克隆细胞(Pre Cloning Cell)”)进行单细胞克隆，选出细胞增殖性出色、形态均匀的细胞株。克隆的具体步骤如下。解冻预克隆细胞，并使用无血清培养基OptiPRO SFM在T25烧瓶内进行培养。使用含有1mM EDTA-4Na的PBS溶液对于在37℃±1℃下培养了三天的细胞进行清洗之后，添加TrypLE Select使细胞从培养器剥离。向该细胞中加入OptiPRO SFM进行离心清洗，并向得到的团块中加入OptiPRO SFM使细胞重新悬浮。统计该细胞悬浮液中的细胞数量，调节成5cells/mL的细胞悬浮液。在96孔板的各孔中分别接种100μL的5cells/mL的细胞悬浮液，并对仅接种了一个细胞的孔贴上标记进行培养。在贴有标记的孔的细胞达到汇合之后，使用TrypLE Select进行剥离，并在24孔板中进行传代。为了除去培养基中的TrypLE Select，在传代第二天将孔中的培养液完全除去，换成新鲜的培养基。同样利用六孔板、T75烧瓶反复进行传代，在得到足够数量的细胞时将克隆MDCK细胞株冷冻保存(传代数63)。
2.筛选
(1)流感病毒的增殖性的评价
对得到的克隆MDCK细胞株实施以流感病毒增殖性为指标的筛选。另外，在本实施例中，按照国立传染病研究所著的《流感诊断指南(第三版，2014年9月)》的“Part IV”中公开的方法，对流感病毒的HA价和传染性滴度进行了确认。
(1-1)第一次筛选
首先，解冻所有的克隆MDCK细胞株和预克隆细胞，并使用无血清培养基OptiPROSFM在T75烧瓶内进行培养(传代数64)。解冻后，将增殖的克隆MDCK细胞株接种至六孔板中，并在37℃±1℃下进行培养，然后使其以m.o.i＝0.0001感染流感病毒株(传代数65)。为了评价克隆MDCK细胞株的病毒增殖性，对病毒培养上清液的HA价进行了测量。
(1-2)第二次筛选
关于呈预克隆细胞以上的HA价的克隆MDCK细胞株(整体的30.2％)，对于其他的流感病毒株的增殖性进行了评价。与之前的试验同样，在使利用六孔板培养过的克隆MDCK细胞株(传代数65)感染病毒之后，进行使用病毒培养上清液的HA价测定试验，选择对于所有病毒株均呈预克隆细胞以上的HA价的克隆MDCK细胞株(整体的2.8％)。
(1-3)第三次筛选
对于通过使用六孔板筛选选择的克隆MDCK细胞株，进一步确认了在T75烧瓶规模(flasco scale)下的流感病毒增殖性。使在T75烧瓶内培养的克隆MDCK细胞株(传代数65)分别以m.o.i＝0.0001感染A/New Caledonia(H1N1)、A/Hiroshima(H3N2)等的病毒株。对病毒培养上清液的HA价进行确认，并选择在所有病毒株中均呈与预克隆细胞同等以上的HA价的克隆MDCK细胞株(整体的0.6％)。
(1-4)第四次筛选
对于通过使用T75烧瓶进行筛选而选择的克隆MDCK细胞株，对于传代十代以上的细胞的流感病毒增殖性进行了确认。解冻克隆MDCK细胞株，并使用无血清培养基OptiPROSFM在T75烧瓶内进行传代培养。使传代数为77代～80代的细胞分别以m.o.i＝0.0001感染A/New Caledonia(H1N1)等的病毒株。测量病毒培养上清液的传染性滴度的结果是：所有克隆MDCK细胞株相对于所有病毒株均得到7.0log10TCID50/mL以上的传染性滴度。
(2)微载体上的细胞增殖能力的评价
关于以病毒增殖性为指标而选择的克隆MDCK细胞株，对其微载体培养的适应性进行了评价。
(3)克隆MDCK细胞株的选择
根据上述评价结果，选择能够使用无血清培养基进行培养，且对多个亚型的流感病毒具有敏感性，进而与微载体的粘着力强的、源自ATCC的无血清驯化克隆MDCK细胞株A(以下称为“细胞株A”)。微载体使用Cytodex1(GE医疗生命科学公司)。另一方面，还选择了与微载体的粘着力弱于细胞株A，但其他性质与细胞株A类似的克隆MDCK细胞株B(以下称为“细胞株B”)，作为比较对象。
另外，细胞株A以保藏编号NITE P-02014保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(邮政编码：292-0818，日本国千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8122号室)(接收日期：2015年3月4日)，并由独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心根据布达佩斯条约申请移交至国际保藏，并以保藏编号NITE BP-02014被接收。
(4)选择的克隆MDCK细胞株的流感病毒增殖性
利用T75烧瓶使细胞株A增殖。当细胞株A汇合时，将流感病毒接种至细胞。关于细胞的培养条件的各参数以及关于流感病毒株的感染时的细胞数量的各参数如下。
【表1】
接种的病毒株均是由国立传染病研究所分配，且通过MDCK细胞传代了五代的细胞，分别称为：A/Ibaraki/N12073/2011(H1N1)pdm09(以下称为“TA-73”)、A/Ibaraki/N12232/2012(H3N2)(以下称为“TA-232”)、B/Ibaraki/N12322/2012(以下称为“TA-322”)、B/Ibaraki/N12336/2012(以下称为“TA-336”)。接种量为m.o.i＝0.001。作为培养用的培养基，使用添加了4mM谷氨酰胺、4.7g/L葡萄糖、20mM碳酸氢钠以及0.1×TrypLE Select的Eagle MEM培养基，并在34℃、5％CO2的条件下进行培养。在感染病毒之后，对培养第一天至第三天的培养上清液进行抽样，并测定了HA价和传染性滴度。关于HA价，对于TA-73、TA-322以及TA-336，使用0.5％鸡红血球在室温下反应一小时后进行测定，对于TA-232，使用1.0％豚鼠红血球在4℃下反应1.5小时后进行测定。另外，传染性滴度的单位为log10TCID50/mL。
感染流感病毒后的第一天至第三天(1～3dpi)的HA价的结果如下述表2所示，传染性滴度的结果如下述表3所示。另外，将上述结果加以总结而成的图表如图1所示。在图1中，实线为传染性滴度，虚线为HA价。
【表2】
HA价
【表3】
传染性滴度
根据HA价和传染性滴度的变迁可知，对于所有病毒株而言，均呈利用细胞株A增殖时的流感病毒增殖性高于利用其他细胞株增殖时的流感病毒增殖性的趋势。
(实施例2)使用微载体的克隆MDCK细胞株的培养
使用添加了4mM谷氨酰胺的无血清培养基OptiPRO SFM(Thermo FisherScientific)对细胞株A进行培养。对照细胞使用细胞株B和预克隆细胞。细胞以2.3×104细胞/cm2的接种密度进行接种。微载体以3.5g/L的密度使用Cytodex 1(GE医疗生命科学公司)。培养条件为：培养第48小时之前的搅拌转速为15rpm、48小时以后的搅拌转速为30rpm、pH为7.0、温度为37.0℃、溶氧浓度(DO)为3.00ppm。通过多孔管进行通气。另外，培养容器使用3L容量的生物反应器。
培养液中的细胞数量通过如下方法进行确认，即：提取一部分的培养液，并使用胰蛋白酶使粘着在微载体上的细胞分散。细胞数量的测量中使用死活细胞自动分析仪(Beckman Coulter公司生产)。另外，代谢物的浓度使用生物过程分析仪Cedex Bio(RocheDiagnostics公司生产)进行确认。
各细胞株的细胞增殖能力的确认结果如图2所示。图2中的实线表示粘着在微载体上的细胞的数量，虚线表示悬浮在培养上清液中的细胞的数量。各细胞株在悬浮状态下无法增殖，从而死亡。细胞株A与预克隆细胞或细胞株B相比较，由于悬浮在上清液中的细胞的数量少，因而可知细胞株A与微载体的粘着力强。
细胞株A在培养第三天增殖至6.9×104细胞/cm2。另一方面，细胞株B和预克隆细胞增殖至同等程度需要四天。
另外，培养基中存在的培养基成分和细胞的代谢产物的浓度如图3所示。
在本实施例的培养条件的培养液中，对悬浮于上清液中的细胞数量进行了测量。通过以下算式算出接种的细胞中悬浮于上清液中的细胞的比例，作为细胞悬浮率。
(各培养时间的悬浮全细胞密度)/(接种细胞密度)×100＝细胞悬浮率(％)
各细胞株的悬浮全细胞密度的确认结果如图4所示，各细胞株的细胞悬浮率如下述表4所示。细胞株A与预克隆细胞或细胞株B相比较，细胞悬浮率低，因而可知细胞株A与微载体的粘着力强。另外，细胞株A在从培养开始经过1.5小时时，接种的细胞几乎全部附着在微载体上。
【表4】
细胞悬浮率
培养时间(hr) 0.5 1.5 4 6 24
预克隆细胞 20.9 7.8 8.8 4.9 5.6
细胞株A 4.1 1.0 0.8 1.0 0.9
细胞株B 41.0 42.9 38.4 19.7 12.3
(实施例3)克隆MDCK细胞株的扩增倍率的确认
与实施例2同样，以下述a～d的细胞接种密度接种细胞株A，并进行培养。使用预克隆细胞作为对照。
a：2.0×104细胞/cm2(17.6×104细胞/mL)
b：1.0×104细胞/cm2(8.8×104细胞/mL)
c：0.6×104细胞/cm2(5.3×104细胞/mL)
d：0.3×104细胞/cm2(2.6×104细胞/mL)
另外，培养容量为400mL，在37.0℃、5％CO2存在下，以60rpm进行搅拌培养。微载体使用Cytodex 1。微载体的密度为2.0g/L。
结果如图5所示。图表的各点附近的值表示各个时刻的扩增倍率的值。由此可知，细胞株A从培养开始经过约30小时～144小时时的扩增倍率高于预克隆细胞，能够高效地增殖。另外，无论细胞接种密度如何，细胞株A从培养开始经过约72小时～96小时时的扩增倍率的值均在约4.5以上，高于预克隆细胞。
(实施例4)克隆MDCK细胞株在微载体间的转移
根据以下条件将细胞株A从微载体转移至微载体。另外，在转移后，使细胞株A感染流感病毒，并通过与实施例1同样的方法测定病毒的HA价和传染性滴度。
(1)微载体间的转移方法
在无血清培养基中使用Cytodex 1作为微载体并以2L规模对细胞株A进行培养，使其增殖。然后，停止培养条件的各种控制，使微载体沉淀。然后，提取培养上清液，添加含有1mM EDTA-4Na的PBS溶液，并在37℃下清洗30分钟。在使微载体再次沉淀之后，提取细胞清洗液。添加胰蛋白酶，并在37℃下进行30分钟左右的处理。在添加胰蛋白酶抑制剂之后，将细胞和微载体全部注入20L的培养器中。表5表示细胞接种时的接种参数，表6表示细胞培养中的增殖参数。
【表5】
接种参数
【表6】
增值参数
有效体积 2L 20L
搅拌 20～30rpm 20～60rpm
温度 37.0℃ 37.0℃
pH 7.4以下 7.4以下
(2)微载体间转移后的克隆MDCK细胞株的病毒敏感性
在微载体间转移之后，当MDCK细胞汇合时，将流感病毒接种至细胞。接种的病毒株为TA-73，接种量为m.o.i＝0.001。流感病毒接种时的有效体积为20L，活细胞密度为12.8×104细胞/cm2～16.0×104细胞/cm2。培养基使用添加了4mM谷氨酰胺、3.6g/L葡萄糖、20mM碳酸氢钠以及0.1×TrypLE Select的Eagle MEM培养基。在接种病毒之后，以搅拌转速20rpm～60rpm、pH7.0、温度34.0℃、溶氧浓度(DO)3.00ppm的培养条件进行培养。在感染病毒之后，在培养第四天之前每天对培养上清液进行抽样，并测定传染性滴度。其中，将最高的传染性滴度的值作为峰值传染性滴度(log10TCID50/mL)。传染性滴度的测定与实施例1同样地进行。
峰值传染性滴度如下述表7所示。
【表7】
峰值传染性滴度
病毒株 第一次研究 第二次研究
TA-73 8.50 8.72
由此可知，由于细胞株A在微载体培养中的细胞增殖能力强，因而可以在病毒培养开始时准备大量的细胞，而且微载体转移后的病毒增殖性也高。
(产业上的可利用性)
如以上详细所述，根据本发明的培养方法，能够使用微载体高效地使MDCK细胞增殖。进而，通过使用本发明的培养方法，能够高效地使病毒增殖，因而能够高效地制造疫苗，从而在产业上表现出色。在疫苗制造的实用化中，大容量的培养是必须的，然而根据本发明的MDCK细胞和使用微载体培养该细胞的培养方法，具有如下优点，即：由于在微载体上的扩增倍率高、和/或与微载体的粘着力高，因而能够节约放大的成本和时间。

Claims (13)

1.一种克隆MDCK细胞的培养方法，其特征在于，
使用微载体培养时的扩增倍率在4.5以上。
2.如权利要求1所述的克隆MDCK细胞的培养方法，其特征在于，
所述克隆MDCK细胞的细胞悬浮率在20％以下。
3.如权利要求1所述的克隆MDCK细胞的培养方法，其特征在于，
所述克隆MDCK细胞的扩增倍率是以2.0×104细胞/cm2以下的细胞接种密度接种所述克隆MDCK细胞并进行培养时的扩增倍率。
4.如权利要求1或3所述的克隆MDCK细胞的培养方法，其特征在于，
所述克隆MDCK细胞的扩增倍率是将所述克隆MDCK细胞培养48小时以上时的扩增倍率。
5.如权利要求1至4中任一项所述的MDCK细胞的培养方法，其特征在于，
所述克隆MDCK细胞是将MDCK细胞群在无血清培养基中驯化后进行克隆而得到的细胞。
6.一种MDCK细胞的培养方法，其特征在于，
包括使用微载体对于根据保藏编号NITE BP-02014确定的MDCK细胞进行培养。
7.一种病毒增殖方法，其特征在于，
使用权利要求1至5中任一项所述的MDCK细胞的培养方法使病毒增殖。
8.如权利要求7所述的病毒增殖方法，其特征在于，
包括在使MDCK细胞感染病毒后对其进行孵育。
9.如权利要求7或8所述的病毒增殖方法，其特征在于，
所述病毒是流感病毒。
10.一种克隆MDCK细胞，其特征在于，
使用微载体培养时的扩增倍率在4.5以上。
11.如权利要求10所述的克隆MDCK细胞，其特征在于，
所述克隆MDCK细胞的扩增倍率是以2.0×104细胞/cm2以下的细胞接种密度接种所述克隆MDCK细胞并进行培养时的扩增倍率。
12.如权利要求10或11所述的克隆MDCK细胞，其特征在于，
所述克隆MDCK细胞的扩增倍率是将所述克隆MDCK细胞培养48小时以上时的扩增倍率。
13.如权利要求10至12中任一项所述的克隆MDCK细胞，其特征在于，
所述克隆MDCK细胞是将MDCK细胞群在无血清培养基中驯化后进行克隆而得到的细胞。
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