WO2006095431A1

WO2006095431A1 - 動物由来の成分なしで培養可能である細胞株及びその作出方法、これを用いたウイルスの生産方法、及びワクチンの生産方法

Info

Publication number: WO2006095431A1
Application number: PCT/JP2005/004240
Authority: WO
Inventors: Masami Mochizuki
Original assignee: Kyoritsu Seiyaku Corporation
Priority date: 2005-03-10
Filing date: 2005-03-10
Publication date: 2006-09-14
Also published as: JP4693839B2; EP1862537A1; CA2601006A1; JPWO2006095431A1; ES2424365T3; US7910366B2; EP1862537A4; CA2601006C; EP1862537B1; US20080138362A1

Abstract

　本発明は、犬腎臓由来細胞であるMDCK細胞から誘導した細胞株であって、動物由来の成分なしで培養可能である細胞株に関する。また、この細胞株は、MDCK細胞を、血清を含有せず細胞増殖因子を含む培地に順化させる工程と、RPMI 1640 培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地を用いて培養し、動物由来の成分なしで培養可能である細胞株を作出する工程とを含む細胞株の作出方法により作出される。

Description

明細書

動物由来の成分なしで培養可能である細胞株及びその作出方法、これを用いたウィルスの生産方法、及びワクチンの生産方法

技術分野

[0001] 本発明は、動物由来の成分なしで培養可能な細胞株及びその作出方法に関する

。また、本発明は、この細胞株を用いたウィルスの生産方法、診断用抗原の製造方法及びワクチンの製造方法に関する。さらに、本発明は、この細胞株の培養に用いる培地に関する。さらに、本発明は、この細胞株の凍結保存用培地および凍結保存方法に関する。

背景技術

[0002] 動物などの細胞を試験管内で培養する技術は創成されてから半世紀以上経過し、科学技術の進歩に相まって格段の進展をみて、る。

[0003] 一般に、生きている動物を直接試験した場合は結果の理解は容易であるが、技術的にも経済的にも多くの問題点がある。そこで、動物の一部を取り出し、シャーレや試験管などの人工環境内で細胞が増殖されるようになった。これは、組織培養法又は細胞培養法と呼ばれている。そのような技術は難しくないために、この方法により、医薬品、ワクチン及び診断用抗原などを作成することが可能となった。しかし、動物細胞を生体外で培養するためには、元の生体の環境となるべく同じ条件で培養することが求められる。例えば、無菌状態、温度環境を生体と同じ温度にする等の条件である。

[0004] さらに、上記の条件を満たしても、細胞の分裂増殖のためには、栄養源として、「細胞成長因子: cell growth factor」を追加供給する必要があった。細胞成長因子としては、例えば、各種ホルモン、インスリン、プトレシン、線維芽細胞増殖因子が挙げられる。しかし、細胞成長因子は全ての細胞種で解明されたわけではなぐ多くの場合「 unknownjな成分を含む。

[0005] そこで、細胞成長因子の代わりに、その効果が非特異的に期待できる動物血清が用いられる。動物血清の中でも、個体数が多ぐ安定的に供給可能であるということから牛血清が選択される。さらに、毒性のある蛋白質が少ない胎仔の血清が、頻繁に使われるようになった。科学的研究の場合には、牛が目的外の動物種であっても、牛に由来する蛋白を試験研究材料中に含むことが許される場合がある。しかし、牛由来の蛋白を、医薬品として人及び他の動物種に対して用いると、問題が起こる場合がある。

[0006] 第 1の問題はアレルギーに関する。ゥシ血清が入っているワクチンや薬剤を、牛以外の人や動物に非経口的に注射した場合、初回では多くは問題にはならない。しかしながら、 2回目の注射以降にはアレルギー反応として問題ィ匕する場合がある。これは免疫学的に説明される。即ち、動物は初めて暴露した高分子物質 (例えば分子量が 10,000ドルトン以上の蛋白質）には低い反応し力示さず、投与された物質は体内で分解処理されてしまう。しかし、免疫系組織には暴露の記憶が残される。そのため、同じ物質 (抗原）の次回以降の暴露時には初回時の記憶免疫細胞が直接反応し、短時間内に初回より強く生体反応が起きてくる。人や動物の個体によっては、これら外力暴露された抗原に対して望ましくない反応をする場合がある。それが典型的にはアレルギー反応と呼ばれる。アレルギー反応により、注射局所の発熱や腫脹、ひどい場合は気管閉塞による呼吸困難、虚脱などのために死亡する。

[0007] 第 2番目の問題は、牛血清中に含まれる病原体又は牛血清抗体の混入に関する。

例えば、牛に感染するぺスチウィルス、レトロウイルス、あるいはマイコプラズマなどの汚染が有名である。最近は、牛海綿状脳症（bovine spongiform encephalopathy: BSE )、いわゆる「狂牛病」の病原体である異常プリオンの混入が問題となっている。

[0008] 上記の通り、牛血清の使用には問題点があるのにもかかわらず、特に動物を対象とする獣医療領域で用いられるワクチンの製造には牛血清が世界中で習慣的に使われてきている。

[0009] しかし、最近になって、牛血清を細胞培養法に用いな、試み (無血清培地： SFMおよび無血清細胞培養法)や、それを用いて牛用の試作ワクチンを作成したと、う報告力 S出てさた (Makoschey et al., Serum-free produced bovine herpesvirus type 1 and bovine parainfluenza type 3 virus vaccines are efficacious and safe. Cytotechnology, 39: 139-145, 2002) ₀しかしながら、この文献には、牛以外の動物用のワクチンにつ、ては開示されておらず、ましてや犬用のワクチンにつ、ては開示されて!ヽな、。

[0010] また、 MDCK細胞を無血清培地で培養し、インフルエンザウイルスを増殖させたと、つ報告力ある (Kessler et ai., Suitability of MDし K cells grown in a serum-free medium for influenza virus production. In Brown et al., ed., Inactivated influenza vaccines prepared in cell culture. Dev. Biol. Stand. Basel, Karger, 1999, vol.98, pp 13—21.： Merten et al., Production of influenza virus in serum-free mammalian cell cultures. In Brown et al" ed., Inactivated influenza vaccines prepared in cell culture. Dev. Biol. Stand. Basel, Karger, 1999, vol.98, pp 23—37.: Voeten et al., eneration and characterization of reassortant influenza A viruses propagated in serum-free cultured MDCK-SF1 cells. In Brown et al., ed., Inactivated influenza vaccines prepared in cell culture. Dev. Biol. Stand. Basel, Karger, 1999, vol.98, pp 77—87.: Voeten et al., Characterization of high-grown reassortant influenza A viruses generated in MDCK cells cultured in serum-free medium. Vaccine 17:

1942-1950, 1999.：牧角啓一ら、無血清培養かつ浮遊培養可能な細胞及び当該細胞を用いたワクチン用ウィルスの製造法、再公表特許 (Al)、国際公開番号 WO 01/064846、国際公開日 2001.9.7)。しかしながら、これらの文献に開示されている培地は、成分が不明であったり、無血清だが動物由来の成分を含んだりしていた。

[0011] 無血清培地で培養した細胞の簡便な凍結保存法については、 SFMの一つである MDSS2培地（AXCELL Biotechnologies, F- 69610 Saint Genis l'Arentiere)にジメチルスルホキシド (Dimethyl sulfoxide : DMSO)を 10%添カ卩して、サル腎臓由来細胞 Vero 細胞とハムスター腎臓由来細胞である BHK-21細胞を凍結保存したことが報告されて V、る (Merten et al., A simple serum-free freezing medium for serum-free cultured cells. Biologicals, 23: 185-189, 1995.)。しかしながら、 MDSS2培地には動物蛋白であるカゼイン由来のペプトンが 0.3%含まれている。また、 VP-SFM培地に 10%の割合で DMSOを添加した培地が無血清培養した細胞の凍結保存に応用できることが報告されて、る (Price and Evege, Serum-free medium without animal components for virus production. Focus, 19: 67-69, 1997.)。しかしながら、 VP-SFM培地自体の組成が不明である。 [0012] すなわち、動物由来の成分を含まない培地、動物由来成分を含まない培地で培養される細胞、及び安全なワクチン及び検査試薬等が望まれてヽた。

発明の開示

[0013] 本発明の一態様は、犬腎臓由来細胞である MDCK細胞力誘導した細胞株であつて、動物由来の成分なしで培養可能である細胞株に関する。この細胞株は、受託番号 FERM BP-10225で寄託された細胞株又はこの細胞株と同等の生物学的性質を有する細胞株であってもよい。

[0014] また、本発明の一態様は、 MDCK細胞を、血清を含有せず細胞増殖因子を含む培地に順化させる工程と、 RPMI 1640培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であつて、動物由来の成分を含まない培地を用いて培養し、動物由来の成分なしで培養可能である細胞株を作出する工程とを含む細胞株の作出方法に関する。

[0015] さらに、本発明の一態様は、細胞株にウィルスを感染させる工程と、感染した細胞株を培養してウィルスを増殖させる工程とを含むウィルスの生産方法に関する。この感染した細胞株を培養する際の培地は、 RPMI 1640培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地であってもよい。感染した細胞株を培養する際に浮遊培養法を用いてもよい。ウィルスは、ノラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ラブドウィルス科、フラビウィルス科、力リシウィルス科、アデノウィルス科、ヘルぺスウィルス科及びパルボウイルス科からなる群から選ばれるウィルスであってもよい。また、ウィルスは、犬ジステンパーウィルス、麻疹ウィルス、犬パラインフルエンザウイルス、 SV5ウィルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウィルス、日本脳炎ウィルス、犬力リシウィルス、 1型および 2型犬アデノウイルス、人アデノウィルス、犬へルぺスウィルス及び 1型と 2型犬パルボウイルスカなる群力選ばれるウイルスであってもよい。

[0016] さらに、本発明の一態様は、上記の方法により生産されたウィルスを用いた診断用抗原の製造方法に関する。

[0017] さらに、本発明の一態様は、上記の方法により生産されたウィルスを用いたワクチンの製造方法に関する。

[0018] さらに、本発明の一態様は、 RPMI 1640培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地に関する。

[0019] さらに、本発明の一態様は、上記の培地にジメチルスルホキシドを 10重量％加えた細胞凍結保存用培地に関する。

[0020] さらに、本発明の一態様は、犬腎臓由来細胞である MDCK細胞力誘導した細胞株であって動物由来の成分なしでも培養可能である細胞株を、上記の細胞凍結保存用培地を用いて凍結保存する工程を含む凍結保存方法に関する。

[0021] 本発明の一態様によると、 MDCK細胞力誘導した細胞株は動物由来の成分なしで培養されるため、これを用いて生産したウィルスを、ワクチン及び検査試薬とした場合には、安全なワクチン及び検査試薬を提供することが可能である。

[0022] また、本発明の一態様によると、安価な市販の培地を用いてウィルスを増殖することができるため、これを用いて生産したウィルスをワクチンおよび検査試薬とした場合には、安価なワクチンおよび検査試薬を提供することが可能である。

[0023] さらに、本発明の一態様によると、培地は動物由来成分を含まないため、ウィルスを感染させた細胞をこの培地を用いて培養した場合に、安全なワクチン及び検査試薬を提供することが可能である。

[0024] さらに、本発明の一態様によると、動物由来成分を含まない培地を用いて細胞を凍結することが可能なため、安全なワクチンおよび検査試薬を提供することが可能である。

[0025] なお、本明細書において、「動物由来の成分を含まない」及び「動物由来の成分なし」とは、特に、動物由来の成分であってアレルギーの原因になり得るような蛋白成分を含まないことをいう。アレルギーの原因になり得る成分としては、例えば、動物由来の血清やその一部である血清アルブミン、細胞増殖因子等の動物性蛋白、及び動物に由来する各種添カ卩物（Bacto peptone, Tryptose phosphate broth等）が挙げられる。

図面の簡単な説明

[0026] [図 1]図 1は、 MDCK-SP株の細胞を示す写真である。

[図 2]図 2は、 RPMI/SP培地で培養した MDCK-SP細胞と、 7.5% MEMで培養した MDCK細胞との増殖曲線を示す図である。 [図 3]図 3は、 RPMI/SP培地とマイクロキャリアビーズを用いて浮遊細胞培養した MDCK-SP細胞を示す写真である。

[図 4]図 4は、 7.5% MEMで培養した MDCK細胞と、 RPMI/SP培地で培養した

MDCK-SP細胞における犬ジステンパーウィルス Snyder Hill株の増殖曲線を示す図である。

[図 5]図 5は、 7.5% MEMで培養した MDCK細胞と、 RPMI/SP培地で培養した

MDCK-SP細胞における犬アデノウイルス 1型 PR 109株と犬アデノウイルス 2型 Manhattan株の増殖曲線を示す図である。

[図 6]図 6は、 7.5% MEMで培養した MDCK細胞と、 RPMI/SP培地で培養した

MDCK-SP細胞における犬パラインフルエンザウイルス Tsukuba株の増殖曲線を示す図である。

[図 7]図 7は、 7.5% MEMで培養した MDCK細胞と、 RPMI/SP培地で培養した

MDCK-SP細胞における犬パルボウイルス 2型 2b抗原型 MD 97-037株の増殖曲線を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0027] まず、犬に用いることのできる、安全かつ有効なワクチンの開発をするため、よりウイルス感染スペクトルの広、犬腎臓細胞系である MDCK細胞を選択した。この MDCK 細胞は、動物由来の成分を含まない市販の基礎培地、例えば、 Eagle' s MEM, RPMI 1640 Medium, Leiovitz' s L- 15 Mediumでは牛血清を添カ卩しないと増殖しない。そのため、 MDCK細胞を、段階的に順化継代する。

[0028] MDCK細胞の順ィ匕は、まず、無血清であって細胞増殖因子を含む培地により行う。

細胞増殖因子としては、上皮細胞増殖因子が好ましぐ組み換え上皮細胞増殖因子であってもよい。この様な培地の具体例としては、以下の例には限定されないが、例えば、商品名「Opti— Pro SFM」（Invitrogen、 Catalogue No.12309-019)、 Eagle' s MEMの改変培地である商品名「Opti- MEM I Reduced-Serum Medium」（Invitrogen、 Catalogue No.31985)が挙げられる。 MDCK細胞の順化は、 MDCK細胞の増殖が安定するまで行われる。

[0029] 上記の順化が終了したら、次に、 RPMI 1640培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地（以下、 RPMI/SP培地とする。）を用いて、 MDCK細胞を順ィ匕させる。大豆由来ペプトンは、非動物性のペプトンであって、蛋白供給源である。培地中の大豆由来ペプトンとしての含有量は、 g/ml— 3000 μ g/mlが好ましぐ 500 μ g/ml— 1000 μ g/mlがより好ましぐ概して 750 μ g/ml程度が特に好ましい。

[0030] 培地中の蛋白含有量は、 20 g/ml以下であることが好ましぐさらに好ましくは 10 g/ml以下であり、特に好ましくは 5 g/ml以下である。

[0031] 大豆ペプトンを 750 μ g/mlになるように含有した場合の RPMI/SP培地の組成は、以下に例示されるが、これに限定されない。

[0032] (RPMI/SP培地の一例）

•RPMI 1640 Medium (GIBCO, Catalogue No.21870)

'大 ϋヘプトン (Peptone from soybean^ enzymatic digest ^ Fhma、 Catalogue No.87972) 15グラムを 1,000 ml滅菌蒸留水に溶解し、 220 nmフィルターで濾過後、 RPMI1640培地 100 ml当たり 5 mlを添加（最終濃度 750 μ g/ml)

• L-グルタミンを 300 mg/Uこなるよう〖こ添カ卩（最終濃度 300 μ g/ml)

'抗生物質として、ペニシリン Gカリウムを 100 U/ml、硫酸ストレプトマイシンを 100 g/ml、アンフォテリシン Bを 2.5 μ g/mlになるように添カ卩 (V、ずれも最終濃度）

MDCK細胞を、「Opti- Pro SFM」培地で 2代及び「Opti- MEM I Reduced-Serum Medium]培地で 33代継代培養した後、 RPMI/SP培地で 28代継代培養すると、 RPMI/SP培地に対して順ィ匕が進み、細胞の増殖が安定した。過去数代に渡って、細胞シートの形成に要する時間と継代間隔が一定になり、 5-7日間隔で 4倍に継代された。この新規な細胞株を「MDCK-SP株」と命名した。さらに、 RPMI/SP培地で 45代まで継代培養すると、 MDCK細胞は、無血清培地である RPMI/SP培地に完全に順ィ匕した。これにより、犬腎臓由来細胞である MDCK細胞力誘導した細胞株であって、動物由来成分なしで培養可能である細胞株が樹立された。 MDCK-SP株細胞（ RPMI/SP培地で 45代継代細胞、無血清培地では総計 80代継代細胞）は、 2004年 12 月 16日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (茨城県つくば巿東 1-1-1)に寄託された（受託番号 FERM P-20329)。その後、 2005年 2月 4日に受託番号 FERM BP-10225として、国際寄託に移管された。

[0033] MDCK-SP細胞株に、 MDCK細胞株に対して感受性のあるウィルスを感染させ、感染した細胞株を培養して増殖させることにより、ウィルスを生産することができる。ウイルスを培養する際の培地は、動物由来の成分を含まない培地が好ましぐ上記の RPMI/SP培地がより好まし!/、。

[0034] 感染した細胞株の培養に、公知の方法を用いることができる。公知の方法としては、例えば、単層培養法および浮遊培養法が挙げられる。

[0035] 単層培養法としては、例えば、容器内面に単層培養させた細胞に、目的とするウイルスを感染させ、静置培養あるいは回転培養することで培養上清中にウィルスを調製することができる。容器としては、例えば、平板培養容器や回転培養瓶が挙げられ、具体的には、例えば、シャーレ、 T-フラスコが挙げられる。容器の基質は、非ガラスが好ましぐプラスチックがより好ましい。

[0036] 浮遊培養法としては、例えば、マイクロキャリアビーズを用いたマイクロキャリア法が挙げられる。マイクロキャリア法としては、例えば、バイオリアクター (培養タンク）内で微小球形粒子 (マイクロキャリアビーズ)の表面に細胞を単層に増殖させ、次、で増殖したマイクロキャリアビーズ上の細胞にウィルスを感染させた後、攪拌しながら培養することでその培養液中に目的とするウィルスを調製することができる。マイクロキヤリァビーズの材質としては、例えば、セラミックス、デキストラン、ガラス、シリコン、プラスチックおよびポリアクリルアミド製等が挙げられる。市販のビーズとしては、例えば、 Amersham Bioscience社製の Cytodex (商標） 1が挙げられる。

[0037] MDCK-SP細胞に感受性のあるウィルスとしては、以下の例には限定されないが、ラブドウィルス科、ボックスウィルス科、ピコルナウィルス科、レオウィルス科、アデノウイルス科、力リシウィルス科、アデノウイルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、フラビウィルス科、ヘルぺスウィルス科、パルボウイルス科が挙げられる。なかでも、増殖が容易な好ましいウィルスとして、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ラブドウィルス科、フラビウィルス科、力リシウィルス科、アデノウイルス科、ヘルぺスウィルス科、及びパルボウイルス科に属するウィルスが挙げられる。好ましいウイルスとして、犬ジステンパーウィルス、麻疹ウィルス、犬パラインフルエンザウイルス、 SV5ウィルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウィルス、日本脳炎ウィルス、犬力リシウィルス、 1型および 2型犬アデノウイルス、人アデノウイルス、犬へルぺスウィルス、及び 1型と 2型犬パルボウイルスがさらに挙げられる。「順化」という、ウィルスを培養細胞に馴らす技法を用いれば、 MDCK-SP細胞の感受性スペクトルは広げることができる。

[0038] 本発明の方法により生産されたウィルスを回収、精製して、ワクチンや診断薬用の抗原物質として使用することができる。ウィルスの回収、精製には、公知の方法を用いることができ、例えば、細胞を凍結溶解することにより細胞を破壊し、融解液を遠心分離して細胞や細胞破壊物を取り除き、上澄液をウィルス液として回収してもよヽ。

[0039] ワクチンとする場合には、不活ィ匕ワクチンとしても、生ワクチンとしてもょ、。不活ィ匕ワクチンとする場合は、回収、精製したウィルスをホルマリンなどにより不活ィ匕し、不活化したウィルスにアジュバントを添加して製造してもよい。また、生ワクチンの場合は、弱毒化したウィルスを、生産した後、回収 '精製し、これにアジュバントを添加して製造してもよい。ワクチン中のウィルスの量は、ワクチンを接種する犬に対して、標的とするウィルスの感染を阻止できる程度の免疫を付与するに十分な量である。一般には、 1 X 10^{3 5}TCID /ml— 1 X 10⁵ °TCID /ml以上のウィルス量である。使用できるアジ

50 50

ュバントは、ワクチンを接種する犬に、全身性感染防御免疫や局所感染防御免疫を付与できるアジュバントが挙げられる。

[0040] 感染診断薬とする場合には、上記の様に不活ィ匕したウィルスを抗原とする力、もしくはウィルスから単離した抗原を ELISAプレートや-トロセルロース膜などの支持体に固定することにより感染診断薬を調整することができる。そのような感染診断薬は犬の血清中に存在する抗体と結合させた後、西洋ヮサビパーォキシダーゼやアルカリ性フォスファターゼなどを結合させた二次抗体との反応及びそれに続く呈色反応などの公知の反応を実施することにより視覚化することができ、各種ウィルスに感染した犬の血中抗体の有無、すなわち感染の有無を検出 ·確認することができる。

[0041] 細胞を低温保存する場合には、本発明による RPMI/SP培地にジメチルスルホキシド (Dimethyl sulfoxide : DMSO)をカ卩えた培地を用いることができる。 DMSOは、 RPMI/SP 培地中、 10— 20重量％が好ましぐより好ましくは概して 10重量 %程度である。従来は、細胞の低温保存、例えば、 -80°Cの電気フリーザーから- 196°Cの液体窒素、には、細胞凍結時の細胞に対する物理化学的な損傷を防ぐため、牛胎児血清及び DMSO を含む培地を用いていた。これに対して、本発明の細胞凍結保存用培地は、血清のみでなぐ動物由来の他の成分を一切含まないので、無血清培地に順化した細胞の低温保存に適している。特に、本発明による MDCK-SP細胞の細胞凍結用保存培地として好ましい。

[0042] 以下の実施例により、本願発明は、さらに詳細に説明されるが、これら実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において「％」は、特に断りのない限り、「重量％」の意味である。

[0043] (実施例 1 RPMI/SP培地を用いた MDCK-SP株の作出）

本実施例で用いた犬腎臓由来細胞である MDCK細胞は、 1958年 9月に、 Madin & Darbyによって健康正常な雌コッカースパニエルの腎臓力も作出された細胞系である。これは、 ATCC (American Type Culture Collection)に登録された細胞（ATCC No.CCL-34)に由来するものと考えられる。 1970年代に東京大学農学部獣医畜産学科家畜微生物学教室で本願発明者が研究用に使っており、その後、同細胞は鹿児島大学農学部獣医学科家畜微生物学講座、共立製薬株式会社臨床微生物研究所へと受け継がれてきた。最後者の臨床微生物研究所では 1995年 4月より、 Eagle's MEM基礎培地（日水製薬株式会社製、イーグル MEM培地「二ッスィ（1)」）に、牛胎児血清を 7.5 %、 Tryptose Phosphate Brothを 10%、および L-グルタミン（0.292g/L)を含み、細菌増殖抑止を目的にペニシリン（100 U/ml)、ストレプトマイシン（100 /z g/ml )、アンフォテリシン B (0.25— 0.5 μ g/ml)を添カロした培地（7.5% MEM)で継代培養してきた。これを親細胞とした。

[0044] まず順化の最初のステップとして、組換え上皮細胞増殖因子を含む無血清培地、商品名「Opti- Pro SFM」（Invitrogen、 Catalogue No.12309- 019)で 2代継代した後、 Eagle's MEMの改変培地である商品名「Opti- MEM I Reduced-Serum MediumJ ( Invitrogen, Catalogue No.31985)に培養液を交換した。さらにこの培地で、牛胎児血清を一切添加しな、で 33代継代培養した。基本的には親細胞と同じ継代条件で細胞を取り扱った。即ち、約 7日間隔で、元細胞を 4倍に拡大継代した。なお、親細胞も、またそれから誘導した無血清培地順ィ匕 MDCK細胞も、継代をする場合には、 0.25%トリプシン +0.02%EDTA (エチレンジァミン四酢酸）溶液にて細胞面を 2回洗浄後、 37°Cのインキュベーターに静置し、細胞を分散させた。用いたトリプシンは豚脾臓由来の DIFCO TRYPSIN 250 (日本べタトン 'ディッキンソン株式会社）で、滅菌 PBS に溶解後、 220 nmフィルター濾過滅菌した。

[0045] なお、細胞順ィ匕の過程でしばしばみられるように、時に細胞の増殖が遅延した。そこで、その間、 1一 2回、培地を新しいものと交換したり、継代倍数を 2— 3倍に減弱させたりして、細胞が途切れないようにした。

[0046] 結果として、明らかに「Optト Pro SFM」と「Optト MEM I Reduced-Serum MediumJ培地で合計 35代継代培養した効果は認められた。つまり、細胞の増殖が安定してきた。

[0047] 次に、「Opti- MEM I Reduced-Serum Medium]にほぼ川頁化した 33代目の細胞を Eagle's MEM, RPMI 1640 Medium, Leiovitz's L— 15 Medium,あるいは McCoys 5A Mediumを用いて培養を試みた。その結果、 McCoys 5A Medium (modified) (GIBCO Base Catalogue No.12330および 16600)では良好な増殖を示したものの、他の培地では、培養器壁面に付着するが増殖が途中で停止し、細胞シートを形成しな力つた

[0048] McCoys 5A Medium (modified) (GIBCO Base Catalogue No.12330および 16600)とその他の基礎培地の成分比較で明らかな相違点は、 McCoys 5A Medium (modified) (GIBCO Base Catalogue No.12330および 16600)には Bacto- peptoneが添カ卩されている力否かであった。なお、 Bacto-peptoneは牛の各種蛋白を酵素消化して得た「栄養源」であるため、本発明の意図に反することから、 McCoys 5A Mediumは比較例である。 McCoys 5A Mediumを用いた増殖が良好だったのは、 McCoys 5A Mediumにだけ添加されている牛蛋白由来酵素消化物である Bacto-peptoneの影響によるものと考えられる。そこで、同様の蛋白供給源である非動物性のペプトンを種々検討した結果、大豆由来ペプトンに到達した。

[0049] 上記の基礎培地、 Eagle's MEM, RPMI 1640 Medium,および Leiovitz's L- 15 Mediumの中では、 RPMI 1640 Mediumでの増殖が一番優れていた。そこで、 RPMI 1640 Mediumを採用し、これに大豆ペプトンを加えて、動物由来蛋白不含培地（ RPMI/SP培地とする。）とした。なお、表 1に RPMI/SP培地を示す力ここに示した培地と添加物は巿販品を用いた一例であって、本発明の RPMI/SP培地はこれに限定されない。

[表 1] 表 1 RPMI/SP培地の一具体例

1 ) RPM1 1640 Medium (GIBCO, Catalogue No.21870)

2 )大ぺプ Γ·ン (Peptone from soybean, enzymatic digest、 Fluka、 Catalogue No.87972) 15グラムを 1 ,000 ml滅菌蒸留水に溶解し、 220 nmフィルタ一で濾過後、 1 ) の培地 100 ml当たり 5 mlを添加（最終濃度 750 g/ml)

3 ) しグルタミンを 300 mg/Lになるように添加（最終濃度 300^ g/ml)

4 ) 抗生物質として、ペニシリン Gカリウムを 100 U/ml、硫酸ストレプトマイシンを 100 w g/ml、アンフォテリシン Bを 2.5w g/mlになるように添加（いずれも最終濃度）

[0050] 培養に用いた培養器はプラスチック製容器、例えば、 25cm² Tフラスコ、 6 cm直径プラスチックシャーレなどの非ガラス製の容器であり、これを用いて無血清培地による培養を開始した結果、本来の MDCK細胞の持つ壁面付着性が減弱した。ガラス壁面では付着はするものの細胞の伸展増殖はみられず、細胞塊を形成し細胞シートの形成には至らな力た。従って本発明の全ての過程でプラスチック製培養器を用いた。

[0051] 表 1の培地に、「Opti- Pro SFM」と「Opti- MEM I Reduced-Serum MediumJ培地で合計 35代継代培養した MDCK細胞を同様に順化継代した。 RPMI/SP培地で 28代継代した時点で、明らかに RPMI/SP培地に対して順ィ匕が進み、細胞の増殖が安定してきたことが確認された。即ち、過去数代に渡って、細胞シートの形成に要する時間と継代間隔が一定になり、 5— 7日間隔で 4倍に継代されるようになった。さらに継代を進め、 45代目で無血清培地である RPMI/SP培地に完全に順ィ匕した。 45代目の細胞株を、新たに誘導された細胞株であるとして、既に述べた通り国際寄託した（ MDCK- SP株）。

[0052] 図 1には MDCK-SP株細胞、 40代目の培養 3日目の細胞シートの写真を示す。無固定'無染色で、倒立顕微鏡下で撮影した。細胞はこの後もその数を増加させ、シートを密にしていった。

[0053] 図 2には RPMI/SP培地で 41代目の MDCK-SP細胞の増殖状態を示した。対照とした親細胞は 7.5% MEM培地で培養を開始した。共に 5.0 X 10⁵/mlの細胞濃度に調整した細胞浮遊液を 25cm² Tフラスコに 7.5ml入れ、閉鎖系で静置培養し、 24時間毎に細胞数を計測した。図 2に示したように 7日後には、 MDCK-SP細胞は約 4倍、親細胞は約 5.5倍に増加した。この結果力 MDCK-SP細胞は、親細胞である MDCK細胞と同様に増殖に優れて、ることが分かる。

[0054] その他の MDCK-SP細胞の性状は次の通りであった。

[0055] 44代目の MDCK- SP細胞を大豆ペプトン無添カ卩の RPMI 1640 Mediumで培養を試みた。初代は 4日後に細胞シートを形成した力継代すると、網の目状にしか増殖せず、細胞シートを形成しな力つたことより、誘導した MDCK-SP株細胞はその増殖に RPMI/SP培地中の大豆ペプトンを必要としていることが再確認された。

[0056] RPMI/SP培地の大豆ペプトンの量を 2倍および 4倍、即ち、 1.5 mg/ml及び 3

mg/mlに変更した場合の MDCK-SP細胞の増殖性への影響について、 47代目力の MDCK-SP細胞について調べた。その結果、大豆ペプトンの量を増加させても、 MDCK-SP細胞は同様に増殖した。

[0057] (実施例 2 マイクロキャリアビーズを用いた浮遊細胞培養）

MDCK-SP細胞を、巿販のマイクロキャリアビーズを用いて浮遊培養した。

[0058] 市販のマイクロキャリアビーズとして、 Amersham Bioscienceの Cytodex (商標） 1を用 V、た。これはデキストラン力もなる細胞培養専用の球体である。

[0059] マイクロキャリアビーズを 0.3 g計量し、 Ca⁺⁺と Mg⁺⁺を含まないリン酸緩衝食塩水で使用説明書通りに活性ィ匕した後、オートクレープで加熱滅菌し、 RPMI/SP培地に置換した。このマイクロキャリアビーズ浮遊液をスピナ一フラスコ（Wheaton Science

Products, NJ, USA)に移した後、総計 10⁷個の MDCK-SP細胞（継代 56代目）を 50 ml の RPMI/SP培地に浮遊してフラスコに入れ、 37°Cで吸着させた。約 3時間の間、時々 2分間くらい 40 rpmで回転させて、細胞と球体の混和'接触をさせた。その後、さらに 50 mlの RPMI/SP培地をカ卩え、計 100 mlを、 60 rpmでスピナ一を回転させながら培養を開始した。

[0060] 培養開始後、 3日間隔で培地を半量づっ交換して、つたところ、培養開始 20日後の時点で球体の一部に細胞が数個ほど吸着していることが観察され、培地の色も増殖を示唆するように黄変し始めた。その 4日後には付着細胞数が増加していることが確認された。図 3は培養 27日後の顕微鏡写真である。

[0061] 図 3によると、球体表面を細胞が覆っているのが判る。この付着細胞は、前述のトリプシン · EDTA溶液を用いて回収した後、新しいマイクロキャリアビーズと培地に継代可能であった。すなわち、 MDCK-SP細胞と RPMI/SP培地の組み合わせによると、マイク口キャリアビーズを用いた浮遊細胞培養が可能である。

[0062] マイクロキャリアビーズによる浮遊培養法は、単位容量当たりに産生される細胞数を増加させるために用いる技術である。この培養法により、 MDCK/SP細胞を用いて犬パルボウイルスを増殖してもよい。この培養法は、犬パルボウイルスのように、ウィルスの増殖程度が感染する宿主細胞の増殖能力に依存して、るウィルスの産生に極めて有用である。結果として、産生されるウィルス量ははるかに高まることが期待される。例えば、現在市販されている犬用ワクチンの 1バイアル（1 ml容量）に含まれる犬パルボウイルスの量は 10^{5 Q}— 10^{7 Q} TCID であることから、例えば後に記載の表 2に示し

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たシードウィルス液の感染価を得る培養法でも十分にその目的は達成できる。そして、このマイクロキャリアビーズによる浮遊培養法を応用することで、そのような細胞機能依存性ウィルスに特有の問題点を解決することができる。

[0063] (実施例 3 無血清シードウィルス液の作成）

実施例 3において、現在広ぐ世界中の飼い犬の予防接種に用いられているワクチンを構成している、犬ジステンパーウィルス、 1型と 2型の犬アデノウイルス、犬パラインフルェンザウィルス、犬パルボウイルス 2型の 5種類を用いた。これらのウィルス液のストックはこれまで牛胎児血清や Tryptose Phosphate Brothを添カ卩した、例えば Eagle's MEM培地などの細胞培養内で増殖させている。そのため、無血清培地による細胞培養内でウィルスを増殖させるためにはこれらの牛血清成分などの動物蛋白質を取り除く必要がある。そこで、本実施例において無血清シードウィルス液を作成した。表 2には上記のウィルス種のうち、実際に用いたウィルス株名と、それらを用いて作出したシードウィルス液のウィルス力価を示した。

[表 2] 表 2 シードウィルス液のウィルスと感染価

感染価 0"CID₅₀/0.1 ml) ウィルス株名細胞種 7.5% MEM培地 RPMI/SP培地犬ジステンパーウィルス Snyder-Hill MDCK

犬アデノウイルス 1型 PR109 MDCK

犬アデノウイルス 2型 Manhattan MDCK

犬パルボウイルス 2型 D97-037 MDCK

犬パラインフルエンザウイルス Tsukuba MDCK

[0064] 犬ジステンパーウィルス、 1型と 2型の犬アデノウイルス、及び犬パラインフルエンザウィルスについては、最初のウィルス液は、ウィルス接種後、親細胞の MDCK細胞を牛胎児血清が 2%に添加された培地でウィルス増殖を促している。そのため、その上清中には牛血清が 2%に、 Tryptose Phosphate Brothが 10%に o o o o o含 48657まれることから、それらの成分の影響をなくす処置を次の通り試みた。閉鎖系フラスコ内で培養され、細胞シートを形成して、る MDCK- SP細胞にウィルス液を接種し、 1時間のウィルス吸着後、ウィルス液を吸引除去し、さらに RPMI/SP培地で 2回細胞表面を洗浄した。その後、

RPMI/SP培地をカ卩え、 37°Cのインキュベーター内で静置培養し、ウィルスの増殖を図つた。ウィルスが十分に増殖した、数日力 7日後、一度、フラスコごと凍結融解し、融解液は低速遠心により細胞や細胞破砕物を取り除き、上清を第二代ウィルス液とした

。この操作を合計 2回繰り返した、 3代目の培養上清をストックウィルス液として- 80°C フリーザー内に分注保存した。

[0065] 犬パルボウイルス 2型につ!、ては、 MDCK-SP細胞力 SRPMI/SP培地に浮遊された時点でウィルス接種を行った。そのために、最初のウィルス液には牛胎児血清が 7.5%に含有されており、他のウィルス液よりも牛血清の影響が大きい。そこで MDCK-SP細胞を RPMI/SP培地に浮遊させた時点で、培養液の約 5%量のウィルス液をカ卩え、 37°Cのインキュベーター内で静置培養し、細胞が壁面に接着後の 24時間後に、培養液を吸引除去、細胞面を RPMI/SP培地で一度洗浄後、新しい RPMI/SP培地をカ卩ぇウィルスの増殖を図った。さらに 6日後、感染細胞そのものを、正常の MDCK-SP細胞のトリプシン消ィ匕継代操作と同じようにして継代した。この操作を合計 2回繰り返した 3代目を、一度、フラスコごと凍結融解し、融解液は低速遠心により細胞や細胞破砕物を取り除き、上清をシードウィルス液とした。

[0066] 作出した RPMI/SP培地で培養した MDCK-SP細胞におけるそれぞれのウィルス種の感染価を同じく表 2に示す。表 2によると、これらの感染価は、親細胞である MDCK 細胞で増殖させた場合と比べ同等であることが示された。

[0067] (実施例 4 犬ジステンパーウィルス犬由来培養細胞順化株）

1) 25 cm²Tフラスコに親細胞である MDCK細胞を 7.5% MEM培地で、 MDCK-SP細胞を RPMI/SP培地で培養開始し、シートを形成した培養 3日後に細胞数を計測した。

[0068] 2)表 2に示したストックウィルス液の中の、犬ジステンパーウィルス、 Snyder Hill株を、それぞれ同じ m.o丄（multiplicity of infection;感染の多重性、既知の数の培養細胞に加えた感染性ウィルス粒子数の比率)の 0.01になるようにウィルスを希釈接種した。

[0069] 3) 37°C、 1時間のウィルス吸着の後、未吸着ウィルスを吸引除去し、 7.5% MEMあるいは RPMI/SP培地をカロえ、静置培養した。

[0070] 4)その後 24時間間隔で接種後、 1, 2, 3, 4,及び 7日目にフラスコごと- 80°Cフリーザ一に凍結保存した。

[0071] 5)ウィルス感染価測定に先立ち、凍結しておいたフラスコを室温で融解し、 2,500 rpm、 10分間の遠心で細胞成分を除去した上清を感染価測定に用いた。

[0072] 6)感染価の測定は 96穴マイクロプレートを用いた Micro- titration法にて行った。即ち、 5)で得たウィルス液を 7.5% MEM培地で 10倍階段希釈し、各希釈につき 4穴に 100 μ 1づっ加え、さらに総ての穴に 100 1細胞浮遊液をカ卩え、軽く混合し、 37°Cの 5%炭酸ガスインキュベーター内で静置培養した。

[0073] 7)細胞浮遊液は、 7.5% MEM培地に 1 x 10⁵/mlになるように犬ジステンパーウィルスの細胞側レセプターである Canine SLAM (CD150)を発現させた Vero (SLAMVero)細胞 (¾eki et al., Efficient isolation of wild strains of canine distemper virus in Vero cells expressing canine SLAM (CD 150) and their adaptability to marmoset B95a cells. J. Virol, 77: 9943-9950, 2003.)を用いた。 [0074] 8)ウィルス接種 7日後にウィルス変性効果 (CPE)の有無によって感染価の終末点を算出した。

[0075] これらの結果を図 4に示す。図 4には 7.5% MEMで培養した親細胞 MDCK細胞と、発明した動物由来蛋白不含培地で培養した MDCK-SP細胞での犬ジステンパーウィルス Snyder Hill株の増殖曲線を示した。ウィルス接種後翌日より、親細胞 MDCK細胞と MDCK-SP細胞、いずれでも感染後 24時間でウィルス産生が開始され、以後増加して、つた。総てのタイムポイントで MDCK-SP細胞の方が 32倍一 100倍高、ウィルス感染価を示した。

[0076] (実施例 5 犬アデノウイルス 1型と 2型）

実施例 4同じ方法で実施したが、相違するのは、

1)用いたウィルス株力犬アデノウイルス 1型（CAV-1)は PR 109株、犬アデノウィルス 2型 (CAV-2)は Manhattan株であること、

2)感染価測定の Micro-titration法に用いた細胞が MDCK細胞であること、の 2点である。

[0077] これらの結果を図 5に示す。図 5によると、いずれの培養細胞においても、また両ウイルス株とも、ほとんど同じように増殖した。また、牛血清を添加したこれまでのウィルス培養法と、新しく発明した動物由来蛋白不含培地で培養の MDCK-SP細胞によるウイルス培養法に差は認められず、 Vヽずれも優れた感染価を示した。

[0078] (実施例 6 犬パラインフルエンザウイルス）

実施例 4と同じ方法で実施したが、相違するのは、

1)用いたウィルス株が Tsukuba株であること、

2)感染価測定の Micro-titration法に用いた細胞が MDCK細胞であること、

3)感染価測定の Micro-titration法で用いた、感染価終末点の確定には、各希釈穴の上清中に産生されている血球凝集素の有無で行った。即ち、各穴から 50 1の上清を取り出し、別に用意した血球凝集反応用マイクロプレートに移し、総ての穴に等量の pH 7.0のリン酸緩衝食塩水（PBS)と等量のァカゲザル血球浮遊液をカ卩えた。ァ力ゲザル血球浮遊液は同じ PBSに 0.75%の割合で赤血球を浮遊し調整した。よく攪拌後、室温に 2時間静置し、凝集の有無にて感染価を算出した。 [0079] 以上の 3点である。

[0080] 以上の結果を図 6に示す。図 6によると、牛血清を添カ卩したこれまでのウィルス培養法の方がウィルス増殖のピーク到達まで 24時間ほど速力つた力牛血清を添カ卩したこれまでのウィルス培養法と、新しく発明した動物由来蛋白不含培地で培養した MDCK-SP細胞によるウィルス培養法に、到達したウィルス力価に差は認められなかつた o

[0081] (実施例 7 犬ノルボウイルス 2型）

実施例 4と同じ方法で実施したが、相違するのは、

1)用いたウィルス株は 2b抗原型の MD97-037株であること、

2) m.o.i.が 0.05になるようにストックウィルス液を希釈し、実施例 3で説明したように、細胞が培地に浮遊された時点でウィルス接種を行ったこと、

3)感染価測定の Micro-titration法に用いた細胞が MDCK細胞であること、

4)実施例 6と同じように、感染価終末点の確定には、各希釈穴の上清中に産生されて、る血球凝集素の有無で行ったこと、

5)その際に用いた PBSの pHは 6.8で、 4°Cで反応させたこと、

以上の 5点である。

[0082] 図 7にその結果を示す。実施例 4一 7の場合のウィルス種と異なり、牛血清を添カロしたこれまでのウィルス培養法の方が、動物由来蛋白不含培地で培養した

MDCK-SP細胞によるウィルス培養法に比して、高いウィルス産生が認められた。しかしながら、図 7によると、動物由来蛋白不含培地で培養した MDCK-SP細胞によるウイルス培養法でも、実用上十分なウィルス感染価が示されて、る。

[0083] パルボウイルスは一般に、宿主細胞が盛んに分裂増殖する場合、ウィルスの産生量も増えることが知られて、る。これはウィルス DNAの複製に必要な核酸合成酵素をパルボウイルス自らは持たず、感染した宿主細胞の DNA合成酵素を借用しているためである。パルボウイルスでは、宿主細胞が盛んに分裂増殖する場合はその DNA合成酵素の量も多くなり、複製が促進される。実施例 3で行ったようなウィルス感染細胞をトリプシンにより消化分散させて新しい培地に継代する方法では、継代する度にゥィルス感染細胞の割合が増え、細胞継代により、宿主細胞も分裂し、よりウィルス複製に好適な環境に変化するため、一定量の培地内により多量にウィルスが産生されると考えられる。一方、本実施例のように、最初にウィルスが細胞に接触感染するだけで、培養器内での細胞増殖に一定の制限がある（即ち、細胞が付着して増殖できる面積が決まって、る）場合には、宿主細胞の増殖速度や密度にウィルス産生が直接的に規定されてしまうと考えられる。細胞増殖能 (感染価)を高くするのであれば、細胞密度、感染ウィルス量、あるいはウィルス感染細胞の継代などにより、ウィルス増殖法を改変すればよい。

[0084] (実施例 8 無血清培地で培養した細胞の簡便な凍結保存法）

RPMI/SP培地に、 DMSO (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Catalogue No.043-07216)を 10%に含む細胞凍結用培地を調整した。この培地に、 RPMI/SP培地で 44代継代した MDCK-SP細胞を 10⁶/ml以上になるように浮遊し、凍結保存用バイアルに 1.8 mlずつ分注した。正確な細胞数は 6.5 X 10⁶/バイアルであった。本バイァルを冷蔵しておいた簡易細胞凍結器「BICELL (商標）」（Nihon Freezer Co., Ltd.)に入れ、 -80°Cフリーザーで一晩かけて凍結した。その後、液体窒素 (液相）に移管した

[0085] 凍結保存状況の確認のために、 48時間後、定法通り、液体窒素より取り出し、 40°C 程度の温湯中で一気に溶解、 RPMI/SP培地 10mlに希釈浮遊させ、低速遠心で細胞を回収した。細胞ペレットを 7.5 mlの RPMI/SP培地に再浮遊し、 25 cm²の Tフラスコに入れ、 37°Cで培養を開始した。

[0086] 培養 3日目には細胞シートを形成したので、 5日目に 4倍量の新、培地に継代した。継代培養した細胞はやはり 3日目に細胞シートを形成し、少なくても顕微鏡下で観察した分には本凍結法による悪影響は認められな力つた。以後、非凍結の細胞と同じように継代が可能であった。このことから、本発明の MDCK-SP細胞の凍結に 10% DMSO添加 RPMI/SP培地を用いることが有効であることが確認された。

[0087] 前述したところが、本発明の好ま、実施態様であって、多くの変更及び修正を本発明の精神とにそむくことなく実行できることは当業者によって了解される。

Claims

請求の範囲

[1] 犬腎臓由来細胞である MDCK細胞力誘導した細胞株であって、動物由来の成分なしで培養可能である細胞株。

[2] 前記細胞株は、受託番号 FERM BP-10225で寄託された細胞株又はこの細胞株と同等の生物学的性質を有する細胞株である請求項 1の細胞株。

[3] MDCK細胞を、血清を含有せず細胞増殖因子を含む培地に順化させる工程と、

RPMI 1640培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地を用いて培養し、動物由来の成分なしで培養可能である細胞株を作出する工程とを含む細胞株の作出方法。

[4] 請求項 1又は 2の細胞株にウィルスを感染させる工程と、感染した細胞株を培養してウィルスを増殖させる工程とを含むウィルスの生産方法。

[5] 前記感染した細胞株を培養する際の培地は、 RPMI 1640培地及び大豆由来ぺプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地である請求項 4のウイルスの生産方法。

[6] 前記感染した細胞株を培養する際に浮遊培養法を用いる請求項 4又は 5のウィルスの生産方法。

[7] 前記ウィルスは、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ラブドウィルス科、フラビウィルス科、力リシウィルス科、アデノウイルス科、ヘルぺスウィルス科及びパルボウィルス科からなる群力選ばれる請求項 4一 6のいずれかのウィルスの生産方法。

[8] 前記ウィルスは、犬ジステンパーウィルス、麻疹ウィルス、犬パラインフルエンザウイルス、 SV5ウィルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウィルス、日本脳炎ウィルス、犬力リシウィルス、 1型および 2型犬アデノウイルス、人アデノウイルス、犬へルぺスウイルス及び 1型と 2型犬パルボウイルスカなる群力選ばれる請求項 4一 6のいずれかのウィルスの生産方法。

[9] 請求項 4一 8のいずれかの方法により生産されたウィルスを用いることを特徴とする診断用抗原の製造方法。

[10] 請求項 4一 8のいずれかの方法により生産されたウィルスを用いることを特徴とするヮクチンの製造方法。

[11] RPMI 1640培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地。

[12] 請求項 11の培地にさらにジメチルスルホキシドを 10重量％含む細胞凍結保存用培地。

[13] 犬腎臓由来細胞である MDCK細胞力誘導した細胞株であって動物由来の成分なしで培養可能である細胞株を、請求項 12の細胞凍結保存用培地を用いて凍結保存する工程を含む細胞の凍結保存方法。