CN108602860B - 通过去脂作用灭活病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有包膜病毒的疫苗，所述病毒的包膜中已经使用甲基‑β‑环糊精(MBCD)将脂质消耗。以两步方法去脂包膜病毒消除了这些病毒的感染性，这使去脂病毒安全地用在疫苗中。与其他方法相反，使用MBCD消耗脂质如胆固醇导致病毒含有低于20％的未处理病毒胆固醇，但这种去脂病毒保留了至少85％的未处理病毒蛋白质含量。MBCD去脂也保留了病毒蛋白的免疫原性。本发明在两步方法中使用MBCD处理来去脂包膜病毒代表了用于产生掺入有效疫苗中的灭活病毒的新替代选择。

Description

通过去脂作用灭活病毒
本发明涉及含有包膜病毒颗粒的疫苗，其包膜已用甲基β-环糊精(MBCD)去脂。
病毒是一种本身没有代谢活性的移动的遗传元件。相反地，病毒必须感染宿主细胞并使用该宿主细胞的能量和过程以便繁殖。一些病毒是“裸露的”，这意味着单个病毒颗粒或病毒粒子仅由病毒基因组周围的衣壳组成，并且可能还有一些病毒编码的非结构蛋白。在其他病毒中，衣壳包含在膜或包膜内。由于病毒基因组通常太小而不能编码参与脂质合成的蛋白质，所以这种包膜病毒必须从宿主细胞脂质构建它们的包膜。病毒包膜的脂质含量因此取决于宿主细胞的脂质特征而变化。
病毒很适合其宿主生物体，并且经常是致病的，导致宿主疾病甚至死亡。病毒可以通过感染人类和/或其伴侣动物或通过影响作为食物来源的植物和动物而产生巨大的经济影响。疫苗是保护宿主动物免受病毒感染的优选方法。疫苗对病毒产生保护性免疫应答，包括产生抗体和细胞免疫。通常需要两种类型的反应来减少宿主细胞的新感染并从宿主中清除病毒颗粒和感染的细胞。
近40年前，Moore等人(J.Virol.27(2)：320-329,1978)显示使用从病毒包膜中消除胆固醇的不含胆固醇的囊泡会降低病毒颗粒感染其靶细胞的能力。相反地，其他研究人员报道了病毒感染性需要胆固醇存在于靶细胞膜中，而不是在病毒包膜中。还有其他人认为去除胆固醇的过程而不是在包膜中缺乏胆固醇是感染性下降的原因。无论胆固醇在病毒功能中的作用如何，完全和永久的感染性丧失在消耗胆固醇的病毒中都没有得到证实，也没有证明消耗胆固醇的病毒可用于安全有效的疫苗。
已经报道了消耗胆固醇的化学手段，诸如，例如使用环糊精，正丁醇，二异丙醚(DIPE)，氟醚如七氟醚(sevoflurane)，表面活性剂如TRITON X-100TM(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚或聚氧乙烯辛基苯基醚)或TWEEN 20TM(PEG(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)，二乙醚及其组合。一些化学手段已被证明过于苛刻，导致病毒蛋白从病毒粒子中丧失，或导致结构变化为其余蛋白质。为了使消耗胆固醇的病毒粒子用于疫苗，特别是刺激针对病毒包膜蛋白的中和抗体产生的疫苗，蛋白质的存在和天然构象将是必需的。
在一些情况下，胆固醇的去除已被显示是可逆的。添加外源胆固醇可以重建病毒包膜并恢复感染力。这可能会引起关于在疫苗中使用消耗胆固醇的病毒的安全性担忧，因为存在于血液或其他体液或甚至宿主细胞膜中的胆固醇和其他脂质，与消耗胆固醇的病毒粒子接触可能潜在地重建病毒粒子并恢复感染力。
含有减毒病毒的疫苗通常在产生保护性免疫方面被认为是最有效的。然而，存在着减毒病毒可能会突变或重组，从而回复到致命状态的安全担忧。灭活的(即杀死的)病毒通常被认为在疫苗中应用更安全，但灭活手段经常改变或破坏抗原表位，因此作为保护性免疫的刺激物的有效性降低或丧失。
由于缺乏有效的疫苗，包膜病毒继续对人类和非人类动物构成健康风险，由包膜病毒引起的疾病具有巨大的经济影响。需要既安全又有效的改进的疫苗。例如，保留病毒抗原免疫原性、维持病毒粒子完整、并且赋予很少或没有安全风险的灭活包膜病毒的改进方法将有益于减轻由包膜病毒引起的疾病。本申请公开了这种改进的病毒灭活方法，包括用MBCD去除病毒包膜的脂质。
因此，本发明提供了一种制备灭活的包膜病毒的方法，包括将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段。第一混合物中MBCD的浓度为至少5mM至约100mM。此外，第一混合物中MBCD的浓度为约20mM至约40mM。再此外，第一混合物中MBCD的浓度为约20mM、约30mM或约40mM。
本发明提供了制备灭活的包膜病毒的方法，包括将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段；其中第二混合物中MBCD的浓度为至少10mM至约100mM。此外，第二混合物中MBCD的浓度为约30mM至约50mM。再此外，第一混合物中MBCD的浓度为约30mM、约40mM或约50mM。
本发明提供了制备灭活的包膜病毒的方法，包括将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段；其中第一时间段为约15分钟至约24小时。此外，第一时间段为约4小时至约24小时。再此外，第一时间段约为4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24小时。
本发明提供了制备灭活的包膜病毒的方法，包括将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段；其中第二时间段为约4小时至约48小时。此外，第二时间段为约24小时至约48小时。再此外，第二时间段约为24、30、36、40、44或48小时。
本发明提供了制备灭活的包膜病毒的方法，包括将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段；其中在第一时间段期间第一混合物的温度是室温，或者约20℃至约25℃。此外，在第一时间段期间第一混合物的温度为约22℃至约24℃。
本发明提供了制备灭活的包膜病毒的方法，包括将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段；其中在第二时间段期间第二混合物的温度是室温，或者约20℃至约25℃。此外，在第二时间段期间第二混合物的温度为约22℃至约24℃。
本发明提供了制备灭活的包膜病毒的方法，包括将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段；其中在获得第二混合物的步骤之前从第一混合物中分离包膜病毒。备选地且不作限制，第二MBCD溶液可以直接与第一混合物混合。直接混合可以在与第一混合相同的灭活容器中进行，或者可以在与第二MBCD溶液混合之前将第一混合物移至新的灭活容器。
本发明提供了制备灭活的包膜病毒的方法，包括将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段；其中第一时间段还包括第一混合物的混合。搅拌可以是约30rpm至约100rpm。优选地，搅拌可以是约40rpm至约60rpm。最优选地，搅拌可以是约50rpm。
本发明提供了制备灭活的包膜病毒的方法，包括将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段；其中第二时间段还包括第二混合物的混合。搅拌可以是约30rpm至约100rpm。优选地，搅拌可以是约50rpm。
本发明提供了制备灭活的包膜病毒的方法，包括将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段；其中包膜病毒是猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病毒。包膜病毒也可以是猪流行性腹泻病毒(PEDV)。
本发明提供了去脂包膜病毒，该去脂包膜病毒是通过将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段的方法获得的。优选地，第一混合物中MBCD的浓度为至少5mM至约100mM，或约20mM至约40mM。优选地，第二混合物中MBCD的浓度为至少10mM至约100mM，或约30mM至约50mM，或约30mM，约40mM或约50mM。优选地，第一时间段为约15分钟至约24小时，或约4小时至约24小时，或约4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24小时。优选地，第二时间段为约4小时至约48小时，或约24小时至约48小时，或约24、30、36、40、44或48小时。优选地，在第一时间段期间第一混合物的温度是室温，或者约20℃至约25℃，或者甚至约22℃至约24℃。优选地，在第二时间段期间第二混合物的温度是室温，或者约20℃至约25℃，或者甚至约22℃至约24℃。优选地，在获得第二混合物的步骤之前将包膜病毒从第一混合物中分离。备选地且不作限制，第二MBCD溶液可以直接与第一混合物混合。直接混合可以在与第一混合相同的灭活容器中进行，或者可以在与第二MBCD溶液混合之前将第一混合物移至新的灭活容器。优选地，第一时间段还包括第一混合物的混合，其中搅拌可以是约30rpm至约100rpm，约40rpm至约60rpm或约50rpm。优选地，第二时间段还包括第二混合物的混合，其中搅拌可以是约30rpm至约100rpm，约40rpm至约60rpm或约50rpm。优选地，包膜病毒是猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病毒或猪流行性腹泻病毒(PEDV)。
本发明提供了包含去脂包膜病毒的疫苗，其是通过将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段的方法获得的。优选地，第一混合物中MBCD的浓度为至少5mM至约100mM，或约20mM至约40mM。优选地，第二混合物中MBCD的浓度为至少10mM至约100mM，或约30mM至约50mM，或约30mM，约40mM或约50mM。优选地，第一时间段为约15分钟至约24小时，或约4小时至约24小时，或约4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24小时。优选地，第二时间段为约4小时至约48小时，或约24小时至约48小时，或约24、30、36、40、44或48小时。优选地，在第一时间段期间第一混合物的温度是室温，或者约20℃至约25℃，或者甚至约22℃至约24℃。优选地，在第二时间段期间第二混合物的温度是室温，或者约20℃至约25℃，或者甚至约22℃至约24℃。优选地，在获得第二混合物的步骤之前将包膜病毒从第一混合物中分离。备选地且不作限制，第二MBCD溶液可以直接与第一混合物混合。直接混合可以在与第一混合相同的灭活容器中进行，或者可以在与第二MBCD溶液混合之前将第一混合物移至新的灭活容器。优选地，第一时间段还包括第一混合物的混合，其中搅拌可以是约30rpm至约100rpm，约40rpm至约60rpm或约50rpm。优选地，第二时间段还包括第二混合物的混合，其中搅拌可以是约30rpm至约100rpm，或约50rpm。优选地，包膜病毒是猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病毒或猪流行性腹泻病毒(PEDV)。
本发明提供了包含去脂包膜病毒的疫苗，其是通过将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段的方法获得的；其中疫苗还包含佐剂、稳定剂、防腐剂和共混稀释剂中的至少一种。优选地，佐剂是含水聚合物佐剂，其中聚合物是丙烯酸酯或聚丙烯酸酯。优选地，稳定剂包含糖、碳水化合物、蛋白质和明胶中的至少一种。优选地，防腐剂是延迟、抑制或防止微生物的生长、代谢活性或增殖的抗生素或生物抑制化合物(biostatic compound)。优选地，共混稀释剂是水、磷酸盐缓冲盐水、细胞培养基或包含生理盐度和pH的其它溶液。
本发明提供了去脂包膜病毒的用途，该去脂包膜病毒是通过将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段的方法获得的；其中所述用途包括治疗由包膜病毒引起的疾病或症状。
本发明提供去脂包膜病毒在制备用于治疗由包膜病毒引起的疾病或症状的药物中的用途；其中去脂包膜病毒是通过将包含包膜病毒的溶液与第一MBCD溶液混合以获得第一混合物；将第一混合物温育第一时间段；将来自第一混合物的包膜病毒与第二MBCD溶液混合以获得第二混合物；和将所述第二混合物温育第二时间段的方法获得的。
如本文所用，“包膜病毒”是具有包围核蛋白核心的脂质双层膜或包膜的任何病毒。病毒的包膜通常衍生自宿主细胞膜并含有磷脂、糖脂、鞘脂和甾醇如胆固醇。包膜病毒包括具有由DNA或RNA编码的基因组的病毒。包膜病毒的种类包括但不限于：疱疹病毒、痘病毒、虹彩病毒、嗜肝DNA病毒、逆转录病毒、正粘病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、副粘病毒、单加重病毒、弹状病毒、丝状病毒、冠状病毒、动脉病毒、黄病毒和披散病毒。正在发现新的包膜病毒，并且随着更好地表征每种病毒，正在对包膜病毒进行分类和重新分类。包膜病毒的更完整的描述可以在诸如Fields Virology(D.M.Knipe和P.M.Howley编辑，LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia，PA，USA，2013)(现在是第六版)的文本中找到。
如本文所用，术语“病毒”可以意指病毒的种类，或可互换地指含有核酸、蛋白质和包膜的各种感染单位。“病毒颗粒”是单个感染单位，并且这个术语与术语“病毒粒子”是同义的。
“去脂作用”是从病毒包膜中去除或消耗脂质的过程。去脂作用是通过MBCD从病毒颗粒中除去胆固醇的量来测定的。然而，MBCD也可以提取、去除或消耗其他脂质，如磷脂。MBCD也已显示出与一些蛋白质相互作用，尽管本文描述的方法由于MBCD介导的去脂作用而使来自病毒蛋白质的蛋白质损失最小化。
“感染性”是病毒在宿主细胞内建立感染的能力，宿主细胞是来自能够支持病毒复制的人类或非人类动物的任何细胞。感染性可以通过例如由一定数量的病毒颗粒感染的宿主细胞的数量或百分数或者感染宿主细胞所必需的病毒颗粒的数量或百分比来测量。病毒颗粒可以在操作上计数，例如通过确定一定体积的病毒颗粒内噬菌斑形成单位(PFU)的数量。还可以物理地测量病毒颗粒，例如通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)检测的特定病毒蛋白的存在或通过例如实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测的溶液中存在的病毒基因组的拷贝数目的度量。
“抗原”是能够被生物体的免疫系统特异性检测的任何分子。通常，病毒抗原是由病毒基因组编码的病毒蛋白。病毒抗原的存在可以被T淋巴细胞和B淋巴细胞特异性地检测。“免疫原性”是指抗原引起免疫应答的能力。对于疫苗，病毒抗原的免疫原性将优先在动物体内产生保护性免疫，这将减少、减轻或改善病毒感染。
与抗原相反，“佐剂”是免疫应答的非特异性刺激物。佐剂可以通过结合并激活模式识别受体(PRR)来刺激先天免疫应答。PRR的这种刺激物可以是例如病毒或细菌核酸、来自细菌或寄生虫的脂质、或细菌蛋白质或毒素、或这些分子的任何人工构建的模拟物。佐剂还包括但不限于：聚集抗原以促进B淋巴细胞识别或被吞噬细胞摄取的无机化合物，如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙(calcium phosphate hydroxide)或硫酸铵；油；和洗涤剂。佐剂还可以是免疫信号传导的宿主介质，例如但不限于细胞因子、淋巴因子、趋化因子、干扰素、过敏毒素、生长因子、分化因子和粘附分子。
如本文所用，术语“治疗着”、“以治疗”或“治疗”包括抑制、减缓、停止、减轻、改善或逆转现有症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。治疗可以预防性或治疗性地应用。
如本文所用，“施用于动物”包括皮肤、皮下、肌内、粘膜、粘膜下、透皮、口服或鼻内施用。施用可以包括注射或局部施用。
以下实验例阐述了去脂过程。应该理解的是，其他实施方案和用途对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且本发明不限于这些具体说明性示例或优选的实施方案。包膜病毒在其包膜中含有不同水平的胆固醇，取决于(例如但不限于)包膜病毒的类型和种类以及在其中复制包膜病毒的宿主细胞。如本领域技术人员将认识到的，本文描述的去脂过程可能需要针对每种特定病毒原种进行优化。微生物膜可以含有胆固醇、藿烷类(hopanoids)或其他甾醇和类固醇分子，因此病毒以外的病原体也可以通过本文公开的方法灭活。
实施例1
使用以下程序对人流感病毒H1N1A/WSN/33株去脂。在下面的实施例中，流感病毒(IFV)的去脂作用损害感染性。由于本发明的去脂方法保留了病毒包膜蛋白，因此预期用去脂化的IFV接种的动物产生免疫原性应答，以保护它们免于致病剂量的致病性强的病毒的感染。
试剂：
人流感病毒H1N1A/WSN/33株及其宿主细胞系MDCK可从Wuxi AppTec(中国上海)购得。其他试剂包括MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)；EMEM(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)；ULTRAMDCK TM无血清培养基(Lonza，Inc.，Allendale，NJ)；胎牛血清(FBS；Invitrogen)；0.25％胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸；Invitrogen)；甲基-β-环糊精(MBCD，Sigma-Aldrich)；AMPLEX Red胆固醇测定试剂盒(Invitrogen)；PIERCETMBCA蛋白测定试剂盒(Rockford，IL)；和MTT(Sigma-Aldrich)。
H1N1A/WSN/33流感病毒在MDCK细胞系中的繁殖：
根据以下程序用IFV接种细胞。从在T-75烧瓶中生长的MDCK细胞中除去培养基，在室温下用5mL PBS漂洗MDCK细胞单层，并在37℃用1.5mL胰蛋白酶/EDTA使细胞不贴壁。将细胞重悬于10mL含有10％FBS的MEM中，并通过在4℃以800rpm离心5分钟使其沉淀。将细胞重悬于含有10％FBS的MEM中，并将细胞密度调整至2.5×105个细胞/mL。将15mL MDCK细胞悬浮液接种到每个T-75烧瓶中，并将烧瓶置于37℃和5％CO2中并温育过夜。
当MDCK细胞超过90％汇合时，从T75烧瓶除去MEM，加入5mL含有1％FBS和1μg/mL胰蛋白酶的EMEM维持培养基，并用流感病毒以感染复数(MOI)为0.01感染细胞。在37℃用5％CO2将烧瓶温育60-90分钟，并且每15分钟轻轻摇动。将10mL含有1％FBS和1μg/mL胰蛋白酶的EMEM维持培养基加入到每个烧瓶中，并将烧瓶在37℃和5％CO2下温育48小时。当达到病毒致约80％的细胞病变效应(CPE)时(通常约48小时后)，收获培养物上清液以获得IFV。
H1N1A/WSN/33IFV的纯化和滴定：
IFV根据以下程序纯化。将收集的培养上清液以3000rpm离心20分钟以除去细胞碎片，并收集上清液。将上清液以38000rpm离心60分钟以沉淀IFV。将IFV沉淀再悬浮于合适体积的生理缓冲盐水(PBS)中以得到>1.0x109噬菌斑形成单位/mL(PFU/mL)的最终滴度。将100μL这种浓缩的IFV贮液的等分试样储存在-80℃。
使用以下程序对IFV进行体外感染性滴定。使用上述细胞培养和转移程序，将MDCK细胞悬浮于含有10％FBS的MEM中，最终密度为2.5×105个细胞/mL。向6孔板的每个孔中加入2mL MDCK细胞悬浮液，并将板在37℃用5％CO2温育过夜。将病毒贮液在37℃水浴中融化，然后在4℃下以500×g离心10分钟。制备贮液的1/10稀释系列并储存在4℃直至使用，使用ULTRAMDCK TM无血清培养基和2.5μg/mL胰蛋白酶作为稀释缓冲液。
当细胞至少90％汇合时，除去培养基，并向每个孔中加入0.5mL稀释缓冲液和0.5mL病毒稀释液。对于阴性对照，使用1.0mL稀释缓冲液。每次添加稀释液后立即轻轻摇动板。将板在37℃，5％CO2下温育60-90分钟，并且每15分钟摇动一次。然后将每个6孔板的每个孔用3mL 2.5％低熔点琼脂糖的PBS溶液和稀释缓冲液的1：4混合物在37℃下覆盖。将板在室温温育15分钟以使覆盖混合物固化；然后将板在37℃用5％CO2温育3天。
使用以下程序可见噬菌斑。在噬菌斑充分显现(感染后3天)后，加入1mL 4％多聚甲醛，并将板在室温温育1小时。丢弃溶解的琼脂糖，并向每个孔中加入0.1mL 0.5％结晶紫。温育15分钟后计数噬菌斑的数量，并基于稀释系数转化为滴度。
去脂作用：
纯化IFV的去脂过程以两个平行反应进行：溶剂处理包括使IFV与MBCD接触并进行模拟处理，其中IFV以相同的方式处理但不暴露于MBCD。在模拟处理和溶剂处理中都使用相同的IFV滴度。模拟处理中的IFV可以滴定以提供对溶剂处理后剩余的去脂IFV的量的间接测量。
根据以下程序进行溶剂处理和模拟处理。将上面制备的IFV贮液(>1.0×109PFU/mL)的等分试样(100μL)稀释到Eppendorf管中的900μL PBS中以获得1.0-5.0x108PFU/mL的最终滴度。对溶剂处理，加入PBS中的MBCD至最终浓度为50mM，或者对模拟处理加入等体积的PBS。然后盖上Eppendorf管并用石蜡膜密封。所有样品均置于预热至37℃的SHZ-82恒温轨道式空气浴振荡器(中国Changzhou Guohua Appliance Co.)中。溶剂处理和模拟处理的样品在37℃以220rpm的轨道旋转速度旋转30分钟或45分钟。将样品在微型离心机中离心1分钟，并将含有IFV的上清液转移到超速离心管中。将管以200000xg(OPTIMATM L-100XP；Beckman Coulter，Inc.，Indianapolis IN)离心30分钟以沉淀IFV，并弃去上清液。将IFV沉淀重新悬浮于添加到上述每个Eppendorf管中的原始体积的1/10，并储存在-80℃直至进一步分析。
去脂IFV的表征：
根据制造商的说明书，使用BCA测定法(PIERCE TM BCA蛋白质测定试剂盒)测定去脂处理和模拟处理的IFV的蛋白质含量。使用根据制造商的说明书进行的胆固醇测定法(
Figure BDA0001743706760000111
Red胆固醇测定试剂盒，Life Technologies，Grand Island，NY)测定胆固醇含量。使用与上述相同的滴定程序测量体外感染性。
血细胞凝集(HA)活性如下测定。用PBS洗涤新鲜分离的鸡血三次，并将红血细胞(RBC)以1％的浓度重悬于PBS中。在PBS中制备病毒稀释液(50μL)并与50μL的RBC悬浮液混合。将混合物加入到96孔板中的各个孔中，并使RBC沉降45分钟。如果存在RBC的点或沉淀，则判断孔是HA阴性的(即，没有RBC的凝集)，并且如果存在平滑的RBC悬浮液则判断孔为阳性。
根据上述程序制备两批去脂处理和模拟处理的IFV样品。用于测试的IFV贮液具有2.2x 1010PFU/mL滴度。在第一批(“制备物A”)中，去脂时间为30分钟；在第二批(“制备物B”)中，去脂时间为45分钟。超速离心后，表征去脂和模拟处理的样品。
体外感染性显示去脂样品的PFU约为相应模拟样品的PFU的约1/7000。感染性结果如下表1所示。尽管滴度不同，但各种样品的蛋白质含量在彼此的10％以内。来自制备物A的去脂IFV的蛋白质含量是模拟样品的97％并且来自制备物B的去脂IFV的蛋白质含量是模拟样品的93％(参见表1)。还观察到，在处理后，大约20％的起始材料被回收，如通过蛋白质含量所测定的。基于蛋白质含量的回收百分比与起始材料(2.2x109PFU/mL)和模拟处理样品(4.0x108PFU/mL，其为起始滴度的18％)的测量滴度相当。去脂处理后，与模拟处理相比，少于2％的胆固醇保留(参见表1)。
表1
Figure BDA0001743706760000121
注：a与模拟处理相比，感染性的分数；
b与模拟处理相比的百分比。
模拟处理表明物理处理(摇动和离心)导致滴度和蛋白质损失。通过MBCD的去脂从IFV中优先去除胆固醇，而不是去除蛋白质。此外，用MBCD处理的IFV具有较小的体外感染性，但是感染性并未完全消除。
用二异丙醚和MBCD的IFV去脂的比较：
除了MBCD之外，使用另一种脂质溶剂二异丙醚(DIPE)来去脂IFV。用不同浓度的DIPE或用50mM MBCD处理相同起始材料的IFV样品。用2％、4％、8％或12％DIPE或50mM MBCD将相同量的IFV的等分试样在37℃下处理30分钟。在2000×g短暂离心3分钟后，除去可见溶剂，并将含水物质在通风橱中干燥20分钟。然后将样品在200000×g离心30分钟以回收病毒颗粒。表2中显示了该IFV的体外感染性、HA活性、蛋白质含量和胆固醇含量。
在相同条件下，浓度高达12％的DIPE处理在去除胆固醇方面不如50mM MBCD有效。尽管12％DIPE从IFV中去除约80％的胆固醇，但50mM MBCD去除超过98％。如通过比较PFU/mL所测定的，与模拟处理相比，这两种处理的IFV感染性分别降低32倍和2250倍。两种溶剂对胆固醇的去除都是相对特异的，因为在各种处理中蛋白质含量降低小于20％。在量化血细胞凝集(HA)活性的能力中，50mM MBCD以与2％-8％DIPE相同的程度影响HA活性。
表2
处理 PFU/mL HA单位 蛋白质(mg/mL) 胆固醇(μg/mL)
模拟 9.0x 108 64 0.39 8.26
2％DIPE 1.2x 108 32 0.39(100％)a 6.61(80.0％)a
4％DIPE 1.4x 108 32 0.32(82％)a 4.88(59.1％)a
8％DIPE 9.0x 107 32 0.36(92％)a 3.47(42.0％)a
12％DIPE 2.8x 107 16 0.33(85％)a 1.81(21.9％)a
50mM MBCD 4.0x 105 32 0.33(85％)a 0.14(1.7％)a
注：a与模拟处理相比的百分比
用溶剂处理45分钟：
除了MBCD处理时间从30分钟延长到45分钟之外，重复上述处理。结果如下表3所示。
表3
Figure BDA0001743706760000131
注：a在37℃下颠倒旋转30分钟。
b在37℃下颠倒旋转45分钟。
c与模拟处理相比的百分比。
与30分钟的处理一样，用50mM MBCD处理45分钟为IFV去除约97％的胆固醇，并且使该病毒体外感染性与模拟处理相比降低10,000倍以上。相反地，10％DIPE(30分钟处理)在去除胆固醇方面效果较差(约80％)，并导致体外感染性下降约120倍。HA活性不受MBCD的可测量影响，尽管其可测量地被10％DIPE降低。10％DIPE处理后蛋白质含量降低至50％，相比之下50mM MBCD处理后降低6％。
本文呈现的两组实验表明50mM MBCD选择性地去除胆固醇并且使得去脂IFV具有较低的感染性，同时维持大部分蛋白质。然而，这些处理都不能完全消除感染性并因此完全灭活病毒，因此需要进一步优化程序以完全灭活流感病毒。进一步的优化可以包括但不限于增加MBCD处理的时间以及用MBCD在第二时间段处理病毒。
实施例2
用MBCD处理PRRSV选择性地去除胆固醇，降低病毒感染性并保持大部分病毒蛋白质含量。
试剂：
本实施例中使用的PRRSV病毒株是RESP(中国江苏省农业科学院)。使用的宿主细胞是Marc-145(Wuxi AppTec，中国上海)。除了培养Marc-145细胞时使用的DMEM(Invitrogen)以外，其他使用的试剂与上述实施例1相同。
PRRSV在Marc-145细胞中的繁殖：
根据以下程序用PRRSV接种细胞。从在T-75烧瓶中生长的Marc-145细胞中除去培养基，在室温下用5mL PBS漂洗Marc-145细胞单层，并且在37℃下用1.5mL胰蛋白酶/EDTA使细胞不贴壁。将细胞重悬于10mL含有10％FBS的DMEM培养基中，并通过在4℃以800rpm离心5分钟使其沉淀。将细胞重悬于含有10％FBS的DMEM培养基中，并将细胞密度调整至2.5×105个细胞/mL。将15mL Marc 145细胞悬浮液接种到每个T75烧瓶中，并将烧瓶置于37℃，5％CO2中并温育过夜。
当Marc-145细胞超过90％汇合时，从T-75烧瓶中除去DMEM，加入5mL含有2％FBS的EMEM维持培养基，并且以0.1的MOI用PRRSV感染细胞。在37℃和5％CO2下将烧瓶温育60-90分钟，每15分钟轻轻摇动。将10mL含有2％FBS的EMEM维持培养基加入到每个烧瓶中，并将烧瓶在37℃和5％CO2下温育96小时。当达到80％的CPE(通常为96小时)时，收获培养物上清液以获得PRRSV。
PRRSV的纯化：
根据以下程序纯化PRRSV。将收集的培养上清液以3000rpm离心20分钟以除去细胞碎片，并收集上清液。将上清液以100000×g离心60分钟以沉淀PRRSV。将PRRSV沉淀重悬于适量体积的生理缓冲盐水(PBS)中至约1×109PFU/mL的滴度。将100μL浓缩的PRRSV等分试样储存在－80℃。
使用以下程序对PRRSV进行体外感染性滴定。使用上述细胞培养和转移程序，将Marc145细胞悬浮于含有10％FBS的DMEM中，终浓度为1.5×105个细胞/mL。将2mL Marc-145细胞悬浮液加入到6孔板的每个孔中，并将板在37℃下用5％CO2温育过夜。将病毒样品在37℃水浴中融化，随后在4℃下以500×g离心10分钟。制备病毒的1/10稀释系列，并在4℃下储存直至使用，使用EMEM作为稀释缓冲液。
当Marc-145细胞至少90％汇合时，除去培养基，并向每个孔中加入0.5mL稀释缓冲液和0.5mL病毒稀释液。对于阴性对照，使用1.0mL稀释缓冲液。每次添加稀释液后立即轻轻摇动板。将板在37℃，5％CO2下温育60-90分钟，每15分钟摇动一次。然后将每个6孔板的每个孔用3mL 2.5％低熔点琼脂糖的PBS溶液和稀释缓冲液的1：4混合物在37℃下覆盖。将板在室温温育15分钟以使覆盖混合物固化，然后将板在37℃以5％CO2温育96小时。
使用以下程序可见噬菌斑。在噬菌斑充分显现后(感染96小时后)，加入1mL 4％多聚甲醛，并将板在室温温育1小时。丢弃溶解的琼脂糖，并向每个孔中加入0.5mL 0.5％结晶紫。在与结晶紫温育15分钟后计数噬菌斑的数量，并基于稀释系数转化为滴度。
PRRSV的体外增殖：
对于蛋白质和胆固醇测定，优选PRRSV滴度大于1×107PFU/mL。PRRSV-RESP株在Marc-145细胞中的增殖产生了具有滴度>1×108PFU/mL的浓缩病毒样品。
PRRSV的去脂：
根据以下程序进行溶剂处理和模拟处理。将100μL约1x109PFU/mL的浓缩PRRSV贮液等分试样稀释到Eppendorf管中的900μL PBS中以获得1.0-5.0x108PFU/mL的最终滴度。对于溶剂处理，将PBS中的MBCD加入到所需浓度，或对于模拟处理加入等体积的PBS。然后盖上Eppendorf管并用石蜡膜密封。所有样品均置于预热至37℃的SHZ-82恒温轨道式空气浴振荡器(常州国华电器有限公司)中。将溶剂处理和模拟处理的样品在37℃以220rpm的轨道旋转速度旋转所需的时间。将各样品在微型离心机中离心1分钟，将含有IFV的上清液转移到超速离心管中。将管以100000×g离心(OPTIMATM L-100XP离心机；Beckman Coulter，Inc.，Indianapolis IN)30分钟以沉淀PRRSV，弃去上清液。将PRRSV沉淀重悬于200μL PBS中并储存在－80℃直至进一步分析。
去脂PRRSV的表征：
根据制造商的说明书，使用BCA测定法(PIERCETM BCA蛋白质测定试剂盒)测定去脂和模拟处理的PRRSV的蛋白质含量。胆固醇含量还使用根据制造商的说明书进行的胆固醇测定法(
Figure BDA0001743706760000162
Red胆固醇测定试剂盒，Life Technologies，Grand Island，NY)来测定。使用与上述相同的程序测量体外感染性。
MBCD的浓度依赖性：
在第一次去脂实验中，PRRSV用5、10、20、30和50mM MBCD在37℃下去脂60分钟。超速离心后，测试Marc-145细胞中模拟处理样品和去脂样品的体外感染性，并使用上述程序测定蛋白质和胆固醇含量。表4显示了去脂PRRSV的感染性、蛋白质含量和胆固醇含量。
表4
Figure BDA0001743706760000161
Figure BDA0001743706760000171
注：a与模拟处理相比的百分比。
起始PRRSV-RESP贮液的滴度为1.0×108PFU/mL，其中0.1mL与0.9mL PBS以及适量的MBCD混合。在37℃下以220RPM的轨道振荡60分钟后，通过超速离心使病毒样品沉淀并悬浮于最终体积为0.2mL的PBS中。模拟处理样品的滴度为1.6×107PFU/mL(表4)，表明模拟处理后恢复了超过30％的病毒活性。MBCD处理以大的浓度依赖性方式降低了感染性和胆固醇含量，而在所有MBCD浓度下总蛋白质含量的88％-98％被回收(参见表4)。用50mM MBCD处理后，与模拟样品相比，去脂PRRSV保留了约28％的胆固醇起始量，并且PRRSV感染性降低了约380倍，但再次是并未完全消除。
去脂PRRSV样品的盲传测定：
其中一个去脂PRRSV样品(100mM MBCD 90分钟)的滴度低于检测限。这就提出了样品中是否有感染性病毒颗粒的问题。为了解决是否存在这种感染性病毒颗粒的问题，用100mM MBCD将新样品去脂90分钟，并进行如下所述的盲传测定。虽然对照PRRSV-RESP样品的滴度为1.6×106PFU/mL，但通过盲传测定没有从用100mM MBCD去脂90分钟的PRRSV样品中检测到噬菌斑。用100mM MBCD去脂90分钟可能完全灭活PRRSV-RESP。
根据以下程序进行盲传测定。将100μL去脂的PRRSV样品转移到通过上述程序制备的含有Marc-145细胞的6孔板的每个孔中。板在37℃，5％CO2下温育4天。进行三次连续的冻融循环以裂解细胞，收获含有PRRSV的上清液，并在4℃以800rpm离心5分钟。将400μL上清液转移到Marc-145细胞的烧瓶中。将烧瓶在37℃和5％CO2下温育4天。重复冻融循环，再次收获上清液，离心并如前所述转移到Marc-145细胞的烧瓶中。再次重复冻融循环，再次收获上清液并离心，并将含有PRRSV的上清液在-80℃冷冻直至进一步使用。如上所述使用Marc-145细胞测定最终收获的样品的PRRSV滴度。
实施例3
本研究的目的是通过利用甲基β环糊精(MBCD)的去脂方法来测定PRRSV株ND 99-14灭活的时间依赖性。MBCD以粉末形式购自CTD，Inc.(Alachua，FL)。通过将1000mL水加入到280g MBCD中以生成贮液来制备300mM贮液。
病毒去脂：
使用PRRSV株ND99-14进行灭活动力学实验，其描述于2016年2月18日递交的共同待决申请美国系列号62/296,658中。通常该方法包括以40mM的最终浓度添加MBCD和在室温下总共72小时的温育时间，并持续混合。MBCD的添加发生在2个步骤中，20mM以开始灭活过程，24小时后另外20mM的MBCD，并在室温温育另外的48小时并持续混合。室温在大约20℃和大约25℃之间，并且最佳地在大约22℃和大约24℃之间。
通过将567mL MBCD溶液加入到8.5L病毒贮液中，将300mM的MBCD溶液贮液最初加入到病毒中至20mM的最终浓度。病毒在室温下以50rpm混合温育24小时。在MBCD加入后0小时，15分钟，4、8、12、16、20和24小时收集30mL病毒。将每个时间点的等分试样储存在4℃和-70℃直至进一步使用。
在收集24小时样品后，将病毒转移到新的容器中。再加入另外20mM的MBCD(加入到9.75L病毒贮液中的650mL MBCD)以达到40mM的最终浓度。病毒在室温温育另外的48小时。在第一次MBCD添加后30、36、42、48、60、72、84和96小时收集30mL病毒。将每个时间点的等分试样储存在4℃和-70℃直至进一步使用。
病毒测量：
将模拟灭活病毒和灭活病毒的10倍连续稀释液(10-1-10-9)加入在96孔板上培养的MARC145细胞中。将板在37℃和5％CO2下温育96小时以允许活病毒感染细胞。通过观察由于病毒感染MARC145细胞导致的细胞病变效应(CPE)来确定病毒复制。对于CPE，将每个含有病毒稀释液的孔评分为阳性或阴性，并且使用Reed-Muench TCID50计算将每种稀释液的所得阳性或阴性孔的数量用于确定TCID50/mL。在与灭活病毒相同的培养基和温度条件下对模拟灭活病毒进行处理，但不添加灭活剂。
使用在T-225烧瓶上培养的MARC145细胞进行模拟灭活病毒和灭活病毒以及仅培养基对照的三次连续盲传。将灭活的样品和对照样品加入到MARC145细胞的2天培养物中，并在37℃和5％CO2(3mL样品到27mL培养基中)中温育7天。目视检查烧瓶中CPE的存在。关于CPE，每个烧瓶评分为阳性(+)或阴性(-)，并记录。收获烧瓶中的上清液并加入到含有MARC-145细胞的2天培养物的一组新的T-225烧瓶中，并在37℃和5％CO2下培养7天。上述过程重复两次以获得3次连续病毒传代的CPE观察结果。
如所示地，使用在2个不同温度下储存的样品，测定在96小时温育期间收集的所有时间点的PRRS病毒滴度。0表示通过PRRS活病毒TCID50测定法检测不到或未测定滴度。表5中呈现的结果表明，以2步方法加入的40mM能够以至少8log10TCID50/mL的滴度灭活PRRS病毒。更高的滴度表明用20mM MBCD灭活不完全，但在第二次加入MBCD使浓度达到40mM后病毒是检测不到的。结果还表明，时间不是导致灭活的因素。在给定浓度的MBCD中更长的温育时间不增加灭活水平。20mM浓度的MBCD在温育15分钟后将活病毒减少约2.5个log值，并且检测到的活病毒水平在24小时内保持恒定。温育24小时时第二次添加20mM MBCD通过收集的下一时间点样品(30小时)将病毒灭活至检测不到的水平。在存在40mM MBCD于不同储存温度下也观察到存活力的差异。具有可检测活病毒的时间点样品在-70℃存储时相对于4℃存储有至少100倍更少的病毒。
表5
小时 存储在4℃的样品 存储在-70℃的样品
0.25 5.8a 3.3
4 5.8 nd
8 5.9 2.8
12 5.6 3.2
16 5.6 3.2
20 5.6 3.4
24 5.6 3.6
30 0 0
36 0 0
42 0 0
48 0 0
56 0 0
64 0 0
72 0 0
84 0 0
96 0 0
a Log10TCID50/mL
实施例4
本研究的目的是评估实验性灭活的PRRSV疫苗在疫苗接种攻击研究中的安全性和有效性。评估疫苗对降低肺部病变和病毒血症水平的能力。目的疫苗特征包括储存温度、剂量数(1对2)和佐剂添加。该研究在Veterinary Resources，Inc.,Cambridge,Iowa的BSL-2设施中进行。实验室测定在爱荷华州艾姆斯市的爱荷华州立大学兽医诊断实验室和南达科他州布鲁金斯市的南达科他州州立大学兽医诊断实验室进行。本研究纳入了60只临床健康的、约3周龄的对PRRSV为血清阴性的断奶仔猪。通过降低体重对猪进行排名，并且形成10个区组，每个区组6只动物。猪被随机分配到六个处理组之一(每组10只猪)。处理组包括未接种疫苗的对照组(T01)和接种了实验性灭活的PRRSV疫苗的五组。通过使用甲基-β-环糊精(MBCD)去脂来灭活疫苗。T02和T03组疫苗不含佐剂并且储存在2-8℃(T02)或-20℃(T03)。T04和T05组疫苗含有MONTANIDE TM Gel 01佐剂(Seppic)，并且施用一次(T04)或两次(T05)。T06组疫苗含有MONTANIDE TM IMS1313VG N PR佐剂(Seppic)并且给予两次。
通过顶部加料器让猪随意获食标准的商业加药(CTC
Figure BDA0001743706760000211
)起始食料(NRC，2012)。猪可以通过乳头饮水器随意获得干净的饮用水。所有研究猪均在接种后天数(DPV)10天用
Figure BDA0001743706760000214
处理。此外，所有的猪均接受单剂量的
Figure BDA0001743706760000212
-500和另一种
Figure BDA0001743706760000213
21DPV的处理。所有药物均按照标签说明进行施用。
疫苗
在本研究中使用PRRSV株SD11-21(传代水平84)作为抗原。SD11-21是一种田间株，其通过MARC-145细胞系传代84次以及三轮噬菌斑纯化和蔗糖梯度离心而适应于细胞培养生长，如2016年2月18日递交的共同待决申请美国系列号62/296,658所述。在连接到HILLEXII微载体(Pall Corporation，Port Washington，NY)上的MARC-145接种的5L BioBLU单次使用生物反应器(Eppendorf，Hamburg，Germany)中，在补充有2％胎牛血清(Sigma，St.Louis，MO)和50ug/mL庆大霉素(Life Technologies，Grand Island，NY)的OPTI-MEM培养基(Life Technologies，Grand Island，NY)中生产第85代(p85)。如通过实施例3中所述的病毒滴定测定法测定的，收获的p85病毒贮液的滴度为7.3log10TCID50。
在1L瓶中，将19.7mL的300mM MBCD(Sigma，St.Louis，MO)贮液加入300mL SD11-21病毒贮液中。将混合物在室温下以50rpm恒定混合温育24小时。在24小时温育后，加入另外的9.8mL MBCD贮液，并将混合物在室温下以50rpm恒速混合另外温育24小时。MBCD的终浓度是30mM，总共48小时的室温温育。还制备了模拟灭活病毒贮液，其中加入等量的水代替MBCD，温育时间和混合与灭活的病毒相同。模拟灭活病毒被用作病毒测量测定法的对照。处理后，模拟灭活病毒以6.5log10TCID50/mL存在，而在MBCD灭活的病毒溶液中未检测到活病毒。将病毒贮液储存在4℃下直至进一步使用。
配制疫苗以包含稳定剂和防腐剂。使用OPTI-
Figure BDA0001743706760000221
I还原血清培养基作为混合稀释剂。佐剂包括MONTANIDETM Gel 01(Seppic)和MONTANIDE TM 1313VG N PR(Seppic)的商业制剂。对照产品为商业制剂(Corning Cellgro，Mediatech Inc.的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。没有佐剂的疫苗含有去脂病毒，25％Stabililzer B，25μg/mL庆大霉素作为防腐剂以及混合稀释剂。具有佐剂的疫苗含有20％的所示佐剂。Stabililzer B含有在pH 7.0-7.2的超纯水(Life Technologies)中的2.5％D-甘露醇(Sigma)，1.2％明胶A型(Fisher，Pittsburgh，PA)，1％NZ胺酪蛋白水解物(Sigma)，5％蔗糖(Sigma)和6.2％海藻糖(Fisher)。
疫苗接种和攻击
纳入研究的60只猪中的每只都在攻击前的第35天接种疫苗。在T01-T05中的猪在颈部右侧以1.0mL肌内剂量注射它们的指定处理。T06中的猪用1.5mL注射。T01-T03和T05和T06中的猪在14天后(在攻击前-21天)再次以相同方式接种。在0DPC时，攻击材料通过在攻击前立即融化冷冻的NADC-20株的等分试样来制备。在用来自Mediatech，Inc的Earle's盐和L-谷氨酰胺(MEM)的Minimum Essential Medium Eagle中稀释后，滴度被测定为1.26×105.0TCID50/ml。每只猪都被物理限制用于攻击，头朝上。使用3mL非鲁尔锁定注射器以鼻内递送2mL剂量，每个鼻孔约1mL。
结果
在14DPC时，动物按照现场程序人道安乐死。由不了解处理的研究调查员将肺切除并进行评分。通过视觉和触诊检查七个肺叶中的每一个，用于归因于PRRSV的总的特征性病变。将每个肺叶中的病变/巩固量记录为肺叶的0和100％之间的实际值。将每个肺叶的评分输入权重公式以计算具有病变的肺的百分比。根据下列公式计算具有病变的总肺的百分比：具有病变的总肺的百分比＝{(0.10×左尖)+(0.10×左心脏)+(0.25×左膈)+(0.10×右尖)+(0.10×右心脏)+(0.25×右膈)+(0.10×中间)}。
此外，在进一步分析之前，使用反正弦平方根转换具有病变的总肺的百分比。通过混合线性模型分析转换数据，该模型包括处理的固定效应(SAS中的MIXED程序)和区组的随机效应。
表6总结了肺病变评分的统计分析结果。治疗的主要效果是统计学显著的(P＝0.0003)。与对照组(T01)比较表明，在Gel 01佐剂组(T04和T05)中肺受累百分比显著较低(P<0.05)。此外，两次施用并在2-8℃保存的非佐剂疫苗(T02)导致与用-20℃保存的疫苗(T03)处理的类似组相比显著更低(P<0.05)的病变评分。
表6.平均肺病变评分-反正弦转换的肺受累百分比(处理的主要效果：P＝0.0003)
Figure BDA0001743706760000231
*T01相对于T04和T05而言显著不同，P<0.05
1未转换的平均值
2逆转换的(back transformed)平均值
在攻击前的第35天和第21天收集用于测定病毒血症水平的血液样品。另外，在0、3、7、10和14DPC收集用于测定病毒血症水平的血液样品。使用qRT-PCR技术检测样品中PRRS病毒核酸的存在。
在分析之前，将血清学和病毒血症数据转化为log10单位，给出非正态分布。使用重复测量混合模型(MIXED程序)分析转换值。统计模型包括处理、时间和按时间相互作用的处理作为固定效应。区组作为随机效应包含在模型中。如果按时间相互作用的处理是显著的(P<0.05)，则评估时间处理内的效果。如果相互作用是不显著的，则评估治疗的主要效果。给出了最小二乘平均值(逆转换)和标准误。
表7中总结了病毒血症水平的分析。在PRRSV攻击之前，在任何猪中未观察到病毒血症，证实疫苗病毒灭活。攻击前的时间点被排除在统计分析之外。攻击后，日相互作用的处理无显著性(P＝0.0974)，因此评估了治疗的主要效果。治疗效果显著(P＝0.0107)。与对照组(T01)比较表明，佐剂化的所有疫苗组(T04，T05和T06)显著较低的(P<0.05)水平。预先计划的对比度不是统计学显著的。
表7.在3、7、10和14DPC，病毒血症-PRRSV基因组拷贝/ml的几何平均值(log10转换的)(处理的主要效果：P＝0.011；日相互作用处理：P＝0.097)
Figure BDA0001743706760000241
*T01相对于T04、T05、T06而言显著不同，P<0.05
1未转换的log10平均值
2逆转换的平均值
结论
用一剂或两剂MBCD灭活的Gel 01佐剂疫苗接种猪与对照组相比在显著减少肺病变和病毒血症水平上是有效的。在用2-8℃储存的其他MBCD灭活疫苗(T02和T06)接种的猪中，肺病变数量减少。由于肺病变评分的变化，这些差异在P<0.05水平上不显著。所有含有佐剂(MONTANIDETMGel01或1313)的MBCD疫苗显著降低病毒血症。在未来的研究中，当NADC-20株被用作攻击材料时，可能需要更大的样品量，以检测肺病变和病毒血症中的有意义的生物学差异。
储存温度似乎对疫苗效力有影响。与储存在2-8℃的疫苗相比，将疫苗储存在-20℃对疫苗效力具有负面影响。
在第一次接种14天后增加另外的接种，并不能进一步提高以Gel 01为佐剂的MBCD灭活疫苗接种的猪的疫苗效力。
将Gel 01佐剂包括到MBCD灭活疫苗中不影响疫苗效力。
MBCD灭活疫苗对于生长猪是安全的，如在第二次接种后在Seppic MONTANIDE TMGel 01佐剂化组中没有接种后全身反应，没有注射部位病变和仅短暂(1或2天)发热反应所证明。

Claims (11)

1.一种制备灭活的包膜病毒的方法，包括：
将包含包膜病毒的溶液与第一甲基β-环糊精溶液混合以获得第一混合物，其中所述第一混合物中甲基β-环糊精的浓度为20mM至50mM；
将第一混合物温育第一时间段，其中所述第一时间段为15分钟至24小时；
将来自第一混合物的包膜病毒与第二甲基β-环糊精溶液混合以获得第二混合物，其中所述第二混合物中甲基β-环糊精的浓度为20mM至50mM；和
将所述第二混合物温育第二时间段，其中所述第二时间段为4小时至48小时。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一混合物中甲基β-环糊精的浓度为20mM至40mM。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第二混合物中甲基β-环糊精的浓度为30mM至50mM。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一时间段为4小时至24小时。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第二时间段为24小时、36小时或48小时。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述第一时间段和所述第二时间段中的至少一个的温度为20℃至25℃。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述温度为22℃至24℃。
8.如权利要求1所述的方法，其中在获得第二混合物的步骤之前从第一混合物中分离出包膜病毒。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述包膜病毒是猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病毒。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第一时间段和所述第二时间段中的至少一个还包括搅拌第一混合物和/或第二混合物。
11.通过权利要求1-10中任一项所述的方法获得的去脂包膜病毒的用途，用于制备治疗由包膜病毒引起的疾病的药物。
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