JP2021184761A - ウイルス様粒子からの感染性インフルエンザウイルスの生成 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年8月28日に出願された米国特許出願第62/211,125号の出願日の利益を請求し、その開示は、本明細書に参照によって組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたHHSN272201400008Cの下、政府支援によりなされた。
本発明は、以下の項目を提供する。
(項目1)
少なくとも1つから最大8つのインフルエンザA型またはB型ウイルスセグメントを有する第1のVLPを産生するための第1の宿主細胞と、
少なくとも1つから最大8つのインフルエンザA型またはB型ウイルスウイルスセグメントを有する第2のVLPを産生するための第2の宿主細胞と
を含む単離された宿主細胞のセットであって、
該第1の宿主細胞は、
インフルエンザウイルスPA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB1 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB2 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNP DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスM DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNS DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、もしくは
インフルエンザウイルスHA DNAもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザA型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも1つから最大8つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも1つから最大8つの転写カセットを含む1つまたは複数のベクター;または
インフルエンザウイルスPA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB1 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB2 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNP DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスM DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNS DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNAおよびNB DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、もしくはインフルエンザウイルスHA DNAもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザB型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも1つから最大8つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも1つから最大8つの転写カセットを含む1つまたは複数のベクター;
ならびに
インフルエンザウイルスPA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスPB1 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスPB2 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスNP DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、および任意選択で、インフルエンザウイルスHAまたは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質に作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むmRNA産生用転写カセットを含む1つまたは複数のベクター
を含み、
該第2の宿主細胞は、
インフルエンザウイルスPA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB1 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB2 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNP DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスM DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNS DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスHA DNAもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザA型のゲノムに由来する少なくとも1つから最大8つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも1つから最大8つの転写カセットを含む1つまたは複数のベクター;または
インフルエンザウイルスPA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB1 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB2 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNP DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスM DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNS DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNAおよびNB DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスHA DNAもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザB型のゲノムに由来する少なくとも1つから最大8つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも1つから最大8つの転写カセットを含む1つまたは複数のベクター;
ならびに
インフルエンザウイルスPA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスPB1 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスPB2 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスNP DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、および任意選択で、インフルエンザウイルスHAまたは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質に作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むmRNA産生用転写カセットを含む1つまたは複数のベクター
を含み、
該第1の宿主細胞が、該第2の宿主細胞に存在しない少なくとも1つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも1つの転写カセットを有するか、または該第1の宿主細胞が、該第2の宿主細胞において対応するウイルスセグメントが修飾されることにより該対応するセグメントから機能性インフルエンザウイルスタンパク質が発現されないようになっている少なくとも1つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも1つの転写カセットを有する、セット。
(項目2)
前記第2の宿主細胞が、前記第1の宿主細胞に存在しない少なくとも1つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも1つの転写カセットを有する、項目1に記載のセット。
(項目3)
前記第1の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの7つを有するか、または前記第2の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの7つを有する、項目1に記載のセット。
(項目4)
前記第1の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも2つを有し、前記第2の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも6つを有する、項目1に記載のセット。
(項目5)
前記第1の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも3つを有し、前記第2の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも5つを有する、項目1に記載のセット。
(項目6)
前記第1の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも4つを有し、前記第2の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも4つを有する、項目1に記載のセット。
(項目7)
前記第1の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも5つを有し、前記第2の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも3つを有する、項目1に記載のセット。
(項目8)
前記第1の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも6つを有し、前記第2の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも2つを有する、項目1に記載のセット。
(項目9)
前記第1の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの7つ未満を有するか、または前記第2の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの7つ未満を有する、項目1に記載のセット。
(項目10)
前記第1および第2の宿主細胞におけるウイルスセグメントのための前記転写カセットが、8つのインフルエンザA型ウイルスセグメント全てを含まない場合、該第1および第2の宿主細胞に存在しないインフルエンザA型ウイルスセグメントを有するVLPを各々が産生する1つまたは複数の宿主細胞をさらに含む、項目1に記載のセット。
(項目11)
前記第1の宿主細胞が、前記mRNA産生用転写カセットの1つまたは複数を安定して発現する、項目1から10のいずれか一項に記載のセット。
(項目12)
前記第2の宿主細胞が、前記mRNA産生用転写カセットの1つまたは複数を安定して発現する、項目1から11のいずれか一項に記載のセット。
(項目13)
各転写カセットが、プラスミドまたは非インフルエンザウイルスベクターに存在する、項目1から12のいずれか一項に記載のセット。
(項目14)
1つまたは複数の転写カセットが、1つまたは複数のプラスミドまたは非インフルエンザウイルスベクターに存在する、項目1から12のいずれか一項に記載のセット。
(項目15)
前記第1または第2の宿主細胞が、転写終結配列に連結した3’インフルエンザウイルス非コード配列を含む3’インフルエンザウイルス配列に連結した目的のDNAに連結した5’インフルエンザウイルス非コード配列を含む5’インフルエンザウイルス配列に連結したプロモーターを含む転写カセットをさらに含む、項目1から14のいずれか一項に記載のセット。
(項目16)
前記第1の宿主細胞には、ウイルスセグメントのための前記1つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスM DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、M1およびM2のmRNA産生用ベクターが任意選択で含まれ、ウイルスセグメントのための前記1つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスNS DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、NS1およびNS2のmRNA産生用ベクターが任意選択で含まれ、vRNAのための前記1つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスNA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、NAのmRNA産生用ベクターが含まれる、項目1から14のいずれか一項に記載のセット。
(項目17)
前記第2の宿主細胞には、ウイルスセグメントのための前記1つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスM DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、M1およびM2のmRNA産生用ベクターが任意選択で含まれ、ウイルスセグメントのための前記1つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスNS DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、NS1およびNS2のmRNA産生用ベクターが任意選択で含まれ、vRNAのための前記1つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスNA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、NAのmRNA産生用ベクターが含まれる、項目1から14のいずれか一項に記載のセット。
(項目18)
前記非インフルエンザウイルス宿主細胞結合タンパク質が、フィロウイルスタンパク質、抗体、アルファウイルスタンパク質、レンチウイルスタンパク質、レトロウイルスタンパク質、アルブミン、またはラブドウイルスタンパク質を含む、項目1から17のいずれか一項に記載のセット。
(項目19)
単離された宿主細胞であって、少なくとも1つから最大8つのインフルエンザA型またはB型ウイルスセグメントを有するウイルス様粒子(VLP)を産生し、
インフルエンザウイルスPA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB1 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB2 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNP DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスM DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNS DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、または
インフルエンザウイルスHA DNAもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザA型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも1つから最大8つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも1つから最大8つの転写カセットを含む1つまたは複数のベクターを有するか;または
インフルエンザウイルスPA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB1 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスPB2 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNP DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスM DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNS DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスNaおよびNB DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、またはインフルエンザウイルスHA DNAもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザB型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも1つから最大8つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも1つから最大8つの転写カセットを含む1つまたは複数のベクター;
ならびに
インフルエンザウイルスPA DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスPB1 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスPB2 DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスNP DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、および任意選択で、インフルエンザウイルスHAまたは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質DNAに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むmRNA産生用転写カセットを含む1つまたは複数のベクター
を有し、
該宿主細胞が1つのウイルスセグメントのみの転写カセットを有する場合、該セグメントは、機能性インフルエンザウイルスタンパク質をコードし、該宿主細胞が、7つのウイルスセグメントのための転写カセットを有する場合、該宿主細胞は、NAウイルスセグメントを産生するためのNAコードまたは非コード配列に対応する配列を含まず、NAのmRNAを産生するための配列を含まず、該宿主細胞が、8つのウイルスセグメントのための転写カセットを有する場合、該セグメントの少なくとも1つは、機能性インフルエンザウイルスタンパク質がそのセグメントから発現されないように修飾されており、該修飾されたセグメントが、PB2セグメントではない、宿主細胞。
(項目20)
ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つを有する、項目19に記載の宿主細胞。
(項目21)
前記mRNA産生用転写カセットの1つまたは複数を安定して発現する、項目19または20に記載の宿主細胞。
(項目22)
転写終結配列に連結した3’インフルエンザウイルス非コード配列を含む3’インフルエンザウイルス配列に連結した目的のDNAに連結した5’インフルエンザウイルス非コード配列を含む5’インフルエンザウイルス配列に連結したプロモーターを含む転写カセットをさらに含む、項目19から21のいずれか一項に記載の宿主細胞。
(項目23)
単離されたVLPのセットであって、該セットの1つのVLPが、
インフルエンザウイルスPAセグメント、
インフルエンザウイルスPB1セグメント、
インフルエンザウイルスPB2セグメント、
インフルエンザウイルスNPセグメント、
インフルエンザウイルスMセグメント、
インフルエンザウイルスNSセグメント、
インフルエンザウイルスNAセグメント、もしくはインフルエンザNAおよびNBセグメント、または
インフルエンザウイルスHAもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質の配列を有する修飾HAセグメントから選択される1つまたは最大8つのインフルエンザA型ウイルスセグメントを有し、
該VLPが、PA、PB1、PB2、NP、およびHA、または非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質を含み、
前記セットの第2のVLPが、
インフルエンザウイルスPAセグメント、
インフルエンザウイルスPB1セグメント、
インフルエンザウイルスPB2セグメント、
インフルエンザウイルスNPセグメント、
インフルエンザウイルスMセグメント、
インフルエンザウイルスNSセグメント、
インフルエンザウイルスNAセグメント、もしくはインフルエンザNAおよびNBセグメント;または
インフルエンザウイルスHAセグメントもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質の配列を有する修飾HAセグメントから選択される1つから最大8つのインフルエンザA型ウイルスウイルスセグメントを有し、
該第2のVLPが、PA、PB1、PB2、NP、およびHA、または非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質を含み、
第1のVLPが、該第2のVLPに存在しない少なくとも1つのセグメントを有するか、または該第1のVLPが、該第2のVLPにおいて修飾されることによりその修飾セグメントから機能性インフルエンザウイルスタンパク質が発現されないようになっている少なくとも1つのセグメントを有する、セット。
(項目24)
前記第2のVLPが、前記第1のVLPに存在しない少なくとも1つのウイルスセグメントを有する、項目23に記載のセット。
(項目25)
前記VLPの少なくとも1つが、5’インフルエンザウイルス非コード配列に連結した非インフルエンザ配列に連結した3’インフルエンザウイルス非コード配列を含むインフルエンザウイルスセグメントをさらに含む、項目23または24に記載のセット。
(項目26)
インフルエンザA型またはB型ウイルスを調製するための方法であって、
宿主細胞を、少なくとも2つの異なるVLPで感染させるステップであって、該VLPが、少なくとも1つから最大8つのインフルエンザA型またはB型ウイルスセグメントを有する第1の単離されたVLP、および少なくとも1つから最大8つのインフルエンザA型ウイルスウイルスセグメントを有する第2のVLPを含み、該第1のVLPおよび該第2のVLPが、
インフルエンザウイルスPAセグメント、
インフルエンザウイルスPB1セグメント、
インフルエンザウイルスPB2セグメント、
インフルエンザウイルスNPセグメント、
インフルエンザウイルスMセグメント、
インフルエンザウイルスNSセグメント、
インフルエンザウイルスNAセグメント、または
インフルエンザウイルスHAセグメントもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質の配列を有する修飾HAセグメントから選択される1つまたは最大8つのインフルエンザA型ウイルスセグメントを含み、または該第1のVLPおよび該第2のVLPが、
インフルエンザウイルスPAセグメント、
インフルエンザウイルスPB1セグメント、
インフルエンザウイルスPB2セグメント、
インフルエンザウイルスNPセグメント、
インフルエンザウイルスMセグメント、
インフルエンザウイルスNSセグメント、
インフルエンザウイルスNAおよびNBセグメント、または
インフルエンザウイルスHAセグメントもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質の配列を有する修飾HAセグメントから選択される1つまたは最大8つのインフルエンザB型ウイルスウイルスセグメントを含み、
該第1のVLPおよび該第2のVLPが各々、PA、PB1、PB2、NP、およびHA、または非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質を含み、
該第1のVLPが、該第2のVLPに存在しない少なくとも1つのウイルスセグメントを有するか、または該第1のVLPが、該第2のVLPにおいて修飾されることによりその修飾セグメントから機能性インフルエンザウイルスタンパク質が発現されないようになっている少なくとも1つのセグメントを有する、ステップ;および
子孫ウイルスを単離するステップ
を含む方法。
(項目27)
前記第2のVLPが、前記第1のVLPに存在しない少なくとも1つのウイルスセグメントを有する、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記第1のVLPのウイルスセグメントの少なくとも1つが、前記第2のVLPにおける対応するウイルスセグメントと同じウイルス分離株に由来する、項目26に記載の方法。
(項目29)
前記第1のVLPのウイルスセグメントの少なくとも1つが、前記第2のVLPにおける対応するセグメントとは異なるウイルス分離株に由来する、項目26に記載の方法。
(項目30)
前記第1のVLPが、7つのウイルスセグメントを有するか、または前記第2のVLPが、7つのウイルスセグメントを有する、項目26から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記第1のVLPが、7つのウイルスセグメントを有し、前記第2のVLPが、6つのウイルスセグメントを有する、項目26から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記第1のVLPが、少なくとも3つのウイルスセグメントを有し、前記第2のVLPが、7つのウイルスセグメントを有する、項目26から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記第1のVLPが、少なくとも4つのウイルスセグメントを有し、前記第2のVLPが、少なくとも4つのウイルスセグメントを有する、項目26から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記第1のVLPが、8つ未満のウイルスセグメントを有し、前記第2のVLPが、8つ未満のウイルスセグメントを有する、項目26に記載の方法。
(項目35)
前記第1のVLPが、8つ未満のウイルスセグメントを有する、項目26に記載の方法。
(項目36)
前記第2のVLPが、8つ未満のウイルスセグメントを有する、項目26に記載の方法。
(項目37)
前記第1および第2のVLPのウイルスセグメントが、8つのゲノムウイルスセグメントを含んでいない場合、前記宿主細胞が、該第1および第2のVLPに存在しないウイルスセグメントを有する1つまたは複数の他のVLPにさらに感染する、項目26から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
HAおよびNAのためのウイルスセグメントが、同じウイルス分離株に由来する、項目26から37のいずれか一項に記載の方法。
「VLP」は、本明細書で使用される場合、1つもしくは最大8つの(インフルエンザA型およびB型ウイルスの場合)または1つもしくは最大7つ(インフルエンザC型ウイルスの場合)のインフルエンザウイルスゲノムセグメントを含むインフルエンザウイルス様粒子である。一実施形態では、VLPは、8つ未満のゲノムセグメント(インフルエンザA型およびB型ウイルスの場合)または7つ未満のゲノムセグメント(インフルエンザC型ウイルスの場合)を有する。VLPは、細胞に感染することができるが、それ自体では、例えば補完的VLPを提供することにより、何か(something)がトランスで提供されることを除いて、子孫ウイルスを産生することができない。一実施形態では、VLPは、8つ未満のゲノムセグメント(インフルエンザA型およびB型ウイルスの場合)を有しており、それらインフルエンザA型ウイルスまたはインフルエンザB型ウイルスセグメントの各々は、機能性インフルエンザウイルスタンパク質(複数可)をコードする配列を有する。一実施形態では、VLPは、7つ未満のゲノムセグメント(インフルエンザC型の場合)を有しており、それらインフルエンザC型ウイルスセグメントの各々は、機能性インフルエンザウイルスタンパク質(複数可)をコードする配列を有する。一実施形態では、1つを超えるゲノムセグメントが存在する場合、少なくとも1つのインフルエンザウイルスゲノムセグメントは、例えば1つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換による、例えばゲノムセグメントの修飾の結果として、それぞれのセグメントによりコードされている主なウイルスタンパク質(複数可)(つまり、PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NS2タンパク質)の機能型をコードしていなくともよい。一実施形態では、VLPは、野生型インフルエンザウイルスと同数のウイルスセグメントを有し得、例えばインフルエンザA型またはB型では8つのセグメントであるが、VLPの少なくとも1つのセグメントは、非機能であり、例えば、複製のための、またはパッケージングのための、または感染性ウイルス産生のためのウイルスタンパク質を発現しない。1つまたは複数のウイルスゲノムセグメント(複数可)に加えて、VLPは、少なくとも、宿主細胞との結合に必要なタンパク質(例えば、インフルエンザウイルスHAタンパク質、エボラウイルスGPタンパク質、またはVSV Gタンパク質)、およびウイルスRNA複製および転写に必要なウイルスタンパク質(つまり、ウイルスRNAと共にウイルスリボ核タンパク質複合体を形成する、PB2、PB1、PA、およびNPタンパク質)を含んでいてもよい。ほとんどのVLPは、複製能力がない(つまり、ヘルパー機能依存性)。一部のVLPは、複製能力があり得る(つまり、NAまたはNS1等のインフルエンザウイルスタンパク質を発現する能力を欠如し得るが、依然として感染性子孫ウイルスを形成することが可能であり得る)。複製能力のあるVLPは、弱毒化され得る。VLPのセットを使用して、細胞を共感染させ、上記セットが、A型またはB型の場合の8つのセグメントの各々について少なくとも1つの「機能性セグメント」(機能性PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、またはNB、M1、M2、NS1、またはNS2タンパク質をコードするセグメントと定義される)またはC型の場合は7つのセグメントの各々について少なくとも1つの機能性セグメントを含む限り、複製能力のあるインフルエンザウイルスを産出することができる。
ネガティブセンスRNAウイルスは、RSウイルス(respiratory syncytial virus)、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、およびエボラウイルス等の一般的なヒト病原体、ならびに家禽および畜牛産業に多大な経済的影響を及ぼす動物ウイルス(例えば、ニューカッスル病ウイルスおよび牛疫ウイルス)を含む、7つの科に分類される(ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、フィロウイルス科(Filoviridae)、ボルナウイルス科(Bornaviridae)、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、およびアレナウイルス科(Arenaviridae))。最初の4つの科は、非分節ゲノムにより特徴付けられ、後の3つは、それぞれ、6〜8つの、3つの、または2つのネガティブセンスRNAセグメントで構成されるゲノムを有する。ネガティブセンスRNAウイルスの共通特徴は、それらのRNAゲノムの負極性である。つまり、ウイルスRNA(vRNA)は、mRNAに対して相補的であり、したがってそれ自体は感染性ではない。ウイルス転写および複製を開始するためには、vRNAが、それぞれウイルスポリメラーゼ複合体および核タンパク質により、プラスセンスmRNAまたはcRNAへと転写されなければならない。インフルエンザA型ウイルスの場合、ウイルスポリメラーゼ複合体は、3つのポリメラーゼタンパク質PB2、PB1、およびPAで構成されている。ウイルス複製中、cRNAは、新しいvRNA分子を合成するための鋳型としての役目を果たす。全てのネガティブ鎖RNAウイルスでは、vRNAおよびcRNAの5’および3’末端の両方の非コード領域は、ウイルスゲノムの転写および複製に重要である。細胞性またはウイルス性mRNA転写物とは異なり、cRNAおよびvRNAはいずれも、5’末端でのキャッピングがされておらず、まさに3’末端でのポリアデニル化もされていない。
季節性インフルエンザに対する現行ワクチンは三価であり、H3N2およびH1N1サブタイプの2つのインフルエンザA型ウイルス株およびインフルエンザB型ウイルスを含むか、または四価である。こうしたワクチンは、HAタンパク質およびNAタンパク質に点変異が蓄積されて、ウイルスがヒト免疫応答を回避することが可能になるため、平均して2〜3年毎に更新される。現行のインフルエンザワクチンは、不活化ワクチンまたは弱毒生ワクチンのいずれかである。インフルエンザウイルスワクチン市場では不活化ワクチンが主流であり、優勢株または標的株の表面タンパク質をコードする遺伝子、最もよく知られているものとしてはHA遺伝子およびNA遺伝子を含む再集合体ウイルスで作られている。こうしたウイルスは、典型的には、鶏卵で過剰産生され、その後、化学的に、例えばホルムアルデヒドで処理して不活化される。不活化されているが完全なビリオンを導入することにより、HAおよびNAの組合せ(HおよびN、例えばH5N1とも呼ばれる)に特異的な免疫応答が誘導される。
不活化インフルエンザワクチンおよび生インフルエンザワクチンの生産は両方とも、ある特定の遺伝子配置を有する再集合体ウイルスを単離することに依拠する。2つの異なるインフルエンザA型またはB型ウイルスによる細胞の共感染は、28=256通りの異なる遺伝子組合せをもたらすため、所望の再集合体の単離は煩雑である。1999年には、クローニングされたcDNAに由来するインフルエンザウイルスの人為的生成を可能にする系が開発された(Neumannら、1999年)。この手法では、細胞を、インフルエンザvRNAをコードするプラスミド、およびウイルス複製複合体の成分(つまり、ポリメラーゼおよびNPタンパク質)をコードするプラスミドで共形質移入する。前者のプラスミドは、vRNA産生用プロモーター、例えば、RNAポリメラーゼIプロモーター配列、ネガティブセンス配向性の全長ウイルスRNAをコードするcDNA、およびRNAターミネーター配列、例えばRNAポリメラーゼIターミネーター配列を含む。RNAポリメラーゼIによる細胞内転写は、したがって、ウイルスポリメラーゼおよび核タンパク質により増幅され得るインフルエンザウイルスRNAと同一の転写物を産出する。形質移入の48時間後、細胞培養上清の1ml当たり最大108個の感染性ウイルスが検出される。この系は、インフルエンザウイルスゲノムへの任意の(生存可能な)変異の導入を可能にする。さらに、この系を使用すると、特注の(tailor-made)再集合体ウイルスを生成することができる。ワクチンウイルスを産生するため、細胞を、流行株のHA遺伝子およびNA遺伝子をコードする2つのプラスミド、およびPR8ウイルス(不活化ワクチンを生産する場合)または弱毒A/Ann Arbor/6/60ウイルス(弱毒生ウイルスを生産する場合)のいずれかの内部遺伝子をコードする6つのプラスミドで形質移入することができる。本明細書に記載されているように、リバースジェネティクスは、NA活性を欠如し、任意選択で他のウイルス遺伝子に変異、例えば得られるウイルスの病原性能力を低減するHA遺伝子の変異を含む弱毒生インフルエンザウイルスワクチンを開発するための基盤である。
ビリオン内部のRNPの立体構造は、注目すべき論争の的だった。陰性染色法で検査するときに、直径7〜8nmの連続鎖が、破壊されたビリオン内にヘリックスの形態で配置されている。ヘリックスは、ターン数および全体的な直径に関して、ビリオン毎にかなり異なっている。連続鎖は、陰性染色法によりビリオン内で観察される唯一構造だったため、ウイルスRNPの天然組織(natural organization)を表わすと考えられていた。したがって、ウイルスRNPは、単一連続ヘリックスとしてビリオン内に存在し、連続ヘリックスは、精製プロセス中に複数のRNPに断片化されたと考えられると提唱された。しかしながら、単一連続ヘリックスを、RNPをビリオンから抽出するときに観察される捻れた棒状構造物と形態学的に一致させるのは難しい。加えて、連続ヘリックスが、実際にNP分子で構成されているという証拠はない。その後、陰性染色電子顕微鏡観察により、ビリオン内の多種多様な連続ヘリックスが、4×4nmの寸法を有する同じユニットで構成されていることが明らかにされた。また、単離されたM1タンパク質は、in vitroで脂質と再結合させたときに、リポソームで規則正しい鎖を形成することが示された。インフルエンザウイルスは、2つの主要な内部タンパク質NPおよびM1を有し、NPモノマーは、6.2×3.5nmの寸法を有するため、4nm×4nmのユニットは、M1分子に該当すると結論付けられた。したがって、陰性染色された破壊ビリオンで観察される直径が7〜8nmの連続ヘリックスは、脂質エンベロープの下のM1タンパク質の層に該当する、M1鎖の対である可能性が高い。クライオ電子顕微鏡観察により精製ビリオンで観察される同様の連続ヘリックスも、M1分子の層に該当する可能性がある。
断片化RNPがビリオン内でどのように組織化されるかは依然として不明である。この問題が解決されれば、vRNAセグメントが各ビリオンに組み込まれるゲノムパッケージング機序を最終的に解明することができる。初期の提唱では、vRNAセグメントは、単一の骨格と結合して、分節vRNAが協同的にパッケージングされると予想されていた。しかしながら、この考えは、陰性染色された破壊ビリオンでは単一の連続ヘリックスが観察されるという電子顕微鏡観察に基づいており、それは、その後M1分子の層に該当することが示されているため、見込みのないシナリオである。ビリオン内の断片化棒状RNPの組織化に関する情報はわずかである。
vRNAセグメントがビリオン内にパッケージングされる機序を説明するために、これまで2つのモデル:無作為パッケージングモデルおよび選択的パッケージングモデルが提唱されている。前者のモデルでは、全てのvRNAセグメントに共通したパッケージングシグナルが仮定されており、vRNAと細胞性RNAとは区別されるが、vRNAの間は区別されず、任意の数および組合せのvRNAのビリオン内への無作為組込みが可能である。選択的パッケージングモデルでは、各vRNAセグメントに特異的なパッケージングシグナルの存在が予測されており、vRNAと細胞性RNAとが区別されるだけでなく、個々のvRNA間も区別され、8つのvRNAセグメントの完全セットのビリオン内への組込みをもたらす。いずれかのモデルを支持する決定的な証拠はなく、ゲノムパッケージングの機序に関する論争は続いている。最近、リバースジェネティクスにより、8つのvRNAセグメントが全て、ビリオン内への効率的組込みのためのセグメント特異的パッケージングシグナルを有することが明らかにされた。こうしたパッケージングシグナルは、保存されたプロモーター配列だけでなく、プロモーター領域に隣接するコード領域およびセグメント特異的非コード領域を収容する二部構成の配列を、vRNAの5’末端および3’末端に含む。こうした知見は、インフルエンザビリオン内部の電子顕微鏡観察と共に、選択的パッケージングモデルを支持しており、無作為パッケージングモデルの誤りを証明する。
一実施形態では、本発明は、1つまたは複数の単離されたベクター、または1つもしくは複数の単離されたベクターを含む組成物であって、インフルエンザvRNA(ウイルスセグメント)を産生するための、およびタンパク質産生用のインフルエンザウイルスmRNAのための複数の転写カセットを有するが、ウイルスゲノムのセグメントの完全未満の相補体を有するか、または少なくとも1つの機能性インフルエンザウイルスタンパク質をコードしないウイルスセグメントを有するベクターまたは組成物を提供する。一実施形態では、ベクター(複数可)または組成物は、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPA cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスPA cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB1 cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスPB1 cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB2 cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスPB2 cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスHA cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNP cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスNP cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスM cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスM cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNS cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスNS cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolII転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPAのDNAコード領域に作動可能に連結したPolIIプロモーターを含む転写カセット、PolII転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB1のDNAコード領域に作動可能に連結したPolIIプロモーターを含む転写カセット、PolII転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB2のDNAコード領域に作動可能に連結したPolIIプロモーターを含む転写カセット、PolII転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNPのDNAコード領域に作動可能に連結したPolIIプロモーターを含む転写カセット、ならびに任意選択で、インフルエンザウイルスHAのDNAセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結したPolIIプロモーターおよびPolII転写終結を含む転写カセット、インフルエンザウイルスMのDNAセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスM cDNAに作動可能に連結したPolIIプロモーターおよびPolII転写終結配列を含む転写カセット、および/またはインフルエンザウイルスNSのDNAセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスNS cDNAに作動可能に連結したPolIIプロモーター配列およびPolII転写終結配列を含む転写カセットを有する、1つまたは複数のベクターを含む。
本発明は、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPA cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスPA cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB1 cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスPB1 cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB2 cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスPB2 cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスHA cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNP cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスNP cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスM cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスM cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、および/またはPolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNS cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスNS cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセットから選択されるvRNA産生用(しかし、一実施形態では、vRNAの完全未満の相補体)またはcRNA産生用の1つまたは複数の転写カセットを含む、少なくとも1つのベクター、例えば少なくとも1つのプラスミド;ならびにPolII転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPAのDNAコード領域に作動可能に連結したPolIIプロモーターを含む転写カセット、PolII転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB1のDNAコード領域に作動可能に連結したPolIIプロモーターを含む転写カセット、PolII転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB2のDNAコード領域に作動可能に連結したPolIIプロモーターを含む転写カセット、および/またはPolII転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNPのDNAコード領域に作動可能に連結したPolIIプロモーターを含む転写カセットから選択される1つまたは複数のmRNA産生用転写カセットを含む、少なくとも1つのベクター、例えば少なくとも1つのプラスミドを含む組成物を提供する。一実施形態では、各PolIプロモーターは、同じである。一実施形態では、各PolIIプロモーターは、同じである。一実施形態では、各PolI転写ターミネーター配列は同じである。一実施形態では、各PolII転写ターミネーター配列は同じである。
供する。上記カセットは、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスHA cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNA cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスNA cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスM cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスM cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット、およびPolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNS cDNA、例えば全長インフルエンザウイルスNS cDNAに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセット;ならびにインフルエンザウイルスPAのcDNA、例えば全長インフルエンザウイルスPA cDNAに各々が作動可能に連結したPolIプロモーターおよびPolI転写終結配列ならびにPolIIプロモーターおよびPolII転写終結配列を含む転写カセット、インフルエンザウイルスPB1のcDNA、例えば全長インフルエンザウイルスPB1 cDNAに各々が作動可能に連結したPolIプロモーターおよびPolI転写終結配列ならびにPolIIプロモーターおよびPolII転写終結配列を含む転写カセット、インフルエンザウイルスPB2のcDNA、例えば全長インフルエンザウイルスPB2 cDNAに各々が作動可能に連結したPolIプロモーターおよびPolI転写終結配列ならびにPolIIプロモーターおよびPolII転写終結配列を含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスNPのcDNA、例えば全長インフルエンザウイルスNP cDNAに各々が作動可能に連結したPolIプロモーターおよびPolI転写終結配列ならびにPolIIプロモーターおよびPolII転写終結配列を含む転写カセットから選択される1つまたは複数の転写カセットから選択される。一実施形態では、転写カセット中のHAは、A型HAである。別の実施形態では、転写カセット中のHAは、B型HAである。一実施形態では、RNA PolIプロモーターは、ヒトRNA PolIプロモーターである。一実施形態では、組成物は、PolI転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスM cDNA、例えばM1およびBM2を有するものに作動可能に連結したPolIプロモーターを含む転写カセットをさらに含む。
また、本発明は、インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供する。上記方法は、細胞を、少なくとも2つのVLPと接触させることを含み、各VLPは、インフルエンザウイルスPAセグメント、インフルエンザウイルスPB1セグメント、インフルエンザウイルスPB2セグメント、インフルエンザウイルスNPセグメント、インフルエンザウイルスMセグメント、インフルエンザウイルスNSセグメント、インフルエンザウイルスNAセグメント、またはインフルエンザウイルスHAセグメントから選択される1つから最大8つのセグメントを有し、上記VLPは、PA、PB1、PB2、NP、およびHAまたは非インフルエンザウイルス宿主細胞結合タンパク質、およびNAを含み、一実施形態では、第1のVLPは、第2のVLPに存在しない少なくとも1つのセグメントを有し、第2のVLPは、第1の宿主細胞に存在しない少なくとも1つのウイルスセグメントを有する。HAセグメントは、H1〜H18のいずれか1つであってもよく、NAは、N1〜N11のいずれか1つであってもよい。
本発明によると、インフルエンザウイルスの受容体である1つまたは複数のシアル酸の発現レベルが低減または減少した変異体細胞を含む、インフルエンザウイルスの効率的な複製を支援する任意の細胞を本発明で使用することができる。上記方法により得られるウイルスは、再集合体ウイルスにすることができる。
本発明のワクチンは、任意の病原体の糖タンパク質を含む免疫原性タンパク質、例えば、1つまたは複数の細菌、ウイルス、酵母、または真菌に由来する免疫原性タンパク質を含んでいてもよい。したがって、一実施形態では、本発明のインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス、またはこれらに限定されないが、HIV等のレンチウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、CMVもしくはHSV等のヘルペスウイルス、もしくは口蹄疫ウイルスを含む他のウイルス病原体のワクチンベクターであってもよい。
接種、または非経口投与、または経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、弱毒化または不活化インフルエンザウイルスを含み、任意選択で、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンをさらに含む。組成物は、当技術分野で公知の助剤または賦形剤をさらに含んでいてもよい。例えば、Berkowら、1987年;Avery's Drug Treatment、1987年を参照されたい。本発明の組成物は、一般的に、個々の用量(単位用量)の形態で提供される。
組成物(またはそれが誘発する抗血清)の投与は、「予防」または「治療」目的のいずれであってもよい。予防的に提供される場合、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染の任意の症状が顕在化する前に提供される。組成物の予防的な投与は、その後のあらゆる感染を予防または減じる役目を果たす。本発明の遺伝子治療組成物は、疾患の任意の症状が顕在化する前に提供されてもよい。組成物の予防的な投与は、疾患に関連する1つまたは複数の症状を予防または減じる役目を果たす。
本発明の組成物は、受動免疫または能動免疫のいずれかにより、1つまたは複数の病原体、例えば、1つまたは複数のインフルエンザウイルス株に対する耐性を付与することができる。能動免疫では、不活化または弱毒化された生ウイルスワクチン組成物は、宿主(例えば、哺乳動物)に予防的に投与され、投与に対する宿主の免疫応答は、感染および/または疾患に対して防御する。受動免疫の場合、誘発された抗血清を回収し、少なくとも1つのインフルエンザウイルス株により引き起こされた感染症を有する疑いのあるレシピエントに投与することができる。本発明の遺伝子治療組成物は、能動免疫により、予防レベルまたは治療レベルの所望の遺伝子産物を産出することができる。
7年を参照されたい。
による精製および保管中に不安定である場合がある。ワクチンの各0.5ml用量は、およそ10〜500億個のウイルス粒子、例えば100億個の粒子を含んでいてもよい。
7セグメントのインフルエンザA型ウイルスの特徴付け
NA vRNAを欠如するNA欠損ウイルスは、幾つかの魅力的な特徴:(i)高レベルの弱毒化;(ii)リバースジェネティクスによる生成の容易さ、および(iii)野生型表現型への復帰変異を引き起こし得る点変異が存在しないことによるバイオセイフティー、を併せ持つ。さらに、循環野生型株との7セグメントウイルスの再集合は、7セグメントウイルスが由来した野生型株を再生成するに過ぎないだろう。そのようなウイルスは、H5およびH3インフルエンザウイルスの場合に、特に重要であり得る。幾つかの候補H5N1ウイルスワクチンが開発されているが(Bressonら、2006年;Treanorら、2006年)、不活化サブビリオンまたはスプリットワクチンによる前臨床試験および臨床試験により、適切な免疫応答を達成するためには高用量のHAが必要であることが示された(Treanorら、2006年)。アジュバントが存在する場合でさえ、非アジュバント化H3 HAワクチンで典型的に見出されるものと同等の免疫応答を達成するには、30μgのHAが必要とされた(Bressonら、2006年)。
ウイルス。ヒトH5N1ウイルス[A/Vietnam/1203/2004(VN1203)およびA/Vietnam/1194/2004(VN1204)]を使用した。ヒト分離株を、メイディンダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞で増殖させ、5%新生仔ウシ血清を有する最小必須培地で維持した。生ウイルスによるおよびリバースジェネティクスにより生成された形質移入体による実験は全て、CDCおよび米国農務省によりそのような使用が承認されているバイオセイフティーレベル3封じ込め実験室で実施した。
NAセグメントを欠如する変異体A/Vietnam/1194/04(H5N1)ウイルス(「VN1194NA−」)、およびNAセグメントが、eGFP遺伝子を有する変異体NAセグメントで置き換えられているウイルス(「VN1194NAeGFP」)は、外因性ノイラミニダーゼ処理を行わなくともMDCK細胞で複製することが見出された(表1)。
NA遺伝子を完全に欠如するA/Vietnam/1194/04(H5N1)(VN1194)変異体ウイルス(VN1194NA−)を生成した。すなわち、このウイルスは、7つのRNAセグメントのみを含む。このウイルスは、MDCK細胞では、細胞培養上清の1ml当たり約102プラーク形成単位(pfu)に増殖した。しかしながら、MDCK細胞中で10回連続継代した後では、ウイルス力価は、細胞培養上清の1ml当たり約106pfuに増加した。これは、VN1194NA−が、細胞培養での効率的増殖を可能にする変異を獲得したことを示唆していた。しかしながら、このバリアントは、マウスでは高度に弱毒化のままであり、>105pfuのMLD50(感染動物の50%を死亡させるのに必要なウイルス量)を有した。対照的に、親VN1194ウイルスのMLD50は、3.1pfuだった。したがって、7セグメントウイルスは、細胞培養では適当な力価に増殖するが、マウスでは高度に弱毒化されており、弱毒生ワクチンとしての使用可能性が示唆される。
NA− VLPを、実施例IIIおよび特許請求の範囲に記載されているもの等の補完的VLPと共に使用して、細胞を感染させ、複製能力のあるインフルエンザウイルスを産生することができる。
7セグメントのインフルエンザウイルスおよび追加の弱毒化変異
NA欠損インフルエンザウイルスを弱毒生ワクチンとして確立するために、NA欠損インフルエンザウイルスH3およびH5サブタイプの組換えウイルスを生成および評価する。弱毒生NA欠損H3ワクチンウイルスは、「季節性インフルエンザ」に対する防御を提供することができる。対照的に、弱毒生NA欠損H5ワクチンウイルスは、このワクチンの使用が新しいHAサブタイプをヒト集団に導入することができるため、このサブタイプのウイルスにより引き起こされるパンデミックのために確保される可能性がある。H5N1インフルエンザウイルスパンデミックの場合、このサブタイプのウイルスが既にヒト中で循環していれば、弱毒生H5N1ワクチンは、その免疫原性が不活化ワクチンのそれよりも優れていると予想されるため、非常に貴重であろう。
高病原性H5N1インフルエンザウイルスは、今では複数のクレードに分類されており、こうしたクレードの2つの候補ワクチンウイルス:NA欠損A/Vietnam/1194/04(VN1194、クレード1)およびA/Indonesia/5/05(Ind/05、クレード2)の生成が促進される。
NA欠損H5ウイルスを生成するための上記で概説した戦略に従い、NA欠損H3ウイルスを「季節性インフルエンザ」に対する使用のために生成する。具体的には、最近のヒトH3N2ウイルスであるA/Yokohama/2017/03(Yok)ウイルスに基づくNA欠損ウイルスを、リバースジェネティクスを使用して調製する。NAセグメントを欠如するYokウイルス(YokNA−)を生成し、高増殖性バリアントを、ベロ細胞およびMDCK細胞で調製する。高増殖性YokNA−バリアントを、マスター種ウイルスへと発展させてもよい。ベロ細胞およびMDCK細胞で開発した高増殖性YokNA−バリアントを完全に配列決定し、高増殖性ベロ細胞増殖YokNA−バリアントに見出される全ての変異を、部位特異的変異誘発を使用して、YokNA−を生成するためのRNAポリメラーゼIプラスミドに導入する。高増殖性MDCK細胞増殖YokNA−バリアントに見出される全ての変異を、部位特異的変異誘発を使用して、YokNA−を生成するための別のセットのRNAポリメラーゼIプラスミドに導入する。
弱毒生ワクチンは、十分に弱毒性であり(疾患症状を引き起こさないかまたは軽度である)、免疫原性であり(強力な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を刺激する)、および防御性である(免疫個体に防御免疫を提供する)。
VN1194およびInd/05等の高病原性H5N1インフルエンザウイルスは、典型的には、感染の8日以内にマウスを死亡させる。VN1194HAAvNA−およびInd/05HAAvNA−の弱毒化レベルを評価するため、それらのLD50値を決定する。また、LD50値は、親VN1194およびInd/05ウイルスについて決定するが、ホルマリン不活化ウイルスについて決定しない。
高病原性H5N1インフルエンザウイルスとは対照的に、ヒトH3N2ウイルスは、典型的には、マウスまたはフェレットでは全身感染を引き起こさず、これら動物を死亡させない。親Yokウイルスと比較したYokNA−の弱毒化レベルを確立するため、マウスおよびフェレットを、上述のように鼻腔内感染させる。動物は、体重減少、活動低下、またはくしゃみ(フェレットの場合)等の疾患徴候を毎日観察する。並行して、感染後1日目、3日目、および6日目に、感染動物の鼻甲介および肺でウイルス力価を決定する。Yokウイルスの場合、軽度疾患の徴候が感染初期に生じ、徴候は、感染後6日目までに解消される場合がある。YokNA−ウイルスの場合、低ウイルス力価が1日目に観察され(ウイルスの限定的な複製能力を反映する)、無疾患症状でない場合でもそれほど著しくなく、ウイルス複製が幾らかある場合でも非常に低い力価が、感染後3日目に観察される。
弱毒生ワクチンについては、弱毒化と免疫原性とのバランスが重要である。VN1194HAAvNA−、Ind/05HAAvNA−、およびYokNA−の免疫原性を評価するため、体液性免疫応答および細胞性免疫応答をマウスで試験し、体液性応答をフェレットで試験する。
NA欠損ウイルスの防御効力を評価するため、マウス群(またはフェレット群;9匹動物/群)を、免疫原性について試験した同用量の弱毒生NA欠損ウイルスまたは不活化ウイルスで鼻腔内免疫する。免疫原性研究により、追加免疫を伴う2用量レジメンが、単回免疫よりも効率的であることが示される場合、防御研究では、追加免疫も実施される。両レジメンの効力が同等である場合、マウスを1回のみ免疫する。偽感染動物は、対照としての役目を果たす。免疫の1〜3か月後、動物を、致死量(マウスの場合、10または100MLD50;フェレットの場合、106pfu)の同種VN1194ウイルスまたはInd/05ウイルスで負荷する。動物を、疾患の徴候について毎日観察する。負荷後3日目および6日目に、1群当たり3匹の動物を安楽死させる。器官でのウイルス力価および血清抗体力価を決定する。
NA欠損H3N2ウイルスの防御効力を確立するため、免疫および負荷研究を、H5N1ウイルスについて上述したものと本質的に同様に実施する。免疫原性を試験した同用量のYokNA−またはYokInactで、マウス群(およびフェレット群;9匹動物/群)を鼻腔内免疫する。偽感染動物は、対照としての役目を果たす。免疫の1〜3か月後、動物を、106pfuのYokウイルスで負荷する。動物を、疾患の徴候について毎日観察する。負荷後3日目および6日目に、1群当たり3匹の動物を安楽死させる。鼻甲介および肺のウイルス力価および血清抗体力価を決定する。
インフルエンザA型ウイルスのリバースジェネティクス系を、1つの細胞内にて8つのインフルエンザA型ウイルスゲノムセグメント全てを合成するためのプラスミドで細胞を形質移入するという概念に基づいて構築する。プラスミドからインフルエンザウイルスを生成するための異なる戦略が、本明細書で提供される。細胞を、7つのRNAポリメラーゼIプラスミド(例えば、HA vRNAをコードするプラスミドが省略される)で形質移入する。細胞を、ポリメラーゼおよびNPのタンパク質を発現するプラスミドで共形質移入して、ウイルス複製および転写を開始させる。HAタンパク質は、タンパク質発現プラスミドまたは安定細胞株から供給される。7つのvRNAセグメントのみを有するウイルス様粒子(VLP)が放出される。これら粒子は、新鮮な細胞を感染させることができるが、HA vRNAを欠如するため、追加のラウンドの増殖を起こさない。
・感染性ウイルス(>108pfu/mL)は、VLP−1およびVLP−2で共感染させたMDCK細胞では検出されたが、いずれかのVLPで感染させたMDCK細胞では検出されなかった。
・感染性ウイルスは、異なるvRNAを欠如する2つの7セグメントウイルスで細胞を共感染させると生成することができる。
実験1
7つのウイルスRNA(vRNA)の異なるセットを有する2つのVLPを生成した。具体的には、293T細胞を、ウイルスタンパク質を全て発現するプラスミド、および7つのvRNAを発現するプラスミドで形質移入した。
a. VLP−1では、PB2−vRNAが省略されていた。
b. VLP−2では、HA−vRNAが省略されていた。
4つのvRNAの異なるセットを有する2つのVLPを生成した。VLP−4は、PB1 vRNA、PB2 vRNA、PA vRNA、およびHA vRNAを有し、VLP−3は、NP vRNA、NA vRNA、M vRNA、およびNS vRNAを有していた。実験は、上述のように実施した。
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- 本明細書に記載の組成物。
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