JP2009511084A - 機能的インフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ） - Google Patents

機能的インフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ） Download PDF

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Abstract

本発明では、季節的なインフルエンザウイルスのタンパク質、トリインフルエンザウイルスタンパク質、および／または世界的に流行する可能性があるウイルスに由来するインフルエンザウイルスタンパク質を発現する、ならびに／あるいはそれらが含まれているウイルス様粒子（ＶＬＰ）が開示され、そして請求される。本発明には、上記タンパク質が含まれているベクター構築物、上記構築物が含まれている細胞、本発明のＶＬＰが含まれている処方物およびワクチンが含まれる。本発明にはまた、ＶＬＰを作成し、そして脊椎動物に投与する方法も含まれる、これには、季節的なインフルエンザおよびトリインフルエンザ、またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。

Description

本願は、２００５年１０月１８日に出願された仮特許出願第６０／７２７，５１３号、２００６年３月１０日に出願された仮特許出願第６０／７８０，８４７号、２００６年５月１５日に出願された仮特許出願第６０／８００，００６号、２００６年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／８３１，１９６号、２００６年７月２１日に出願された仮とっきょ出願大６０／８３２，１６６号、および２００６年９月１９日に出願された仮特許出願第６０／８４５，４９５号に対する優先権を主張する。これらの全てが、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
（発明の背景）
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のファミリーのメンバーである（概要については、Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｗｅｂｓｔｅｒ，１９９６を参照のこと）。これには、Ａ、Ｂ、およびＣと指定されたインフルエンザウイルスの３つのサブタイプが存在している。インフルエンザのビリオンには、断片化されているマイナスセンスのＲＮＡゲノムが含まれている。インフルエンザのビリオンには以下のタンパク質が含まれる：ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックス（Ｍ１）、プロトンイオン−チャンネルタンパク質（Ｍ２）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢ１）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、および非構造タンパク質２（ＮＳ２）タンパク質。ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、およびＭ２は膜結合型であり、一方、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＳ２はヌクレオカプシド結合タンパク質である。ＮＳ１は、ビリオン粒子に結合していない唯一の非構造タンパク質であるが、これは、インフルエンザに感染した細胞に特異的である。Ｍ１タンパク質は、インフルエンザ粒子の中に最も豊富に存在しているタンパク質である。ＨＡタンパク質とＮＡタンパク質は、ウイルスの付着、および細胞へのウイルス粒子の浸潤に関与しているエンベロープ糖タンパク質であり、そしてウイルスの中和および防御免疫のための主要な免疫優性エピトープの供給源である。ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質はいずれも、予防的なインフルエンザワクチンの最も重要な成分と考えられている。
インフルエンザウイルス感染は、シアル酸が含まれている細胞性受容体（糖タンパク質および糖脂質）に対するビリオン表面のＨＡタンパク質の結合によって開始される。ＮＡタンパク質は、シアル酸受容体のプロセシングを媒介し、そして細胞へのウイルスの浸潤は、ＨＡ依存性受容体によって媒介されるエンドサイトーシスに依存する。インフルエンザのビリオンが含まれているインターナライズされたエンドソームの酸性の範囲（ｃｏｎｆｉｎｅ）においては、ＨＡタンパク質は立体構造の変化を受け、それにより、ウイルスと宿主の細胞膜との融合、続いて、ウイルスの脱殻およびヌクレオカプシド結合リボ核タンパク質（ＲＮＰ）に由来するＭ１タンパク質のＭ２によって媒介される放出が導かれる。これは、ウイルスＲＮＡの合成のために細胞核の中に移動する。ＨＡ分子に対する抗体は、ウイルスの感染性を中和することによってウイルス感染を予防することができる。一方、ＮＡタンパク質に対する抗体は、ウイルスの複製の初期段階に対するそれらの作用を媒介する。
不活化させられたＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスワクチンは、現在、非経口投与用の３価のワクチンとして認可されている。これらの３価のワクチンは、胚含有鶏卵の尿膜腔の中で１価の塊として生産され、ｒａｔｅ ｚｏｎａｌ遠心分離またはカラムクロマトグラフィーによって精製され、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトンで不活化させられ、そして定められた年に人の集団の間で流行するＡ型インフルエンザウイルス株とＢ型インフルエンザウイルス株の２つの株の混合物として処方される。利用することができる市販されているインフルエンザワクチンは、全ウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）（ＷＶ）ワクチンまたはサブビリオン（ＳＶ；分割されたまたは精製された表面抗原）ウイルスワクチンである。ＷＶワクチンには、完全な、不活化させられたビリオンが含まれる。トリ−ｎ−ブチルホスフェート（Ｆｌｕ−Ｓｈｉｅｌｄ，Ｗｙｅｔｈ−Ｌｅｄｅｒｌｅ）のような溶媒で処理されたＳＶワクチンには、ほとんど全てのウイルスの構造タンパク質と、ウイルスエンベロープのいくつかが含まれる。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で可溶化させられたＳＶワクチン（Ｆｌｕｚｏｎｅ，Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ；Ｆｌｕｖｉｒｉｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）には、主にＨＡモノマー、ＮＡ、およびＮＰの凝集物が含まれるが、残りの量の他のウイルスの構造タンパク質も存在する。生存している弱毒化させられた低温適応性のウイルスワクチン（ＦｌｕＭｉｓｔ，ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）は、５〜１７歳の健常な小児および若者、ならびに１８〜４９歳の健常な成人において、能動免疫法、ならびにＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患の予防に適応される鼻腔内に投与されるワクチンとして商業的な使用がＦＤＡによって最近承認された、承認された製品（ｇｒａｎｔｅｄ ｍａｒｋｅｔｉｎｇ）である。
いくつかの組み換え産物が、組み換え体であるインフルエンザワクチンの候補として開発されている。これらのアプローチは、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の発現、生産、および精製に焦点があてられており、これには、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９９９；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，１９９９；Ｔｒｅａｎｏｒら、１９９６）、ウイルスベクター（Ｐｕｓｈｋｏら、１９９７；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら、１９９９）およびＤＮＡワクチン構築物（Ｏｌｓｅｎら、１９９７）を使用するこれらのタンパク質の発現が含まれる。
Ｃｒａｗｆｏｒｄら、（１９９９）では、バキュロウイルスに感染させられた昆虫細胞の中で発現させられたインフルエンザＨＡが、トリＨ５インフルエンザサブタイプおよびＨ７インフルエンザサブタイプによって引き起こされる致死性のインフルエンザ疾患を予防することができることが明らかにされている。同時に、別のグループによっては、バキュロウイルスによって発現させられたインフルエンザのＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質によって、従来のワクチンによって誘導される免疫応答よりも優れた免疫応答が動物において誘導されることが明らかにされている（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、１９９９）。バキュロウイルスによって発現させられたウマインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの免疫原性と効力が、相同ＤＮＡワクチンの候補に対して比較された（Ｏｌｓｅｎら、１９９７）。まとめると、データは、インフルエンザウイルスでのチャレンジに対する高い程度の防御を組み換え体であるＨＡタンパク質またはＮＡタンパク質を用いて、様々な実験的アプローチを使用して様々な動物モデルにおいて誘導することができたことを示している。
Ｌａｋｅｙら（１９９６）は、バキュロウイルスから誘導されたインフルエンザＨＡワクチンが、第Ｉ相用量増加安全性試験においてヒトボランティアにおいて十分な耐用性があり、免疫原性であることを示した。しかし、ＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質からなるインフルエンザワクチンの数回の用量がワクチン接種されたヒトボランティアにおいていくつかの臨床機関で行われた第ＩＩ相試験による結果は、組み換え体であるサブユニットタンパク質ワクチンは防御免疫を誘発しなかったことを示した［Ｇ．Ｓｍｉｔｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍ．Ｐｅｒｄｕｅ，ＵＳＤＡ，Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ］。これらの結果は、感染性のビリオンのＨＡおよびＮＡペプロマー（ｐｅｐｌｏｍｅｒ）の表面上に提示される立体構造エピトープが、中和抗体および防御免疫の誘発に重要であることを示していた。
組み換え体インフルエンザワクチンの候補の中に他のインフルエンザタンパク質を含めることに関して、多数の実験が行われており、これには、インフルエンザ核タンパク質、ＮＰが、単独で、またはＭ１タンパク質との組み合わせにおいて関与している実験が含まれる（Ｕｌｍｅｒら、１９９３；Ｕｌｍｅｒら、１９９８；Ｚｈｏｕら、１９９５；Ｔｓｕｉら、１９９８）。これらのワクチン候補（これは、擬似不変内部ビリオンタンパク質からなる）は、主に細胞性（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞の両方）である、広範な免疫力を誘発した。これらの実験には、ＤＮＡベクターまたはウイルスゲノムベクターの使用が含まれていた。比較的多量のＤＮＡの注射が必要であった。なぜなら、低い用量のＤＮＡを用いた実験の結果はほとんど防御を示さなかったか、または全く防御を示さなかったからである（Ｃｈｅｎら、１９９８）。したがって、さらに別の前臨床試験および臨床試験が、インフルエンザＮＰおよびＭ１が関与しているそのようなＤＮＡをベースとするアプローチが安全であり、有効であり、そして持続性であるかどうかを評価するために必要であり得る。
最近、インフルエンザについてのより有効なワクチンを開発する試みにおいて、粒子状タンパク質が、インフルエンザＭ２タンパク質エピトープのキャリアとして使用された。Ｍ２をベースとするワクチンの開発についての理論的根拠は、動物実験においては、インフルエンザに対する防御免疫がＭ２タンパク質によって誘発されたことである（Ｓｌｅｐｕｓｈｋｉｎら、１９９５）。Ｎｅｉｒｙｎｃｋら、（１９９９）は、ＨＢｃＡｇキャプシド様粒子の表面上のＭ２エピトープ（単数または複数）に曝すためのＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）とのアミノ末端融合パートナーとして、２３アミノ酸長のＭ２膜貫通ドメインを使用した。しかし、全長のＭ２タンパク質とＭ２−ＨＢｃＡｇ ＶＬＰのいずれもがマウスにおいて検出可能な抗体および防御を誘導したという事実にもかかわらず、将来のインフルエンザワクチンがもっぱらＭ２タンパク質をベースとするとはなりそうにはない。なぜなら、Ｍ２タンパク質はビリオンあたり低コピー数で存在し、抗原性が弱く、遊離のインフルエンザビリオンに結合した抗体を誘発することができず、そして細胞受容体に対するウイルスの結合をブロックすること（すなわち、ウイルスの中和）ができないからである。
これまでの研究によって表面インフルエンザ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡがインフルエンザウイルスに対する防御免疫の誘発についての主な標的であり、そしてＭ１はインフルエンザに対する細胞性免疫についての保存されている標的を提供することが示されたので、新しいワクチン候補には、タンパク質の巨大分子粒子（例えば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ））としてのこれらのウイルス抗原が含まれ得る。さらに、これらのインフルエンザ抗原を有している粒子は立体構造エピトープを提示することができ、これは、インフルエンザウイルスの複数の株に対して中和抗体を誘発する。
いくつかの実験によって、組み換え体インフルエンザタンパク質が、哺乳動物発現プラスミドまたはバキュロウイルスベクターを使用する細胞培養物中でＶＬＰになるように自己アセンブリすることができることが明らかにされている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。非特許文献１によっては、インフルエンザＶＬＰの効率的な形成がウイルスタンパク質の発現レベルに依存していることが明らかにされた。非特許文献２によっては、クローニングされたｃＤＮＡに完全に由来する感染性のインフルエンザウイルス様粒子を作成するための、哺乳動物発現プラスミドをベースとするシステムが確立された。非特許文献３によっては、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、およびＭ２遺伝子を同時発現する組み換え体であるバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞中でのインフルエンザＶＬＰの形成が報告された。これらの実験により、インフルエンザビリオンタンパク質は、真核生物細胞の中での同時発現されると自己アセンブリし得ることが明らかとなった。
Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓら、（１９９９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０，１６３５−１６４５ Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｇら、（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，５４７−５５１ Ｌａｔｈａｍ，Ｔ．，およびＧａｌａｒｚａ，Ｊ．Ｍ．（２００１)Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，６１５４−６１６５
発明の要旨
本発明により、インフルエンザウイルスＭ１タンパク質とインフルエンザウイルスＨ５およびＮ１ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質が含まれているウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。１つの実施形態においては、Ｍ１タンパク質は、Ｈ５およびＮ１タンパク質と比較して、異なるインフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態においては、上記Ｈ５またはＮ１は、Ｈ５Ｎ１クレード１のインフルエンザウイルスに由来する。
本発明によってはまた、ＶＬＰの形成を可能にする条件下で、インフルエンザＨ５タンパク質およびＮ１タンパク質とインフルエンザＭ１タンパク質をコードする１つ以上の核酸が含まれている真核生物細胞から発現させられたＶＬＰも提供される。１つの実施形態においては、上記真核生物細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物の細胞から選択される。他の実施形態においては、上記真核生物細胞は昆虫細胞である。
本発明によってはまた、ヒトまたは動物に投与されると、インフルエンザ感染に対して防御性である中和抗体を上記ヒトまたは動物の中で誘発するＶＬＰも提供される。
本発明によってはまた、有効用量の本発明のＶＬＰが含まれている免疫原性組成物も提供される。１つの実施形態においては、上記組成物にはアジュバントが含まれる。
本発明によってはまた、有効用量の本発明のＶＬＰが含まれているワクチンも提供される。１つの実施形態においては、上記ワクチンには、少なくとも第２のＶＬＰが含まれる。これには、異なるインフルエンザ株に由来するＨＡとＮＡが含まれる。別の実施形態においては、上記ワクチンにはアジュバントが含まれる。
本発明によってはまた、動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する方法も提供される。この方法には、少なくとも１有効用量の、本発明のＶＬＰが含まれているワクチンを投与する工程が含まれる。１つの実施形態においては、上記ワクチンは、動物に対して経口で、皮内で、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される。
本発明によってはまた、動物用のワクチンの調製のための本発明のＶＬＰの使用も提供される。ここでは、ワクチンによって、上記動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力が誘導される。
本発明によってはまた、本発明のＶＬＰを作成する方法も提供される。この方法には、真核生物細胞の中でＭ１、ＨＡ、およびＮＡを発現させる工程が含まれる。
本発明によっては、インフルエンザＶＬＰが含まれているワクチンが提供される。ここでは、上記ＶＬＰには、インフルエンザＭ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質が含まれる。ここでは、上記ワクチンによって、ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力が誘導される。１つの実施形態においては、上記ワクチンにはインフルエンザＶＬＰが含まれる。ここでは、ＶＬＰは、原則としてインフルエンザＭ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質から構成される。ここでは、上記ワクチンによって、ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力が誘導される。別の実施形態においては、上記ワクチンには、インフルエンザＶＬＰが含まれる。ここでは、上記ＶＬＰには、インフルエンザＭ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質が含まれる。ここでは、上記ワクチンによって、ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力が誘導される。
本発明によってはまた、インフルエンザＶＬＰの使用も提供される。ここでは、上記ＶＬＰには、ワクチンの調製のためのインフルエンザＭ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質が含まれる。ここでは、ワクチンによって、ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力が誘導される。
したがって、本発明により、（ａ）第１のインフルエンザウイルスＭ１タンパク質と（ｂ）さらなる構造タンパク質（これには、第２またはそれ以上のインフルエンザウイルスＭ１タンパク質；第１、第２、またはそれ以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質；第１、第２、またはそれ以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質；および第１、第２、またはそれ以上のインフルエンザウイルスＭ２タンパク質が含まれ得る）が含まれている、巨大分子タンパク質構造が提供される。さらに別の構造タンパク質が第２またはそれ以上のインフルエンザウイルスＭ１タンパク質に由来しない場合には、グループの両方のメンバーまたは全てのメンバー（例えば、第１および第２のインフルエンザＭ２ウイルスタンパク質）が含まれる。このように、サブウイルス粒子、ＶＬＰ、もしくはカプソメア構造が含まれている機能性のインフルエンザタンパク質構造、またはその一部、ワクチン、多価ワクチン、および本発明の方法によって生産されたインフルエンザウイルス構造タンパク質から原則として構成されているそれらの混合物が提供される。特に好ましい実施形態においては、インフルエンザ巨大分子タンパク質構造には、野生型ウイルスに由来する合成断片としてクローニングされたインフルエンザウイルス遺伝子の遺伝子産物である、インフルエンザウイルスＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質が含まれる。
巨大分子タンパク質構造にはまた、さらに別の構造タンパク質、例えば、核タンパク質（ＮＰ）、非インフルエンザ（ｎｏｎｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルス以外の種に由来する膜タンパク質、およびインフルエンザではない供給源に由来する膜タンパク質（これは、トリまたは哺乳動物起源、およびインフルエンザウイルスの様々なサブタイプ（インフルエンザウイルスサブタイプＡおよびサブタイプＢが含まれる）に由来する）も含まれ得る。本発明には、キメラである巨大分子タンパク質構造が含まれ得る。これには、インフルエンザウイルスによっては生産されない部分を有している少なくとも１つのタンパク質の一部が含まれる。
インフルエンザの予防は、組み換え体である構築物から宿主細胞の中で自己アセンブリし得る巨大分子タンパク質構造を提供することによって得られ得る。本発明の巨大分子タンパク質構造は、ＨＡおよびＮＡタンパク質上に立体構造エピトープを提示する同型または異型のウイルス様粒子（ＶＬＰ）になるように自己アセンブリする能力を有しており、これは、防御性である中和抗体を誘発する。組成物はワクチン組成物であり得、これにはまた、担体もしくは希釈剤および／またはアジュバントも含まれる。機能性のインフルエンザＶＬＰは、機能性のインフルエンザＶＬＰに１つ以上のウイルス株またはタイプに由来するＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質が含まれているかどうかに応じて、インフルエンザウイルスの１つ以上の株またはタイプに対する中和抗体を誘発する。ワクチンには、野生型インフルエンザウイルスタンパク質であるインフルエンザウイルスタンパク質が含まれ得る。好ましくは、インフルエンザＶＬＰが含まれている構造タンパク質、またはその一部は、野生型インフルエンザウイルスの様々な株に由来し得る。インフルエンザワクチンは１つ以上のインフルエンザウイルス株またはタイプに対する防御免疫を誘発するために、ヒトまたは動物に投与され得る。
本発明の巨大分子タンパク質構造は、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示し得る。
本発明により、Ｍ１、ＨＡ、およびインフルエンザウイルスに由来する少なくとも１つの構造タンパク質が含まれている、インフルエンザ構造遺伝子をコードする組み換え体構築物を構築することによって、インフルエンザに由来するＶＬＰを生産するための方法が提供される。組み換え体である構築物は、組み換え体であるバキュロウイルスで適切な宿主細胞をトランスフェクトする、感染させる、または形質転換するために使用される。宿主細胞は、Ｍ１、ＨＡ、およびインフルエンザウイルスに由来する少なくとも１つの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で培養され、そしてＶＬＰは宿主細胞中で形成させられる。機能性のインフルエンザＶＬＰが含まれている感染させられた細胞は細胞媒体が回収され、そしてＶＬＰが精製される。本発明はまた、第２のインフルエンザタンパク質をコードする第２の組み換え体構築物を用いて、宿主細胞を同時トランスフェクトする、同時感染させる、または同時形質転換し、それによって、ＶＬＰの中に第２のインフルエンザタンパク質を取り込ませるさらなる工程を特徴とする。そのような構造タンパク質は、インフルエンザウイルスに由来し得（ＮＡ、Ｍ２、およびＮＰが含まれる）、そして少なくとも１つの構造タンパク質はトリまたは哺乳動物起源に由来する。構造タンパク質は、インフルエンザウイルスサブタイプＡおよびサブタイプＢであり得る。本発明にしたがうと、宿主細胞は真核生物細胞であり得る。加えて、ＶＬＰはキメラＶＬＰであり得る。
本発明はまた、宿主細胞の中にインフルエンザウイルス遺伝子をコードする組み換え体構築物を導入すること、および組み換え体であるインフルエンザウイルスタンパク質の機能性の同型または異型ＶＬＰへの細胞の中での自己アセンブリを可能にすることによって、インフルエンザＶＬＰが含まれている製剤原料を処方する方法を特徴とする。インフルエンザＶＬＰが単離され、精製され、そしてインフルエンザＶＬＰが含まれている薬物原料が処方される。薬物原料にはさらに、アジュバントが含まれ得る。加えて、本発明により、そのようなインフルエンザＶＬＰが含まれている薬物材料を脂質小胞（すなわち、非イオン性の脂質小胞）と混合することによる、薬物材料を処方するための方法が提供される。したがって、機能性の同型または異型ＶＬＰが、感染させられた細胞から包まれた（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）粒子として芽を出し得る。発芽したインフルエンザＶＬＰは、限外濾過またはカラムクロマトグラフィーによって、薬物材料として単離されそして精製され得、そして単独で処方され得るか、またはワクチンのような薬物産物としてのＮｏｖａｖａｘ，Ｉｎｃの製品であるＮｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）のように、単独でまたはアジュバントとともに処方される。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）（これにより、高い免疫学的効果が提供される）はさらに、引用により本明細書中に組み入れられる米国特許第４，９１１，９２８に記載されている。
本発明により、脊椎動物においてインフルエンザウイルス感染に対する体液性免疫を検出するための方法が提供される。この方法は、インフルエンザウイルスの巨大分子構造の少なくとも１つの立体構造エピトープを有している有効な抗体検出量のインフルエンザウイルスタンパク質が含まれている試験試薬を提供することによる。試験試薬は、インフルエンザウイルス感染について試験される脊椎動物に由来する体液試料と接触させられる。試料中に含まれるインフルエンザウイルス特異的抗体は、抗原−抗体複合体を形成するように、インフルエンザウイルスの巨大分子構造の立体構造エピトープに結合させることができる。複合体は、結合していない複合体から分離され、そして検出できるように標識された免疫グロブリン結合試薬と接触させられる。複合体に結合させられた検出できるように標識された免疫グロブリン結合試薬の量が決定される。
インフルエンザウイルスは、検出可能なシグナルを生産する標識を有しているか、または検出できるように標識された試薬に結合させられた、インフルエンザウイルスの粒子の少なくとも１つの立体構造エピトープに対して特異性を有している抗体を提供することによって、ウイルスに感染していると予想される動物またはヒト由来の検体の中で検出することができる。検体は抗体と接触させられ、そして抗体がインフルエンザウイルスに結合させられる。検体中のインフルエンザウイルスの存在は、検出可能な標識によって決定される。
本発明により、有効量の本発明の組成物を脊椎動物に投与することにより、処置、予防のための、および防御免疫応答を生じさせるための方法が提供される。
あるいは、インフルエンザＶＬＰ薬物材料は、インフルエンザウイルスの構造試験および臨床的な診断アッセイに使用される研究室用の試薬として処方され得る。本発明によってはまた、有効量の本発明の組成物を投与することによりインフルエンザウイルスを処置するためのキット、および使用のための説明書も提供される。
本発明によってはまた、脊椎動物において病的状態または死を引き起こす可能性がある、トリインフルエンザウイルスに由来するＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質が含まれているＶＬＰも提供される。１つの実施形態においては、上記ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質は、Ａ型トリインフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態においては、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群より選択され、そしてＮＡは、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９からなる群より選択される。さらなる実施形態においては、上記ＨＡタンパク質とＮＡタンパク質は、それぞれ、Ｈ５およびＮ１である。別の実施形態においては、上記ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質は、それぞれ、Ｈ９およびＮ２である。別の実施形態においては、上記ＨＡおよび／またはＮＡは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示す。１つの実施形態においては、ＶＬＰは、原則として、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質から構成される。すなわち、これらのインフルエンザタンパク質しか、ＶＬＰ中には実質的には存在しない。
本発明によってはまた、ＶＬＰを生産する方法も提供される。この方法には、トリインフルエンザウイルスタンパク質をコードするベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトする工程、および上記トリインフルエンザウイルスタンパク質を、ＶＬＰを形成させるための条件下で発現させる工程が含まれる。１つの実施形態においては、この方法には、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１インフルエンザタンパク質だけをコードする組み換え体ＤＮＡ分子で宿主細胞をトランスフェクトする工程が含まれる。
本発明にはまた、脊椎動物において病的状態または死を引き起こす可能性がある、トリインフルエンザウイルスに由来するＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質が含まれているＶＬＰが含まれている抗原性処方物も含まれる。別の実施形態においては、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群より選択され、そしてＮＡは、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９からなる群より選択される。さらなる実施形態においては、上記ＨＡタンパク質とＮＡタンパク質は、それぞれ、Ｈ５およびＮ１である。別の実施形態においては、上記ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質は、それぞれ、Ｈ９およびＮ２である。さらなる実施形態においては、上記抗原性処方物は、被験体に対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される。
本発明によってはさらに、トリインフルエンザウイルスに対して脊椎動物を予防接種する方法が提供される。この方法には、上記脊椎動物に、トリインフルエンザウイルスに由来するＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質が含まれているＶＬＰの防御誘導量を投与する工程が含まれる。
本発明にはまた、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法も含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。１つの実施形態においては、上記ＶＬＰは、原則として、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。別の実施形態においては、上記ＶＬＰには、インフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質はＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。別の実施形態においては、上記ＨＡおよび／またはＮＡは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示す。
本発明にはまた、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量のトリインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。１つの実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰは、原則として、トリＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザＬＶＰにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質はトリＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。
本発明にはさらに、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量の季節的なインフルエンザのＶＬＰを投与する工程が含まれる。１つの実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰは、原則として、季節的なＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は季節的なＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。
本発明にはさらに、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量の少なくとも１つの季節的なインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。１つの実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰには、季節的なインフルエンザのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれる。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰは、原則的には、季節的なインフルエンザのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。
本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な防御性の免疫応答を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。
本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的に防御性の細胞性免疫応答を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。
本発明にはさらに、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導するワクチンを処方する方法が含まれる。この方法には、上記処方物に対して、有効用量のインフルエンザＶＬＰを添加する工程が含まれる。１つの実施形態においては、上記インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力は、１用量で誘導される。別の実施形態においては、上記インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力は、複数回の用量で誘導される。
本発明にはさらに、インフルエンザＶＬＰが含まれているワクチンが含まれる。ここでは、上記ワクチンは、被験体に投与されると、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する。１つの実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰは、トリインフルエンザＶＬＰである。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰは季節的なインフルエンザのＶＬＰである。
本発明にはさらに、インフルエンザＶＬＰが含まれている抗原性処方物が含まれる。ここでは、上記ワクチンは、被験体に投与されると、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する。１つの実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰはトリインフルエンザＶＬＰである。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰは季節的なインフルエンザのＶＬＰである。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用される場合は、用語「バキュロウイルス」はバキュロウイルス科としても知られており、節足動物のエンベロープを有しているＤＮＡウイルスのファミリーを意味する。そのうちの複数メンバーは、昆虫細胞培養物中で組み換え体タンパク質を生産させるための発現ベクターとして使用することができる。ビリオンには、環状のスーパーコイル状の二本鎖のＤＮＡ分子が含まれている１つ以上の桿状のヌクレオカプシドが含まれる（Ｍｒ ５４×１０６〜１５４×１０６）。ベクターとして使用されるウイルスは、通常は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＮＶＰ）である。導入された遺伝子の発現は、その中ではウイルスが感染させられた細胞の中に埋め込まれている大きな核内封入体の多面体タンパク質成分の発現を通常制御する強いプロモーターの制御下にある。
本明細書中で使用される場合には、用語「〜に由来する」は起源または供給源を意味し、そしてこれには、自然界に存在している分子、組み換え体である分子、精製されていない分子、または精製された分子が含まれ得る。本発明のタンパク質および分子は、インフルエンザ分子またはインフルエンザ以外の分子に由来し得る。
本明細書中で使用される場合には、用語「第１の」インフルエンザウイルスタンパク質、すなわち、第１のインフルエンザウイルスＭ１タンパク質は、Ｍ１、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２のようなタンパク質を意味し、これは、インフルエンザウイルスの特定の株に由来する。第１のインフルエンザウイルスの株またはタイプは、第２のインフルエンザウイルスタンパク質の株またはタイプとは異なる。したがって、「第２の」インフルエンザウイルスタンパク質、すなわち、第２のインフルエンザウイルスＭ１タンパク質は、第１のインフルエンザウイルスタンパク質とは異なる株またはタイプである第２のインフルエンザウイルス株に由来する、Ｍ１、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２のようなタンパク質を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「ヘマグルチニン活性」は、ＨＡ含有タンパク質、ＶＬＰ、またはその一部の、赤血球細胞（赤血球）に結合し、そしてそれらを凝集させる能力を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「ノイラミニダーゼ活性」は、ＮＡ含有タンパク質、ＶＬＰ、またはその一部の、フェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）のようなタンパク質が含まれている基質からシアル酸残基を切断する酵素活性を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「異型（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ）」は、ウイルスの１つ以上の異なるタイプまたは株を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「同型（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ）」は、ウイルスの１つのタイプまたは株を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「巨大分子タンパク質構造」は、１つ以上のタンパク質の構造または配置を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「多価」ワクチンは、インフルエンザウイルスの複数のタイプまたは株に対するワクチンを意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「インフルエンザ以外の」は、インフルエンザウイルス由来ではないタンパク質または分子を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「ワクチン」は、病原体に対する抗体の形成または免疫力を誘導するために使用される、死滅させられたかもしくは弱められた病原体の調製、または誘導された抗原性決定基の調製を意味する。ワクチンは、疾患（例えば、インフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザ）に対する免疫力を提供するために投与される。本発明により、免疫原性であるワクチン組成物が提供され、そして防御が提供される。加えて、用語「ワクチン」はまた、脊椎動物が防御免疫（すなわち、感染に付随する疾患の重篤度を低くする免疫力）を生じるように投与される、免疫原（例えば、ＶＬＰ）の懸濁液または溶液を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「実質的な免疫力」は、本発明のＶＬＰが脊椎動物に投与された場合に、上記脊椎動物においてインフルエンザ感染の予防、インフルエンザ感染の改善、または上記脊椎動物におけるインフルエンザウイルス感染に関する少なくとも１つの症状の軽減を生じる、上記脊椎動物の免疫システムの誘導が存在する免疫応答を意味する。実質的な免疫力はまた、哺乳動物における≧４０のヘマグルチニン阻害（ＨＩ）力価をも意味し得、ここでは、本発明のＶＬＰが投与され、そして免疫応答が誘導される。
本明細書中で使用される場合は、用語「アジュバント」は、処方物中で特異的な免疫原（例えば、ＶＬＰ）と組み合わせて使用された場合に、得られる免疫応答を増進するか、または別の方法で変更するもしくは変化させる化合物を意味する。免疫応答の変更には、抗体および細胞性の免疫応答のいずれかまたは両方の特異性の強化または拡大が含まれる。免疫応答の変更はまた、特定の抗原特異的免疫応答の減少または抑制をも意味し得る。
本明細書中で使用される場合は、用語「免疫促進剤」は、体自身の化学的伝達物質（サイトカイン）を介して免疫応答を増進する化合物を意味する。これらの分子には、免疫賦活活性、免疫増強活性、およびプロ炎症活性を有している様々なサイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（例えば、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；ならびに、他の免疫賦活分子（例えば、）マクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２など）が含まれる。免疫促進剤分子は、インフルエンザＶＬＰと同じ処方物の中で投与することができ、また、別々に投与することもできる。タンパク質、またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを、免疫賦活効果を生じるように投与することができる。
本明細書中で使用される場合は、「有効用量」は、一般的には、免疫力を誘導するため、インフルエンザウイルス感染を防ぐおよび／もしくは改善するため、またはインフルエンザ感染の少なくとも１つの症状を軽減するため、ならびに／あるいは、ＶＬＰのさらなる用量の効力を高めるために十分な本発明のＶＬＰの量を意味する。有効用量は、インフルエンザ感染の発症を遅らせるかまたは最少にするために十分なＶＬＰの量を意味し得る。有効用量はまた、インフルエンザ感染の処置または管理において治療上の利点を提供するＶＬＰの量をも意味し得る。さらに、有効用量は、本発明のＶＬＰに関する、単独での、または他の治療薬との組み合わせにおける量であり、これによって、インフルエンザウイルス感染の処置または管理において治療上の利点が提供される。有効用量はまた、その後のインフルエンザウイルスへの暴露に対して、被験体（例えば、ヒト）自身の免疫応答を増進するために十分な量でもあり得る。免疫力のレベルは、例えば、中和分泌抗体および／または血清抗体の量を測定することによって、例えば、プラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着、または中和試験（ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）によってモニターすることができる。ワクチンの場合には、「有効用量」は、疾患を防ぐか、または症状の重篤度を低くする用量である。
本明細書中で使用される場合は、用語「トリインフルエンザウイルス」は、主に鳥類において見られるが、ヒトまたは他の動物にも感染することができるインフルエンザウイルスを意味する。いくつかの例においては、トリインフルエンザウイルスは、一人のヒトから別のヒトに感染または拡散し得る。ヒトに感染するトリインフルエンザウイルスは、インフルエンザの世界的流行、すなわち、ヒトにおいて疾患状態および／または死を引き起こす可能性がある。世界的流行は、新しいインフルエンザウイルス株（ヒトが生まれつきの免疫力を有していないウイルス）が出現し、個々の地域を越えて拡散し、おそらくは地球全体に拡散し、そして瞬時に多くのヒトに感染すると起こる。
本明細書中で使用される場合は、用語「季節的なインフルエンザウイルス」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅによって行われた疫学的調査に基づいて所定のインフルエンザの季節についてヒトの集団の中で流行する（ｐａｓｓ）と決定されたインフルエンザウイルス株を意味する。これらの疫学的試験およびいくつかの単離されたインフルエンザウイルスは、詳細な試験のために４つのＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）参照試験所（そのうちの１つは、ＡｔｌａｎｔａのＣａｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）にある）のうちの１つに送られる。これらの試験所では、現在のワクチンに対して作成された抗体が流行しているウイルスおよび新規のｆｌｕウイルスに対してどの程度十分に反応するかが試験される。この情報は、ｆｌｕ活性についての情報とともにまとめられ、そして米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）の諮問委員会と、ＷＨＯ会議に提示される。これらの会議により、その後の秋および冬のためのｆｌｕワクチンに入れられる３種類のウイルス（Ａ型インフルエンザウイルスの２つのサブタイプとＢ型インフルエンザウイルスの１つのサブタイプ）の選択が行われる。選択は、北半球では２月に、南半球では９月に行われる。通常、ワクチンの中の３種類の株のうちの１つまたは２つは毎年変えられる。
本明細書中で使用される場合は、用語「実質的に防御性の抗体応答」は、脊椎動物（例えば、ヒト）によって示される、インフルエンザ感染を防ぐかもしくは改善する、またはその少なくとも１つの症状を軽減する、インフルエンザウイルスに対する抗体によって媒介される免疫応答を意味する。本発明のＶＬＰは、抗体（例えば、インフルエンザウイルスの細胞への侵入をブロックする、上記インフルエンザの複製をウイルスに結合することによってブロックする、ならびに／または宿主細胞を感染および崩壊から防御する中和抗体）の生産を刺激することができる。
本明細書中で使用される場合は、用語「実質的に防御性の細胞応答」は、脊椎動物（例えば、ヒト）によって示される、インフルエンザ感染を防ぐかもしくは改善する、またはその少なくとも１つの症状を軽減する、Ｔ−リンパ球および／または他の白血球によって媒介されるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を意味する。細胞性の免疫の１つの重要な態様には、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答が含まれる。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によってコードされ、そして細胞の表面上で発現されるタンパク質と会合した状態で提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の崩壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を助け、誘導し、そして促進する。細胞性免疫の別の態様には、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答が含まれる。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上のＭＨＣ分子と会合した状態でペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能の刺激を助け、そしてその活性の焦点をあてるように作用する。「細胞性の免疫応答」はまた、活性化Ｔ細胞、および／または他の白血球細胞によって生産されるサイトカイン、ケモカイン、および他のそのような分子（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞に由来する分子が含まれる）の生産をも意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「広い集団における（ｉｎ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｗｉｄｅ ｂａｓｉｓ）実質的な免疫力」は、集団の中の複数の個体に対して投与された本発明のＶＬＰの結果としての免疫力を意味する。上記集団の中の上記個体の免疫力は、上記個体においてインフルエンザ感染の予防、改善、または上記個体のインフルエンザウイルス感染に関連する少なくとも１つの症状の軽減、ならびに上記集団の他のものに対する上記インフルエンザウイルスの拡散の予防を生じる。用語集団は、個体のグループ（例えば、学童、高齢者、健常な個体など）として定義され、そしてこれには、幾何学的領域（例えば、特定の市、学校、近隣、職場、国、州など）が含まれ得る。
本明細書中で使用される場合は、用語「抗原性処方物」または「抗原性組成物」は、脊椎動物（特に、鳥類または哺乳動物）に投与されると免疫応答を誘導するであろう調製物を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「脊椎動物」または「被験体」または「患者」は、ｃｏｒｄａｔａ亜門（ヒトおよび他の霊長類（ヒト以外の霊長類（例えば、チンパンジー、および他の類人猿およびサル種）が含まれるが、これらに限定はされない））の任意のメンバーを意味する。家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）；家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ）である哺乳動物（例えば、イヌおよび猫）；実験用動物（齧歯類（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）が含まれる）；鳥類（家畜である鳥類、野生の鳥類、および競技用の鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽である鳥類、アヒル、ガチョウなど）が含まれる）もまた、限定ではない例である。用語「哺乳動物」および「動物」はこの定義に含まれる。生体である個体および生まれたばかりの個体が含まれるように意図される。
インフルエンザは、最適条件下でも６０〜８０％の有効性しかない特異的な不活化されたウイルスワクチンの有用性にもかかわらず、伝染する公衆衛生の懸念がある。これらのワクチンが有効であれば、疾病は通常はウイルス感染を防ぐことによって回避される。度重なる抗原性の差（抗原性のシフトおよび抗原性のドリフト）の結果として、ワクチンがうまくいかないことが起こり得る。例えば、トリＡ型インフルエンザウイルスＨ９Ｎ２は、ブタにおいてはヒトＡ型インフルエンザウイルスＳｙｄｎｅｙ／９７（Ｈ２Ｎ２）と一緒に流行して、世界的に流行する可能性のある新しいヒトインフルエンザウイルス株の遺伝的混ぜ合わせおよび出現を導く（Ｐｅｉｒｉｓら、２００１）。そのような抗原性のシフトの事象においては、現在のワクチンは適切な防御は提供できないであろう。
インフルエンザワクチンプログラムが十分ではないことについての別の理由は、現在のワクチンによって引き起こされる免疫力の持続期間が比較的短いことである。インフルエンザの感染対策のさらなる不適切さは、幼い小児、高齢者および市販の認可されている不活化ウイルスインフルエンザワクチンの製造に使用される卵の成分に対してアレルギーを有しているヒトにおけるワクチンの反応生成性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）と副作用の理由から、現在のワクチンの使用の制限に反映される。
加えて、不活化インフルエンザウイルスワクチンには、多くの場合には、ＨＡおよびＮＡの立体構造エピトープは含まれないか、または、中和抗体を誘発し、そして疾患に対する防御において主要な役割を果たす変化させられたＨＡおよびＮＡの立体構造エピトープが含まれる。したがって、不活化ウイルスワクチン、ならびにいくつかの組み換え体であるモノマーインフルエンザサブユニットタンパク質ワクチンは不適切な応答を誘導する。一方、巨大分子タンパク質構造（例えば、カプソメア、サブウイルス粒子、および／またはＶＬＰ）には、立体構造エピトープを示す自然界に存在しているタンパク質の複数のコピーが含まれる。これらは、最適なワクチン免疫原性に有利である。
本発明には、トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子の１つのバキュロウイルス発現ベクターへの、単独で、またはタンデムでのクローニング、ならびに、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞の中で機能性でありそして免疫原性である同型の巨大分子タンパク質構造（これには、サブウイルスインフルエンザ粒子とインフルエンザＶＬＰが含まれる）へと自己アセンブリする組み換え体であるインフルエンザ構造タンパク質からなるインフルエンザワクチン候補または試薬の生産が記載される。
本発明には、ヒトインフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７およびＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、およびＮＰ遺伝子のバキュロウイルス発現ベクターへのクローニング、ならびに、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞の中で機能性でありそして免疫原性である同型の巨大分子タンパク質構造（これには、サブウイルスインフルエンザ粒子とインフルエンザＶＬＰが含まれる）へと自己アセンブリするインフルエンザ構造タンパク質からなるインフルエンザワクチン候補または試薬の生産が記載される。
加えて、本発明には、ヒトインフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７およびＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのＨＡと、トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子の１つのバキュロウイルスへのタンデムでのクローニング、ならびに、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞の中で機能性でありそして免疫原性である異型の巨大分子タンパク質構造（これには、サブウイルスインフルエンザ粒子とインフルエンザＶＬＰが含まれる）へと自己アセンブリするインフルエンザ構造タンパク質からなるインフルエンザワクチン候補または試薬の生産が記載される。
本発明のＶＬＰ
本発明のインフルエンザＶＬＰは、インフルエンザウイルスに対するワクチンの調製に有用である。このシステムの１つの重要な特徴は、ＨＡおよび／もしくはＮＡまたは他のウイルスタンパク質のさまざまなサブタイプを有している表面糖タンパク質を置き換え、したがってそれによって毎年の新しいインフルエンザの抗原性変異体のアップデートと、インフルエンザの世界的流行に備えた準備を可能にする能力である。これらの糖タンパク質の抗原性変異体が同定されているので、ＶＬＰは、これらの新しい変異体（例えば、季節的なインフルエンザワクチンについての新しい変異体）を含むようにアップデートすることができる。加えて、世界的流行の可能性があるウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１）に由来する表面糖タンパク質、または世界的流行の可能性がある他のＨＡ、ＮＡの組み合わせを、数十年間ヒトにおいては流行しなかった遺伝子の放出を懸念することなく、ＶＬＰの中に取り込ませることができる。その理由は、ＶＬＰが感染性ではないこと、複製しないこと、および疾患を引き起こし得ないことである。したがって、このシステムにより、毎年新しい候補のインフルエンザワクチンを作成することが可能となり、そして／または、必要である場合にはいつでもインフルエンザの世界的流行に対するワクチンを作成することが可能となる。
１６種類のヘマグルチニン（ＨＡ）と９種類のノイラミニダーゼ（ＮＡ）が存在しており、これらは全て、鳥類の間で広く見られる。野性の鳥類は、主に、全てのＡ型インフルエンザウイルスの自然界でのレザーバーであり、そして他の全ての脊椎動物のあらゆるタイプのＡ型インフルエンザウイルスの供給源であると考えられる。これらのサブタイプは、それらの表面上のヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の変化が原因で異なる。ＨＡタンパク質とＮＡタンパク質の多くの様々な組み合わせが可能である。個々の組み合わせは、様々なタイプのＡ型インフルエンザウイルスを示す。加えて、個々のタイプはさらに、その８個の遺伝子のそれぞれにおいて見られるさまざまな変異に基づいて複数の株に分類することができる。
全ての公知のタイプのＡ型インフルエンザウイルスは鳥類で見ることができる。通常、トリインフルエンザウイルスはヒトには感染しない。しかし、いくつかのトリインフルエンザウイルスは、種のバリアを超える能力を伴っている遺伝子のバリエーションを生じる。そのようなウイルスは、世界的流行を引き起こすことができる。なぜなら、ヒトは、このウイルスに対しては生まれつきの免疫力を有しておらず、ヒトからヒトへと容易に拡散し得るからである。１９９７年には、香港での家禽類におけるトリｆｌｕの大発生の間に、トリインフルエンザはトリからヒトにまで突然飛び越えた。このウイルスは、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１と同定された。このウイルスは、１８人において重篤な呼吸器疾患を引き起こし、そのうちの６人が死亡した。その時から、既知のＨ５Ｎ１感染のさらに多くの症例がヒトの間で世界的に流行した。これらのヒトのうちのおよそ半分が死亡した。
したがって、本発明には、トリインフルエンザウイルス、世界的流行の可能性のあるインフルエンザウイルス、および／または季節的なインフルエンザウイルスに由来するＨＡ、ＮＡ、およびＭ１ヌクレオチドの、発現ベクターへのクローニングが含まれる。本発明にはまた、機能的なＶＬＰへと自己アセンブリするインフルエンザタンパク質からなるインフルエンザワクチンの候補または試薬の生産も記載される。ウイルスタンパク質の全ての組み合わせは、Ｍ１ヌクレオチドと同時発現されなければならない。
本発明のＶＬＰは、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなるか、または本発明のＶＬＰにはそれらが含まれる。１つの実施形態においては、上記ＶＬＰには、トリ、世界的流行する、および／もしくは季節的なインフルエンザウイルスに由来するＨＡと、トリ、世界的に流行する、および／もしくは季節的なインフルエンザウイルスに由来するＮＡが含まれる。ここでは、上記ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群より選択され、そして上記ＮＡは、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９からなる群より選択される。別の実施形態においては、本発明にはＶＬＰが含まれ、これは原則として、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。上記ＨＡおよびＮＡは、ＨＡおよびＮＡについての上記のリストによるものであり得る。これらのＶＬＰには、さらに別のインフルエンザタンパク質および／またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰにはインフルエンザタンパク質が含まれる。ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡの断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、ＨＡおよび／またはＮＡは、ＶＬＰの表面上に発現された場合には、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性をそれぞれ示し得る。
別の実施形態においては、上記ＶＬＰには、Ｈ５Ｎ１ウイルスのＨＡとＮＡ、およびＭ１タンパク質（Ｍ１タンパク質は同じウイルス株に由来する場合も、またはそうではない場合もある）が含まれる。別の実施形態においては、上記ＶＬＰは、原則として、Ｍ１タンパク質と、Ｈ５Ｎ１ウイルスのＨＡ、ＮＡからなる。これらのＶＬＰには、さらに別のインフルエンザタンパク質および／またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。さらなる実施形態においては、上記ＶＬＰは、Ｍ１タンパク質と、Ｈ５Ｎ１ウイルスのＨＡ、ＮＡからなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、Ｈ５、Ｎ１、およびＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、Ｈ５、Ｎ９、およびＭ１が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、Ｈ４、および／またはＮ１の断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、Ｈ５および／またはＮ１は、ＶＬＰの表面上に発現された場合には、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示し得る。
別の実施形態においては、上記ＶＬＰには、Ｍ１タンパク質、ならびに、Ｈ９Ｎ２ウイルスのＨＡとＮＡが含まれる。別の実施形態においては、上記ＶＬＰは、原則として、Ｈ９Ｎ２ウイルスのＨＡとＮＡ、ならびにＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、さらに別のインフルエンザタンパク質および／またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、上記ＶＬＰは、Ｍ１タンパク質、ならびに、Ｈ９Ｎ２ウイルスのＨＡとＮＡからなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、Ｈ９、Ｎ２、およびＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、Ｈ９、Ｎ２、およびＭ１が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、Ｈ９、および／またはＮ２の断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、Ｈ９および／またはＮ２は、ＶＬＰの表面上に発現された場合には、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示し得る。
別の実施形態においては、上記ＶＬＰには、Ｍ１タンパク質、ならびに、Ｂ型インフルエンザウイルスに由来するＨＡおよびＮＡが含まれる。Ｂ型インフルエンザウイルスは、通常、ヒトだけに見られる。Ａ型インフルエンザウイルスとは異なり、これらのウイルスはサブタイプには分類されない。Ｂ型インフルエンザウイルスは、ヒトにおいて疾患状態および死を引き起こす可能性があるが、一般的には、Ａ型インフルエンザウイルスほど深刻には流行しない。別の実施形態においては、上記ＶＬＰは、原則として、Ｍ１タンパク質、ならびに、Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡからなる。これらのＶＬＰには、さらに別のインフルエンザタンパク質および／またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡの断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、上記ＶＬＰは、Ｍ１タンパク質、ならびに、Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡからなる。別の実施形態においては、ＨＡおよび／またはＮＡは、ＶＬＰの表面上に発現された場合には、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示し得る。
本発明にはまた、本発明のＶＬＰ上で、またはＶＬＰの中で発現させられた上記インフルエンザタンパク質の変異体も含まれる。変異体には、構成要素であるタンパク質のアミノ酸配列の中に変化が含まれ得る。用語「変異体」は、ポリペプチドに関して用いられる場合には、参照配列と比較して１つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を意味する。変異体は、「保存的」変化を有し得、ここでは、置換されたアミノ酸は、類似する構造的または化学的特性を有する（例えば、ロイシンのイソロイシンでの置換）。あるいは、変異体は、「非保存的」変化（例えば、グリシンのトリプトファンでの置換）を有し得る。同様の主要ではないバリエーションにはまた、アミノ酸の欠失または挿入、あるいはそれらの両方が含まれ得る。どのアミノ酸残基を、生物学的または免疫学的活性を失うことなく置換する、挿入する、または欠失させることができるかを決定する指針は、当業者に周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を使用して見出すことができる。
自然界に存在している変異体は、抗原性のドリフトが原因で起こり得る。抗原性のドリフトは、時間と共に頻繁に起こり得るウイルスタンパク質の中での小さな変化である。したがって、特定のｆｌｕウイルス株に感染したヒトは、そのウイルスに対する抗体を生じ、新しいウイルス株が出現すると、もはや古い株に対する抗体は新しいウイルスを認識することができず、再感染が起こり得る。これは、季節ごとにインフルエンザに対する新しいワクチンが存在する理由である。加えて、インフルエンザウイルスにおけるいくつかの変化は、種を飛び越えるインフルエンザを生じる可能性がある。例えば、いくつかのトリインフルエンザウイルスは、種のバリアを飛び越える能力を有している遺伝的バリエーションを生じた。そのようなウイルスは、世界的流行を引き起こす可能性がある。なぜなら、ヒトはそのウイルスに対しては生まれつきの免疫力を有しておらず、ウイルスはヒトからヒトへ容易に拡散することができるからである。インフルエンザタンパク質のこれらの自然界に存在しているバリエーションは、本発明の１つの実施形態である。
本発明に適用することができる分子生物学的技術（クローニング、突然変異、細胞培養など）が記載されている一般的なテキストとしては、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）の合弁会社が挙げられる。これらのテキストには、突然変異誘発、例えば、ＨＡおよび／またはＮＡ分子のクローニングおよび突然変異に関係するベクター、プロモーター、および他の多くの関連トピックスの使用が記載されている。したがって、本発明には、本発明のＶＬＰ上で、またはＶＬＰの中で発現させられたインフルエンザタンパク質の特性を改良するまたは変化させるための、タンパク質の操作、および組み換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用することも含まれる。様々なタイプの突然変異誘発を、変異体ＨＡ、ＮＡ、および／またはＭ１分子を生産しそして／または単離するために、ならびに／あるいは、本発明のポリペプチドを改良する／変異させるために使用することができる。これらには、部位特異的、ランダムな点変異、相同組み換え（ＤＮＡシャッフリング）、ウラシルが含まれている鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップが入れられた二本鎖のＤＮＡを使用する突然変異誘発などが含まれるが、これらに限定はされない。さらに別の適切な方法としては、点不適合の修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異、遺伝子合成全体による突然変異誘発、二本鎖の断裂の修復などが挙げられる。突然変異誘発（例えば、キメラ構築物が含まれる）もまた、本発明に含まれる。１つの実施形態においては、突然変異誘発は、自然界に存在している分子、または変化させられたかもしくは突然変異させられた自然界に存在している分子の公知の情報（例えば、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造など）によって導かれ得る。
本発明にはさらに、実質的な生物学的活性を示す（例えば、ＶＬＰ上でまたはＶＬＰの中で発現された場合に有効な抗体応答を誘発することができる）インフルエンザタンパク質変異体が含まれる。そのような変異体には、活性に対してはほとんど影響を及ぼさないように、当該分野で公知の一般的な規則にしたがって選択された欠失、挿入、反転、反復、および置換が含まれる。
上記インフルエンザタンパク質のクローニング方法は当該分野で公知である。例えば、特異的なインフルエンザタンパク質をコードするインフルエンザ遺伝子は、インフルエンザウイルスに感染させられた細胞から抽出されたポリアデニル化ｍＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによって単離することができる。得られる産物である遺伝子は、ベクターの中にＤＮＡ挿入断片としてクローニングすることができる。用語「ベクター」は、それによって核酸を生物、細胞、または細胞性の成分の間で増幅させることができ、そして／また導入することができる手段を意味する。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などが挙げられ、これらは自律複製するか、または宿主細胞の染色体の中に組み入ることができる。ベクターはまた、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖の中にＤＮＡとＲＮＡの両方が含まれているポリヌクレオチド、ポリリジン結合ＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡなどでもあり得、これらは自律複製しない。多くの（しかし全てではない）一般的な実施形態においては、本発明のベクターはプラスミドまたはバックミド（ｂａｃｍｉｄ）である。
したがって、本発明にはＶＬＰの形成を誘導する細胞の中で発現させることができる発現ベクターにクローニングされた、ＨＡ、ＮＡ、および／またはＭ１インフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドが含まれる。「発現ベクター」は、さらには、その中に取り込まれている核酸の発現、さらには複製を促進させることができるプラスミドのようなベクターである。通常、発現させられる核酸は、プロモーターおよび／またはエンハンサーに「動作可能であるように連結」されており、そして、プロモーターおよび／またはエンハンサーによる転写の調節が制御される。１つの実施形態においては、トリインフルエンザウイルス、世界的に流行するインフルエンザウイルス、および／または季節的なインフルエンザウイルスに由来するＨＡをコードする上記ヌクレオチドは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群より選択される。別の実施形態においては、トリインフルエンザウイルス、世界的に流行するインフルエンザウイルス、および／または季節的なインフルエンザウイルスに由来するＮＡをコードする上記ヌクレオチドは、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９からなる群より選択される。別の実施形態においては、上記ベクターには、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１インフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドが含まれる。別の実施形態においては、上記ベクターは、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１インフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドからなる。好ましい発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。上記インフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドがクローニングされた後、上記ヌクレオチドをさらに操作することができる。例えば、当業者は、変異体が生じるようにコード領域の中の特異的な塩基を変異させることができる。変異体には、コード領域の中に、非コード領域の中に、またはそれらの両方の中に変化が含まれる。そのような変異体は、インフルエンザタンパク質の免疫原性を高める場合があり、また、タンパク質もしくはＲＮＡからスプライシング部位を除去する場合もある。例えば、１つの実施形態においては、インフルエンザＭタンパク質（全長）上にあるスプライシングドナー部位およびスプライシングアクセプター部位は、Ｍ１およびＭ２転写物の中でのＭ ｍＲＮＡのスプライシングを防ぐように変異させられる。別の実施形態においては、ＨＡは切断部位を除去するかまたは変異させるように操作される。例えば、野生型Ｈ５ ＨＡは、複数の塩基性アミノ酸（ＲＲＲＫＲ）が含まれている切断部位を有する。この野生型配列は、ＨＡを、宿主の中に存在し得る複数の偏在するプロテアーゼに対して、またはシステムの発現をこれらのＨＡに対してより敏感にする。１つの実施形態においては、これらのアミノ酸を除去することによって、様々なプロテアーゼに対するＨＡの感度を下げることができる。別の実施形態においては、切断部位は、切断部位を除去するように変異させる（例えば、ＲＥＳＲに変異させる）ことができる。
本発明ではまた、ＮＡ、ＨＡ、およびＭ１をコードする核酸およびポリペプチドも利用される。１つの実施形態においては、インフルエンザＮＡ核酸またはタンパク質は、配列番号１、１１、３１、３２、３９、３８、４６、４７、５４、または５５に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。別の実施形態においては、インフルエンザＨＡ核酸またはタンパク質は、配列番号２、１０、５６、５７、５８、２７、２８、２９、３０、３７、３６、３３、３４、３５、４２、４３、４４、４５、５０、５１、５２、または５３に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。別の実施形態においては、インフルエンザＭ１核酸またはタンパク質は、配列番号１２、４０、４１、４８、または４９に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
いくつかの実施形態においては、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるタンパク質の特性または活性を変化させることのない変化が含まれている変異、ならびにタンパク質を作成する方法が開示される。様々な理由からヌクレオチド変異体が生産され得る（例えば、特定の宿主についてコドンの発現を最適化させるため（ヒトｍＲＮＡのコドンがＳｆ９細胞のような昆虫細胞に好ましいコドンに変化させられる））。米国特許公開番号２００５／０１１８１９１（全ての目的のためのその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。本発明の最適化されたコドン配列の例は以下に開示される（例えば、配列番号４２、４４、４６、４８、５１、および５４を参照のこと）。
加えて、ヌクレオチドは、正確なコード領域がクローニングされ、そしていずれの望ましくない変異も含まれないことを確実にするために、配列決定され得る。ヌクレオチドは、任意の細胞の中での発現のために発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）にサブクローニングされ得る。上記は、インフルエンザウイルスタンパク質をクローニングすることができる方法の一例にすぎない。当業者は、さらに別の方法を利用することができ、それらが可能であることを理解している。
本発明によってはまた、ＮＡ、Ｍ１、および／またはＨＡを含むインフルエンザウイルス構造遺伝子をコードする、トリ、世界的に流行する、および／または季節的なヌクレオチドが含まれている構築物ならびに／あるいはベクターも提供される。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであり得る。ＮＡ、Ｍ１、および／またはＨＡを含む、トリ、世界的に流行する、および／または季節的なインフルエンザウイルス構造遺伝子をコードする構築物ならびに／あるいはベクターは、適切なプロモーター（例えば、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーター（または他のバキュロウイルス）、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびに、レトロウイルスＬＴＲのプロモーターが限定ではない例である）に動作可能であるように連結されなければならない。他の適切なプロモーターは、所望される宿主細胞および／または所望される発現速度に応じて、当業者に公知であろう。発現構築物にはさらに、転写開始、終結のための複数の部位、ならびに、転写される領域の中に、翻訳のためのリボソーム結合部位が含まれるであろう。構築物によって発現させられた転写物のコード部分には、好ましくは、開始部位の翻訳開始コドンと、翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置された終結コドンが含まれるであろう。
発現ベクターには、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーが含まれるであろう。そのようなマーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、真核生物細胞の培養のためのＧ４１８もしくはネオマイシン耐性、ならびに、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌の中での培養のためのテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。中でも好ましいベクターは、ウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ニワトリポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、ブタポックスウイルスなど）、アデノウイルス（例えば、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス、ならびにレトロウイルス）である。本発明とともに使用することができる他のベクターには、細菌の中で使用されるベクターが含まれる。これには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。中でも好ましい真核生物ベクターは、ｐＦａｓｔＢａｃ１ ｐＷＩＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬである。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかであろう。１つの実施形態においては、ＨＡ、Ｍ１、および／またはＮＡを含む、トリ、世界的に流行する、および／または季節的なインフルエンザウイルス構造遺伝子をコードするヌクレオチドが含まれている上記ベクターは、ｐＦａｓｔＢａｃである。別の実施形態においては、ＨＡ、Ｍ１、および／またはＮＡを含む、トリ、世界的に流行する、および／または季節的なインフルエンザウイルス構造遺伝子をコードするヌクレオチドからなる挿入断片が含まれている上記ベクターは、ｐＦａｓｔＢａｃである。
次に、組み換え体ベクターは、適切な宿主細胞にトランスフェクトされる、感染させられる、または形質転換され得る。したがって、本発明により、ＨＡ、Ｍ１、および／またはＮＡをコードし、ＶＬＰを形成させることができる条件下で上記宿主細胞中でＨＡ、Ｍ１、および／またはＮＡを発現することができる核酸が含まれているベクター（単数または複数）が含まれている宿主細胞が提供される。
１つの実施形態においては、上記組み換え体構築物は、真核生物および／または原核生物細胞をトランスフェクトする、感染させる、もしくは形質転換するために使用することができ、そしてそれらの中でＨＡ、ＮＡ、およびＭ１インフルエンザタンパク質を発現することができる。中でも、真核生物宿主細胞は、酵母、昆虫、トリ、植物、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（すなわち、線虫）、および哺乳動物の宿主細胞である。昆虫細胞の限定ではない例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞（例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞）、ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞である。真菌（酵母が含まれる）宿主細胞の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｃａｎｄｉｄａの種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｇｌａｂｒａｔａが含まれる）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、ならびにＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。哺乳動物細胞の例は、ＣＯＳ細胞、べビーハムスター腎臓細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、およびアフリカミドリザル細胞、ＣＶ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＨｅｐ−２細胞である。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵巣細胞または両生類起源の他の細胞もまた、使用され得る。原核生物宿主細胞としては、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびマイコバクテリウムが挙げられる。
ベクター（例えば、ＨＡ、ＮＡ、および／またはＭ１ポリヌクレオチドが含まれているベクター）は、当該分野で周知の方法にしたがって宿主細胞にトランスフェクトすることができる。例えば、真核生物細胞の中への核酸の導入は、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を使用するトランスフェクションによって行うことができる。１つの実施形態においては、上記ベクターは、組み換え体バキュロウイルスである。別の実施形態においては、上記組み換え体バキュロウイルスは、真核生物細胞の中にトランスフェクトされる。好ましい実施形態においては、上記細胞は昆虫細胞である。別の実施形態においては、上記昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
別の実施形態においては、上記ベクターおよび／または宿主細胞には、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群より選択される、トリ、世界的に流行する、および／または季節的なインフルエンザウイルスＨＡタンパク質をコードするヌクレオチドが含まれる。別の実施形態においては、上記ベクターおよび／または宿主細胞には、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９からなる群より選択されるＮＡタンパク質をコードするヌクレオチドが含まれる。別の実施形態においては、上記ベクターおよび／または宿主細胞には、インフルエンザＨＡ、Ｍ１、および／またはＮＡが含まれる。別の実施形態においては、上記ベクターおよび／または宿主細胞は、原則として、ＨＡ、Ｍ１、および／またはＮＡから構成される。さらなる実施形態においては、上記ベクターおよび／または宿主細胞は、ＨＡ、Ｍ１、およびＮＡを含むインフルエンザタンパク質からなる。これらのベクターおよび／または宿主細胞には、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれ、そしてこれには、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡの断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、上記ヌクレオチドは、ＶＬＰの表面上に発現された場合には、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性をそれぞれ示す、ＨＡおよび／またはＮＡをコードする。
本発明によってはまた、ＶＬＰの生産効率を高めるであろう構築物および方法も提供される。例えば、タンパク質の発現を増大させるためのタンパク質からの切断部位の除去である（上記を参照のこと）。他の方法には、より効率的な輸送のための、ＨＡ、ＮＡ、および／またはＭ１タンパク質に対するリーダー配列の付加が含まれる。例えば、異種シグナル配列を、ＨＡ、ＮＡ，および／またはＭ１インフルエンザタンパク質に融合させることができる。１つの実施形態においては、シグナル配列は昆虫細胞の遺伝子から導くことができ、そして（昆虫細胞の中での発現のために）インフルエンザＨＡタンパク質に融合させることができる。別の実施形態においては、シグナルペプチドはキチナーゼシグナル配列であり、これは、バキュロウイルス発現システムにおいて効率よく役割を果たす。他の実施態様においては、複数のインフルエンザタンパク質の間の交換（ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｉｎｇ）リーダー配列によって、より良好なタンパク質の輸送が提供され得る。例えば、Ｈ５ヘマグルチニンが、粒子の表面への輸送については効率が悪いことが示されている。しかし、Ｈ９ヘマグルチニンは表面を標的化し、より効率よく表面に組み込まれる。したがって、１つの実施形態においては、Ｈ９リーダー配列がＨ５タンパク質に融合させられる。
ＶＬＰの生産効率を高めるための別の方法は、特異的な細胞のタイプのＨＡ、ＮＡ、および／またはＭ１タンパク質をコードするヌクレオチドをコドン最適化することである。例えば、Ｓｆ９細胞中での発現のための核酸のコドン最適化である（米国特許公開番号２００５／０１１８１９１（全ての目的のためのその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。Ｓｆ９細胞について最適化させられたコドン配列の例が以下に開示される（例えば、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５２、および５４）。１つの実施形態においては、コドンが最適化されたインフルエンザタンパク質の核酸配列は、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５２、および５４のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
本発明によってはまた、ＶＬＰを生産する方法も提供される。上記方法には、ＶＬＰの形成を可能にする条件下での、トリ、世界的に流行する、および／または季節的なインフルエンザタンパク質を発現させる工程が含まれる。選択された発現システムおよび宿主細胞に応じて、ＶＬＰは、組み換えタンパク質が発現させられ、そしてＶＬＰが形成される条件下で、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を増殖させることによって生産される。適切な増殖条件の選択は、当業者の能力の範囲内である。
本発明のＶＬＰを生産するように操作された細胞を増殖させるための方法としては、バッチ、フェドバッチ（ｂａｔｃｈ−ｆｅｄ）、連続、および潅流細胞培養技術が挙げられるが、これらに限定はされない。細胞培養は、バイオリアクター（醗酵チャンバー）の中での細胞の増殖および拡大を意味し、ここで、細胞が増殖し、精製および単離されるタンパク質（例えば、組み換え体タンパク質）が発現させられる。通常、細胞培養は、バイオリアクターの中で、滅菌状態、管理された温度および空気圧条件下で行われる。バイオリアクターは、その中の環境条件（例えば、温度、空気圧、攪拌、および／またはｐＨ）をモニターすることができる、細胞を培養するために使用されるチャンバーである。１つの実施形態においては、上記バイオリアクターは滅菌の鋼鉄製のチャンバーである。別の実施形態においては、上記バイオリアクターは、予め滅菌されたプラスチックバッグ（例えば、Ｃｅｌｌｂａｇ（登録商標）、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）である。他の実施形態においては、上記予め滅菌されたプラスチックバッグは、約５０Ｌから１０００Ｌのバッグである。
その後、ＶＬＰは、その完全性を保つ方法（例えば、勾配遠心分離（例えば、塩化セシウム、スクロース、およびイオジキサノール）ならびに標準的な精製技術（例えば、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーが含まれる）を使用して単離される。
以下は、本発明のＶＬＰを作成し、単離し、そして精製することができる方法の一例である。通常、ＶＬＰは、上記細胞が細胞培養物の中で増殖させられる（上記を参照のこと）と、ＶＬＰを作成するように操作された組み換え体細胞株から生産される。ＶＬＰの生産は、図２６に示される反応図式によって行われ得る。当業者は、本発明のＶＬＰを作成し、そして精製するために利用することができるさらに別の方法が存在することを理解するであろう。したがって、本発明は記載される方法に限定されない。
本発明のＶＬＰの生産は、Ｓｆ９細胞（感染させられていない）を震盪フラスコの中に播種することによって開始することができる。これによって、細胞は拡大させられ、そして細胞増殖および複製するにつれてスケールアップ（例えば、１２５ｍｌのフラスコから５０ＬのＷａｖｅバッグへと）することができる。細胞を増殖させるために使用される培地は、適切な細胞株用に策定される（好ましくは、無血清培地、例えば、昆虫培地ＥｘＣｅｌｌ−４２０、ＪＲＨ）。次に、上記細胞が、組み換え体バキュロウイルスで最も効率のよい感染多重度で感染させられる（例えば、１つの細胞あたり約１から約３プラーク形成単位）。一旦感染が起こると、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質がウイルスゲノムから発現され、ＶＬＰへと自己アセンブリし、そして感染後およそ２４から７２時間で細胞から分泌される。通常、感染は、細胞が対数増殖中期にある（４〜８×１０６細胞／ｍｌ）ときに最も効率が高く、そして少なくとも約９０％が生存可能である。
本発明のＶＬＰは、感染後およそ４８から９６時間で回収することができる。この時点では、細胞培養培地中でのＶＬＰのレベルはほぼ最大であるが、多数の細胞が溶解する前である。回収時のＳｆ９細胞の密度および生存性は、色素排除試験によって示されるように、約０．５×１０６細胞／ｍｌから約１．５×１０６細胞／ｍｌで、少なくとも２０％の生存性であり得る。次に、培地が取り出され、明澄化させられる。ＮａＣｌを約０．４から約１．０Ｍの濃度で、好ましくは、約０．５Ｍの濃度で培地に添加して、ＶＬＰの凝集を避けることができる。本発明のＶＬＰが含まれている細胞培養培地からの細胞および細胞破片の除去は、使い捨ての予め滅菌された中空繊維０．５または１．００μｍのフィルターカートリッジまたは同様のデバイスを用いる接線流濾過（ＴＦＦ）によって行うことができる。
次に、明澄化させられた培養培地中のＶＬＰは、使い捨ての予め滅菌された５００，０００分子量カットオフ中空繊維フィルターカートリッジを使用して、限外濾過によって濃縮することができる。濃縮されたＶＬＰは、１０倍量の、０．５ＭのＮａＣｌが含まれているｐＨ７．０から８．０のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析して、残留している培地成分を除去することができる。
濃縮され、透析されたＶＬＰは、さらに、０．５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中の２０％から６０％の不連続なスクロース勾配上で、約４℃から１０℃で１８時間、６，５００×ｇでの遠心分離によって精製することができる。通常、ＶＬＰは、約３０％から約４０％のスクロースの間、または勾配から回収しそして保存することができる界面（２０％および６０％の段階の勾配において）に、際立った見ることができるバンドを形成するであろう。この生成物は、精製プロセスの次の工程のための準備において、２００ｍＭのＮａＣｌを含むように希釈することができる。この生成物にＶＬＰが含まれており、これには、完全なバキュロウイする粒子が含まれ得る。
ＶＬＰのさらなる精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー、または４４％の等密度スクロースクッション遠心分離によって行うことができる。陰イオン交換クロマトグラフィーにおいては、スクロース勾配による試料（上記を参照のこと）が、陰イオンを含む媒体が含まれているカラム（例えば、Ｍａｔｒｉｘ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ）にロードされ、そして塩勾配（約０．２Ｍから約１．０ＭのＮａＣｌ）によって溶出させられる。これによりＶＬＰを他の混入物質（例えば、バキュロウイルスおよびＤＮＡ／ＲＮＡ）から分離することができる。スクロースクション法においては、ＶＬＰが含まれている試料が４４％のスクロースクッションに添加され、３０，０００ｇで約１８時間遠心分離される。ＶＬＰは４４％スクロースの最上部にバンドを形成し、一方、バキュロウイルスは底に沈殿し、他の混入しているタンパク質は上部の０％スクロースの層に残る。ＶＬＰのピークまたはバンドが回収される。
完全なバキュロウイルスは、所望される場合には不活化させることができる。不活化は、化学的方法（例えば、ホルマリンまたはβ−プロピルラクトン（ＢＰＬ））によって行うことができる。完全なバキュロウイルスの除去および／または不活化はまた、主に、上記で説明されたような当該分野で公知の選択的沈殿およびクロマトグラフィー方法を使用して行うこともできる。不活化方法には、ＶＬＰが含まれている試料を０．２％のＢＰＬの中で、約２５℃から約２７℃で３時間インキュベートする工程が含まれる。バキュロウイルスは、ＶＬＰが含まれている試料を０．０５％のＢＰＬとともに４℃で３日間インキュベートし、その後、３７℃で１時間インキュベートすることによっても不活化させることができる。
不活化／除去工程の後、ＶＬＰが含まれている生成物については、不活化工程による任意の試薬および／または全ての残留しているスクロースを除去し、そして所望される緩衝液（例えば、ＰＢＳ）の中にＶＬＰを入れるための、さらなる透析工程を行うことができる。ＶＬＰが含まれている溶液は当該分野で公知の方法（例えば、滅菌濾過）によって滅菌することができ、そして、冷蔵庫または冷凍庫で保存することができる。
上記技術は、様々な規模で行うことができる。例えば、Ｔフラスコ、震盪フラスコ、スピナーボトル（ｓｐｉｎｎｅｒ ｂｏｔｔｌｅ）、産業的規模のバイオリアクターまでである。バイオリアクターには、鋼鉄製のタンクまたは予め滅菌されたプラスチックバッグ（例えば、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪによって販売されているシステム）のいずれかを含めることができる。当業者は、彼らの目的に最も望ましいものを知っているであろう。
バキュロウイルス発現ベクターの増幅および生産、ならびに、組み換え体インフルエンザＶＬＰを生産させるための組み換え体バキュロウイルスでの細胞の感染は、先に記載されたように、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９昆虫細胞）の中で行うことができる。好ましい実施形態においては、細胞は、インフルエンザＶＬＰを生産するように操作された組み換え体バキュロウイルスに感染させられたＳＦ９である。
薬学的処方物またはワクチン処方物、および投与
本明細書中で有用な薬学的組成物には、薬学的に許容される担体（任意の適切な希釈剤または賦形剤が含まれる）（これには、それ自体は組成物を投与される脊椎動物に対して有害な免疫応答の生産を誘導することはなく、そして、投与されても過度の毒性は伴わない任意の薬学的物質が含まれる）と本発明のＶＬＰが含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の監督官庁によって承認されているか、あるいは、米国薬局方、欧州薬局方、または脊椎動物（およびより具体的には、ヒト）での使用について一般的に認識されている他の薬局方に列挙されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御性の免疫応答を誘導するためのワクチンおよび／または抗原性組成物として有用であり得る。
上記本発明の薬学的処方物には、インフルエンザＭ１、ＨＡ、および／またはＮＡタンパク質を含むＶＬＰと、薬学的に許容される担体または賦形剤が含まれる。薬学的に許容される担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌の等張性の水性緩衝液、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされない。薬学的に許容される担体、希釈剤、および他の賦形剤についての十分な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．，現行版）に示されている。処方物は、投与の態様に適していなければならない。好ましい実施形態においては、処方物はヒトへの投与に適しており、好ましくは、滅菌であり、微粒子状ではなく、そして／また非発熱性である。
所望される場合には、組成物にはまた、主要ではない量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含まれ得る。組成物は、固体の形態（例えば、再構成に適している凍結乾燥させられた粉末）、液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放処方物、または散剤であり得る。経口処方物には、標準的な担体（例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム）が含まれ得る。
本発明によってはまた、本発明のワクチン処方物の成分のうちの１つ以上が充填された１つ以上の容器が含まれている、薬学的パックまたはキットも提供される。好ましい実施形態においては、キットには２つの容器が含まれ、一方にはＶＬＰが含まれており、そして他方にアジュバントが含まれる。そのような容器（単数または複数）には、製造を規制する政府機関によって記載された形式で、薬学的製品または生物学的製品の使用または販売についての注意書きが伴う場合がある。この注意書きには、製造機関による承認、ヒトへの投与についての使用または販売が反映される。
本発明によってはまた、組成物の量が示されているアンプルまたは小袋のような、密封された容器の中にパッケージされたＶＬＰ処方物も提供される。１つの実施形態においては、ＶＬＰ組成物は液体として、別の実施形態においては、密封された容器の中に乾燥している滅菌された凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として提供され、そして、例えば、被験体への投与に適している濃縮物になるように、例えば、水または生理食塩水で再構成することができる。好ましくは、ＶＬＰ組成物は、密封された容器の中の乾燥した滅菌の凍結乾燥粉末として、好ましい単位投与量で、約１μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約１２５μｇ、約１５０μｇ、または約２００μｇで提供される。あるいは、ＶＬＰ組成物の単位投与量は、約１μｇ未満、例えば、約０．０８μｇ、約０．０４μｇ；約０．２μｇ、約０．４μｇ、約０．８μｇ、約０．５μｇまたはそれ未満、約０．２５μｇまたはそれ未満、あるいは約０．１μｇまたはそれ未満であるか、あるいは、約１２５μｇより多い、例えば、約１５０μｇまたはそれより多い、約２５０μｇまたはそれより多い、または約５００μｇまたはそれより多い。これらの用量は、ＶＬＰ全体として測定される場合も、また、ＨＡのμｇとして測定される場合もある。ＶＬＰ組成物は、凍結乾燥させられた粉末から再構成された後、約１２時間以内に、好ましくは約６時間以内に、約５時間以内に、約３時間以内に、または約１時間以内に投与されるべきである。
別の実施形態においては、ＶＬＰ組成物は、ＶＬＰ組成物の量および濃度が示されている密封された容器の中に液体形態で提供される。好ましくは、ＶＬＰ組成物の液体形態は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、または少なくとも１ｍｇ／ｍｌで、密封された容器の中に提供される。
一般的には、本発明のインフルエンザＶＬＰは、１つ以上のインフルエンザウイルス株に対する免疫応答を刺激するために効果的な量または十分な量（上記で定義された）で投与される。好ましくは、本発明のＶＬＰの投与によって、少なくとも１つのインフルエンザウイルスに対する実質的な免疫力が誘発される。通常、用量は、年齢、健康状態、体重、性別、食事療法、投与のタイミング、および他の臨床的な要因に基づいてこの範囲内で調節することができる。予防用のワクチン処方物は、全身的に、例えば、注射針と注射器、または針のない注射用デバイスを使用して、皮下または筋肉内注射によって投与される。あるいは、ワクチン処方物は、鼻腔内に、点鼻薬、大きな粒子のエアゾール（約１０ミクロンよりも大きい）、または上部呼吸管への噴霧のいずれかによって投与される。上記投与経路のいずれによっても免疫応答が生じるが、鼻腔内投与によっては、インフルエンザウイルスの侵入部位での粘膜免疫を誘発する付加的な利点が提供される。
したがって、本発明には、被験体に対してインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導するワクチンまたは抗原性組成物を処方する方法も含まれる。この方法には、上記処方物に有効用量のインフルエンザＶＬＰを加える工程が含まれる。
１用量での実質的な免疫力の刺激が好ましいが、所望される効果を得るためにさらなる投与量を同じ経路または別の経路によって投与することができる。新生物および乳児においては、例えば、複数内の投与が十分なレベルの免疫力を誘発するために必要であり得る。投与は、インフルエンザ感染に対する十分なレベルの防御を維持するため必要に応じて、小児期の間に間隔をあけて継続して行われ得る。同様に、繰り返しのインフルエンザ感染または重篤なインフルエンザ感染に特にかかりやすい成人（例えば、医療従事者、デイケア従事者、低年齢の小児の家族のメンバー、高齢者、および心肺機能が低下している個体）には、防御免疫応答を確立し、そして／または維持するためには複数回の免疫化が必要であり得る。誘導される免疫力のレベルは、例えば、中和分泌抗体および血清抗体の量を測定することによってモニターされ得、そして、所望される防御レベルを誘発し、そして維持するため必要に応じて、投与量が調節されるかまたはワクチン接種が繰り返され得る。
したがって、１つの実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰには、インフルエンザウイルスＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質が含まれる。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰは、原則として、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。上記ＶＬＰには、さらに別のインフルエンザタンパク質および／またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰは、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１は、季節的なインフルエンザおよび／またはトリインフルエンザウイルスに由来する。別の実施態様においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量の、インフルエンザタンパク質が含まれているインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパクからなる。これらのＶＬＰにはＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれ、そして、これには、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡの断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、上記ＨＡおよび／またはＮＡは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。別の実施形態においては、上記方法には、１用量の上記処方物を投与することにより、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する工程が含まれる。別の実施形態においては、この方法には、複数回の用量で上記処方物を投与することにより、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する工程が含まれる。
ＶＬＰが含まれている組成物（ワクチンおよび／または抗原性処方物）を投与する方法としては、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔内および経口、または肺経路、または坐剤による）が挙げられるが、これらに限定はされない。特異的な実施形態においては、本発明の組成物は、筋肉内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、または皮内に投与される。組成物は、例えば、任意の通常の経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜の内層（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽頭、中咽頭、膣、子宮、膀胱、および腸粘膜など）を介する吸収によって投与することができ、そして、他の生物学的活性のある物質と一緒に投与することができる。いくつかの実施形態においては、本発明のＶＬＰが含まれている組成物の鼻腔内または他の粘膜による投与経路によって、他の投与経路よりも実質的に高い抗体応答または他の免疫応答が誘導され得る。別の実施形態においては、本発明のＶＬＰが含まれている組成物の鼻腔内または他の粘膜による投与経路によって、他のインフルエンザウイルス株に対する交差防御（ｃｒｏｓｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を誘導するであろう抗体応答または他の免疫応答が誘導され得る。投与は全身的であっても、また局所的であってもよい。
なお別の実施形態においては、ワクチンおよび／または抗原性処方物は、免疫化の部位で免疫応答を誘発するために粘膜組織を標的化する様式で投与される。例えば、粘膜組織（例えば、消化管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ））は、特定の粘膜標的化特性を有しているアジュバントを含む組成物の経口投与を使用することによって、免疫化のために標的化され得る。さらに別の粘膜組織（例えば、鼻咽頭リンパ系組織（ＮＡＬＴ）および気管支関連リンパ系組織（ＢＡＬＴ））もまた標的化され得る。
本発明のワクチンおよび／または抗原性処方物はまた、投与スケジュールで、例えば、最初のワクチン組成物の投与と、それに続くブースター投与で投与される場合もある。特定の実施形態においては、組成物の第２の用量は、最初の投与後、２週間から１年、好ましくは、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月から約６ヶ月のいずれかの時点で投与される。加えて、３回目の用量が、２回目の投与後に、そして最初の投与後約３ヶ月から約２年、またはさらに長い間、好ましくは、約４ヶ月、約５ヶ月、または約６ヶ月、または約７ヶ月から約１年後に投与され得る。３回目の用量は、状況に応じて、２回目の用量の後、被験体の血清および／もしくは尿、または粘膜分泌物の中で特異的な免疫グロブリンがもはや検出されないか、低いレベルでしか検出されなくなった時点で投与される場合もある。好ましい実施形態においては、２回目の用量は１回目の投与の約１ヵ月後に投与され、そして３回目の用量は１回目の投与の約６ヵ月後に投与される。別の実施形態においては、２回目の用量は１回目の投与の約６ヵ月後に投与される。
別の実施形態においては、本発明の上記ＶＬＰは、併用療法の一部として投与することができる。例えば、本発明のＶＬＰは、他の免疫原性組成物および／または抗ウイルス剤（例えば、アマンタジン（Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）、リマンタジン（Ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）、ザナミビル（Ｚａｎａｍｉｖｉｒ）およびオステルタミビル（Ｏｓｔｅｌｔａｍｉｖｉｒ））と一緒に処方することができる。
薬学的処方物の投与量は、例えば、予防的な免疫応答または治療的な免疫応答を誘発するために有効な用量を（例えば、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を測定することによって、または血清試料、もしくは尿試料、もしくは粘膜分泌液中での抗体の阻害率を測定することによって）最初に同定することにより、当業者によって容易に決定することができる。上記投与量は、動物実験から決定することができる。インフルエンザウイルスを研究するために使用される動物の限定ではないリストには、モルモット、ゴールデンハムスター（Ｓｙｒｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ）、チンチラ、ハリネズミ、ニワトリ、ラット、マウス、およびフェレットが含まれる。ほとんどの動物は、自然界ではインフルエンザウイルスの宿主ではないが、それでも疾患の様々な態様の研究に役立ち得る。例えば、上記動物のうちの任意のものに、ワクチンの候補（例えば、本発明のＶＬＰ）を、誘導される免疫応答を部分的に特性決定するために、および／またはどの中和抗体が生産されるかを決定するために、投与することができる。例えば、多くの研究がマウスモデルにおいて行われている。なぜなら、マウスは大きさが小さく、そのコストが低いことによって研究者は大規模な実験を行うことができるからである。そうは言うものの、マウスの小さい大きさは疾患のあらゆる臨床的兆候の容易な観察の難しさをもまた増大させ、そしてマウスは、ヒトの疾患についての予測モデルではない。
ヒトインフルエンザウイルス感染およびその作用の経過の様々な態様を研究するためにはフェレットが広く使用されている。インフルエンザウイルスに対する免疫力についての現在の概念の多くの開発は、フェレットの使用なしには不可能である（Ｍａｈｅｒら、２００４）。フェレットは、いくつかの理由からインフルエンザを研究するための優れたモデルであることが証明されている：フェレットでのインフルエンザ感染は、臨床的兆候、病因、および免疫力に関して、ヒトでの感染とよく似ている；ヒトのＡ型およびＢ型インフルエンザは、自然界でフェレットに感染し、したがって、その中で感染、疾病の伝染と、インフルエンザウイルスの糖タンパク質の中でのアミノ酸の配列バリエーションの間での相互作用が観察される、完全に制御された集団を実験するための機会が提供される；そして、フェレットは、それを疾患の発現を解析するための理想的なモデルとする他の身体特性を有している。例えば、フェレットとヒトは、宿主の年齢、ウイルスの株、環境条件、２回目の細菌感染の程度、および多くの他の変数に応じて見られる、インフルエンザ感染の極めて類似する臨床的兆候を示す。したがって、当業者は、上記に記載されたマウスまたは任意の他の動物モデルと比較して、フェレットモデルによるインフルエンザワクチンの効力および投与レジュメを、ヒトに対してより容易に相関させることができる。
加えて、ヒトについての好ましい有効用量を決定するためのヒトでの臨床試験を、当業者は行うことができる。そのような臨床試験は日常的に行われ、そして当該分野で周知である。使用される正確な用量は投与経路に応じて様々であろう。有効用量は、インビトロまたは動物試験システムから導かれる用量応答曲線から推定され得る。
これもまた当該分野で周知であるように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって高めることができる。アジュバントは、未知の抗原に対する免疫力の全体的な増大を促進するように、経験的に使用されている（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号）。免疫化プロトコールでは、長年にわたり応答を刺激するためにアジュバントが使用されており、そしてそのようなアジュバントは当業者には周知である。いくつかのアジュバントは、抗原が提示される方法に影響を与える。例えば、免疫応答は、タンパク質抗原がミョウバンによって沈殿させられると高まる。抗原の乳化によっては、抗原の提示期間も長くなる。全ての目的のためにその全体が引用により本明細書中に組み入れられるＶｏｇｅｌら、「Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第２版）」に記載されている任意のアジュバントを含めることは、本発明の範囲において想定される。
例示的なアジュバントには、完全なフロイトのアジュバント（死滅させられたヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が含まれている免疫応答の非特異的刺激因子）、不完全なフロイトのアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。他のアジュバントにはＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ＭＤＰ化合物（例えば、ｔｈｕｒ−ＭＤＰ、およびｎｏｒ−ＭＤＰ）、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピッドＡ（ｌｉｐｉｄ Ａ）、ならびに、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）が含まれる。ＲＩＢＩ（これには、細菌から抽出された３つの成分：ＭＰＬ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）が２％のスクワレン／Ｔｗｅｅｎ ８０エマルジョンの中に含まれている）もまた想定される。ＭＦ−５９、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）、ＭＨＣ抗原もまた使用され得る。
本発明の１つの実施形態においては、アジュバントは、脂質二重層を含まない大きな不定形の中心孔の回りを取り囲む水層によって分けられた実質的に球形の殻の形態に配置された、約２から１０個の二重層を有している寡層薄膜非リン脂質小胞体（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ ｌｉｐｉｄ ｖｅｓｉｃｌｅ）である。寡層薄膜非リン脂質小胞体は、いくつかの方法で、非特異的刺激因子として、抗原についての担体として、さらに別のアジュバントの担体として、およびそれらの組み合わせで、免疫応答を刺激するように作用し得る。寡層薄膜非リン脂質小胞体は、例えば、抗原を予め形成させられた小胞と混合することによってワクチンが調製される場合には非特異的免疫刺激因子として作用し、その結果、抗原は、小胞に対して細胞外にとどまる。抗原を小胞の中心孔にカプセル化することによって、小胞は、免疫刺激因子としても、そして抗原のための担体としても作用する。別の実施形態においては、小胞は、主にリン脂質ではない小胞からなる。他の実施形態においては、小胞は、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓである。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）は、約１００ｎｍから約５００ｎｍの範囲の寡層薄膜非リン脂質小胞体である。これらには、Ｂｒｉｊ ７２、コレステロール、オレイン酸、およびスクワレンが含まれる。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓは、インフルエンザ抗原についての有効なアジュバントであることが示されている（全ての目的のためのそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる、米国特許第５，６２９，０２１号、同第６，３８７，３７３号、および同第４，９１１，９２８号を参照のこと）。
１つの態様においては、アジュバント効果は、リン酸緩衝化生理食塩水中で約０．０５から約０．１％溶液として使用される、ミョウバンのような物質の使用によって得られる。あるいは、ＶＬＰは、約０．２５％の溶液として使用される糖の合成ポリマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合物として作成することができる。いくつかのアジュバント（例えば、細菌から得られる特定の有機分子）は、抗原ではなくむしろ宿主に対して作用する。一例は、ムラミルジペプチド（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン［ＭＤＰ］）、細菌のペプチドグリカンである。他の実施形態においては、ヘモシアニンおよびヘモエリスリンもまた、本発明のＶＬＰとともに使用され得る。キーホールリンペット由来のヘモシアニン（ＫＬＨ）の使用が、特定の実施形態においては好ましいが、他の軟体動物ならびに節足動物のヘモシアニンおよびヘモエリスリンが使用される場合もある。
様々な多糖アジュバントもまた使用され得る。例えば、マウスの抗体応答に対する様々な肺炎球菌多糖アジュバントの使用が記載されている（Ｙｉｎら、１９８９）。最適な応答を生じるか、またはそうでなければ抑制を生じない用量は、示されているように使用されるべきである（Ｙｉｎら、１９８９）。多糖類のポリアミン変化が特に好ましく、例えば、キチンおよびキトサン（脱アセチル化キチンが含まれる）である。別の実施形態においては、ムラミルジペプチドの親水性二糖−三糖誘導体が、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールから形成させられた人工のリポソームの中での使用について記載されている。
両親媒性の界面活性物質（例えば、サポニン、およびＱＳ２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような誘導体）は、本発明のＶＬＰと共に使用されるアジュバントのなお別のグループを形成する。非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、１９９４）もまた使用され得る。オリゴヌクレオチドは、アジュバントの別の有用なグループである（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８８）。Ｑｕｉｌ Ａおよびレンチネン（ｌｅｎｔｉｎｅｎ）は、本発明の特定の実施形態において使用され得る他のアジュバントである。
アジュバントの別のグループは、解毒された内毒素であり、例えば、米国特許第４，８６６，０３４号の精製された解毒された内毒素である。これらの精製された解毒された内毒素は、脊椎動物においてアジュバント応答を生じさせることにおいて有効である。もちろん、解毒された内毒素は、マルチアジュバント処方物を調製するために他のアジュバントと組み合わせられ得る。例えば、解毒された内毒素のトレハロースジミコレートとの組み合わせが、米国特許第４，４３５，３８６号に記載されているように具体的に想定される。米国特許第４，４３６，７２７号、同第４，４３６，７２８号、および同第４，５０５，９００号に記載されているように、解毒された内毒素の、細胞壁骨格（ＣＷＳ）、またはＣＷＳとトレハロースとの組み合わせにおいてそうであるように、解毒された内毒素のトレハロースジミコレートおよび内毒素の糖脂質との組み合わせもまた想定される（米国特許第４，５０５，８９９号）。解毒された内毒素が含まれていない、ＣＷＳとトレハロースジミコレートだけの組み合わせもまた、米国特許第４，５２０，０１９号に記載されているように、有用であると想定される。
当業者は、本発明にしたがってワクチンに組み合わせることができる様々な種類のアジュバントを知っているであろう。そしてこれらには、アルキルリソホスフィリピッド（ａｌｋｙｌ ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｉｌｉｐｉｄ）（ＡＬＰ）；ＢＣＧ、およびビオチン（ビオチニル化された誘導体が含まれる）などが含まれる。使用が具体的に想定される特定のアジュバントは、グラム細胞（Ｇｒａｍ−ｃｅｌｌ）に由来するテイコ酸である。これらには、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、リビトールテイコ酸（ＲＴＡ）、およびグリセロールテイコ酸（ＧＴＡ）が含まれる。それらの合成の対応物の活性な形態もまた、本発明と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｄａら、１９９５）。
様々なアジュバント（さらには、ヒトにおいては一般的には使用されないものも）もなお、例えば、抗体を惹起させること、または続いて活性化Ｔ細胞を得ることが所望される場合には、他の脊椎動物において使用される場合がある。アジュバントまたは細胞のいずれかによって生じ得る（例えば、照射されていない腫瘍細胞を使用することによって起こり得る）、毒性または他の有害な作用は、そのような状況においては不適切である。
免疫応答を誘導する別の方法は、「免疫促進剤」と共に本発明のＶＬＰを処方することによって行うことができる。これらは、免疫系の応答を増大させるための体自身の化学的伝達物質（サイトカイン）である。免疫促進剤としては、免疫賦活活性、免疫増強活性、およびプロ炎症活性を有している様々なサイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（例えば、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；ならびに、他の免疫賦活分子（例えば、マクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２など）が挙げられるが、これらに限定はされない。免疫促進剤分子は、インフルエンザＶＬＰと同じ処方物の中で投与することができ、また、別々に投与することもできる。タンパク質、またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを、免疫賦活効果を生じるように投与することができる。
インフルエンザに対する免疫応答を刺激する方法
本発明のＶＬＰは、インフルエンザウイルスに対する免疫力または実質的な免疫力を付与する免疫応答を刺激する組成物を調製するために有用である。粘膜免疫および細胞性の免疫のいずれもが、インフルエンザ感染および疾患に対する免疫力に寄与し得る。上部呼吸管に局所的に分泌される抗体は、自然な感染に対する抵抗力の主要な要因である。分泌型の免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）は、上部呼吸管の防御に、そして血清ＩｇＧは下部呼吸管の防御に関与している。感染によって誘導された免疫応答は、同じウイルスへの再感染、または抗原的に類似しているウイルス株への再感染を防御する。インフルエンザウイルスは、頻繁に、そして予想できない変化を受ける；したがって、自然な感染後には、宿主の免疫力によって提供された防御の有効期間は、社会に流行する新しいウイルス株に対してはわずかに数年間しかない。
本発明のＶＬＰは、脊椎動物（例えば、ヒト）に投与された場合には、上記脊椎動物において実質的な免疫力を誘導することができる。実質的な免疫力は、本発明のインフルエンザＶＬＰに対する免疫応答によって生じ、これは、上記脊椎動物におけるインフルエンザ感染を防御もしくは緩和する、またはインフルエンザウイルス感染の症状を少なくとも症状を軽減する。いくつかの例においては、上記脊椎動物が感染しても、上記感染は無症候性である。応答は、完全には防御性の応答ではない場合がある。この場合、上記脊椎動物がインフルエンザウイルスに感染すると、脊椎動物は、免疫化されていない脊椎動物と比較すると、軽い症状または短い症状の期間を経験するであろう。
１つの実施形態においては、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。別の実施形態においては、上記実質的な免疫力の誘導によってインフルエンザの症状の期間が短くなる。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰには、インフルエンザウイルスＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質が含まれる。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡの断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰは、原則として、インフルエンザウイルスＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。上記ＶＬＰには、さらに別のインフルエンザタンパク質および／またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰは、インフルエンザウイルスＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。別の実施形態においては、上記ＨＡおよび／またはＮＡは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記ＶＬＰは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。
最近、世界的流行を起こす可能性があるトリインフルエンザウイルスに対するワクチンをつくる努力が行われている。この理由は、多数のトリインフルエンザが種のバリアを飛び越えて、ヒトに直接感染して疾病を生じ、いくつかの症例では死亡しているからである。これらのウイルスは、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、およびＨ９Ｎ１である（Ｃｏｘら、２００４）。最近の実験では、ワクチンとして不活化させられたＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスを使用する可能性が試験された。ワクチンの処方は、現在販売が認可されている承認されている不活化ワクチンと同様であった。不活化Ｈ５Ｎ１ウイルスを使用して行われた実験では、ヒトにおいては免疫応答が誘導されたが、投与された用量が非常に多かった（認可されているワクチンの１５μｇと比較して、９０μｇのトリインフルエンザ）（Ｔｒｅａｎｏｒら、２００６）。トリインフルエンザ抗原についてのこの量の多さは、全世界でのワクチン接種キャンペーンのためには非現実的である。以下に説明されるように、本発明のＶＬＰは、脊椎動物に投与されると、上記脊椎動物において免疫応答を誘導する。
したがって、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量のトリインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。別の実施形態においては、上記実質的な免疫力の誘導によってインフルエンザの症状の期間が短くなる。別の実施形態においては、上記免疫力の誘導は、本発明のＶＬＰの中で少なくとも０．２μｇのトリＨＡを投与することによる。別の実施形態においては、上記免疫力の誘導は、本発明のＶＬＰの中で約０．２μｇのトリＨＡから約１５μｇのＨＡを投与することによる。投与は、１回以上の用量で行われ得るが、１用量で行われることが有利であり得る。別の実施形態においては、上記ＶＬＰのトリＨＡは、トリインフルエンザＨ５Ｎ１に由来する。
別の実施形態においては、本発明には、被験体においてトリインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量のトリインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれ、ここでは、上記ＶＬＰには、トリインフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれる。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザＶＬＰにはトリインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記トリインフルエンザタンパク質はＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡの断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、被験体においてトリインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する上記方法には、少なくとも１有効用量のトリインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれ、ここでは、上記ＶＬＰは、原則として、トリインフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。上記ＶＬＰには、さらに別のインフルエンザタンパク質および／またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰは、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザＨＡおよびＮＡは、それぞれ、Ｈ５Ｎ１である。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザＨＡおよびＮＡは、それぞれ、Ｈ９Ｎ２である。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザＨＡおよびＮＡは、それぞれ、Ｈ７Ｎ７である。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザＨＡおよび／またはＮＡは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記ＶＬＰは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。
別の実施形態においては、上記トリインフルエンザＶＬＰによっては、脊椎動物において免疫応答が誘導されるであろう。これは、現在販売が認可されている承認されている不活化ワクチンと同様に処方された類似するトリインフルエンザ抗原よりも、約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１２８倍大きく強力（またはより高く強力）である。現在の処方物には、完全な不活化ウイルスワクチン（例えば、ホルムアルデヒド処理されたもの）、ウイルス成分ワクチン（化学的に破壊させられたもの）、およびサブユニットワクチン（精製された糖タンパク質）が含まれる。ワクチンの効力を決定するための方法は当該分野で公知であり、日常的に行われている。例えば、中和試験（ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）およびヘマグルチニン阻害試験を、現在製造が認可されている承認されている不活化ワクチンと同様に処方されたトリインフルエンザ抗原と比較して、トリＶＬＰワクチンの効力を決定するために行うことができる。１つの実施形態においては、効力における上記増大は、約０．２μｇ、約０．４μｇ、約０．６μｇ、約０．８μｇ、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、またはそれ以上のＶＬＰと、現在販売が認可されている不活化ワクチンと同様に処方された抗原が脊椎動物に投与された場合（すなわち、認可されている不活化ワクチンおよび／または任意の他の抗原と同様に処方された等量のＨＡおよび／またはＮＡが含まれている、ＶＬＰ中の等量のＨＡおよび／またはＮＡ）に、実現される。量は、ＨＡ含有量にしたがって測定することができる。例えば、１μｇの本発明のＶＬＰは、ＨＡが含まれているＶＬＰの溶液中の約１μｇのＨＡであるか、またはＶＬＰの重量から測定され得る。
季節的なインフルエンザワクチンは、各年のインフルエンザの症例の罹患率を低下させるために、毎年ヒトに投与される。現在は、米国で流行しているものは、Ａ型インフルエンザとＢ型インフルエンザの２つのサブタイプがある。したがって、現在のワクチンは、現在流行している株に対する防御を提供するための、３価のものである。毎年、インフルエンザウイルスのさまざまな株またはバリエーションが変化する。したがって、ほとんどの年について、新しいワクチン組成物が製造され、投与される。不活化ワクチンは、孵化鶏卵の中でのウイルスの増殖によって生産される。尿膜腔液が回収され、そしてウイルスが濃縮され、精製され、そして不活化される。したがって、現在認可されているインフルエンザウイルスワクチンには、残留している卵タンパク質が微量含まれる可能性があり、したがって、卵に対するアナフィラキシー性の過敏症を有しているヒトには投与されるべきではない。加えて、卵の供給業者が組織化されていなければならず、ワクチンの生産のための株は、次のインフルエンザの季節より数ヶ月前に選択されなければならず、それにより、このアプローチの柔軟性が制限され、多くの場合には、生産と流通に遅れおよび不足が生じる。加えて、いくつかのインフルエンザ株は、孵化鶏卵の中では十分には複製せず、これにより、増殖させ、ワクチンに処方することができるインフルエンザ株が制限され得る。
上記のように、本発明のＶＬＰには、生産のためには卵は必要ない。これらのＶＬＰは細胞培養システムによって作成される。したがって、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量の季節的なインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。上記で議論されたように、季節的なインフルエンザウイルスは、世界中のＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｃｅｎｔｅｒによる疫学的調査に基づいて所定のインフルエンザの季節についてヒトの集団の中で流行する（ｐａｓｓ）と決定されたインフルエンザウイルス株を意味する。上記研究、およびいくつかの単離されたインフルエンザウイルスは、詳細な試験のために４つのＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）参照試験所（そのうちの１つは、ＡｔｌａｎｔａのＣａｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）にある）のうちの１つに送られる。これらの試験所では、現在のワクチンに対して作成された抗体が流行しているウイルスおよび新規のｆｌｕウイルスに対してどの程度十分に反応するかが試験される。この情報は、ｆｌｕ活性についての情報とともにまとめられ、そして米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）の諮問委員会と、ＷＨＯ会議に提示される。これらの会議により、その後の秋および冬のためのｆｌｕワクチンに入れられる３種類のウイルス（Ａ型インフルエンザウイルスの２つのサブタイプとＢ型インフルエンザウイルスの１つのサブタイプ）の選択が行われる。選択は、北半球では２月に、南半球では９月に行われる。通常、ワクチンの中の３種類の株のうちの１つまたは２つは毎年変えられる。別の実施形態においては、実質的な免疫力の上記誘導により、インフルエンザの症状の期間が短くなる。
別の実施形態においては、本発明には、被験体において季節的なインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量の季節的なインフルエンザのＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰには、季節的なインフルエンザのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれる。別の実施形態においては、上記季節的なインフルエンザＶＬＰには季節的なインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質はＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡの断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、被験体において季節的なインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する上記方法には、少なくとも１有効用量の季節的なインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれ、ここでは、上記ＶＬＰは、原則として、季節的なインフルエンザのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。上記ＶＬＰには、さらに別のインフルエンザタンパク質および／またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰは、季節的なインフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザＨＡおよび／またはＮＡは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記ＶＬＰは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。
一般的には、本発明の季節的なインフルエンザＶＬＰは、１種類以上の季節的なインフルエンザウイルス株に対する実質的な免疫力を刺激するために十分な量で投与される。１つの実施形態においては、ＶＬＰは、異なるインフルエンザサブタイプのタンパク質（上記に列挙される）が含まれている他のＶＬＰと一緒に混合される。別の実施形態においては、処方物は、少なくとも２種類のＡ型インフルエンザサブタイプおよび／または少なくとも１種類のＢ型インフルエンザサブタイプに由来する、季節的なインフルエンザＨＡおよび／またはＮＡタンパク質とのＶＬＰの混合物が含まれている３価の処方物である。別の実施形態においては、上記Ｂ型のサブタイプは、上記と同じ方法で生産される。別の実施形態においては、多価の処方物には、上記のように、本発明の１種類以上のＶＬＰが含まれる。
別の実施形態においては、本発明のＶＬＰ（トリＶＬＰまたは季節的なＶＬＰ）は、１種類以上のインフルエンザウイルス株に対する防御を提供するであろう免疫応答を誘発し得る。特定のサブグループの特定の株から構築されたインフルエンザＶＬＰでの脊椎動物のこの交差防御は、様々な株および／またはサブグループのインフルエンザウイルスに対する交差防御を誘導するであろう。以下の例は、本発明のＶＬＰが様々な株および／またはサブグループとの交差反応を誘導できることを示している。
体液性の免疫系によっては、様々なインフルエンザ抗原に対する抗体が生産される。そのうち、ＨＡ特異的抗体は、ウイルスの中和、ひいては疾病の予防に最も重要である。ＮＡ特異的抗体は、感染の予防においては効果が低いが、これらは、感染した細胞からのウイルスの放出を少なくする。粘膜組織は、インフルエンザを含む多くの病原体の主要な侵入口であり、そして、粘膜の免疫系によっては、先天性免疫とは異なる、感染に対する第１線の防御が提供される。ＳＩｇＡは、そしてＩｇＭはある程度は、病原体の侵入を防ぐ粘膜の病原体に対する主要な中和抗体であり、ウイルスの複製を阻害するように細胞内で機能することができる。鼻汁には、特に、インフルエンザＨＡおよびＮＡに対する中和抗体が含まれる。これらは主にＩｇＡイソ型であり、局所的に生産される。最初の感染の際には、ＨＡに特異的な全部で３種類の主要なＩｇクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ）が、酵素結合免疫吸着アッセイによって、鼻洗浄液の中で検出され得るが、ＩｇＡおよびＩｇＭが、ＩｇＧよりも頻繁に検出される。ＩｇＡ、およびいくらかであるがＩｇＭも、局所的に活発に分泌され、一方、ＩｇＧは血清分泌物に由来する。局所的なＩｇＡ応答を有している被験体においては、血清ＩｇＡ応答もまた観察される。自然な感染によって刺激された局所的なＩｇＡ応答は、少なくとも３〜５ヶ月間持続し、そしてインフルエンザ特異的であるＩｇＡ前駆メモリー細胞（ＩｇＡ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌ）は局所的に検出され得る。ＩｇＡもまた、二次感染後の局所分泌液において優性なＩｇイソ型であり、ＩｇＡ応答がその後の感染の際に血清中で検出される。生存しているウイルスワクチンによって誘導された局所的に生産された中和抗体の存在は、野生型ウイルスでのチャレンジ後の感染および疾病に対する抵抗力と相関する。
インフルエンザ感染または疾病に対する抵抗力は、ＨＡおよびＮＡに対する局所および／または血清抗体のレベルと相関する。血清抗ＨＡ抗体は、インフルエンザに対する防御についての最も一般的に測定される相関関係があるものである（Ｃｏｘら、１９９９）。防御性の血清抗体（ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）力価≧４０）応答は、自然なインフルエンザ感染後に、被験体のうちのおよそ８０％において検出することができる。３種類の主要なＩｇクラスを全て生産するＢ細胞は、正常な被験体においては末梢血の中に存在し（Ｃｏｘら、１９９４）、そしてインフルエンザに感染した個体においても末梢血の中に存在する。ヒトにおいては、血清抗体は、インフルエンザ感染に対する抵抗力、およびインフルエンザ感染からの回復のいずれにおいても役割を担っている。ヒトにおけるＨＡおよびＮＡに対する血清抗体のレベルは、実験による感染後、および自然な感染後の疾病に対する抵抗力と相関関係にあり得る。最初の感染の際には、３種類の主要なＩｇクラスが１０〜１４日以内に検出され得る。ＩｇＡおよびＩｇＭレベルは２週間後にピークとなり、その後、低下し始める。一方、ＩｇＧのレベルは４〜６週間でピークとなる。ＩｇＧおよびＩｇＭは、初回応答において優性であり、ＩｇＧとＩｇＡは二次免疫応答において優性である。
したがって、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な防御抗体応答を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。別の実施形態においては、実質的な防御抗体応答の上記誘導により、インフルエンザの症状の期間が短くなる。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な防御抗体応答を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰには、インフルエンザウイルスＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質が含まれる。
別の実施形態においては、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な防御抗体応答を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰは、原則として、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる。上記ＶＬＰには、さらに別のインフルエンザタンパク質および／またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、原則として、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれ、そして、これには、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡの断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰは、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１からなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１は、季節的なインフルエンザおよび／またはトリインフルエンザに由来する。別の実施形態においては、上記ＨＡおよび／またはＮＡは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記ＶＬＰは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。
本明細書中で使用される場合は、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的に、あるいは部分的にコードされる１つ以上のポリペプチドが含まれているタンパク質である。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは順に、それぞれ、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位には四量体が含まれる。個々の四量体は、２つの同じポリペプチド鎖の対からなり、それぞれの対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有している。それぞれの鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担っている、約１００から１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。抗体は、完全な免疫グロブリンとして、または、様々なペプチダーゼでの消化によって生じる十分に特性決定された多数の断片として存在する。
細胞媒介性免疫もまた、インフルエンザ感染からの回復において役割を担っており、そしてインフルエンザが関係している合併症を防ぎ得る。インフルエンザ特異的細胞性リンパ球は、感染した被験体の血液中および下部呼吸管分泌液中で検出されている。インフルエンザに感染した細胞の細胞溶解は、インフルエンザ特異的抗体および補体と協力してＣＴＬによって媒介される。最初の細胞傷害性応答は、感染した個体、またはワクチン接種された個体において、６〜１４日後に血液中で検出することができ、２１日までに消滅する（Ｅｎｎｉｓら、１９８１）。インフルエンザ特異的ＣＴＬは、インビトロ培養物中で交差反応特異性を示す；したがって、これらは、同じタイプのインフルエンザに感染した細胞を溶解させるが、他のタイプのインフルエンザに感染した細胞は溶解させない（例えば、Ａ型インフルエンザウイルスに感染した細胞を溶解させるが、Ｂ型インフルエンザウイルスに感染した細胞は溶解させない）。内部非グリコシル化タンパク質Ｍ、ＮＰ、およびＰＢ２を認識するＣＴＬが単離されている（Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒら、１９８５）。ＣＴＬ応答は、Ａ型インフルエンザ株の間では交差反応性であり（Ｇｅｒｈａｒｄら、２００１）、そして、抗体との併用においては、ウイルスの拡散を最少にすることにおいて重要である（Ｎｇｕｙｅｎら、２００１）。
細胞媒介性免疫もまた、インフルエンザ感染からの回復において役割を担っており、そして、インフルエンザが関係している合併症を防ぎ得る。インフルエンザ特異的細胞性リンパ球は、感染した被験体の血液、および下部呼吸管において検出されている。インフルエンザに感染した細胞の細胞溶解は、インフルエンザ特異的抗体および補体と協力してＣＴＬによって媒介される。最初の細胞傷害性応答は、感染した個体、またはワクチン接種された個体において、６〜１４日後に検出することができ、２１日までに消滅する（Ｅｎｎｉｓら、１９８１）。インフルエンザ特異的ＣＴＬは、インビトロ培養物中で交差反応特異性を示す；したがって、これらは、同じタイプのインフルエンザに感染した細胞を溶解させるが、他のタイプのインフルエンザに感染した細胞は溶解させない（例えば、Ａ型インフルエンザウイルスに感染した細胞を溶解させるが、Ｂ型インフルエンザウイルスに感染した細胞は溶解させない）。内部非グリコシル化タンパク質Ｍ、ＮＰ、およびＰＢ２を認識するＣＴＬが単離されている（Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒら（１９８５））。ＣＴＬ応答は、Ａ型インフルエンザ株の間では交差反応性であり（Ｇｅｒｈａｒｄら、２００１）、そして、抗体との併用においてウイルスの拡散を最少にすることにおいて重要である（Ｎｇｕｙｅｎら、２００１）。
したがって、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な防御性の細胞性免疫応答を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザのＶＬＰを投与する工程が含まれる。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも１有効用量のインフルエンザＶＬＰを投与する工程が含まれる。ここでは、上記ＶＬＰは、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザＶＬＰにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡの断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、上記インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１は、季節的なインフルエンザおよび／またはトリインフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態においては、上記ＨＡおよび／またはＮＡは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記ＶＬＰは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。
上記に記載されたように、本発明のＶＬＰ（トリインフルエンザＶＬＰおよび／または季節的なインフルエンザＶＬＰ）は、被験体のインフルエンザ感染の少なくとも１つの症状を予防するかまたは軽減する。インフルエンザの症状は当業者に周知である。これには、発熱、筋肉痛、頭痛、ひどい倦怠感、乾性咳嗽、のどの痛み、体重の減少、および鼻炎が含まれる。したがって、本発明の方法には、インフルエンザウイルス感染に伴う少なくとも１つの症状の予防または軽減が含まれる。症状の軽減は、主観的に、または客観的に、例えば、被験体による自己評価によって、医師の評価によって、あるいは、適切なアッセイまたは測定（例えば、体温）（例えば、生活の質の評価、インフルエンザ感染もしくはさらに別の症状の進行の遅延、インフルエンザの症状の重篤度の低下が含まれる）、あるいは適切なアッセイ（例えば、抗体力価および／またはＴ細胞活性化アッセイ）を行うことによって決定され得る。客観的評価には、動物の評価とヒトの評価の両方が含まれる。
インフルエンザの管理についてのＡｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＡＣＩＰ）によって主張される主要なストラテジーは、インフルエンザによる重篤な合併症のリスクがあるヒト（具体的には、≧６５歳のヒト）へのワクチン接種である。しかし、毎年のインフルエンザの流行は衰えることなく継続し、我々の社会に対して有意な健康上の負担および金銭的な負担となる（Ｇｌａｓｅｒら、１９９６）。最近２０年（１９７６〜１９９９年）には、インフルエンザが原因である全ての過剰死亡の有意な増加が起こった。１９９０年から１９９９年には、毎年のインフルエンザが原因である全ての死亡が５０，０００件を超えた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００３）。最近１０年間で≧６５歳のヒトのワクチン接種率は６５％にまで増えたにもかかわらず、インフルエンザが原因である全ての過剰死亡においては、対応する減少は観察されていない。
したがって、インフルエンザの予防および管理のための別のストラテジーは、健常な小児および個体の全てに対するワクチン接種である。子供は感染率が高く、インフルエンザによる疾病および入院が医学的に付随する（Ｎｅｕｚｉｌら、２０００）。小児は、学校、家族、および社会におけるインフルエンザの伝染において重要な役割を担っている。社会において学齢期の児童のおよそ８０％に現在のインフルエンザワクチンをワクチン接種することによって、成人の呼吸器疾患、および高齢者の過剰死亡が減少した（Ｒｅｉｃｈｅｒｔら、２００１）。この概念は「コミュニティー免疫（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）または「間接予防（ｈｅｒｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」として知られており、疾患に対して社会を防御する重要な部分を果たすと考えられている。ワクチン接種されたヒトはインフルエンザウイルスを中和する抗体を有するので、彼らはインフルエンザウイルスを他のヒトに伝染させる可能性はかなり低い。したがって、ワクチン接種されていないヒト（およびワクチンが弱くなったヒト、またはワクチンが完全には有効ではなかったヒト）でも、多くの場合には、彼らの周りのワクチン接種された人が病気にならないので、間接予防によって防御することができる。間接予防は、ワクチン接種されたヒトの割合が多ければ多いほど有効である。間接予防を得るためには、社会のうちのおよそ９５％がワクチンによって防御されなければならないと考えられている。免疫化されていないヒトは、彼らおよび他の人が疾患にかかる可能性を高める。
したがって、本発明には、社会の集団に対して本発明のＶＬＰを投与することによる、免疫力がない個体またはワクチン接種されていない個体の間でのインフルエンザウイルス感染の罹患率を低下させるために、集団または社会に対してインフルエンザウイルス感染に対する実質的な防御免疫力を誘導する方法が含まれる。１つの実施形態においては、ほとんどの学齢期の児童が、本発明のＶＬＰを投与することによってインフルエンザウイルスに対して免疫化される。別の実施形態においては、社会のほとんどの健常な個体が、本発明のＶＬＰを投与することによってインフルエンザウイルスに対して免疫化される。別の実施形態においては、本発明のＶＬＰは、「ダイナミックワクチン（ｄｙｎａｍｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」ストラテジーの一部である。ダイナミックワクチンは、新しい世界的に流行する株に関係している低効力のワクチンの安定した生産であるが、抗原性のドリフトが原因で、哺乳動物においては完全な防御を提供できない可能性がある（Ｇｅｒｍａｎｎら、２００６を参照のこと）。世界的に流行する株の将来の実態についての不確実さの理由から、十分に適合した世界的に流行する株を備蓄することはほとんど不可能である。しかし、あまり適合していないが、有効である可能性があるワクチンでのワクチン接種によっては、世界的に流行するウイルスの拡散を遅らせることができる可能性があり、そして／また、世界的に流行するインフルエンザウイルス株の症状の重篤度を下げる可能性がある。
本発明にはまた、インフルエンザＶＬＰが含まれているワクチンが含まれる。ここでは、被験体に投与された場合には、上記ワクチンによって、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力が誘導される。別の実施形態においては、実質的な免疫力の上記誘導により、インフルエンザの症状の期間が短くなる。別の実施形態においては、上記ワクチンにより、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力が誘導され、上記ワクチンには、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質を含むＶＬＰが含まれる。別の実施形態においては、上記ワクチンにより、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力が誘導され、上記ワクチンには、原則としてインフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなるＶＬＰが含まれる。上記ＶＬＰには、さらに別のインフルエンザタンパク質および／またはタンパク質混入物質が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、上記ワクチンによって、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力が誘導され、上記ワクチンには、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなるＶＬＰが含まれる。別の実施形態においては、上記ワクチンによって、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫力が誘導され、上記ワクチンには、インフルエンザタンパク質を含むＶＬＰが含まれる。ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる。これらのＶＬＰには、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１が含まれ、これには、さらに別の細胞性の構成成分（例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など）が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質（Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡの断片以外）は含まれない。別の実施形態においては、上記インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質は、トリインフルエンザウイルス、および／または季節的なインフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態においては、上記ＨＡおよび／またはＮＡは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記ＶＬＰは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。別の実施形態においては、上記ワクチンは哺乳動物に投与される。さらなる実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。
本発明は以下の実施例によってさらに説明される。以下の実施例は限定と解釈されるべきではない。本明細書を通じて引用される全ての参考文献、特許、および公開されている特許出願の内容、ならびに図面および配列表は、引用により本明細書中に組み入れられる。
実施例１
材料および方法
トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子を、バキュロウイルスバックミド発現システムを使用してヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ−９Ｓ細胞株；ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４０４７）の中で発現させた。ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子を逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスから単離したＲＮＡを使用して合成した（図１、２、および３）。逆転写およびＰＣＲのために、トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した（表１）。これらの遺伝子のｃＤＮＡコピーを、最初に、細菌のサブクローニングベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにクローニングした。得られた３種類のｐＣＲ２．１ＴＯＰＯをベースとするプラスミドから、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子を、バキュロウイルストランスファーベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の中のＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの下流に挿入し、３種類のｐＦａｓｔＢａｃ−１をベースとするプラスミド：それぞれ、これらのインフルエンザウイルス遺伝子を発現するｐＨＡ、ｐＮＡ、およびｐＭ１を得た。その後、ＨＡ遺伝子とＭ１遺伝子の両方（それぞれ、別のポリヘドリンプロモーターの下流にある）をコードする１つのｐＦａｓｔＢａｃ１をベースとするプラスミドｐＨＡＭを構築した（図４）。ｐＮＡプラスミドの中に隣接する５’領域と３’領域を有しているＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を決定した（配列番号１）（図１）。同時に、隣接する領域を有しているＨＡ遺伝子とＭ１遺伝子のヌクレオチド配列もまた、ｐＨＡＭプラスミドを使用して決定した（配列番号２および３）（図２および３）。
最後に、ＨＡ発現カセットとＭ１発現カセットの両方をコードする、ｐＨＡＭプラスミドに由来する制限ＤＮＡ断片を、ｐＮＡプラスミドにクローニングした。これによって、トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子をコードするプラスミドｐＮＡＨＡＭを得た（図４）。
プラスミドｐＮＡＨＡＭを使用して、ゲノムの中に組み込まれたインフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子を含む（それぞれ、別のバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流にある）組み換え体バキュロウイルスを構築した。得られた組換え体バキュロウイルスでの、感染許容状態のＳｆ−９Ｓ昆虫細胞の感染によって、そのような組み換え体バキュロウイルスに感染した個々のＳｆ−９Ｓ細胞の中でのこれらの３種類のインフルエンザ遺伝子の同時発現が生じた。
感染させたＳｆ−９Ｓ細胞の中の発現産物を、感染の７２時間後に特性決定した（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、クマシーブルータンパク質染色、ならびに、ＨＡ特異的抗体およびＭ１特異的抗体を使用するウェスタン免疫ブロット分析による）（図５）。ウェスタン免疫ブロット分析を、インフルエンザウイルスＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）に対して惹起させられたウサギ抗体（ＣＤＣ，Ａｔｌａｎｔａ、Ｇａ．，ＵＳＡ）、またはインフルエンザＭ１タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＵＫ）を使用して行った。予想される分子量（それぞれ、６４ｋｄ、６０ｋｄ、および３１ｋｄ）のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質を、ウェスタン免疫ブロット分析によって検出した。このアッセイにおいて検出したＨＡタンパク質の量と比較すると、ＮＡタンパク質は、インフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスに対するウサギ血清との低い反応性を示した。検出することができるＮＡタンパク質の量の説明には、ＨＡタンパク質と比較した、組み換え体バキュロウイルスに感染させたＳｆ−９Ｓ細胞からのＮＡタンパク質の低い発現レベル、ウェスタン免疫ブロットアッセイの変性条件下でのこの血清とのＮＡの低い反応性（膜結合の電気泳動の間の重要なＮＡエピトープの排除が原因である）、ＨＡ抗体と比較した低いＮＡ抗体親和性、または血清中のＮＡ抗体の少ない量が含まれた。
Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質を発現する組み換え体バキュロウイルスに感染させたＳｆ−９Ｓ細胞からの培養培地もまた、インフルエンザタンパク質についてプローブした。明澄化させた培養上清を、インフルエンザウイルスの高分子タンパク質複合体（例えば、サブウイルス粒子、ＶＬＰ、ＶＬＰの複合体、ならびに、おそらくは、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる他の自己アセンブリした粒子）を濃縮するために、２７，０００ｒｐｍで超遠心分離した。ペレット状となったタンパク質産物をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）の中に再懸濁し、不連続な２０〜６０％のスクロース段階勾配上での超遠心分離によってさらに精製した。スクロース勾配からの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウェスタン免疫ブロット分析、および電子顕微鏡によって分析した。
予想された分子量のインフルエンザＨＡおよびＭ１タンパク質を、クマシーブルー染色およびウェスタン免疫ブロット分析によって、複数のスクロース密度勾配画分の中で検出した（図６、表１）。これは、感染したＳｆ−９Ｓ細胞からのインフルエンザウイルスタンパク質が、高分子量の複合体（例えば、カプソメア、サブウイルス粒子、ＶＬＰ、および／またはＶＬＰ複合体）に凝集することが示唆している。ＮＡタンパク質は、クマシーブルー染色とウェスタン免疫ブロット分析によっては一貫性なく検出された（その原因はおそらく、ウェスタン免疫ブロットアッセイにおいては、ウサギの抗インフルエンザ血清は変性したＮＡタンパク質を認識することができないことである）が、ノイラミニダーゼ酵素活性のアッセイにおいては、一貫して検出された（図１０）。
Figure 2009511084
Figure 2009511084
 高分子量ＶＬＰの存在をゲル濾過クロマトグラフィーによって確認した。インフルエンザウイルスタンパク質が含まれているスクロース密度勾配画分によるアリコートを、質量に基づく分画のためにＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラム上にロードした。カラムを、それぞれ、２，０００，０００；２０，０００；および１，３５７ダルトンの見かけの分子量を有しているデキストランブルー（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｂｌｕｅ）２０００、デキストランイエロー（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｙｅｌｌｏｗ）、およびビタミンＢ１２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で較正し、カラムの空隙容量を決定した。予想したように、高分子量のインフルエンザウイルスタンパク質は、カラムの空隙容量に移動し、これは、ウイルス粒子のような巨大分子タンパク質の特徴である。画分をウェスタン免疫ブロット分析によって分析して、インフルエンザタンパク質およびバキュロウイルスタンパク質を検出した。例えば、Ｍ１タンパク質は空隙容量画分の中で検出された。これはまた、バキュロウイルスタンパク質も含んでいた（図７）。
スクロース勾配画分の中のインフルエンザＶＬＰおよびタンパク質の形態を電子顕微鏡検査によって解析した。ネガティブ染色電子顕微鏡検査のために、２つのスクロース密度勾配画分からのインフルエンザタンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２％のグルタルアルデヒドで固定した。ネガティブ染色した試料の電子顕微鏡検査により、両方の画分の中の巨大分子タンパク質複合体またはＶＬＰの存在が明らかになった。これらのＶＬＰは、およそ６０および８０ｎｍの直径を含む様々な大きさ、ならびに形態（球形）を示した。両方のタイプの粒子の大きな複雑さもまた検出され、さらには、棒状の粒子も検出された（図８）。全ての観察された巨大分子構造はそれらの表面上に鋭くとがった部分（ｓｐｉｋｅ）（ペプロマー（ｐｅｐｌｏｍｅｒ））を有しており、これはインフルエンザウイルスの特徴である。８０ｎｍの粒子の大きさおよび外観は野生型インフルエンザウイルスの粒子と類似しているので、これらの構造はおそらくＶＬＰを呈し、これは、野生型インフルエンザビリオンに対して異なる類似性（類似する粒子の幾何学、構造、三角形の数（ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）、対称性、および他の特徴）を有する。およそ６０ｎｍの小さい粒子は、形態学的にも、構造的にも、ＶＬＰとは異なるサブウイルス粒子を示し得る。様々な大きさおよび形態の組み換え体巨大分子タンパク質の類似する表現形もまた、他のウイルスについて報告された。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスの組み換え体コア抗原（ＨＢｃＡｇ）は、様々な大きさの粒子を形成し、これらは様々な構造および三角形の数Ｔ＝４およびＴ＝３を、それぞれ有する（Ｃｒｏｗｔｈｅｒら、１９９４）。
精製されたインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＶＬＰの機能的特性を特性決定するために、試料をヘマグルチニンアッセイ（図９）およびノイラミニダーゼ酵素アッセイ（図１０）において試験した。ヘマグルチニンアッセイについては、精製したインフルエンザＶＬＰの２倍希釈物を０．６％のモルモットの赤血球と混合し、４℃で１時間または１６時間インキュベートした。ヘマグルチニン化の程度を目視検査し、赤血球を凝集させることができる組換え体インフルエンザタンパク質の最大希釈を決定し、記録した（図９）。再び、スクロース密度勾配による多くの画分がヘマグルチニン活性を示し、これは、インフルエンザタンパク質の複数の巨大分子形態および単量体形態が存在することを示唆している。検出された最も高い力価は１：４０００であった。対照実験においては、野生型インフルエンザＡ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇウイルスは、１：２０００の力価を示した。ヘマグルチニンアッセイによっては、インフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる組み換え体ＶＬＰが機能的に活性であることが明らかになった。これはＶＬＰの中でのＨＡサブユニットタンパク質のアセンブリ、立体構造、および折り畳みが、野生型インフルエンザウイルスのものと類似しているか、または同じであることを示唆していた。
加えて、ノイラミニダーゼ酵素アッセイを、精製したＨ９Ｎ２ ＶＬＰの試料について行った。スクロース密度勾配画分中のノイラミニダーゼ活性の量を、基質としてフェチュインを使用して決定した。ノイラミニダーゼアッセイにおいては、ノイラミニダーゼによって、基質分子からシアル酸が切断されて、測定されるシアル酸が放出された。亜ヒ酸塩試薬を酵素活性を停止させるために添加した。遊離させられたシアル酸の量を、遊離のシアル酸の量に比例してピンク色を生じるチオバルビツール酸を用いて化学的に決定した。色（発色団）の量を、５４９ｎｍの波長で分光光学的に測定した。この方法を使用して、ノイラミニダーゼ活性を、インフルエンザＶＬＰが含まれているスクロース勾配画分の中で明らかにした（図１０）。予想したように、活性はいくつかの画分の中で観察され、２つのピーク画分があった。ポジティブ対照としては、野生型インフルエンザウイルスを使用した。野生型インフルエンザウイルスは、精製されたインフルエンザＶＬＰのものに匹敵するノイラミニダーゼ酵素活性を示した。これらの知見は、タンパク質の立体構造に関するＨＡの結果を裏づけ、インフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスの精製したＶＬＰが野生型インフルエンザウイルスと機能的に類似していることを示唆していた。
上記の分析およびアッセイによる結果は、インフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質の発現が、バキュロウイルスに感染した細胞からの機能的なＶＬＰの自己アセンブリおよび輸送に十分であることを示していた。これらのインフルエンザＶＬＰは、自己アセンブリしたインフルエンザ構造タンパク質を呈し、そして野生型インフルエンザウイルスの特性と類似する機能的および生化学的特性を示すので、これらのインフルエンザＶＬＰは、有効なインフルエンザワクチンに不可欠な表面エピトープを含む重要な立体構造を保存していた。
実施例２
トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９ウイルス遺伝子のＲＴ−ＰＣＲクローニング
組み換え体インフルエンザウイルスタンパク質の生産を指示することができる合成の核酸配列を提供することが、本発明の１つの目的である。そのような合成の核酸配列は、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法によって、ウイルスから単離されたインフルエンザウイルスの天然のゲノムＲＮＡを使用して得た。この用途の目的については、核酸配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質をコードするそれらの任意の合成の変異体を意味する。
トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスは、Ｋ．Ｓｕｂｂａｒａｏ博士（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａ．，ＵＳＡ）によって提供された。ウイルスのゲノムＲＮＡを酸フェノールＲＮＡ抽出法によって、ＣＤＣのＢｉｏｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ ３（ＢＳＬ３）汚染条件下で、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）を使用して単離した。ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ分子は、ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する逆転写、ならびに、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーとＴａｑ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＰＣＲによって得た（表１）。ＰＣＲ断片を、細菌のサブクローニングベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＥｃｏＲＩ部位の間にクローニングし、これによりＨＡ、ＨＡ、およびＭ１ ｃＤＮＡクローンを含む３種類の組み換え体プラスミドを得た。
実施例３
ヒトインフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９４（Ｈ３Ｎ２）ウイルス遺伝子のＲＴ−ＰＣＲクローニング
インフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７（Ｈ３Ｎ２）ウイルスは、Ｍ．Ｍａｓｓａｒｅ博士（Ｎｏｖａｖａｘ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）から得た。ウイルスのゲノムＲＮＡを酸フェノールＲＮＡ抽出法によって、Ｎｏｖａｖａｘ，Ｉｎｃ．のＢＳＬ２汚染条件下で、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離した。ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ分子は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、およびＮＰタンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する逆転写とＰＣＲによって得た（表１）。ＰＣＲ断片を、細菌のサブクローニングベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＥｃｏＲＩ部位の間にクローニングして、ＨＡ、ＨＡ、Ｍ１、Ｍ２、およびＮＰ ｃＤＮＡクローンを含む５種類の組み換え体プラスミドを得た。
実施例４
トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９ウイルス ｃＤＮＡのバキュロウイルストランスファーベクターへのクローニング
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯをベースとするプラスミドから、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子を、ｐＦａｓｔＢａｃ１バキュロウイルストランスファーベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の中に、ポリへドロン遺伝子座とＴｎ７ ａｔｔ部位の中に、そしてバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流であり、ポリアデニル化シグナル配列の上流にサブクローニングした。ウイルス遺伝子を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結した。ＨＡ遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ＨＡに由来するＢａｍＨＩ−Ｋｐｎ Ｉ ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡの中に挿入した。ＮＡ遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ＮＡに由来するＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡの中に挿入した。Ｍ１遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−Ｍ１に由来するＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡの中に挿入した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細菌（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）をこれらのＤＮＡ連結反応物で形質転換し、形質転換されたコロニーを得、そして細菌クローンを単離した。得られたｐＦａｓｔＢａｃ１をベースとするプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＡ、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＮＡ、およびｐＦａｓｔＢａｃ１−Ｍ１を、アガロースゲル上での制限酵素マッピングによって特性決定した（図４Ａ）。クローニングした遺伝子の図１〜３に示したようなヌクレオチド配列を、自動ＤＮＡ配列決定法によって決定した。ＤＮＡ配列分析は、クローニングしたインフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子についてのヌクレオチド配列と同じであることを示していた（インフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＮＡ、ＨＡ、およびＭ１遺伝子（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４０４６２９、ＡＪ４０４６２６、およびＡＪ２７８６４６））。
実施例５
ヒトインフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７ウイルスｃＤＮＡのバキュロウイルストランスファーベクターへのクローニング
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯをベースとするプラスミドから、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、およびＮＰ遺伝子を、ｐＦａｓｔＢａｃ１バキュロウイルストランスファーベクターの中に、ポリへドロン遺伝子座とＴｎ７ ａｔｔ部位の中に、そしてバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流であり、ポリアデニル化シグナル配列の上流にサブクローニングした。ウイルス遺伝子を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結した。ＨＡ遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ｈＨＡ３に由来するＢａｍＨＩ−Ｋｐｎ Ｉ ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡの中に挿入した。ＮＡ遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ｈＮＡに由来するＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡの中に挿入した。Ｍ１遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ｈＭ１に由来するＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡの中に挿入した。Ｍ２遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ｈＭ２に由来するＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡの中に挿入した。ＮＰ遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ｈＮＰに由来するＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡの中に挿入した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細菌をこれらのＤＮＡ連結反応物で形質転換し、形質転換されたコロニーを得、そして細菌クローンを単離した。得られたｐＦａｓｔＢａｃ１をベースとするプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ｈＨＡ３、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ｈＮＡ２、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ｈＭ１、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１−ｈＭ２、およびｐＦＡＳＴＢＡＣ１−ｈＮＰを、アガロースゲル上での制限酵素マッピングによって特性決定した。クローニングした遺伝子のヌクレオチド配列を、自動ＤＮＡ配列決定法によって決定した。ＤＮＡ配列分析は、クローニングしたインフルエンザＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、およびＮＰ遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子のヌクレオチド配列と同じであることを示していた。
実施例６
複数のトリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９ウイルスの遺伝子をコードする多重遺伝子バキュロウイルストランスファーベクターの構築
複数のインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスの遺伝子を発現するｐＦａｓｔＢａｃ１をベースとするバックミドトランスファーベクターを構築するために、最初に、Ｍ１遺伝子が含まれているｐＦａｓｔＢａｃ１−Ｍ１プラスミドに由来するＳｎａＢＩ−ＨｐａＩ ＤＮＡ断片を、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＡのＨｐａＩ部位にクローニングした。これにより、別々の発現カセットの中に、そして別々のポリヘドリンプロモーターの制御下で発現させられるＨＡ遺伝子とＭ１遺伝子の両方をコードするｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＡＭプラスミドを得た。
最後に、ＨＡ発現カセットとＭ１発現カセットが含まれているｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＡＭに由来するＳｎａＢＩ−ＡｖｒＩＩ ＤＮＡ断片を、ＨｐａＩ−ＡｖｒＩＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１−ＮＡプラスミドＤＮＡに導入した。これにより、インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子の発現のための３つの異なる発現カセットをコードし、別々のポリヘドリンプロモーターの制御下で発現させられる、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＮＡＨＡＭを得た（図４Ｂ）。
別の実施例においては、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１−ｈＨＡ３（実施例５を参照のこと）に由来するＨ３遺伝子を、異種インフルエンザＶＬＰの発現および生産のための第４のインフルエンザウイルス遺伝子として、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１−ＮＡＨＡＭにクローニングした。
実施例７
昆虫細胞の中でのトリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９ウイルスのＮＡ、ＨＡ、およびＭ１遺伝子をコードする多重遺伝子組み換え体バキュロウイルスの作成
得られた多重遺伝子バックミドトランスファーベクターｐＦａｓｔＢａｃ１−ＮＡＨＡＭを使用して、昆虫細胞の中での発現のためのトリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子をコードする多重遺伝子組み換え体バキュロウイルスを作成した。組み換え体バックミドＤＮＡを、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０ＢＡＣ細胞（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の中に有しているｐＦａｓｔＢａｃ１−ＮＡＨＡＭ ＤＮＡとＡｃＭＮＰＣバキュロウイルスゲノムとの間でのポリヘドリンとＴｎ７ ａｔｔ ＤＮＡ配列での部位特異的組み換えによって得た（図４Ｂ）。組み換え体バックミドＤＮＡを、ミニプレップＤＮＡ法によって単離し、陽イオン性脂質ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＳｆ−９ｓ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、組み換え体バキュロウイルスを単離し、プラークを精製し、そしてＳｆ−９Ｓ昆虫細胞の中で増幅させた。ウイルスのストックをＳｆ−９Ｓ昆虫細胞の中で調製し、そしてトリインフルエンザウイルスＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子産物の発現について特性決定した。得られた組み換え体バキュロウイルスをｂＮＡＨＡＭ−Ｈ９Ｎ２と命名した。
実施例８
昆虫細胞の中での組み換え体トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９タンパク質の発現
無血清培地（ＨｙＱ ＳＦＭ，ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｏｇｄｅｎ，Ｕｔａｈ）の中で２８℃の震盪フラスコの中で懸濁培養物として維持したＳｆ−９Ｓ昆虫細胞を、３ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で、組み換え体バキュロウイルスｂＮＡＨＡＭ−Ｈ９Ｎ２に２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で感染させた。ウイルス感染を７２時間進行させて、インフルエンザタンパク質を発現させた。感染した昆虫細胞中でのトリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＨＡおよびＭ１タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン免疫ブロット分析によって確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、４〜１２％の直線勾配のＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、還元条件と変性条件下で行った。ウェスタン免疫ブロット分析の中の一次抗体は、ＣＤＣから入手したトリインフルエンザウイルスＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）に対して惹起させられたポリクローナルウサギ抗血清、およびインフルエンザＭ１タンパク質に対するマウスモノクローナル抗血清（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＵＫ）であった。ウェスタン免疫ブロット分析のための二次抗体は、ウサギまたはマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対して惹起させられた、アルカリホスファターゼ結合ヤギＩｇＧ抗血清（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．，ＵＳＡ）であった。これらの分析の結果（図５）は、ＨＡタンパク質とＭ１タンパク質が、バキュロウイルスに感染させられた昆虫細胞の中で発現されることを示していた。
実施例９
組み換え体トリインフルエンザＨ９Ｎ２ウイルス様粒子および巨大分子タンパク質複合体の精製
トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子産物を発現する組み換え体バキュロウイルスｂＮＡＨＡＭ−Ｈ９Ｎ２に感染させたＳｆ−９Ｓ昆虫細胞に由来する培養上清（２００ｍｌ）を、低速遠心分離によって回収した。培養上清を、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ高速遠心分離機でＧＳ−３ローターを使用して、４℃で１０，０００×ｇで１時間の遠心分離によって明澄化させた。ウイルスとＶＬＰを、Ｓｏｒｖａｌ ＯＴＤ−６５超遠心分離機の中での、２７，０００ｐｍで３時間、４℃での、Ｓｏｒｖａｌ ＴＨ−６４１スイングバケットローターを使用した遠心分離によって、明澄化させた培養上清から単離した。ウイルスのペレットを、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、２０〜６０％の不連続なスクロース段階勾配上にロードし、Ｓｏｒｖａｌ ＯＴＤ−６５超遠心分離機の中での、２７，０００ｐｍで１６時間、４℃での、Ｓｏｒｖａｌ ＴＨ−６４１ローターを使用した遠心分離によって分解させた。画分（０．５ｍｌ）を、スクロース勾配の最上部から回収した。
複数のスクロース勾配画分中のインフルエンザタンパク質を、実施例６において上記に記載したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン免疫ブロット分析によって分析した。ＨＡタンパク質およびＭ１タンパク質は、ウェスタンブロット分析によって示されたものと同じスクロース勾配画分の中に見られ（図６）、そしてこのことは、ＨＡタンパク質とＭ１タンパク質が巨大分子タンパク質複合体として会合していることを示唆していた。ＨＡタンパク質とＭ１タンパク質はいずれも、スクロース勾配全体にわたって複数の画分の中で見られた。このことは、これらの組み換え体ウイルスタンパク質が様々な密度および組成の巨大分子タンパク質複合体と会合していることを示唆している。
実施例１０
ゲル濾過クロマトグラフィーによる組み換え体トリインフルエンザＨ９Ｎ２のＶＬＰおよびタンパク質の分析
ＶＬＰのようなタンパク質巨大分子および単量体タンパク質は、ゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィー上では、それらの質量の大きさおよび形状に基づいて異なって移動する。スクロース抗体画分に由来する組み換え体インフルエンザタンパク質が単量体タンパク質であるかまたはＶＬＰのような巨大分子タンパク質複合体であるかを決定するために、１４ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の樹脂ベッド容量を有しているクロマトグラフィーカラム（７ｍｍ×１４０ｍｍ）を準備した。サイズ排除カラムをＰＢＳで平衡化し、それぞれ、２，０００，０００；２０，０００；および１，３５７ダルトンの見かけの分子量を有しているデキストランブルー（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｂｌｕｅ）２０００、デキストランイエロー（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｙｅｌｌｏｗ）、およびビタミンＢ１２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で較正して、カラムの空隙容量を決定した。空隙容量（６ｍｌの画分）の中のカラムからは、デキストランブルー２０００もまた溶出した。予想したように、組み換え体インフルエンザタンパク質複合体が、空隙容量（６ｍｌの画分）のカラムから溶出した。この結果は、ＶＬＰのような高分子量の巨大分子タンパク質複合体の特徴である。カラム画分中のウイルスタンパク質を、上記実施例６に記載したように、ウェスタン免疫ブロット分析によって検出した。Ｍ１タンパク質は空隙容量の画分の中で検出された（図７）。予想したように、バキュロウイルスタンパク質もまた、空隙容量の中に含まれていた。
実施例１１
組み換え体インフルエンザＶＬＰの電子顕微鏡検査
スクロース勾配上で単離した、組み換え体トリインフルエンザタンパク質が含まれている巨大分子タンパク質複合体がインフルエンザビリオンと同様の形態を有しているかどうかを決定するために、ネガティブ染色された試料の電子顕微鏡試験を行った。組み換え体トリインフルエンザＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）タンパク質複合体を、実施例７に記載したように、不連続なスクロース勾配上での超遠心分離によって培養上清から濃縮し、精製した。スクロース勾配画分のアリコートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２％のグルタルアルデヒドで処理し、新しく放電させたプラスチック／炭素コーティングした格子上に吸着させ、そして蒸留水で洗浄した。試料を２％のタングストリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で染色し、透過型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ）を使用して観察した。２つのスクロース勾配画分に由来するネガティブ染色した組み換え体トリインフルエンザＨ９Ｎ２タンパク質複合体の試料の電子顕微鏡写真は、２つのスクロース勾配画分から球状および棒状の粒子を示した（図８）。粒子は、様々な大きさ（６０および８０ｎｍ）および形態を有していた。両方のタイプの粒子の大きな複雑さもまた検出され、さらには、棒状の粒子も検出された（図８）。全ての観察されたタンパク質複合体構造は、インフルエンザウイルスＨＡおよびＮＡペプロマーに似ている鋭くとがった部分（ｓｐｉｋｅ）を有している表面上の突起を示した。８０ｎｍの粒子の大きさおよび外観は野生型インフルエンザウイルスの粒子のものと類似しているので、これらの構造はおそらくエンベロープを持ったインフルエンザＶＬＰを呈する。およそ６０ｎｍの小さい粒子は、おそらく、形態学的にも、構造的にも、上記ＶＬＰとは異なるサブウイルス粒子を呈する。
実施例１２
ヘマグルチニンアッセイによるインフルエンザタンパク質の機能的特徴の分析
精製したインフルエンザＶＬＰおよびタンパク質がインフルエンザウイルスの特徴である機能的活性（例えば、ヘマグルチニン活性およびノイラミニダーゼ活性）を有しているかどうかを決定するために、精製したインフルエンザＶＬＰおよびタンパク質を、ヘマグルチニンアッセイおよびノイラミニダーゼアッセイにおいて試験した。
ヘマグルチニンアッセイについては、インフルエンザＶＬＰまたはポジティブ対照である野生型のＡ型インフルエンザウイルスが含まれているスクロース勾配画分の２倍希釈物のシリーズを準備した。その後、これらを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の０．６％のモルモット赤血球と混合し、４℃で１時間〜１６時間インキュベートした。ネガティブ対照としては、ＰＢＳを使用した。ヘマグルチニン化の程度を目視検査し、モルモットの赤血球を凝集させることができる画分の最大希釈を決定した（図９）。精製したインフルエンザＶＬＰおよびタンパク質について観察された最も高いヘマグルチニン化の力価は１：４０００であった。これは、１：２０００であった野生型インフルエンザによって示された力価よりも高かった。
実施例１３
ノイラミニダーゼアッセイによるインフルエンザタンパク質の機能的特性の分析
インフルエンザＶＬＰが含まれているスクロース勾配画分中のノイラミニダーゼ活性の量をノイラミニダーゼアッセイによって決定した。このアッセイでは、ＮＡ（酵素）が基質（フェチュイン）に対して作用して、シアル酸が放出させられる。亜ヒ酸塩試薬を酵素活性を停止させるために添加した。遊離させられたシアル酸の量を、遊離のシアル酸に比例してピンク色を生じるチオバルビツール酸を用いて化学的に決定した。色（発色団）の量を、５９４ｎｍの波長で分光光度計で測定した。図８に示したデータは、有意な量のシアル酸がＶＬＰが含まれているスクロース勾配の画分によって生産されたこと、およびこれらの画分がヘマグルチニン活性を示すそれらの画分と対応していたことを示していた。
実施例１４
機能的な同型の組み換え体インフルエンザＨ９Ｎ２ ＶＬＰでのＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化
組み換え体インフルエンザＶＬＰの免疫原性を、マウスの免疫化、それに続く免疫血清のウェスタンブロット分析によって確認した。Ａ型トリインフルエンザ／ＨｏｎｋＫｏｎｇ／１０７３／９９に由来するウイルスＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質から構成されており、そして、スクロース勾配上で精製した組み換え体ＶＬＰ（１μｇ／注射）を、０日目および２８日目に、１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの三角筋部に皮下に接種した（図１１）。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を、ネガティブ対照として５匹のマウスに同様に投与した。マウスを、−１日目（事前採血）、２７日目（１回目の採血）、および５４日目（２回目の採血）に、眼窩上の孔（ｓｕｐｒａｏｒｂｉｔａｌ ｃａｖｉｔｙ）から採血した。血清を、一晩の凝固および遠心分離後に血液試料から回収した。
ウェスタンブロット分析のために、２００ｎｇの不活化Ａ型トリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２または低温適応性のＡ型トリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２、ならびに、Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ Ｐｌｕｓ ２で予め染色したタンパク質標準物（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を変性させ（９５℃、５分間）、そして、ＭＢＳ緩衝液中の４〜１２％のポリアクリルアミド勾配ＮｕＰＡＧＥゲル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）上の還元条件（１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で、１７２ボルトで、ブロモフェノールブルー追跡用色素が消滅するまで電気泳動した。タンパク質ゲルについては、電気泳動タンパク質をコロイド状のクマシーブルー試薬（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）での染色によって視覚化した。タンパク質を、標準的なウェスタンブロット手順によってゲルからメタノール中のニトロセルロース膜に移動させた。ＶＬＰで免疫化したマウス、および不活化トリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２（ポジティブ対照血清）で免疫化したウサギに由来する血清を、それぞれ、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）中で１：２５および１：１００に希釈し、一次抗体として使用した。５％のカゼインでブロックしたタンパク質を結合させた膜を、一次抗血清と、室温で６０分間、一定速度で震盪させながら反応させた。Ｔｗｅｅｎ ２０が含まれているリン酸緩衝化生理食塩溶液での一次抗体膜の洗浄後、二次抗血清（ヤギ抗マウスＩｇＧ−−アルカリホスファターゼ結合体（１：１０，０００）またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−−アルカリホスファターゼ結合体（１：１０，０００））を膜と６０分間反応させた。Ｔｗｅｅｎ ２０が含まれているリン酸緩衝化生理食塩水での二次抗体膜の洗浄後、膜上の抗体が結合したタンパク質を、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のような発色性の基質での現像によって視覚化させた。
ウェスタンブロット分析の結果（図１２）は、ウイルスのＨＡタンパク質およびＭ１タンパク質（それぞれ、７５および３０ｋｄ）に類似する分子量を有しているタンパク質がポジティブ対照血清に結合し（図１２Ｂ）、そして、組み換え体インフルエンザＨ９Ｎ２ ＶＬＰで免疫化したマウスに由来する血清にも結合した（図１２Ａ）ことを示している。これらの結果は、組み換え体インフルエンザＨ９Ｎ２は、単独で、この投与経路によってマウスにおいて免疫原性であることを示していた。
実施例１５
Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＶＬＰの免疫原性とＢＡＬＢ／ｃマウスでのチャレンジ実験
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１００μｇのＮｏｖａｓｏｍｅアジュバントを含むか、またはＮｏｖａｓｏｍｅアジュバントを含まないＨ９Ｎ２ ＶＬＰ（１μｇのＨＡまたは１０μｇのＨＡ／用量）で、０日目および２１日目に免疫化し、そして５７日目に同種の感染性ウイルスＩＮでチャレンジした。マウスを、０日目、２７日目、および５７日目に採血し、そしてシチメンチョウＲＢＣを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩ）によって抗ＨＡ抗体について、そしてＥＬＩＳＡによってインフルエンザについて血清をアッセイした。この実験の結果を、図１３から図１６に示す。
高力価のＨ９Ｎ２抗体が、Ｎｏｖａｓｏｍｅを含むか、またはＮｏｖａｓｏｍｅを含まないＨ９Ｎ２ ＶＬＰワクチンと、１μｇのＨＡを含む１０μｇのＶＬＰの用量を含む１回の免疫化（初回）後に誘導された（図１３）。特異的抗体力価は、追加免疫後に約２分の１から１対数増大した。
Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰの形態の１μｇのＨＡでの免疫化および追加免疫後、血清ＨＩレベルは全ての動物において一般的に防御性と考えられるレベル（ｌｏｇ２＝５）であったか、またはそれを越えるものであった（図１４、下左のパネル）。Ｎｏｖａｓｏｍｅアジュバントを用いて処方したＨ９Ｎ２ ＶＬＰは、初回免疫化後には約２倍にＨＩ応答を増大させ、追加免疫後には約４倍に増大させた（図１４、下右のパネル）。精製したサブユニットＨ９Ｎ２ヘマグルチニンもまた、追加免疫化後に防御レベルのＨＩ抗体を誘導し、Ｎｏｖａｓｏｍｅは、再び、ＨＩ抗体応答を初回免疫化後には約２倍、そして追加免疫後には４倍増大させた（図１４、上のパネル）。サブユニットワクチンとして投与された１０μｇのＨＡによって誘導されたＨＩ抗体のレベルは、ＶＬＰの形態で提示された１μｇのＨＡと同じであった。
加えて、体重の減少は、ワクチン接種しなかった対照動物と比較して、Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰで免疫化したマウス、またはＶＬＰとアジュバントで免疫化したマウスにおいて有意に少なかった（図１５）。Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰで免疫化したグループ、およびＨ９Ｎ２ ＶＬＰとＮｏｖａｓｏｍｅアジュバントで免疫化したグループにおいては、体重の減少に統計的な差はなかった。
同様に、Ｈ９Ｎ２ウイルスでのチャレンジの３日後および５日後の肺でのウイルス力価は、Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰで免疫化したマウスにおいては有意に低かった（図１６）。肺組織の中でインフルエンザウイルス力価がピークとなる３日目には、Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰとＮｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）で免疫化したマウスは、ＶＬＰだけで免疫化したマウス、およびワクチン接種しなかった対照のマウスと比較して、ウイルス力価の有意な低下を有していた。
実施例１６
Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰの免疫原性といくつかのインフルエンザ株の間での交差反応性
ＢＡＬＢ／ｃマウスをＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２ ＶＬＰ（３．０、０．６、０．１２、および０．２４μｇのＨＡ／用量）で、ＩＭおよびＩＮで２回免疫化した。マウスを０日目および３５日目に採血した。その後、血清を、シチメンチョウＲＢＣを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩ）によって抗ＨＡ抗体について、そしてＥＬＩＳＡによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。この実験の結果を、図１７Ａ、１７Ｂ、および１７Ｃに示す。これらの結果は、免疫応答が、ＨＡおよびＮＡに対するＩＭおよびＩＮの両方を増大させたことを示している。
実施例１７
Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰの接種後のマウスの中でのＩｇＧイソ型の決定
マウスにＶＬＰを筋肉内および鼻腔内に接種した。５週間で血清を回収し、そしてＩｇＧイソ型を識別するためにアッセイした。
血清を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して精製したＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３でコーティングしたプレート上で試験した。血清の段階的な５倍希釈物をウェルに添加し、そしてプレートをインキュベートした。次に、ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇ、または抗マウスＩｇＧ１、抗マウスＩｇＧ２ａ、抗マウスＩｇＧ２ｂ、および抗マウスＩｇＧ３。その後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼをウェルに添加した。結合した結合体を検出した。結果を図１８ＡおよびＢに示す。これらの結果は、ＩｇＧ２ａが、マウスでのＶＬＰに対する免疫応答において最も豊富なイソ型であることを示している。
実施例１８
ＳＤラットにおけるＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）用量範囲試験
ＳＤラット（１用量につき６匹）を、中性ｐＨのＰＢＳで０．１２、０．６、３．０、および１５．０μｇのＨＡになるようにＰＢＳで希釈した精製したＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＶＬＰで、あるいは、ＰＢＳだけで、０日目および２１日目に免疫化した。血液試料を、０日目、２１日目、３５日目、および４９日目に動物から採取し、ヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩ）のために血清をアッセイして、ＨＡの結合機能を阻害することができる機能性の抗体を検出した。投与量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、そして精製したＨ９Ｎ２ ＶＬＰのデンシトメトリーをスキャンして測定したＨＡ含有量に基づいた。ヘマグルチニン阻害アッセイの力価の結果を図１９に示す。１回の０．６μｇＨＡ用量のＨ９Ｎ２ ＶＬＰ、または２用量の０．１２μｇのＨＡによって、ラットにおいてＨＩ抗体の防御的レベルが生じた。これらのデータは、ＨＡがＶＬＰの一部である場合には、少量のＨＡによって、防御応答を誘導できることを示している。
実施例１９
Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＶＬＰの免疫原性
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、１００μｇのＮｏｖａｓｏｍｅおよびＡｌｕｍアジュバントを含むか、またはＮｏｖａｓｏｍｅおよびＡｌｕｍアジュバントを含まないＨ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１２、０．６μｇのＨＡ／用量）で、０日目および２１日目に免疫化し、そして５７日目に同種の感染性ウイルスＩＮでチャレンジした。マウスを、３．０および１５．０μｇのＨＡ／用量（アジュバントを含まない）でも免疫化した。マウスを０日目、２１日目、３５日目、および４９日目に採血し、そしてシチメンチョウＲＢＣを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩ）によって抗ＨＡ抗体について、そしてＥＬＩＳＡによってインフルエンザについて血清をアッセイした。この実験の結果を、図２０ＡおよびＢに示す。
結果は、より強い全体的な免疫応答が、ＶＬＰをアジュバントと共に投与した場合には観察されたことを示している。しかし、防御性の応答が、Ａｌｕｍを含むＶＬＰ処方物およびアジュバントを含まないＶＬＰと比較した場合に、３週間目に、０．１２μｇのＨＡ／用量によって誘発された。７週目にもまた、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓを含むＶＬＰは、Ａｌｕｍを含むＶＬＰと比較して、ＨＩ力価の約２ｌｏｇの増大を有していた。応答の強さは、アジュバントを含まない、３．０および１５．０μｇのＨＡ／用量で投与したＶＬＰと同様であった。これらの結果は、ＮｏｖａｓｏｍｅｓがＡｌｕｍと比較してより強い応答を誘発することを示している。加えて、ＶＬＰをＮｏｖａｓｏｍｅｓを含む処方物の中で投与した場合には、防御免疫応答を２５分の１の少ないＶＬＰを用いて得ることができた。
また、０．６μｇのＨＡ／用量のデータにおいては、Ｎｏｖａｓｏｍｅ処方物は、Ａｌｕｍと比較すると、約１．５ｌｏｇ大きな応答を有していた。免疫応答は、アジュバントを含まない、３．０および１５．０μｇのＨＡ／用量で投与したＶＬＰと同様の大きさであった。これらの結果は、アジュバントを含む場合には、防御応答を得るために、およそ５分の１の少ないＶＬＰしか投与される必要がないことを示している。
また、図２０Ｂは、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓの様々な処方物を使用したＨ９Ｎ２ ＶＬＰのＨＩ力価を示す。以下は、実験に使用した式である：
グループ１：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）（ｎ＝５）
グループ２：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／ＤＣＷ ｎｅａｔ）（ｎ＝５）
グループ３：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／ＤＣＷ １：３）（ｎ＝５）
グループ４：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／ＤＣＷ １：９）（ｎ＝５）
グループ５：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／ＤＣＷ １：２７）（ｎ＝５）
グループ６：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／ＮＶＡＸ１）（ｎ＝５）
グループ７：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／ＮＶＡＸ２）（ｎ＝５）
グループ８：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／ＮＶＡＸ３）（ｎ＝５）
グループ９：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／ＮＶＡＸ４）（ｎ＝５）
グループ１０：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／ＮＶＡＸ５）（ｎ＝５）
グループ１１：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／Ａｌｕｍ−ＯＨ）（ｎ＝５）
グループ１２：Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰ（０．１μｇ）ｗ／ＣｐＧ）（ｎ＝５）
グループ１３：ＰＢＳ（０．６μｇ）（ｎ＝５）
グループ１４：Ｈ３ ＶＬＰｓ（０．６μｇ）（ｎ＝５）
グループ１５：Ｈ５ ＶＬＰｓ（０．６μｇ）（ｎ＝８）
−Ｈ９：（ロット＃１１００５）
−ＤＣＷ：Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（ロット＃１２１５０５−２、ポリオキシエチレン−２−セチルエーテル、コレステロール、細かい大豆油、および塩化セチルピリジニウム）
−ＮＶＡＸ１：Ｂ３５Ｐ８３、ＭＦ−５９レプリカ（スクワレン、ポリソルベート、およびＳｐａｎ）
−ＮＶＡＸ２：Ｂ３５Ｐ８７（大豆油、Ｂｒｉｊ、コレステロール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８）
−ＮＶＡＸ３：Ｂ３５Ｐ８８（大豆油、Ｂｒｉｊ、コレステロール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、およびポリエチレンイミン）
−ＮＶＡＸ４：Ｂ３１Ｐ６０（スクワレン、Ｂｒｉｊ、コレステロール、オレイン酸）
−ＮＶＡＸ５：Ｂ３１Ｐ６３（大豆油、モノステアリン酸グリセリル、コレステロール、ポリソルベート）
−ＣｐＧ：（ロット＃１０２６００４）
−Ｈ５：（ロット＃２２４０６）
図２１は、Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰの用量応答曲線を示す。このデータは、０．６μｇのＨＡ／用量のＶＬＰの用量が、３週間後にマウスにおいて防御免疫応答を誘発するための最少量であることを示している。
実施例２０
フェレットの実験のための材料および方法
フェレットを、Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍｓ（ＦＦＦ、Ｓａｙｒｅ，ＰＡ）から購入した。購入した全てのフェレットは、１０ヘマグルチニン単位未満であるＨＡＩ力価を有していた。ワクチン接種のおよそ２日前に、動物に温度自動応答装置（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｒａｎｓｐｏｎｄｅｒ）（ＢｉｏＭｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）を埋め込んだ。動物（６匹の動物／グループ）に、（１）ＰＢＳ（ネガティブ対照、グループ１）、（２）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＶＬＰ＠１５μｇのＨ３（グループ２）、（３）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＶＬＰ＠３μｇのＨ３（グループ２）、（４）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＶＬＰ＠０．６μｇのＨ３（グループ３）、（５）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＶＬＰ＠０．１２μｇのＨ３（グループ５）、または（６）ｒＨ３Ｎ２＠１５μｇ（グループ６）のいずれかを、０日目にワクチン接種した。２１日目に動物にワクチンを追加免疫した。動物を、０日目（ワクチン接種前）、２１日目（追加ワクチン接種の前）、および４２日目に採血した。動物を、有害なワクチン効果の臨床的兆候について、実験期間を通じて１週間に１回評価した。同様の実験を他のインフルエンザＶＬＰを用いて行った。
フェレットの血清中のＨＡＩレベル
フェレットの血清をＦＦＦから入手し、Ｒｅｃｅｐｔｅｒ Ｄｅｓｔｒｏｙｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ（ＲＤＥ）で処理し、そして標準的な手順（Ｋｅｎｄａｌら、（１９８２））によってヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイにおいて試験した。試験した実験のために選択した全てのフェレットは、現在流行しているヒトインフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ／０１／０４（Ｈ２Ｎ３）、およびＢ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９、およびＨ５Ｎ１）に対する既存の抗体についてはネガティブ（ＨＡＩ＝１０）であった。
フェレット
およそ８ヶ月齢の、インフルエンザに感染したことのない、去勢したもの、および去勢していない雄のＦｉｔｃｈフェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ ｐｕｔｏｒｉｕｓ ｆｕｒｏ）をＦＦＦから購入した。動物を、Ｓａｎｉ−ｃｈｉｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｂｅｄｄｉｎｇ（Ｐ．Ｊ．Ｍｕｒｐｈｙ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＮＪ）を含むステンレス鋼製のウサギ用のケージ（Ｓｈｏｒ−ｌｉｎｅ，ＫＳ）の中で飼育した。フェレットには、Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｆｅｒｒｅｔ Ｄｉｅｔ（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ，ＷＩ）と新鮮な水を不断給餌で与えた。皿は１週間に３回交換し、ケージは１週間に２回（ｂｙｗｅｅｋｌｙ）清掃した。
フェレットのワクチン接種と採血
ワクチンであるＨ３Ｎ２インフルエンザＶＬＰまたはＨ９Ｎ２インフルエンザＶＬＰと、対照（例えば、ｒＨ３ＮＡ（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３）およびＰＢＳ（ネガティブ対照））は使用するまで４℃で保存しておいた。ほとんどの実験については、フェレットの６つのグループ（Ｎ−６／グループ）に、０．５ｍｌの容量中のいずれかの濃度のワクチンまたは対照を筋肉内にワクチン接種した。
採血およびワクチン接種の前に、動物を、カタミン（Ｋａｔａｍｉｎｅ）（２５ｍｇ／ｋｇ）、アトロピン（Ａｔｒｏｐｉｎｅ）（０．０５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ）（２．０ｍｇ／ｋｇ）の溶液「ＫＡＸ」で太ももの内側への筋肉内注射によって麻酔した。麻酔がかかった時点で、フェレットを背を下にして寝させ、１ｃｃのツベルクリン注射器に取り付けた２３ゲージの１’’針を使用して、前脚の静脈から血液を採血した（０．５から１．０ｍｌの間の容量）。血液を、血清分離装置と血餅活性化因子（ｃｌｏｔ ａｃｔｉｖａｏｒ）が含まれているチューブに移して、室温で凝血させた。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、そして−８０℃で凍結させた。血液は、ワクチン接種前（０日目）、追加ワクチン接種の前（２１日目）、および４２日目に採血し、ＨＡＩアッセイによって試験した。
フェレットのモニタリング
温度を、実験期間の間中、ほぼ同じ時間に１週間に１回測定した。ワクチン接種前の値を平均して、個々のフェレットについてのベースライン温度を得た。温度（カ氏温度）の変化を、個々の動物についてそれぞれの時点で計算した。フェレットを、有害なワクチン効果の臨床的兆候（温度、体重の減少、活動の減少、鼻汁、くしゃみ、および下痢を含む）について毎週試験した。Ｒｅｕｍａｎら（１９８９）に記載されているシステムに基づくスコアリングシステムを使用して、活性のレベルを評価した。ここでは、０＝機敏であり、よくじゃれる；１＝機敏であるが、刺激を与えた時にしかじゃれない；２＝機敏であるが、刺激を与えてもじゃれない；３＝機敏ではなく、刺激を与えてもじゃれない。グループの中の個々の動物についてのスコアに基づいて、相対的な非活動指数を、Σ（０日目−４２日目）［活動スコア＋１］／Σ（０日目−４２日目）として計算した。式中、ｎは観察の総数に等しい。１の値を個々のベーススコアに加え、「０」のスコアを分母で割り算できるようにして、１．０の指標値を得た。
血清の調製
血清は、一般的には、ヘマグルチニンに対する非特異的阻害因子について低いレベルを有していた。これらの非特異的阻害因子を不活化させるために、血清を、試験する前に（ＲＤＥ）で処理した。簡単に説明すると、３部のＲＤＥを１部の血清に添加して、３７℃で一晩インキュベートした。ＲＤＥを、５６℃で３０分間のインキュベーションによって不活化させた。ＲＤＥの不活化の後、ＰＢＳを、１：１０（ＲＤＥ−Ｔｘ）の最終的な血清希釈のために試料に添加した。希釈したＲＤＥ−Ｔｘ血清を、試験するまで（７日間）４℃で保存したか、または−２０℃で保存した。
シチメンチョウの赤血球の調製：
ヒトインフルエンザウイルスは、Ｎ−アセチルノイラミン酸α２，６−ガラクトース結合を含むシアル酸受容体に結合する。トリインフルエンザウイルスは、Ｎ−アセチルノイラミン酸α２，３ガラクトース（α２，３結合）を含むシアル酸受容体に結合し、α２，３およびα２，６結合の両方を発現する。シチメンチョウの赤血球（ＴＲＢＣ）をＨＡＩアッセイに使用した。なぜなら、Ａ／Ｆｕｊｉａｎはヒトインフルエンザウイルスであるからである。ＴＲＢＣは、ＰＢＳで０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ懸濁液となるように調節した。細胞を４℃で維持し、調製から７２時間以内に使用した。
ＨＡＩアッセイ
ＨＡＩアッセイを、ＣＤＣの研究室をベースとするインフルエンザの管理マニュアル（全ての目的についてその全体が引用により本明細書中に組み入れられるＫｅｎｄａｌら、（１９８２）Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｒｕｄｅｓ ｆｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｂａｓｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ）から採用した。ＲＤＥ−Ｔｘ血清を、ｖ底マイクロタイタープレートの中で段階的に２倍希釈した。ウイルスを等容量になるように調節し、それぞれのウェルにおよそ８ＨＡＵ／５０μｌに調節したものを添加した。プレートにカバーをかけ、室温で１５分間インキュベートし、その後、０．５％のＴＲＢＣを添加した。プレートを攪拌によって混合し、カバーをかけ、そしてＴＲＢＣを室温で３０分間沈殿させた。ＨＡＩ力価を、凝集しなかったＴＲＢＣが含まれていた最後の列の希釈率の逆数によって決定した。ポジティブ血清対照とネガティブ血清対照をそれぞれのプレートに含めた。
実施例２１
フェレットでのＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＶＬＰ用量範囲の実験
インフルエンザウイルスについてヘマグルチニン阻害によって血清学的にネガティブであったフェレットを使用して、Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰの接種後の抗体およびＨＩ力価を評価した。フェレットを、０日目および２１日目に採血し、血清を、シチメンチョウＲＢＣを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩ）によって抗ＨＡ抗体について、そしてＥＬＩＳＡによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。結果を図２２に示す。これらの結果は、ＨＩ力価が１．５および１５μｇのＶＬＰ用量での防御抗体レベルに対応することを示している。
実施例２１
フェレットでのＨ３Ｎ２ ＶＬＰのワクチン接種
フェレットを、０日目にワクチン接種し、そして２１日目には、様々な投与量の様々なＨ３Ｎ２株のＶＬＰで追加免疫を投与した（０．１２、０．６、３．０、１５．０μｇのＨＡ投与量）。ポジティブ対照は、１５μｇのｒＨ３ＨＡであり、ＰＢＳだけをネガティブ対照とした。上記のように、血清を、０日目（ワクチン接種前）、２１日目（追加ワクチン接種の前）、および４２日目にフェレットから採血した。ＨＩアッセイを血清試料について行って、ＶＬＰに対する免疫応答があるかどうかを決定した。これらのデータを図２３に示す。これらのデータは、Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰが、フェレットに導入した場合には、免疫応答を誘導することを示している。したがって、Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰはフェレットにおいては免疫原性である。
実施例２２
インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子のＲＴ−ＰＣＲならびにクローニング
Ｃｌａｄｅ ２インフルエンザウイルスであるＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５株（Ｈ５Ｎ１）ウイルスのＲＮＡを、ＢＳＬ−３封じ込め条件下で、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して抽出した。逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲを、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲシステム（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、抽出したウイルスＲＮＡについて行った。以下のプライマーを、それぞれ、Ｈ５Ｎ１ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、およびマトリックス（Ｍ１）遺伝子の合成のために使用した：
Figure 2009511084
 （配列番号４）と、
Figure 2009511084
 （配列番号５）（ＨＡ）；
Figure 2009511084
 （配列番号６）と
Figure 2009511084
 （配列番号７）（ＮＡ）；ならびに、
Figure 2009511084
 （配列番号８）と
Figure 2009511084
 （配列番号９）（Ｍ１）（ＡＴＧコドンには下線を付けた）。
ＲＴ−ＰＣＲの後、それぞれ、１．７、１．４、および０．７ｋＢの分子量を有しているインフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子が含まれているｃＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＨＡ、ＮＡ，およびＭ１遺伝子のヌクレオチド配列を、ＤＮＡ配列決定によって決定した。同様のストラテジーを、Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００３からのｃｌａｄｅ １ Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのクローニングのために行った。
実施例２３
Ｈ５Ｎ１を含む組み換え体バキュロウイルスの作成
ＨＡ遺伝子を、ＲｓｒＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１バックミドトランスファーベクター（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）の中に、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの下流にＲｓｒＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片（１．７ｋｂ）としてクローニングした。同様に、ＮＡおよびＭ１遺伝子を、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡの中に、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片（それぞれ、１．４ｋｂおよび０．８ｋｂ）としてクローニングした。インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子をそれぞれ含む、３種類の得られたバキュロウイルストランスファープラスミドｐＨＡ、ｐＮＡ、およびｐＭ１を使用して、組み換え体バックミドを作成した。
バックミドは、ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスゲノムを含むＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中にインフルエンザ遺伝子を含むバックミドトランスファープラスミドの形質転換後の、部位特異的相同組み換えによって得た。組み換え体バックミドＤＮＡを、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクトした。
Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子のヌクレオチド配列
ＨＡ（配列番号１０）
Figure 2009511084
 ＮＡ（配列番号１１）
Figure 2009511084
Figure 2009511084
 Ｍ１（配列番号１２）
Figure 2009511084
 １つのクローニングしたＨＡ遺伝子であるｐＨＡは、野生型のＨＡ遺伝子配列と比較すると、２つのヌクレオチド変化（ｎｔ＃１１７２およびｎｔ＃１５０８（野生型において））を含んでいた。同様のストラテジーを、Ｖｉｅｔｎａｎ／１２０３／２００３ ＶＬＰに由来するｃｌａｄｅ １ Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスを構築し、作成するために行った（以下を参照のこと）。ｐＨＡ５ヌクレオチド配列とアミノ酸配列のアラインメントは以下である。
Figure 2009511084
Figure 2009511084
Figure 2009511084
Figure 2009511084
 ヘマグルチニンのアミノ酸配列のアラインメント
Figure 2009511084
 実施例２６
Ｓｆ９細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子の作成
以下のポリペプチドは、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５のＨＡ遺伝子に対応するコドンが最適化させられたヌクレオチドに由来する（実施例３１を参照のこと）。コドンが最適化させられたヌクレオチドは、米国特許公開番号２００５／０１１８１９１（全ての目的のためのその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている方法にしたがって設計し、生産した（Ｇｅｎｅａｒｔ ＧＭＢＨ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ＦＲＧ）。ヌクレオチド配列については実施例３１を参照のこと。
Ｖａｃ２−ｈａｃ−ｏｐｔ（修飾されていないアミノ酸配列）（配列番号２７）
Figure 2009511084
 Ｖａｃ２−ｈａｃ−ｓｐｃ−ｏｐｔ
（修飾された、キチナーゼに由来するシグナルペプチド、下線）（配列番号２８）
Figure 2009511084
 Ｖａｃ２−ｈａｃ−ｓｐｈ９−ｏｐｔ（修飾された、Ｈ９に由来するシグナルペプチド、下線）（配列番号２９）
Figure 2009511084
Figure 2009511084
 Ｖａｃ２−ｈａｃ−ｃｓ−ｏｐｔ（−は修飾された切断部位である）（配列番号３０）
Figure 2009511084
 修飾されていない、コドンが最適化させられたＮＡおよびＭ１遺伝子に対応する以下のポリペプチドもまた、ここで合成した。
Ｖａｃ２−ｎａｊ−ｏｐｔ（ノイラミニダーゼ）（配列番号３１）
Figure 2009511084
 Ｖａｃ２−ｍｃ−ｏｐｔ（マトリックス）（配列番号３２）
Figure 2009511084
 合成のコドンが最適化させられたＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子を、上記のようにＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してｐＦａｓｔＢａｃ１トランスファープラスミドにサブクローニングした。合成のＨＡ、ＮＡ、Ｍ１遺伝子のＳｆ９細胞中での発現のための組み換え体バックミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂａｃ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、上記のように作成した。
実施例２４
ＲＴ−ＰＣＲによるＣｌａｄｅ １ Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）インフルエンザウイルスのクローニング
ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子を、上記の方法にしたがってＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした。以下の配列は、クローニングした遺伝子と比較した公開されている遺伝子の比較である。
Ｃｌａｄｅ １ Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子
上のレーン：Ａｃｃ＃ＡＹ８１８１３５ ＨＡ遺伝子（配列番号３６）
下のレーン：ＮｏｖａｖａｘのＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）ＨＡ遺伝子（配列番号３７）
Figure 2009511084
Figure 2009511084
Figure 2009511084
 ＮＡ遺伝子の比較
Ｃｌａｄｅ １ Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＮＡ遺伝子（配列番号３９）
Ｈ５Ｎ１ｎａＬＡＮＬ ＩＳＤＮ ３８７０４×ＮＡ＿Ｖｉｅｔ１２０３＿Ｌａｒｋ（ＮＶＡＸ）（配列番号３８）
Figure 2009511084
Figure 2009511084
Figure 2009511084
 Ｍ１遺伝子の比較
Ｃｌａｄｅ １ Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＭ１遺伝子（配列番号４０）
Ｈ５Ｎ１ｍ１Ｌａｎｌ ＩＳＤＮ ３９９５８×Ｍ１＿Ｖｉｅｔ１２０３＿Ｌａｒｋ（ＮＶＡＸ）（配列番号４１）
Figure 2009511084
Figure 2009511084
 全ての配列は、上記に開示した方法にしたがってクローニングし、分析した。
実施例２５
Ｓｆ９細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたＣｌａｄｅ １ Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子の作成
以下のポリペプチドは、Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４に対応するコドンが最適化させられたヌクレオチドに由来する。ヌクレオチドは、上記に開示したように（実施例２４を参照のこと）設計し、そして合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ ＧＭＢＨ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ＦＲＧ）。
ＶＮ１２０３−ｈａ−ｃｓ−ｏｐｔ（修飾された切断部位、下線）（配列番号３３）
Figure 2009511084
 ＶＮ１２０３−ｈａ−ｓｐｃ−ｏｐｔ（修飾されたシグナルペプチド、下線）（配列番号３４）
Figure 2009511084
 ＶＮ１２０３−ｈａ−ｓｐｈ９−ｏｐｔ（シグナルペプチドと切断部位が隠された（ｓｈａｄｅｄ））（配列番号３５）
Figure 2009511084
 実施例２６
Ｈ５Ｎ１ Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００３ ＶＬＰの免疫原性（極端な投与量の節約）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、極めて低用量のＶＬＰ（０．２、０．０４、０．００８、０．００１６μｇのＨＡ／用量）で、Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰで筋肉内および鼻腔内に免疫化した。マウスを、０日目、２１日目、および３５日目に採血した。マウスを２１日目に追加免疫した。血清を、シチメンチョウＲＢＣを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩ）によって抗ＨＡ抗体について、そしてＥＬＩＳＡを使用してインフルエンザウイルスについてアッセイした。この実験の結果を図２４および２５に示す。
結果は、ＶＬＰを極めて低用量で筋肉内に投与した場合には、強い全体的な免疫応答が観察されたことを示している。応答の強さは、３．０および０．６μｇのＨＡ／用量では対照と同程度であった。これらのデータは、０．２μｇのＶＬＰに対する真の用量応答と抗体応答が、３．０μｇのｒＨＡタンパク質よりも大きいことが見られることを示している。応答は、鼻腔内投与ほど強くはないが、０．２μｇのＨＡ／用量でのＶＬＰの用量によっては、強い応答が誘導された。この実験において０．２μｇの用量を用いた場合のＥＬＩＳＡ力価は、以前の実験（上記を参照のこと）での０．１２μｇのＨ３Ｎ２ ＶＬＰワクチンの用量と同程度である。
実施例２７
チャレンジ実験
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、３μｇ、０．６μｇ、０．１２μｇ、および０．０２μｇの濃度のＨ３Ｎ２ ＶＬＰでＶＬＰを筋肉内および鼻腔内（合計のＨＡ用量）に接種した後、マウスを、インフルエンザウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２６８×３１でチャレンジした。この実験の結果を図２７および２８に示す。これらのデータは、全てのワクチン接種した動物において体重が減少したが、３．０μｇおよび０．１２μｇのＶＬＰをワクチン接種した動物は、筋肉内でのワクチン接種および鼻腔内でのワクチン接種のいずれにおいても、他の動物よりも早く回復したことを示している。鼻腔内での投与によっては、高い防御が提供された。
実施例２９
チャレンジ実験（フェレット）
この実験では、フェレットにＨ９Ｎ２ ＶＬＰをワクチン接種した。全部で１８匹のフェレットをチャレンジ実験に含めた：６匹には模擬ワクチンを、６匹には、中用量（１．５μｇ）を、そして６匹には高用量（１５．０μｇ）を筋肉内にワクチン接種した。次に、フェレットに、Ａ／ＨＫ／１０７３／９９の１０６ ＥＩＤ５０を鼻腔内にチャレンジした。鼻腔洗浄液を、１日目、３日目、５日目、および７日目に回収した。鼻腔洗浄液の中のウイルスを、全ての動物について３日目、５日目、および７日目に滴定した。これらのデータを表２および図２９に示す。これらのデータは、７日目までに、ワクチン接種した全ての動物について、鼻腔洗浄液の中に検出できるウイルスはなく、一方、模擬グループは検出できるウイルス力価を有していたことを示している。
表２ ウイルスでのチャレンジ後のフェレットにおける野生型ウイルス力価（ｌｏｇ１０／ｍｌ）
グループ：プラセボによる模擬対照（ｎ＝６）
Figure 2009511084
 実施例３０
マウスでの筋肉内および鼻腔内接種実験
マウスに、０日目に、３μｇ、０．６μｇ、０．１２μｇ、または０．０２４μｇ（合計のＨＡ用量）の濃度のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰを、筋肉内または鼻腔内に接種し、３週間後に追加免疫した。対照マウスには、ホルマリンで不活化させたＡ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｆｕｊｉａｎ−Ｌｉｋｅ、ワクチン株）またはＰＢＳを接種した。血清を接種したマウスから、０週目、３週目、５週目、および８週目に回収した。回収した血清を、ヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩ）によって抗ＨＡ抗体について、そしてＥＬＩＳＡによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。アッセイは、Ｈ３Ｎ２のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／０３、およびＡ／ＮｅｗＹｏｒｋ／５５／２００４インフルエンザウイルス株を使用して行った。この実験の結果を図３０Ａ〜Ｈに示す。これらのデータは、Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰによって、元のインフルエンザウイルスＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２株に対する抗体と、他のＨ３Ｎ２株に対する抗体が誘導されたことを示している。これらのデータはまた、筋肉内に接種したマウスよりも、鼻腔内に摂取したマウスにおいては力価が遅れて上昇することを示している。しかし、鼻腔内投与による力価は、約８週間後には筋肉内投与による力価よりも高い。加えて、不活化ウイルス抗原に対する力価は、筋肉内接種後の等用量のＶＬＰに匹敵することが明らかである。しかし、不活化抗原は、鼻腔内接種後には免疫原性ではないようであり、鼻腔内接種後にも広く防御的ではないようである。
実施例３１
Ｓｆ９細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたＣｌａｄｅ ２ Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子の作成
Ｃｌａｄｅ ２ Ｈ５Ｎ１ウイルス、Ａ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５、Ａ／Ｂａｒ ｈｅａｄｅｄ ｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／２００５、およびＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１に対応する、以下の最適化させられたヌクレオチドおよびポリペプチドを、上記に開示したように設計し、合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ ＧＭＢＨ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ＦＲＧ）。最適化されたヌクレオチドおよびポリペプチドを以下に列挙する。ＶＬＰを作成するために、Ａ／Ａｎｈｕｉ ＨＡは、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＮＡおよびＭ１を用いて発現させることができる。Ａ／Ｑｕｉｎｇｈａｉ ＨＡおよびＮＡが含まれているＶＬＰについては、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ Ｍ１遺伝子をＡ／Ｑｕｉｎｇｈａｉ ＨＡおよびＮＡと同時に発現させることができる。
Ａ／ＩＮＤＯＮＥＳＩＡ／５／０５
Ａ／ＩＮＤＯＮＥＳＩＡの最適化させられたＨＡ（開始コドンと終結コドンには下線を付けた）（配列番号４２）
Figure 2009511084
Figure 2009511084
 Ａ／ＩＮＤＯＮＥＳＩＡのＨＡタンパク質配列（配列番号４３）
Figure 2009511084
 Ａ／ＩＮＤＯＮＥＳＩＡの最適化させられたＨＡ（切断部位を欠失させた）
（開始コドンと終結コドンには下線を付けた）（配列番号４４）
Figure 2009511084
Figure 2009511084
 Ａ／ＩＮＤＯＮＥＳＩＡのＨＡタンパク質配列（配列番号４５）
Figure 2009511084
 Ａ／ＩＮＤＯＮＥＳＩＡの最適化させられたＮＡ（開始コドンと終結コドンには下線を付けた）（配列番号４６）
Figure 2009511084
 Ａ／ＩＮＤＯＮＥＳＩＡのＮＡタンパク質配列（配列番号４７）
Figure 2009511084
 Ａ／ＩＮＤＯＮＥＳＩＡの最適化させられたＭ１（配列番号４８）
Figure 2009511084
 Ａ／ＩＮＤＯＮＥＳＩＡのＭ１タンパク質配列（配列番号４９）
Figure 2009511084
 Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５
Ａ／Ａｎｈｕｉの最適化させられたＨＡ（開始コドンと終結コドンには下線を付けた）（配列番号５０）
Figure 2009511084
 Ａ／ＡｎｈｕｉのＨＡタンパク質配列（配列番号５１）
Figure 2009511084
 Ａ／Ｂａｒ ｈｅａｄｅｄ ｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／２００５
Ａ／Ｑｉｎｇｈａｉの最適化させられたＨＡ（開始コドンと終結コドンには下線を付けた）（配列番号５２）
Figure 2009511084
 Ａ／ＱｉｎｇｈａｉのＨＡタンパク質配列（配列番号５３）
Figure 2009511084
 Ａ／Ｑｉｎｇｈａｉの最適化させられたＮＡ（開始コドンと終結コドンには下線を付けた）（配列番号５４）
Figure 2009511084
 タンパク質配列：
Ａ／ＱｉｎｇｈａｉのＮＡタンパク質配列（配列番号５５）
Figure 2009511084
 以下の参考文献は引用により本明細書中に組み入れられる：
Figure 2009511084
Figure 2009511084
Figure 2009511084
Figure 2009511084
 他の実施形態
当業者は、日常的に行われる実験以上のものを用いることなく、本明細書中に記載される本発明の特異的な実施形態と同等の多くのものを理解するか、または確認することができるであろう。そのような同等物は以下の請求項に包含することが意図される。
図１は、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子のヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。 図２は、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子のヌクレオチド配列を示す（配列番号２）。 図３は、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのマトリックスタンパク質Ｍ１（Ｍ１）遺伝子のヌクレオチド配列を示す（配列番号３）。 図４は、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質の発現のための組み換え体バキュロウイルスの構築のためのトランファーベクターを示す。図４Ａは、個々の遺伝子の発現のためのトランスファーベクターを示し、そして図４Ｂは遺伝子のマルチ発現のためのトランスファーベクターを示す。 図５は、Ｓｆ−９Ｓ細胞中でのトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質の発現を示す。 図６は、ショ糖密度勾配法によるトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＶＬＰの精製を示す。 図７は、ゲル濾過クロマトグラフィーによるインフルエンザウイルスタンパク質の検出を示す。ウェスタンブロット分析において使用した抗体は以下である：（Ａ）ウサギ抗Ｈ９Ｎ２；（ｂ）マウス抗Ｍ１ ｍＡｂ；および（Ｃ）マウス抗ＢＡＣｇｐ６４． 図８は、サブウイルス粒子、ＶＬＰ、およびＶＬＰ複合体が含まれているトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）タンパク質の電子顕微鏡による検出を示す。 図９は、精製したトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＶＬＰのヘマグルチニン活性を示す。 図１０は、精製したトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＶＬＰのノイラミニダーゼ活性を示す。 図１１は、マウスにおける、精製したトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＶＬＰを用いた組み換え体インフルエンザの免疫原性試験についての免疫化および放血（ｂｌｅｅｄ）のスケジュールを示す。 図１２は、組み換え体インフルエンザＨ９Ｎ２のＶＬＰで免疫化したマウスにおける免疫原性試験の結果を示す。図１２Ａは、トリインフルエンザＡ／Ｈ９Ｎ２／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９型に由来するＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質からなる組み換え体ＶＬＰで免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来する血清を示す。図１２Ｂは、不活化させられたＡ型トリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２で免疫化したＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギに由来する血清が不活化させられたＡ型トリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２（レーン１および３）または低温適応性のＡ型トリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２（レーン２および４）が含まれているウェスタンブロットと反応させられたことを示している。 図１３は、初回免疫および２回目の免疫後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける幾何平均抗体応答を示す。 図１４は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）応答を示す。 図１５は、Ｈ９Ｎ２インフルエンザでチャレンジしたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける体重の減少（％）を示す。 図１６は、Ｈ９Ｎ２でのチャレンジの３日後および５日後の肺でのウイルス力価を示す。 図１７Ａ、１７Ｂ、および１７Ｃは、Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰで免疫化した場合のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２に対するマウスの抗体応答を示す。 図１７Ａ、１７Ｂ、および１７Ｃは、Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰで免疫化した場合のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２に対するマウスの抗体応答を示す。 図１７Ａ、１７Ｂ、および１７Ｃは、Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰで免疫化した場合のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２に対するマウスの抗体応答を示す。 図１８ＡおよびＢは、マウスＩｇＧ抗体のイソ型を示す。 図１８ＡおよびＢは、マウスＩｇＧ抗体のイソ型を示す。 図１９は、Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰワクチンで免疫化したＳＤラットにおけるヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。 図２０Ａおよび２０Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、アジュバントを用いた場合、またはアジュバントを用いなかった場合の、Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰの様々な用量に対するヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。 図２０Ａおよび２０Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、アジュバントを用いた場合、またはアジュバントを用いなかった場合の、Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰの様々な用量に対するヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。 図２１は、様々な用量のＶＬＰの間でのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）応答を示す。 図２２は、フェレットにおける血清ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）応答を示す。 図２３は、Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰの様々な株の投与後２１日目および４２日目にフェレットから採血した血清に由来する血清ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）応答を示す。 図２４は、低用量のＨ５Ｎ１（Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００３）を筋肉内に接種したマウスの抗ＨＡ抗体（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｔｉｔｅｒ）を示す。 図２５は、低用量のＨ５Ｎ１（Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００３）を鼻腔内に接種したマウスの抗ＨＡ抗体（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｔｉｔｅｒ）を示す。 図２６は、本発明のＶＬＰの製造、単離、および精製についての例を示す。 図２７は、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを筋肉内に投与し、続いて鼻腔内にチャレンジした、Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰを接種したマウスを示す。 図２８は、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを鼻腔内に投与し、続いて鼻腔内にチャレンジした、Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰを接種したマウスを示す。 図２９は、Ｈ９Ｎ２ ＶＬＰワクチンを接種し、続いてＨ９Ｎ２ウイルスを鼻腔内にチャレンジしたフェレットの鼻洗浄液中のウイルスの脱落を示す。 図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ、３０Ｇ、３０Ｈは、インフルエンザウイルスの様々なＨ３Ｎ２株に対して試験した、様々な用量のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰの筋肉内または鼻腔内での接種後のマウスにおけるヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。 図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ、３０Ｇ、３０Ｈは、インフルエンザウイルスの様々なＨ３Ｎ２株に対して試験した、様々な用量のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰの筋肉内または鼻腔内での接種後のマウスにおけるヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。 図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ、３０Ｇ、３０Ｈは、インフルエンザウイルスの様々なＨ３Ｎ２株に対して試験した、様々な用量のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰの筋肉内または鼻腔内での接種後のマウスにおけるヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。 図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ、３０Ｇ、３０Ｈは、インフルエンザウイルスの様々なＨ３Ｎ２株に対して試験した、様々な用量のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰの筋肉内または鼻腔内での接種後のマウスにおけるヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。 図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ、３０Ｇ、３０Ｈは、インフルエンザウイルスの様々なＨ３Ｎ２株に対して試験した、様々な用量のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰの筋肉内または鼻腔内での接種後のマウスにおけるヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。 図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ、３０Ｇ、３０Ｈは、インフルエンザウイルスの様々なＨ３Ｎ２株に対して試験した、様々な用量のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰの筋肉内または鼻腔内での接種後のマウスにおけるヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。 図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ、３０Ｇ、３０Ｈは、インフルエンザウイルスの様々なＨ３Ｎ２株に対して試験した、様々な用量のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰの筋肉内または鼻腔内での接種後のマウスにおけるヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。 図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ、３０Ｇ、３０Ｈは、インフルエンザウイルスの様々なＨ３Ｎ２株に対して試験した、様々な用量のＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰの筋肉内または鼻腔内での接種後のマウスにおけるヘマグルチニン阻害（ＨＩ）抗体応答を示す。

Claims (40)

  1. インフルエンザウイルスＭ１タンパク質と、インフルエンザウイルスＨ５およびＮ１ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質が含まれている、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
  2. 前記Ｍ１タンパク質が、Ｈ５およびＮ１タンパク質タンパク質と比較して、異なるインフルエンザウイルス株に由来する、請求項１に記載のＶＬＰ。
  3. 前記Ｈ５またはＮ１が、Ｈ５Ｎ１ ｃｌａｄｅ １インフルエンザウイルス由来である、請求項１に記載のＶＬＰ。
  4. 前記Ｈ５およびＮ１が、Ｈ５Ｎ１ ｃｌａｄｅ ２インフルエンザウイルス由来である、請求項１に記載のＶＬＰ。
  5. 前記Ｈ５およびＮ１タンパク質に、それぞれ、配列番号４３および４６、または、前記配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む配列が含まれている、請求項３に記載のＶＬＰ。
  6. 前記Ｈ５およびＮ１タンパク質に、それぞれ、配列番号５０および５４、または、前記配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む配列が含まれている、請求項４に記載のＶＬＰ。
  7. 前記Ｈ５およびＮ１が、感染した動物から単離されたインフルエンザウイルス由来である、請求項１に記載のＶＬＰ。
  8. 前記感染した動物がヒトである、請求項７に記載のＶＬＰ。
  9. 前記ＶＬＰが、ＶＬＰの形成が可能な条件下で、インフルエンザＨ５およびＮ１タンパク質をコードする核酸と、インフルエンザＭ１タンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を含む真核生物細胞から発現される、請求項１に記載のＶＬＰ。
  10. 前記真核生物細胞が、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物の細胞からなる群より選択される、請求項９に記載のＶＬＰ。
  11. 前記真核生物細胞が昆虫細胞である、請求項１０に記載のＶＬＰ。
  12. 前記昆虫細胞がＳｆ９である、請求項１１に記載のＶＬＰ。
  13. 前記ＶＬＰが、ヒトまたは動物に投与されるとインフルエンザ感染に対して防御的である中和抗体を前記ヒトまたは動物において誘発する、請求項１に記載のＶＬＰ。
  14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰの有効用量が含まれている免疫原性組成物。
  15. 前記組成物にアジュバントが含まれている、請求項１４に記載の組成物。
  16. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰの有効用量が含まれているワクチン。
  17. 前記ワクチンに、様々なインフルエンザ株に由来するＨＡおよびＮＡを含む第２のＶＬＰが少なくとも含まれている、請求項１６に記載のワクチン。
  18. 前記ワクチンにアジュバントが含まれている、請求項１６または１７に記載のワクチン。
  19. 前記アジュバントにＮｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）が含まれている、請求項１５もしくは１８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
  20. 請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のワクチンの少なくとも１有効用量を投与する工程が含まれる、動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する方法。
  21. 前記ワクチンが動物に対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記動物がヒトである、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 動物用のワクチンの調製のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰの使用であって、前記ワクチンが前記動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
  24. 前記ワクチンが動物に対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、請求項２３に記載の方法。
  25. 真核生物細胞の中で前記Ｍ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質を発現させる工程が含まれる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰを作成する方法。
  26. 前記真核生物細胞が、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物の細胞からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記真核生物細胞が昆虫細胞である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記昆虫細胞がＳｆ９である、請求項２７に記載の方法。
  29. インフルエンザＨ５またはＮ１タンパク質の少なくとも１つをコードする、昆虫細胞発現ベクター。
  30. インフルエンザＶＬＰを含むワクチンであって、前記ＶＬＰに、インフルエンザＭ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
  31. インフルエンザＶＬＰを含むワクチンであって、前記ＶＬＰは、原則として、インフルエンザＭ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質からなり、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
  32. インフルエンザＶＬＰを含むワクチンであって、前記ＶＬＰには、Ｍ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
  33. ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する方法であって、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のワクチンの少なくとも１有効用量を投与する工程が含まれる、方法。
  34. 前記ワクチンが、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、請求項３３に記載の方法。
  35. ワクチンの調製のためのインフルエンザＶＬＰの使用であって、前記ＶＬＰにインフルエンザＭ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
  36. ワクチンの調製のためのインフルエンザＶＬＰの使用であって、前記ＶＬＰがインフルエンザＭ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質からなり、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
  37. ワクチンの調製のためのインフルエンザＶＬＰの使用であって、前記ＶＬＰに、インフルエンザＭ１、ＨＡ、およびＮＡタンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
  38. 前記ワクチンがヒトに対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記ワクチンがバキュロウイルスを不活化させるために処理される、請求項１６〜１９および３０〜３２のいずれか１項に記載のワクチン。
  40. 前記不活化処理に、およそ０．２％のβ−プロピルラクトン（ＢＰＬ）中にＶＬＰを含む試料を、約２５℃で約３時間インキュベートする工程が含まれる、請求項４０に記載のワクチン。
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Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0250488A (ja) * 1988-08-11 1990-02-20 Nec Corp 超伝導配線
JP2012036154A (ja) * 2010-08-11 2012-02-23 Goshu Yakuhin Kk 食品
JP2012527874A (ja) * 2009-05-28 2012-11-12 アボツト・バイオロジカルズ・ベー・ブイ 外来物質試験
JP2013048597A (ja) * 2011-08-31 2013-03-14 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス
JP2013520167A (ja) * 2010-02-18 2013-06-06 テクノヴァックス，インコーポレイテッド 万能ウイルス様粒子（ｖｌｐ）インフルエンザワクチン
JP2016104015A (ja) * 2009-05-01 2016-06-09 ファイザー・インク 多重遺伝子ベクターによってコードされる組換えウイルス様粒子
JP2018530314A (ja) * 2015-08-28 2018-10-18 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ウイルス様粒子からの感染性インフルエンザウイルスの生成
JP2019141061A (ja) * 2013-03-28 2019-08-29 メディカゴ インコーポレイテッド 植物におけるインフルエンザウイルス様粒子の生成
US11384339B2 (en) 2011-08-26 2022-07-12 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza viruses with mutant PB2 gene segment as live attenuated vaccines
US11802273B2 (en) 2014-06-20 2023-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
US11807872B2 (en) 2019-08-27 2023-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
US11851648B2 (en) 2019-02-08 2023-12-26 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Humanized cell line
US12076387B2 (en) 2010-03-23 2024-09-03 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
US12122807B2 (en) 2022-07-18 2024-10-22 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8551756B2 (en) 2003-07-11 2013-10-08 Novavax, Inc. Avian influenza chimeric VLPS
WO2007130330A2 (en) 2006-05-01 2007-11-15 Technovax, Inc. Polyvalent influenza virus-like particle (vlp) compositions
WO2007130327A2 (en) 2006-05-01 2007-11-15 Technovax, Inc. Influenza virus-like particle (vlp) compositions
WO2008094197A2 (en) * 2006-07-27 2008-08-07 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Chimeric influenza virus-like particles
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
JP2010533737A (ja) * 2007-07-19 2010-10-28 ノババックス，インコーポレイテッド キメラ水痘帯状疱疹ウイルス−ウイルス様粒子
AU2008331673B2 (en) 2007-11-12 2014-12-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel vaccines against multiple subtypes of influenza virus
CN101978066A (zh) 2007-11-27 2011-02-16 麦迪卡格公司 表达血凝素之转基因植物中生产的重组流感病毒样颗粒(vlp)
PT2294202E (pt) 2008-07-08 2015-10-09 Medicago Inc Antigénios gripais recombinantes solúveis
ES2593277T3 (es) 2008-07-18 2016-12-07 Medicago Inc. Nuevo epítopo de inmunización contra el virus de la influenza
MY159543A (en) * 2008-11-28 2017-01-13 Merial Inc Recombinant avian influenza vaccine and uses thereof
CA2759873A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Cytos Biotechnology Ag Influenza hemagglutinin compositions and uses thereof
NZ597401A (en) 2009-06-24 2013-09-27 Medicago Inc Chimeric influenza virus-like particles comprising hemagglutinin
PL2480658T3 (pl) 2009-09-22 2017-12-29 Medicago Inc. Sposób otrzymywania VLP pochodzenia roślinnego
CN101947317B (zh) * 2010-09-27 2012-05-30 武汉大学 一种h5n1禽流感病毒样颗粒疫苗的规模化制备方法
US20140004146A1 (en) * 2011-03-17 2014-01-02 Institut Pasteur Of Shanghai, Chinese Academy Of Sciences Method for producing virus-like particle by using drosophila cell and applications thereof
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
EA016866B1 (ru) * 2011-06-06 2012-08-30 Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт") Вакцина для специфической профилактики гриппа
KR101302245B1 (ko) * 2011-06-27 2013-09-02 조지아 스테이트 유니버시티 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 넓은 범위의 교차 방어능력을 갖는 신규한 보강 인플루엔자 백신
AR088028A1 (es) * 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
US11390878B2 (en) 2011-09-30 2022-07-19 Medicago Inc. Increasing protein yield in plants
TWI700368B (zh) * 2011-09-30 2020-08-01 苜蓿股份有限公司 增加植物類病毒顆粒產率
CA2863658C (en) * 2012-02-03 2023-03-14 Emory University Immunostimulatory compositions, particles, and uses related thereto
RU2485973C1 (ru) * 2012-02-28 2013-06-27 Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" Рекомбинантная трехвалентная вакцина от гриппа человека
ES2689878T3 (es) * 2013-02-21 2018-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Proteínas H5 del virus de la gripe H5N1 para su uso como un medicamento
US9649375B2 (en) * 2013-03-14 2017-05-16 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Immunogenic peptide conjugate and method for inducing an anti-influenza therapeutic antibody response therewith
US11441150B2 (en) 2014-01-10 2022-09-13 Medicago Inc. CPMV enhancer elements
CN103740655A (zh) * 2014-01-20 2014-04-23 瑞鑫百奥生物科技（深圳）有限公司 H5n1禽流感病毒样颗粒及其应用和制备方法、疫苗
WO2015143567A1 (en) 2014-03-27 2015-10-01 Medicago Inc. Modified cpmv enhancer elements
CN106559986A (zh) * 2014-06-20 2017-04-05 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 多价流感病毒样颗粒(vlp)及其作为疫苗的用途
RU2639491C2 (ru) * 2015-08-31 2017-12-21 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Вирионы и вирусоподобные частицы вируса мозаики альтернантеры как усилители иммунного ответа
CN109689093B (zh) * 2016-04-18 2024-03-08 港大科桥有限公司 适合于粘膜递送的冷适应的和毒力因子缺失的活减毒疫苗
CN107353328A (zh) * 2017-08-23 2017-11-17 上海市动物疫病预防控制中心 一种重组的h9n2亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和用途
CN110240634B (zh) * 2018-03-08 2022-09-06 普莱柯生物工程股份有限公司 一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用
CN108409842A (zh) * 2018-03-15 2018-08-17 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种单克隆抗体及其制备方法
KR102151962B1 (ko) * 2020-03-24 2020-09-04 안병철 어린 포유동물의 전염성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 혈청 조성물의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 혈청 조성물 및 이의 용도
JP2023518924A (ja) * 2020-03-24 2023-05-09 チョル アン，ビョン 幼い哺乳動物の粘膜関連伝染性疾病を予防または治療するための血清組成物の製造方法、前記方法によって製造された血清組成物及びその用途
CN113461786B (zh) * 2020-03-30 2022-09-13 普莱柯生物工程股份有限公司 一种禽流感病毒样颗粒疫苗、及其制备方法和应用
MX2022013456A (es) 2020-05-01 2022-11-16 Sinocelltech Ltd Metodo para mejorar la inmunogenicidad de un antigeno proteinico/peptidico.
CN112342149A (zh) * 2020-11-12 2021-02-09 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） 一种禽流感病毒样颗粒组装表达系统及其应用
CN112979796A (zh) * 2021-04-27 2021-06-18 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 马抗甲型h5n1虎源流感病毒免疫球蛋白和特异性免疫球蛋白及其精制方法
CN113862284B (zh) * 2021-09-13 2023-05-26 华南农业大学 一种编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因、病毒样颗粒、疫苗及制备与应用
CN114262720B (zh) * 2021-12-27 2023-07-25 河南兴华生物技术有限公司 杆状病毒表达系统的信号肽及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004501647A (ja) * 2000-06-23 2004-01-22 ワイス・ホールディングズ・コーポレイション 野性型およびキメラのインフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ）のアセンブリー
WO2005020889A2 (en) * 2003-07-11 2005-03-10 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (vlps)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US4911928A (en) 1987-03-13 1990-03-27 Micro-Pak, Inc. Paucilamellar lipid vesicles
US6387373B1 (en) 1993-01-15 2002-05-14 Novavax, Inc. Vaccines containing paucilsmellar lipid vesicles as immunological adjuvants
US5629021A (en) 1995-01-31 1997-05-13 Novavax, Inc. Micellar nanoparticles
US20040063188A1 (en) 2002-02-14 2004-04-01 Novavax, Inc. Kit for treating gastrointestinal tract

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004501647A (ja) * 2000-06-23 2004-01-22 ワイス・ホールディングズ・コーポレイション 野性型およびキメラのインフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ）のアセンブリー
WO2005020889A2 (en) * 2003-07-11 2005-03-10 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (vlps)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012008821; 臨牀と研究 第８１巻，第１２号, 2004, ｐ．１８９９-１９０３ *
JPN6012008823; 日本臨牀 第５８巻，第１号, 2000, ｐ．２５５-２６４ *
JPN6013026659; ウイルス 第５５巻，第１号, 200506, ｐ．５５-６２

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0250488A (ja) * 1988-08-11 1990-02-20 Nec Corp 超伝導配線
JP2016104015A (ja) * 2009-05-01 2016-06-09 ファイザー・インク 多重遺伝子ベクターによってコードされる組換えウイルス様粒子
JP2012527874A (ja) * 2009-05-28 2012-11-12 アボツト・バイオロジカルズ・ベー・ブイ 外来物質試験
JP2013520167A (ja) * 2010-02-18 2013-06-06 テクノヴァックス，インコーポレイテッド 万能ウイルス様粒子（ｖｌｐ）インフルエンザワクチン
JP2016198107A (ja) * 2010-02-18 2016-12-01 テクノヴァックス, インコーポレイテッドTechnovax, Inc. 万能ウイルス様粒子（ｖｌｐ）インフルエンザワクチン
US12076387B2 (en) 2010-03-23 2024-09-03 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
JP2012036154A (ja) * 2010-08-11 2012-02-23 Goshu Yakuhin Kk 食品
US11384339B2 (en) 2011-08-26 2022-07-12 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza viruses with mutant PB2 gene segment as live attenuated vaccines
JP2013048597A (ja) * 2011-08-31 2013-03-14 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス
JP7065803B2 (ja) 2013-03-28 2022-05-12 メディカゴ インコーポレイテッド 植物におけるインフルエンザウイルス様粒子の生成
JP2019141061A (ja) * 2013-03-28 2019-08-29 メディカゴ インコーポレイテッド 植物におけるインフルエンザウイルス様粒子の生成
US11802273B2 (en) 2014-06-20 2023-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
US11180737B2 (en) 2015-08-28 2021-11-23 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Generation of infectious influenza viruses from virus-like particles
JP2021184761A (ja) * 2015-08-28 2021-12-09 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ウイルス様粒子からの感染性インフルエンザウイルスの生成
JP7244455B2 (ja) 2015-08-28 2023-03-22 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ウイルス様粒子からの感染性インフルエンザウイルスの生成
JP7297832B2 (ja) 2015-08-28 2023-06-26 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ウイルス様粒子からの感染性インフルエンザウイルスの生成
JP2020114250A (ja) * 2015-08-28 2020-07-30 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ウイルス様粒子からの感染性インフルエンザウイルスの生成
JP2018530314A (ja) * 2015-08-28 2018-10-18 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ウイルス様粒子からの感染性インフルエンザウイルスの生成
US11851648B2 (en) 2019-02-08 2023-12-26 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Humanized cell line
US11807872B2 (en) 2019-08-27 2023-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
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