CN101325966A - 功能性流感病毒样颗粒(vlp) - Google Patents

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Abstract

本发明公开并要求保护病毒样颗粒(VLP)，这些VLP表达和/或含有季候性流感病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和/或来自具有大流行潜力的病毒的流感蛋白。本发明包括包含所述蛋白的载体构建体、包含所述构建体的细胞、包含本发明VLP的制剂和疫苗。本发明还包含制备VLP和对脊椎动物施用VLP的方法，包括诱发针对季候性流感和禽流感，或它们的至少一种症状的显著的免疫力的方法。

Description

功能性流感病毒样颗粒(VLP)
本申请要求下列申请的优先权：2005年10月18日提交的临时申请60/727,513；2006年5月10日提交的临时申请60/780,847；2006年5月15日提交的临时申请60/800,006；2006年7月17日提交的临时申请60/831,196；2006年7月21日提交的临时申请60/832,116；和2006年9月19日提交的临时申请60/845,495；本文引证收录上述申请的全部内容用于所有目的。
发明背景
流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员(综述见Murphy andWebster，1996)。流感病毒有三个亚型，称为A、B和C。流感病毒体含有分段的负义RNA基因组。流感病毒体包括下述蛋白：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质(M1)、质子离子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、和非结构蛋白2(NS2)蛋白。HA、NA、M1和M2是膜相关的，而NP、PB1、PB2、PA和NS2是核壳相关蛋白。NS1是不与病毒体颗粒结合而是特异于流感病毒感染细胞的唯一非结构蛋白。M1蛋白是流感病毒颗粒中最丰富的蛋白。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，负责病毒附着和病毒颗粒侵入细胞，是病毒中和和保护性免疫所用的主要免疫显性表位的来源。HA和NA蛋白都被认为是预防性流感疫苗最重要的组分。
流感病毒感染通过病毒体表面HA蛋白附着于含唾液酸细胞受体(糖蛋白和糖脂)而被引发。NA蛋白介导唾液酸受体的加工，且病毒对细胞的侵入依赖于HA依赖性受体介导的胞吞作用。在内化的含流感病毒体的内体的酸性境界中，HA蛋白经历构象变化，导致病毒和宿主细胞膜融合，随后病毒脱壳，M1蛋白在M2的介导下从核壳相关核糖核蛋白(RNP)释放，进入细胞核以进行病毒RNA合成。针对HA分子的抗体可以通过中和病毒感染性来预防病毒感染，而针对NA蛋白的抗体介导它们对病毒复制早期步骤的作用。
目前得到许可的灭活甲型和乙型流感病毒疫苗是作为供非消化道施用的三价疫苗。这些三价疫苗是在含胚鸡卵尿囊腔中作为单价的总物料产生，通过速率区带离心或柱层析纯化，用福尔马林或β-丙内酯灭活，然后配制成特定年份人群中流行的两株甲型和乙型流感病毒株的混合物。现有的商品化流感疫苗是全病毒(WV)或亚病毒体(SV，裂解或纯化的表面抗原(splitor purified surface antigen))病毒疫苗。WV疫苗含有完整的灭活病毒体。用诸如磷酸三正丁酯等溶剂处理过的SV疫苗(Flu-Shield，Wyeth-Lederle)含有几乎所有的病毒结构蛋白和一些病毒包膜。用Triton X-100溶解的SV疫苗(Fluzone，Sanofi-Aventis；Fluvirin，Novartis)主要含有HA单体、NA和NP的聚集物，尽管存在残余量的其它病毒结构蛋白。最近FDA对一种活的减毒冷适应病毒疫苗(FluMist，MedImmune)授予了销售许可，批准其作为鼻内投递疫苗用于在5-17岁的健康儿童和青年及18-49岁的健康成人中针对甲型及乙型流感病毒所引起的疾病的自动免疫接种和预防的商业应用。
已经开发了数种重组产品作为候选的重组流感疫苗。这些手段均着眼于甲型流感病毒HA和NA蛋白的表达、生产和纯化，包括使用杆状病毒感染的昆虫细胞(Crawford et al，1999；Johansson，1999；Treanor et al.，1996)，病毒载体(Pushko et al.，1997；Berglund et al.，1999)，和DNA疫苗构建体(Olsenet al.，1997)表达这些蛋白。
Crawford et al.(1999)证明杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的流感HA能够预防由H5和H7禽流感亚型引起的致死性流感疾病。同时，另一个小组证明杆状病毒表达的流感HA和NA蛋白在动物中诱导的免疫应答优于一种常规疫苗所诱导的免疫应答(Johansson et al.，1999)。将杆状病毒表达的马流感病毒血凝素的免疫原性和效力与一种同源DNA疫苗候选物进行了比较(Olsen et al.，1997)。总之，这些数据证明，使用各种实验手段，在不同的动物模型中，用重组HA或NA蛋白均可诱导出针对流感病毒攻击的高度保护。
Lakey等人(1996)显示，在一项I期剂量升高安全性研究中，源自杆状病毒的流感HA疫苗在人志愿者中得到了良好的耐受并且具有免疫原性。然而，在数个临床点用数个剂量的由HA和/或NA蛋白组成的流感疫苗接种人志愿者进行第二期研究，结果表明重组亚单位蛋白疫苗没有引发保护性免疫[G.Smith，Protein Sciences；M.Perdue，USDA，PersonalCommunications]。这些结果表明，感染性病毒体HA和NA包膜粒(peplomer)表面上展示的构象表位在中和性抗体和保护性免疫的引发中是重要的。
关于在重组流感疫苗候选物中包含其它流感蛋白的问题，已经进行了若干研究，包括涉及流感核蛋白NP(单独地或者与M1蛋白组合地)的实验(Ulmer et al.，1993；Ulmer et al.，1998；Zhou et al.，1995；Tsui et al.，1998)。这些由近似不变的内部病毒体蛋白构成的疫苗候选物可引发广谱的免疫力，主要是细胞免疫(CD4+和CD8+记忆T细胞)。这些实验涉及使用DNA或病毒基因载体。需要相对大量的注射DNA，因为使用较低剂量DNA的实验结果显示很少或没有保护作用(Chen et al.，1998)。因此，需要进一步的临床前和临床研究来评估此类涉及流感NP和M1的基于DNA的手段是否安全、有效和持久。
最近，为了尝试开发更有效的流感疫苗，使用了颗粒蛋白作为流感M2蛋白表位的载体。开发基于M2的疫苗的理论根据是在动物研究中M2蛋白引发了针对流感的保护性免疫(Slepushkin et al.，1995)。Neirynck et al.(1999)使用一种23个氨基酸长的M2跨膜域作为与乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的氨基末端融合配偶体，以将M2表位暴露在HBcAg壳体样颗粒的表面上。然而，尽管全长M2蛋白和M2-HBcAg VLP在小鼠中均诱导可检测的抗体和保护作用，将来的流感疫苗不大可能仅仅基于M2蛋白，因为M2蛋白每个病毒体中存在的拷贝数低，抗原性弱，不能引发结合游离流感病毒体的抗体，也不能阻断病毒对细胞受体的附着(即中和病毒)。
由于先前的研究已经显示，表面流感糖蛋白HA和NA是引发抗流感病毒保护性免疫的主要靶标，而且M1提供抗流感细胞免疫的保守靶标，新疫苗候选物可能包含这些病毒抗原作为蛋白大分子颗粒，诸如病毒样颗粒(VLP)。此外，具有这些流感抗原的颗粒可展示能引发针对多种流感病毒株的中和性抗体的构象表位。
数项研究已经证明，在使用哺乳动物表达质粒或者杆状病毒载体的细胞培养中重组流感蛋白能够自组装成VLP(Gomez-Puertas et al.，1999；Neumann et al.，2000；Latham and Galarza，2001)。Gomez-Puertas et al.(1999)证明，流感VLP的高效形成依赖于病毒蛋白的表达水平。Neumann et al.(2000)建立了一种基于哺乳动物表达质粒的系统，用于完全从克隆的cDNA产生感染性的流感病毒样颗粒。Latham和Galarza(2001)报道了在共表达HA、NA、M1和M2基因的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中形成流感VLP。这些研究证明，流感病毒体蛋白在真核细胞中共表达时可自组装。
发明概述
本发明提供一种病毒样颗粒(VLP)，它包含流感病毒M1蛋白和流感病毒H5及N1血凝素和神经氨酸酶蛋白。在一个实施方案中，M1蛋白与H5和N1蛋白相比衍生自不同的流感病毒株。在另一个实施方案中，所述H5或N1来自H5N1进化枝(clade)1流感病毒。
本发明还提供在容许VLP形成的条件下，由包含编码流感H5和N1蛋白及流感M1蛋白的一种或多种核酸的真核细胞表达的VLP。在一个实施方案中，所述真核细胞选自酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、禽类细胞和哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述真核细胞是昆虫细胞。
本发明还提供这样的VLP，当它施用于人或动物时，在所述人或动物体中引发针对流感感染具有保护性的中和性抗体。
本发明还提供包含有效剂量的本发明VLP的免疫原性组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含佐剂。
本发明还提供包含有效剂量的本发明VLP的疫苗。在一个实施方案中，所述疫苗至少包含第二种VLP，其包含来自不同流感病毒株的HA和NA。在另一个实施方案中，所述疫苗包含佐剂。
本发明还提供在动物中诱发显著的抗流感病毒感染免疫的方法，其包括施用至少一个有效剂量的包含本发明VLP的疫苗。在一个实施方案中，将所述疫苗通过口服、皮内、鼻内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用于动物。
本发明还提供本发明的VLP用于制备动物用疫苗的用途，其中该疫苗在所述动物中诱发显著的抗流感病毒感染免疫。
本发明还提供制备本发明VLP的方法，其包括在真核细胞中表达M1、HA和NA蛋白。
本发明提供包含流感VLP的疫苗，其中所述VLP包含流感M1、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人体中诱导显著的抗流感病毒感染免疫。在一个实施方案中，所述疫苗包含流感VLP，其中所述VLP基本上由流感M1、HA和NA蛋白组成，其中所述疫苗在人体中诱导显著的抗流感病毒感染免疫。在另一个实施方案中，所述疫苗包含流感VLP，其中所述VLP包含选自流感M1、HA和NA蛋白的多种流感蛋白，其中所述疫苗在人体内诱导显著的抗流感病毒感染免疫。
本发明还提供流感VLP用于制备疫苗的用途，其中所述VLP包含流感M1、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人体中诱导显著的抗流感病毒感染免疫。
由此，本发明提供一种大分子蛋白结构，其包含(a)第一种流感病毒M1蛋白和(b)附加结构蛋白，其可以包括：第二种或更多种流感病毒M1蛋白；第一种、第二种或更多种流感病毒HA蛋白；第一种、第二种或更多种流感病毒NA蛋白；和第一种、第二种或更多种流感病毒M2蛋白。如果所述附加结构蛋白不是来自第二种或更多种流感病毒M1蛋白，那么该组中所有的成员，例如第一种和第二种流感M2病毒蛋白，均包括在内。由此，本发明提供一种基本上由通过本发明方法产生的流感病毒结构蛋白所组成的功能性流感蛋白结构，包括亚病毒颗粒、VLP或壳粒结构，或者其部分、疫苗、多价疫苗以及它们的混合物。在一个特别优选的实施方案中，所述流感大分子蛋白结构包括流感病毒HA、NA和M1蛋白，这些蛋白是从野生型病毒作为合成片段克隆的流感病毒基因的表达产物。
所述大分子蛋白结构还可以包括附加结构蛋白，例如核蛋白(NP)、来自非流感病毒(noninfluenza viruses)之外的物种的膜蛋白及来自非流感来源(non-influenza source)的膜蛋白，这些蛋白衍生自禽类或哺乳动物来源及流感病毒的不同亚型，包括甲型和乙型流感病毒。本发明可包括嵌合大分子蛋白结构，其所包括的至少一种蛋白质的一部分具有不是由流感病毒所产生的模块。
可以通过提供可在宿主细胞中由重组构建体自组装的大分子蛋白结构来实现流感的预防。本发明的大分子蛋白结构能够自组装成同型或异型的病毒样颗粒(VLP)，这些颗粒在HA和NA蛋白上展示构象表位，这些表位引发保护性的中和性抗体。所述组合物可以是疫苗组合物，其还含有载体或稀释剂和/或佐剂。功能性流感VLP能引发针对一种或多种流感病毒株或病毒型的中和性抗体，取决于所述功能性流感VLP是否含有来自一种或多种病毒株或病毒型的HA和/或NA蛋白。所述疫苗包含的流感病毒蛋白可以是野生型流感病毒蛋白。优选地，含有流感VLP的结构蛋白或者其部分，可衍生自野生型流感病毒的多种病毒株。可以将所述流感疫苗施用于人或动物以引发针对一种或多种流感病毒株或病毒型的保护性免疫力。
本发明的大分子蛋白结构可以展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。
本发明提供一种通过构建重组构建体来制备流感衍生的VLP的方法，其中所述重组构建体编码流感结构基因(包括M1、HA)和至少一种流感病毒衍生的结构蛋白。使用重组构建体，利用重组杆状病毒转染、感染或转化合适的宿主细胞。在容许表达M1、HA和至少一种流感病毒衍生的结构蛋白的条件下培养所述宿主细胞，在所述宿主细胞中形成VLP。收获含有功能性流感VLP的被感染细胞的培养液，并纯化VLP。本发明还有一个特点在于用编码第二种流感蛋白的第二重组构建体共转染、共感染或共转化宿主细胞，从而将第二种流感蛋白纳入VLP中的额外步骤。这样的结构蛋白可以衍生自流感病毒，包括NA、M2和NP，并且至少一种结构蛋白衍生自禽类或哺乳动物来源。结构蛋白可以是甲型和乙型流感病毒。根据本发明，宿主细胞可以是真核细胞。此外，VLP可以是嵌合型VLP。
本发明的另一个特点是一种配制含有流感VLP的药品的方法，该方法是通过向宿主细胞中导入编码流感病毒基因的重组构建体，并容许重组流感病毒蛋白在细胞中自组装成为功能性的同型或异型VLP。分离并纯化流感VLP，并配制含有该流感VLP的药品。所述药品可以进一步包含佐剂。此外，本发明提供一种配制药品的方法，该方法是通过将此类含有流感VLP的药品与脂质小泡，即非离子性脂质小泡混合。由此，功能性的同型或异型VLP可作为覆包膜的颗粒从被感染细胞出芽(bud)。出芽的流感VLP可以通过超离心或柱层析分离纯化为药品，并单独地或者与佐剂诸如(Novavax，Inc产品)等配制成药物产品，诸如疫苗。
Figure A20068004585000102
提供增强的免疫效应，在美国专利No.4,911,928中对其有进一步描述，通过提述纳入本文。
本发明提供一种检测脊椎动物中针对流感病毒感染的体液免疫的方法，该方法是通过提供包含有效抗体检测量的流感病毒蛋白的测试试剂，所述流感病毒蛋白具有流感病毒大分子结构的至少一个构象表位。将测试试剂与来自需要检查流感病毒感染的脊椎动物的体液样品接触。让样品中包含的流感病毒特异性抗体与流感病毒大分子结构的构象表位结合以形成抗原-抗体复合物。将这些复合物从未结合的复合物中分离出来，并使它们与可检测地标记的免疫球蛋白结合剂接触。测定结合于所述复合物的可检测地标记的免疫球蛋白结合剂的量。
可以如下检测来自怀疑感染了流感病毒的动物或人的标本中的流感病毒，即通过提供具有产生可检测信号的标记物或者连接于可检测地标记的试剂、并且对流感病毒颗粒的至少一种构象表位具有特异性的抗体。使标本与抗体接触，并让抗体与流感病毒结合。利用所述可检测标记物确定标本中流感病毒的存在。
本发明提供治疗、预防和产生保护性免疫应答的方法，所述方法是通过对脊椎动物施用有效量的本发明的组合物。
或者，所述流感VLP药品可以配制成实验室试剂，用于流感病毒结构研究和临床诊断测定。本发明还提供用于通过施用有效量的本发明的组合物来治疗流感病毒的试剂盒和使用指导。
本发明还提供包含HA、NA和M1蛋白的VLP，所述HA、NA和M1蛋白衍生自能够在脊椎动物中导致发病(morbidity)或死亡(mortality)的禽流感病毒。在一个实施方案中，所述HA、NA和M1蛋白衍生自甲型禽流感病毒。在另一个实施方案中，HA选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16，而NA选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一个实施方案中，所述HA和NA蛋白分别是H5和N1。在另一个实施方案中，所述HA和NA蛋白分别是H9和N2。在另一个实施方案中，所述HA和/或NA分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。在一个实施方案中，VLP基本上由HA、NA和M1蛋白组成，也就是说，这些蛋白基本上是VLP中仅有的流感蛋白。
本发明还提供一种产生VLP的方法，其包括将编码禽流感病毒蛋白的载体转染到合适的宿主细胞中，并在容许形成VLP的条件下表达所述禽流感病毒蛋白。在一个实施方案中，该方法涉及用仅编码HA、NA和M1流感蛋白的重组DNA分子转染宿主细胞。
本发明还包括一种包含VLP的抗原性制剂，所述VLP含有衍生自能够在脊椎动物中导致发病和死亡的禽流感病毒的HA、NA和M1蛋白。在另一个实施方案中，HA选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16，而NA选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一个实施方案中，所述HA和NA蛋白分别是H5和N1。在另一个实施方案中，所述HA和NA蛋白分别是H9和N2。在另一个实施方案中，将所述抗原性制剂通过口服、皮内、鼻内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用于受试者。
本发明进一步提供对脊椎动物进行抗禽流感病毒免疫接种的方法，其包括对所述脊椎动物施用诱导保护量的VLP，所述VLP包含衍生自禽流感病毒的HA、NA和M1蛋白。
本发明还包括在受试者中诱导针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的流感VLP。在一个实施方案中，所述VLP基本上由HA、NA和M1组成。在另一个实施方案中，所述VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和M1组成。在另一个实施方案中，所述HA和/或NA分别展现血凝素和/或神经氨酸酶活性。
本发明还包括在受试者中诱导针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的禽流感VLP。在一个实施方案中，所述流感VLP基本上由禽类HA、NA和M1组成。在另一个实施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由禽类HA、NA和M1组成。
本发明还包括在受试者中诱导针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的季候性流感VLP。在一个实施方案中，所述流感VLP基本上由季候性HA、NA和M1组成。在另一个实施方案中，所述流感VLP包括流感蛋白，其中所述流感蛋白由季候性HA、NA和M1组成。
本发明还包括在受试者中诱导针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的至少一种季候性流感VLP。在一个实施方案中，所述流感VLP包含季候性流感HA、NA和M1。在另一个实施方案中，所述流感VLP基本上由季候性流感HA、NA和M1组成。
本发明进一步包括在受试者中诱导针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的保护性抗体应答的方法，其包括施用至少一个有效剂量的流感VLP。
本发明包括在受试者中诱导针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的保护性细胞免疫应答的方法，其包括施用至少一个有效剂量的流感VLP。
本发明还包括配制疫苗的方法，所述疫苗在受试者中诱导针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力，所述方法包括向所述制剂中加入有效剂量的流感VLP。在一个实施方案中，所述针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力是通过一个剂量赋予的。在另一个实施方案中，所述针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力是通过多个剂量赋予的。
本发明还包括一种含有流感VLP的疫苗，其中所述疫苗当施用于受试者时诱导针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力。在一个实施方案中，所述流感VLP是禽流感VLP。在另一个实施方案中，所述流感VLP是季候性流感VLP。
本发明还包括一种含有流感VLP的抗原性制剂，其中所述疫苗当施用于受试者时诱导针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力。在一个实施方案中，所述流感VLP是禽流感VLP。在另一个实施方案中，所述流感VLP是季候性流感VLP。
附图简要说明
图1描述禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒神经氨酸酶(NA)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2描述禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒血凝素(HA)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
图3描述禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒基质蛋白M1(M1)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
图4描述构建用于表达禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)HA、NA和M1蛋白的重组杆状病毒所用转移载体。图4A描述表达各个基因的转移载体，图4B描述用于基因的多重表达的转移载体。
图5描述禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)HA、NA和M1蛋白在Sf-9S细胞中的表达。
图6描述通过蔗糖密度梯度方法纯化禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)VLP。
图7描述通过凝胶过滤层析检测流感病毒蛋白。Western印迹分析中所用的抗体如下：(A)兔抗H9N2；(b)鼠抗M1单抗；(C)鼠抗BACgp64。
图8描述通过电子显微术检测禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)蛋白，包括亚病毒颗粒、VLP和VLP复合物。
图9描述纯化的禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)VLP的血凝素活性。
图10描述纯化的禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)VLP的神经氨酸酶活性。
图11描述在小鼠中使用纯化的禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)VLP进行重组流感免疫原性研究所用的免疫和取血时间表。
图12描述在用重组流感H9N2VLP免疫的小鼠中免疫原性研究的结果。图12A描述来自用重组VLP免疫的BALB/c小鼠的血清，其中的VLP由来自禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)的HA、NA和M1蛋白组成。图12B描述将来自用灭活甲型禽流感病毒H9N2免疫的新西兰白兔的血清与含有灭活甲型禽流感病毒H9N2(泳道1和3)或冷适应甲型禽流感病毒H9N2(泳道2和4)的Western印迹反应。
图13描述初次免疫和再次免疫之后BALB/c小鼠中的几何平均抗体应答。
图14描述BALB/c小鼠中的血清血凝素抑制(HI)应答。
图15描述用H9N2流感攻击的BALB/c小鼠中的体重减轻(％)。
图16描述用H9N2攻击后3天和5天的肺病毒效价。
图17A、17B和17C描述用H3N2VLP免疫小鼠后针对甲型/福建/411/2002的抗体应答。
图18A和B描述小鼠IgG抗体同种型。
图19描述用H9N2VLP疫苗免疫的SD大鼠中的血凝素抑制(HI)抗体应答。
图20A和20B描述BALB/c小鼠中针对有和没有佐剂的不同剂量H9N2VLP的血凝素抑制(HI)抗体应答。
图21描述BALB/c小鼠中在不同剂量的VLP之间的血清血凝素抑制(HI)应答。
图22描述在雪貂中的血清血凝素抑制(HI)应答。
图23描述雪貂施用不同病毒株的H3N2VLP后21和42天时抽取的血清的血清血凝素抑制(HI)应答。
图24描述肌肉内接种低剂量H5N1(越南/1203/2003)VLP的小鼠的抗HA抗体(终点稀释效价)。
图25描述鼻内接种低剂量H5N1(越南/1203/2003)VLP的小鼠的抗HA抗体(终点稀释效价)。
图26描述制造、分离和纯化本发明VLP的一个实例。
图27描述通过肌肉内给药H3N2VLP接种小鼠，然后通过鼻内用甲型/Aichi/2/68x31(H3N2)病毒攻击。
图28描述通过鼻内给药H3N2VLP接种小鼠，然后通过鼻内用甲型/Aichi/2/68x31(H3N2)病毒攻击。
图29描述用H9N2VLP疫苗接种后用H9N2病毒鼻内攻击的雪貂洗鼻液中的病毒脱落(shedding)。
图30A、30B、30C、30D、30E、30F、30G和30H描述用不同剂量的甲型/福建/411/2002(H3N2)VLP肌肉内或鼻内接种后针对不同的流感病毒H3N2株进行测试时小鼠中的血凝素抑制(HI)抗体应答。
发明详述
如本文所用的，术语“杆状病毒”，又称杆状病毒科(baculoviridae)，是指节肢动物有包膜DNA病毒的一个科，该科的成员可以用作表达载体在昆虫细胞培养中生成重组蛋白。病毒体含有一种或多种杆状核壳，所述核壳还有环状超螺旋双链DNA分子(Mr 54×106-154×106)。用作载体的病毒通常是苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(NVP)。导入基因的表达是处于通常调控大核包涵体(在被感染细胞中病毒包埋在大核包涵体内)多角体蛋白组分的强启动子的控制之下。
如本文所用的，术语“衍生自”指起源或来源，可包括天然存在的、重组的、未纯化的、或者纯化的分子。本发明的蛋白和分子可以衍生自流感或非流感分子。
如本文所用的，术语“第一种”流感病毒蛋白，即第一种流感病毒M1蛋白，是指衍生自某一具体流感病毒株的蛋白质，例如M1、HA、NA和M2。第一种流感病毒的株或型不同于第二种流感病毒蛋白的株或型。因此，“第二种”流感病毒蛋白，即第二种流感病毒M1蛋白，是指衍生自第二种流感病毒株的蛋白，例如M1、HA、NA和M2，其中第二种流感病毒株是不同于第一种流感病毒蛋白的株或型。
如本文所用的，术语“血凝素活性”是指含HA蛋白、VLP或它们的部分所具有的结合红细胞(红血球)并使之凝集的能力。
如本文所用的，术语“神经氨酸酶活性”是指含NA蛋白、VLP或它们的部分所具有的从底物(包括蛋白质，例如胎球蛋白)切除唾液酸残基的酶活性。
如本文所用的，术语“异型的”(heterotypic)是指一种或多种不同型或株的病毒。
如本文所用的，术语“同型的”(heterotypic)是指一种型或株的病毒。
如本文所用的，术语“大分子蛋白结构”是指一种或多种蛋白的构造(construction)或排列(arrangement)。
如本文所用的，术语“多价”疫苗是指针对多种流感病毒株或病毒型的疫苗。
如本文所用的，术语“非流感的”(non-influenza)是指非衍生自流感病毒的蛋白或分子。
如本文所用的，术语“疫苗”是指死亡或弱化的病原体的制备物，或者衍生的抗原性决定簇的制备物，用于诱导针对所述病原体的抗体或免疫力的形成。给予疫苗以提供针对疾病(例如由流感病毒导致的流感)的免疫力。本发明提供具有免疫原性并提供保护的疫苗组合物。此外，术语“疫苗”还指免疫原(例如VLP)的悬液或溶液，其被施用于脊椎动物以产生保护性免疫力，即减轻感染相关疾病的严重性的免疫力。
如本文所用的，术语“显著的免疫力”是指这样的免疫应答：当对脊椎动物施用本发明的VLP时，该脊椎动物中存在免疫系统的诱导，导致所述脊椎动物中流感感染的预防、流感感染的改善或者与流感病毒感染相关的至少一种症状的减轻。显著的免疫力还可以指在已施用本发明VLP并已诱导了免疫应答的哺乳动物中≥40的血凝抑制(HI)效价。
如本文使用的，术语“佐剂”是指这样的化合物，当其与特定的免疫原(例如VLP)在制剂中组合使用时，增大或以其它方式改变或修饰由此所致的免疫应答。免疫应答的修饰包括抗体免疫应答和细胞免疫应答之一或二者的强度增大或特异性增宽。免疫应答的修饰还可以意味着特定的抗原特异性免疫应答的降低或抑制。
如本文所用的，术语“免疫刺激物”是指通过身体自身的化学信使(细胞因子)增强免疫应答的化合物。这些分子包括具有免疫刺激、免疫强化和促炎症活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，诸如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)集落刺激因子(CSF))；及其它免疫刺激分子，诸如巨噬细胞炎症因子，Flt3配体，B.71；B7.2等。免疫刺激物分子可以在与流感VLP相同的制剂中施用，或者可以另行施用。可以施用蛋白质或者编码该蛋白质的表达载体来产生免疫刺激效应。
如本文所用的，“有效剂量”一般指足以诱导免疫力、预防和/或改善流感病毒感染或减轻流感感染的至少一种症状、和/或增强另一个剂量的VLP的效力的本发明VLP的量。有效剂量可以指足以延迟流感感染发作或使之最小化的VLP的量。有效剂量还可以指在流感感染的治疗或管理中提供治疗益处的VLP的量。此外，有效剂量是就单独或与其它疗法组合在流感病毒感染的治疗或管理中提供治疗益处的本发明VLP而言的量。有效剂量还可以是足以增强受试者(例如人)自己针对后来与流感病毒接触的免疫应答的量。免疫力的水平可以通过例如测量中和性分泌抗体和/或血清抗体的量来加以监测，所述测量例如通过噬斑中和(plaque neutralization)、补体结合(complement fixation)、酶联免疫吸附、或微中和(microneutralization)测定来进行。在疫苗的情况下，“有效剂量”是预防疾病或降低症状严重性的剂量。
如本文所用的，术语“禽流感病毒”是指主要见于鸟类中，但也可感染人类或其它动物的流感病毒。在一些情况下，禽流感病毒可以从一个人传播或扩散至另一个人。感染人的禽流感病毒具有导致流感大流行，即导致人类中的发病和死亡的潜力。当出现新的流感病毒株(人对其不具有天然免疫力的病毒)，其扩散经过各个地点并可能遍及全球，同时感染很多人时，即出现大流行。
如本文所用的，术语“季候性流感病毒”是指就某一流感季候而言，已根据全球各国家流感中心(National Influenza Centers)进行的流行病学调查确定为正在人群内传播的流感病毒株。这些流行病学研究结果以及某些分离的流感病毒被送到世界卫生组织(WHO)的四个参考实验室之一以进行详细研究，其中一个实验室设置在亚特兰大的疾病控制和预防中心(Centers forDisease Control and Prevention(CDC))。这些实验室测试针对现有疫苗制备的抗体与流行中的病毒和新流感病毒反应的良好程度。将该信息和有关流感活动情况的信息汇总并提交到美国食品和药品管理局(FDA)的一个顾问委员会以及WHO的会议上。这些会议的结果是选择三种病毒(甲型流感病毒的两个亚型和乙型流感病毒的一个亚型)进入用于下个秋季和冬季的流感疫苗。该选择在北半球于2月份进行，在南半球于9月份进行。通常，每年改变疫苗中三种病毒株中的一种或两种。
如本文所用的，术语“显著保护性的抗体应答”是指脊椎动物(例如人)展现的、由针对流感病毒的抗体介导的、预防或改善流感感染或减轻其至少一种症状的免疫应答。本发明的VLP可以刺激产生抗体(例如中和性抗体)，所述抗体阻止流感病毒进入细胞、结合所述流感病毒从而阻断该病毒复制、和/或保护宿主细胞不受感染和破坏。
如本文所用的，术语“显著保护性的细胞免疫”是指脊椎动物(例如人)展现的、由针对流感病毒的T淋巴细胞和/或其它白细胞介导的、预防或改善流感感染或减轻其至少一种症状的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及细胞溶解性T细胞(CTL)所致的抗原特异性应答。CTL针对与主要组织相容性复合物(MHC)编码蛋白结合呈递并表达在细胞表面的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导和促进细胞内微生物的破坏或感染了这些微生物的细胞的溶解。细胞免疫的另一个方面涉及T辅助细胞所致的抗原特异性应答。T辅助细胞帮助刺激非特异性效应细胞的功能，并使这些效应细胞的活性集中指向在其表面上展示与MHC分子结合的肽抗原的细胞。“细胞免疫应答”还指由活化T细胞和/或其它白细胞(包括衍生自CD4+和CD8+T细胞的细胞)所产生的细胞因子、趋化因子以及其它此类分子的产生。
如本文所用的，术语“基于全群体的显著免疫力”是指对群体中的个体施用的本发明VLP所致的免疫力。所述群体中的所述个体中的免疫力，导致所述个体中流感感染的预防、改善，或者与流感病毒感染相关的至少一种症状的减轻，并防止所述流感病毒扩散到群体中其它个体。术语“群体”定义为个体(例如学童、老人、健康个体等等)的群组，可包括地理区域(例如具体的城市、学校、小区、工作场所、国家(country)、州(state)，等)。
如本文所用的，术语“抗原性制剂”或“抗原性组合物”是指这样的制备物：当将它施用于脊椎动物，尤其是鸟类或哺乳动物时，会诱导免疫应答。
如本文所用的，术语“脊椎动物”或“受试者”或“患者”是指脊索动物亚门(subphylum cordata)的任何成员，包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，例如黑猩猩和其它猿类和猴类物种。家畜(farm animals)，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养动物，如狗和猫；实验动物，包括啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家禽、野鸟和猎禽，如鸡、火鸡和其它鹑鸡类鸟类，鸭、鹅等等也是非限制性的例子。该定义中包含术语“哺乳动物”和“动物”。意图覆盖成体和新生个体。
虽然现有在最优条件下60-80％有效的特异性灭活病毒疫苗，流感仍然是一个普遍的公共健康问题。当这些疫苗有效时，通常通过防止病毒感染而避免患病。抗原性差异的积累(抗原性转变和抗原性漂移)可导致疫苗失效。例如，甲型禽流感H9N2与人流感病毒甲型/悉尼/97(H3N2)在猪中共流行(co-circulate)，导致基因重排列和具有大流行潜力的人流感病毒新株的出现(Peiris et a1.，2001)。在发生此类抗原性转变的情况下，现有的疫苗不大可能提供足够的保护。
缺乏流感疫苗方案的另一个原因是现有疫苗引发的免疫力持续时间相对较短。流感控制措施的进一步缺乏反映了现有疫苗的使用受到限制，这是由于疫苗的反应原性以及对幼儿、老年人和对商业许可的灭活病毒流感疫苗的制造中使用的卵组分过敏的人的副作用。
此外，灭活的流感病毒疫苗往往缺少HA和NA构象表位或者所含HA和NA构象表位发生了改变，而这些表位引发中和性抗体并且在抗病免疫中起重要作用。因此，灭活病毒疫苗和某些重组单体流感亚基蛋白疫苗赋予的保护不足。另一方面，大分子蛋白结构，例如壳粒、亚病毒颗粒和/或VLP，含有多拷贝的展示构象表位的天然蛋白，有利于获得最优的疫苗免疫原性。
本发明描述将禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1基因单独或串联地克隆到单一杆状病毒表达载体中，以及生产由重组流感结构蛋白构成的流感疫苗候选物或试剂；在杆状病毒感染的昆虫细胞中，这些重组流感结构蛋白自组装成功能性和免疫原性同型大分子蛋白结构，包括亚病毒流感颗粒和流感VLP。
本发明描述将人流感甲型/悉尼/5/97和甲型/福建/411/2002(H3N2)病毒HA、NA、M1、M2和NP基因克隆到杆状病毒表达载体中，以及生产由流感结构蛋白构成的流感疫苗候选物或试剂；在杆状病毒感染的昆虫细胞中，这些流感结构蛋白自组装成功能性和免疫原性同型大分子蛋白结构，包括亚病毒流感颗粒和流感VLP。
此外，本发明描述将人流感甲型/悉尼/5/97和甲型/福建/411/2002(H3N2)病毒的HA基因和禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)的HA、NA和M1基因串联地克隆到单一杆状病毒表达载体中，以及生产由流感结构蛋白构成的流感疫苗候选物或试剂；在杆状病毒感染的昆虫细胞中，这些流感结构蛋白自组装成功能性和免疫原性同型大分子蛋白结构，包括亚病毒流感颗粒和流感VLP。
本发明的VLP
本发明的流感VLP有用于制备针对流感病毒的疫苗。该系统的一个重要特征是能够用不同亚型的HA和/或NA或其它病毒蛋白代替表面糖蛋白，从而可以每年更新新的流感抗原性变体或为流感大流行做准备。当这些糖蛋白的抗原性变体被鉴定时，可以更新VLP以包含这些新变体(例如用于季候性流感疫苗)。此外，来自潜在大流行性病毒如H5N1的表面糖蛋白，或其它具有大流行性潜力的HA、NA组合，也可纳入VLP中，而不用担心释放出已有数十年未在人类中流行的基因。这是因为这些VLP没有感染性，不会复制且不能致病。因此，该系统可用于每年创造新的候选流感疫苗，和/或在任何需要的时候创造流感大流行性疫苗。
有16种不同的血凝素(HA)和9种不同的神经氨酸酶(NA)，它们都已在野生鸟类中找到。野生鸟类是所有类型的甲型流感病毒的主要天然储库，并且被认为是所有其它脊椎动物中的所有类型的甲型流感病毒的来源。这些亚型由于它们表面上的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的变化而不同。HA和NA蛋白的许多不同组合是可能的。每种组合代表一种不同的甲型流感病毒类型。此外，每种类型根据其8种基因的每一种中发现的不同突变可以进一步分类为多种病毒株。
所有已知类型的甲型流感病毒均可在鸟类中找到。通常，禽流感病毒不感染人类。但是，某些禽流感病毒可发生与穿越物种屏障的能力相关联的遗传变异。这样的病毒能够造成大流行，因为人类对此病毒没有天然免疫力，能够容易地从人到人传播。1997年香港，在一次家禽禽流感爆发中，禽流感病毒从鸟类传到了人类。该病毒被鉴定为流感病毒H5N1。这种病毒导致18人发生严重的呼吸道病情，其中6人死亡。从那时起，全世界人类中发生了越来越多的已知H5N1感染病例，这些人中大约半数已经死亡。
因此，本发明包括从禽流感病毒、具有大流行潜力的流感病毒和/或季候性流感病毒克隆HA、NA和M1核苷酸到表达载体中。本发明还描述由自组装成功能性VLP的流感蛋白构成的流感疫苗候选物或试剂的生产。所有病毒蛋白组合都必须与M1核苷酸共表达。
本发明的VLP包括流感HA、NA和M1蛋白或由它们组成。在一个实施方案中，所述VLP包含来自禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒的HA，和来自禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒的NA，其中所述HA选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16，所述NA选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一个实施方案中，本发明包括基本上由HA、NA和M1组成的VLP。所述HA和NA可以来自上面所列的HA和NA。这些VLP可包含可忽略浓度的其它流感蛋白和/或蛋白杂质。在另一个实施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和M1蛋白组成。这些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它细胞组分如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除了M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一个实施方案中，当表达在VLP表面上时，HA和/或NA可分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。
在另一个实施方案中，所述VLP包含H5N1病毒的HA和NA，以及M1蛋白(该M1蛋白可以来自也可以不来自同一病毒株)。在另一个实施方案中，所述VLP基本上由H5N1病毒的HA和NA以及M1蛋白组成。这些VLP可以包含可忽略浓度的其它流感蛋白和/或蛋白杂质。在另一个实施方案中，所述VLP由H5N1病毒的HA和NA以及M1蛋白组成。在另一个实施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由H5、N1和M1蛋白组成。这些VLP含有H5、N9和M1，并可含有其它细胞组分如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除了M1、H5和/或N1的片段之外)。在另一个实施方案中，当表达在VLP表面上时，H5和/或N1可分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。
在另一个实施方案中，所述VLP包含H9N2病毒的HA和NA，以及M1蛋白。在另一个实施方案中，所述VLP基本上由H9N2病毒的HA和NA，以及M1蛋白组成。这些VLP可以包含可忽略浓度的其它流感蛋白和/或蛋白杂质。在另一个实施方案中，所述VLP由H9N2病毒的HA和NA，以及M1蛋白组成。在另一个实施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由H9、N2和M1蛋白组成。这些VLP含有H9、N2和M1，并可含有其它细胞组分如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除了M1、H9和/或N2的片段之外)。在另一个实施方案中，当表达在VLP表面上时，H9和/或N2可分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。
在另一个实施方案中，所述VLP包含来自乙型流感病毒的HA和NA，以及M1蛋白。乙型流感病毒通常仅见于人类。和甲型流感病毒不同，这些病毒不根据亚型分类。乙型流感病毒可在人类中导致发病和死亡，但与甲型流感病毒相比，其相关的流行严重程度一般较小。在另一个实施方案中，所述VLP基本上由来自乙型流感病毒的HA和NA，以及M1蛋白组成。这些VLP可以包含可忽略浓度的其它流感蛋白和/或蛋白杂质。在另一个实施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和M1蛋白组成。这些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它细胞组分如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除了M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一个实施方案中，所述VLP由乙型流感病毒的HA和NA，以及M1蛋白组成。在另一个实施方案中，当表达在VLP表面上时，HA和/或NA可分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。
本发明还涵盖在本发明VLP之上或之中表达的所述流感蛋白的变体。这些变体可在所述组分蛋白的氨基酸序列中包含改变。术语“变体”就多肽而言是指相对于参考序列改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可具有“保守的”改变，其中用于替换的氨基酸具有类似的结构或化学性质，例如用异亮氨酸替换亮氨酸。或者，变体可具有“非保守的”改变，例如用色氨酸替换甘氨酸。类似的次要变化还可包括氨基酸缺失和/或插入。使用本领域公知的计算机程序，例如DNASTAR软件，可以找到确定哪些氨基酸残基可供替换、插入或缺失而不消除生物学活性或免疫学活性的指导。
天然变体可由于抗原性漂移而产生。抗原性漂移是病毒蛋白中随时间不断发生的细小变化。因此，感染了某一特定流感病毒株的人产生针对该病毒的抗体，当新病毒株出现时，针对较旧病毒株的抗体不再识别该较新的病毒，而可能发生再感染。这就是每个季候都有新流感疫苗的原因。此外，流感病毒中的某些改变可导致流感病毒跨种传播。例如，某些禽流感病毒发生与穿越物种屏障能力相关的遗传变异。这样的病毒能够造成大流行，因为人类对此病毒没有天然免疫力，该病毒能够容易地从人到人传播。所述流感蛋白的天然发生的变异是本发明的一个实施方案。
描述可应用于本发明的分子生物学技术例如克隆、突变、细胞培养等的通用教科书包括：Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(Berger)；Sambrook et al.，Molecular Cloning--A Laboratory Manual(3rd Ed.)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，2000(“Sambrook”)和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel et al.，eds.，Current Protocols，由Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley &Sons，Inc.联合出版(“Ausubel”)。这些教科书描述了诱变、载体的使用、启动子和许多其它相关的题目，例如HA和/或NA分子的克隆和突变等。因此，本发明也涵盖使用已知的蛋白质工程和重组DNA技术的方法来改进或改变表达在本发明VLP之上或之中的流感蛋白的特性。有多种诱变类型可用于产生和/或分离变体HA、NA和/或M1分子和/或用于进一步修饰/突变本发明的多肽。它们包括但不限于定点诱变、随机点诱变、同源重组(DNA改组)、使用含尿嘧啶模板进行诱变、寡核苷酸定点诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用缺口双链体DNA的诱变等等。其它合适的方法包括点错配修复(point mismatch repair)，使用修复缺陷的宿主株的诱变，限制选择和限制纯化，缺失诱变，通过全基因合成的诱变，双链断裂修复等等。诱变，例如涉及嵌合构建体的诱变，也包含在本发明中。在一个实施方案中，可通过天然存在的分子或经过改变或突变的天然存在的分子，例如序列、序列比较、物理性质、晶体结构等等的已知信息来指导诱变。
本发明还包括当表达在VLP之上或之中时显示显著的生物学活性(例如能够引发有效的抗体应答)的流感蛋白变体。这样的变体包括缺失、插入、倒序(inversion)、重复，和替代，根据本领域已知的一般规则来选择它们使其对活性几乎不产生影响。
克隆所述流感蛋白的方法是本领域已知的。例如，可以从感染了流感病毒的细胞提取聚腺苷酸化mRNA，通过RT-PCR从中分离出编码特定流感蛋白的流感基因。所得产物基因可以作为DNA插入片段克隆到载体中。术语“载体”是指可用于扩增核酸和/或在生物体、细胞或细胞组分之间转移核酸的工具。载体包括自主复制或可整合到宿主细胞的染色体中的质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等等。载体还可以是非自主复制性的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链中包含DNA和RNA二者的多核苷酸、聚赖氨酸偶联的DNA或RNA、肽偶联的DNA或RNA、脂质体偶联的DNA等等。在许多但不是所有的通常实施方案中，本发明的载体是质粒或杆粒(bacmid)。
因此，本发明包括这样的核苷酸，它们编码HA、NA和/或M1流感蛋白，克隆到能在细胞中表达的表达载体中，其中所述载体诱导VLP的形成。“表达载体”是能够促进纳入其中的核酸的表达和复制的载体，例如质粒。典型地，要表达的核酸与启动子和/或增强子“可操作地连接”，并受该启动子和/或增强子的转录调控。在一个实施方案中，所述编码来自禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒的HA的核苷酸选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。在另一个实施方案中，所述编码来自禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒的NA的核苷酸选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一个实施方案中，所述载体由编码HA、NA和/或M1流感蛋白的核苷酸组成。在另一个实施方案中，所述载体由编码HA、NA和M1流感蛋白的核苷酸组成。优选的表达载体是杆状病毒载体。克隆了编码所述流感蛋白的核苷酸之后，对所述核苷酸可以进一步加以操作。例如，本领域技术人员可以突变编码区的特定碱基来产生变体。变体可在编码区、非编码区或者编码区和非编码区二者中含有改变。这样的变体可增加流感蛋白的免疫原性或去除蛋白或RNA中的剪接位点。例如，在一个实施方案中，将流感M蛋白(全长)上的供体和受体剪接位点突变，以避免M mRNA被剪接成M1和M2转录物。在另一个实施方案中，将HA工程化以去除或突变剪切位点。例如，野生型H5 HA具有含多个碱性氨基酸的剪切位点(RRRKR)。该野生型序列使得HA对宿主中或表达这些HA的系统中可能存在的多种遍在蛋白酶更为敏感。在一个实施方案中，去除这些氨基酸可以降低HA对多种蛋白酶的敏感性。在另一个实施方案中，可突变该剪切位点以去除该剪切位点(例如突变成RESR)。
本发明还使用编码NA、HA和M1的核酸和多肽。在一个实施方案中，流感NA核酸或蛋白与SEQ ID NO 1、11、31、32、39、38、46、47、54或55至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。在另一个实施方案中，流感HA核酸或蛋白与SEQ ID NO 2、10、56、57、58、27、28、29、30、37、36、33、34、35、42、43、44、45、50、51、52或53至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。在另一个实施方案中，流感M1核酸或蛋白与SEQ ID NO 12、40、41、48或49至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
在一些实施方案中，突变包含这样的变化：这些变化产生沉默的替换、添加或缺失，但不改变被编码蛋白的性质或活性或者生成这些蛋白的方式。可以出于多种原因而产生核苷酸变体，例如为了最优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变为昆虫细胞例如Sf9细胞偏好的那些密码子)。参见美国专利公布2005/0118191，本文通过提述收录其全部内容用于所有目的。本发明的最优化密码子序列的例子在下文公开(例如SEQ ID 42、44、46、48、50、52和54)。
此外，可将核苷酸测序以保证克隆的是正确的编码区，且不含有任何不希望的突变。可以将这些核苷酸亚克隆到表达载体(例如杆状病毒)中用于在任何细胞中表达。上文仅仅是如何克隆流感病毒蛋白的一个例子。本领域技术人员理解，其它方法也是可用和可能的。
本发明还提供这样的构建体和/或载体，其包含编码流感病毒结构基因包括NA、M1和/或HA的禽类、大流行性和/或季候性核苷酸。所述载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。所述编码禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒结构基因包括NA、M1和/或HA的构建体和/或载体应与合适的启动子可操作地连接，这样的启动子的非限制性例子有诸如AcMNPV多角体蛋白启动子(或其它杆状病毒)，λ噬菌体PL启动子，大肠杆菌(E.coli)lac、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子，和逆转录病毒LTR的启动子。取决于希望的宿主细胞和/或表达率，本领域技术人员将知道其它合适的启动子。表达构建体将进一步含有转录起始、终止位点，以及被转录区域中用于翻译的核糖体结合位点。所述构建体所表达的转录物的编码部分优选在要翻译的多肽的起始处包含翻译起始密码子，而在该多肽末尾处的合适位置上含有终止密码子。
表达载体优选包含至少一种选择标记。这样的标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，以及用于培养大肠杆菌和其它细菌的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。优选的载体包括病毒载体，例如杆状病毒、痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒(avipox virus)、金丝雀痘病毒、禽痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒等等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、疱疹病毒和逆转录病毒。可用于本发明的其它载体包括用于细菌的载体，包括pQE70、pQE60和pQE-9，pBluescript载体，Phagescript载体，pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体包括pFastBac1 pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合适的载体是本领域技术人员显而易见的。在一个实施方案中，所述包含编码禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒结构基因(包括HA、M1和/或NA)的核苷酸的载体是pFastBac。在另一个实施方案中，所述包含由编码禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒结构基因(包括HA、M1和/或NA)的核苷酸组成的插入片段的载体是pFastBac。
接下来，可以将重组载体转染、感染或转化到合适的宿主细胞中。由此，本发明提供这样的宿主细胞：它们包含载体(或多个载体)，所述载体含有编码HA、M1和/或NA且容许HA、M1和/或NA在可形成VLP的条件下于所述宿主细胞中表达的核酸。
在一个实施方案中，上述重组构建体可以用来转染、感染或转化，并可以在真核细胞和/或原核细胞中表达HA、NA和M1流感蛋白。真核宿主细胞包括酵母、昆虫、禽类、植物、秀丽隐杆线虫(C.elegans)(或线虫)和哺乳动物宿主细胞。昆虫细胞的非限制性例子有：草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf)细胞、例如Sf9、Sf21，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞，例如High Five细胞，和果蝇S2细胞。真菌(包括酵母)宿主细胞的例子有酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis；K.lactis)、假丝酵母属(Candida)物种包括白色假丝酵母(C.albicans)和光滑假丝酵母(C.glabrata)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe；S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、和解脂耶罗酵母(Yarrowialipolytica)。哺乳动物细胞的例子有COS细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞和非洲绿猴细胞、CVl细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、Vero和Hep-2细胞。非洲爪蟾(Xenopuslaevis)卵母细胞，或两栖动物来源的其它细胞也可以使用。原核宿主细胞包括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和分枝杆菌。
可以将载体，例如包含HA、NA和/或M1多核苷酸的载体根据本领域公知的技术转染到宿主细胞中。例如，可通过磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染和利用多胺转染试剂的转染来将核酸导入真核细胞。在一个实施方案中，所述载体是重组杆状病毒。在另一个实施方案中，所述重组杆状病毒被转染到真核细胞中。在一个优选的实施方案中，所述细胞是昆虫细胞。在另一个实施方案中，所述昆虫细胞是Sf9细胞。
在另一实施方案中，所述载体和/或宿主细胞包含这样的核苷酸：所述核苷酸编码选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16的禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒HA蛋白。在另一实施方案中，所述载体和/或宿主细胞包含这样的核苷酸：所述核苷酸编码选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9的NA蛋白。在另一实施方案中，所述载体和/或宿主细胞包含流感HA、M1和/或NA。在另一实施方案中，所述载体和/或宿主细胞基本上由HA、M1和/或NA组成。在又一实施方案中，所述载体和/或宿主细胞由包括HA、M1和NA的流感蛋白组成。这些载体和/或宿主细胞包含HA、NA和M1，并可含有其它细胞组分诸如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一实施方案中，所述核苷酸编码这样的HA和/或NA：当它们表达在VLP表面上时，分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。
本发明还提供将增加VLP产生效率的构建体和方法。例如，去除蛋白质中的剪切位点以增加蛋白质表达(见上文)。其它方法包括向HA、NA和/或M1蛋白添加前导序列以增加转运效率。例如，可将异源信号序列与HA、NA和/或M1流感蛋白融合。在一个实施方案中，所述信号序列可衍生自昆虫细胞的基因，且融合于流感HA蛋白(用于在昆虫细胞中表达)。在另一个实施方案中，信号肽是几丁质酶信号序列，其可在杆状病毒表达系统中高效地工作。在其它实施方案中，在流感蛋白之间互相交换前导序列可提供更好的蛋白转运。例如，已证明H5血凝素转运到颗粒表面的效率较低。而H9血凝素靶向表面和整合到表面中的效率更高。因此，在一个实施方案中，将H9前导序列与H5蛋白融合。
另一种增加VLP产生效率的方法是针对具体的细胞类型对编码HA、NA和/或M1蛋白的核苷酸进行密码子优化。例如，为在Sf9细胞中表达而对核酸进行密码子优化(见美国专利公布2005/0118191，本文通过提述收录其全部内容用于所有目的)。下文公开了用于Sf9细胞的经过密码子优化的序列的例子(例如SEQ ID 42、44、46、48、50、52和54)。在一个实施方案中，经过密码子优化的流感蛋白的核酸序列与SEQ ID NO 42、44、46、48、50、52和54的任一序列有至少85％、90％、95％、96、97、98或99％的同一性。
本发明还提供产生VLP的方法，所述方法包括在可形成VLP的条件下表达禽类、大流行性和/或季候性流感蛋白。取决于所选的表达系统和宿主细胞，在表达重组蛋白和形成VLP的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞，来产生VLP。合适的培养条件的选择在本领域普通技术人员的技术之内。
培养经过工程化而产生本发明VLP的细胞的方法包括但不限于分批、分批补料、连续和灌流(perfusion)细胞培养技术。细胞培养意思是在生物反应器(发酵室)中使细胞生长和增殖，其中细胞在生物反应器中增殖并表达蛋白(例如重组蛋白)以供纯化分离用。典型地，细胞培养在生物反应器中无菌、温度和大气受控的条件下进行。生物反应器是用于培养细胞的腔室(chamber)，其中可以监控环境条件例如温度、大气、搅拌和/或pH。在一个实施方案中，所述生物反应器是不锈钢室。在另一个实施方案中，所述生物反应器是预灭菌的塑料袋(例如
Figure A20068004585000281
Wave Biotech，Bridgewater，NJ)。在另一实施方案中，所述预灭菌的塑料袋为大约50L到1000L的袋子。
然后用保持VLP完整性的方法来分离这些VLP，例如通过梯度离心，例如氯化铯、蔗糖和碘克沙醇(iodixanol)梯度离心，以及标准纯化技术，包括例如离子交换和凝胶过滤层析。
下面是如何制备、分离和纯化本发明VLP的一个例子。通常VLP是由重组细胞系产生的，其中这些细胞系经过工程化而在细胞培养(见上文)中生长时产生VLP。可以利用图26所示的方案实现VLP的生产。本领域技术人员将会理解，可以使用其它的方法来制备和纯化本发明的VLP，因此本发明不限于所述的方法。
本发明的VLP的生产可首先将Sf9细胞(未感染的)接种到摇瓶中，使细胞随着生长繁殖而扩增和规模放大(例如从125ml瓶到50L Wave袋)。培养细胞所用的培养基为合适的细胞系配制(优选无血清培养基，例如昆虫培养基ExCell-420，JRH)。然后，用重组杆状病毒以效率最高的感染复数(例如每个细胞约1个到约3个噬斑形成单位)感染所述细胞。一旦发生感染，流感HA、NA和M1蛋白即从病毒基因组表达，自组装成VLP，并在感染后大约24到72小时从细胞分泌出来。通常，当细胞处于生长的对数中期(4-8×106个细胞/ml)且至少约90％生存时，感染效率最高。
可以在感染后大约48到96小时，当细胞培养基中VLP水平接近最大值但尚未发生广泛的细胞裂解之前收获本发明的VLP。收获时的Sf9细胞密度和生存力可以为：大约0.5×106个细胞/ml到大约1.5×106个细胞/ml，生存力至少为20％，如染料排除测定所示。然后，移出培养基并将其澄清。可以向培养基中加入NaCl至浓度为大约0.4到大约1.0M，优选到大约0.5M，以避免VLP聚集。可利用一次性使用的预灭菌中空纤维0.5或1.00μm筒式滤器或类似的装置进行切向流过滤(TFF)，来从含有本发明VLP的细胞培养基中去除细胞和细胞碎片。
接着，可以使用一次性使用的、预灭菌的500,000分子量截留中空纤维筒式滤器通过超滤来浓缩经过澄清的培养基中的VLP。可以将经过浓缩的VLP对10倍体积的含0.5M NaCl的pH 7.0到8.0的磷酸盐缓冲盐水(PBS)渗滤来去除残余的培养基成分。
可以将经过浓缩、渗滤的VLP置于含0.5M NaCl的pH 7.2PBS缓冲液中20％-60％不连续蔗糖梯度上，于大约4℃到大约10℃6,500×g离心18小时来进一步纯化。通常，VLP将在大约30％到大约40％蔗糖之间或者在界面上(在20％和60％的分步梯度中)形成显著可见的条带，可从梯度中收集该条带并保存。可稀释该产物使其含有200mM NaCl，以准备纯化过程的下一步。该产物含有VLP，并可能含有完整的杆状病毒颗粒。
可以通过阴离子交换层析或者44％等密度蔗糖垫层(cushion)离心来进一步纯化VLP。在阴离子交换层析中，将来自蔗糖梯度(见上文)的样品加载到装有带阴离子介质(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的柱子中，并通过盐梯度(从大约0.2M到大约1.0M NaCl)洗脱，该梯度可以将VLP与其它杂质(例如杆状病毒和DNA/RNA)分开。在蔗糖垫层方法中，将含有VLP的样品添加到44％蔗糖垫层，并在30,000g离心约18小时。VLP在44％蔗糖的顶部形成条带，而杆状病毒沉淀于底部，其它杂质蛋白停留在顶部的0％蔗糖层中。收集VLP峰或VLP带。
如果希望，可以将完整的杆状病毒灭活。可以通过化学方法，例如福尔马林或β-丙内酯(BPL)灭活。还可以主要使用本领域已知的选择性沉淀和层析方法，如上文例举的，来实现完整杆状病毒的去除和/或灭活。灭活方法包括将含有VLP的样品在0.2％BPL中于大约25℃到大约27℃温育3小时。还可以将含有VLP的样品在0.05％BPL于4℃温育3天，然后在37℃温育1小时，来灭活杆状病毒。
灭活/去除步骤后，可使含有VLP的产物经过另一渗滤步骤以去除任何来自灭活步骤的试剂和/或任何残余的蔗糖，并将VLP置入期望的缓冲液(例如PBS)中。含有VLP的溶液可以通过本领域已知的方法(例如无菌过滤)灭菌，并保存在冰箱或低温冰箱中。
上述技术可以在多种规模上实施。例如，T形瓶(T-flasks)、摇瓶、转瓶、乃至工业级容量的生物反应器。生物反应器可包括不锈钢槽或预灭菌的塑料袋(例如，Wave Biotech，Bridgewater，NJ出售的系统)。本领域技术人员将知道用于其目的的最佳选择。
杆状病毒表达载体的扩增和生产，以及用重组杆状病毒感染细胞以生产重组流感VLP，可以在昆虫细胞，例如前文所述的Sf9昆虫细胞中实现。在一个优选的实施方案中，所述细胞是用产生流感VLP的工程化重组杆状病毒感染的SF9细胞。
药物或疫苗制剂和施用
本文中有用的药物组合物含有可药用载体和本发明的VLP，其中所述载体，包括任何合适的稀释剂或赋形剂，包括本身不诱导产生对接受该组合物的脊椎动物有害的免疫应答、并且可以在不引起任何异常毒性的条件下施用的任何药剂。如本文所用的，术语“可药用”意思是经过联邦或州政府监管部门批准，或者在美国药典、欧洲药典或其它公认的药典中记载用于脊椎动物，更具体地用于人类中。这些组合物可以用作疫苗和/或抗原性组合物，用于在脊椎动物中诱导保护性免疫应答。
所述本发明的药物制剂包括含流感M1、HA和/或NA蛋白的VLP和可药用的载体或赋形剂。可药用载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等渗缓冲水溶液，和它们的组合。Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.N.J.current edition)提供了可药用载体、稀释剂和其它赋形剂的全面讨论。制剂必须适合施用模式。在一个优选的实施方案中，制剂适于施用给人，优选制剂是无菌、非颗粒性(non-particulate)和/或非热原性的。
如果期望，组合物还可以含有次要量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可以是固体形式，例如适于重构的冻干粉末；液体溶液；悬液；乳液；片剂；丸剂；胶囊；持续释放制剂；或粉剂。口服制剂可包含标准的载体，例如药品级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。
本发明还提供药包(pharmaceutical pack)或试剂盒(kit)；其包含一个或多个容器，所述容器装有本发明疫苗制剂的一种或多种成分。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含两个容器，其一装有VLP，另一个装有佐剂。所述容器还可以伴有通告，该通告采取由监管药品或生物制品的生产、使用或销售的政府部门规定的形式，反映该部门对为人体施用而生产、使用或销售的许可。
本发明还提供VLP制剂包装在标示组合物数量的密封容器例如安瓿或小药囊(sachette)中。在一个实施方案中，VLP组合物作为液体提供，在另一个实施方案中，作为密封容器中的干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物提供，并且可以例如用水或盐水重构为供施用于受试者的合适浓度。优选地，VLP组合物作为密封容器中的干燥无菌冻干粉末提供，单位剂量优选为大约1μg、大约5μg、大约10μg、大约20μg、大约25μg、大约30μg、大约50μg、大约100μg、大约125μg、大约150μg或大约200μg。或者，VLP组合物的单位剂量小于约1μg(例如大约0.08μg，大约0.04μg；大约0.2μg、大约0.4μg、大约0.8μg、大约0.5μg或更少、大约0.25μg或更少，或大约0.1μg或更少)，或多于大约125μg(例如大约150μg或更多、大约250μg或更多、或大约500μg或更多)。这些剂量可以以总VLP或HA的μg数测量。VLP组合物应当在自冻干粉末重构后大约12小时内、优选约6小时内、约5小时内、约3小时内、或约1小时内施用。
在一个作为选择的实施方案中，VLP组合物作为标示VLP组合物的数量和浓度的密封容器中的液体形式提供。优选地，VLP组合物在密封容器中以至少约50μg/ml、优选至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少500μg/ml、或至少1mg/ml的浓度提供。
通常，本发明的流感VLP以足以刺激针对一种或多种流感病毒株的免疫应答的有效量或数量(如上文定义的)施用。优选地，施用本发明的VLP引发针对至少一种流感病毒的显著的免疫力。典型地，可以根据例如年龄、身体健康状况、体重、性别、饮食、施用时间和其它临床因素，在该范围内调节该剂量。预防性疫苗制剂是全身施用的，例如通过使用针头和注射器或无针头注射装置进行皮下或肌肉内注射来施用。或者，疫苗制剂是鼻内施用的，通过滴剂、大颗粒气溶胶(大于约10微米)、或喷雾到上呼吸道中。虽然上述任何投递途径均产生免疫应答，但鼻内施用还带来额外的益处，即在流感病毒进入的部位引发粘膜免疫。
由此，本发明还包括诱导受试者中针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著免疫力的疫苗或抗原性组合物的配制方法，包括对所述制剂添加有效剂量的流感VLP。
虽然优选的是以单个剂量刺激显著的免疫力，但可以通过相同或不同的途径施用额外的剂量来达到所需效果。例如，在新生儿和婴儿中，可能需要多次施用来引发足够的免疫水平。根据维持足够水平的抗流感感染保护的需要，可以在整个儿童期以一定间隔继续进行施用。类似地，特别容易受到反复或严重的流感感染的成年人，例如卫生保健工作者、日间护理工作者、幼儿的家人、老年人、以及心肺功能受损的个体等，可能需要进行多次免疫来建立和/或维持保护性免疫应答。可以通过例如测量中和性分泌和血清抗体的量来监测诱导产生的免疫力的水平，并根据引发和维持期望的保护水平的需要来调整剂量或重复接种。
因此，在一个实施方案中，诱发受试者中针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP包含流感HA、NA和M1蛋白。在另一个实施方案中，诱发受试者中针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP基本上由流感HA、NA和M1组成。所述VLP可包含可忽略浓度的其它流感蛋白和/或蛋白杂质。在另一个实施方案中，诱发受试者中针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和M1组成。在另一个实施方案中，所述流感HA、NA和M1衍生自季候性流感和/或禽流感病毒。在另一个实施方案中，诱发受试者中针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的包含流感蛋白的流感VLP，其中所述流感蛋白由HA、NA和M1蛋白组成。这些VLP包含HA、NA和M1，并可含有其它细胞组分诸如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一个实施方案中，所述HA和/或NA分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在另一个实施方案中，所述方法包括通过以一个剂量施用所述制剂而诱发针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力。在另一个实施方案中，所述方法包括通过以多个剂量施用所述制剂而诱发针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力。
包含VLP的组合物(疫苗和/或抗原性制剂)的施用方法包括，但不限于，非消化道施用(例如皮内、肌肉内、静脉内和皮下)、硬膜外、和粘膜(例如鼻内和口腔或肺途径或通过栓剂)。在一个具体实施方案中，本发明的组合物通过肌肉内、静脉内、皮下、透皮或皮内施用。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、结肠、结膜、鼻咽、口咽、阴道、尿道、膀胱和肠粘膜等)的吸收，并且可以与其它生物学活性剂一起施用。在一些实施方案中，本发明含VLP组合物的鼻内或其它粘膜施用途径所诱发的抗体或其它免疫应答可显著高于其它施用途径。在另一个实施方案中，本发明含VLP组合物的鼻内或其它粘膜施用途径可诱发这样的抗体或其它免疫应答，所述应答将诱发针对其它流感病毒株的交叉保护。施用可以是全身性的或者是局部的。
在又一个实施方案中，所述疫苗和/或抗原性制剂以这样的方式施用，使得其靶向粘膜组织，以在免疫部位引发免疫应答。例如，可以通过口服含有具备特定粘膜靶向性质的佐剂的组合物，来靶向粘膜组织例如肠相关淋巴样组织(GALT)进行免疫。还可以靶向其它粘膜组织，例如鼻咽淋巴样组织(NALT)和支气管相关淋巴样组织(BALT)。
本发明的疫苗和/或抗原性制剂还可以按照剂量日程表(dosage schedule)来施用，例如用疫苗组合物进行一次初次施用，随后进行多次加强施用。在具体的实施方案中，第二个剂量的组合物在初次施用后大约两周到一年，优选约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月到约6个月施用。进一步，可以在第二个剂量之后，且在初次施用后大约3个月到大约两年甚至更长时间，优选约4个月、约5个月、或者约6个月、或者约7个月到约1年施用第三个剂量。当施用第二个剂量后在受试者的血清和/或尿或者粘膜分泌物中没有检测到或者检测到低水平的特异性免疫球蛋白时，可任选地施用第三个剂量。在一个优选的实施方案中，第二个剂量在第一次施用后大约1个月施用，而第三个剂量在第一次施用后大约6个月施用。在另一个实施方案中，第二个剂量在第一次施用后大约6个月施用。
在另一个实施方案中，所述本发明的VLP可用作为联合疗法的一部分施用。例如，本发明的VLP可以与其它免疫原性组合物和/或抗病毒剂(例如金刚烷胺(Amantadine)、金刚乙胺(Rimantadine)、扎那米韦(Zanamivir)和奥塞米韦(Osteltamivir))共同配制。
本领域技术人员可以容易地确定药物制剂的剂量，例如通过首先鉴定可有效引发预防性或治疗性免疫应答的剂量，例如通过测量病毒特异性免疫球蛋白的血清效价或通过测量血清样品或尿样品或粘膜分泌物中抗体的抑制比。所述剂量可以由动物研究确定。用于研究流感病毒的动物的非限制性清单包括豚鼠、叙利亚地鼠(Syrian hamster)、栗鼠(chinchilla)、刺猬、鸡、大鼠、小鼠和雪貂(ferret)。大多数动物不是流感病毒的天然宿主，但仍可用于该疾病的各个方面的研究。例如，可以对任何上述动物定量给予疫苗候选物，例如本发明的VLP，以部分地表征诱发的免疫应答，和/或确定是否生成了任何中和性抗体。例如，已经在小鼠模型中进行了许多研究，因为小鼠体型小，而且它们的成本低使得研究者可以进行大规模研究。但是，小鼠的小体型也增加了迅捷观察任何疾病临床体征的难度，而且小鼠不是人类中疾病的预测性模型。
雪貂已经广泛地用于人流感病毒感染及其作用过程的各个方面的研究。如果没有雪貂的应用，对流感病毒免疫的许多现代概念的发展是不可能的(Maher et al.2004)。已经证明雪貂是研究流感的良好模型，原因有如下数方面：就临床体征、发病机制和免疫力而言，雪貂中的流感感染非常近似于人中的流感感染；人类甲型和乙型流感病毒天然地感染雪貂，从而使人们有机会对完全受控的群体进行研究以观察感染传播、疾病和流感病毒糖蛋白中氨基酸序列变异之间的相互影响；而且雪貂还具有其它使其成为解析该疾病表现的理想模型的体质特征。例如，雪貂和人显示非常近似的流感感染临床体征，这些体征看起来依赖于宿主年龄、病毒株、环境条件、继发细菌感染的程度和其它许多变量。因此，相比于小鼠或者上述其它任何模型，本领域技术人员可以更容易地将来自雪貂模型的流感疫苗的效力与剂量方案与人相关联。
此外，本领域技术人员可以进行人体临床研究来确定用于人的优选有效剂量。这样的临床研究是常规的，且为本领域公知。要使用的确切剂量还将依赖于施用途径。可以从衍生自体外或动物试验系统的剂量-应答曲线外推得到有效剂量。
本领域还公知，可以使用免疫应答的非特异性刺激物来增强具体组合物的免疫原性，这样的刺激物称为佐剂。实验上已经使用佐剂来促进针对未知抗原的免疫力的普遍增加(见美国专利No.4,877,611)。免疫规程使用佐剂来刺激应答已有多年，因此，本领域普通技术人员对佐剂是熟知的。有些佐剂影响抗原呈递的方式。例如，当蛋白抗原被明矾沉淀时，免疫应答增加。抗原的乳化也可延长抗原呈递的持续时间。本发明的范围意图涵盖Vogel等人“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients(2ndEdition)，”(本文通过提述收录该文献全部内容用于所有目的)中所述任何佐剂的引入。
示例性的佐剂包括完全弗氏佐剂(一种非特异性免疫应答刺激物，含有已杀死的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。其它佐剂包括GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物诸如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A(MPL)。还设想使用RIBI，其在2％角鲨烯/Tween 80乳液中含有从细菌提取的3种成分：MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。还可以使用MF-59、
Figure A20068004585000351
MHC抗原。
在本发明的一个实施方案中，所述佐剂是少片层(paucilamellar)脂质小泡，其具有大约2到10个双层，它们排列成多个基本呈球形的壳，由水性层隔开，围绕着不含脂质双层的无定形中心大空腔。少片层脂质小泡可以通过数种方式起作用来刺激免疫应答：作为非特异性刺激物、作为抗原载体、作为其它佐剂的载体，以及这些方式的组合。例如，当通过混合抗原与预先形成的小泡，使得抗原相对于小泡保持在胞外(extracellular)的方法制备疫苗时，少片层脂质小泡起非特异性免疫刺激物的作用。通过将抗原包被在小泡的中心空腔中，小泡起到免疫刺激物和抗原载体两方面的作用。在另一个实施方案中，小泡主要由非磷脂小泡构成。在另一个实施方案中，小泡是Novasomes。
Figure A20068004585000361
是大约100nm到大约500nm范围的少片层非磷脂小泡。它们包含Brij 72、胆固醇、油酸和角鲨烯。Novasomes已被证明是流感抗原的有效佐剂(参见美国专利5,629,021、6,387,373和4,911,928，本文通过提述收录它们的全部内容用于所有目的)。
在一个方面，使用药剂来达到佐剂的效果，例如使用明矾，其以磷酸盐缓冲盐水中大约0.05到大约0.1％的溶液使用。或者，VLP可以制成与合成糖聚合物(
Figure A20068004585000362
)的混合物，所述聚合物以大约0.25％的溶液使用。有些佐剂，例如某些从细菌获得的有机分子，作用于宿主而非抗原。一个例子是胞壁酰二肽(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺[MDP])，一种细菌肽聚糖。在其它实施方案中，血蓝蛋白和血红蛋白(hemoerythrin)也可与本发明的VLP一起使用。在某些实施方案中优选使用来自钥孔
Figure A20068004585000363
的血蓝蛋白(KLH)，但可以使用其它软体动物和节肢动物血蓝蛋白和血红蛋白。
还可以使用各种多糖佐剂。例如，各种肺炎球菌多糖佐剂对小鼠抗体应答的效用已经有描述(Yin et al.，1989)。产生最佳应答的剂量或者在其它方面不产生抑制的剂量应当如指示地使用(Yin et al.，1989)。多糖的多胺变化形式是特别优选的，例如几丁质和壳聚糖，包括脱乙酰几丁质。在另一个实施方案中，胞壁酰二肽的亲脂性双糖-三肽衍生物描述用于由磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油形成的人工脂质体中。
两亲性物质和表面活性物质，例如皂苷和衍生物例如QS21(CambridgeBiotech)构成用于本发明的VLP的另一类佐剂。非离子型嵌段共聚物表面活性剂(Rabinovich et al.，1994)也可以使用。寡核苷酸是另一类有用的佐剂(Yamamoto et al.，1988)。Quil A和香菇多糖(lentinen)是其它可用于本发明某些实施方案中的佐剂。
另一类佐剂是脱毒的内毒素，例如美国专利No.4,866,034的精制脱毒内毒素。这些精制脱毒内毒素可在脊椎动物中有效产生佐剂应答。当然，脱毒内毒素可以与其它佐剂组合使用以制备多佐剂制剂。例如，特别考虑脱毒内毒素与海藻糖二霉菌酸酯的组合，如美国专利No.4,435,386所述的。还考虑脱毒内毒素与海藻糖二霉菌酸酯和内毒素糖脂的组合(美国专利No.4,505,899)，以及脱毒内毒素与细胞壁骨架(CWS)的组合或者与CWS和海藻糖二霉菌酸酯的组合，如美国专利No.4,436,727、4,436,728和4,505,900所述的。我们预想，仅有CWS和海藻糖二霉菌酸酯而无脱毒内毒素的组合也是有用的，如美国专利No.4,520,019中所述的。
本领域技术人员将会知道能够与根据本发明的疫苗偶联的不同种类的佐剂，这些包括烷基溶血磷脂(ALP)；BCG；和生物素(包括生物素化的衍生物)，以及其它。本文特别考虑使用的某些佐剂有来自革兰氏细胞(Gram-cells)的磷壁酸。这些包括脂磷壁酸(lipoteichoic acids，LTA)、核糖醇磷壁酸(ribitolteichoic acids，RTA)和甘油磷壁酸(glycerol teichoic acid，GTA)。它们的合成对应物的活性形式也可以用于本发明(Takada et al.，1995)。
例如，如果希望激发抗体或随后获得活化T细胞，多种佐剂，即使是那些通常不用于人的佐剂，仍可用于其它脊椎动物。佐剂或细胞可能造成的毒性或其它不良作用，例如使用未受照射的肿瘤细胞时可能发生的毒性或其它不良作用，在此情况下是不相干的。
另一种诱发免疫应答的方法可以通过将本发明的VLP与“免疫刺激物”一起配制来实现。这些“免疫刺激物”是身体自有的增加免疫系统应答的化学信使(细胞因子)。免疫刺激物包括但不限于具有免疫刺激性、免疫强化和促炎症活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，例如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)集落刺激因子(CSF))；和其它免疫刺激性分子，例如巨噬细胞炎性因子，Flt3配体、B7.1、B7.2等等。免疫刺激性分子可以与流感VLP在相同的制剂中施用，或者可以另行施用。可以施用蛋白质或者编码该蛋白质的表达载体来产生免疫刺激效应。
刺激抗流感免疫应答的方法
本发明的VLP可用于制备刺激免疫应答的组合物，所述免疫应答赋予针对流感病毒的免疫力或显著的免疫力。粘膜免疫和细胞免疫均可贡献于抗流感感染和疾病的免疫力。在上呼吸道中局部分泌的抗体是针对自然感染的抗性中的主要因素。分泌型免疫球蛋白A(sIgA)参与上呼吸道的保护，血清IgG参与下呼吸道的保护。感染所诱发的免疫应答抵御同一病毒或抗原性类似的病毒株的再次感染。流感病毒频繁发生不可预测的变化，因此，自然感染后，宿主免疫提供的针对人群中流行的新病毒株的有效保护期可能仅有数年。
本发明的VLP当施用于脊椎动物(例如人)时可以在所述脊椎动物中诱发显著的免疫力。显著的免疫力由针对本发明的流感VLP的免疫应答导致，在所述脊椎动物中保护或改善流感病毒感染或者至少减轻流感病毒感染的症状。在一些情况下，如果所述脊椎动物被感染，所述感染将是无症状的。所述应答可能不是完全保护性的应答。在此情况下，如果所述脊椎动物感染了流感病毒，该脊椎动物与未经免疫的脊椎动物相比将经历减轻的症状或者较短的症状持续时间。
在一个实施方案中，本发明包括诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法，包括施用至少一个有效剂量的流感VLP。在另一个实施方案中，所述显著的免疫力的诱导减少流感症状的持续时间。在另一个实施方案中，诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP包含流感HA、NA和M1蛋白。在另一个实施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和M1蛋白构成。这些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它细胞组分诸如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一个实施方案中，诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP基本上由HA、NA和M1组成。所述VLP可包含可忽略浓度的其它流感蛋白和/或蛋白杂质。在另一个实施方案中，诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和M1组成。在另一个实施方案中，所述HA和/或NA分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在又一个实施方案中，所述VLP与佐剂或免疫刺激物一起配制。
最近，人们共同致力于构建针对具有产生大流行潜力的禽流感病毒的疫苗。这是因为多种禽流感病毒已经跨越了物种屏障而直接感染了人类，使人患病，而且在一些情况下导致死亡。这些病毒是H5N1、H9N2和H7N7(Cox et al.，2004)。最近一项研究考察了使用灭活H5N1流感病毒作为疫苗的潜力。该疫苗的配方与现有已许可上市的许可灭活疫苗相似。该研究的结论是使用灭活的H5N1病毒的确在人类中诱导了免疫应答，但所给的剂量很高(90μg禽流感，相比于15μg的许可疫苗)(Treanor et al.，2006)。大量的禽流感抗原对于世界范围的接种计划而言是不切实际的。如下文说明的，本发明的VLP当施用于脊椎动物时在所述脊椎动物中诱发免疫应答。
因此，本发明涵盖诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法，包括施用至少一个有效剂量的禽流感VLP。在另一个实施方案中，所述显著的免疫力的诱发减少流感症状的持续时间。在另一个实施方案中，所述免疫力的诱发是来自施用含至少0.2μg禽类HA的本发明VLP。在另一个实施方案中，所述免疫力的诱发是来自施用含至少0.2μg禽类HA到至少15μg禽类HA的本发明VLP。施用可以分为一个或更多个剂量进行，但有利的是以一个剂量进行。在另一个实施方案中，所述VLP禽类HA衍生自禽流感H5N1。
在另一个实施方案中，本发明包括诱发受试者体内针对禽流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法，包括施用至少一个有效剂量的禽流感VLP，其中所述VLP包含禽流感HA、NA和M1。在另一个实施方案中，所述禽流感VLP包含禽流感蛋白，其中所述禽流感蛋白由HA、NA和M1蛋白组成。这些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它细胞组分诸如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一个实施方案中，所述诱发受试者体内针对禽流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的禽流感VLP，其中所述VLP基本上由禽流感HA、NA和M1组成。所述VLP可包含可忽略浓度的其它流感蛋白和/或蛋白杂质。在另一个实施方案中，所述诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP由禽流感HA、NA和M1蛋白组成。在另一个实施方案中，所述禽流感HA和NA分别是H5N1。在另一个实施方案中，所述禽流感HA和NA分别是H9N2。在另一个实施方案中，所述禽流感HA和NA分别是H7N7。在另一个实施方案中，所述禽流感HA和/或NA分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在又一个实施方案中，所述VLP与佐剂或免疫刺激物一起配制。
在另一个实施方案中，所述禽流感VLP在脊椎动物中诱发的免疫应答，与配制方式类似于现有许可上市的许可灭活疫苗的相似禽流感抗原相比，效力增加到大约2倍，大约4倍，大约8倍，大约16倍，大约32倍，大约64倍，大约128倍(或更高)。现有制剂包括全灭活病毒(例如甲醛处理的)疫苗、裂解(split)病毒(化学性破坏的)疫苗、和亚单位(纯化糖蛋白)疫苗。确定疫苗效力的方法在本领域是已知和常规的。例如，可进行微中和测定和凝血抑制测定来确定禽类VLP疫苗相对于配制方式类似于现有许可上市的许可灭活疫苗的禽流感抗原的效力。在一个实施方案中，当对脊椎动物施用大约0.2μg、大约0.4μg、大约0.6μg、大约0.8μg、大约1μg、大约2μg、大约3μg、大约4μg、大约5μg、大约6μg、大约7μg、大约9μg、大约10μg、大约15μg、大约20μg、大约25μg、大约30μg、大约35μg、40μg、大约45μg、大约50μg或更多的VLP和配制方式类似于现有许可上市灭活疫苗的抗原(即：VLP中相当量的HA和/或NA，和以配制方式类似于许可灭活疫苗和/或任何其它抗原的相当量的HA和/或NA)时，实现上述效力增加。可以根据HA含量来测量。例如，1μg的本发明VLP为含HA的VLP溶液中的1μg HA或者可以VLP重量测量。
人们每年接受季候性流感疫苗以减少每年流感病例的发生。目前，在美国有两种亚型的甲型流感和乙型流感流行。因此，现有疫苗是三价的，以提供针对流行中病毒株的保护。每年不同的流感病毒株或流感病毒变体改变。因此，大多数年份中制造并施用新疫苗组合物。灭活疫苗是通过在含胚鸡蛋中扩增病毒来生产的。采集尿囊液，浓缩并纯化病毒后加以灭活。因此，现有的许可流感病毒疫苗可能含有痕量的残余卵蛋白，因此不应给予对蛋有过敏性超敏反应的人。此外，蛋的供应必须是有组织的，而且用于生产疫苗的病毒株必须在下一个流感季候前数个月选定，这样就限制了该方法的灵活性，经常导致生产和分配的迟延和短缺。而且，一些流感病毒株在含胚鸡蛋中复制不好，这可能对能够生长并配制成疫苗的流感病毒株构成限制。
如上所述，本发明VLP的生产不需要蛋。这些VLP是藉由细胞培养系统制备的。因此，本发明涵盖诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法，包括施用至少一个有效剂量的季候性流感VLP。如上文讨论的，季候性流感病毒是指就某一流感季候而言，已根据全球各国家流感中心进行的流行病学调查确定为正在人群内传播的流感病毒株。所述研究结果以及某些分离的流感病毒被送到世界卫生组织(WHO)的四个参考实验室之一以进行详细研究，其中一个实验室设置在亚特兰大的疾病控制和预防中心(CDC)。这些实验室测试针对现有疫苗制备的抗体与流行中的病毒和新流感病毒反应的良好程度。将该信息和有关流感活动情况的信息汇总并提交到美国食品和药品管理局(FDA)的一个顾问委员会以及WHO的会议上。这些会议的结果是选择三种病毒(甲型流感病毒的两个亚型和乙型流感病毒的一个亚型)进入用于下个秋季和冬季的流感疫苗。该选择在北半球于2月份进行，在南半球于9月份进行。通常，每年改变疫苗中三种病毒株中的一种或两种。在另一个实施方案中，所述显著的免疫力的诱导减少流感症状的持续时间。
在另一个实施方案中，本发明包含诱发受试者体内针对季候性流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法，包括施用至少一个有效剂量的季候性流感VLP，其中所述VLP包含季候性流感HA、NA和M1蛋白。在另一个实施方案中，所述季候性流感VLP包含季候性流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和M1蛋白构成。这些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它细胞组分诸如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一个实施方案中，所述诱发受试者体内针对季候性流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的季候性流感VLP，其中所述VLP基本上由季候性流感HA、NA和M1组成。所述VLP可包含可忽略浓度的其它流感蛋白和/或蛋白杂质。在另一个实施方案中，诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP由季候性流感HA、NA和M1组成。在另一个实施方案中，所述禽流感HA和/或NA分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在又一个实施方案中，所述VLP与佐剂或免疫刺激物一起配制。
通常，本发明的季候性流感VLP的施用数量足以刺激针对一种或多种季候性流感病毒株的显著的免疫力。在一个实施方案中，将所述VLP与包含不同流感亚型蛋白(如上面列出的)的其它VLP一起掺混。在另一个实施方案中，制剂是三价制剂，包含具有来自至少两种甲型流感亚型和/或至少一种乙型流感亚型的季候性流感HA和/或NA蛋白的VLP的混合物。在另一个实施方案中，所述乙型亚型是通过与上面所述相同的方法制备的。在另一个实施方案中，多价组合物包含一种或多种如上所述的本发明VLP。
在另一个实施方案中，本发明的VLP(禽类或季候性VLP)可引发这样的免疫应答，所述免疫应答将提供针对多于一种流感病毒株的保护。由具体亚类的、具体病毒株构建的流感VLP对脊椎动物的交叉保护可诱发针对不同毒株和/或亚类的流感病毒的交叉保护。下文的实施例显示，本发明的VLP能够诱发与不同病毒株和/或亚类的交叉反应性。
体液免疫系统产生针对不同流感抗原的抗体，其中HA特异性抗体对于中和病毒及由此防止疾病是最重要的。NA特异性抗体预防感染的有效性较低，但它们减少被感染细胞释放病毒。粘膜组织是许多病原体包括流感的主要侵入门户，而粘膜免疫系统提供了除天然免疫之外针对感染的第一道防线。SIgA，从某种程度上说还有IgM，是针对粘膜病原体的主要中和性抗体，防止病原体进入，并且可以在细胞内作用以抑制病毒复制。鼻分泌物含有中和性抗体，特别是针对流感HA和NA的中和性抗体，其主要为IgA同种型且为局部产生。在原发感染过程中，可以通过酶联免疫吸附测定在鼻冲洗液中检出对HA特异性的所有三个主要的Ig类型(IgG、IgA和IgM)，虽然IgA和IgM比IgG更常被检出。IgA，从某种程度上说还有IgM，均在局部活跃地分泌，而IgG是作为血清分泌物衍生的。在具有局部IgA应答的受试者中，也观察到血清IgA应答。由自然感染刺激的局部IgA应答持续至少3-5个月，并且可以在局部检出流感特异性IgA定向的记忆细胞。IgA也是继发感染后局部分泌物中的主要Ig同种型，并且在后续感染时在血清中检测到IgA应答。活病毒疫苗诱发的局部产生的中和性抗体的存在与野生型病毒攻击后的感染抵抗力和病情相关联。
针对流感感染的抵抗力或病情与针对HA和NA抗体的局部和/或血清水平相关。血清抗HA抗体是最经常被测量的抗流感保护相关指标(Cox et al.，1999)。自然流感感染后在大约80％的受试者中可检测到保护性血清抗体(凝血抑制(HI)效价≥40)应答。在正常受试者(Cox et al.，1994)和正经历流感感染的个体中存在产生所有三种主要Ig类型的B细胞。在人类中，血清抗体在流感感染的抵抗力和恢复中起作用。人类中针对HA和NA的血清抗体水平可以与实验感染和自然感染后的病情抵抗力相关联。在原发感染过程中，在10-14天内可检测到三种主要Ig类型。IgA和IgM水平在2周后达到峰值然后开始降低，而IgG水平在4-6周达到峰值。虽然初次应答中IgG和IgM是主要的，在二次免疫应答中IgG和IgA占主要地位。
由此，本发明包含诱发受试者中针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的保护性抗体应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的流感VLP。在另一个实施方案中，所述显著的保护性抗体应答的诱发减少流感症状的持续时间。在另一个实施方案中，诱发受试者中针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的保护性抗体应答的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP包含流感HA、NA和M1蛋白。
在另一个实施方案中，本发明包括诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的保护性抗体应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP基本上由流感HA、NA和M1组成。所述VLP可包含可忽略浓度的其它流感蛋白和/或蛋白杂质。在另一个实施方案中，所述VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和M1组成。这些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它细胞组分诸如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一个实施方案中，诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和M1组成。在另一个实施方案中，其中所述流感HA、NA和M1衍生自季候性流感和/或禽流感。在另一个实施方案中，所述HA和/或NA分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在又一个实施方案中，所述VLP与佐剂或免疫刺激物一起配制。
如本文所用的，术语“抗体”是包含一个或多个基本上或者部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因和无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们进而分别定义免疫球蛋白的类型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗体)结构单位由四聚体构成。每个四聚体由同样的两对多肽链组成，每对具有一条“轻”(大约25kD)链和一条“重”(大约50-70kD)链。每条链的N末端定义一个大约100-110个或更多氨基酸的可变区，它主要负责抗原识别。抗体作为完整的免疫球蛋白存在，或者作为若干通过各种肽酶消化而产生的、已充分表征的片段存在。
细胞介导的免疫也在流感感染的恢复中起作用，还可以防止流感相关的并发症。已经在被感染受试者的血液和下呼吸道分泌物中检出了流感特异性细胞淋巴细胞。流感感染细胞的细胞溶解是由CTL与流感特异性抗体和补体共同介导的。在被感染或接种疫苗的个体中，初次细胞毒性应答可于6-14天后在血液中检测到，并在第21天以前消失(Ennis et al.，1981)。流感特异性CTL在体外培养中展现交叉反应特异性，从而，它们溶解感染了相同类型流感而非其它类型(例如甲型流感而非乙型流感病毒)的细胞。识别内部非糖基化蛋白，M、NP和PB2的CTL已得到分离(Fleischer et al.，1985)。CTL应答在甲型流感病毒株之间有交叉反应性(Gerhard et al.，2001)，并且在与抗体共同使病毒扩散最小化中是重要的(Nguyen et al.，2001)。
细胞介导的免疫也在流感感染的恢复中起作用，还可以防止流感相关的并发症。已经在被感染受试者的血液和下呼吸道分泌物中检出了流感特异性细胞淋巴细胞。流感感染细胞的细胞溶解是由CTL与流感特异性抗体和补体共同介导的。在被感染或接种疫苗的个体中，初次细胞毒性应答可于6-14天后在血液中检测到，并在第21天以前消失(Ennis et al.，1981)。流感特异性CTL在体外培养中展现交叉反应特异性，从而，它们溶解感染了相同类型流感而非其它类型(例如甲型流感而非乙型流感病毒)的细胞。识别内部非糖基化蛋白，M、NP和PB2的CTL已得到分离(Fleischer et al.，1985)。CTL应答在甲型流感病毒株之间有交叉反应性(Gerhard et al.，2001)，并且在与抗体共同使病毒扩散最小化中是重要的(Nguyen et al.，2001)。
由此，本发明包括诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的保护性细胞免疫应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的流感VLP。在另一个实施方案中，诱发受试者体内针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的流感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和M1组成。在另一个实施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和M1蛋白组成。这些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它细胞组分诸如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一个实施方案中，其中所述流感HA、NA和M1衍生自季候性流感和/或禽流感病毒。在另一个实施方案中，所述HA和/或NA分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在又一个实施方案中，所述VLP与佐剂或免疫刺激物一起配制。
如上所述，本发明的VLP(例如禽流感和/或季候性流感VLP)预防或减轻受试者中流感感染的至少一种症状。流感的症状是本领域公知的。它们包括发热、肌痛、头痛、严重不适、干咳、咽喉痛、体重减轻和鼻炎。因此，本发明的方法包括预防或减轻与流感病毒感染相关的至少一种症状。症状的减轻可以主观地或者客观地确定，例如受试者自我评估、由内科医生评估、或通过实施合适的测定或测量(例如体温)，包括例如生活质量评价、流感感染或其它症状的进展减慢、流感症状的严重程度降低或者合适的测定(例如抗体效价(titer)和/或T细胞激活测定)。客观评价包括动物和人的评价。
免疫实施咨询委员会(Advisory Committee on Immunization Practices，ACIP)所提倡的主要流感控制策略是对具有流感严重并发症风险的人，特别是≥65岁的人进行疫苗接种。但是，每年的流感流行仍未减轻，并给我们的社会带来了重大的健康和财政负担(Glaser et al.，1996)。在过去的20年中(1976-1999)，流感相关全因超额死亡数(influenza-associated all cause excessdeaths)发生了显著的增加。从1990年到1999年，每年流感相关全因死亡数超过50,000(Thompson et al.，2003)。虽然过去10年内≥65岁的人的疫苗覆盖率增加到了65％，但流感相关全因超额死亡数未出现相应的减少。
因此，流感预防和控制的另一策略是对健康儿童和个体进行普遍接种。儿童的流感感染率、流感所致的就医疾病率和入院率均较高(Neuzil et al.，2000)。儿童在学校、家庭和社区内的流感传播中扮演着重要的角色。用现有流感疫苗对某个社区中大约80％的学童进行接种减少了成人中的呼吸系统疾病和老年人中的超额死亡(Reichert et al.，2001)。这种理念被称为社区免疫力或者“群体免疫力”(herd immunity)，并被认为对于保护社区免于疾病具有重要意义。由于被接种的人具有能中和流感病毒的抗体，他们将流感病毒传播给其他人的可能性大大降低。从而，即使没有经过接种的人(以及接种已经减弱或者疫苗不完全有效的人)往往可以受到群体免疫力的防护，因为他们周围经过接种的人不得病。群体免疫力随着经过接种的人的百分比增加而更为有效。人们认为，为了实现群体免疫力，社区中大约95％的人必须得到疫苗的保护。未经免疫的人可增加他们和别人患病的机会。
因此，本发明包括通过对社区中的人群施用本发明的VLP，对人群或社区诱发针对流感病毒感染的显著的保护性免疫，以在免疫受损的个体或未接种个体中减少流感病毒感染发生率的方法。在一个实施方案中，通过施用本发明的VLP对大多数学龄儿童进行抗流感病毒免疫。在另一个实施方案中，通过施用本发明的VLP对社区中大多数健康个体进行抗流感病毒免疫。在另一个实施方案中，本发明的VLP是“动态接种”策略的一个部分。动态接种是指坚定地生产低效力的疫苗，该疫苗与新发的大流行性病毒株相关，但由于抗原性漂移而可能不会在哺乳动物中提供完全的保护(见Germann et al.，2006)。由于将来大流行性病毒株的身份的不确定性，储备匹配良好的大流行性病毒株几乎是不可能的。但是，用匹配性不高但可能有效的疫苗进行接种可能延缓大流行性病毒的扩散和/或减少流感病毒大流行株症状的严重程度。
本发明还涵盖一种包含流感VLP的疫苗，其中所述疫苗当施用于受试者时诱发针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力。在另一个实施方案中，所述显著的免疫力的诱发减少流感症状的持续时间。在另一个实施方案中，所述疫苗在受试者中诱发针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力，包括含有流感HA、NA和M1蛋白的VLP。在另一个实施方案中，一种所述疫苗在受试者中诱发针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力，包含基本上由流感HA、NA和M1蛋白组成的VLP。所述VLP可含有可忽略浓度的其它流感蛋白和/或蛋白杂质。在另一个实施方案中，一种所述疫苗在受试者中诱发针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力，包含由流感HA、NA和M1蛋白组成的VLP。在另一个实施方案中，一种所述疫苗在受试者中诱发针对流感病毒感染或其至少一种症状的显著的免疫力，包含含有流感蛋白的VLP，其中所述流感蛋白由HA、NA和M1蛋白组成。这些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它细胞组分诸如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一个实施方案中，所述流感HA、NA和M1蛋白衍生自禽流感和/或季候性流感病毒。在另一个实施方案中，所述HA和/或NA分别展现血凝素活性和/或神经氨酸酶活性。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在又一个实施方案中，所述VLP与佐剂或免疫刺激物一起配制。在另一个实施方案中，所述疫苗施用于哺乳动物。在又一个实施方案中，所述哺乳动物是人。
通过下面的实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为限制性的。本文通过提述收录本申请中引用的所有参考文献、专利和已公开的专利申请，以及附图和序列表。
实施例
实施例1
材料和方法
使用杆状病毒杆粒载体表达系统在草地夜蛾细胞(Sf-9S细胞系；ATCCPTA-4047)中表达禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1基因。HA、NA和M1基因是利用从禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒分离的RNA通过逆转录和聚合酶链式反应(PCR)合成的(图1、2和3)。逆转录和PCR使用对禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1基因特异性的寡核苷酸引物(表1)。首先将这些基因的cDNA拷贝克隆到细菌亚克隆载体pCR2.1TOPO中。从所得的三种基于pCR2.1TOPO的质粒将HA、NA和M1基因插入杆状病毒转移载体pFastBac1(InVitrogen)中AcMNPV多角体蛋白启动子的下游，得到三种基于pFastBac1的质粒：pHA、pNA和pM1，它们分别表达这些流感病毒基因。然后，构建了编码HA和M1基因二者的、基于pFastBac1的单一质粒pHAM，这两个基因分别位于不同的多角体蛋白启动子的下游(图4)。测定了pNA质粒中NA基因和邻近的5’-和3’-区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)(图1)。同时，也使用pHAM质粒测定了HA和M1基因及邻近区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：2和3)(图2和3)。
最后，将来自pHAM质粒的一个编码HA和M1表达盒的限制性DNA片段克隆到pNA质粒中。由此得到编码禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1基因的质粒pNAHAM(图4)。
使用质粒pNAHAM构建重组杆状病毒，该病毒含有整合到基因组中的流感病毒NA、HA和M1基因，这些基因分别在不同的杆状病毒多角体蛋白启动子的下游。用所得的重组杆状病毒感染允许性Sf-9S昆虫细胞，结果这三种流感基因在每个感染了这些重组杆状病毒的Sf-9S细胞中共表达。
感染后(p.i.)经过72小时，使用HA特异性和M1特异性抗体通过SDS-PAGE分析、考马斯蓝蛋白染色和Western免疫印迹分析对Sf-9S细胞中的表达产物进行表征(图5)。使用针对流感病毒甲型/香港/1073/99(H9N2)激发产生的兔抗体(CDC，Atlanta，Ga.，USA)或者针对流感M1蛋白的小鼠单克隆抗体(Serotec，UK)进行Western免疫印迹分析。Western免疫印迹分析检测到了具有期望分子量的HA、NA和M1蛋白(分别为64kd、60kd和31kd)。相比于该测定中检测到的HA蛋白的量，NA蛋白与针对流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒的兔血清显示较低的反应性。对于可检测的NA蛋白的量的解释包括：与HA蛋白相比，感染了重组杆状病毒的Sf-9S细胞的NA蛋白表达水平较低；在Western免疫印迹测定中的致变性条件下NA与该血清的反应性较低(由于膜结合的凝胶电泳过程中重要的NA表位丧失)；与HA-抗体相比NA-抗体亲合力较低；或者血清中NA-抗体丰度较低。
对于来自感染了表达甲型/香港/1073/99(H9N2)HA、NA和M1蛋白的重组杆状病毒的Sf-9S细胞的培养基也进行了流感病毒的探测。对经过澄清的培养上清液进行27,000rpm的超离心，以浓缩流感病毒的高分子(量)蛋白复合物，例如亚病毒颗粒、VLP、VLP复合物以及可能存在的由流感HA、NA和M1蛋白构成的其它自组装颗粒物。将离心沉淀的蛋白产物重悬在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.2)中，然后在不连续的20-60％蔗糖分步梯度上进行超离心来进一步纯化。从蔗糖梯度收集级分并利用SDS-PAGE分析、Western免疫印迹分析和电子显微术进行分析。
通过考马斯蓝染色和Western免疫印迹分析在多个蔗糖密度梯度级分中检测到了具有期望分子量的流感HA和M1蛋白(图6，表1)。这提示来自被感染的Sf-9S细胞的流感病毒蛋白在大分子量复合物(如壳粒结构、亚病毒颗粒、VLP和/或VLP复合物)中是聚集的。考马斯蓝染色和Western免疫印迹分析对NA蛋白的检出不稳定，这可能是由于兔抗流感血清在Western免疫印迹分析中不能识别变性的NA蛋白所致，但在神经氨酸酶活性测定中稳定地检出了NA蛋白(图10)。
表1
*来自20-60％蔗糖梯度的级分
**阴性对照
***阳性对照
Figure A20068004585000492
Figure A20068004585000501
通过凝胶过滤层析确认了高分子量VLP的存在。将来自含有流感病毒蛋白的蔗糖密度梯度级分的等份试样加载到Sepharose CL-4B柱上，根据质量加以分级。用表观分子量分别为2,000,000、20,000和1,357道尔顿的蓝色右旋糖苷2000(dextran blue 2000)、黄色右旋糖苷(dextran yellow)和维生素B12(Amersham Pharmacia)校准柱子，并测定柱子的外水体积。如同预期的那样，高分子量的流感病毒蛋白在柱子的外水体积中迁移，这是大分子蛋白，诸如病毒颗粒的特征。用Western免疫印迹分析法分析级分以检测流感蛋白和杆状病毒蛋白。例如，外水体积级分中检测到了M1蛋白，也含有杆状病毒蛋白(图7)。
通过电子显微术阐明了蔗糖梯度级分中的流感VLP和蛋白的形态。对于负染色电子显微术，将来自两个蔗糖密度梯度级分的流感蛋白用含2％戊二醛的PBS pH 7.2固定。对负染色的样品进行电子显微镜检，发现两个级分中均存在大分子蛋白质复合物或VLP。这些VLP呈现不同的大小(包括大约60和80nm的直径)和形态(球体)。还检测到这两种颗粒的更大的复合物以及杆状颗粒(图8)。观察到的所有大分子结构的表面均有刺突(包膜粒)，这是流感病毒的特征。由于80nm颗粒的大小和外观与野生型流感病毒颗粒相似，这些结构可能是VLP，与野生型流感病毒体具有显著的相似性，包括类似的颗粒几何特征、构造、三角划分数、对称性以及其它特征。大约60nm的较小颗粒可能是亚病毒颗粒，与VLP在形态上和结构上均有不同。对于其它病毒也报道了不同大小和形态的重组大分子蛋白质的类似现象。例如，乙型肝炎病毒重组核心抗原(HBcAg)形成不同大小的颗粒，它们具有不同的构造，三角划分数分别为T＝4和T＝3(Crowther et al.，1994)。
为了表征纯化的流感甲型/香港/1073/99(H9N2)VLP的功能性质，在血凝测定(图9)和神经氨酸酶酶测定中对样品进行了测试(图10)。对于血凝测定，将纯化的流感VLP的二倍稀释物与0.6％豚鼠红细胞混合，在4℃保温1小时或16小时。肉眼观察凝血程度，确定并记录能够凝集红细胞的重组流感蛋白最高稀释度(图9)。同样地，来自所述蔗糖密度梯度的许多级分均显示出凝血活性，提示流感蛋白的多种大分子及单体形式的存在。测得的最高效价是1∶4000。在对照实验中，野生型流感甲型/Shangdong病毒显示的效价为1∶2000。该凝血测定显示，由流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1蛋白组成的重组VLP是功能活性的。这提示，在这些VLP内HA亚单位蛋白的组装、构象和折叠与野生型流感病毒是相似或相同的。
此外，对纯化的H9N2 VLP的样品进行了神经氨酸酶酶测定。用胎球蛋白作为底物，测定了蔗糖密度梯度级分中神经氨酸酶活性的量。在该神经氨酸酶测定中，神经氨酸酶从底物分子切下唾液酸，从而释放唾液酸供测定。加入亚砷酸盐试剂终止酶活性。释放的唾液酸量用硫代巴比妥酸加以化学测定，后者产生与游离唾液酸量成比例的粉红颜色。颜色(生色团)的量通过分光光度法以549nm波长测量。使用该方法，在含有流感VLP的蔗糖梯度级分中显示了神经氨酸酶活性(图10)。正如预期的那样，在数个级分，包括两个峰级分中观察到了活性。使用野生型流感病毒作为阳性对照。野生型流感病毒展现的神经氨酸酶活性与纯化的流感VLP相似。这些发现支持了蛋白构象方面的HA结果，提示流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒的纯化VLP在功能上与野生型流感病毒相似。
上述分析和测定的结果表明，流感甲型/香港/1073/99(H9N2)HA、NA和M1蛋白的表达对于来自杆状病毒感染的昆虫细胞的功能性VLP的自组装和转运是足够的。由于这些流感VLP是自组装的流感结构蛋白，并显示与野生型流感病毒相似的功能和生化性质，这些流感VLP保留了重要的结构构象，包括对于有效的流感疫苗而言必需的表面表位。
实施例2
禽流感甲型/香港/1073/99病毒基因的RT-PCR克隆
本发明的一个目的是提供能够指导重组流感病毒蛋白产生的合成核酸序列。使用从流感病毒分离的该病毒天然基因组RNA，利用逆转录和聚合酶链式反应(PCR)方法获得了这样的合成核酸序列。为本申请的目的，核酸序列是指RNA、DNA、cDNA或者它们编码所述蛋白的任何合成变体。
禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒由K.Subbarao博士(Centers forDisease Control，Atlanta，Ga.，USA)提供。在CDC于3级生物安全(B SL3)防范条件下，使用Trizol LS试剂(Invitrogen，Carlsbad，Calif.USA)利用酸性酚RNA抽提法分离病毒基因组RNA。使用MuLV逆转录酶(InVitrogen)进行逆转录，并使用对HA、NA和M1蛋白特异性的寡核苷酸引物及Taq I DNA聚合酶(InVitrogen)进行PCR，获得了这些病毒RNA的cDNA分子(表1)。将PCR片段克隆到细菌亚克隆载体pCR2.1TOPO(InVitrogen)中EcoRI位点之间，得到含有HA、NA和M1 cDNA克隆的三种重组质粒。
实施例3
人流感甲型/悉尼/5/94(H3N2)病毒基因的RT-PCR克隆
流感甲型/悉尼/5/94(H3N2)病毒由M.Massare博士(Novavax，Inc.，Rockville，Md.)提供。在Novavax.Inc于BSL2防范条件下，使用Trizol LS试剂(Invitrogen)利用酸性酚RNA抽提法分离病毒基因组RNA。通过逆转录并使用对HA、NA、M1、M2和NP蛋白特异性的寡核苷酸引物(表1)进行PCR，获得了这些病毒RNA的cDNA分子。将PCR片段克隆到细菌亚克隆载体pCR2.1TOPO中EcoRI位点之间，得到含有HA、NA、M1、M2和NPcDNA克隆的五种重组质粒。
实施例4
将禽流感甲型/香港/1073/99病毒cDNA克隆到杆状病毒转移载体中
从所述基于pCR2.1TOPO的质粒将HA、NA或M1基因亚克隆到pFastBac1杆状病毒转移载体(InVitrogen)中多角体蛋白基因座内和Tn7 att位点中及杆状病毒多角体启动子下游和聚腺苷酸化信号序列上游。用T4DNA连接酶连接这些病毒基因。对于HA基因，将来自pCR2.1TOPO-HA的Bam HI-Kpn I DNA片段插入用BamHI-KpnI消化的pFastBac1质粒DNA中。对于NA基因，将来自pCR2.1TOPO-NA的EcoRI DNA片段插入用EcoRI消化的pFastBac1质粒DNA中。对于M1基因，将来自pCR2.1TOPO-M1的EcoRI DNA片段插入用EcoRI消化的pFastBac1质粒DNA中。用这些DNA连接反应物转化感受态大肠杆菌DH5α细菌(InVitrogen)，产生转化菌落，分离细菌克隆。对所得的基于pFastBac1的质粒：pFastBac1-HA、pFastBac1-NA和pFastBac1-M1通过琼脂糖凝胶上的限制酶作图进行表征(图4A)。通过自动化DNA测序测定了被克隆基因的核苷酸序列，如图1-3所示。DNA序列分析显示，所克隆的流感HA、NA和M1基因与早先公开的这些基因的核苷酸序列[流感甲型/香港/1073/99(H9N2)的NA、HA和M1基因(GenBank登录号分别为AJ404629、AJ404626和AJ278646)]相同。
实施例5
将人流感甲型/悉尼/5/97病毒cDNA克隆到杆状病毒转移载体中
从所述基于pCR2.1TOPO的质粒将HA、NA、M1、M2和NP基因亚克隆到pFastBac1杆状病毒转移载体中多角体蛋白基因座内和Tn7 att位点中及杆状病毒多角体启动子下游和聚腺苷酸化信号序列上游。用T4 DNA连接酶连接这些病毒基因。对于HA基因，将来自pCR2.1TOPO-hHA3的Bam HI-Kpn I DNA片段插入用BamHI-KpnI消化的pFastBac1质粒DNA中。对于NA基因，将来自pCR2.1TOPO-hNA的EcoRI DNA片段插入用EcoRI消化的pFastBac1质粒DNA中。对于M1基因，将来自pCR2.1TOPO-hM1的EcoRI DNA片段插入用EcoRI消化的pFastBac1质粒DNA中。对于M2基因，将来自pCR2.1TOPO-hM2的EcoRI DNA片段插入用EcoRI消化的pFastBac1质粒DNA中。对于NP基因，将来自pCR2.1TOPO-hNP的EcoRIDNA片段插入用EcoRI消化的pFastBac1质粒DNA中。用这些DNA连接反应物转化感受态大肠杆菌DH5α细菌(InVitrogen)，产生转化菌落，分离细菌克隆。对所得的基于pFastBac1的质粒：pFastBac1-hHA3、pFastBac1-hNA2、pFastBac1-hM1、pFASTBAC1-hM2和pFASTBAC1-hNP通过琼脂糖凝胶上的限制酶作图进行表征。通过自动化DNA测序测定了被克隆基因的核苷酸序列。DNA序列分析显示，所克隆的流感HA、NA、M1、M2和NP基因与早先公开的这些基因的核苷酸序列相同。
实施例6
编码多个禽流感甲型/香港/1073/99病毒基因的多基因杆状病毒转移载体的构建
为了构建表达多个流感甲型/香港/1073/99(H9N2)病毒基因的基于pFastBac1的杆粒转移载体，首先将来自pFastBac1-M1质粒的含M1基因的Sna BI-Hpa I DNA片段插入pFastBac1-HA的Hpa I位点。这样得到了pFastBac1-HAM质粒，其同时在独立的表达盒中编码HA和M1，并在不同的多角体蛋白启动子控制之下表达。
最后，将来自pFastBac1-HAM的含有所述HA和M1表达盒的SnaBI-AvrII DNA片段转入经过Hpa I-Avr II消化的pFastBac1-NA质粒DNA中。这样得到质粒pFastBac1-NAHAM，其编码用于表达流感HA、NA和M1基因的3个独立的表达盒，并在不同的多角体蛋白启动子控制之下表达(图4B)。
在另一个例子中，将来自pFASTBAC1-hHA3(见实施例5)的H3基因克隆到pFASTBAC1-NAHAM中作为第四种流感病毒基因，用于表达和生产异型流感VLP。
实施例7
在昆虫细胞中产生编码禽流感甲型/香港/1073/99病毒NA、HA和M1基因的多基因重组杆状病毒
使用得到的多基因杆粒转移载体pFastBac1-NAHAM产生多基因重组杆状病毒，该病毒编码用于在昆虫细胞中表达的禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)NA、HA和M1基因。通过pFastBac1-NAHAM DNA与感受态大肠杆菌DH10BAC细胞(InVitrogen)中所含AcMNPC杆状病毒基因组之间在多角体蛋白和Tn7att DNA序列上的位点特异性重组产生重组杆粒DNA(图4B)。通过小提质粒DNA法分离重组杆粒DNA，并利用阳离子脂质CELLFECTIN(InVitrogen)转染到Sf-9s细胞中。转染后，分离重组的杆状病毒，噬斑纯化后，在Sf-9S昆虫细胞中扩增。在Sf-9S昆虫细胞中制备病毒储备物，并对其禽流感病毒HA、NA和M1基因产物的表达表征。将所得的重组杆状病毒命名为bNAHAM-H9N2。
实施例8
在昆虫细胞中表达重组禽流感甲型/香港/1073/99蛋白
将作为悬浮培养物在装有无血清培养基(HyQ SFM，HyClone，Ogden，Utah)的摇瓶中于28℃维持的Sf-9S昆虫细胞以2x106个细胞/ml的细胞密度用所述重组杆状病毒bNAHAM-H9N2感染，感染复数(MOI)为3pfu/细胞。病毒感染进行72小时以容许流感蛋白表达。通过SDS-PAGE和Western免疫印迹分析确证了禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)HA和M1蛋白在被感染昆虫细胞中的表达。SDS-PAGE分析在4-12％线性梯度NuPAGE凝胶(Invitrogen)上于还原和致变性条件下进行。Western免疫印迹分析中所用的第一抗体是获自CDC的针对禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)激发产生的多克隆兔抗血清，以及针对流感M1蛋白的单克隆鼠抗血清(Serotec，UK)。用于Western免疫印迹分析的第二抗体是碱性磷酸酶偶联的、针对兔或小鼠IgG(H+L)激发产生的山羊IgG抗血清(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，Md.，USA)。这些分析的结果(图5)表明HA和M1蛋白在所述杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。
实施例9
重组禽流感H9N2病毒样颗粒和大分子蛋白复合物的纯化
通过低速离心从感染了重组杆状病毒bNAHAM-H9N2的Sf-9S昆虫细胞收集培养上清液(200ml)，其中所述bNAHAM-H9N2表达禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)HA、NA和M1基因产物。在Sorval RC-5B超速离心机中使用GS-3转子10,000xg、4℃离心1小时澄清培养上清液。在SorvalOTD-65超离心机中使用Sorval TH-641摇篮式转子27,000rpm、4℃离心3小时，从澄清的培养上清液中分离出病毒和VLP。将病毒离心沉淀重悬在1ml PBS(pH 7.2)中，加载到20-60％(w/v)不连续蔗糖分步梯度上，并在SorvalOTD-65超离心机中使用Sorval TH-641转子27,000rpm、4℃离心16小时加以解析。从蔗糖梯度的顶部收集级分(0.5ml)。
如上文实施例6中所述，通过SDS-PAGE和Western免疫印迹分析法来分析蔗糖梯度级分中的流感蛋白。如Western印迹分析显示的，HA和M1蛋白出现在相同的蔗糖梯度级分中(图6)，这提示HA和M1蛋白是作为大分子蛋白复合物相结合的。而且，HA和M1蛋白在整个蔗糖梯度的级分中都有出现，提示这些重组病毒蛋白是与不同密度和组成的大分子蛋白复合物结合的。
实施例10
通过凝胶过滤层析分析重组禽流感H9N2 VLP和蛋白
蛋白质大分子，例如VLP和单体蛋白，根据它们的质量大小和形状而在凝胶过滤或者大小排阻层析柱上以不同方式迁移。为了确定来自蔗糖梯度级分的重组流感蛋白是单体蛋白还是大分子蛋白复合物如VLP，制备了树脂床体积为14ml Sepharose CL-4B(Amersham)的层析柱(7mm×140mm)。用PBS平衡该大小排阻柱，并用用表观分子量分别为2,000,000、20,000和1,357的蓝色右旋糖苷2000、黄色右旋糖苷和维生素B12(AmershamPharmacia)校准柱子，以测定柱外水体积。蓝色右旋糖苷2000也在外水体积中(6ml级分)从柱子洗脱。正如预期的那样，重组流感蛋白复合物在外水体积中(6ml级分)从柱子洗脱。该结果是高分子量大分子蛋白复合物例如VLP的特征。如上文实施例6中所述，通过Western免疫印迹分析来检测柱级分中的病毒蛋白。M1蛋白在外水体积级分中被检出(图7)。正如预期的，杆状病毒蛋白也在外水体积中。
实施例11
重组流感VLP的电子显微术
为了确定在蔗糖梯度上分离的、含有重组禽流感蛋白的大分子蛋白复合物是否具有与流感病毒体相似的形态，对负染色的样品进行了电子显微镜观察。如实施例7中的描述，通过在不连续蔗糖梯度上超离心来从培养上清液浓缩并纯化了重组禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)蛋白复合物。将这些蔗糖梯度级分的等份试样用含2％戊二醛的PBS，pH 7.2处理，吸收到新近放电的塑料/碳涂层载网上，并用蒸馏水洗涤。用2％磷钨酸钠pH 6.5染色样品，使用透射电子显微镜(Phillips)观察。来自两个蔗糖梯度级分的重组禽流感H9N2蛋白复合物负染色样品的电子显微照相显示了来自两个蔗糖梯度级分的球形和杆形颗粒(图8)。这些颗粒具有不同的大小(60和80nm)和形态。还检测到两种颗粒的更大的复合物，以及杆状颗粒(图8)。所有观察到的蛋白复合物结构均展现了类似于流感病毒HA和NA包膜粒的刺突样突起。由于80nm颗粒的大小和外观近似于野生型流感病毒颗粒，这些结构可能是被包膜的流感VLP。约60nm的较小颗粒可能是与上述VLP在形态上和结构上均有不同的亚病毒颗粒。
实施例12
通过凝血测定分析流感蛋白的功能特性
为了确定纯化的流感VLP和蛋白是否具有流感病毒特征性的功能活性，例如凝血和神经氨酸酶活性，在凝血测定和神经氨酸酶测定中测试了纯化的流感VLP和蛋白。
对于凝血测定，制备了含有流感VLP的蔗糖梯度级分或者阳性对照野生型甲型流感病毒的一系列2倍稀释物。然后将它们与含0.6％豚鼠红细胞的PBS(pH 7.2)混合，在4℃保温1到16小时。使用PBS作为阴性对照。肉眼观察凝血程度，并确定能够凝集豚鼠红细胞的级分最高稀释度(图9)。纯化的流感VLP和蛋白观察到的最高凝血效价是1∶4000，高于野生型流感对照所示的效价1∶2000。
实施例13
通过神经氨酸酶测定分析流感蛋白的功能特性
通过神经氨酸酶测定确定了含有流感VLP的蔗糖梯度级分中神经氨酸酶活性的量。在该测定中，NA(酶)作用于底物(胎球蛋白)并释放唾液酸。加入亚砷酸盐试剂终止酶活性。释放的唾液酸量用硫代巴比妥酸加以化学测定，后者产生与游离唾液酸量成比例的粉红颜色。颜色(生色团)的量通过分光光度法以594nm波长测量。数据如图8所示，表明含VLP的蔗糖梯度级分产生了显著量的唾液酸，并且这些级分对应于展现凝血活性的那些级分。
实施例14
用功能性同型重组流感H9N2 VLP免疫BALB/c小鼠
通过免疫小鼠而后对免疫血清进行Western印迹分析来确定重组流感VLP的免疫原性。在第0天和第28天对十(10)只雌性BALB/c小鼠的三角肌区域中皮下接种重组VLP(1μg/次注射)，其中该重组VLP由来自禽流感甲型/香港/1073/99(H9N2)的病毒HA、NA和M1蛋白组成，并已经过蔗糖梯度纯化(图11)。类似地对五(5)只小鼠施用PBS(pH 7.2)作为阴性对照。在第-1天(预取血)、第27天(初次取血)和第54天(二次取血)从小鼠眶上腔取血。经过过夜凝血和离心，从血样中收集血清。
对于Western印迹分析，取200ng灭活的禽流感甲型H9N2或冷适应的禽流感甲型H9N2以及用See Blue Plus 2预染色的蛋白标准品(InVitrogen)，变性(95℃、5分钟)后，于还原条件下(10mM β-巯基乙醇)，在4-12％聚丙烯酰胺梯度NuPAGE凝胶(InVitrogen)上，MES缓冲液中以172伏电泳，直到溴酚蓝径迹染料消失。对于蛋白凝胶，用胶体考马斯蓝试剂(InVitrogen)染色来显现电泳蛋白。通过标准Western印迹程序将蛋白从凝胶转移到甲醇中的硝酸纤维素膜上。将来自用VLP免疫的小鼠的血清和来自用灭活禽流感病毒H9N2的兔的血清(阳性对照血清)分别以1∶25和1∶100稀释于PBS溶液(pH7.2)中，用作第一抗体。将结合有蛋白的膜经过5％酪蛋白封闭后，与第一抗血清在室温、持续摇动下反应60分钟。用含有Tween 20的磷酸盐缓充盐水洗涤第一抗体膜后，将膜与第二抗血清[山羊抗鼠IgG-碱性磷酸酶偶联物(1∶10,000)，或者山羊抗兔IgG-碱性磷酸酶偶联物(1∶10,000)]反应60分钟。用含有Tween 20的磷酸盐缓充盐水洗涤第二抗体膜后，用生色底物如NBT/BCIP(InVitrogen)显色来显现膜上结合了抗体的蛋白。
Western印迹分析的结果(图12)是：分子量近似于病毒HA和M1蛋白的蛋白质(分别为75和30kd)与阳性对照血清(图12B)和来自用重组流感H9N2VLP免疫的小鼠的血清(图12A)结合。这些结果表明，通过这种施用途径，单独的重组流感H9N2VLP在小鼠中是具有免疫原性的。
实施例15
BALB/c小鼠中的香港/1073/99(H9N2)VLP免疫原性和攻击研究
在第0天和第21天对BALB/c小鼠用含或不含100μg Novosome佐剂的H9N2VLP(1μg HA或10μg HA/剂)免疫，在第57天用同源感染性病毒IN攻击。小鼠在第0、27和57天取血，对血清使用火鸡红细胞进行凝血抑制(HI)测定来测定抗HA抗体，并通过ELISA来测定流感。该研究的结果示于图13至图16。
在用含或不含Novasome的H9N2 VLP单次免疫(初次)以及一个剂量的含1μg HA的10μg VLP后，诱导了高效价的H9N2抗体(图13)。在一次增强免疫后，特异性抗体效价增加了半个到一个对数级。
在用H9N2 VLP形式的1μg HA进行免疫和加强免疫后，在所有的动物中，血清HI水平均达到或高于通常视作阳性的水平(log2＝5)(图14，左下图)。与Novasome佐剂共配制的H9N2VLP使初次免疫后的HI应答增加到约2倍，加强免疫后的HI应答增加到约4倍(图14，右下图)。纯化的亚单位H9N2血凝素也在加强免疫后诱导了保护水平的HI抗体，而Novasome同样使初次免疫后的HI抗体应答增加到约2倍，加强免疫后的HI抗体应答增加到约4倍(图14，上图)。由10μg作为亚单位疫苗给予的HA所诱导的HI抗体水平与1μg以VLP形式提供的HA相等。
此外，与未接种的对照动物相比，在接种了H9N2 VLP或VLP加佐剂的小鼠中体重减轻明显较少(图15)。在接种H9N2 VLP的组和接种H9N2VLP加Novasome佐剂的组之间体重减轻没有统计学上的差异。
同样，在用H9N2 VLP免疫的小鼠中，用H9N2病毒攻击后3天和5天时的肺病毒效价显著降低(图16)。与仅用VLP免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠相比，用H9N2 VLP加
Figure A20068004585000591
免疫的小鼠在第3天(此时肺组织中流感病毒效价达到峰值)的病毒效价具有明显较大的减少。
实施例16
甲型/福建/411/2002(H3N2)VLP免疫原性和数种流感病毒株之间的交叉反应性
对BALB/c小鼠，用甲型/福建/411/2002 VLP(3.0、0.6、0.12和0.24μgHA/剂)肌肉内(IM)和鼻内(IN)免疫两次。在第0天和第35天对小鼠取血。对于血清，使用火鸡红细胞进行凝血抑制测定(HI)来检测抗HA抗体，用ELISA来检测抗流感抗体。该研究的结果显示于图17A、17B和17C。这些结果表明，在肌肉内和鼻内均引发了针对HA和NA的免疫应答。
实施例17
接种H3N2 VLP后小鼠中IgG同种型的确定
用VLP肌肉内和鼻内接种小鼠。于第5周时采取血清并加以分析以区分IgG同种型。
使用ELISA测定体系，在包被了纯化HA(Protein Sciences)甲型/怀俄明/3/2003的平板上测试血清。将血清的系列5倍稀释物加入孔中并温育平板。然后，生物素化的山羊抗小鼠Ig、或抗小鼠IgG1、抗小鼠IgG2a、抗小鼠IgG2b和抗小鼠IgG3。然后向孔中加入链霉亲合素-过氧化物酶。检测结合的偶联物。结果示于图18A和B。这些结果说明IgG2a是在小鼠的抗VLP免疫应答中最丰富的同种型。
实施例18
SD大鼠中的甲型/香港/1073/99(H9N2)VLP剂量范围研究
在第0天和第21天，对SD大鼠(每个剂量n＝6)接种纯化的甲型/香港/1073/99(H9N2)VLP(用pH中性的PBS稀释到0.12、0.6、3.0和15.0μg HA)或者单独的PBS。在第0天、第21天、第35天和第49天从动物采取血样，并对血清进行凝血抑制测定(HI)以检测能够抑制HA的结合功能的功能性抗体。剂量是基于HA含量，HA含量通过对纯化的H9N2VLP进行SDS-PAGE和扫描密度测量确定。凝血抑制测定效价结果示于图19。单个0.6μg HA剂量的H9N2 VLP或者两个剂量的0.12μg HA在大鼠中产生了保护水平的HI抗体。这些结果表明，当HA是VLP的一部分时，较低量的HA可以诱发保护性应答。
实施例19
香港/1073/99(H9N2)VLP免疫原性
在第0天和第21天用含或不含100μg Novosome和明矾佐剂的H9N2VLP免疫BALB/C小鼠(0.12，0.6μg HA/剂)，并在第57天用同源感染性病毒鼻内攻击。还用3.0和15.0μg HA/剂(无佐剂)免疫小鼠。在第0、21、35和49天对小鼠取血，对于血清使用火鸡红细胞进行凝血抑制测定(HI)来分析抗-HA抗体，并通过ELISA分析流感。该研究的结果显示于图20A和B。
这些结果表明，当VLP与佐剂一起施用时，观察到了更强健的总体免疫应答。但是，相比于含明矾的VLP制剂和不含佐剂的VLP，用0.12μg HA/剂在第3周诱发了保护性应答。另外在第7周，含Novasomes的VLP的HI效价比含明矾的VLP增加了大约2个对数级。应答的强健性与不含佐剂的、以3.0及15.0μg HA/剂施用的VLP相似。这些结果表明，Novasomes引发的应答比明矾更为强健。此外，当VLP在含Novasomes的制剂中施用时，使用少25倍的所述VLP即可实现保护性免疫应答。
此外，在0.6μg HA/剂的数据中，Novasomes制剂与明矾相比应答高大约1.5个对数级。免疫应答在幅度上与不含佐剂的、以3.0和15.0μg HA/剂施用的VLP相似。这些结果表明，在使用佐剂的情况下，实现保护性应答所需要施用的VLP少大约5倍。
此外，图20B显示了使用不同Novasomes制剂的H9N2 VLP的HI效价。下面是实验中使用的配方：
第1组：H9N2 VLP(0.1μg)(n＝5)
第2组：H9N2 VLP(0.1μg)有DCW纯的)(n＝5)
第3组：H9N2 VLP(0.1μg)有DCW1:3)(n＝5)
第4组：H9N2 VLP(0.1μg)有DCW1:9)(n＝5)
第5组：H9N2 VLP(0.1μg)有DCW1:27)(n＝5)
第6组：H9N2 VLP(0.1μg)有NVAX1)(n＝5)
第7组：H9N2 VLP(0.1μg)有NVAX2)(n＝5)
第8组：H9N2 VLP(0.1μg)有NVAX3)(n＝5)
第9组：H9N2 VLP(0.1μg)有NVAX4)(n＝5)
第10组：H9N2 VLP(0.1μg)有NVAX5)(n＝5)
第11组：H9N2 VLP(0.1μg)有Alum-OH)(n＝5)
第12组：H9N2 VLP(0.1μg)有CpG)(n＝5)
第13组：PBS(0.6μg)(n＝5)
第14组：H3VLP(0.6μg)(n＝5)
第15组：H5VLP(0.6μg)(n＝8)
-H9：(批号11005)
-DCW：Novasomes(批号121505-2，聚氧乙烯-2-十六烷基醚，胆固醇，超纯大豆油，和氯化十六烷基吡啶鎓)
-NVAX1：B35P83，MF-59 replica(角鲨烯，聚山梨醇酯，和Span)
-NVAX2：B35P87(大豆油，Brij，胆固醇，Pluronic F-68)
-NVAX3：B35P88(大豆油，Brij，胆固醇，Pluronic F-68、和聚乙烯亚胺)
-NVAX4：B31P60(角鲨烯，Brij，胆固醇，油酸)
-NVAX5：B31P63(大豆油，单硬脂酸甘油酯，胆固醇，聚山梨醇酯)
-CpG：(批号1026004)
-H5：(批号22406)
图21显示H9N2 VLP的剂量应答曲线。该数据表明，0.6μg HA/剂的VLP剂量是3周后在小鼠中引发保护性免疫应答的最小剂量。
实施例20
雪貂研究的材料和方法
雪貂购自Triple F Farms(FFF，Sayre，PA)。购买的所有雪貂均具有小于10个凝血单位的HAI效价。免疫前大约2天，给动物植入体温转发器(temperature transponder)(BioMedic Data Systems，Inc.)。在第0天给动物(6只动物/组)接种：(1)PBS(阴性对照，第1组)；(2)15μg H3量的H3N2流感VLP(第2组)；(3)3μg H3量的H3N2流感VLP(第2组)；(4)0.6μg H3量的H3N2流感VLP(第3组)；(5)0.12μg H3量的H3N2流感VLP(第5组)；或(6)15μg的rH3HA(第6组)。在第21天用疫苗对动物加强免疫。在第0天(免疫接种之前)、第21天(疫苗加强免疫之前)和第42天对动物取血。在整个研究期内，每周一次对动物评估疫苗有害效应的临床体征。用其它流感VLP进行了类似的研究。
雪貂血清中的HAI水平
从FFF取得雪貂血清，用受体破坏酶(Receptor Destroying Enzyme，RDE)处理后，按照标准程序(Kendal et al.(1982))进行凝血抑制(HAI)测定加以测试。在该项研究选用的所有雪貂中，针对正在流行中的人流感病毒(甲型/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、甲型/巴拿马/2007/99(H3N2)、甲型/惠灵顿/01/04(H2N3)和乙型/四川/379/99和H5N1)的预先存在的抗体检测均为阴性(HAI≤10)。
雪貂
大约8月龄、未接触过流感(influenza na
Figure A20068004585000621
ve)、经阉割和脱臭(descented)的雄性Fitch雪貂(Mustela putorius furo)购自FFF。将动物圈养在内装Sani-chips实验动物垫料(Sani-chips Laboratory Animal Bedding)(P.J.MurphyForest Products，NJ)的不锈钢兔笼(Shor-line，KS)中。不限制地给雪貂提供Teklad通用雪貂食料(Teklad Global Ferret Diet)(Harlan Teklad，WI)和淡水。每周更换三次食盘，每两周清扫笼子一次。
雪貂的接种和采血
疫苗[如H3N2流感VLP或H9N2流感VLP]和对照[例如rH3NA(甲型/怀俄明/3/2003)和PBS(阴性对照)]在使用前保存在4℃。对大多数研究，用0.5ml体积的疫苗浓缩物或对照肌肉内接种6组雪貂(N-6/组)。
在采血和接种前，用氯胺酮(Katamine)(25mg/kg)、阿托品(Atropine)(0.05mg/kg)和赛拉嗪(Xylazine)(2.0mg/kg)的“KAX”溶液对动物大腿内侧肌肉注射将其麻醉。一旦雪貂处于麻醉状态下，即将其置于仰卧位，用连有1cc结核菌素注射器的23号1”针头从前腔静脉取血(体积为0.5-1.0ml)。将血液转移到装有血清分离剂和凝血活化剂的试管中，使其在室温凝结。将试管离心，移出血清，冷冻在-80℃。在接种前(第0天)、加强免疫前(第21天)和第42天采血，并用HAI测定加以测试。
雪貂的监测
在整个研究期间，每周在几乎相同的时间测量体温。将接种前的数值取平均，得到每只雪貂的基线体温。对各只动物在各个时间点上计算体温的变化(以华氏度计)。每周检查雪貂的疫苗有害效应的临床体征，包括体温、体重减少、活跃度减少、流涕、喷嚏和腹泻。使用基于Reuman等人(1989)记载的评分系统来评估活跃度水平，其中0＝警觉，好嬉戏；1＝警觉，但仅在受刺激时才好嬉戏；2＝警觉，但受刺激时也不好嬉戏；3＝不警觉，受刺激时也不好嬉戏。基于组中各动物的分数，以下式计算相对不活跃度：∑(第0天-第42天)[活跃度分数+1]/∑(第0天-第42天)，其中n等于总观察次数。给每个基础分数加上数值1，使得分数“0”能够被分母除，得到指数值1.0。
血清分离
血清一般具有低水平的非特异性凝血抑制剂。为了使这些非特异性抑制剂失活，在测试前用(RDE)处理血清。简单的说，向一份血清中加入三份RDE，37℃保温过夜。在56℃保温大约30分钟使RDE失活。RDE失活后，向样品中加入PBS，得到1∶10的最终血清稀释物(RDE-Tx)。将经稀释的RDE-Tx血清在测试之前保存于4℃(7天)或保存于-20℃。
火鸡红细胞的制备
人流感病毒结合含有N-乙酰神经氨酸α2，6-半乳糖连接的唾液酸受体。禽流感病毒结合含有N-乙酰神经氨酸α2，3半乳糖(α2，3连接)的唾液酸受体并表达α2，3和α2，6连接。将火鸡红细胞(TRBC)用于HAI测定，因为甲型/福建是一种人流感病毒。用PBS调节TRBC获得0.5％v/v的悬液。将细胞保存在4℃，并在制备后72小时内使用。
HAI测定
HAI测定法是从CDC的基于实验室的流感监视手册(Kendal et al.(1982)Concepts and procedures for laboratory based influenza surveillance，U.S.Department of Health and Human Services，Public Health Service，Centers forDisease Control，Atlanta，Georgia，本文通过提述收录其全部内容用于所有目的)改编的。将RDE-Tx血清在v形底微量滴定板中连续2倍稀释。向每个孔中加入等体积的调整到大约8HAU/50ul的病毒。平板加盖后在室温温育15分钟，然后加入0.5％的TRBC。摇动混合平板，加盖，让TRBC在室温沉降30分钟。由含有未凝集的TRBC的最后一行的稀释度之倒数确定HAI效价。每个板均包括阳性和阴性血清对照。
实施例21
雪貂中的甲型/香港/1073/99(H9N2)VLP剂量范围研究
使用通过凝血抑制确定为流感病毒血清学阴性的雪貂来评估接种H9N2 VLP后的抗体和HI效价。在第0天和第21天对雪貂取血，对血清使用火鸡红细胞通过凝血抑制测定(HI)检测抗HA抗体，并通过ELISA检测抗流感抗体。结果示于图22。这些结果显示在1.5和15μg的VLP剂量下与保护性抗体水平相应的HI效价。
实施例21
雪貂中H3N2 VLP的接种
用不同病毒株的H3N2 VLP以不同的剂量(HA剂量：0.12、0.6、3.0、15.0μg)在第0天接种雪貂，并在第21天给予加强免疫。阳性对照是15μg的rH3HA，阴性对照是单独的PBS。如上所述，在第0天(接种前)、第21天(加强免疫前)和第42天从雪貂取得血清。对血清样品进行HI测定以确定是否存在针对这些VLP的免疫应答。这些数据示于图23。这些数据表明H3N2 VLP当导入雪貂中时确实诱发免疫应答。因此，这些H3N2 VLP在雪貂中有免疫原性。
实施例22
流感甲型/印度尼西亚/5/05(H5N1)病毒HA、NA和M1基因的RT-PCR和克隆
在BSL-3防范条件下使用Trizol LS(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取进化枝2流感病毒，甲型/印度尼西亚/5/05(H5N1)株的病毒RNA。对提取的病毒RNA用基因特异性寡核苷酸引物使用一步RT-PCR系统(Invitrogen)进行逆转录(RT)和PCR。下面的引物对分别用于H5N1血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和基质(M1)基因的合成：
5’-AACGGTCCGATGGAGAAAATAGTGCTTCTTC-3’(SEQ ID.4)和
5’-AAAGCTTTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAACG-3’(SEQ ID.5)(HA)；
5’-AACGGTCCGATGAATCCAAATCAGAAGATAAT-3’(SEQ ID.6)和
5’-AAAGCTTCTACTTGTCAATGGTGAATGGCAAC-3’(SEQ ID.7)(NA)；及
5’-AACGGTCCGATGAGTCTTCTAACCGAGGTC-3’(SEQ ID.8)和
5’-AAAGCTTTCACTTGAATCGCTGCATCTGCAC-3’(SEQ ID.9)(M1)
(ATG密码子加有下划线)。
RT-PCR之后，将分别含有流感HA、NA和M1基因的分子量分别为1.7、1.4和0.7kB的cDNA片段克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)中。通过DNA测序确定了HA、NA和M1基因的核苷酸序列。根据类似的策略从越南/1203/2003克隆了进化枝1 H5N1流感病毒。
实施例23
包含H5N1的重组杆状病毒的生成
将HA基因作为RsrII-HindIII DNA片段(1.7kb)克隆到经过RsrII和HindIII消化的pFastBac1杆粒转移载体(Invitrogen)内AcMNPV多角体蛋白启动子的下游。类似地，将NA和M1基因作为EcoRI-HindIII DNA片段(分别为1.4和0.8kb)克隆到经过EcoRI-HindIII消化的pFastBac1质粒DNA中。得到三种杆状病毒转移质粒pHA、pNA和pM1，分别含有流感甲型/印度尼西亚/5/05(H5N1)病毒HA、NA和M1基因，使用它们来产生重组杆粒。
将含有流感基因的杆粒转移质粒转化到含有AcMNPV杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞(Invitrogen)中之后，通过位点特异性同源重组产生了杆粒。将重组杆粒DNA转染到Sf9昆虫细胞中。印度尼西亚/5/05 HA、NA和M1基因的核苷酸序列
HA(SEQ ID NO：10)
ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGC
ATTGGTTACCATGCAAACAATTCAACAGAGCAGGTTGACACAATCATGGAAAAGAACGTT
ACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTA
GATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTAAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGGAAC
CCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTACCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAAT
CCAACCAATGACCTCTGTTACCCAGGGAGTTTCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTA
TTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAAATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCGAT
CATGAAGCCTCATCAGGAGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTGGGAAGTCCCTCCTTTTTT
AGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAGAAAAGCTAC
AATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGAATTCACCATCCTAATGATGCG
GCAGAGCAGACAAGGCTATATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCATTGGGACATCAACA
CTAAACCAGAGATTGGTACCAAAAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGA
AGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCTAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAAT
GGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAGCAATT
ATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCG
ATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAA
TATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCAACAGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAG
AGCAGAAGAAAAAAGAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGG
CAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTAC
GCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCA
ATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAATAACTTAGAA
AGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTTCTAGATGTCTGGACTTAT
AATGCCGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAAT
GTTAAGAACCTCTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGT
AACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTATAAGAAAC
GGAACGTACAACTATCCGCAGTATTCAGAAGAAGCAAGATTAAAAAGAGAGGAAATAAGT
GGGGTAAAATTGGAATCAATAGGAACTTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCG
AGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGATGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCTCCAATGGA
TCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA
NA(SEQ ID.11)
ATGAATCCAAATCAGAAGATAATAACCATTGGATCAATCTGTATGGTAATTGGAATAGTT
AGCTTAATGTTACAAATTGGGAACATGATCTCAATATGGGTCAGTCATTCAATTCAGACA
GGGAATCAACACCAAGCTGAATCAATCAGCAATACTAACCCTCTTACTGAGAAAGCTGTG
GCTTCAGTAACATTAGCGGGCAATTCATCTCTTTGCCCCATTAGAGGATGGGCTGTACAC
AGTAAGGACAACAATATAAGGATCGGTTCCAAGGGGGATGTGTTTGTTATTAGAGAGCCG
TTCATCTCATGCTCCCACCTGGAATGCAGAACTTTCTTCTTGACTCAGGGAGCCTTGCTG
AATGACAAGCACTCCAACGGGACTGTCAAAGACAGAAGCCCTCACAGAACATTAATGAGT
TGTCCTGTGGGTGAGGCTCCCTCTCCATATAACTCAAGGTTTGAGTCTGTTGCTTGGTCA
GCAAGTGCTTGCCATGATGGCACCAGTTGGTTGACAATTGGAATTTCTGGCCCAGACAAT
GAGGCTGTGGCTGTATTGAAATACAATGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGG
AACAACATACTGAGAACTCAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGGCTCTTGCTTTACT
GTAATGACTGATGGACCAAGTGATGGGCAGGCATCATATAAGATCTTCAAAATGGAAAAA
GGAAAAGTGGTCAAATCAGTCGAATTGGATGCTCCTAATTATCACTATGAGGAATGCTCC
TGTTATCCTGATGCCGGCGAAATCACATGTGTTTGCAGGGATAATTGGCATGGCTCAAAT
AGGCCATGGGTATCTTTCAATCAAAATTTGGAGTATCAAATAGGATATATATGCAGTGGA
GTTTTCGGAGACAATCCACGCCCCAATGATGGAACAGGTAGTTGTGGCCCGATGTCCCCT
AACGGGGCATATGGGGTAAAAGGGTTTTCATTTAAATACGGCAATGGTGTTTGGATCGGG
AGAACCAAAAGCACTAATTCCAGGAGCGGCTTTGAAATGATTTGGGATCCAAATGGGTGG
ACTGGAACGGACAGTAGCTTTTCAGTGAAACAAGATATAGTAGCAATAACTGATTGGTCA
GGATATAGCGGGAGTTTTGTCCAGCATCCAGAACTGACAGGATTAGATTGCATAAGACCT
TGTTTCTGGGTTGAGTTAATCAGAGGGCGGCCCAAAGAGAGCACAATTTGGACTAGTGGG
AGCAGCATATCTTTTTGTGGTGTAAATAGTGACACTGTGAGTTGGTCTTGGCCAGACGGT
GCTGAGTTGCCATTCACCATTGACAAGTAG
M1(SEQ ID.12)
ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTC
AAAGCCGAGATCGCGCAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCTCGAG
GCTCTCATGGAGTGGCTGAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAAGGGATTTTG
GGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTC
CAGAATGCCCTAAATGGAAATGGAGATCCAAATAATATGGATAGGGCAGTTAAGCTATAT
AAGAAGCTGAAAAGAGAAATAACATTCCATGGGGCTAAAGAGGTTTCACTCAGCTACTCA
ACCGGTGCACTTGCCAGTTGCATGGGTCTCATATACAACAGGATGGGAACGGTGACTACG
GAAGTGGCTTTTGGCCTAGTGTGTGCCACTTGTGAGCAGATTGCAGATTCACAGCATCGG
TCTCACAGGCAGATGGCAACTATCACCAACCCACTAATCAGGCATGAAAACAGAATGGTG
CTGGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGAGCAGGCAGCG
GAAGCCATGGAGGTCGCTAATCAGGCTAGGCAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGA
ACTCATCCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGAGATAATCTTCTTGAAAATTTGCAGGCCTAC
CAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGA
一个克隆的HA基因，pHA5，相比于野生型HA基因序列含有两个核苷酸变化nt#1172和nt#1508(在野生型中)。使用类似的策略，从越南/1203/2003 VLP构建和生成了进化枝1 H5N1流感病毒(见下文)。下面是pHA5核苷酸和氨基酸序列的比对。
wt    1 ...................ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATAG 31 seq id 10
                           |||||||||||||||||||||||||||||||
pHA5 51 ATTCGCCCTTAACGGTCCGATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATAG 100 seq id 56
                 .         .         .         .         .
     32 TCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAAT 81
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    101 TCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAAT 150
                 .         .         .         .         .
     82 TCAACAGAGCAGGTTGACACAATCATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACA 131
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    151 TCAACAGAGCAGGTTGACACAATCATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACA 200
                 .         .         .         .         .
    132 TGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAG 181
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    201 TGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAG 250
                 .         .         .         .         .
    182 ATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTAAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTC 231
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    251 ATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTAAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTC 300
                 .         .         .         .         .
    232 CTCGGGAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTACCGGAATGGTCTTA 281
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    301 CTCGGGAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTACCGGAATGGTCTTA 350
                 .         .         .         .         .
    282 CATAGTGGAGAAGGCCAATCCAACCAATGACCTCTGTTACCCAGGGAGTT 331
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    351 CATAGTGGAGAAGGCCAATCCAACCAATGACCTCTGTTACCCAGGGAGTT 400
                 .         .         .         .         .
    332 TCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTT 381
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    401 TCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTT 450
                                               .         .
              .         .         .         .         .
382  GAGAAAATTCAAATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCGATCATGAAGCCTC 431
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
451  GAGAAAATTCAAATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCGATCATGAAGCCTC 500
              .         .         .         .         .
432  ATCAGGAGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTGGGAAGTCCCTCCTTTTTTA 481
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
501  ATCAGGAGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTGGGAAGTCCCTCCTTTTTTA 550
              .         .         .         .         .
482  GAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAG 531
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
551  GAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAG 600
              .         .         .         .         .
532  AAAAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGAAT 581
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
601  AAAAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGAAT 650
              .         .         .         .         .
582  TCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGACAAGGCTATATCAAAACCCAA 631
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
651  TCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGACAAGGCTATATCAAAACCCAA 700
              .         .         .         .         .
632  CCACCTATATTTCCATTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCA 681
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
701  CCACCTATATTTCCATTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCA 750
              .         .         .         .         .
682  AAAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTT 731
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
751  AAAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTT 800
              .         .         .         .         .
732  CTTCTGGACAATTTTAAAACCTAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATG 781
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
801  CTTCTGGACAATTTTAAAACCTAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATG 850
              .         .         .         .         .
782  GAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGAC 831
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
851  GAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGAC 900
              .         .         .         .         .
832  TCAGCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTG 881
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
901  TCAGCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTG 950
              .         .         .         .         .
882  TCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATAC 931
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
951  TCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATAC 1000
              .          .          .          .         .
932  ACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTA 981
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1001 ACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTA 1050
              .         .         .         .         .
982  GTCCTTGCAACAGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGCAGAAGAAA 1031
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1051 GTCCTTGCAACAGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGCAGAAGAAA 1100
              .         .         .         .         .
1032 AAAGAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGC 1081
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1101 AAAGAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGC 1150
              .         .         .         .         .
1082 AGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGG 1131
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1151 AGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGG 1200
              .         .         .         .         .
1132 AGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGT 1181
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||
1201 AGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATGGATGGAGT 1250
              .         .         .         .         .
1182 CACCAATAAGGTCAACTCAATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGG 1231
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1251 CACCAATAAGGTCAACTCAATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGG 1300
              .         .         .         .         .
1232 CCGTTGGAAGGGAATTTAATAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAAC 1281
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1301 CCGTTGGAAGGGAATTTAATAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAAC 1350
              .         .         .         .         .
1282 AAGAAGATGGAAGACGGGTTTCTAGATGTCTGGACTTATAATGCCGAACT 1331
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1351 AAGAAGATGGAAGACGGGTTTCTAGATGTCTGGACTTATAATGCCGAACT 1400
              .         .         .         .         .
1332 TCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATG 1381
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1401 TCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATG 1450
              .         .         .         .         .
1382 TTAAGAACCTCTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAG 1431
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1451 TTAAGAACCTCTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAG 1500
              .         .         .         .         .
1432 GAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATG 1481
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1501 GAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATG 1550
              .         .         .         .         .
1482 TATGGAAAGTATAAGAAACGGAACGTACAACTATCCGCAGTATTCAGAAG 1531
     |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1551 TATGGAAAGTATAAGAAACGGAACGTGCAACTATCCGCAGTATTCAGAAG 1600
              .         .         .         .         .
1532 AAGCAAGATTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGGGTAAAATTGGAATCAATA 1581
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1601 AAGCAAGATTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGGGTAAAATTGGAATCAATA 1650
              .         .         .         .         .
1582 GGAACTTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGC 1631
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1651 GGAACTTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGC 1700
              .         .         .         .         .
1632 ACTGGCAATCATGATGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCTCCAATGGAT 1681
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1701 ACTGGCAATCATGATGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCTCCAATGGAT 1750
              .         .         .         .         .
1682 CGTTACAATGCAGAATTTGCATtTAA........................ 1707
     ||||||||||||||||||||||||||
1751 CGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAAAAGCTTTAAGGGCGAATTCCAGCA 1800
血凝素氨基酸序列比对
pHA5 1  MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE 50 seq id 57
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
wt   1  MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE 50 seq id 58
                 .         .         .         .         .
    51  KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKAN 100
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    51  KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKAN 100
                 .         .         .         .         .
    101 PTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSA 150
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    101 PTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSA 150
                 .         .         .         .         .
    151 CPYLGSPSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDA 200
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    151 CPYLGSPSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDA 200
                 .         .         .         .         .
    201 AEQTRLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILK 250
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    201 AEQTRLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILK 250
                 .         .         .         .         .
    251 PNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA 300
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    251 PNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA 300
                 .         .         .         .         .
    301 INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRESRRKKRGLFG 350
        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
    301 INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRESRRKKRGLFG 350
             .         .         .         .         .
351 AIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAMDGVTNKVNS 400
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||.|||||||||
351 AIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNS 400
             .         .         .         .         .
401 IIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN 450
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
401 IIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN 450
             .         .         .         .         .
451 ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESIRN 500
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
451 ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESIRN 500
             .         .         .         .         .
501 GTCNYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMMA 550
    |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
501 GTYNYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMMA 550
             .
551 GLSLWMCSNGSLQCRICI.                                568
    ||||||||||||||||||
551 GLSLWMCSNGSLQCRICI＊                               569
实施例26
在Sf9细胞中高效表达的优化流感甲型/印度尼西亚/5/05 HA、NA和M1基因的生成
下列多肽衍生自与印度尼西亚/5/05 HA基因相对应的密码子优化的核苷酸(见实施例31)。这些密码子优化的核苷酸是根据美国专利公布2005/0118191中(本文通过提述收录其全部内容用于所有目的)披露的方法设计和制备(Geneart GMBH，Regensburg，FRG)的。核酸序列见实施例31。
Vac2-hac-opt(未修饰的氨基酸序列)(SEQ ID 27)
MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE
KTHNGKLCDL DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFINVP EWSYIVEKAN
PTNDLCYPGS FNDYEELKHL LSRINHFEKI QIIPKSSWSD HEASSGVSSA
CPYLGSPSFF RNVVWLIKKN STYPTIKKSY NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA
AEQTRLYQNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG RMEFFWTILK
PNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI MKSELEYGNC NTKCQTPMGA
INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQRE SRRKKRGLFG
AIAGFIEGGW QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS
IIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN
ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMESIRN
GTYNYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA SSLALAIMMA
GLSLWMCSNG SLQCRICI＊
Vac2-hac-spc-opt(修饰的，信号肽来自几丁质酶，带下划线的)(SEQ ID 28)
Mplykllnvlwlvavsnaip DQICIGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE
KTHNGKLCDL DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFINVP EWSYIVEKAN
PTNDLCYPGS FNDYEELKHL LSRINHFEKI QIIPKSSWSD HEASSGVSSA
CPYLGSPSFF RNVVWLIKKN STYPTIKKSY NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA
AEQTRLYQNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG RMEFFWTILK
PNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI MKSELEYGNC NTKCQTPMGA
INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQRE SRRKKRGLFG
AIAGFIEGGW QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS
IIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN
ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMESIRN
GTYNYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA SSLALAIMMA
GLSLWMCSNG SLQCRICI＊
Vac2-hac-sph9-opt(修饰的，信号肽来自H9，带下划线的)(SEQ ID 29)
METISLITIL LVVTASNA DQICIGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE
KTHNGKLCDL DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFINVP EWSYIVEKAN
PTNDLCYPGS FNDYEELKHL LSRINHFEKI QIIPKSSWSD HEASSGVSSA
CPYLGSPSFF RNVVWLIKKN STYPTIKKSY NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA
AEQTRLYQNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG RMEFFWTILK
PNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI MKSELEYGNC NTKCQTPMGA
INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQRE SRRKKRGLFG
AIAGFIEGGW QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS
IIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN
ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMESIRN
GTYNYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA SSLALAIMMA
GLSLWMCSNG SLQCRICI＊
Vac2-hac-cs-opt(-是修饰的剪切位点)(SEQ ID 30)
MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE
KTHNGKLCDL DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFINVP EWSYIVEKAN
PTNDLCYPGS FNDYEELKHL LSRINHFEKI QIIPKSSWSD HEASSGVSSA
CPYLGSPSFF RNVVWLIKKN STYPTIKKSY NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA
AEQTRLYQNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG RMEFFWTILK
PNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI MKSELEYGNC NTKCQTPMGA
INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQRE S----RGLFG
AIAGFIEGGW QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS
IIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN
ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMESIRN
GTYNYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA SSLALAIMMA
GLSLWMCSNG SLQCRICI＊
下面的多肽对应于也被合成的未修饰、密码子优化的NA和M1基因。
Vac2-naj-opt(神经氨酸酶)(SEQ ID 31)
MNPNQKIITI GSICMVIGIV SLMLQIGNMI SIWVSHSIQT GNQHQAESIS
NTNPLTEKAV ASVTLAGNSS LCPIRGWAVH SKDNNIRIGS KGDVFVIREP
FISCSHLECR TFFLTQGALL NDKHSNGTVK DRSPHRTLMS CPVGEAPSPY
NSRFESVAWS ASACHDGTSW LTIGISGPDN EAVAVLKYNG IITDTIKSWR
NNILRTQESE CACVNGSCFT VMTDGPSDGQ ASYKIFKMEK GKVVKSVELD
APNYHYEECS CYPDAGEITC VCRDNWHGSN RPWVSFNQNL EYQIGYICSG
VFGDNPRPND GTGSCGPMSP NGAYGVKGFS FKYGNGVWIG RTKSTNSRSG
FEMIWDPNGW TGTDSSFSVK QDIVAITDWS GYSGSFVQHP ELTGLDCIRP
CFWVELIRGR PKESTIWTSG SSISFCGVNS DTVSWSWPDG AELPFTIDK＊
Vac2-mc-opt(基质)(SEQ ID 32)
MSLLTEVETY VLSIIPSGPL KAEIAQKLED VFAGKNTDLE ALMEWLKTRP
ILSPLTKGIL GFVFTLTVPS ERGLQRRRFV QNALNGNGDP NNMDRAVKLY
KKLKREITFH GAKEVSLSYS TGALASCMGL IYNRMGTVTT EVAFGLVCAT
CEQIADSQHR SHRQMATITN PLIRHENRMV LASTTAKAME QMAGSSEQAA
EAMEVANQAR QMVQAMRTIG THPNSSAGLR DNLLENLQAY QKRMGVQMQR
FK＊
如上所述，利用BamHI和HindIII位点将合成的密码子优化HA、NA和M1基因亚克隆到pFastBac1转移载体中。如上所述使用大肠杆菌DH10Bac株(Invitrogen)生成用于在Sf9细胞中表达合成HA、NA和M1基因的重组杆粒。
实施例24
进化枝1甲型/越南/1203/04(H5N1)流感病毒的RT-PCR克隆
根据上文所述的方法通过RT-PCR克隆HA、NA和M1基因。下面的序列是公开的基因与克隆的基因的比较。
进化枝1甲型/越南/1203/04(H5N1)的HA基因
上道：Acc#AY818135 HA基因(SEQ ID 36)
下道：Novavax的甲型/越南/1203/2004(H5N1)HA基因(SEQ ID 37)
  1 ........................................ATGGAGAAAA 10
                                            ||||||||||
301 AGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTAGGCGCGCCATGGAGAAAA 350
             .         .         .         .         .
 11 TAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGC 60
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
351 TAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGC 400
             .         .         .         .         .
 61 ATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGA 110
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
401 ATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGA 450
             .         .         .         .         .
111 AAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACA 160
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
451 AAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACA 500
             .         .         .         .         .
161 ACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTGAGAGAT 210
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
501 ACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTGAGAGAT 550
             .         .         .         .         .
211 TGTAGCGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCAT 260
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
551 TGTAGCGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCAT 600
             .         .         .         .         .
261 CAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAATG 310
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
601 CAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAATG 650
             .         .         .         .         .
311 ACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTA 360
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
651 ACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTA 700
             .         .         .         .         .
361 TTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTC 410
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
701 TTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTC 750
             .         .         .         .         .
411 TTGGTCCAGTCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACC 460
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
751 TTGGTCCAGTCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACC 800
             .         .         .         .         .
461 AGGGAAAGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAAC 510
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
801 AGGGAAAGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAAC 850
             .         .         .         .         .
511 AGTACATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGA 560
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
851 AGTACATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGA 900
             .         .         .         .         .
561 TCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGA 610
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
901 TCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGA 950
             .         .         .         .         .
611 CAAAGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCGTTGGGACATCAACA 660
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
951 CAAAGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCGTTGGGACATCAACA 1000
             .         .         .         .         .
              .         .         .         .         .
661  CTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGG 710
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1001 CTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGG 1050
              .         .         .         .         .
711  GCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATG 760
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1051 GCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATG 1100
              .         .         .         .         .
761  CAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATAC 810
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1101 CAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATAC 1150
              .         .         .         .         .
811  AAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATA 860
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1151 AAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATA 1200
              .         .         .         .         .
861  TGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTA 910
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1201 TGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTA 1250
              .         .         .         .         .
911  GCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAA 960
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1251 GCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAA 1300
              .         .         .         .         .
961  TATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCC 1010
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1301 TATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCC 1350
              .         .         .         .         .
1011 TCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAG 1060
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1351 TCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAG 1400
              .         .         .         .         .
1061 GTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTAC 1110
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1401 GTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTAC 1450
              .         .         .         .         .
1111 CACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCAC 1160
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1451 CACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCAC 1500
              .         .         .         .         .
1161 TCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACA 1210
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1501 TCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACA 1550
              .         .         .         .         .
1211 AAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAA 1260
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1551 AAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAA 1600
              .         .         .         .         .
1261 AGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGT 1310
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1601 AGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGT 1650
              .         .         .         .         .
1311 CTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTC 1360
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1651 CTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTC 1700
              .         .         .         .         .
1361 TAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTA 1410
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1701 TAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTA 1750
              .         .         .         .         .
1411 CAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTA 1460
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1751 CAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTA 1800
              .         .         .         .         .
1461 TCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATG 1510
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1801 TCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATG 1850
              .         .         .         .         .
1511 ACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGT 1560
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1851 ACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGT 1900
              .         .         .         .         .
1561 GGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTC 1610
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1901 GGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTC 1950
              .         .         .         .         .
1611 TACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCT 1660
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1951 TACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCT 2000
              .         .         .         .         .
1661 TATGGATGTGCTCCAATGGATCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA... 1707
     ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||
2001 TATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAAGCG 2050
NA基因的比较
进化枝1甲型/越南/1203/04(H5N1)NA基因(SEQ ID NO：39)
H5N1naLANL ISDN 38704x NA_Viet1203_Lark(NVAX)(SEQ ID 38)
             .         .         .         .         .
1   .....ATGAATCCAAATCAGAAGATAATAACCATCGGATCAATCTGTATG  45
         |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
451 CCGGGATGAATCCAAATCAGAAGATAATAACCATCGGATCAATCTGTATG  500
             .         .         .         .         .
46  GTAACTGGAATAGTTAGCTTAATGTTACAAATTGGGAACATGATCTCAAT  95
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
501 GTAACTGGAATAGTTAGCTTAATGTTACAAATTGGGAACATGATCTCAAT  550
             .         .         .         .         .
96  ATGGGTCAGTCATTCAATTCACACAGGGAATCAACACCAATCTGAACCAA  145
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
551 ATGGGTCAGTCATTCAATTCACACAGGGAATCAACACCAATCTGAACCAA  600
             .         .         .         .         .
146 TCAGCAATACTAATTTTCTTACTGAGAAAGCTGTGGCTTCAGTAAAATTA  195
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
601 TCAGCAATACTAATTTTCTTACTGAGAAAGCTGTGGCTTCAGTAAAATTA  650
             .         .         .         .         .
196 GCGGGCAATTCATCTCTTTGCCCCATTAACGGATGGGCTGTATACAGTAA  245
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
651 GCGGGCAATTCATCTCTTTGCCCCATTAACGGATGGGCTGTATACAGTAA  700
             .         .         .         .         .
246 GGACAACAGTATAAGGATCGGTTCCAAGGGGGATGTGTTTGTTATAAGAG  295
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
701 GGACAACAGTATAAGGATCGGTTCCAAGGGGGATGTGTTTGTTATAAGAG  750
             .         .         .         .         .
296 AGCCGTTCATCTCATGCTCCCACTTGGAATGCAGAACTTTCTTTTTGACT  345
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
751 AGCCGTTCATCTCATGCTCCCACTTGGAATGCAGAACTTTCTTTTTGACT  800
             .         .         .         .         .
346 CAGGGAGCCTTGCTGAATGACAAGCACTCCAATGGGACTGTCAAAGACAG  395
    |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
801 CAGGGAGCCTCGCTGAATGACAAGCACTCCAATGGGACTGTCAAAGACAG  850
             .         .         .         .         .
396 AAGCCCTCACAGAACATTAATGAGTTGTCCTGTGGGTGAGGCTCCCTCCC  445
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
851 AAGCCCTCACAGAACATTAATGAGTTGTCCTGTGGGTGAGGCTCCCTCCC  900
             .         .         .         .         .
446 CATATAACTCAAGGTTTGAGTCTGTTGCTTGGTCAGCAAGTGCTTGCCAT  495
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
901 CATATAACTCAAGGTTTGAGTCTGTTGCTTGGTCAGCAAGTGCTTGCCAT  950
             .         .         .         .         .
496 GATGGCACCAGTTGGTTGACGATTGGAATTTCTGGCCCAGACAATGGGGC  545
    ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
951 GATGGCACCAGTTGGTTGACGATTGGAATTTCTGGCCCAGACAATGGGGC  1000
              .         .         .         .         .
546  TGTGGCTGTATTGAAATACAATGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTT 595
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1001 TGTGGCTGTATTGAAATACAATGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTT 1050
              .         .         .         .         .
596  GGAGGAACAACATACTGAGAACTCAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAAT 645
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1051 GGAGGAACAACATACTGAGAACTCAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAAT 1100
              .         .         .         .         .
646  GGCTCTTGCTTTACTGTAATGACTGACGGACCAAGTAATGGTCAGGCATC 695
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1101 GGCTCTTGCTTTACTGTAATGACTGACGGACCAAGTAATGGTCAGGCATC 1150
              .         .         .         .         .
696  ACATAAGATCTTCAAAATGGAAAAAGGGAAAGTGGTTAAATCAGTCGAAT 745
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1151 ACATAAGATCTTCAAAATGGAAAAAGGGAAAGTGGTTAAATCAGTCGAAT 1200
              .         .         .         .         .
746  TGGATGCTCCTAATTATCACTATGAGGAATGCTCCTGTTATCCTAATGCC 795
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1201 TGGATGCTCCTAATTATCACTATGAGGAATGCTCCTGTTATCCTAATGCC 1250
              .         .         .         .         .
796  GGAGAAATCACATGTGTGTGCAGGGATAATTGGCATGGCTCAAATCGGCC 845
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1251 GGAGAAATCACATGTGTGTGCAGGGATAATTGGCATGGCTCAAATCGGCC 1300
              .         .         .         .         .
846  ATGGGTATCTTTCAATCAAAATTTGGAGTATCAAATAGGATATATATGCA 895
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1301 ATGGGTATCTTTCAATCAAAATTTGGAGTATCAAATAGGATATATATGCA 1350
              .         .         .         .         .
896  GTGGAGTTTTCGGAGACAATCCACGCCCCAATGATGGAACAGGTAGTTGT 945
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1351 GTGGAGTTTTCGGAGACAATCCACGCCCCAATGATGGAACAGGTAGTTGT 1400
              .         .         .         .         .
946  GGTCCGGTGTCCTCTAACGGGGCATATGGGGTAAAAGGGTTTTCATTTAA 995
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1401 GGTCCGGTGTCCTCTAACGGGGCATATGGGGTAAAAGGGTTTTCATTTAA 1450
              .         .         .         .         .
996  ATACGGCAATGGTGTCTGGATCGGGAGAACCAAAAGCACTAATTCCAGGA 1045
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1451 ATACGGCAATGGTGTCTGGATCGGGAGAACCAAAAGCACTAATTCCAGGA 1500
              .         .         .         .         .
1046 GCGGCTTTGAAATGATTTGGGATCCAAATGGGTGGACTGAAACGGACAGT 1095
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1501 GCGGCTTTGAAATGATTTGGGATCCAAATGGGTGGACTGAAACGGACAGT 1550
              .         .         .         .         .
1096 AGCTTTTCAGTGAAACAAGATATCGTAGCAATAACTGATTGGTCAGGATA 1145
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1551 AGCTTTTCAGTGAAACAAGATATCGTAGCAATAACTGATTGGTCAGGATA 1600
              .         .         .         .         .
1146 TAGCGGGAGTTTTGTCCAGCATCCAGAACTGACAGGACTAGATTGCATAA 1195
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1601 TAGCGGGAGTTTTGTCCAGCATCCAGAACTGACAGGACTAGATTGCATAA 1650
              .         .         .         .         .
1196 GACCTTGTTTCTGGGTTGAGTTGATCAGAGGGCGGCCCAAAGAGAGCACA 1245
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1651 GACCTTGTTTCTGGGTTGAGTTGATCAGAGGGCGGCCCAAAGAGAGCACA 1700
              .         .         .         .         .
1246 ATTTGGACTAGTGGGAGCAGCATATCTTTTTGTGGTGTAAATAGTGACAC 1295
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1701 ATTTGGACTAGTGGGAGCAGCATATCTTTTTGTGGTGTAAATAGTGACAC 1750
              .         .         .         .         .
1296 TGTGGGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCCGAGTTGCCATTCACCATTGACA 1345
     ||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||
1751 TGTGGGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTCACCATTGACA 1800
              .         .         .         .         .
1346 AGTAG............................................. 1350
     |||||
1801 AGTAGGGGCCCTCGAGTAAGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTAC 1850
M1基因的比较
进化枝1甲型/越南/1203/04(H5N1)M1基因(SEQ ID NO：40)
H5N1m1LanlISDN39958x M1_Viet1203_Lark(NVAX)(SEQ ID 41)
              .         .         .         .         .
1    ..................................ATGAGTCTTCTAACCG 16
                                       ||||||||||||||||
301  ATATCTGCAGAATTCGCCCTTAGAATTCGACGTCATGAGTCTTCTAACCG 350
              .         .         .         .         .
17   AGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCC 66
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
351  AGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCC 400
              .         .         .         .         .
67   GAGATCGCACAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCT 116
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
401  GAGATCGCACAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCT 450
              .         .         .         .         .
117  CGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA 166
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
451  CGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA 500
              .         .         .         .         .
167  CTAAAGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGA 216
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
501  CTAAAGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGA 550
              .         .         .         .         .
217  GGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAGAATGCCCTAAATGGAAATGGAGA 266
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
551  GGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAGAATGCCCTAAATGGAAATGGAGA 600
              .         .         .         .         .
267  TCCAAATAATATGGATAGGGCAGTTAAGCTATATAAGAAGCTGAAAAGAG 316
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
601  TCCAAATAATATGGATAGGGCAGTTAAGCTATATAAGAAGCTGAAAAGAG 650
              .         .         .         .         .
317  AAATAACATTCCATGGGGCTAAGGAGGTCGCACTCAGCTACTCAACCGGT 366
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
651  AAATAACATTCCATGGGGCTAAGGAGGTCGCACTCAGCTACTCAACCGGT 700
              .         .         .         .         .
367  GCACTTGCCAGTTGCATGGGTCTCATATACAACAGGATGGGAACGGTGAC 416
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
701  GCACTTGCCAGTTGCATGGGTCTCATATACAACAGGATGGGAACGGTGAC 750
              .         .         .         .         .
417  TACGGAAGTGGCTTTTGGCCTAGTGTGTGCCACTTGTGAGCAGATTGCAG 466
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
751  TACGGAAGTGGCTTTTGGCCTAGTGTGTGCCACTTGTGAGCAGATTGCAG 800
              .         .         .         .         .
467  ATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCAACTATCACCAACCCACTA 516
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
801  ATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCAACTATCACCAACCCACTA 850
              .         .         .         .         .
517  ATCAGACATGAGAACAGAATGGTGCTGGCCAGCACTACAGCTAAGGCTAT 566
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
851  ATCAGACATGAGAACAGAATGGTGCTGGCCAGCACTACAGCTAAGGCTAT 900
              .         .         .         .         .
567  GGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGAGCAGGCAGCGGAAGCCATGGAGATCG 616
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
901  GGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGAGCAGGCAGCGGAAGCCATGGAGATCG 950
              .         .         .         .         .
617  CTAATCAGGCTAGGCAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGGACTCAT 666
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
951  CTAATCAGGCTAGGCAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGGACTCAT 1000
              .         .         .         .         .
667  CCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGAGATAATCTTCTTGAAAATTTGCAGGC 716
     ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1001 CCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGAGATAATCTTCTTGAAAATTTGCAGGC 1050
              .         .         .         .
717  CTACCAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGA
     |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1051 CTACCAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGA
所有序列均根据上文公开的方法克隆和分析。
实施例25
在Sf9细胞中高效表达的优化进化枝1 H5N1流感甲型/越南/1203/04HA、NA和M1基因的生成
下面的多肽衍生自对应于甲型/越南/1203/04的密码子优化的核苷酸。这些核苷酸是如上文所公开的(见实施例24)设计和合成的(Geneart GMBH，Regensburg，FRG)。
VN1203-ha-cs-opt(修饰的剪切位点，加下划线的)(SEQ ID 33)
MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH
AQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPA
NDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFF
RNVVWLIKKNNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGT
STLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKG
DSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLR
NSPQRET----RGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAID
GVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN
ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQY
SEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRI
CI＊
VN1203-ha-spc-opt(修饰的信号肽，加下划线的)(SEQ ID 34)
Mplykllnvlwlvavsnaip DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH
AQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPA
NDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFF
RNVVWLIKKNNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGT
STLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKG
DSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLR
NSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAID
GVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN
ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQY
SEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRI
CI＊
VN1203-ha-sph9-opt(信号肽和剪切位点带阴影)(SEQ ID 35)
METISLITIL LVVTASNA DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH
AQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPA
NDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFF
RNVVWLIKKNNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGT
STLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKG
DSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFMNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLR
NSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAID
GVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN
ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQY
SEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRI
CI＊
实施例26
H5N1越南/1203/2003 VLP免疫原性(极限剂量节制)
以很低的VLP剂量(0.2、0.04、0.008、0.0016μg HA/剂)给BALB/C小鼠肌肉内和鼻内免疫H5N1 VLP，在第0、21和35天对小鼠取血。在第21天给小鼠加强免疫。对血清使用火鸡红细胞进行凝血抑制测定(HI)检测抗HA抗体，并使用ELISA检测流感病毒。该研究的结果示于图24和25。
这些结果表明，当以很低的剂量肌肉内施用VLP时，观察到了强健的总体免疫应答。在3.0和0.6μg HA/剂，应答的强健性与对照相似。这些结果显示了真实的剂量应答，而且针对0.2μg VLP的抗体应答大于3.0μg的rHA蛋白。虽然鼻内施用的应答没有那么强健，但0.2μg HA/剂的VLP剂量确实诱发了强健的应答。本实验中0.2μg剂量的ELISA效价与先前实验中0.12μg剂量的H3N2 VLP疫苗相似，见上文。
实施例27
攻击研究
以3μg、0.6μg、0.12μg和0.02μg H3N2 VLP(总HA剂量)的浓度给BALB/c小鼠肌肉内和鼻内接种VLP，然后用流感病毒甲型/Aichi/268x31对小鼠攻击。该研究的结果如图27和28所示。这些结果显示，在所有被接种动物中均有体重减少，但是在肌肉内和鼻内接种中，接种3.0μg和0.12μgVLP的动物均比其它动物恢复得快。鼻内剂量提供了更强的保护。
实施例29
攻击研究(雪貂)
在该研究中，给雪貂接种H9N2 VLP。该攻击研究中总共有18只雪貂：6只接受模拟物，6只接受中等剂量(1.5μg)，6只接受高剂量(15.0μg)，均为肌肉内接种。然后，用106 EID50的甲型/香港/1073/99对雪貂鼻内攻击。在第1、3、5和7天收集鼻冲洗物。对所有动物在第3、5和7天确定鼻冲洗物中的病毒效价。这些数据示于表2和图29。这些数据显示到第7天为止，所有被接种的动物在鼻冲洗物中均没有可检测到的病毒，而模拟组具有可检测到的病毒效价。
表2：经过病毒攻击后雪貂中的野生型病毒效价(log 10/ml)
Figure A20068004585000781
Figure A20068004585000791
组：低剂量
  雪貂   第3天   第5天  第7天
  391639173918391939203921   6.757.57.55.56.756.5   2.755.56.532.253.5  1.51.51.51.51.51.5
  平均   6.75   3.916667  1.5
  标准偏差   0.74162   1.693123  0
组：高剂量
  雪貂   第3天   第5天  第7天
  392239233924392539263927   6.56.255.756.56.255.75   2.753.751.54.753.51.5  1.51.51.51.51.51.5
  平均   6.166667   2.958333  1.5
  标准偏差   0.341565   1.298236  0
实施例30
小鼠肌肉内和鼻内接种研究
在第0天给小鼠肌肉内或鼻内接种3μg、0.6μg、0.12μg或0.024μg(总HA剂量)浓度的甲型/福建/411/2002(H3N2)VLP，3周后加强免疫。对照小鼠接种福尔马林灭活的甲型怀俄明(福建样，疫苗株)或PBS。第0、3、5和8周从经接种的小鼠收集血清。对收集的血清通过凝血抑制测定(HI)分析抗HA抗体，用ELISA分析抗流感抗体。该测定使用H3N2的甲型/福建/411/2002、甲型/巴拿马/2007/99、甲型/怀俄明/3/03和甲型/纽约/55/2004流感病毒株。该研究的结果示于图30A-H。这些结果表明H3N2 VLP诱发了针对亲本甲型/福建/411/2002流感病毒株的抗体和针对其它H3N2株的抗体。这些结果还表明，鼻内接种的小鼠中效价的上升较肌肉内接种的小鼠晚。但是，在大约8周后，鼻内的效价高于肌肉内的效价。此外，在肌肉内接种后，针对灭活病毒抗原的效价似乎与相当剂量的VLP相近。然而，灭活抗原在鼻内接种后似乎没有那么高的免疫原性，而且鼻内接种后也没有那么宽的保护性。
实施例31
用于在Sf9细胞中高效表达的优化进化枝2H5N1流感HA、NA和M1基因的产生
下面的优化核苷酸和多肽对应于进化枝2H5N1病毒甲型/印度尼西亚/5/05、甲型/斑头雁/青海/1A/2005和甲型/安徽/1/2005的HA、NA和M1，它们是如上文公开的那样设计和合成的(Geneart GMBH，Regensburg，FRG)。经过优化的核苷酸和多肽如下列出。为了制备VLP，可以将甲型/安徽HA与甲型/印度尼西亚NA和M1一起表达。为了制备含有甲型/青海HA和NA的VLP，可以将甲型/印度尼西亚M1基因与甲型/青海HA和NA共表达。
甲型/印度尼西亚/5/05
甲型/印度尼西亚优化的HA(起始和终止密码子加有下划线)(SEQ ID 42)
GGTACCGGATCCGCCACCATGGAGAAGATCGTGCTGCTGCTGGCTATCGTGTCCCTGGTG
AAGTCCGACCAGATCTGCATCGGTTACCACGCTAACAACTCCACCGAGCAGGTGGACACC
ATCATGGAGAAGAACGTCACCGTGACCCACGCTCAGGACATCCTCGAAAAGACCCACAAC
GGCAAGCTGTGCGACCTGGACGGTGTCAAGCCCCTGATCCTGCGTGACTGCTCCGTGGCT
GGTTGGCTGCTGGGTAACCCCATGTGCGACGAGTTCATCAACGTGCCCGAGTGGTCCTAC
ATCGTGGAGAAGGCTAACCCCACCAACGACCTGTGCTACCCCGGTTCCTTCAACGACTAC
GAGGAGCTGAAGCACCTGCTGTCCCGTATCAACCACTTCGAGAAGATCCAGATCATCCCC
AAGTCCTCTTGGTCCGACCACGAGGCTTCCTCCGGTGTCTCCTCCGCTTGCCCCTACCTG
GGTTCCCCCTCCTTCTTCCGTAACGTGGTGTGGCTGATCAAGAAGAACTCCACCTACCCC
ACCATCAAGAAGTCCTACAACAACACCAACCAGGAGGACCTGCTGGTCCTGTGGGGTATC
CACCACCCCAACGACGCTGCCGAGCAGACCCGTCTGTACCAGAACCCCACCACCTACATC
TCCATCGGCACCTCCACCCTGAACCAGCGTCTGGTGCCCAAGATCGCTACCCGTTCCAAG
GTGAACGGCCAGTCCGGTCGTATGGAGTTCTTCTGGACCATCCTGAAGCCTAACGACGCT
ATCAACTTCGAGTCCAACGGCAACTTCATCGCTCCCGAGTACGCTTACAAGATCGTGAAG
AAGGGCGACTCCGCTATCATGAAGTCCGAGCTGGAGTACGGTAACTGCAACACCAAGTGC
CAGACCCCCATGGGTGCTATCAACTCCTCCATGCCCTTCCACAACATCCACCCCCTGACC
ATCGGCGAGTGCCCCAAGTACGTGAAGTCCAACCGTCTGGTGCTGGCTACCGGTCTGCGT
AACTCCCCCCAGCGCGAGTCCCGTCGTAAGAAGCGTGGTCTGTTCGGCGCTATCGCTGGT
TTCATCGAGGGCGGTTGGCAGGGCATGGTGGACGGATGGTACGGTTACCACCACTCTAAC
GAGCAGGGTTCCGGTTACGCTGCTGACAAGGAGTCCACCCAGAAGGCTATCGACGGCGTC
ACCAACAAGGTGAACTCCATCATCGACAAGATGAACACCCAGTTCGAGGCTGTGGGTCGT
GAGTTCAACAACCTCGAGCGTCGTATCGAGAACCTGAACAAGAAGATGGAGGACGGTTTC
CTGGACGTGTGGACCTACAACGCCGAGCTGCTGGTGCTGATGGAGAACGAGCGTAGCCTG
GACTTCCACGACTCCAACGTGAAGAACCTGTACGACAAGGTCCGCCTGCAGCTGCGTGAC
AACGCTAAGGAGCTGGGTAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACGAGTGC
ATGGAGTCCATCCGTAACGGCACCTACAACTACCCCCAGTACTCCGAGGAGGCTCGTCTG
AAGCGTGAGGAGATCTCCGGCGTGAAGCTCGAGTCCATCGGAACCTACCAGATCCTGTCC
ATCTACTCCACCGTGGCTTCCTCCCTGGCTCTGGCTATCATGATGGCTGGTCTGTCCCTG
TGGATGTGCTCCAACGGTTCCCTGCAGTGCCGTATCTGCATCTAATGAAAGCTTGAGCTC
甲型/印度尼西亚HA蛋白序列(SEQ ID NO：43)
MEKIVLLLAI   VSLVKSDQIC   IGYHANNSTE   QVDTIMEKNV   TVTHAQDILE
KTHNGKLCDL   DGVKPLILRD   CSVAGWLLGN   PMCDEFINVP   EWSYIVEKAN
PTNDLCYPGS   FNDYEELKHL   LSRINHFEKI   QIIPKSSWSD   HEASSGVSSA
CPYLGSPSFF   RNVVWLIKKN   STYPTIKKSY   NNTNQEDLLV   LWGIHHPNDA
AEQTRLYQNP   TTYISIGTST   LNQRLVPKIA   TRSKVNGQSG   RMEFFWTILK
PNDAINFESN   GNFIAPEYAY   KIVKKGDSAI   MKSELEYGNC   NTKCQTPMGA
INSSMPFHNI   HPLTIGECPK   YVKSNRLVLA   TGLRNSPQRE   SRRKKRGLFG
AIAGFIEGGW   QGMVDGWYGY   HHSNEQGSGY   AADKESTQKA   IDGVTNKVNS
IIDKMNTQFE   AVGREFNNLE   RRIENLNKKM   EDGFLDVWTY   NAELLVLMEN
ERTLDFHDSN   VKNLYDKVRL   QLRDNAKELG   NGCFEFYHKC   DNECMESIRN
GTYNYPQYSE   EARLKREEIS   GVKLESIGTY   QILSIYSTVA   SSLALAIMMA
GLSLWMCSNG   SLQCRICI
甲型/印度尼西亚优化的HA(删除了剪切位点)
(起始和终止密码子加有下划线)(SEQ ID NO：44)
GGATCCGCCACCATGGAGAAGATCGTGCTGCTGCTGGCTATCGTGTCCCTGGTGAAGTCC
GACCAGATCTGCATCGGTTACCACGCTAACAACTCCACCGAGCAGGTGGACACCATCATG
GAGAAGAACGTCACCGTGACCCACGCTCAGGACATCCTCGAAAAGACCCACAACGGCAAG
CTGTGCGACCTGGACGGTGTCAAGCCCCTGATCCTGCGTGACTGCTCCGTGGCTGGTTGG
CTGCTGGGTAACCCCATGTGCGACGAGTTCATCAACGTGCCCGAGTGGTCCTACATCGTG
GAGAAGGCTAACCCCACCAACGACCTGTGCTACCCCGGTTCCTTCAACGACTACGAGGAG
CTGAAGCACCTGCTGTCCCGTATCAACCACTTCGAGAAGATCCAGATCATCCCCAAGTCC
TCTTGGTCCGACCACGAGGCTTCCTCCGGTGTCTCCTCCGCTTGCCCCTACCTGGGTTCC
CCCTCCTTCTTCCGTAACGTGGTGTGGCTGATCAAGAAGAACTCCACCTACCCCACCATC
AAGAAGTCCTACAACAACACCAACCAGGAGGACCTGCTGGTCCTGTGGGGTATCCACCAC
CCCAACGACGCTGCCGAGCAGACCCGTCTGTACCAGAACCCCACCACCTACATCTCCATC
GGCACCTCCACCCTGAACCAGCGTCTGGTGCCCAAGATCGCTACCCGTTCCAAGGTGAAC
GGCCAGTCCGGTCGTATGGAGTTCTTCTGGACCATCCTGAAGCCTAACGACGCTATCAAC
TTCGAGTCCAACGGCAACTTCATCGCTCCCGAGTACGCTTACAAGATCGTGAAGAAGGGC
GACTCCGCTATCATGAAGTCCGAGCTGGAGTACGGTAACTGCAACACCAAGTGCCAGACC
CCCATGGGTGCTATCAACTCCTCCATGCCCTTCCACAACATCCACCCCCTGACCATCGGC
GAGTGCCCCAAGTACGTGAAGTCCAACCGTCTGGTGCTGGCTACCGGTCTGCGTAACTCC
CCCCAGCGCGAGTCCCGTGGTCTGTTCGGCGCTATCGCTGGTTTCATCGAGGGCGGTTGG
CAGGGCATGGTGGACGGATGGTACGGTTACCACCACTCTAACGAGCAGGGTTCCGGTTAC
GCTGCTGACAAGGAGTCCACCCAGAAGGCTATCGACGGCGTCACCAACAAGGTGAACTCC
ATCATCGACAAGATGAACACCCAGTTCGAGGCTGTGGGTCGTGAGTTCAACAACCTCGAG
CGTCGTATCGAGAACCTGAACAAGAAGATGGAGGACGGTTTCCTGGACGTGTGGACCTAC
AACGCCGAGCTGCTGGTGCTGATGGAGAACGAGCGTACCCTGGACTTCCACGACTCCAAC
GTGAAGAACCTGTACGACAAGGTCCGCCTGCAGCTGCGTGACAACGCTAAGGAGCTGGGT
AACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACGAGTGCATGGAGTCCATCCGTAAC
GGCACCTACAACTACCCCCAGTACTCCGAGGAGGCTCGTCTGAAGCGTGAGGAGATCTCC
GGCGTGAAGCTCGAGTCCATCGGAACCTACCAGATCCTGTCCATCTACTCCACCGTGGCT
TCCTCCCTGGCTCTGGCTATCATGATGGCTGGTCTGTCCCTGTGGATGTGCTCCAACGGT
TCCCTGCAGTGCCGTATCTGCATCTAATGAAAGCTT
甲型/印度尼西亚HA蛋白序列(SEQ ID NO：45)
MEKIVLLLAI   VSLVKSDQIC   IGYHANNSTE   QVDTIMEKNV   TVTHAQDILE
KTHNGKLCDL   DGVKPLILRD   CSVAGWLLGN   PMCDEFINVP   EWSYIVEKAN
PTNDLCYPGS   FNDYEELKHL   LSRINHFEKI   QIIPKSSWSD   HEASSGVSSA
CPYLGSPSFF   RNVVWLIKKN   STYPTIKKSY   NNTNQEDLLV   LWGIHHPNDA
AEQTRLYQNP   TTYISIGTST   LNQRLVPKIA   TRSKVNGQSG   RMEFFWTILK
PNDAINFESN   GNFIAPEYAY   KIVKKGDSAI   MKSELEYGNC   NTKCQTPMGA
INSSMPFHNI   HPLTIGECPK   YVKSNRLVLA   TGLRNSPQRE   SRGLFGAIAG
FIEGGWQGMV   DGWYGYHHSN   EQGSGYAADK   ESTQKAIDGV   TNKVNSIIDK
MNTQFEAVGR   EFNNLERRIE   NLNKKMEDGF   LDVWTYNAEL   LVLMENERTL
DFHDSNVKNL   YDKVRLQLRD   NAKELGNGCF  EFYHKCDNEC   MESIRNGTYN
YPQYSEEARL   KREEISGVKL   ESIGTYQILS  IYSTVASSLA   LAIMMAGLSL
WMCSNGSLQC   RICI
甲型/印度尼西亚优化的NA(起始和终止密码子加有下划线)
(SEQ ID 46)
GGTACCGGATCCGCCACCATGAACCCCAACCAGAAGATCATCACCATCGGCTCCATCTGC
ATGGTGATCGGTATCGTGTCCCTGATGCTGCAGATCGGTAACATGATCTCCATCTGGGTG
TCCCACTCCATCCAGACCGGTAACCAGCACCAGGCTGAGTCCATCTCCAACACCAACCCC
CTGACCGAGAAGGCTGTGGCTTCCGTGACCCTGGCTGGTAACTCCTCCCTGTGCCCCATC
CGTGGTTGGGCTGTGCACTCCAAGGACAACAACATCCGCATCGGTTCCAAGGGTGACGTG
TTCGTGATCCGTGAGCCCTTCATCTCCTGCTCCCACCTCGAGTGCCGTACCTTCTTCCTG
ACCCAAGGTGCTCTGCTGAACGACAAGCACTCCAACGGCACCGTGAAGGACCGTTCCCCC
CACCGTACCCTGATGTCCTGCCCCGTGGGCGAGGCTCCCTCCCCCTACAACTCCCGTTTC
GAGTCCGTGGCTTGGTCCGCTTCCGCTTGCCACGACGGCACCTCTTGGCTGACCATCGGT
ATCTCCGGTCCCGACAACGAGGCTGTCGCTGTGCTGAAGTACAACGGCATCATCACCGAC
ACCATCAAGTCCTGGCGTAACAACATCCTGCGTACCCAGGAGTCCGAGTGCGCTTGCGTG
AACGGTTCCTGCTTCACCGTGATGACCGACGGTCCCTCCGACGGCCAGGCTTCCTACAAG
ATCTTCAAGATGGAGAAGGGCAAGGTGGTGAAGTCCGTGGAGCTGGACGCTCCCAACTAC
CACTACGAGGAGTGCTCTTGCTACCCCGACGCTGGCGAGATCACCTGCGTGTGCCGTGAC
AACTGGCACGGTTCCAACCGTCCCTGGGTGTCCTTCAACCAGAACCTCGAGTACCAGATC
GGTTACATCTGCTCCGGCGTGTTCGGTGACAACCCCCGTCCCAACGACGGAACCGGTTCC
TGCGGTCCCATGTCCCCCAACGGTGCTTACGGTGTCAAGGGCTTCTCCTTCAAGTACGGT
AACGGTGTCTGGATCGGTCGTACCAAGTCCACCAACTCCCGCTCCGGTTTCGAGATGATC
TGGGACCCCAACGGTTGGACCGGCACCGACTCTTCCTTCTCCGTGAAGCAGGACATCGTG
GCTATCACCGACTGGTCCGGTTACTCCGGTTCCTTCGTGCAGCACCCCGAGCTGACCGGT
CTGGACTGCATTCGTCCCTGCTTCTGGGTGGAGCTGATCCGTGGTCGTCCCAAGGAGTCC
ACCATCTGGACCTCCGGCTCCTCCATCTCTTTCTGCGGTGTGAACTCCGACACCGTGTCC
TGGTCCTGGCCCGACGGTGCCGAGCTGCCCTTCACCATCGACAAGTAATGAAAGCTTGAG
CTC
甲型/印度尼西亚NA蛋白序列(SEQ ID 47)
MNPNQKIITI   GSICMVIGIV   SLMLQIGNMI   SIWVSHSIQT   GNQHQAESIS
NTNPLTEKAV   ASVTLAGNSS   LCPIRGWAVH   SKDNNIRIGS   KGDVFVIREP
FISCSHLECR   TFFLTQGALL   NDKHSNGTVK   DRSPHRTLMS   CPVGEAPSPY
NSRFESVAWS   ASACHDGTSW   LTIGISGPDN   EAVAVLKYNG   IITDTIKSWR
NNILRTQESE   CACVNGSCFT   VMTDGPSDGQ   ASYKIFKMEK   GKVVKSVELD
APNYHYEECS   CYPDAGEITC   VCRDNWHGSN   RPWVSFNQNL   EYQIGYICSG
VFGDNPRPND   GTGSCGPMSP   NGAYGVKGFS   FKYGNGVWIG   RTKSTNSRSG
FEMIWDPNGW   TGTDSSFSVK   QDIVAITDWS   GYSGSFVQHP   ELTGLDCIRP
CFWVELIRGR   PKESTIWTSG   SSISFCGVNS   DTVSWSWPDG   AELPFTIDK
甲型/印度尼西亚优化的M1(SEQ ID 48)
GGTACCGGATCCGCCACCATGTCCCTGCTGACCGAGGTGGAGACCTACGTGCTGTCCATC
ATCCCCTCCGGTCCTCTGAAGGCTGAGATCGCTCAGAAGCTCGAGGACGTTTTCGCTGGC
AAGAACACCGACCTCGAGGCTCTGATGGAGTGGCTCAAGACCCGTCCCATCCTGTCCCCC
CTGACCAAGGGTATCCTGGGTTTCGTGTTCACCCTGACCGTGCCCTCCGAGCGTGGTCTG
CAGCGTCGTCGTTTCGTGCAGAACGCTCTGAACGGTAACGGTGACCCCAACAACATGGAC
CGTGCTGTGAAGCTGTACAAGAAGCTGAAGCGCGAGATCACCTTCCACGGTGCTAAGGAG
GTGTCCCTGTCCTACTCCACCGGTGCTCTGGCTAGCTGCATGGGCCTGATCTACAACCGT
ATGGGCACCGTGACCACCGAGGTGGCCTTCGGTCTGGTCTGCGCTACCTGCGAGCAGATC
GCTGACTCCCAGCACCGTTCCCACCGTCAGATGGCTACCATCACCAACCCCCTGATCCGT
CACGAGAACCGTATGGTGCTGGCTTCCACCACCGCTAAGGCTATGGAGCAGATGGCTGGT
TCCTCCGAGCAGGCTGCTGAGGCCATGGAGGTGGCCAACCAGGCTCGTCAGATGGTGCAG
GCTATGCGTACCATCGGCACCCACCCCAACTCCTCCGCTGGTCTGCGTGACAACCTGCTC
GAGAACCTGCAGGCTTACCAGAAGCGTATGGGAGTCCAGATGCAGCGCTTCAAGTAATGA
AAGCTTGAGCTC
甲型/印度尼西亚M1蛋白序列(SEQ ID 49)
MSLLTEVETY VLSIIPSGPL  KAEIAQKLED   VFAGKNTDLE   ALMEWLKTRP
ILSPLTKGIL GFVFTLTVPS  ERGLQRRRFV   QNALNGNGDP   NNMDRAVKLY
KKLKREITFH GAKEVSLSYS  TGALASCMGL   IYNRMGTVTT   EVAFGLVCAT
CEQIADSQHR SHRQMATITN  PLIRHENRMV   LASTTAKAME   QMAGSSEQAA
EAMEVANQAR QMVQAMRTIG  THPNSSAGLR   DNLLENLQAY   QKRMGVQMQR
FK
甲型/安徽/1/2005
甲型/安徽优化的HA(起始和终止密码子加有下划线)(SEQ ID 50)
GGTACCGGATCCCTCGAGATGGAGAAGATCGTGCTGCTGCTGGCTATCGTGTCCCTGGTG
AAGTCCGACCAGATCTGCATCGGTTACCACGCTAACAACTCCACCGAGCAGGTGGACACC
ATCATGGAGAAGAACGTCACCGTGACCCACGCTCAGGACATCCTGGAAAAGACCCACAAC
GGCAAGCTGTGCGACCTGGACGGTGTCAAGCCCCTGATCCTGCGTGACTGCTCCGTGGCT
GGTTGGCTGCTGGGTAACCCCATGTGCGACGAGTTCATCAACGTGCCCGAGTGGTCCTAC
ATCGTGGAGAAGGCTAACCCCGCTAACGACCTGTGCTACCCCGGTAACTTCAACGACTAC
GAGGAGCTGAAGCACCTGCTGTCCCGTATCAACCACTTCGAGAAGATCCAGATCATCCCC
AAGTCCTCTTGGTCCGACCACGAGGCTTCCTCCGGTGTCTCCTCCGCTTGCCCATACCAG
GGCACCCCATCTTTCTTCCGTAACGTGGTGTGGCTGATCAAGAAGAACAACACCTACCCC
ACCATCAAGCGTTCCTACAACAACACCAACCAGGAGGACCTGCTGATCCTGTGGGGTATC
CACCACTCCAACGACGCTGCCGAGCAGACCAAGCTGTACCAGAACCCCACCACCTACATC
TCCGTGGGCACCTCCACCCTGAACCAGCGTCTGGTGCCCAAGATCGCTACCCGTTCCAAG
GTGAACGGCCAGTCCGGTCGTATGGACTTCTTCTGGACCATCCTGAAGCCTAACGACGCT
ATCAACTTCGAGTCCAACGGCAACTTCATCGCTCCCGAGTACGCTTACAAGATCGTGAAG
AAGGGCGACTCCGCTATCGTCAAGTCCGAGGTGGAGTACGGTAACTGCAACACCAAGTGC
CAGACCCCCATCGGTGCTATCAACTCCTCCATGCCCTTCCACAACATCCACCCCCTGACC
ATCGGCGAGTGCCCCAAGTACGTGAAGTCCAACAAGCTGGTGCTGGCTACCGGTCTGCGT
AACTCCCCCCTGCGTGAGCGTGGTCTGTTCGGCGCTATCGCTGGTTTCATCGAGGGCGGT
TGGCAGGGCATGGTGGACGGTTGGTACGGTTACCACCACAGCAACGAGCAGGGTTCCGGT
TACGCTGCTGACAAGGAGTCCACCCAGAAGGCTATCGACGGCGTCACCAACAAGGTGAAC
TCCATCATCGACAAGATGAACACCCAGTTCGAGGCTGTGGGTCGTGAGTTCAACAACCTG
GAGCGTCGTATCGAGAACCTGAACAAGAAGATGGAGGACGGTTTCCTGGACGTGTGGACC
TACAACGCCGAGCTGCTGGTGCTGATGGAGAACGAGCGTACCCTGGACTTCCACGACTCT
AACGTGAAGAACCTGTACGACAAGGTCCGCCTGCAGCTGCGTGACAACGCTAAGGAGCTG
GGTAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACGAGTGCATGGAGTCCGTGCGT
AACGGCACCTACGACTACCCCCAGTACTCCGAGGAGGCTCGTCTGAAGCGTGAGGAGATC
TCCGGCGTGAAGCTGGAGTCCATCGGCACCTACCAGATCCTGTCCATCTACTCCACCGTG
GCTTCCTCCCTGGCTCTGGCTATCATGGTGGCTGGTCTGTCCCTGTGGATGTGCTCCAAC
GGTTCCCTGCAGTGCCGTATCTGCATCTAATAATGAGGCGCGCCAAGCTTGAGCTC
甲型/安徽HA蛋白序列(SEQ ID 51)
MEKIVLLLAI   VSLVKSDQIC   IGYHANNSTE   QVDTIMEKNV   TVTHAQDILE
KTHNGKLCDL   DGVKPLILRD   CSVAGWLLGN   PMCDEFINVP   EWSYIVEKAN
PANDLCYPGN   FNDYEELKHL   LSRINHFEKI   QIIPKSSWSD   HEASSGVSSA
CPYQGTPSFF   RNVVWLIKKN   NTYPTIKRSY   NNTNQEDLLI   LWGIRHSNDA
AEQTKLYQNP   TTYISVGTST   LNQRLVPKIA   TRSKVNGQSG   RMDFFWTILK
PNDAINFESN   GNFIAPEYAY   KIVKKGDSAI   VKSEVEYGNC   NTKCQTPIGA
INSSMPFHNI   HPLTIGECPK   YVKSNKLVLA   TGLRNSPLRE   RGLFGAIAGF
IEGGWQGMVD   GWYGYHHSNE   QGSGYAADKE   STQKAIDGVT   NKVNSIIDKM
NTQFEAVGRE   FNNLERRIEN   LNKKMEDGFL   DVWTYNAELL   VLMENERTLD
FHDSNVKNLY   DKVRLQLRDN   AKELGNGCFE   FYHKCDNECM   ESVRNGTYDY
PQYSEEARLK   REEISGVKLE   SIGTYQILSI   YSTVASSLAL   AIMVAGLSLW
MCSNGSLQCR   ICI
甲型/斑头雁/青海/1A/2005
甲型/青海优化的HA(起始和终止密码子加有下划线)(SEQ ID 52)
CGGGCGCGGAGCGGCCGCATGGAGAAGATCGTGCTGCTGCTGGCTATCGTGTCTCTGGTCAAGTCCGACCAGATCTGCA
TCGGTTACCACGCTAACAACTCCACCGAGCAGGTGGACACCATCATGGAGAAGAACGTCACCGTGACCCACGCTCAGGA
CATCCTCGAAAAGACCCACAACGGCAAGCTGTGCGACCTGGACGGCGTGAAGCCCCTGATCCTGCGTGACTGCTCCGTG
GCTGGTTGGCTGCTGGGTAACCCCATGTGCGACGAGTTCCTCAACGTGCCCGAGTGGTCCTACATCGTGGAGAAGATCA
ACCCCGCTAACGACCTGTGCTACCCCGGTAACTTCAACGACTACGAGGAGCTGAAGCACCTGCTGTCCCGTATCAACCA
CTTCGAGAAGATCCAGATCATCCCCAAGTCCTCTTGGTCCGACCACGAGGCTTCCTCCGGTGTCTCCTCCGCTTGCCCA
TACCAGGGCCGTTCTTCCTTCTTCCGCAACGTGGTGTGGCTGATCAAGAAGAACAACGCCTACCCCACCATCAAGCGTT
CCTACAACAACACCAACCAGGAGGACCTGCTGGTCCTGTGGGGTATCCACCACCCCAACGACGCTGCCGAGCAGACCCG
TCTGTACCAGAACCCCACCACCTACATCTCCGTGGGCACCTCTACCCTGAACCAGCGTCTGGTGCCCAAGATCGCTACC
CGTTCCAAGGTGAACGGCCAGTCCGGTCGTATGGAGTTCTTCTGGACCATCCTGAAGCCTAACGACGCTATCAACTTCG
AGTCCAACGGCAACTTCATCGCTCCCGAGAACGCTTACAAGATCGTGAAGAAGGGCGACTCCACCATCATGAAGTCCGA
GCTGGAGTACGGCAACTGCAACACTAAGTGCCAGACCCCCATCGGTGCTATCAACTCCTCCATGCCCTTCCACAACATC
CACCCCCTGACTATCGGCGAGTGCCCCAAGTACGTGAAGTCCAACCGTCTGGTGCTGGCTACCGGTCTGCGTAACTCCC
CCCAGATCGAGACTCGTGGTCTGTTCGGCGCTATCGCTGGTTTCATCGAGGGCGGTTGGCAGGGCATGGTGGACGGTTG
GTACGGTTACCACCACTCTAACGAGCAGGGTTCCGGTTACGCTGCTGACAAGGAGTCTACCCAGAAGGCTATCGACGGC
GTCACCAACAAGGTGAACTCCATCATCGACAAGATGAACACCCAGTTCGAGGCTGTGGGTCGTGAGTTCAACAACCTCG
AACGTCGTATCGAGAACCTGAACAAGAAGATGGAGGACGGTTTCCTGGACGTGTGGACCTACAACGCCGAGCTGCTGGT
GCTGATGGAGAACGAGCGTACCCTGGACTTCCACGACTCCAACGTGAAGAACCTGTACGACAAGGTCCGCCTGCAGCTG
CGTGACAACGCTAAGGAGCTGGGTAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACCGTTGCGACAACGAGTGCATGGAGTCCGTGC
GTAACGGCACCTACGACTACCCCCAGTACTCCGAGGAGGCTCGTCTGAAGCGTGAGGAGATCTCCGGTGTCAAGCTCGA
ATCCATCGGAACCTACCAGATCCTGTCCATCTACTCCACCGTGGCTTCCTCCCTGGCTCTGGCTATCATGGTGGCTGGT
CTGTCCCTGTGGATGTGCTCCAACGGTTCCCTGCAGTGCCGTATCTGCATCTAATAATGAGGCGCGCCAAGCTTGTCGA
甲型/青海HA蛋白序列(SEQ ID 53)
MEKIVLLLAI   VSLVKSDQIC   IGYHANNSTE   QVDTIMEKNV   TVTHAQDILE
KTHNGKLCDL   DGVKPLILRD   CSVAGWLLGN   PMCDEFLNVP   EWSYIVEKIN
PANDLCYPGN   FNDYEELKHL   LSRINHFEKI   QIIPKSSWSD   HEASSGVSSA
CPYQGRSSFF   RNVVWLIKKN   NAYPTIKRSY   NNTNQEDLLV   LWGIHHPNDA
AEQTRLYQNP   TTYISVGTST   LNQRLVPKIA   TRSKVNGQSG   RMEFFWTILK
PNDAINFESN   GNFIAPENAY   KIVKKGDSTI   MKSELEYGNC   NTKCQTPIGA
INSSMPFHNI   HPLTIGECPK   YVKSNRLVLA   TGLRNSPQIE   TRGLFGAIAG
FIEGGWQGMV   DGWYGYHHSN   EQGSGYAADK   ESTQKAIDGV   TNKVNSIIDK
MNTQFEAVGR   EFNNLERRIE   NLNKKMEDGF   LDVWTYNAEL   LVLMENERTL
DFHDSNVKNL   YDKVRLQLRD   NAKELGNGCF   EFYHRCDNEC   MESVRNGTYD
YPQYSEEARL   KREEISGVKL   ESIGTYQILS   IYSTVASSLA   LAIMVAGLSL
WMCSNGSLQC   RICI
甲型/青海优化的NA(起始和终止密码子加有下划线)(SEQ ID 54)
ACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCCTCGAGATGAACCCCAACCAGAAGATCATCACCATCGGCTCCATCTGCATGGT
GATCGGTATCGTGTCCCTGATGCTGCAGATCGGTAACATGATCTCCATCTGGGTGTCCCACTCCATCCAGACCGGTAAC
CAGCGTCAGGCCGAGCCCATCTCCAACACCAAGTTCCTCACCGAGAAGGCTGTGGCTTCCGTGACCCTGGCTGGTAACT
CCTCCCTGTGCCCCATCTCCGGTTGGGCTGTGTACTCCAAGGACAACTCCATCCGTATCGGTTCCCGTGGTGACGTGTT
CGTGATCCGTGAGCCCTTCATCTCCTGCTCCCACCTCGAATGCCGTACCTTCTTCCTGACCCAGGGTGCTCTGCTGAAC
GACAAGCACTCCAACGGCACCGTGAAGGACCGTTCCCCCCACCGTACCCTGATGTCCTGCCCCGTGGGCGAGGCTCCCT
CCCCCTACAACTCCCGTTTCGAGTCCGTGGCTTGGTCCGCTTCCGCTTGCCACGACGGCACCTCTTGGCTGACCATCGG
TATCTCCGGTCCCGACAACGGTGCTGTGGCTGTGCTGAAGTACAACGGCATCATCACCGACACCATCAAGTCCTGGCGT
AACAACATCCTGCGTACCCAAGAGTCCGAGTGCGCTTGCGTGAACGGTTCCTGCTTCACCGTGATGACCGACGGTCCCT
CCAACGGCCAGGCTTCCTACAAGATCTTCAAGATGGAGAAGGGCAAGGTGGTGAAGTCCGTGGAGCTGGACGCTCCCAA
CTACCACTACGAGGAGTGCTCTTGCTACCCCGACGCTGGCGAGATCACCTGCGTGTGCCGTGACAACTGGCACGGTTCC
AACCGTCCCTGGGTGTCCTTCAACCAGAACCTCGAATACCAGATCGGTTACATCTGCTCCGGCGTGTTCGGTGACAACC
CCCGTCCCAACGACGGAACCGGTTCCTGCGGTCCCGTGTCCCCCAACGGTGCTTACGGTGTCAAGGGCTTCTCCTTCAA
GTACGGTAACGGTGTCTGGATCGGTCGTACCAAGTCCACCAACTCCCGCTCCGGTTTCGAGATGATCTGGGACCCCAAC
GGTTGGACCGGCACCGACTCTTCCTTCTCCGTGAAGCAGGACATCGTGGCTATCACCGACTGGTCCGGTTACTCCGGTT
CCTTCGTGCAGCACCCCGAGCTGACCGGTCTGGACTGTATCCGTCCCTGCTTCTGGGTGGAGCTGATCCGTGGTCGTCC
CAAGGAGTCCACCATCTGGACCTCCGGCTCCTCCATCTCTTTCTGCGGTGTGAACTCCGACACCGTGTCCTGGTCCTGG
CCCGACGGTGCCGAGCTGCCCTTCACCATCGACAAGTAATAATGAATCGATTTGTCGAGAAGTACTAGAGGATCATAAT
Protein sequence：
蛋白序列：
甲型/青海NA蛋白序列(SEQ ID 55)
MNPNQKIITI   GSICMVIGIV   SLMLQIGNMI   SIWVSHSIQT   GNQRQAEPIS
NTKFLTEKAV   ASVTLAGNSS   LCPISGWAVY   SKDNSIRIGS   RGDVFVIREP
FISCSHLECR   TFFLTQGALL   NDKHSNGTVK   DRSPHRTLMS   CPVGEAPSPY
NSRFESVAWS   ASACHDGTSW   LTIGISGPDN   GAVAVLKYNG   IITDTIKSWR
NNILRTQESE   CACVNGSCFT   VMTDGPSNGQ   ASYKIFKMEK   GKVVKSVELD
APNYHYEECS   CYPDAGEITC   VCRDNWHGSN   RPWVSFNQNL   EYQIGYICSG
VFGDNPRPND   GTGSCGPVSP   NGAYGVKGFS   FKYGNGVWIG   RTKSTNSRSG
FEMIWDPNGW   TGTDSSFSVK   QDIVAITDWS   GYSGSFVQHP   ELTGLDCIRP
CFWVELIRGR   PKESTIWTSG   SSISFCGVNS   DTVSWSWPDG   AELPFTIDK
本文通过提述收录下列参考文献：
Berglund，P.，Fleeton，M.N.，Smerdou，C.，and Liljestrom，P.(1999).Immunization with recombinant Semliki Forest virus induces protection againstinfluenza challenge in mice.Vaccine 17，497-507.
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Watanabe，T.，Watanabe，S.，Neumann，G.，and Kawaoka，Y.(2002)Immunogenicity and protective efficacy of replication-incompetent influenzavirus-like particles.J.Virol.76，767-773.
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其它实施方案：
本领域技术人员将会想到或者仅使用常规实验就可以确认本文描述的本发明具体实施方案的许多等同物。所附权利要求意在涵盖这些等同物。
序列表
<110>诺瓦瓦克斯股份有限公司(Novavax，Inc.)
<120>功能性流感病毒样颗粒(VLP)
<130>NOVV-002/06WO
<150>US 60/727,513
<151>2005-10-18
<150>US 60/780,847
<151>2006-03-10
<150>US 60/800,006
<151>2006-05-15
<150>US 60/831,196
<151>2006-07-17
<150>US 60/832,116
<151>2006-07-21
<150>US 60/845,495
<151>2006-09-19
<160>58
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1404
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>1
atgaatccaa atcaaaagat aatagcactt ggctctgttt ctataactat tgcgacaata    60
tgtttactca tgcagattgc catcttagca acgactatga cactacattt caatgaatgt    120
accaacccat cgaacaatca agcagtgcca tgtgaaccaa tcataataga aaggaacata    180
acagagatag tgcatttgaa taatactacc atagagaagg aaagttgtcc taaagtagca    240
gaatacaaga attggtcaaa accgcaatgt caaattacag ggttcgcccc tttctccaag    300
gacaactcaa ttaggctttc tgcaggcggg gatatttggg tgacaagaga accttatgta    360
tcgtgcggtc ttggtaaatg ttaccaattt gcacttgggc agggaaccac tttgaacaac    420
aaacactcaa atggcacaat acatgatagg agtccccata gaaccctttt aatgaacgag    480
ttgggtgttc catttcattt gggaaccaaa caagtgtgca tagcatggtc cagctcaagc    540
tgccatgatg ggaaggcatg gttacatgtt tgtgtcactg gggatgatag aaatgcgact    600
gctagcatca tttatgatgg gatgcttacc gacagtattg gttcatggtc taagaacatc    660
ctcagaactc aggagtcaga atgcgtttgc atcaatggaa cttgtacagt agtaatgact    720
gatggaagtg catcaggaag ggctgatact aaaatactat tcattagaga agggaaaatt    780
gtccacattg gtccactgtc aggaagtgct cagcatgtgg aggaatgctc ctgttacccc    840
cggtatccag aagttagatg tgtttgcaga gacaattgga agggctccaa tagacccgtg    900
ctatatataa atgtggcaga ttatagtgtt gattctagtt atgtgtgctc aggacttgtt    960
ggcgacacac caagaaatga cgatagctcc agcagcagta actgcaggga tcctaataac   1020
gagagagggg gcccaggagt gaaagggtgg gcctttgaca atggaaatga tgtttggatg   1080
ggacgaacaa tcaagaaaga ttcgcgctct ggttatgaga ctttcagggt cgttggtggt   1140
tggactacgg ctaattccaa gtcacaaata aataggcaag tcatagttga cagtgataac   1200
tggtctgggt attctggtat attctctgtt gaaggaaaaa cctgcatcaa caggtgtttt   1260
tatgtggagt tgataagagg gagaccacag gagaccagag tatggtggac ttcaaatagc   1320
atcattgtat tttgtggaac ttcaggtacc tatggaacag gctcatggcc cgatggagcg   1380
aatatcaatt tcatgtctat ataa                                          1404
<210>2
<211>1683
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>2
atggaaacaa tatcactaat aactatacta ctagtagtaa cagcaagcaa tgcagataaa     60
atctgcatcg gccaccagtc aacaaactcc acagaaactg tggacacgct aacagaaacc    120
aatgttcctg tgacacatgc caaagaattg ctccacacag agcataatgg aatgctgtgt    180
gcaacaagcc tgggacatcc cctcattcta gacacatgca ctattgaagg actagtctat    240
ggcaaccctt cttgtgacct gctgttggga ggaagagaat ggtcctacat cgtcgaaaga    300
tcatcagctg taaatggaac gtgttaccct gggaatgtag aaaacctaga ggaactcagg    360
acacttttta gttccgctag ttcctaccaa agaatccaaa tcttcccaga cacaacctgg    420
aatgtgactt acactggaac aagcagagca tgttcaggtt cattctacag gagtatgaga    480
tggctgactc aaaagagcgg tttttaccct gttcaagacg cccaatacac aaataacagg    540
ggaaagagca ttcttttcgt gtggggcata catcacccac ccacctatac cgagcaaaca    600
aatttgtaca taagaaacga cacaacaaca agcgtgacaa cagaagattt gaataggacc    660
ttcaaaccag tgatagggcc aaggcccctt gtcaatggtc tgcagggaag aattgattat    720
tattggtcgg tactaaaacc aggccaaaca ttgcgagtac gatccaatgg gaatctaatt    780
gctccatggt atggacacgt tctttcagga gggagccatg gaagaatcct gaagactgat    840
ttaaaaggtg gtaattgtgt agtgcaatgt cagactgaaa aaggtggctt aaacagtaca    900
ttgccattcc acaatatcag taaatatgca tttggaacct gccccaaata tgtaagagtt    960
aatagtctca aactggcagt cggtctgagg aacgtgcctg ctagatcaag tagaggacta   1020
tttggagcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagtcgc tggctggtat   1080
ggtttccagc attcaaatga tcaaggggtt ggtatggctg cagataggga ttcaactcaa   1140
aaggcaattg ataaaataac atccaaggtg aataatatag tcgacaagat gaacaagcaa   1200
tatgaaataa ttgatcatga attcagtgag gttgaaacta gactcaatat gatcaataat   1260
aagattgatg accaaataca agacgtatgg gcatataatg cagaattgct agtactactt   1320
gaaaatcaaa aaacactcga tgagcatgat gcgaacgtga acaatctata taacaaggtg   1380
aagagggcac tgggctccaa tgctatggaa gatgggaaag gctgtttcga gctataccat   1440
aaatgtgatg atcagtgcat ggaaacaatt cggaacggga cctataatag gagaaagtat   1500
agagaggaat caagactaga aaggcagaaa atagaggggg ttaagctgga atctgaggga   1560
acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgct tgcaatgggg   1620
tttgctgcct tcctgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata   1680
taa                                                                 1683
<210>3
<211>759
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>3
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccatc aggccccctc     60
aaagccgaga tcgcgcagag acttgaggat gtttttgcag ggaagaacac agatcttgag    120
gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta    180
gggtttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgatttgtc    240
caaaatgccc taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acagggcagt taaactatac    300
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atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa   1260
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ggaacgtaca actatccgca gtattcagaa gaagcaagat taaaaagaga ggaaataagt   1560
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<223>Vac2-hac-opt
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Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
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Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
            340                 345                 350
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
        355                 360                 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
    370                 375                 380
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
385                 390                 395                 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe
                405                 410                 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
            420                 425                 430
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
        435                 440                 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
    450                 455                 460
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465                 470                 475                 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
                485                 490                 495
Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
            500                 505                 510
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Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
    530                 535                 540
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Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565
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<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>Vac2-hac-spc-opt
<400>28
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Asn Ala Ile Pro Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser
            20                  25                  30
Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His
        35                  40                  45
Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu
    50                  55                  60
Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp
65                  70                  75                  80
Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp
                85                  90                  95
Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro
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Gly Ser Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile
        115                 120                 125
Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp
    130                 135                 140
His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser
145                 150                 155                 160
Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr
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Tyr Pro Thr Ile Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu
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Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr
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Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr
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Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn
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Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn
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Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr
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Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn
385                 390                 395                 400
Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val
                405                 410                 415
Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys
            420                 425                 430
Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu
        435                 440                 445
Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn
    450                 455                 460
Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala
465                 470                 475                 480
Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn
                485                 490                 495
Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr
            500                 505                 510
Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu
        515                 520                 525
Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala
    530                 535                 540
Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met
545                 550                 555                 560
Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565                 570
<210>29
<211>570
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>Vac2-hac-sph9-opt
<400>29
Met Glu Thr Ile Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Val Thr Ala Ser
1               5                   10                  15
Asn Ala Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu
            20                  25                  30
Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln
        35                  40                  45
Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly
    50                  55                  60
Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu
65                  70                  75                  80
Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr
                85                  90                  95
Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser
            100                 105                 110
Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His
        115                 120                 125
Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu
    130                 135                 140
Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser
145                 150                 155                 160
Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro
                165                 170                 175
Thr Ile Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val
            180                 185                 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu
        195                 200                 205
Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn
    210                 215                 220
Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln
225                 230                 235                 240
Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala
                245                 250                 255
Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr
            260                 265                 270
Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu
        275                 280                 285
Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn
    290                 295                 300
Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys
305                 310                 315                 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg
                325                 330                 335
Asn Ser Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly
            340                 345                 350
Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly
        355                 360                 365
Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala
    370                 375                 380
Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val
385                 390                 395                 400
Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg
                405                 410                 415
Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met
            420                 425                 430
Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val
        435                 440                 445
Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys
    450                 455                 460
Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu
465                 470                 475                 480
Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys
                485                 490                 495
Met Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu
            500                 505                 510
Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser
        515                 520                 525
Ile Gly Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser
    530                 535                 540
Leu Ala Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser
545                 550                 555                 560
Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565                 570
<210>30
<211>564
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>Vac2-hac-cs-opt
<400>30
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Gln Arg Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
            340                 345                 350
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
        355                 360                 365
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
    370                 375                 380
Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
385                 390                 395                 400
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu
                405                 410                 415
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
            420                 425                 430
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
        435                 440                 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
    450                 455                 460
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe
4654                 70                 475                 480
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn
                485                 490                 495
Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg
            500                 505                 510
Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile
        515                 520                 525
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
    530                 535                 540
Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545                 550                 555                 560
Arg Ile Cys Ile
<210>31
<211>449
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>Vac2-naj-opt
<400>31
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Val
1               5                   10                  15
Ile Gly Ile Val Ser Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met Ile Ser Ile
            20                  25                  30
Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Asn Gln His Gln Ala Glu Ser
        35                  40                  45
Ile Ser Asn Thr Asn Pro Leu Thr Glu Lys Ala Val Ala Ser Val Thr
    50                  55                  60
Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg Gly Trp Ala Val His
65                  70                  75                  80
Ser Lys Asp Asn Asn Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val
                85                  90                  95
Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu Cys Arg Thr Phe
            100                 105                 110
Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr
        115                 120                 125
Val Lys Asp Arg Ser Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly
    130                 135                 140
Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser
                165                 170                 175
Gly Pro Asp Asn Glu Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile
            180                 185                 190
Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
        195                 200                 205
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met Thr Asp
    210                 215                 220
Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Lys Met Glu Lys
225                 230                 235                 240
Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr His Tyr
                245                 250                 255
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ala Gly Glu Ile Thr Cys Val Cys
            260                 265                 270
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
        275                 280                 285
Asn Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
    290                 295                 300
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro Met Ser Pro
305                 310                 315                 320
Asn Gly Ala Tyr Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly
                325                 330                 335
Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly Phe Glu
            340                 345                 350
Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Ser Ser Phe Ser
        355                 360                 365
Val Lys Gln Asp Ile Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly
    370                 375                 380
Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro
385                 390                 395                 400
Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr Ile
                405                 410                 415
Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr
            420                 425                 430
Val Ser Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp
        435                 440                 445
Lys
<210>32
<211>252
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>Vac2-mc-opt
<400>32
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro
1               5                   10                  15
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Lys Leu Glu Asp Val Phe
            20                  25                  30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr
        35                  40                  45
Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe
    50                  55                  60
Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val
65                  70                  75                  80
Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala
                85                  90                  95
Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala
            100                 105                 110
Lys Glu Val Ser Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met
        115                 120                 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe
    130                 135                 140
Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg
145                 150                 155                 160
Ser His Arg Gln Met Ala Thr Ile Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu
                165                 170                 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met
            180                 185                 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Asn Gln
        195                 200                 205
Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Asn
    210                 215                 220
Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asp Asn Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
225                 230                 235                 240
Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys
                245                 250
<210>33
<211>564
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>VN1203-ha-cs-opt
<400>33
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Asn Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
            340                 345                 350
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
        355                 360                 365
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
    370                 375                 380
Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
385                 390                 395                 400
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu
                405                 410                 415
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
            420                 425                 430
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
        435                 440                 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
    450                 455                 460
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe
465                 470                 475                 480
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn
                485                 490                 495
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg
            500                 505                 510
Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile
        515                 520                 525
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
    530                 535                 540
Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545                 550                 555                 560
Arg Ile Cys Ile
<210>34
<211>572
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>VN1203-ha-spc-opt
<400>34
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Asn Ala Ile Pro Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser
            20                  25                  30
Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His
        35                  40                  45
Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu
    50                  55                  60
Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp
65                  70                  75                  80
Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp
                85                  90                  95
Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro
            100                 105                 110
Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile
        115                 120                 125
Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Ser
    130                 135                 140
His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala
                165                 170                 175
Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu
            180                 185                 190
Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr
        195                 200                 205
Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr
    210                 215                 220
Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn
225                 230                 235                 240
Gly Gln Asn Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn
                245                 250                 255
Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr
            260                 265                 270
Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu
        275                 280                 285
Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala
    290                 295                 300
Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly
305                 310                 315                 320
Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly
                325                 330                 335
Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu
            340                 345                 350
Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val
        355                 360                 365
Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr
    370                 375                 380
Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn
385                 390                 395                 400
Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val
                405                 410                 415
Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys
            420                 425                 430
Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu
        435                 440                 445
Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn
    450                 455                 460
Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala
465                 470                 475                 480
Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn
                485                 490                 495
Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr
            500                 505                 510
Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu
        515                 520                 525
Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala
    530                 535                 540
Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met
545                 550                 555                 560
Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565                 570
<210>35
<211>570
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>VN1203-ha-sph9-opt
<400>35
Met Glu Thr Ile Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Val Thr Ala Ser
1               5                   10                  15
Asn Ala Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu
            20                  25                  30
Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln
        35                  40                  45
Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly
    50                  55                  60
Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu
65                  70                  75                  80
Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr
                85                  90                  95
Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp
            100                 105                 110
Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Hi s Leu Leu Ser Arg Ile Asn His
        115                 120                 125
Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Ser His Glu
    130                 135                 140
Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser
145                 150                 155                 160
Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro
                165                 170                 175
Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val
            180                 185                 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu
        195                 200                 205
Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn
    210                 215                 220
Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln
225                 230                 235                 240
Asn Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala
                245                 250                 255
Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr
            260                 265                 270
Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu
        275                 280                 285
Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn
    290                 295                 300
Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys
305                 310                 315                 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg
                325                 330                 335
Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly
            340                 345                 350
Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly
        355                 360                 365
Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala
    370                 375                 380
Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val
385                 390                 395                 400
Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg
                405                 410                 415
Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met
            420                 425                 430
Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val
        435                 440                 445
Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys
    450                 455                 460
Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu
465                 470                 475                 480
Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys
                485                 490                 495
Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu
            500                 505                 510
Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser
        515                 520                 525
Ile Gly Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser
    530                 535                 540
Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser
545                 550                 555                 560
Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565                 570
<210>36
<211>1707
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>36
atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc     60
attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt    120
actgttacac atgcccaaga catactggaa aagaaacaca acgggaagct ctgcgatcta    180
gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagcgtag ctggatggct cctcggaaac    240
ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat    300
ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta    360
ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt    420
catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc    480
agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac    540
aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg    600
gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca    660
ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga    720
aggatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat    780
ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt    840
atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg    900
ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccattgggga atgccccaaa    960
tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag   1020
agaagaagaa aaaagagagg attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg   1080
cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac   1140
gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg   1200
atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa caacttagaa   1260
aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt tcctagatgt ctggacttat   1320
aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat   1380
gtcaagaacc tttacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt   1440
aacggttgtt tcgagttcta tcataaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaat   1500
ggaacgtatg actacccgca gtattcagaa gaagcgagac taaaaagaga ggaaataagt   1560
ggagtaaaat tggaatcaat aggaatttac caaatactgt caatttattc tacagtggcg   1620
agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctatcct tatggatgtg ctccaatgga   1680
tcgttacaat gcagaatttg catttaa                                       1707
<210>37
<211>1750
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>37
agtgtgatgg atatctgcag aattcgccct taggcgcgcc atggagaaaa tagtgcttct     60
ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc attggttacc atgcaaacaa    120
ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt actgttacac atgcccaaga    180
catactggaa aagaaacaca acgggaagct ctgcgatcta gatggagtga agcctctaat    240
tttgagagat tgtagcgtag ctggatggct cctcggaaac ccaatgtgtg acgaattcat    300
caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat ccagtcaatg acctctgtta    360
cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta ttgagcagaa taaaccattt    420
tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt catgaagcct cattaggggt    480
gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc agaaatgtgg tatggcttat    540
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tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg gcagagcaga caaagctcta    660
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aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga aggatggagt tcttctggac    780
aattttaaag ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat ggaaatttca ttgctccaga    840
atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt atgaaaagtg aattggaata    900
tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg ataaactcta gcatgccatt    960
ccacaatata caccctctca ccattgggga atgccccaaa tatgtgaaat caaacagatt   1020
agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag agaagaagaa aaaagagagg   1080
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caagaagatg gaagacgggt tcctagatgt ctggacttat aatgctgaac ttctggttct   1380
catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat gtcaagaacc tttacgacaa   1440
ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt aacggttgtt tcgagttcta   1500
tcataaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaat ggaacgtatg actacccgca   1560
gtattcagaa gaagcgagac taaaaagaga ggaaataagt ggagtaaaat tggaatcaat   1620
aggaatttac caaatactgt caatttattc tacagtggcg agttccctag cactggcaat   1680
catggtagct ggtctatcct tatggatgtg ctccaatggg tcgttacaat gcagaatttg   1740
catttaagcg                                                          1750
<210>38
<211>1350
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>38
atgaatccaa atcagaagat aataaccatc ggatcaatct gtatggtaac tggaatagtt     60
agcttaatgt tacaaattgg gaacatgatc tcaatatggg tcagtcattc aattcacaca    120
gggaatcaac accaatctga accaatcagc aatactaatt ttcttactga gaaagctgtg    180
gcttcagtaa aattagcggg caattcatct ctttgcccca ttaacggatg ggctgtatac    240
agtaaggaca acagtataag gatcggttcc aagggggatg tgtttgttat aagagagccg    300
ttcatctcat gctcccactt ggaatgcaga actttctttt tgactcaggg agccttgctg    360
aatgacaagc actccaatgg gactgtcaaa gacagaagcc ctcacagaac attaatgagt    420
tgtcctgtgg gtgaggctcc ctccccatat aactcaaggt ttgagtctgt tgcttggtca    480
gcaagtgctt gccatgatgg caccagttgg ttgacgattg gaatttctgg cccagacaat    540
ggggctgtgg ctgtattgaa atacaatggc ataataacag acactatcaa gagttggagg    600
aacaacatac tgagaactca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggctc ttgctttact    660
gtaatgactg acggaccaag taatggtcag gcatcacata agatcttcaa aatggaaaaa    720
gggaaagtgg ttaaatcagt cgaattggat gctcctaatt atcactatga ggaatgctcc    780
tgttatccta atgccggaga aatcacatgt gtgtgcaggg ataattggca tggctcaaat    840
cggccatggg tatctttcaa tcaaaatttg gagtatcaaa taggatatat atgcagtgga    900
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aacggggcat atggggtaaa agggttttca tttaaatacg gcaatggtgt ctggatcggg   1020
agaaccaaaa gcactaattc caggagcggc tttgaaatga tttgggatcc aaatgggtgg   1080
actgaaacgg acagtagctt ttcagtgaaa caagatatcg tagcaataac tgattggtca   1140
ggatatagcg ggagttttgt ccagcatcca gaactgacag gactagattg cataagacct   1200
tgtttctggg ttgagttgat cagagggcgg cccaaagaga gcacaatttg gactagtggg   1260
agcagcatat ctttttgtgg tgtaaatagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt   1320
gccgagttgc cattcaccat tgacaagtag                                    1350
<210>39
<211>1400
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>39
ccgggatgaa tccaaatcag aagataataa ccatcggatc aatctgtatg gtaactggaa     60
tagttagctt aatgttacaa attgggaaca tgatctcaat atgggtcagt cattcaattc    120
acacagggaa tcaacaccaa tctgaaccaa tcagcaatac taattttctt actgagaaag    180
ctgtggcttc agtaaaatta gcgggcaatt catctctttg ccccattaac ggatgggctg    240
tatacagtaa ggacaacagt ataaggatcg gttccaaggg ggatgtgttt gttataagag    300
agccgttcat ctcatgctcc cacttggaat gcagaacttt ctttttgact cagggagcct    360
cgctgaatga caagcactcc aatgggactg tcaaagacag aagccctcac agaacattaa    420
tgagttgtcc tgtgggtgag gctccctccc catataactc aaggtttgag tctgttgctt    480
ggtcagcaag tgcttgccat gatggcacca gttggttgac gattggaatt tctggcccag    540
acaatggggc tgtggctgta ttgaaataca atggcataat aacagacact atcaagagtt    600
ggaggaacaa catactgaga actcaagagt ctgaatgtgc atgtgtaaat ggctcttgct    660
ttactgtaat gactgacgga ccaagtaatg gtcaggcatc acataagatc ttcaaaatgg    720
aaaaagggaa agtggttaaa tcagtcgaat tggatgctcc taattatcac tatgaggaat    780
gctcctgtta tcctaatgcc ggagaaatca catgtgtgtg cagggataat tggcatggct    840
caaatcggcc atgggtatct ttcaatcaaa atttggagta tcaaatagga tatatatgca    900
gtggagtttt cggagacaat ccacgcccca atgatggaac aggtagttgt ggtccggtgt    960
cctctaacgg ggcatatggg gtaaaagggt tttcatttaa atacggcaat ggtgtctgga   1020
tcgggagaac caaaagcact aattccagga gcggctttga aatgatttgg gatccaaatg   1080
ggtggactga aacggacagt agcttttcag tgaaacaaga tatcgtagca ataactgatt   1140
ggtcaggata tagcgggagt tttgtccagc atccagaact gacaggacta gattgcataa   1200
gaccttgttt ctgggttgag ttgatcagag ggcggcccaa agagagcaca atttggacta   1260
gtgggagcag catatctttt tgtggtgtaa atagtgacac tgtgggttgg tcttggccag   1320
acggtgctga gttgccattc accattgaca agtaggggcc ctcgagtaag ggcgaattcc   1380
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<210>40
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<212>DNA
<213>流感病毒
<400>40
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc     60
aaagccgaga tcgcacagaa acttgaagat gtctttgcag gaaagaacac cgatctcgag    120
gctctcatgg agtggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggattttg    180
ggatttgtat tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc    240
cagaatgccc taaatggaaa tggagatcca aataatatgg atagggcagt taagctatat    300
aagaagctga aaagagaaat aacattccat ggggctaagg aggtcgcact cagctactca    360
accggtgcac ttgccagttg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac ggtgactacg    420
gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccact tgtgagcaga ttgcagattc acagcatcgg    480
tctcacagac agatggcaac tatcaccaac ccactaatca gacatgagaa cagaatggtg    540
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<210>41
<211>793
<212>DNA
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<400>41
atatctgcag aattcgccct tagaattcga cgtcatgagt cttctaaccg aggtcgaaac     60
gtacgttctc tctatcatcc cgtcaggccc cctcaaagcc gagatcgcac agaaacttga    120
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<210>42
<211>1740
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为在昆虫细胞表达系统中表达而优化的流感HA基因
<400>42
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<210>43
<211>568
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>43
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
            340                 345                 350
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
        355                 360                 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
    370                 375                 380
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
385                 390                 395                 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe
                405                 410                 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
            420                 425                 430
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
        435                 440                 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
    450                 455                 460
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465                 470                 475                 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
                485                 490                 495
Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
            500                 505                 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly
        515                 520                 525
Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
    530                 535                 540
Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545                 550                 555                 560
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565
<210>44
<211>1716
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为在昆虫细胞表达系统中表达而优化的流感HA基因
<400>44
ggatccgcca ccatggagaa gatcgtgctg ctgctggcta tcgtgtccct ggtgaagtcc     60
gaccagatct gcatcggtta ccacgctaac aactccaccg agcaggtgga caccatcatg    120
gagaagaacg tcaccgtgac ccacgctcag gacatcctcg aaaagaccca caacggcaag    180
ctgtgcgacc tggacggtgt caagcccctg atcctgcgtg actgctccgt ggctggttgg    240
ctgctgggta accccatgtg cgacgagttc atcaacgtgc ccgagtggtc ctacatcgtg    300
gagaaggcta accccaccaa cgacctgtgc taccccggtt ccttcaacga ctacgaggag    360
ctgaagcacc tgctgtcccg tatcaaccac ttcgagaaga tccagatcat ccccaagtcc    420
tcttggtccg accacgaggc ttcctccggt gtctcctccg cttgccccta cctgggttcc    480
ccctccttct tccgtaacgt ggtgtggctg atcaagaaga actccaccta ccccaccatc    540
aagaagtcct acaacaacac caaccaggag gacctgctgg tcctgtgggg tatccaccac    600
cccaacgacg ctgccgagca gacccgtctg taccagaacc ccaccaccta catctccatc    660
ggcacctcca ccctgaacca gcgtctggtg cccaagatcg ctacccgttc caaggtgaac    720
ggccagtccg gtcgtatgga gttcttctgg accatcctga agcctaacga cgctatcaac    780
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ccccagcgcg agtcccgtgg tctgttcggc gctatcgctg gtttcatcga gggcggttgg   1080
cagggcatgg tggacggatg gtacggttac caccactcta acgagcaggg ttccggttac   1140
gctgctgaca aggagtccac ccagaaggct atcgacggcg tcaccaacaa ggtgaactcc   1200
atcatcgaca agatgaacac ccagttcgag gctgtgggtc gtgagttcaa caacctcgag   1260
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aacggttgct tcgagttcta ccacaagtgc gacaacgagt gcatggagtc catccgtaac   1500
ggcacctaca actaccccca gtactccgag gaggctcgtc tgaagcgtga ggagatctcc   1560
ggcgtgaagc tcgagtccat cggaacctac cagatcctgt ccatctactc caccgtggct   1620
tcctccctgg ctctggctat catgatggct ggtctgtccc tgtggatgtg ctccaacggt   1680
tccctgcagt gccgtatctg catctaatga aagctt                             1716
<210>45
<211>564
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>45
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Gln Arg Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
            340                 345                 350
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
        355                 360                 365
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
    370                 375                 380
Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
385                 390                 395                 400
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu
                405                 410                 415
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
            420                 425                 430
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
        435                 440                 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
    450                 455                 460
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe
465                 470                 475                 480
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn
                485                 490                 495
Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg
            500                 505                 510
Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile
        515                 520                 525
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
    530                 535                 540
Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545                 550                 555                 560
Arg Ile Cys Ile
<210>46
<211>1383
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为在昆虫细胞表达系统中表达而优化的流感NA基因
<400>46
ggtaccggat ccgccaccat gaaccccaac cagaagatca tcaccatcgg ctccatctgc     60
atggtgatcg gtatcgtgtc cctgatgctg cagatcggta acatgatctc catctgggtg    120
tcccactcca tccagaccgg taaccagcac caggctgagt ccatctccaa caccaacccc    180
ctgaccgaga aggctgtggc ttccgtgacc ctggctggta actcctccct gtgccccatc    240
cgtggttggg ctgtgcactc caaggacaac aacatccgca tcggttccaa gggtgacgtg    300
ttcgtgatcc gtgagccctt catctcctgc tcccacctcg agtgccgtac cttcttcctg    360
acccaaggtg ctctgctgaa cgacaagcac tccaacggca ccgtgaagga ccgttccccc    420
caccgtaccc tgatgtcctg ccccgtgggc gaggctccct ccccctacaa ctcccgtttc    480
gagtccgtgg cttggtccgc ttccgcttgc cacgacggca cctcttggct gaccatcggt    540
atctccggtc ccgacaacga ggctgtcgct gtgctgaagt acaacggcat catcaccgac    600
accatcaagt cctggcgtaa caacatcctg cgtacccagg agtccgagtg cgcttgcgtg    660
aacggttcct gcttcaccgt gatgaccgac ggtccctccg acggccaggc ttcctacaag    720
atcttcaaga tggagaaggg caaggtggtg aagtccgtgg agctggacgc tcccaactac    780
cactacgagg agtgctcttg ctaccccgac gctggcgaga tcacctgcgt gtgccgtgac    840
aactggcacg gttccaaccg tccctgggtg tccttcaacc agaacctcga gtaccagatc    900
ggttacatct gctccggcgt gttcggtgac aacccccgtc ccaacgacgg aaccggttcc    960
tgcggtccca tgtcccccaa cggtgcttac ggtgtcaagg gcttctcctt caagtacggt   1020
aacggtgtct ggatcggtcg taccaagtcc accaactccc gctccggttt cgagatgatc   1080
tgggacccca acggttggac cggcaccgac tcttccttct ccgtgaagca ggacatcgtg   1140
gctatcaccg actggtccgg ttactccggt tccttcgtgc agcaccccga gctgaccggt   1200
ctggactgca ttcgtccctg cttctgggtg gagctgatcc gtggtcgtcc caaggagtcc   1260
accatctgga cctccggctc ctccatctct ttctgcggtg tgaactccga caccgtgtcc   1320
tggtcctggc ccgacggtgc cgagctgccc ttcaccatcg acaagtaatg aaagcttgag   1380
ctc                                                                 1383
<210>47
<211>449
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>47
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Val
1               5                   10                  15
Ile Gly Ile Val Ser Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met Ile Ser Ile
            20                  25                  30
Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Asn Gln His Gln Ala Glu Ser
        35                  40                  45
Ile Ser Asn Thr Asn Pro Leu Thr Glu Lys Ala Val Ala Ser Val Thr
    50                  55                  60
Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg Gly Trp Ala Val His
65                  70                  75                  80
Ser Lys Asp Asn Asn Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val
                85                  90                  95
Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu Cys Arg Thr Phe
            100                 105                 110
Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr
        115                 120                 125
Val Lys Asp Arg Ser Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly
    130                 135                 140
Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser
                165                 170                 175
Gly Pro Asp Asn Glu Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile
            180                 185                 190
Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
        195                 200                 205
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met Thr Asp
    210                 215                 220
Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Lys Met Glu Lys
225                 230                 235                 240
Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr His Tyr
                245                 250                 255
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ala Gly Glu Ile Thr Cys Val Cys
            260                 265                 270
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
        275                 280                 285
Asn Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
    290                 295                 300
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro Met Ser Pro
305                 310                 315                 320
Asn Gly Ala Tyr Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly
                325                 330                 335
Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly Phe Glu
            340                 345                 350
Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Ser Ser Phe Ser
        355                 360                 365
Val Lys Gln Asp Ile Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly
    370                 375                 380
Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro
385                 390                 395                 400
Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr Ile
                405                 410                 415
Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr
            420                 425                 430
Val Ser Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp
        435                 440                 445
Lys
<210>48
<211>792
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为在昆虫细胞表达系统中表达而优化的流感M1基因
<400>48
ggtaccggat ccgccaccat gtccctgctg accgaggtgg agacctacgt gctgtccatc     60
atcccctccg gtcctctgaa ggctgagatc gctcagaagc tcgaggacgt tttcgctggc    120
aagaacaccg acctcgaggc tctgatggag tggctcaaga cccgtcccat cctgtccccc    180
ctgaccaagg gtatcctggg tttcgtgttc accctgaccg tgccctccga gcgtggtctg    240
cagcgtcgtc gtttcgtgca gaacgctctg aacggtaacg gtgaccccaa caacatggac    300
cgtgctgtga agctgtacaa gaagctgaag cgcgagatca ccttccacgg tgctaaggag    360
gtgtccctgt cctactccac cggtgctctg gctagctgca tgggcctgat ctacaaccgt    420
atgggcaccg tgaccaccga ggtggccttc ggtctggtct gcgctacctg cgagcagatc    480
gctgactccc agcaccgttc ccaccgtcag atggctacca tcaccaaccc cctgatccgt    540
cacgagaacc gtatggtgct ggcttccacc accgctaagg ctatggagca gatggctggt    600
tcctccgagc aggctgctga ggccatggag gtggccaacc aggctcgtca gatggtgcag    660
gctatgcgta ccatcggcac ccaccccaac tcctccgctg gtctgcgtga caacctgctc    720
gagaacctgc aggcttacca gaagcgtatg ggagtccaga tgcagcgctt caagtaatga    780
aagcttgagc tc                                                        792
<210>49
<211>252
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>49
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro
1               5                   10                  15
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Lys Leu Glu Asp Val Phe
            20                  25                  30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr
        35                  40                  45
Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe
    50                  55                  60
Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val
65                  70                  75                  80
Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala
                85                  90                  95
Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala
            100                 105                 110
Lys Glu Val Ser Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met
        115                 120                 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe
    130                 135                 140
Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg
145                 150                 155                 160
Ser His Arg Gln Met Ala Thr Ile Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu
                165                 170                 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met
            180                 185                 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Asn Gln
        195                 200                 205
Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Asn
    210                 215                 220
Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asp Asn Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
225                 230                 235                 240
Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys
                245                 250
<210>50
<211>1736
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为在昆虫细胞表达系统中表达而优化的流感HA基因
<400>50
ggtaccggat ccctcgagat ggagaagatc gtgctgctgc tggctatcgt gtccctggtg     60
aagtccgacc agatctgcat cggttaccac gctaacaact ccaccgagca ggtggacacc    120
atcatggaga agaacgtcac cgtgacccac gctcaggaca tcctggaaaa gacccacaac    180
ggcaagctgt gcgacctgga cggtgtcaag cccctgatcc tgcgtgactg ctccgtggct    240
ggttggctgc tgggtaaccc catgtgcgac gagttcatca acgtgcccga gtggtcctac    300
atcgtggaga aggctaaccc cgctaacgac ctgtgctacc ccggtaactt caacgactac    360
gaggagctga agcacctgct gtcccgtatc aaccacttcg agaagatcca gatcatcccc    420
aagtcctctt ggtccgacca cgaggcttcc tccggtgtct cctccgcttg cccataccag    480
ggcaccccat ctttcttccg taacgtggtg tggctgatca agaagaacaa cacctacccc    540
accatcaagc gttcctacaa caacaccaac caggaggacc tgctgatcct gtggggtatc    600
caccactcca acgacgctgc cgagcagacc aagctgtacc agaaccccac cacctacatc    660
tccgtgggca cctccaccct gaaccagcgt ctggtgccca agatcgctac ccgttccaag    720
gtgaacggcc agtccggtcg tatggacttc ttctggacca tcctgaagcc taacgacgct    780
atcaacttcg agtccaacgg caacttcatc gctcccgagt acgcttacaa gatcgtgaag    840
aagggcgact ccgctatcgt caagtccgag gtggagtacg gtaactgcaa caccaagtgc    900
cagaccccca tcggtgctat caactcctcc atgcccttcc acaacatcca ccccctgacc    960
atcggcgagt gccccaagta cgtgaagtcc aacaagctgg tgctggctac cggtctgcgt   1020
aactcccccc tgcgtgagcg tggtctgttc ggcgctatcg ctggtttcat cgagggcggt   1080
tggcagggca tggtggacgg ttggtacggt taccaccaca gcaacgagca gggttccggt   1140
tacgctgctg acaaggagtc cacccagaag gctatcgacg gcgtcaccaa caaggtgaac   1200
tccatcatcg acaagatgaa cacccagttc gaggctgtgg gtcgtgagtt caacaacctg   1260
gagcgtcgta tcgagaacct gaacaagaag atggaggacg gtttcctgga cgtgtggacc   1320
tacaacgccg agctgctggt gctgatggag aacgagcgta ccctggactt ccacgactct   1380
aacgtgaaga acctgtacga caaggtccgc ctgcagctgc gtgacaacgc taaggagctg   1440
ggtaacggtt gcttcgagtt ctaccacaag tgcgacaacg agtgcatgga gtccgtgcgt   1500
aacggcacct acgactaccc ccagtactcc gaggaggctc gtctgaagcg tgaggagatc   1560
tccggcgtga agctggagtc catcggcacc taccagatcc tgtccatcta ctccaccgtg   1620
gcttcctccc tggctctggc tatcatggtg gctggtctgt ccctgtggat gtgctccaac   1680
ggttccctgc agtgccgtat ctgcatctaa taatgaggcg cgccaagctt gagctc       1736
<210>51
<211>563
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>51
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Thr Pro Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Ser Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
       195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Val Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Leu Arg Glu Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
            340                 345                 350
Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser
        355                 360                 365
Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys
    370                 375                 380
Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met
385                 390                 395                 400
Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg
                405                 410                 415
Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val
            420                 425                 430
Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr
        435                 440                 445
Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg
    450                 455                 460
Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu
465                 470                 475                 480
Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly
                485                 490                 495
Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu
            500                 505                 510
Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile Leu
        515                 520                 525
Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val
    530                 535                 540
Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg
545                 550                 555                 560
Ile Cys Ile
<210>52
<211>1738
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为在昆虫细胞表达系统中表达而优化的流感HA基因
<400>52
cgggcgcgga gcggccgcat ggagaagatc gtgctgctgc tggctatcgt gtctctggtc     60
aagtccgacc agatctgcat cggttaccac gctaacaact ccaccgagca ggtggacacc    120
atcatggaga agaacgtcac cgtgacccac gctcaggaca tcctcgaaaa gacccacaac    180
ggcaagctgt gcgacctgga cggcgtgaag cccctgatcc tgcgtgactg ctccgtggct    240
ggttggctgc tgggtaaccc catgtgcgac gagttcctca acgtgcccga gtggtcctac    300
atcgtggaga agatcaaccc cgctaacgac ctgtgctacc ccggtaactt caacgactac    360
gaggagctga agcacctgct gtcccgtatc aaccacttcg agaagatcca gatcatcccc    420
aagtcctctt ggtccgacca cgaggcttcc tccggtgtct cctccgcttg cccataccag    480
ggccgttctt ccttcttccg caacgtggtg tggctgatca agaagaacaa cgcctacccc    540
accatcaagc gttcctacaa caacaccaac caggaggacc tgctggtcct gtggggtatc    600
caccacccca acgacgctgc cgagcagacc cgtctgtacc agaaccccac cacctacatc    660
tccgtgggca cctctaccct gaaccagcgt ctggtgccca agatcgctac ccgttccaag    720
gtgaacggcc agtccggtcg tatggagttc ttctggacca tcctgaagcc taacgacgct    780
atcaacttcg agtccaacgg caacttcatc gctcccgaga acgcttacaa gatcgtgaag    840
aagggcgact ccaccatcat gaagtccgag ctggagtacg gcaactgcaa cactaagtgc    900
cagaccccca tcggtgctat caactcctcc atgcccttcc acaacatcca ccccctgact    960
atcggcgagt gccccaagta cgtgaagtcc aaccgtctgg tgctggctac cggtctgcgt   1020
aactcccccc agatcgagac tcgtggtctg ttcggcgcta tcgctggttt catcgagggc   1080
ggttggcagg gcatggtgga cggttggtac ggttaccacc actctaacga gcagggttcc   1140
ggttacgctg ctgacaagga gtctacccag aaggctatcg acggcgtcac caacaaggtg   1200
aactccatca tcgacaagat gaacacccag ttcgaggctg tgggtcgtga gttcaacaac   1260
ctcgaacgtc gtatcgagaa cctgaacaag aagatggagg acggtttcct ggacgtgtgg   1320
acctacaacg ccgagctgct ggtgctgatg gagaacgagc gtaccctgga cttccacgac   1380
tccaacgtga agaacctgta cgacaaggtc cgcctgcagc tgcgtgacaa cgctaaggag   1440
ctgggtaacg gttgcttcga gttctaccac cgttgcgaca acgagtgcat ggagtccgtg   1500
cgtaacggca cctacgacta cccccagtac tccgaggagg ctcgtctgaa gcgtgaggag   1560
atctccggtg tcaagctcga atccatcgga acctaccaga tcctgtccat ctactccacc   1620
gtggcttcct ccctggctct ggctatcatg gtggctggtc tgtccctgtg gatgtgctcc   1680
aacggttccc tgcagtgccg tatctgcatc taataatgag gcgcgccaag cttgtcga     1738
<210>53
<211>564
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>53
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ile Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Arg Ser Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
       195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Gln Ile Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
            340                 345                 350
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
        355                 360                 365
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
    370                 375                 380
Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
385                 390                 395                 400
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu
                405                 410                 415
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
            420                 425                 430
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
        435                 440                 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
    450                 455                 460
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe
465                 470                 475                 480
Glu Phe Tyr His Arg Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn
                485                 490                 495
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg
            500                 505                 510
Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile
        515                 520                 525
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
    530                 535                 540
Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545                 550                 555                 560
Arg Ile Cys Ile
<210>54
<211>1422
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为在昆虫细胞表达系统中表达而优化的流感NA基因
<400>54
accgtcccac catcgggcgc ggatccctcg agatgaaccc caaccagaag atcatcacca     60
tcggctccat ctgcatggtg atcggtatcg tgtccctgat gctgcagatc ggtaacatga    120
tctccatctg ggtgtcccac tccatccaga ccggtaacca gcgtcaggcc gagcccatct    180
ccaacaccaa gttcctcacc gagaaggctg tggcttccgt gaccctggct ggtaactcct    240
ccctgtgccc catctccggt tgggctgtgt actccaagga caactccatc cgtatcggtt    300
cccgtggtga cgtgttcgtg atccgtgagc ccttcatctc ctgctcccac ctcgaatgcc    360
gtaccttctt cctgacccag ggtgctctgc tgaacgacaa gcactccaac ggcaccgtga    420
aggaccgttc cccccaccgt accctgatgt cctgccccgt gggcgaggct ccctccccct    480
acaactcccg tttcgagtcc gtggcttggt ccgcttccgc ttgccacgac ggcacctctt    540
ggctgaccat cggtatctcc ggtcccgaca acggtgctgt ggctgtgctg aagtacaacg    600
gcatcatcac cgacaccatc aagtcctggc gtaacaacat cctgcgtacc caagagtccg    660
agtgcgcttg cgtgaacggt tcctgcttca ccgtgatgac cgacggtccc tccaacggcc    720
aggcttccta caagatcttc aagatggaga agggcaaggt ggtgaagtcc gtggagctgg    780
acgctcccaa ctaccactac gaggagtgct cttgctaccc cgacgctggc gagatcacct    840
gcgtgtgccg tgacaactgg cacggttcca accgtccctg ggtgtccttc aaccagaacc    900
tcgaatacca gatcggttac atctgctccg gcgtgttcgg tgacaacccc cgtcccaacg    960
acggaaccgg ttcctgcggt cccgtgtccc ccaacggtgc ttacggtgtc aagggcttct   1020
ccttcaagta cggtaacggt gtctggatcg gtcgtaccaa gtccaccaac tcccgctccg   1080
gtttcgagat gatctgggac cccaacggtt ggaccggcac cgactcttcc ttctccgtga   1140
agcaggacat cgtggctatc accgactggt ccggttactc cggttccttc gtgcagcacc   1200
ccgagctgac cggtctggac tgtatccgtc cctgcttctg ggtggagctg atccgtggtc   1260
gtcccaagga gtccaccatc tggacctccg gctcctccat ctctttctgc ggtgtgaact   1320
ccgacaccgt gtcctggtcc tggcccgacg gtgccgagct gcccttcacc atcgacaagt   1380
aataatgaat cgatttgtcg agaagtacta gaggatcata at                      1422
<210>55
<211>449
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>55
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Val
1               5                   10                  15
Ile Gly Ile Val Ser Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met Ile Ser Ile
            20                  25                  30
Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Asn Gln Arg Gln Ala Glu Pro
        35                  40                  45
Ile Ser Asn Thr Lys Phe Leu Thr Glu Lys Ala Val Ala Ser Val Thr
    50                  55                  60
Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Ser Gly Trp Ala Val Tyr
65                  70                  75                  80
Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Arg Gly Asp Val Phe Val
                85                  90                  95
Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu Cys Arg Thr Phe
            100                 105                 110
Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr
        115                 120                 125
Val Lys Asp Arg Ser Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly
    130                 135                 140
Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser
                165                 170                 175
Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile
            180                 185                 190
Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
        195                 200                 205
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met Thr Asp
    210                 215                 220
Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Lys Met Glu Lys
225                 230                 235                 240
Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr His Tyr
                245                 250                 255
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ala Gly Glu Ile Thr Cys Val Cys
            260                 265                 270
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
        275                 280                 285
Asn Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
    290                 295                 300
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Pro
305                 310                 315                 320
Asn Gly Ala Tyr Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly
                325                 330                 335
Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly Phe Glu
            340                 345                 350
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        355                 360                 365
Val Lys Gln Asp Ile Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly
    370                 375                 380
Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro
385                 390                 395                 400
Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr Ile
                405                 410                 415
Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr
            420                 425                 430
Val Ser Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp
        435                 440                 445
Lys
<210>56
<211>1750
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>56
attcgccctt aacggtccga tggagaaaat agtgcttctt cttgcaatag tcagtcttgt     60
taaaagtgat cagatttgca ttggttacca tgcaaacaat tcaacagagc aggttgacac    120
aatcatggaa aagaacgtta ctgttacaca tgcccaagac atactggaaa agacacacaa    180
cgggaagctc tgcgatctag atggagtgaa gcctctaatt ttaagagatt gtagtgtagc    240
tggatggctc ctcgggaacc caatgtgtga cgaattcatc aatgtaccgg aatggtctta    300
catagtggag aaggccaatc caaccaatga cctctgttac ccagggagtt tcaacgacta    360
tgaagaactg aaacacctat tgagcagaat aaaccatttt gagaaaattc aaatcatccc    420
caaaagttct tggtccgatc atgaagcctc atcaggagtg agctcagcat gtccatacct    480
gggaagtccc tcctttttta gaaatgtggt atggcttatc aaaaagaaca gtacataccc    540
aacaataaag aaaagctaca ataataccaa ccaagaagat cttttggtac tgtggggaat    600
tcaccatcct aatgatgcgg cagagcagac aaggctatat caaaacccaa ccacctatat    660
ttccattggg acatcaacac taaaccagag attggtacca aaaatagcta ctagatccaa    720
agtaaacggg caaagtggaa ggatggagtt cttctggaca attttaaaac ctaatgatgc    780
aatcaacttc gagagtaatg gaaatttcat tgctccagaa tatgcataca aaattgtcaa    840
gaaaggggac tcagcaatta tgaaaagtga attggaatat ggtaactgca acaccaagtg    900
tcaaactcca atgggggcga taaactctag tatgccattc cacaacatac accctctcac    960
catcggggaa tgccccaaat atgtgaaatc aaacagatta gtccttgcaa cagggctcag   1020
aaatagccct caaagagaga gcagaagaaa aaagagagga ctatttggag ctatagcagg   1080
ttttatagag ggaggatggc agggaatggt agatggttgg tatgggtacc accatagcaa   1140
tgagcagggg agtgggtacg ctgcagacaa agaatccact caaaaggcaa tggatggagt   1200
caccaataag gtcaactcaa tcattgacaa aatgaacact cagtttgagg ccgttggaag   1260
ggaatttaat aacttagaaa ggagaataga gaatttaaac aagaagatgg aagacgggtt   1320
tctagatgtc tggacttata atgccgaact tctggttctc atggaaaatg agagaactct   1380
agactttcat gactcaaatg ttaagaacct ctacgacaag gtccgactac agcttaggga   1440
taatgcaaag gagctgggta acggttgttt cgagttctat cacaaatgtg ataatgaatg   1500
tatggaaagt ataagaaacg gaacgtgcaa ctatccgcag tattcagaag aagcaagatt   1560
aaaaagagag gaaataagtg gggtaaaatt ggaatcaata ggaacttacc aaatactgtc   1620
aatttattca acagtggcga gttccctagc actggcaatc atgatggctg gtctatcttt   1680
atggatgtgc tccaatggat cgttacaatg cagaatttgc atttaaaagc tttaagggcg   1740
aattccagca                                                          1750
<210>57
<211>568
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>57
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe I1e Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
            340                 345                 350
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
        355                 360                 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
    370                 375                 380
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Met Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
385                 390                 395                 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe
                405                 410                 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
            420                 425                 430
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
        435                 440                 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
    450                 455                 460
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465                 470                 475                 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
                485                 490                 495
Ser Ile Arg Asn Gly Thr Cys Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
            500                 505                 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly
        515                 520                 525
Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
    530                 535                 540
Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545                 550                 555                 560
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565
<210>58
<211>568
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>58
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
            340                 345                 350
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
        355                 360                 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
    370                 375                 380
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
385                 390                 395                 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe
                405                 410                 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
            420                 425                 430
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
        435                 440                 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
    450                 455                 460
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465                 470                 475                 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
                485                 490                 495
Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
            500                 505                 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly
        515                 520                 525
Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
    530                 535                 540
Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545                 550                 555                 560
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565

Claims (40)

1.一种病毒样颗粒(VLP)，其包含流感病毒M1蛋白和流感病毒H5和N1血凝素和神经氨酸酶蛋白。
2.权利要求1的VLP，其中所述M1蛋白与H5和N1蛋白相比衍生自不同的流感病毒株。
3.权利要求1的VLP，其中所述H5或N1来自H5N1进化枝1流感病毒。
4.权利要求1的VLP，其中所述H5和N1来自H5N1进化枝2流感病毒。
5.权利要求3的VLP，其中所述H5和N1蛋白分别包含SEQ ID NO：43和46，或者与所述序列有至少90％的序列同一性的序列。
6.权利要求4的VLP，其中所述H5和N1蛋白分别包含SEQ ID NO：50和54，或者与所述序列有至少90％的序列同一性的序列。
7.权利要求1的VLP，其中所述H5和N1来自从被感染动物分离的流感病毒。
8.权利要求7的VLP，其中所述被感染动物是人。
9.权利要求1的VLP，其中所述VLP是在容许VLP形成的条件下，由包含编码流感H5和N1蛋白及流感M1蛋白的一种或多种核酸的真核细胞表达的。
10.权利要求9的VLP，其中所述真核细胞选自酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、禽类细胞和哺乳动物细胞。
11.权利要求10的VLP，其中所述真核细胞是昆虫细胞。
12.权利要求11的VLP，其中所述昆虫细胞是Sf9。
13.权利要求1的VLP，其中所述VLP在施用于人或动物时，在所述人或动物体中引发针对流感病毒感染具有保护性的中和性抗体。
14.一种免疫原性组合物，其包含有效剂量的权利要求1-13任一项的VLP。
15.权利要求14的组合物，其中所述组合物包含佐剂。
16.一种疫苗，其包含有效剂量的权利要求1-13任一项的VLP。
17.权利要求16的疫苗，其中所述疫苗至少包含第二种VLP，所述第二种VLP包含来自不同流感病毒株的HA和NA。
18.权利要求16或17的疫苗，其中所述疫苗包含佐剂。
19.权利要求15或18的免疫原性组合物或疫苗，其中所述佐剂包含
20.一种在动物中诱发针对流感病毒感染的显著的免疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的权利要求16-18任一项的疫苗。
21.权利要求20的方法，其中所述疫苗通过口服、皮内、鼻内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用给动物。
22.权利要求20或21的方法，其中所述动物是人。
23.权利要求1-13任一项的VLP用于制备动物用疫苗的用途，其中所述疫苗在所述动物中诱发针对流感病毒感染的显著的免疫力。
24.权利要求23的用途，其中所述疫苗通过口服、皮内、鼻内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用给动物。
25.制备权利要求1-13任一项的VLP的方法，其包括在真核细胞中表达所述M1、HA和NA蛋白。
26.权利要求25的方法，其中所述真核细胞选自酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、禽类细胞和哺乳动物细胞。
27.权利要求26的方法，其中所述真核细胞是昆虫细胞。
28.权利要求27的方法，其中所述昆虫细胞是Sf9。
29.一种昆虫细胞表达载体，其编码至少一种流感H5或N1蛋白。
30.一种包含流感VLP的疫苗，其中所述VLP包含流感M1、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人体中诱发针对流感病毒感染的显著的免疫力。
31.一种包含流感VLP的疫苗，其中所述VLP基本上由流感M1、HA和NA蛋白组成，其中所述疫苗在人体中诱发针对流感病毒感染的显著的免疫力。
32.一种包含流感VLP的疫苗，其中所述VLP包含选自流感M1、HA和NA蛋白的流感蛋白，其中所述疫苗在人体中诱发针对流感病毒感染的显著的免疫力。
33.一种在人体中诱发针对流感病毒感染的显著的免疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的权利要求30-32任一项的疫苗。
34.权利要求33的方法，其中所述疫苗通过口服、皮内、鼻内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用。
35.流感VLP用于制备疫苗的用途，其中所述VLP包含流感M1、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人体中诱发针对流感病毒感染的显著的免疫力。
36.流感VLP用于制备疫苗的用途，其中所述VLP基本上由流感M1、HA和NA蛋白组成，其中所述疫苗在人体中诱发针对流感病毒感染的显著的免疫力。
37.流感VLP用于制备疫苗的用途，其中所述VLP包含选自流感M1、HA和NA蛋白的流感蛋白，其中所述疫苗在人体中诱发针对流感病毒感染的显著的免疫力。
38.权利要求35-37任一项的用途，其中所述疫苗通过口服、皮内、鼻内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用给人。
39.权利要求16-19和30-32任一项的疫苗，其中所述疫苗已经过处理以灭活杆状病毒。
40.权利要求40的疫苗，其中所述灭活处理包括将含有VLP的样品在大约0.2％的β-丙内酯(BPL)中于大约25℃温育大约3小时。
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