KR102151962B1 - 어린 포유동물의 전염성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 혈청 조성물의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 혈청 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
어린 포유동물의 전염성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 혈청 조성물의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 혈청 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 전염성 병원체를 성체 동물에 점막 경로를 통해 투여하여 성체 동물로부터 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체의 생산을 유도하는 단계를 포함하는, 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 혈청을 신생(newborn) 또는 어린 동물에 투여하여 전염성 병원체의 감염으로부터 어린 동물을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의해 어린 동물은 전염성 병원체의 감염으로부터 성공적으로 방어될 수 있었다. 이러한 본 발명의 방법은 어린 포유동물에 있어서 기존의 백신을 대체하거나 또는 기존의 백신이 해결하지 못한 전염성 병원체, 특히 점막관련 (호흡기 및 소화기) 전염성 병원체의 감염을 예방 또는 치료하는데 효과적인 수단으로 사용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 혈청, 및 상기 혈청의 유효량을 신생 또는 어린 동물에 투여하여 어린 동물을 전염성 병원체의 감염으로부터 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
어린 포유동물에 있어서 전염성 병원체의 감염은 전신 질병 및, 소화기 또는 호흡기 질병과 같은 점막 관련 질병을 일으켜 어린 동물의 폐사 및 성장저해를 유발하는 주요 원인이 되고 있다. 자돈에 있어서 소화기 질병의 주요 원인체인 돼지 로타바이러스(Porcine rotavirus, PRV), 장독소형 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 등은 양돈농가에 널리 분포해 있으며, 전염성이 강한 전염성위장염 바이러스(transmissible Gastroenteritis virus, TGEV) 및 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 등은 높은 감염율(≤ 100%) 및 치사율(≥ 85%)을 나타내고 있다. 특히 북미 대륙에서 돼지유행성설사병의 발생은 양돈 산업에서 전염성 질병의 중요성을 한층 더 강조하고 있다.
어린 포유동물에서 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 하나의 방법은 방어항체를 모체로부터 습득하는 것이다. 이러한 모체로부터 습득한 수동면역은 어린 포유동물의 면역체계가 충분히 발달될 때까지 전염성 병원체의 감염으로부터 자신을 방어하는 중요한 수단이 되고 있다. 그러므로 임신한 모체로부터 전염성 병원체에 대한 체액성면역(humoral immunity)을 유도하여 어린 동물에 전달하는 모체 백신접종은 어린 동물을 전염성 병원체의 감염으로부터 방어하는 효과적인 방법으로 사용되고 있다. 예를 들면 일본뇌염 바이러스(Japanese B encephalitis virus, JEV), 돼지열병바이러스(classical Swine fever virus, CSFV)와 같은 비점막관련 전염성 병원체(nonmucosa-related infectious pathogen)에 있어서 근육을 통한 모돈의 백신접종은 모돈으로부터 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 IgG (Immunoglobulin G)를 주요 방어항체로 하는 체액성면역을 유도하여 상기 방어항체를 포함하고 있는 모돈의 초유를 섭취한 자돈은 이들 비점막관련 전염성 병원체의 감염으로부터 효과적으로 방어될 수 있음이 보고되었다.
그러나 모든 전염성 병원체에 대해 백신이 개발되어 있는 것은 아니며, 특히 소화기 또는 호흡기 질병을 일으키는 점막관련 전염성 병원체(mucosa-related infectious pathogen)의 감염을 방어하기 위해 실행되는 모체의 백신접종은 어린 동물의 전염성질병을 예방하는데 있어서 제한적인 효과만을 나타내었다. 예를 들면, ETEC, TGEV, PEDV 및 GAPRV 등과 같은 점막관련 전염성 병원체에 있어서 모돈이 근육을 통해 백신접종 되었을 때 모돈의 혈청은 이들 전염성 병원체에 대해 높은 바이러스 중화(viral neutralization, 이하 VN) 또는 세균 응집(agglutination, 이하 AG) 역가를 나타내지만, 백신 접종된 모돈의 초유를 섭취한 자돈은 이들 전염성 병원체의 감염으로부터 효과적으로 방어되지 않는 것으로 보고되고 있다. 자돈에서 점막관련 전염성 병원체의 감염을 방어하기 위한 또 다른 방법으로 난황 유래 IgY 및 젖소의 초유 유래 항체 등이 사용되고 있으나, 이들 또한 만족할 만한 결과에 이르지 못하고 있는 실정이다.
이와 같은 전염성 병원체의 감염에 대한 효과적인 예방 및 치료방법의 부재, 이로 인해 자돈에서 높은 감염율 및 치사율을 동반하는 전염병의 지속적인 발생, 그리고 약 10억 마리의 돼지 사육두수 (Food and Agriculture Organization (FAO) of the United Nations) 등을 고려할 때, 자돈에서 전염성 병원체의 감염은 세계 양돈산업에 매우 큰 경제적 손실을 초래하는 주요 원인이 되고 있다. 이와 같은 이유로 인하여 자돈을 포함한 어린 포유동물에서 전염성 병원체 특히, 점막관련 (호흡기 및 소화기) 전염성 병원체의 감염을 예방하고 치료할 수 있는 보다 효과적인 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
한편, 한국등록특허 제1671528호에는 '돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프와 점막면역보조제를 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1957040호에는 '돼지 유행성 설사병 바이러스의 N 말단 도메인을 유효성분으로 함유하는, 경구 투여용 백신 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 포유동물의 전염성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 혈청 조성물의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 혈청 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청 및 상기 혈청을 성체 동물로부터 유도·생산하는 방법을 제공하고, 생산된 혈청을 자돈을 포함한 신생(newborn) 또는 어린 포유동물에 투여하여 어린 포유동물을 전염성 병원체의 감염으로부터 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 성체 동물에 전염성병원체를 점막 경로를 통해 투여하여 성체 동물(PAMI serum donor)로부터 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청(the serum harboring protective antibodies or protective antibodies with mucosal immunity against infectious pathogens, PAMI serum)을 유도 생산하고, 생산된 PAMI serum을 효과적인 시간에 유효량을 경구 또는 정맥을 통해 신생 또는 어린 동물(PAMI serum recipient)에 투여하여 어린 동물을 전염성 병원체의 감염으로부터 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 명세서에서 사용된 PAMI serum은 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청을 의미한다. 더 구체적으로는 비점막관련 전염성 병원체에 대해서는 비점막관련 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 IgG를 주요 방어항체로 포함하는 혈청을 의미할 수 있고, 점막관련 전염성 병원체에 대해서는 점막관련 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 점막면역성이 있는 IgA 및 IgG를 주요 방어항체로 포함하는 혈청을 의미한다.
본 발명에 따른 실시예에서 자돈의 점막관련 전염성 병원체 (TGEV, PEDV, GARV, ETEC)를 경구를 통해 성돈에 투여하여 성돈(PAMI serum donor)으로부터 점막관련 전염성 병원체를 방어할 수 있는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함한 혈청 즉 PAMI serum을 유도 생산하였으며, 생산된 PAMI serum을 신생 자돈에 조기에 경구투여하여 자돈(PAMI serum recipient)을 점막관련 전염성 병원체의 실험감염으로부터 방어하였다. 또한 PEDV 발생농장에서 본 발명의 PAMI serum의 적용은 자돈을 PEDV 감염으로부터 완전히 방어하였으며, PEDV 발생농장에서 PEDV 감염의 확산을 성공적으로 종식시키는 놀라운 실험결과를 보여주었다. 이와 같이 본 발명의 방법에 의해 점막면역성이 있는 방어항체를 포함한 PAMI serum은 성공적으로 유도 및 생산되고 수동면역으로서 어린 동물에 성공적으로 전달되어 PAMI serum이 투여된 어린 동물이 전염성 병원체, 특히 점막관련 전염성 병원체의 감염으로부터 효과적으로 방어될 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이와 같이 PAMI serum을 이용한 본 발명의 방법은 자돈을 포함한 어린 포유동물에서 전염성 병원체의 감염을 예방 또는 치료하는데 응용되어 백신과 같은 기존의 방법을 대체하거나 또는 기존의 방법으로 해결하지 못하는 전염성 병원체, 특히 점막관련 (소화기 및 호흡기) 전염성 병원체의 감염을 예방 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있는 장점을 가진다.
본 발명의 PAMI serum은 동결건조를 통해 분말화시킬 경우 장기 보관이 가능하며, 어린 동물에 투여되기 전 수용성 용매를 추가하는 간단한 단계를 통해 용이하게 준비할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 전염성 병원체는 호흡기, 소화기 및 생식기와 같은 점막과 관련된 장기 및 조직에 질병을 일으키는 점막관련 전염성 병원체 및 그 이외의 장기 및 조직에 질병을 일으키는 비점막관련 전염성 병원체로서 어린 동물에서는 중증의 임상증상을 일으키나, 혈청 제조를 위해 이용된 성체 동물 즉, PAMI serum donor에서는 감염성은 있으나 임상적으로 무증상 또는 경증 수준의 증상을 일으키는 야외(wild type) 또는 약독화된(attenuated) 바이러스 또는 세균 등의 전염성 병원체를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 성체 동물(PAMI serum donor)은 면역체계가 충분히 발달되어 전염성 병원체 또는 전염성 병원체의 단백질이 투여되었을 때 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청 즉, PAMI serum을 유도 생산할 수 있는 동물을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 어린 동물(PAMI serum recipient)은 면역체계가 충분히 발달되지 않아 전염성 병원체의 감염에 대항하는 방어항체를 생산할 수 없는 어린 동물 또는 전염성 병원체의 감염을 예방하거나 치료하기 위해 외부로부터 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체의 투여가 필요한 동물을 의미한다. 그러므로, 성체 동물이라도 전염성 병원체에 대한 예방 또는 치료를 위해 수동면역이 필요한 동물은 어린 동물에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 전염성 병원체의 감염을 예방 또는 치료하기 위해 PAMI serum이 경구를 통해 투여되는 신생(newborn) 동물은 모체의 항체가 초유를 통해 새끼에게 전달되는 말, 돼지, 반추류 등에 속하는 어린 동물을 의미한다.
본 명세서에서 전염성 병원체의 감염을 예방하기 위해 PAMI serum이 정맥을 통해 투여되는 어린 동물은 모체의 항체가 초유를 통해서 또는 태반을 통해서 새끼에게 전달되는 모든 포유동물을 의미한다.
본 명세서에서 어린 동물에 투여되는 PAMI serum의 유효량은 PAMI serum이 신생 또는 어린 동물에 경구 또는 정맥을 통해 투여되었을 때 PAMI serum이 투여된 어린 동물이 전염성 병원체의 감염으로부터 예방 또는 치료될 수 있는 양을 의미한다.
본 명세서에서 PAMI serum이 경구를 통해 투여되는 효과적인 시간은 모체의 항체가 초유를 통해서 새끼에게 전달되는 말, 돼지, 반추류 동물 등의 신생 동물에 있어서 태어난 후 한 시간 안에 또는 경구 투여된 PAMI serum의 방어항체가 장에서 체내로 효과적으로 흡수될 수 있는 분만 후 이른 시간을 의미한다.
본 명세서에서 PAMI serum이 정맥을 통해 투여되는 효과적인 시간은 신생 또는 어린 동물에 있어서 전염성 병체의 감염을 예방 또는 치료하기 위해 PAMI serum의 투여가 필요한 때를 의미한다.
본 명세서에서 전염성 병원체의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 상기 PAMI serum을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 약학 조성물로 예방 또는 치료 가능한 질병은 전염성 병원체의 감염에 의한 호흡기 또는 소화기 관련 질병으로 코로나바이러스 감염증, 독감(인플루엔자 바이러스에 의한 급성 호흡기 질환), 아데노바이러스 감염증, 보카바이러스 감염증, 파라인플루엔자바이러스 감염증, 호흡기세포융합바이러스 감염증, 리노바이러스 감염증, 메타뉴모바이러스 감염증, 폐렴알균 감염증, 마이코플라즈마균 감염증, 클라미디아균 감염증, 로타바이러스 감염증, 노로바이러스 감염증, 장아데노바이러스 감염증, 아스트로바이러스 감염증, 사포바이러스 감염증, 대장균 감염증 또는 살모넬라 감염증 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 약학 조성물에 포함되는 PAMI serum의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다.
본 명세서에서, 어린 동물을 전염성 병원체의 감염으로부터 예방 또는 치료하기 위한 수의학적 조성물은 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 PAMI serum을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명에 따른 PAMI serum은 전염성 병원체에 대해 감염 억제 및 치료 효과를 가지고 있으므로, 수의학적 조성물로서 적용될 경우 전염성 병원체에 대한 면역력을 높여 가축의 건강상태를 유지 및 개선시킬 수 있다.
본 발명에서 실시된 동물실험에서 전염성 병원체 (TGEV, PEDV. GAPRV, ETEC 등)의 감염을 방어할 수 있는 혈청(PAMI serum)은 성체 동물(PAMI serum donor)로부터 성공적으로 유도 및 생산되었으며, 상기 혈청이 투여된 자돈(PAMI serum recipient)은 점막관련 전염성 병원체의 실험감염으로부터 효과적으로 방어되었다. 또한 PEDV 발생농장에서 신생 자돈에 상기 혈청의 투여는 신생 자돈을 PEDV 감염으로부터 완전히 방어할 수 있었으며, PEDV 발생농장에서 PEDV 감염의 확산을 성공적으로 종식시켰다.
본 발명에 의해 점막관련 전염성 병원체의 감염으로부터 자돈을 방어하는 방법은 전염성 병원체의 감염에 의한 자돈의 성장저해 및 폐사, 국내외의 돼지 사육두수 등을 고려할 때 국내뿐만 아니라 세계 양돈산업에 있어서 매우 큰 경제적 효과를 나타낼 것으로 사료된다.
본 발명에 있어서 혈청(PAMI serum)을 신생 자돈에 경구를 통해 투여하여 전염성 병원체의 감염을 예방하는 방법은 자돈에서 뿐만 아니라 또한, 모체의 항체가 초유를 통해 새끼에게 전달되는 말 및 반추류 등의 어린 동물에 적용되어 전염성 병원체의 감염을 방어하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 돼지, 말, 반추류 등의 신생동물에 혈청(PAMI serum)을 분만 후 조기에 경구를 통해 투여하는 것과는 달리, 정맥을 통한 상기 혈청의 투여는 신생 동물의 장닫힘 시간과는 무관하게 전염성 병원체에 대한 수동면역을 어린 동물에 전달할 수 있다. 따라서, 혈청(PAMI serum)을 정맥을 통해 어린 동물(PAMI serum recipient)에 투여하여 전염성 병원체의 감염을 방어하는 방법은 모체의 항체가 초유를 통해 또는 임신 중 태반을 통해 새끼에게 전달되는 모든 어린 포유동물에 적용되어 어린 동물을 전염성 병원체의 감염으로부터 예방할 뿐만 아니라 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청은 하나 이상의 다수의 전염성 병원체에 대해 만들어 질 수 있으며 또한, 한 개체(PAMI serum donor)로부터 지속적으로 유지·생산될 수 있다.
본 발명에 있어서, 어린 동물에 투여되는 혈청(PAMI serum)의 용량 또는 전염성 병원체에 대한 혈청의 역가 등을 증감시켜, 상기 혈청이 투여된 어린 동물이 전염성 병원체로부터 방어될 수 있는 수동면역 기간을 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 혈청(PAMI serum)이 투여된 자돈은 모돈으로부터 조기 격리되어 대용유 급여에 의해 성장할 수 있었다. 이와 같이 모돈으로부터 자돈의 조기격리는 모돈에 의한 포유자돈의 압사를 막을 수 있고, 산자수가 많은 모돈에서 모유량 및 유두수의 부족 문제 등을 해결함으로 연간 모돈에 대한 자돈의 이유두수 (Piglet per Sow per Year, PSY)를 증가시킬 수 있으므로, 양돈 농가의 생산성 향상 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 혈청(PAMI serum)은 돼지, 말, 반추류 등을 포함한 어린 포유동물의 점막관련 또는 비점막관련 전염성 병원체의 감염을 방어하는데 있어 기존의 백신을 대체할 수 있을 뿐만 아니라, 기존 백신이 해결하지 못하는 전염성 병원체, 특히 점막관련 (호흡기 및 소화기) 전염성 병원체의 감염을 예방하거나 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
도 1A 내지 도 1C는 성돈 혈청의 바이러스 중화(viral neutralization, VN) 및 세균 응집(agglutination, AG) 역가를 나타낸 그림이다. 성돈은 전염성 병원체 [TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1, E. coli(K88, K99, F18)]에 의해 26주 동안 매주 경구 감염되었으며, 성돈으로부터 전염성 병원체 감염 전(week 0)의 혈청(control serum) 및 전염성 병원체 감염 후(week 26)의 혈청(PAMI serum)은 각각 수집되었다. 또한 전염성 병원체(PEDV-sm98 또는 KPEDV-9)에 의해 근육을 통해 백신접종된 한 마리의 성돈으로부터 백신접종 전의 혈청(control serum) 및 백신접종 후의 혈청(vac-control serum)은 각각 수집되었다. 전염성 병원체 감염 전의 성돈혈청(control serum), 전염성 병원체 감염 26주 후의 성돈혈청(PAMI serum), 백신접종 전의 성돈혈청(control serum), 백신접종 후의 성돈혈청(vac-control serum)의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가는 재료 및 방법에 따라 조사되었다. 각 그래프 상의 숫자 표기는 해당 레인(컬럼)을 의미한다.
도 1A는 성돈(거세 수퇘지)에서 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1 또는 E. coli(K88, K99, F18)에 의한 경구 감염 전 및 후에 성돈으로부터 수집된 혈청(control serum 및 PPMI serum)의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 1B는 성돈(암퇘지)에서 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1, E. coli(K88, K99, F18)에 의해 경구 감염 전 및 후에 성돈로부터 수집된 혈청(control serum 및 PAMI serum)의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 1C는 백신(PEDV-sm98, KPEDV-9) 접종 후의 성돈혈청(vac-control serum) 및 백신 접종 전의 성돈혈청(control serum)의 PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1에 대한 VN 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 2A 및 도 2B는 control serum 및 PAMI serum이 투여된 자돈에서 전염성 병원체 실험감염 후 관찰된 임상증상을 나타낸 그림이다. 각각의 자돈 그룹에서 control serum은 control serum-fed piglets 그룹 자돈에, PAMI serum은 PAMI serum-fed piglets 그룹 자돈에 경구를 통해 투여된 후, 그룹 A 자돈은 TGEV-wt1에, 그룹 B 자돈은 PEDV-wt1에, 그룹 C 자돈은 GAPRV-wt1에, 그룹 D 자돈은 E. coli(K88)에 의해 기술된 재료 및 방법에 따라 각각 감염되고 자돈의 임상증상은 관찰되었다. 각 그래프 상의 숫자 표기는 해당 레인(컬럼)을 의미한다.
도 2A는 control serum 및 PAMI serum이 투여된 각각의 자돈 그룹에서 TGEV-wt1에 실험 감염된 그룹 A 자돈, PEDV-wt1에 실험 감염된 그룹 B 자돈, GAPRV-wt1에 실험 감염된 그룹 C 자돈 및 E.coli(K88)에 실험 감염된 그룹 D 자돈의 치사율을 나타낸 그림이다.
도 2B는 Control serum 및 PAMI serum이 투여된 각각의 자돈 그룹에서 TGEV-wt1에 실험 감염된 그룹 A 자돈, PEDV-wt1에 실험 감염된 그룹 B 자돈, GAPRV-wt1에 실험 감염된 그룹 C 자돈 및 E.coli(K88)에 실험 감염된 그룹 D 자돈의 설사발생률을 나타낸 그림이다.
도 3A 내지 도 3D는 분만 전·후에 수집된 모돈 혈청의 전염성 병원체에 대한 VN 및 AG 역가를 나타낸 그림이다. 혈청은 분만 전 후에 네 마리 초산 모돈(모돈1, 모돈2, 모돈3, 모돈4)으로부터 수집되었으며, 수집된 혈청의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가는 기술된 재료 및 방법에 따라 측정되었다. 각 그래프 상의 숫자 표기는 해당 레인(컬럼)을 의미한다.
도 3A는 분만 전·후에 수집된 모돈1 혈청의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 3B는 분만 전·후에 수집된 모돈2 혈청의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 3C는 분만 전·후에 수집된 모돈3 혈청의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 3D는 분만 전·후에 수집된 모돈4 혈청의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 4는 분만 후 PAMI serum이 자돈에 경구 투여된 시간과 전염성 병원체 (PEDV-wt1)에 실험감염된 자돈의 임상증상을 나타낸 그림이다. 동일한 복안의 자돈에서 PAMI serum은 분만 후 1시간 내에 "0 시간 그룹 자돈(n=3)"에, 분만 후 12시간 내에 "12시간 그룹 자돈(n=3)"에, 분만 후 18 시간 내에 "18시간 그룹 자돈(n=3)"에 각각 경구투여 되었다. 분만 3일 후에 PAMI serum이 투여된 3 그룹의 자돈은 PEDV-wt1(1x106 TCID50/a piglet)에 의해 기술된 재료 및 방법에 따라 실험감염된 후 치사율 및 설사발생률은 생후 28일령까지 관찰되었다. 각 그래프 상의 숫자 표기는 해당 레인(컬럼)을 의미한다.
도 5A 및 도 5B는 PEDV 감염 발생 농장에서 분만 후 1시간 이내에 PAMI serum이 경구 투여된 자돈그룹(n=280) 및 vac-control serum이 경구 투여된 자돈그룹(n=9)의 임상증상을 나타낸 그림이다. PEDV 발생농장에서 PAMI serum은 PAMI serum fed piglets 그룹 (n=280)에, vac-control serum은 vac-control serum fed piglets 그룹 (n=9)에 분만 후 1시간내에 경구를 통해 기술된 재료 및 방법에 따라 각각 투여된 후 자돈의 임상증상은 생후 28일령까지 관찰되었다. 각 그래프 상의 숫자 표기는 해당 레인(컬럼)을 의미한다. NA(not applicable): 해당사항 없음.
도 5A는 PEDV 발생농장에서 PAMI serum이 투여된 자돈 및 vac-control serum이 투여된 자돈의 치사율을 나타낸 그림이다.
도 5B는 PEDV 발생농장에서 PAMI serum이 투여된 자돈 및 vac-control serum이 투여된 자돈의 설사발생률을 나타낸 그림이다.
도 1A는 성돈(거세 수퇘지)에서 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1 또는 E. coli(K88, K99, F18)에 의한 경구 감염 전 및 후에 성돈으로부터 수집된 혈청(control serum 및 PPMI serum)의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 1B는 성돈(암퇘지)에서 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1, E. coli(K88, K99, F18)에 의해 경구 감염 전 및 후에 성돈로부터 수집된 혈청(control serum 및 PAMI serum)의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 1C는 백신(PEDV-sm98, KPEDV-9) 접종 후의 성돈혈청(vac-control serum) 및 백신 접종 전의 성돈혈청(control serum)의 PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1에 대한 VN 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 2A 및 도 2B는 control serum 및 PAMI serum이 투여된 자돈에서 전염성 병원체 실험감염 후 관찰된 임상증상을 나타낸 그림이다. 각각의 자돈 그룹에서 control serum은 control serum-fed piglets 그룹 자돈에, PAMI serum은 PAMI serum-fed piglets 그룹 자돈에 경구를 통해 투여된 후, 그룹 A 자돈은 TGEV-wt1에, 그룹 B 자돈은 PEDV-wt1에, 그룹 C 자돈은 GAPRV-wt1에, 그룹 D 자돈은 E. coli(K88)에 의해 기술된 재료 및 방법에 따라 각각 감염되고 자돈의 임상증상은 관찰되었다. 각 그래프 상의 숫자 표기는 해당 레인(컬럼)을 의미한다.
도 2A는 control serum 및 PAMI serum이 투여된 각각의 자돈 그룹에서 TGEV-wt1에 실험 감염된 그룹 A 자돈, PEDV-wt1에 실험 감염된 그룹 B 자돈, GAPRV-wt1에 실험 감염된 그룹 C 자돈 및 E.coli(K88)에 실험 감염된 그룹 D 자돈의 치사율을 나타낸 그림이다.
도 2B는 Control serum 및 PAMI serum이 투여된 각각의 자돈 그룹에서 TGEV-wt1에 실험 감염된 그룹 A 자돈, PEDV-wt1에 실험 감염된 그룹 B 자돈, GAPRV-wt1에 실험 감염된 그룹 C 자돈 및 E.coli(K88)에 실험 감염된 그룹 D 자돈의 설사발생률을 나타낸 그림이다.
도 3A 내지 도 3D는 분만 전·후에 수집된 모돈 혈청의 전염성 병원체에 대한 VN 및 AG 역가를 나타낸 그림이다. 혈청은 분만 전 후에 네 마리 초산 모돈(모돈1, 모돈2, 모돈3, 모돈4)으로부터 수집되었으며, 수집된 혈청의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가는 기술된 재료 및 방법에 따라 측정되었다. 각 그래프 상의 숫자 표기는 해당 레인(컬럼)을 의미한다.
도 3A는 분만 전·후에 수집된 모돈1 혈청의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 3B는 분만 전·후에 수집된 모돈2 혈청의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 3C는 분만 전·후에 수집된 모돈3 혈청의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 3D는 분만 전·후에 수집된 모돈4 혈청의 TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대한 VN 역가 및 E. coli(K88, K99, F18)에 대한 AG 역가를 각각 나타낸 그림이다.
도 4는 분만 후 PAMI serum이 자돈에 경구 투여된 시간과 전염성 병원체 (PEDV-wt1)에 실험감염된 자돈의 임상증상을 나타낸 그림이다. 동일한 복안의 자돈에서 PAMI serum은 분만 후 1시간 내에 "0 시간 그룹 자돈(n=3)"에, 분만 후 12시간 내에 "12시간 그룹 자돈(n=3)"에, 분만 후 18 시간 내에 "18시간 그룹 자돈(n=3)"에 각각 경구투여 되었다. 분만 3일 후에 PAMI serum이 투여된 3 그룹의 자돈은 PEDV-wt1(1x106 TCID50/a piglet)에 의해 기술된 재료 및 방법에 따라 실험감염된 후 치사율 및 설사발생률은 생후 28일령까지 관찰되었다. 각 그래프 상의 숫자 표기는 해당 레인(컬럼)을 의미한다.
도 5A 및 도 5B는 PEDV 감염 발생 농장에서 분만 후 1시간 이내에 PAMI serum이 경구 투여된 자돈그룹(n=280) 및 vac-control serum이 경구 투여된 자돈그룹(n=9)의 임상증상을 나타낸 그림이다. PEDV 발생농장에서 PAMI serum은 PAMI serum fed piglets 그룹 (n=280)에, vac-control serum은 vac-control serum fed piglets 그룹 (n=9)에 분만 후 1시간내에 경구를 통해 기술된 재료 및 방법에 따라 각각 투여된 후 자돈의 임상증상은 생후 28일령까지 관찰되었다. 각 그래프 상의 숫자 표기는 해당 레인(컬럼)을 의미한다. NA(not applicable): 해당사항 없음.
도 5A는 PEDV 발생농장에서 PAMI serum이 투여된 자돈 및 vac-control serum이 투여된 자돈의 치사율을 나타낸 그림이다.
도 5B는 PEDV 발생농장에서 PAMI serum이 투여된 자돈 및 vac-control serum이 투여된 자돈의 설사발생률을 나타낸 그림이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전염성 병원체를 성체 동물에 점막 경로를 통해 투여하여 성체 동물로부터 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체의 생산을 유도하는 단계를 포함하는, 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 '혈청(serum)'이란 혈장에서 섬유소를 뺀 나머지를 의미하는 것으로, 본 발명에 따른 상기 혈청에는 성체 동물에 투여한 전염성 병원체 또는 이의 단백질에 의한 면역반응으로 유도된 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하고 있다.
본 발명에 따른 혈청의 제조방법에 있어서, 상기 전염성 병원체는 성체 동물에 감염성은 있으나 무증상 또는 경미한 임상 증상을 유발하고, 어린 동물에는 심한 임상 증상을 유발하는 감염성 및 병원성이 있는 야외 주(wild type) 또는 약독화된(attenuated) 바이러스 또는 세균일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니나, 감염성 및 병원성이 있으며 소화기 또는 호흡기 질병을 유발하는 바이러스 또는 세균일 수 있다.
또한, 본 발명의 전염성 병원체는 전염성 병원체의 단백질을 포함할 수도 있다. 상기 단백질은 전염성 병원체에서 면역원성이 있는 단백질, 상기 단백질의 단편 또는 불활화된(inactivated) 전염성 병원체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 '면역원성(immunogenicity)'이란 면역반응을 유도할 수 있는 항원의 능력을 의미하는 것으로, 면역원성은 주로 항원의 크기 및 항원이 그 동물에 존재하는 경우에 항원결정기의 차이에 따라 좌우되며, 같은 항원이라도 투여방법이나 투여 동물에 따라 면역원성은 달라진다.
본 발명에 따른 혈청의 제조방법에 있어서, 상기 전염성 병원체의 투여 용량은 성체 동물의 혈청 내에 전염성 병원체에 대한 방어항체를 충분히 유도 및 생산할 수 있는 용량일 수 있고, 전염성 병원체의 종류 및 상태에 따라 당업자가 적절한 용량을 선택하여 사용할 수 있으며, 혈청 내에 유효한 수준의 방어항체가 유도 및 생성될 수 있도록 투여 횟수를 조절할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 혈청의 제조방법에 있어서, 상기 점막 경로(mucosal route) 투여는 바람직하게는 경구 투여 또는 비강 투여일 수 있고, 상기 점막 경로로 전염성 병원체를 투여하여야 점막면역성이 있는 방어항체가 생성되게 된다. 종래 백신 조성물은 면역원을 근육 주사 등의 비점막 경로로 투여하여 항체 생성을 유도한 것으로, 비점막 경로 투여에 의해 유도 및 생성된 방어항체를 포함하는 혈청의 경우 점막면역성이 결여되어 있으므로, 점막 관련 전염성 병원체의 감염을 예방하기 위한 수동면역원으로 사용될 때 감염 예방 효과가 높지 않은 단점이 있다.
본 발명에 따른 혈청의 제조방법에 있어서, 상기 성체 동물은 면역체계가 충분히 발달되어 전염성 병원체 또는 이의 단백질이 투여되었을 때 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청을 유도 및 생산할 수 있는 동물을 의미하며, 바람직하게는 상기 동물은 포유동물일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 돼지, 말, 반추류 동물(ruminants) 또는 인간 등을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 혈청의 제조방법에 있어서, 상기 방어항체는 전염성 병원체 또는 이의 단백질에 특이적인 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역글로불린(Immunoglobulin)을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 비점막 관련 전염성 병원체에 대해서는 IgG의 면역글로불린이 주요 방어항체이며, 점막 관련 전염성 병원체에 대해서는 점막면역성이 있는 IgA 및 IgG 면역글로불린이 주요 방어항체일 수 있다. 또한, 상기 IgA는 분비형 IgA(secretory IgA, sIgA)를 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청을 제공한다.
본 명세서에서, 상기 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청을 PAMI serum (the serum harboring protective antibodies or protective antibodies with mucosal immunity against infectious pathogens)으로 명명하였고, 상기 PAMI serum은 전염성 병원체 또는 이의 단백질의 다양한 부분(epitope)을 인식하고 각기 다른 항원인식부위를 가지는 방어항체들이 혼합되어 있는 것이 특징이다.
또한, 본 발명의 PAMI serum은 동결건조를 통해 분말화시킬 경우 장기 보관이 가능하며, 어린 동물에 투여되기 전 수용성 용매 예컨대, 물을 추가하는 간단한 단계를 통해 용이하게 준비할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청은 수동면역(passive immunity)에 사용될 수 있고, 용어 '수동면역'이란 항원 자극을 받지않고 있는 개체에, 다른 개체가 항원 자극에 의해 면역응답에서 만들어낸 항체 또는 감작림프구(sensitized lymphocyte)를 주입시켜 획득되는 면역을 말한다. 수동면역은 백신을 주사하여 항체 생성을 유도하는 것과 같은 능동면역에 비해 빠른 시간내에 방어효과를 얻을 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 또한, 상기 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청의 유효량을 신생(newborn) 또는 어린 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 어린 동물을 전염성 병원체의 감염으로부터 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 어린 동물은 면역체계가 충분히 발달되지 않아 전염성 병원체의 감염에 대한 방어항체를 생산할 수 없거나, 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체의 습득이 필요한 어린 동물일 수 있고, 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물, 예를 들면 돼지, 말 또는 반추류 동물(ruminants)일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 반추류 동물은 소, 양, 염소, 낙타 및 사슴 등일 수 있다.
본 발명에 따른 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청의 바람직한 투여는 경구 또는 정맥 경로를 통한 투여일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 경구 투여는 초유를 통해 모체 항체가 전달될 수 있는 말, 돼지 또는 반추류 신생 동물에 적용될 수 있으며, 상기 경구 투여는 신생 동물의 분만 후 1 시간 이내에 투여되는 것이 바람직할 수 있다. 상기 경구 투여의 시간대(time window)는 본 발명의 혈청이 신생 동물에 투여되어서 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체를 흡수하고 가장 현저한 수동면역 효과를 나타낼 수 있는 시간 영역대이다.
또한, 상기 정맥을 통한 혈청의 투여는 신생 및 어린 동물을 포함하는 모든 포유동물에 적용될 수 있다. 상기 정맥을 통해 투여되는 효과적인 시간은 어린 동물에 있어서 전염성 병원체의 감염을 예방 또는 치료하기 위해 외부로부터 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체가 포함된 혈청의 투여가 필요한 시점을 의미한다.
본 발명에 따른 혈청의 투여는 면역학적 유효량으로 투여할 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 전염성 병원체의 감염을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 특정 면역원 및 병원체에 대한 항체의 역가에 따라 달라지며, 대상 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 예방 또는 치료 방법은, 상기 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청에 하나 이상의 면역 증강제를 추가로 혼합하여 신생 또는 어린 동물에 투여할 수 있다.
본 발명에 포함될 수 있는 면역증강제는 본 발명의 혈청을 투여한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 전염성 병원체는 소화기 또는 호흡기 질병을 유발하는 바이러스 또는 세균일 수 있고, 리노바이러스(rhinovirus), 코로나바이러스(Coronavirus), 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza virus), 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus), 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 홍역 바이러스(measles virus), 한타바이러스(Hantavirus), 노로바이러스(Norovirus), 엔테로바이러스(Enterovirus), 돼지 로타바이러스(Porcine rotavirus), 전염성위장염 바이러스(transmissible Gastroenteritis virus), 돼지 유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus), 장독소형 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli), 일본뇌염 바이러스(Japanese B encephalitis virus), 돼지열병바이러스(classical Swine fever virus), 아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus), 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus), E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus), 파보바이러스(Parvovirus), 게타바이러스(Getah virus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 돼지 호흡기 코로나 바이러스(Porcine respiratory corona virus), 돼지 델타 코로나바이러스(Swine delta coronavirus), 돼지 인플루엔자(Swine influenza), 돼지수포병 바이러스(Swine vesicular disease virus), 악성카타르열 바이러스(malignant catarrhal fever virus), 소 코로나바이러스(Bovine coronavirus), 4형 소 헤르페스 바이러스(Bovine herpes virus type 4), 소 파라인플루엔자 바이러스(Bovine parainfluenza virus), 소 합포성 폐염 바이러스(Bovine respiratory syncytial virus), 우역 바이러스(Rinderpest virus), 블루텅바이러스(Bluetongue virus), 웨스트나일열 바이러스(West Nile Fever virus), 소 바이러스성 설사 바이러스(bovine viral diarrhea virus), 수포성구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 소 전염성 비기관염 바이러스(infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR) Virus), 산양 뇌염바이러스(Caprine encephalitis virus), 아프리카마역 바이러스(African horse sickness virus), 말 뇌염바이러스(Equine encephalitis virus), 말 전염성빈혈 바이러스(Equine infectious anemia virus), 아까바네바이러스(Akabane virus), 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 미코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae), 클라미디아 폐렴균(Chlamydia pneumonia), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 브루셀라 종(Brucella spp.), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 비브리오 종(Vibrio spp.), 렙토스피라 종(Leptospira spp.), 클로스트리듐 종(Clostridium spp.), 이질균(Shigella), 에르시니아 종(Yersinia), 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis), 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 만헤미아 해몰리티카(Mannhemia haemolytica), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 히스토필루스 솜니(Histophilus somni), 브라키스피라 하이오디센테리에(Brachyspira hyodysenteriae), CFV(Campylobacter fetus subsp. venerealis), CFF(C. fetus subsp. fetus), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetti), 타일로렐라 에퀴제니탈리스(Taylorella equigenitalis). 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella brochiseptica), 헤포필러스 파라수이스(Hemophilus parasuis), 돼지단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae) 또는 에리시펠로트릭스 루소파티애(Erysipelothrix rhusopathiae) 등일 수 있으며, 바람직하게는 돼지 로타바이러스(Porcine rotavirus), 전염성위장염 바이러스(transmissible Gastroenteritis virus), 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus) 또는 장독소형 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청을 유효성분으로 포함하는, 전염성 병원체의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 혈청외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 물 및 마그네슘 스테아레이트를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 경로, 항체의 반감시, 항체의 역가 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며, 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 전염성 병원체의 감염에 의한 질병은 이에 한정되지 않으나, 코로나바이러스 감염증, 독감(인플루엔자 바이러스에 의한 급성 호흡기 질환), 아데노바이러스 감염증, 보카바이러스 감염증, 파라인플루엔자바이러스 감염증, 호흡기세포융합바이러스 감염증, 리노바이러스 감염증, 메타뉴모바이러스 감염증, 폐렴알균 감염증, 마이코플라즈마균 감염증, 클라미디아균 감염증, 로타바이러스 감염증, 노로바이러스 감염증, 장아데노바이러스 감염증, 아스트로바이러스 감염증, 사포바이러스 감염증, 대장균 감염증 또는 살모넬라 감염증 등일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청을 유효성분으로 포함하는, 어린 동물을 전염성 병원체의 감염으로부터 예방 또는 치료하기 위한 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청은 전염성 병원체에 대해 감염 억제 및 치료 효과를 가지고 있으므로, 가축의 면역력을 높여 가축의 건강상태를 유지 및 개선시킬 수 있다.
본 발명의 수의학적 조성물은 수의학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 혈청의 수의학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 수의학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 혈청을 포함하는 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물 및 마그네슘 스테아레이트를 들 수 있다.
본 발명에 따른 혈청을 포함하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 멸균 주사용액 등의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 수의학적 조성물에 있어서, 상기 전염성 병원체는 소화기 또는 호흡기 질병을 유발하는 바이러스 또는 세균일 수 있으며, 전술한 것과 같다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재료 및 방법
1-1. 세포, 바이러스, 박테리아
베로 세포 (Vero cells), 돼지고환 세포 (swine testis cell, ST cells), 붉은털 원숭이 태아 신장세포 (fetal rhesus monkey kidney (MA104) cells)는 5-10% 소 태아혈청 (fetal bovine serum, FBS), 페니실린(100 units/㎖), 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)이 포함된 EMEM (Eagle's minimum essential medium) 또는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 이용하여 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양되었다. 야외주 돼지 유행성설사병바이러스 (PEDV-wt1), 야외주 돼지 전염성위장관염바이러스 (TGEV-wt1), 야외주 돼지 로타바이러스 (GAPRV-wt1), 백신주 바이러스인 KPEDV-9 (Korea BNP, Korea), PEDV-m98 (Green Cross Veterinary Products Co., LTD, Korea), TGEV(175L) (Green Cross Veterinary Products Co., LTD, Korea) 및 GAPRV-vac (Green Cross Veterinary Products Co., LTD, Korea), 돼지 장독소형 대장균 (ETEC)인 K88, K99 및 F18 균주 (Veterinary Science Research Institute, Korea) 등이 사용되었다. PEDV는 Vero 세포에 트립신(10 ㎍/㎖)이 포함된 DMEM을 사용하여, TGEV는 ST 세포에 DMEM을 사용하여, GAPRV는 MA104 세포에 트립신(0.5-1.5 ㎍/㎖)을 포함하는 EMEM (또는 DMEM)을 사용하여 각각 증식되었다. 그리고 ETEC는 LB broth (Affymetrix, Inc. OH, USA)에 배양되었다.
1-2. 바이러스 야외주의 분리
야외주 TGEV (Zhenhui S et al., 2015. Israel Journal of Veterinary Medicine 70:22-30), 야외주 PEDV (Chen Q et al., 2014. J Clin Microbiol 52:234-243), 야외주 GAPRV (Arnold M et al., 2009. Curr Protoc Microbiol Chapter 15:Unit 15C 13)는 각각의 바이러스에 감염된 자돈의 소장으로부터 기존의 기술된 방법에 따라 분리되었고, PEDV-wt1, GAPRV-wt1, TGEV-wt1로 각각 명명되었다.
1-3. 바이러스 역가측정
바이러스의 역가 측정은 기존의 기술된 방법에 따라 실행되었다. PEDV의 역가측정 (Thomas JT et al., 2015. PLoS One 10:e0139266)을 위해서 96-well culture plate에 배양된 80-90% monolayer Vero 세포는 PBS로 3번 세척되었다. 그리고 37℃에서 1시간 동안 트립신(10 ㎍/㎖)에 활성화된 PEDV는 DMEM에서 단계적으로 연속 희석되었으며, 각각의 희석된 0.1 ㎖ PEDV는 PBS로 세척된 Vero 세포에 접종되었다. 바이러스에 접종된 Vero 세포는 37℃에 1시간 동안 반응 후 바이러스 접종액은 트립신(10 ㎍/㎖)을 포함하는 0.2 ㎖ DMEM으로 치환되었고 Vero 세포는 3-5일 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양되었다. TGEV의 역가측정 (He L et al., 2012. Virol J 9:176)을 위해서 96-well culture plate에 배양된 80-90% monolayer ST 세포는 PBS로 3번 세척되었다. 그리고 TGEV는 DMEM에서 단계적으로 연속 희석되었으며 각각의 희석된 0.1 ㎖ TGEV는 PBS로 세척된 ST 세포에 접종되었다. 바이러스에 접종된 ST 세포는 37℃에 1시간동안 반응 후 바이러스 접종액은 0.2 ㎖ DMEM (5% FBS)으로 치환되었고 ST 세포는 3-5일 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양되었다. GAPRV의 역가측정 (Otto PH et al., 2015. J Virol Methods 223:88-95)을 위해서 96-well culture plate에 배양된 80-90% monolayer MA104 세포는 PBS로 3번 세척되었다. 그리고 37℃에 1시간 동안 트립신에(10 ㎍/㎖) 활성화된 GAPRV는 EMEM (또는 DMEM)에서 단계적으로 연속 희석되었으며 각각의 희석된 0.1 ㎖ GAPRV는 PBS로 세척된 MA104 세포에 접종되었다. 바이러스 접종된 MA104 세포는 37℃에 1시간 동안 반응 후 바이러스 접종액은 트립신(0.5-1.5 ㎍/㎖)이 포함된 0.2 ㎖ EMEM (또는 DMEM)으로 치환되었고 MA104 세포는 5-7일 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양되었다. 바이러스 접종에 의한 세포변성효과 (cytopathic effect, CPE)가 뚜렷이 나타났을 때 바이러스 접종된 세포는 30분동안 10% 포르말린에 고정된 후 0.5% crystal violet (w/v)으로 염색되었다. 바이러스 역가를 나타내는 50% 조직배양 감염 용량 (fifty percent tissue culture infective doses, TCID50)은 각각의 희석된 바이러스에 감염된 세포에서 CPE를 나타내는 가장 높은 바이러스 희석배수의 역으로 계산되었다.
1-4. 실험동물 및 전염성 병원체의 접종
농장에서 구입된 다섯 마리 임신한 초산돈 (모돈 1, 모돈 2, 모돈 3, 모돈 4, 모돈 5)은 각각 분리된 장소에서 사육되었다. 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청 즉 PAMI serum을 유도 생산하기 위해 4마리의 성돈(두 마리의 암퇘지(female pigs)와 두 마리의 거세된 수퇘지(castrated male pigs))은 한 장소에서 사육되었다. 그리고 40 ㎖의 각 바이러스 (106 TCID50/㎖) [TGEV(175L), TGEV-wt1, PEDV-m98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac 및 GAPRV-wt1] 및 18시간 배양된 400 ㎖의 각 E. coli(K88, K99 및 F18)는 돼지 사료와 혼합되어 4마리 성돈에 26주 동안 매주 투여되었다. 백신주에 접종된 돼지의 혈청(vac-control serum)을 생산하기 위해 백신주(KPEDV-9 및 PEDV-m98)는 제조회사의 용법에 따라 근육 경로를 통해 2주 간격으로 2회에 걸쳐 한 마리의 성돈에 접종되었다. 그리고 마지막 접종 후 2주 간격으로 두 번의 추가접종이 실시되었다.
1-5. 혈청 및 역가 측정
네 마리의 초산돈(모돈 1, 모돈 2, 모돈 3, 모돈 4)으로부터 분만 전 혈청 및 분만 후 혈청, 전염성 병원체(PEDV, TGEV, GAPRV 및 E. coli) 투여 전의 4마리 성돈의 혈청(control serum) 및 전염성 병원체 투여 26주 후의 성돈의 혈청(PAMI serum), 그리고 백신주(KPEDV-9 및 PEDV-sm98) 접종 전의 돼지 혈청 및 백신주(KPEDV-9 및 PEDV-sm98) 접종 후의 돼지 혈청(vac-control serum) 등은 유정맥(milk vein) 또는 경동맥(carotid artery)을 통해 각각 수집되었으며, 또한 수집된 모든 혈청에서 PEDV, TGEV 및 GAPRV에 대한 VN 역가 및 E. coli에 대한 AG 역가는 각각 측정되었다.
TGEV, PEDV 및 GAPRV에 대한 혈청의 VN 역가는 기존의 발표된 방법에 따라 수행되었다. 간단하게, 각 혈청은 56℃에 30분 동안 열처리 되었고 round-bottomed micro-titer 96 well plate에서 DMEM (또는 EMEM)을 사용하여 2배수 연속 희석 되었다. 50 ㎕의 바이러스 (200 TCID50/50 ㎕)와 50 ㎕의 희석된 혈청은 혼합되어 37℃에서 30분 동안 반응되었다. 100 ㎕의 PEDV/혈청 혼합물은 96-well culture plate에 배양된 monolayer Vero 세포에, 100 ㎕의 TGEV/혈청 혼합물은 96-well culture plate에 배양된 monolayer ST 세포에, 100 ㎕의 GAPRV/혈청 혼합물은 96-well culture plate에 배양된 monolayer MA104 세포에 각각 더하여진 후 37℃에서 2시간 동안 반응되었다. 바이러스 흡착 후 TGEV/혈청 혼합물은 5% FBS를 포함하는 0.2 ㎖ DMEM으로, PEDV/혈청 혼합물은 10 ㎍/㎖의 트립신을 포함하는 0.2 ㎖ DMEM으로, GAPRV/혈청 혼합물은 0.5-1.5 ㎍/㎖의 트립신을 포함하는 0.2 ㎖ EMEM (또는 DMEM)으로 각각 치환되었다. 그리고 바이러스 감염된 96-well culture plate의 세포는 37℃, CO2 인큐베이터에서 3-7일 동안 배양되었다. 바이러스에 감염된 세포에서 뚜렷한 CPE 현상이 나타날 때, 바이러스에 접종된 96-well culture plate의 세포는 실온에서 30분 동안 10% 포르말린으로 고정된 후 0.5% crystal violet (w/v)으로 염색되었다. 바이러스에 대한 혈청의 VN 역가는 바이러스/혈청 혼합물이 접종된 monolayer 세포에서 CPE를 보이지 않는 혈청의 최고희석배수의 역으로 표현되었다.
E. coli에 대한 혈청의 AG 역가를 조사하기 위해서 AG assay가 실시되었다. E. coli는 LB broth에 37℃, 18시간 동안 배양된 후 1% 포르말린으로 12시간 처리되었다. 포르말린 처리된 E. coli는 PBS로 3번 세척된 후, OD600 0.7의 값으로 PBS에 희석되어 혈청의 AG 역가 측정을 위한 E. coli 항원으로 사용되었다. 96 U-shaped plate 위에서 2배수로 연속 희석된 100 ㎕ 혈청과 100 ㎕ E. coli 항원은 혼합된 후 37℃에서 3시간 동안 반응되었다. E. coli에 대한 혈청의 AG 역가는 E. coli 항원과 반응하여 뚜렷한 응집을 나타내는 혈청의 최고희석배수의 역으로 표현되었다.
1-6. 전염성 병원체 감염실험
PAMI serum이 투여된 자돈이 전염성 병원체의 감염으로부터 방어될 수 있는지를 조사하기 위해 전염성병원체 감염실험이 4마리(모돈 1, 모돈 2, 모돈 3 및 모돈 4) 초산돈으로부터 태어난 자돈에서 실시되었다. 모돈 1로부터 태어난 group A 자돈 [control serum fed piglets (n=7) 및 PAMI serum fed piglets (n=3)]은 TGEV-wt1 감염실험을 위해, 모돈 2로부터 태어난 group B 자돈 [control serum fed piglets (n=8) 및 PAMI serum fed piglets (n=3)]은 PEDV-wt1 감염실험을 위해, 모돈 3으로부터 태어난 group C 자돈 [control serum fed piglets (n=7) 및 PAMI serum fed piglets (n=3)]은 GAPRV-wt1 감염실험을 위해, 모돈 4로부터 태어난 group D 자돈 [control serum fed piglets (n=8) 및 PAMI serum fed piglets (n=3)]은 E.coli(K88) 감염실험을 위해 각각 사용되었다. 10 ㎖의 PAMI serum은 PAMI serum fed piglets에, 10 ㎖의 control serum은 control serum fed piglets에 분만 후 1시간 내에 경구를 통해서 각각의 자돈에 투여되었다. 분만 2일 후 각 그룹의 자돈(group A 자돈, group B 자돈, group C 자돈 및 group D)은 모돈으로부터 각각 분리되어 격리된 장소에서 실험이 끝날 때까지 대용유 (milk replacer, Purina)를 공급하여 사육되었으며, 분만 3일 후에 group A의 자돈은 TGEV-wt1(1x106 TCID50/piglet)에, group B의 자돈은 PEDV-wt1(1x106 TCID50/piglet)에, group C의 자돈은 GAPRV-wt1(1x106 TCID50/piglet)에, group D의 자돈은 E.coil(K88) (1x108 CFU/piglet)에 의해 각각 경구를 통해 감염된 후, 전염성 병원체에 감염된 자돈의 임상증상은 4주 동안 관찰되었다.
신생자돈에 PAMI serum이 투여된 시간과 전염성 병원체의 감염으로부터 자돈의 방어능에 대한 관계를 알아보기 위해 동일한 복(腹)의 자돈에서 전염성 병원체의 감염실험이 실시되었다. 모돈 5로부터 태어난 group E 자돈은 각각 3 그룹 [0 hour group (n=3), 12 hour group (n=3) 및 18 hour group (n=3)]으로 나누어졌다. 그리고 10 ㎖ PAMI serum은 분만 후 1 시간 이내(0 hour group)에, 분만 후 12 시간 이내(12 hour group)에, 및 분만 후 18 시간 이내(18 hour group)에 각각 경구를 통해 투여하고, PAMI serum이 투여된 모든 자돈을 분만 3일 후에 PEDV-wt1(1x106 TCID50/piglet)으로 경구 감염시킨 후 PEDV-wt1에 감염된 자돈의 임상증상을 4주 동안 관찰하였다.
1-7. PEDV 발생 농장에서 PAMI serum의 사용
PAMI serum이 야외에서도 전염성 병원체의 감염을 예방할 수 있는지 알아보기 위해, PEDV 발생 농장(모돈 200두 규모)에서 PAMI serum은 신생자돈에 경구투여되었고 PAMI serum이 투여된 자돈의 임상증상은 4주 동안 관찰되었다. 전염성 병원체에 감염된 4마리 성돈으로부터 수집된 10 ㎖ PAMI serum은 PAMI serum fed piglets (n=280)에, PEDV에 백신 접종된 성돈으로부터 수집된 10 ㎖ vac-control serum은 vac-control serum fed piglets (n=9)에 분만 후 1시간 이내에 경구를 통해 각각 투여되었다. 그리고 PAMI serum 및 vac-control serum이 투여된 자돈의 임상증상은 4주 동안 관찰되었다.
실시예 2. 전염성 병원체에 경구 감염된 성돈의 혈청에 대한 VN 및 AG 역가 분석
전염성 병원체의 감염에 대한 항체의 방어능력을 결정하는 중요한 하나의 요소는 전염성 병원체에 대한 항체의 역가이다. 전염성 병원체(TGEV, PEDV, GAPRV, E. coli)에 경구 감염된 성돈(암퇘지 및 수퇘지)으로부터 수집된 혈청을 대상으로 전염성 병원체에 대한 VN 및 AG 역가는 VN 및 AG assay를 이용하여 조사되었다.
전염성 병원체 [TGEV(L75), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1, E. coli(K88, K99, F18)]에 감염되기 전 성돈으로부터 수집된 혈청(control serum)은 전염성 병원체 [TGEV(L75), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1]에 대하여 음성의 VN 역가를 각각 나타내었으며 (도 1A 및 1B, lanes 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13), 또한 E. coli(K88), E. coli(K99) 및 E. coli(F18)에 대하여 음성의 AG 역가를 각각 나타내었다 (도 1A 및 1B, lanes 15, 17 및 19). 그러나 전염성 병원체 [TGEV(L75), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1, E. coli(K88, K99, F18)]의 감염 26주 후 성돈으로부터 수집된 혈청(PAMI serum)은 TGEV(L75), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1에 대해 1024이상의 VN 역가를 각각 나타내었으며 (도 1A 및 1B, lanes 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14), 또한 E. coli(K88), E. coli(K99) 및 E. coli(F18)에 대해 각각 64 이상의 AG 역가를 각각 나타내었다 (도 1A 및 1B, lanes 16, 18 및 20). PEDV-sm98 및 KPEDV-9 백신으로 접종된 성돈으로부터 수집된 혈청(vac-control serum)은 PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1에 대해서 1024 이상의 높은 VN 역가를 각각 나타내었다 (도 1C, lanes 2, 4 및 6). 그러나 백신 접종 전의 성돈 혈청(control seum)은 PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1에 대해서 음성 VN 역가를 각각 나타내었다 (도 1C, lanes 1, 3 및 5).
모돈의 혈청이 전염성 병원체에 대해 높은 VN 역가를 나타낼 때 모돈의 초유를 섭취한 자돈은 전염성 병원체의 감염으로부터 방어된다. 이와 같이 성돈으로부터 수집된 PAMI serum이 점막관련 바이러스에 대해 높은 VN 역가 및 E. coli에 대해 높은 AG 역가를 나타내는 상기의 실험결과는 성돈으로부터 수집된 혈청 즉 PAMI serum이 경구를 통해 자돈에 투여 되었을 때 PAMI serum이 투여된 자돈은 PAMI serum의 방어항체를 습득하여 초유와 같이 전염성병원체의 감염으로부터 방어될 수 있다는 가능성을 제시하고 있다.
실시예 3. PAMI serum이 경구 투여된 자돈의 도전감염 실험
바이러스 전염성 병원체 (PEDV, TGEV, GAPRV)에 대해 높은 VN 역가 및 세균성 전염성병원체(E. coli)에 대해 높은 AG 역가를 나타내는 PAMI serum이 PEDV-wt1, TGEV-wt1, GAPRV-wt 및 E. coli(K88)에 의한 감염실험으로부터 자돈을 방어할 수 있는지를 조사하였다. 그룹 A, B, C, D 자돈에 있어서 PAMI serum은 PAMI serum fed piglets에, control serum은 control serum fed piglets에 분만 직후 1시간 내에 각각 경구를 통해 투여되었다. 그리고 생후 2일령에 자돈은 모돈으로부터 분리 사육되었으며 생후 3일령에 group A 자돈은 TGEV-wt1에, group B 자돈은 PEDV-wt1에, group C 자돈은 GAPRV-wt1에, group D 자돈은 E. coli(K88)에 의해 각각 경구 감염된 후 자돈의 임상증상은 생후 28일령까지 관찰되었다.
그 결과, TGEV-wt에 실험감염된 group A 자돈에서 PAMI serum이 투여된 자돈은 0%의 폐사율(도 2A, lane 1) 및 33%의 설사발생률(도 2B, lane 1)을 나타내었으며, control serum이 투여된 자돈은 100% 폐사율(도 2A, lane 2) 및 100%의 설사발생률(도 2B, lane 2)을 각각 나타내었다. PEDV-wt1에 실험감염된 group B 자돈에서 PAMI serum이 투여된 자돈은 0%의 폐사율(도 2A, lane 3) 및 33%의 설사발생률(도 2B, lane 3)을 나타내었으며, control serum이 투여된 자돈은 100%의 폐사율(도 2A, lane 4) 및 100%의 설사발생률(도 2B, lane 4)을 각각 나타내었다. GAPRV-wt1에 실험감염된 group C 자돈에서 PAMI serum이 투여된 자돈은 0%의 폐사율(도 2A, lane 5) 및 0%의 설사발생률(도 2B, lane 5)을 나타내었으며, control serum이 투여된 자돈은 29%의 폐사율(도 2A, lane 6) 및 100%의 설사발생률(도 2B, lane 6)을 각각 나타내었다. E. coli(K88)에 실험감염된 group D 자돈에서 PAMI serum이 투여된 자돈은 0%의 폐사율(도 2A, lane 7) 및 33%의 설사발생률(도 2B, lane 7)을 나타내었으며, control serum이 투여된 자돈은 25%의 폐사율(도 2A. lane 8) 및 100%의 설사발생률(도 2B, lane 8)을 각각 나타내었다.
PAMI serum이 투여된 자돈이 전염성 병원체의 [PEDV-wt1, TGEV-wt1, GAPRV-wt1, E. coli(K88)] 실험감염으로부터 방어되었다는 것은 분만 전 모돈이 전염성 병원체 [PEDV-wt1, TGEV-wt1, GAPRV-wt1, E. coli(K88)]에 감염되어 모돈에서 방어항체가 형성되었을 수도 있다는 가능성을 제시하고 있다. 이러한 가능성을 배제하기 위해 분만 전·후 모돈 혈청의 전염성 병원체에 대한 VN 및 AG 역가가 조사되었다. 분만 전·후의 모돈의 혈청은 전염성 병원체에 [TGEV(L75), TGEV-wt1, PEDV-sm98, KPEDV-9, PEDV-wt1, GAPRV-vac, GAPRV-wt1] 대해서 음성 VN 역가(도 3A, B, C 및 D, lanes 1-14)를, 전염성 병원체 E. coli(K88), E. coli(K99) 및 E. coli(F18)에 대해서는 음성 AG 역가(도 3A, B, C 및 D, lanes 15-20)를 각각 나타내었다.
이와 같은 전염성 병원체 감염실험 결과는 점막관련 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 PAMI serum이 성돈(PAMI serum donor)으로부터 유도·생산될 수 있으며, 이와 같이 유도 생산된 PAMI serum이 신생 자돈에 경구를 통해 조기에 투여되었을 때 PAMI serum의 점막면역성이 있는 방어항체는 수동면역으로 자돈에 전달되어 자돈을 전염성 병원체의 감염으로부터 방어할 수 있다는 것을 명확히 보여주고 있다. 또한 PAMI serum을 경구 경로를 통해 어린 포유동물에 투여하여 수동면역을 전달하는 방법은 모체의 방어항체가 초유를 통해 새끼에 전달되는 말, 돼지, 반추류 동물에 동일하게 적용될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 이와 더불어 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 PAMI serum의 방어항체를 수동면역으로서 어린 동물에 전달하는 방법은 경구뿐만 아니라 정맥을 통해서도 전달되어 전염성 병원체의 감염으로부터 어린 포유동물을 방어할 수 있다는 가능성을 제시하고 있다.
실시예 4.
전염성 병원체에 대한 자돈 방어능에 미치는 PAMI serum의 투여 시간(time window) 분석
자돈에 있어서, PAMI serum을 신생 자돈에 경구 투여하는 시간과 전염성 병원체의 감염으로부터 자돈의 방어효과에 관한 연관성을 알아보기 위해 다음 실험이 자돈에서 실시되었다.
Group E 자돈에서 PAMI serum은 분만 후 1시간 내에("0"), 12시간 내에("12"), 18시간 내에("18") 자돈에 경구 투여되었다. 그리고 분만 후 3일령에 PAMI serum이 투여된 모든 자돈은 PEDV-wt1로 실험감염 되었으며, 임상증상은 28 일령까지 관찰되었다. 그 결과, 분만 후 1시간 내에 PAMI serum이 투여된 자돈은 폐사 또는 설사발생 등 어떠한 임상증상도 나타나지 않았다(도 4, lanes 1 및 2). 그러나 분만 후 12시간 내에 PAMI serum이 투여된 자돈은 66% 폐사율 및 100%의 설사발생률을 각각 나타내었으며(도 4, lanes 3 및 4), PAMI serum이 분만 후 18시간내에 투여된 자돈은 100% 폐사율 및 100% 설사발생률을 각각 나타내었다(도 4, lanes 5 및 6).
상기 결과는 자돈에서 전염성 병원체 감염의 효과적인 방어는 신생 자돈에 PAMI serum을 조기에 경구 투여하여 달성될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 또한 PAMI serum을 어린 동물에 조기에 경구를 통해 투여하여 어린 동물을 전염성 병원체의 감염으로부터 방어는 방법은 자돈에서 뿐만 아니라 모체의 항체가 초유를 통해 전달되는 말, 반추류 등의 어린 동물에 또한 적용될 수 있다는 것을 제시하고 있다. 이와 더불어 PAMI serum의 방어항체를 어린 동물에 전달함에 있어서, 정맥을 통한 PAMI serum의 항체의 전달은 신생동물의 장닫힘(gut closure)과 PAMI serum의 투여시간에 영향을 받는 경구 투여와는 달리 필요한 때에 언제나 방어항체를 어린 동물에 전달할 수 있기 때문에 전염성병원체의 감염을 예방할 뿐만 아니라 치료를 위한 목적으로 사용될 수 있음을 제시하고 있다.
실시예 5. PEDV 발생 농장에서 PAMI serum의 PEDV 감염 방어능 분석
본 발명의 PAMI serum이 야외에서도 전염성 병원체의 감염을 효과적으로 방어할 수 있는지를 조사하기 위하여, PEDV 발생 농장(200 sow units)의 신생 자돈을 대상으로 PAMI serum을 경구 투여한 후 PEDV 감염 방어능을 평가하였다. 수퇘지 및 암퇘지로부터 수집된 PAMI serum은 PAMI serum fed piglets 그룹 자돈(n=280)에, vac-control serum은 vac-control fed piglets 그룹 자돈(n=9)에 각각 경구를 통해 투여되었다. 그리고 PAMI serum 및 vac-control serum이 투여된 자돈의 임상증상은 생후 28일까지 관찰되었다. PAMI serum이 투여된 모든 자돈은 생후 28일까지 폐사(도 5A, lanes 1, 3, 5, 7 및 9) 및 설사증상(도 5B, lanes 1, 3, 5, 7 및 9)을 나타내지 않았다. 그러나 근육을 통해 백신접종된 성돈으로부터 수집된 vac-control serum이 투여된 자돈은 생후 7일령에 44% (도 5A, lane 4), 14일령에 89% (도 5A, lane 6), 21일령에 100% (도 5A, lane 8)의 폐사율을 각각 나타내었다. 또한 vac-control serum이 투여된 자돈은 생후 3일령에 33% 설사증상 (도 5B, lane 2), 7일령에 100% 설사증상 (도 5B, lane 4), 14일령에 100% 설사증상 (도 5B, lane 6)을 각각 나타내었다.
이와 같은 결과는 본 발명의 PAMI serum 및 이를 이용한 수동면역의 전달은 실험감염에서뿐만 아니라 전염병이 발생한 농장에서도 어린 동물을 전염성 병원체의 감염으로부터 효과적으로 방어할 수 있다는 것을 보여주고 있으며, 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 방어항체를 포함하는 PAMI serum은 PAMI serum donor의 성별과 관계없이 유도 및 생산될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 또한 점막관련 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청 즉 PAMI serum은 점막관련 전염성 병원체가 비점막경로(피하, 피내, 근육내 등)를 통해 투여되는 것이 아니라 반드시 점막경로(경구, 비강)를 통해서 PAMI serum donor에 투여되어야 전염성 병원체에 대한 방어항체 또는 점막면역성을 가진 방어항체를 포함하는 혈청이 PAMI serum donor로부터 유도 생산된다는 것을 보여주고 있다.
Claims (12)
- 전염성 병원체를 성체 돼지에 경구 또는 비강투여하여 성체 돼지로부터 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 점막면역성이 있는 방어항체의 생산을 유도하는 단계를 포함하는, 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청의 제조방법으로서,
상기 전염성 병원체는 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV), 전염성위장염 바이러스(transmissible Gastroenteritis virus, TGEV), 그룹 A 돼지 로타바이러스(Group A Porcine rotavirus, GAPRV) 또는 장독소형 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)이며,
상기 점막면역성이 있는 방어항체는 IgA인 것을 특징으로 하는 제조방법. - 삭제
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- 제1항의 제조방법에 의해 제조된 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청으로서,
상기 전염성 병원체는 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV), 전염성위장염 바이러스(transmissible Gastroenteritis virus, TGEV), 그룹 A 돼지 로타바이러스(Group A Porcine rotavirus, GAPRV) 또는 장독소형 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)인 것을 특징으로 하는 혈청. - 제6항의 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청의 유효량을 신생자돈 (newborn piglets) 또는 어린 자돈에 투여하는 단계를 포함하는, 자돈을 전염성 병원체의 감염으로부터 예방 또는 치료하는 방법으로서,
상기 전염성 병원체는 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV), 전염성위장염 바이러스(transmissible Gastroenteritis virus, TGEV), 그룹 A 돼지 로타바이러스(Group A Porcine rotavirus, GAPRV) 또는 장독소형 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)이며,
상기 투여는 신생자돈에게 분만 후 1 시간 이내에 경구 투여 경로로 투여되거나, 어린 자돈에게 정맥을 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법. - 삭제
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- 제6항의 전염성 병원체의 감염을 방어할 수 있는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청을 유효성분으로 포함하는, 어린 자돈을 전염성 병원체의 감염으로부터 예방 또는 치료하기 위한 수의학적 조성물로서,
상기 전염성 병원체는 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV), 전염성위장염 바이러스(transmissible Gastroenteritis virus, TGEV), 그룹 A 돼지 로타바이러스(Group A Porcine rotavirus, GAPRV) 또는 장독소형 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)인 것을 특징으로 하는 수의학적 조성물.
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| EP20927889.4A EP4129309A4 (en) | 2020-03-24 | 2020-11-13 | METHOD FOR PRODUCING A SERUM COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF AN INFECTIOUS DISEASE ASSOCIATED WITH THE MUCOSA IN YOUNG MAMMALS, SERUM COMPOSITION THUS PRODUCED AND CORRESPONDING USE |
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Cited By (1)
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| KR20230087304A (ko) | 2021-12-09 | 2023-06-16 | 엔에스엘 유니벌스 주식회사 | 건조 혈청의 재구성용 조성물 |
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| WO2001060156A1 (en) | 2000-02-14 | 2001-08-23 | Gary R. Davis, M.D., L.L.C. | Neutralizing antibody and immunomodulatory enhancing compositions |
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