BR112021008646A2 - uma vacina para proteção contra streptococcus suis - Google Patents

Abstract

UMA VACINA PARA PROTEÇÃO CONTRA STREPTOCOCCUS SUIS. A presente invenção está relacionada a uma vacina compreendendo um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, para uso em um método para proteger porcos contra uma infecção por Streptococcus suis de sorotipo 2 e contra uma infecção por Streptococcus suis de sorotipo 14.

Description

UMA VACINA PARA PROTEÇÃO CONTRA STREPTOCOCCUS SUIS CAMPO GERAL DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere à proteção de porcos contra uma infecção patogênica por bactérias Streptococcus suis de vários sorotipos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O Streptococcus suis (S. suis) é um dos principais agentes etiológicos de doenças bacterianas contagiosas em porcos. O patógeno pode causar uma variedade de síndromes clínicas, incluindo meningite, artrite, pericardite, polisserosite, septicemia, pneumonia e morte súbita. S. suis é um coco gram- positivo facultativamente anaeróbico, originalmente definido como grupos de Lancefield R, S, R/S ou T. Posteriormente, foi proposto um novo sistema de tipagem baseado nos antígenos de polissacarídeos capsulares específicos do tipo localizados na parede celular. Isso levou a um sistema compreendendo 35 sorotipos (Rasmussen e Andresen, 1998, “variações de sequência de rDNA 16S de alguns sorotipos de Streptococcus suis”, Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 1063-1065) dos quais os sorotipos 2, 9, 1, 7 e 1/2 são os mais predominantes, enquanto o sorotipo 14 está emergindo particularmente em toda a Europa. Controle de Streptococcus suis no rebanho de porcos parece ser muito difícil. O Streptococcus suis é um patógeno comensal e oportunista de suínos. Aparentemente, o sistema imunológico não é desencadeado em todas as ocasiões de infecção. Ao lado disso, Streptococcus suis é um patógeno bem encapsulado e usa um arsenal de fatores de virulência para escapar do sistema imunológico do hospedeiro. Juntas, essas características têm desafiado o desenvolvimento de vacinas eficazes no combate a esse importante patógeno. Recentemente, um artigo de visão geral foi publicado a respeito de vacinas contra Streptococcus suis (Mariela Segura: “Streptococcus suis vaccines: candidate antigens and progress, in Expert Review of Vaccines, Volume 14, 2015,

Edição 12, páginas 1587-1608). Nesta revisão, as informações de campo clínico e dados experimentais foram compiladas e comparadas para dar uma visão geral do estado atual do desenvolvimento de vacinas contra Streptococcus suis conforme descrito abaixo na presente invenção.

[003] As vacinas usadas atualmente são principalmente bacterinas de células inteiras. No entanto, os relatórios de campo descrevem dificuldade no gerenciamento e controle de doenças, e especialmente “falhas de vacina" são comuns. Os porcos portadores são a principal fonte de infecção, e tanto a transmissão vertical quanto a horizontal estão envolvidas na disseminação da doença dentro de um rebanho. A mistura de animais portadores com animais suscetíveis sob condições estressantes, tais como desmame e transporte, geralmente resulta em doença clínica. O desmame precoce medicamentoso e as práticas de desmame precoce segregado não eliminam infecção por Streptococcus suis. Portanto, medidas de controle eficazes para prevenir doenças dependerão de procedimentos profiláticos/metafiláticos (quando permitidos) e de vacinação. Atualmente, os esforços de imunização de campo têm se concentrado no uso de bacterinas comerciais ou autógenas. Essas estratégias de vacina têm sido aplicadas a leitões ou porcas. A partir do desmame em diante leitões são mais suscetíveis a infecções de Streptococcus suis devidas aos estresses associados ao desmame e também ao transporte subsequente comum. Portanto, a imunização pré-parto em porcas é frequentemente usada para tentar transmitir imunidade passiva aos leitões e fornecer proteção contra Streptococcus suis sob essas circunstâncias estressantes no início da vida. Além disso, a vacinação de porcas é menos dispendiosa e trabalhosa, representando assim uma alternativa econômica à vacinação de leitões. No entanto, os resultados disponíveis parecem indicar que a vacinação de porcas com bacterinas também é motivo de controvérsia. Em muitos casos, as porcas vacinadas, mesmo quando vacinadas duas vezes antes do parto, respondem mal ou não respondem à vacinação, o que resulta em baixa imunidade materna transferida para as ninhadas. E mesmo que a imunidade materna seja transferida em um nível suficiente, em muitos casos os anticorpos maternos são muito baixos para fornecer proteção no período mais crítico de 4- 7 semanas de idade.

[004] Em porcos, as bacterinas autógenas são frequentemente usadas no campo, especialmente na Europa. Eles são preparados a partir da cepa virulenta isolada na fazenda com problemas clínicos e aplicados na mesma fazenda. Uma das desvantagens das bacterinas autógenas é que faltam dados de segurança de vacina e podem ocorrer reações adversas graves. Erros de amostragem (devido ao uso de apenas um ou dois porcos ou amostras) podem resultar em falha na identificação de uma cepa ou sorotipo associado a um surto recente. Essa falha pode ser especialmente problemática em rebanhos endêmicos. Finalmente, o dilema mais importante das bacterinas autógenas é que sua eficácia real tem sido pouco estudada. Como a aplicação de vacinas autógenas é empírica, não é surpreendente que os resultados obtidos com essas vacinas sejam inconsistentes.

[005] Outras vacinas experimentais também são descritas no estado da técnica. Kai-Jen Hsueh et al. mostram (“Immunization with Streptococcus suis bacterin plus recombinant Sao protein in sows conveys passive immunity to their piglets”, in: BMC Veterinary Research, BMC series – open, inclusive and trusted, 13:15, 7 de janeiro de 2017) que uma bacterina mais subunidade pode ser uma base para a vacinação bem-sucedida de porcas para conferir imunidade protetora a seus leitões.

[006] Vacinas vivas atenuadas também foram contempladas no estado da técnica. Mutantes isogênicos não encapsulados de Streptococcus suis sorotipo 2 mostraram-se claramente avirulentos. No entanto, uma formulação de vacina viva com base em um mutante não encapsulado de sorotipo 2 induziu apenas proteção parcial contra a mortalidade e falhou em prevenir o desenvolvimento de sinais clínicos em porcos desafiados com a cepa de tipo selvagem (Wisselink HJ, Stockhofe-Zurwieden N, Hilgers LA, et al. “Assessment of protective efficacy of live and killed vaccines based on a non-encapsulated mutant of Streptococcus suis serotype 2.” in: Vet Microbiol. 2002, 84:155–168).

[007] Nos últimos anos, uma extensa lista de moléculas de Streptococcus suis antigênicas ou imunogênicas foram relatadas e a maioria delas foram descobertas através de imunoproteômicas usando soros convalescentes de porcos ou humanos infectados e/ou soros imunes produzidos em laboratório. O WO2015/181356 (IDT Biologika GmbH) mostrou que os antígenos de protease de IgM (a proteína inteira ou o domínio Mac-1 altamente conservado representando apenas cerca de 35% da proteína total) podem desencadear uma resposta imune protetora em leitões em um esquema de vacinação de administração de duas doses do antígeno de protease de IgM, opcionalmente em combinação com uma vacinação inicial contendo uma bacterina. Observa-se que o WO2017/005913 (Intervacc AB) também descreve o uso de um antígeno de protease de IgM (em particular, um polipeptídeo de protease de IgM fundido a uma nucleotidase). No entanto, apenas a propriedade de ser capaz de desencadear uma sororesposta foi mostrada. Um efeito protetor para um antígeno de protease de IgM não é mostrado neste pedido de patente internacional.

[008] Outro fator que aumenta o problema de fornecer proteção adequada contra Streptococcus suis é a falta de proteção heteróloga de vacinas existentes. Por exemplo, Porcilis Strepsuis® é uma vacina registrada (disponível na MSD Animal Health e Coopers Animal Health) para proteger suínos contra sorotipo 2 de Streptococcus suis. Também protege passivamente a prole contra o sorotipo 2 por meio da ingestão do colostro. Além disso, conforme conhecido a partir do WO 2010/108977, quando a vacina é administrada a porcas, a prole parece ter algum nível (muito baixo) de proteção contra o desafio heterólogo. No entanto, essa proteção passiva é apenas de duração muito curta. Além disso, nunca foi registrada a vacina para proteção da prole via ingestão de colostro contra bactérias Streptococcus suis de qualquer outro sorotipo, portanto, aparentemente, o nível de proteção heteróloga era muito baixo para atender aos padrões de registro. Isso está de acordo com o conhecimento comum de que para vacinas de Streptococcus suis não ocorre proteção contra bactérias de sorotipos não incluídos na vacina. Isso é confirmado, entre outros, na tese de doutorado de Hendrikus Jan Wisselink, intitulada “Streptococcus suis infection in pigs: Use of virulence-associated markers in diagnostics and vaccines”, publicada em 6 de dezembro de 2001. No sumário, (página 129) é afirmado que uma “estratégia para prevenir doenças causadas por S. suis é pelo uso de vacinas. As vacinas de células inteiras mortas parecem induzir proteção significativa contra o desafio com uma cepa de sorotipo homólogo, mas essa proteção é provavelmente sorotipo-específica”.

[009] Estas descobertas estão de acordo com as descobertas de Smith (US

7.125.548; publicado em 24 de outubro de 2006). Ela afirma que “os anticorpos são sorotipo-específicos e, muitas vezes, só conferirão proteção contra apenas um dos muitos sorotipos conhecidos dentro de um grupo de Estreptococos. Por exemplo, as vacinas de S. suis atuais disponíveis comercialmente, que geralmente são baseadas em preparações bacterianas de células inteiras ou em frações de cápsulas enriquecidas de S. suis, conferem apenas proteção limitada contra cepas heterólogas” (coluna 4, linhas 42-28 da patente dos EUA). Um estudo publicado em janeiro de 2008 (Medycyna Weterynaryjna, Volume 64,

edição 1, páginas 113-116), descreve a proteção contra bactérias S. suis dos sorotipos 2 e 1/2. Se houvesse qualquer nível esperado de proteção heteróloga entre os diferentes sorotipos, seria entre esses sorotipos, uma vez que eles são imunologicamente muito próximos. Ainda, ambos os sorotipos foram incluídos na vacina para obter proteção adequada. A RUMA (Aliança para o Uso Responsável de Medicamentos na Agricultura), sediada no Reino Unido, publicou diretrizes sobre o uso de vacinas e vacinação na produção de porcos em novembro de 2006. Com relação a doenças causadas por S. suis, essas diretrizes declaram (na página 19) que a proteção de porcos pode ser alcançada pela vacinação da porca, mas que “proteção contra doenças causadas por outros os sorotipos de Strep. Suis são improváveis de ocorrer”.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[010] É um objetivo da presente invenção encontrar uma vacina que seja eficaz na proteção de porcos contra Streptococcus, particularmente contra bactérias de dois sorotipos predominantes, 2 e 14. É um objetivo adicional chegar a um nível de proteção contra bactérias de ambos os sorotipos que corresponda (pelo menos) ao nível de proteção das vacinas de bacterina disponíveis comercialmente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[011] A fim de atender ao principal objetivo da presente invenção, verificou-se que um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis pode ser usado em um método para proteger porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 2 e contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 14. O antígeno de protease de IgM é tipicamente compreendido em uma composição de vacina, isto é, uma composição segura para ser administrada a porcos, em cuja composição o antígeno é misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável para facilidade de administração. Ao administrar o antígeno aos porcos, verificou-se que os porcos são protegidos contra uma infecção patogênica por bactérias Streptococcus suis de sorotipo 2 e sorotipo 14. Foi até descoberto que o nível de proteção contra ambos os sorotipos corresponde ao nível de proteção homóloga alcançado ao usar uma vacina de bacterina de sorotipo 2 convencional (cf Porcilis Strepsuis). Isso significa que a proteção heteróloga foi demonstrada para o antígeno de protease de IgM, pelo menos entre os sorotipos 2 e sorotipo 14. Esta é a primeira vez que a proteção ativa adequada contra bactérias Streptococus suis de pelo menos sorotipos 2 e sorotipo 14 foi demonstrada usando apenas um antígeno, particularmente a primeira vez que isso foi demonstrado usando um antígeno de protease de IgM. Isso fornece a opção única de vacinar os porcos por si só e induzir proteção heteróloga ativa, em vez de depender da proteção passiva de curta duração que pode ser obtida através do colostro de porcas imunizadas, conforme conhecido a partir do WO2010/108977. Além disso, o nível real de proteção, tanto homólogo quanto heterólogo, parece ser significativamente melhor do que o obtido com a vacina de tipo bacterina conhecida.

[012] A presente invenção, portanto, também se refere ao uso de um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis para a fabricação de uma vacina para a proteção de porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 2 e contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 14, e a um método para proteger porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 2 e contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 14, através da administração de uma vacina compreendendo um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis para os porcos.

[013] Como mencionado acima na presente invenção, em uma vacina o antígeno é tipicamente combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável, isto é, um meio biocompatível, a saber, um meio que após a administração não induz reações adversas significativas no indivíduo animal, capaz de apresentar o antígeno ao sistema imunológico do animal hospedeiro após a administração da vacina. Tal veículo farmaceuticamente aceitável pode ser, por exemplo, um líquido contendo água e/ou qualquer outro solvente biocompatível ou um veículo sólido, tal como comumente usados para obter vacinas liofilizadas (com base em açúcares e/ou proteínas), opcionalmente compreendendo agentes imunoestimulantes (adjuvantes) Opcionalmente, outras substâncias, tais como estabilizadores, modificadores de viscosidade ou outros componentes, são adicionados dependendo do uso pretendido ou das propriedades necessárias para a vacina.

DEFINIÇÕES

[014] Um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis é uma enzima que degrada especificamente a IgM porcina (e não a IgG porcina ou IgA porcina; Seele et al, in Journal of Bacteriology, 2013, 195 930-940; e em Vaccine 33:2207- 2212; 5 de maio de 2015), uma proteína denotada como IdeSsuis ou uma parte imunogênica do mesmo (tipicamente tendo um comprimento de pelo menos cerca de 30-35% do comprimento total da enzima). A enzima inteira tem um peso de cerca de 100-125 kDa, correspondendo a cerca de 1000-1150 aminoácidos, o tamanho dependendo do sorotipo de S. suis. No WO 2015/181356 são dadas várias sequências que representam um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, a saber SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:5, sendo a última uma parte imunogênica do comprimento total da enzima (denotada como o domínio Mac-1, isto é, aminoácidos 80 a 414 da SED ID NO:7). Outros exemplos de partes imunogênicas do comprimento total da enzima são fornecidos no WO2017/005913. Em particular, a protease de IgM pode ser a protease de acordo com SEQ ID NO:1 de WO2015/1818356 ou uma proteína com pelo menos 90%, ou mesmo 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% até 100% de identidade de sequência nas regiões sobrepostas. A identidade de sequência de aminoácidos pode ser estabelecida com o programa BLAST usando o algoritmo blastp com parâmetros padrão. Espera-se que a protease de IgM de Streptococcus suis de vários sorotipos tenha uma identidade de sequência superior a 90%, em particular espera-se que seja 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% até 100%. Uma proteína artificial, por exemplo, feita para otimizar o rendimento em um sistema de produção recombinante do antígeno, pode levar a uma identidade de sequência de aminoácidos mais baixa, tal como 85%, 80%, 75%, 70% ou mesmo 60% em comparação com a enzima inteira, enquanto mantendo a função imunogênica necessária, e é entendido como um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis no sentido da presente invenção.

[015] Proteção contra uma infecção patogênica por um microrganismo é o mesmo que atingir a imunidade protetora, isto é, ajudar a prevenir, melhorar ou curar a infecção patogênica por esse microrganismo ou um distúrbio decorrente dessa infecção, por exemplo, para prevenir ou reduzir a infecção atual ou um ou mais sinais clínicos resultantes da infecção patogênica com o patógeno.

[016] Um método que compreende administrar um antígeno apenas uma vez significa que a imunidade protetora é conferida após apenas uma única dose do antígeno e, portanto, que uma vacinação de reforço é omitida para se chegar à referida imunidade protetora. Em um regime de duas doses, a primeira vacinação (inicial) é normalmente reforçada dentro de 6 semanas a partir da primeira administração, comumente dentro de 3 ou mesmo 2 semanas a partir da primeira administração, e somente após a segunda administração (reforço) a imunidade protetora, isto é, uma proteção bem-sucedida, como definido acima na presente invenção, é entendida como obtida.

MODALIDADES DA INVENÇÃO

[017] Em uma primeira modalidade da presente invenção, o método compreende administrar o antígeno apenas uma vez aos porcos. Inesperadamente, apenas uma dose do antígeno parece ser capaz de induzir imunidade protetora nos porcos. No estado da técnica, as vacinas de Streptococcus suis não vivas sempre foram administradas em um regime de dose inicial/reforço, e ainda assim, levaram a uma eficácia relativamente baixa. Em relação ao antígeno para uso na presente invenção, o estado da técnica (ver WO2015/181356 e WO2017/005913) tem usado consistentemente este antígeno em uma abordagem de administração de duas doses, opcionalmente usando uma vacina multi-via (isto é, mais do que apenas o antígeno de protease de IgM). Foi, portanto, altamente surpreendente descobrir que uma única injeção com a protease de IgM é capaz de induzir imunidade protetora em porcos.

[018] Em uma segunda modalidade, o método compreende administrar o antígeno aos porcos com idade de no máximo 28 dias. Como indicado acima na presente invenção, o Streptococcus suis é um patógeno comensal e oportunista de suínos. Em particular sob estresse, a bactéria pode desencadear uma infecção patogênica e induzir doença. Sob condições modernas de produção de suínos, o maior estresse é induzido durante ou após os porcos atingirem a idade de 28 dias, por exemplo, induzido pelo desmame de leitões (3-4 semanas) e transporte de leitões jovens logo em seguida. A fim de ser protegido contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, os porcos, portanto, precisam receber sua vacina em uma idade muito jovem, normalmente antes de atingirem a idade de 28 dias. Verificou-se que usando um antígeno de protease de IgM em porcos com idade de no máximo 28 dias, isto é, qualquer idade de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 dias,

pode ser obtida proteção adequada (heteróloga). Como é conhecido no estado da técnica, particularmente a partir do WO2017/005913, uma resposta imune positiva contra um antígeno de protease de IgM pode ser obtida em porcos jovens a partir do dia do nascimento em diante. Isto significa que, pela atual demonstração de proteção real em porcos de 25 dias, entende-se que a proteção pode ser obtida mesmo em uma idade mais jovem.

[019] Em outra modalidade, o método compreende administrar o antígeno antes da idade em que os porcos são desmamados. Em outras palavras, o antígeno é administrado antes que os leitões sejam realmente desmamados (normalmente com uma idade de 3-4 semanas). Foi demonstrado que o uso do antígeno nesta idade precoce, a proteção heteróloga pode ser obtida contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, induzida por estresse dentro de uma janela curta de 2-3 semanas logo após o desmame. É reconhecido que o WO2015/181356 mostra vacinação bem-sucedida usando uma protease de IgM como antígeno. No entanto, além do fato de que a proteção heteróloga não foi mostrada, a vacina foi usada em leitões com uma idade de 5-7 semanas e recebendo uma infecção desafio com a idade de 9 semanas, portanto, bem após o período de risco (isto é, o período de incidência de infecções patogênicas com Streptococcus suis) de 2 a 3 semanas após o desmame/transporte, isto é, 5 a 7 semanas de idade. Portanto, sem qualquer prova de eficácia sob circunstâncias práticas (isto é, infecção desafio na janela de 2-3 semanas após o desmame e estresse de transporte) ainda é questionável, além da questão se a proteção heteróloga seria alcançada, se a estratégia de combinação de vacina de protease de IgM/bacterina conforme descrito no WO 2015/181356 sob circunstâncias práticas.

[020] Em outra modalidade, novamente, o método compreende administrar o antígeno a porcos com anticorpos anti-Streptococcus suis maternalmente derivados. A vacinação ativa de animais jovens tem a preocupação de possível interferência com anticorpos maternos, produzidos por infecção natural ou por imunização ativa de porcas (Baums CG, Bruggemann C, Kock C, et al. ”Immunogenicity of an autogenous Streptococcus suis bacterin in preparturient sows and their piglets in relation to protection after weaning”, em: Clin Vaccine Immunol. 2010;17(1589):1597). De fato, nem a vacinação de leitões em amamentação nem de leitões desmamados de porcas imunizadas foi associada a uma resposta e proteção imune ativa proeminente às 8 semanas de idade. Esta falha foi associada a um forte efeito inibidor de anticorpos maternos ou outros componentes do colostro. Nesse sentido, a interferência entre os anticorpos maternos e a produção ativa de anticorpos contra S. suis também poderia ser demonstrada em um estudo de campo após a vacinação com uma formulação de vacina de tipo 1/2 capsular de S. suis autógeno (Lapointe L, D’Allaire S, Lebrun A, et al.: “Antibody response to an autogenous vaccine and serologic profile for Streptococcus suis capsular type 1/2.” in: Can J Vet Res. 2002; 66: 8–14. Um estudo de campo objetivou determinar a eficácia de um protocolo de bacterina com serotipo 14 de S. suis em injeção única em leitões amamentados de 4 dias de idade também falhou em proteger os leitões contra o desafio homólogo (Amass SF, Stevenson GW, Knox KE, et al. “Efficacy of an autogenous vaccine for preventing streptococcosis in piglets” in: Vet Med. 1999, 94, 480–484). Foi, portanto, uma surpresa que com o antígeno de protease de IgM, a proteção adequada poderia ser obtida mesmo na presença de antígenos anti-Streptococcus suis maternalmente derivados.

[021] Em ainda outra modalidade, o método é para conferir proteção contra mortalidade associada a uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 2 e sorotipo 14.

[022] Em ainda outra modalidade, o método é para conferir proteção contra sinais clínicos associados a uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 2 e sorotipo 14. Sinais clínicos típicos associados a uma infecção patogênica por Streptococcus suis são temperatura retal aumentada, locomoção prejudicada (mancar, articulações inchadas), frequência respiratória aumentada e sinais neurológicos (por exemplo, tremores, convulsões, torticolose, ataxia). Prevenir, melhorar ou curar um ou mais desses sinais será benéfico para o porco, além de ser uma indicação de que a infecção patogênica está sendo suprimida.

[023] A presente invenção será agora explicada com base nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[024] O objetivo do primeiro estudo foi testar se um antígeno de protease IgM, neste caso o antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis sorotipo 2, é capaz de fornecer proteção contra um desafio com Streptococcus suis de sorotipo 2 em comparação com uma vacina de bacterina regular contendo bactérias mortas de S. suis de sorotipo 2 (cf. Porcilis Strepsuis). Projeto de Estudo

[025] Foram usados trinta leitões desmamados. Os porcos foram atribuídos a três grupos (uniformemente distribuídos nas diferentes ninhadas) de 10 porcos cada. O Grupo 1 foi vacinado duas vezes por via intramuscular com 5 e 7 semanas de idade com um antígeno de protease de IgM rIdeSsuis recombinante (Seele et al: Vaccine 33: 2207-2212; 5 de maio de 2015, par. 2.2.) a 230 µg por dose (conforme estabelecido por um ensaio de proteína de Bradford usando BSA como padrão) em adjuvante óleo em água. O Grupo 2 foi vacinado duas vezes por via intramuscular com 5 e 7 semanas de idade com uma bacterina de células inteiras de sorotipo 2 (cf Porcilis Strepsuis) em adjuvante óleo em água (controle positivo). O Grupo 3 não foi vacinado e serviu como controle de desafio. Com 9 semanas de idade, os porcos foram desafiados com uma cultura virulenta de S. suis sorotipo 2. Em tempos regulares, antes e depois do desafio foi coletada a heparina sanguínea dos leitões para o reisolamento da cepa de desafio. Após a desafio os porcos foram observados diariamente para sinais clínicos de infecção por S. suis (tais como depressão, problemas locomotores e/ou sinais neurológicos) e marcados usando um sistema de pontuação regular de 0 (sem sinais) a 3 para os casos graves. Os animais gravemente afetados foram eutanasiados e examinados pós-morte. No final do estudo (7 dias após a desafio), todos os porcos sobreviventes foram eutanasiados e examinados pós- morte. Resultados

[026] Nenhuma das vacinas induziu sítios inaceitáveis ou reações sistêmicas e, portanto, podem ser consideradas seguras. Os dados pós-desafio para o período antes da eutanásia (dia 7) são indicados na Tabela 1. É observado que no dia do desafio um porco do Grupo 1 parecia ser raquítico e foi decidido não desafiar este animal. As pontuações clínicas médias, o número de animais mortos após o desafio e o número de animais a partir dos quais o patógeno poderia ser reisolado a partir do sangue pareceram ter melhorado para ambas as vacinas. Tabela 1: Estudo 1 de dados pós-desafio Grupo Pontuação clínica Morto após a Isolamento de sangue média desafio positivo 1 11 1/9 2/9 2 33 5/10 6/10 3 61 10/10 10/10 Conclusão

[027] Como esperado, a vacina de célula inteira inativada induziu proteção homóloga significativa. O antígeno de protease de IgM induziu proteção ainda melhor contra uma infecção por sorotipo 2 de Streptococcus suis. EXEMPLO 2

[028] O objetivo do segundo estudo foi testar se o antígeno de protease de IgM é capaz de fornecer proteção contra um desafio com sorotipo 14 de Streptococcus suis. Projeto de Estudo

[029] O projeto de estudo foi essencialmente o mesmo do primeiro estudo. Os grupos de 10 porcos foram usados e vacinados duas vezes na idade de 5 e 7 semanas com o antígeno de protease de IgM (Grupo 1) ou foram deixados como animais de controle não vacinados (Grupo 2). Com 9 semanas de idade, os porcos foram desafiados com uma cultura virulenta de sorotipo 14 de S. suis. Resultados

[030] Também neste estudo, a vacina não induziu nenhum sítio inaceitável ou reações sistêmicas. No dia da primeira vacinação (5 semanas de idade), a maioria dos porcos tinha um título de anticorpos (de origem materna) de cerca de 4 log2. Após a vacinação, o grupo da vacina mostrou boas respostas de anticorpos com títulos médios de anticorpos de 9,3 log2 após a vacinação de reforço. Os títulos de anticorpos dos animais controle permaneceram em um nível baixo com títulos de anticorpos médios de 4,1 log2.Os dados pós-desafio para o período antes da eutanásia (no dia 11 após o desafio) são indicados na Tabela 2 (ACS = pontuação clínica média; APT = temperatura média de pico; AST = tempo médio de sobrevivência; DAC = Morte após o desafio; PBI = isolamento de sangue positivo) Tabela 2: Estudo 2 de dados pós-desafio Grupo ACS APT AST DAC PBI 1 1,3 40,0 11,0 0/10 0/10

2 16,9 40,5 9,4 2/10 2/10 Conclusão

[031] Embora neste estudo o desafio pareça ser menos virulento, os resultados demonstram que o antígeno de protease de IgM induz proteção contra desafio de sorotipo 14 de S. suis. Isso foi demonstrado por uma redução nas pontuações clínicas, o número de animais alcançando o ponto final humano, e o número de animais a partir dos quais a bactéria do desafio poderia ser reisolada do sangue. Em seguida, parece que o tempo médio de sobrevivência para os animais vacinados foi melhor. Juntamente com os dados do primeiro estudo, pode-se concluir que o antígeno de protease de IgM é capaz de fornecer proteção contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis com bactérias de sorotipo 2 e sorotipo 14. Isso significa, também levando em consideração a alta identidade entre a protease de IgM do sorotipo 2 e a protease de IgM do sorotipo 14, que a proteção cruzada entre esses serotipos foi demonstrada (isto é, a protease de IgM do sorotipo 2 de Streptococcus suis protege contra o desafio de sorotipo 14 e vice-versa). Além disso, parece que o nível de proteção contra ambos os sorotipos corresponde a (ou é ainda melhor) do que o nível de proteção homóloga obtida com uma vacina de bacterina de sorotipo 2 comumente disponível. EXEMPLO 3

[032] Como proteção contra Streptococcus suis para porcos é preferencialmente obtido no período de risco (normalmente 4-7 semanas de idade), foi avaliado se uma vacina contendo protease de IgM é eficaz como uma vacina de dose única em porcos positivos com anti-Streptococcus suis derivados maternalmente em uma idade de 3 semanas. Projeto de Estudo

[033] O projeto de estudo foi comparável ao dos dois primeiros estudos,

com a principal diferença de que, em vez de animais de 5 semanas de idade, leitões de 3 semanas positivos para MDA anti-Ssuis foram vacinados (apenas 1 em 10 animais parecia ter um nível de MDA abaixo limite de detecção). O Grupo 1 foi vacinado uma vez por via intramuscular com o antígeno de protease de IgM em um adjuvante de óleo em água. O Grupo 2 serviu como um grupo de controle de desafio negativo. Com 4 semanas de idade, os leitões foram desmamados. Com 6 semanas de idade, os leitões foram transportados para a sala de desafio e desafiados imediatamente. Não houve período de aclimatação entre o transporte e o desafio para mimetizar o estresse natural. Os leitões foram desafiados com uma cultura virulenta de sorotipo 2 de Streptococcus suis. Resultados

[034] As vacinas não induziram nenhum sítio inaceitável ou reações sistêmicas. Os dados pós-desafio para o período antes da eutanásia (dia 7) são indicados na Tabela 3. No dia da desafio um porco do Grupo 2 parecia ser raquítico e foi decidido não desafiar este animal. Tabela 3: Estudo 3 de dados pós-desafio Grupo Pontuação clínica Morto após o Isolamento de sangue média desafio positivo 1 18 3/10 3/10 2 43 7/9 7/9 Conclusão

[035] Em conclusão, os resultados demonstram que ao administrar o antígeno de protease de IgM apenas uma vez a proteção adequada pode ser induzida em leitões MDA positivos com 3 semanas de idade contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, mesmo quando desafiados 3 semanas após a vacinação, 2 semanas após o desmame e imediatamente após o transporte. Embora isso tenha sido demonstrado com um desafio de sorotipo 2 apenas, uma vez que o exemplo 2 mostra que o antígeno é capaz de induzir proteção também contra o sorotipo 14, entende-se que resultados comparáveis são obtidos quando se visa proteção contra uma infecção pelo sorotipo 14 neste tipo de porcos.

Claims (9)

REIVINDICAÇÕES

1. Um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, para uso em um método para proteger porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 2 e contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 14.

2. Um antígeno de protease de IgM para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o antígeno aos porcos apenas uma vez.

3. Um antígeno de protease de IgM para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o antígeno aos porcos com idade de no máximo 28 dias.

4. Um antígeno de protease de IgM para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o antígeno antes de uma idade na qual os porcos são desmamados.

5. Um antígeno de protease de IgM para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o antígeno a porcos com anticorpos anti-Streptococcus suis derivados maternalmente.

6. Um antígeno de protease de IgM para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método é para conferir proteção contra mortalidade associada a uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 2 e sorotipo 14.

7. Um antígeno de protease de IgM para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método é para conferir proteção contra sinais clínicos associados a uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 2 e sorotipo 14.

8. Uso de um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, para a fabricação de uma vacina para proteger porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 2 e contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 14.

9. Um método para proteger porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 2 e contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis de sorotipo 14, por administração de uma vacina compreendendo um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis aos porcos.