BR112021002900A2 - vacina de combinação - Google Patents

Abstract

VACINA DE COMBINAÇÃO. A presente invenção diz respeito a uma vacina que compreende (a) uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, (b) uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno fimbrial de Escherichia coli, e (c) uma quantidade imunologicamente eficaz de um toxoide de Clostridium, e também diz respeito ao uso da vacina em um método para proteger porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, Escherichia coli e Clostridium.

Description

VACINA DE COMBINAÇÃO CAMPO GERAL DA INVENÇÃO

[001] A invenção diz respeito a uma vacina de combinação para proteção de porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, Escherichia coli e Clostridium.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere ao campo de vacinologia veterinária, a saber, vacinas de combinação para suínos. Em particular, a invenção se refere a uma vacina de combinação compreendendo antígenos a partir de Streptococcus suis (S. suis), Escherichia coli (E. coli) e Clostridium.

[003] A suinocultura intensiva hoje depende fortemente de produtos médicos veterinários para manter os animais saudáveis e permitir uma operação econômica. Além da otimização da alimentação e dos sistemas de gerenciamento da fazenda, uma variedade de tratamentos é regularmente usada: produtos farmacêuticos, tais como hormônios ou antibióticos, e vacinação contra patógenos bacterianos ou virais.

[004] As vacinas atualmente usadas para proteção contra patógenos bacterianos são principalmente bacterinas de células inteiras. No entanto, os relatórios de campo descrevem dificuldade no gerenciamento e controle de doenças, e especialmente “falhas de vacina” são comuns. Os porcos carreadores são a principal fonte de infecção, e tanto a transmissão vertical quanto a horizontal estão envolvidas na disseminação da doença dentro de um rebanho. A mistura de animais carreadores com animais suscetíveis sob condições estressantes, tais como desmame e transporte, geralmente resulta em doença clínica. Portanto, medidas de controle eficazes para prevenir doenças dependerão de procedimentos profiláticos/metafiláticos (quando permitidos) e de vacinação. Atualmente, os esforços de imunização de campo têm se concentrado no uso de bacterinas comerciais ou autógenas. Essas estratégias de vacina têm sido aplicadas a leitões ou porcas. A vacinação de porcas é menos dispendiosa e trabalhosa, representando assim uma alternativa econômica à vacinação de leitões. No entanto, os resultados disponíveis parecem indicar que a vacinação de porcas com bacterinas também é motivo de controvérsia. Em muitos casos, as porcas vacinadas, mesmo quando vacinadas duas vezes antes do parto, respondem mal ou não respondem à vacinação, o que resulta em baixa imunidade materna transferida para as ninhadas. E mesmo que a imunidade materna seja transferida em um nível suficiente, em muitos casos os anticorpos maternos são muito baixos para fornecer proteção no período mais crítico de 4-7 semanas de idade. A vacinação de porcas é convencionalmente usada para proteção contra uma variedade de infecções patogênicas, tais como infecções causadas por E. coli, Clostridium, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, circovírus porcino e semelhantes.

[005] Streptococcus suis é um patógeno comensal e oportunista de suínos. Em particular sob estresse, a bactéria pode desencadear uma infecção patogênica e induzir doença. O desmame precoce medicamentoso e as práticas de desmame precoce segregado não eliminam infecção de Streptococcus suis. A partir do desmame em diante, leitões são mais suscetíveis a infecções de Streptococcus suis devidas aos estresses associados ao desmame e também ao transporte subsequente comum. Portanto, a imunização pré-parto em porcas é frequentemente usada para tentar transmitir imunidade passiva aos leitões e fornecer proteção contra Streptococcus suis sob essas circunstâncias estressantes no início da vida.

[006] Sob condições de produção de porcos modernas, o maior estresse é induzido, por exemplo, pelo desmame de leitões e transporte de leitões jovens.

Isso fez Streptococcus suis se tornar um principal patógeno suíno. É também um agente zoonótico emergente de meningite humana e de síndrome do choque tóxico estreptocócica. Streptococcus suis é um patógeno bem encapsulado e múltiplos sorotipos foram descritos com base na diversidade antigênica de polissacarídeo capsular. Streptococcus suis usa um arsenal de fatores de virulência para escapar do sistema imunológico do hospedeiro. Juntas, essas características têm desafiado o desenvolvimento de vacinas eficazes no combate a esse importante patógeno. Recentemente, um artigo de visão geral foi publicado a respeito de vacinas contra Streptococcus suis (Mariela Segura: “Streptococcus suis vaccines: candidate antigens and progress, em Expert Review of Vaccines, Volume 14, 2015, Edição 12, páginas 1587- 1608). Nesta revisão, informações de campo clínico e dados experimentais foram compiladas e comparadas para dar uma visão geral do estado atual do desenvolvimento de vacinas contra Streptococcus suis conforme descrito aqui abaixo.

[007] Em porcos, as bacterinas autógenas são frequentemente usadas no campo para proteção contra Streptococcus suis, especialmente na Europa. Eles são preparados a partir da cepa virulenta isolada na fazenda com problemas clínicos e aplicados na mesma fazenda. Uma das desvantagens das bacterinas autógenas é que faltam dados de segurança de vacina e podem ocorrer reações adversas graves. Erros de amostragem (devido ao uso de apenas um ou dois porcos ou amostras) podem resultar em falha na identificação de uma cepa ou sorotipo associado a um surto recente. Essa falha pode ser especialmente problemática em rebanhos endêmicos. Finalmente, o dilema mais importante das bacterinas autógenas é que sua eficácia real tem sido pouco estudada. Como a aplicação de vacinas autógenas é empírica, não é surpreendente que os resultados obtidos com essas vacinas sejam inconsistentes.

[008] Outras vacinas experimentais também são descritas na técnica. Kai- Jen Hsueh et al. mostram (“Immunization with Streptococcus suis bacterin plus recombinant Sao protein in sows conveys passive immunity to their piglets”, in: BMC Veterinary Research, BMC series – open, inclusive and trusted, 13:15, 7 de janeiro de 2017) que uma bacterina mais subunidade pode ser uma base para a vacinação bem-sucedida de porcas para conferir imunidade protetora a seus leitões.

[009] Vacinas vivas atenuadas também foram contempladas na técnica. Mutantes isogênicos não encapsulados de Streptococcus suis de sorotipo 2 mostraram-se claramente avirulentos. No entanto, uma formulação de vacina viva com base em um mutante não encapsulado de sorotipo 2 induziu apenas proteção parcial contra a mortalidade e falhou em prevenir o desenvolvimento de sinais clínicos em porcos inoculados com a cepa de tipo selvagem (Wisselink HJ, Stockhofe-Zurwieden N, Hilgers LA, et al. “Assessment of protective efficacy of live and killed vaccines based on a non-encapsulated mutant of Streptococcus suis serotype 2.” em: Vet Microbiol. 2002, 84:155–168).

[010] Nos últimos anos, uma extensa lista de moléculas de Streptococcus suis antigênicas ou imunogênicas foram relatadas e a maioria delas foram descobertas através de imunoproteômicas usando soros convalescentes de porcos ou humanos infectados e/ou soros imunes produzidos em laboratório. WO2015/181356 (IDT Biologika GmbH) mostrou que os antígenos de protease de IgM (a proteína inteira ou o domínio Mac-1 altamente conservado representando apenas cerca de 35% da proteína total) podem desencadear uma resposta imune protetora em leitões em um esquema de vacinação de administração de duas doses do antígeno de protease de IgM, opcionalmente em combinação com uma vacinação inicial contendo uma bacterina. Observa-

se que WO2017/005913 (Intervacc AB) também descreve o uso de um antígeno de protease de IgM (em particular, um polipeptídeo de protease de IgM fundido a uma nucleotidase), mas apenas a propriedade de ser capaz de desencadear uma sororesposta foi mostrada. Um efeito protetor para um antígeno de protease de IgM não é mostrado neste pedido de patente internacional.

[011] Escherichia coli é uma bactéria Gram negativa peritricamente flagelada pertencente à família Enterobatteriaceae e é o agente causador de uma ampla gama de doenças em suínos, que são importantes causas de morte ocorrendo mundialmente em leitões em amamentação e leitões desmamados, respectivamente. Infecção por E. coli, ou colibacilose, afeta os rebanhos internos e externos, ocorrendo de forma crônica e esporádica. Infecções por E. coli ocorrem em três estágios principais: diarreia neonatal (nos primeiros dias após o parto), diarreia do leitão jovem (desde a primeira semana pós-parto até o desmame) e diarreia pós-desmame (nas primeiras semanas após o desmame). Elas também podem estar presentes em combinação com outros patógenos, incluindo rotavírus, e causar outras doenças, tais como edema e infecções do trato urinário.

[012] Certas cepas de E. coli possuem fímbrias ou pili que lhes permitem aderir ou colonizar as células epiteliais absortivas do jejuno e do íleo. Os tipos antigênicos comuns de pili associados à patogenicidade são F4 (= K88), F5 (= K99), F6 (987P) e F41. As cepas patogênicas produzem enterotoxinas que fazem com que fluido e eletrólitos sejam secretados para o lúmen intestinal, o que resulta em diarreia, desidratação e acidose. A infecção em neonatos é comumente causada pelas cepas K88 e 987P, enquanto a colibacilose pós- desmame é quase sempre devido à cepa K88. Vide Vet Rec. 12 de jan. 2002; 150(2): 35-7.

[013] Várias abordagens têm sido usadas para prevenir a colibacilose, em particular diarreia pós-desmame, incluindo administração passiva com anticorpos específicos, suplementação dietética, tal como prebióticos e probióticos e medidas preventivas dietéticas, reprodução genética para rebanhos resistentes a ETEC e vacina de E. coli não toxigênicos orais vivos (Luppi A., Swine enteric colibacillosis: diagnosis, therapy and antimicrobial resistance, Porcine Health Manag. 2017; 3: 16; Zhang W. Progress and Challenges in Vaccine development against enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) – Associated porcine Post-weaning Diarrhea (PWD) J Vet Med Res. 2014;1(2):1006). Vacinas comerciais estão disponíveis, por exemplo, Porcilis® ColiClos (MSD Animal Health), Gletvax® e Litterguard® (ambos da Zoetis), Clostricol® (IDT Biologika), Entericolix® (Boehringer Ingelheim). Os leitões podem ser adequadamente protegidos contra E. coli através da ingestão de colostro de animais mães vacinados.

[014] Clostridium, uma haste anaeróbica, gram-positiva, formadora de esporos, é um importante patógeno emergente que causa diarreia principalmente em suínos neonatais. O agente foi reconhecido pela primeira vez como uma causa de diarreia associada a antibióticos em pessoas. É mais comum causar doenças em leitões com 1–7 dias de idade e em outros animais domésticos e de laboratório. Infecções por Clostridium inclui infecções por C. difficile e C. perfringens. O organismo pode ser demonstrado no intestino por coloração de Gram direta de manchas. Sobrevivência de Clostridium no ambiente e na excreção das porcas carreadoras é considerada importante na transmissão. Clostridium perfringens tipo C e, em menor medida, tipo B, são patógenos importantes em suínos. Sabe-se que os toxoides correspondentes são capazes de induzir uma resposta imune protetora em suínos. Várias vacinas comerciais estão disponíveis, Porcilis® ColiClos (MSD Animal Health), Gletvax® e

Litterguard® (ambos da Zoetis), Clostricol® (IDT Biologika), Entericolix® (Boehringer Ingelheim). Os leitões podem ser adequadamente protegidos contra Clostridium através da ingestão de colostro de animais mães vacinados.

[015] Para limitar o estresse dos animais e o custo e o trabalho dos cuidadores, geralmente é desejável fornecer proteção contra mais de uma doença. Assim, existe a necessidade de fornecer uma vacina suína para proteção contra Streptococcus suis além de proteção contra outras doenças suínas. No entanto, a eficácia de uma vacina de combinação é imprevisível de antemão devido a possíveis incompatibilidades dos componentes da vacina, tais como interferência negativa entre os antígenos ou outros componentes da vacina, o que pode levar à redução da eficácia de vacinação ou aumento dos efeitos adversos. Embora a combinação de antígenos em uma vacina como tal tenha sido, e ainda seja, um desejo comum, para qualquer vacina de combinação, em particular, o problema de interferência entre antígenos é um problema muito comum que impede que muitas, senão a maioria das combinações de antígenos, sejam desenvolvidas em vacinas multivalentes. Para isso nos referimos a uma palestra de Michel De Wilde de março de 2016, título “Combination vaccines: how and why? Lessons learned”, que é acessível via site da Organização Mundial de Saúde. A palestra confirma que há um desejo comum de buscar vacinas de combinação, mas também que, entre outros problemas, há muitos problemas científicos e técnicos a serem superados. Exemplos de desenvolvimentos falhos de vacinas de combinação usando antígenos comuns são mostrados.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[016] É, portanto, um objetivo da presente invenção encontrar uma vacina de combinação para proteger um porco, em particular um leitão, contra uma infecção patogênica incluindo Streptococcus suis. Além disso, é um objetivo da invenção encontrar uma vacina de combinação para proteger um leitão contra mais de uma infecção patogênica, em que a proteção do leitão contra essas infecções é alcançada por vacinação de porcas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[017] Foi surpreendentemente descoberto na presente invenção que uma vacina de combinação pode ser fornecida para proteção de porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, Escherichia coli e Clostridium. Além disso, foi surpreendentemente descoberto que a vacina pode ser administrada a uma porca fêmea a fim de proteger um leitão contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, Escherichia coli e Clostridium através da ingestão de colostro da porca fêmea vacinada.

[018] A fim de atender ao objetivo da invenção, uma vacina de acordo com a reivindicação 1 é fornecida compreendendo os componentes (a), (b) e (c) de: (a) uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, (b) uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno fimbrial de Escherichia coli, e (c) uma quantidade imunologicamente eficaz de um toxoide de Clostridium.

[019] Modalidades preferenciais da presente invenção são definidas nas reivindicações dependentes.

[020] Assim, a presente invenção pela primeira vez fornece uma vacina de combinação (abreviação: vacina de acordo com a presente invenção) que fornece proteção contra múltiplas infecções patogênicas incluindo uma infecção causada por S. suis. Além disso, tornou-se possível com a presente invenção proteger um leitão contra múltiplas infecções patogênicas, incluindo uma infecção causada por S. suis, através da vacinação de porcas.

[021] A invenção é, portanto, também fornece um kit de partes compreendendo múltiplos recipientes de vacina separados, um dos quais compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis e um ou mais recipientes adicionais em combinação compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno fimbrial de Escherichia coli e uma quantidade imunologicamente eficaz de um toxoide de Clostridium (por exemplo, um recipiente compreendendo antígenos de E. coli e Clostridium, ou dois ou mais recipientes separados, cada um compreendendo um ou mais dos respectivos antígenos).

[022] A invenção também fornece uma vacina compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, para uso em um método para proteger um animal contra infecção de Streptococcus suis, infecção de Escherichia coli e infecção de Clostridium, em que o antígeno de protease de IgM é misturado com uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno fimbrial de Escherichia coli e uma quantidade imunologicamente eficaz de um toxoide de Clostridium, antes da administração da vacina.

DEFINIÇÕES

[023] Uma vacina é uma composição farmacêutica que é segura para administrar a um indivíduo animal e é capaz de induzir imunidade protetora nesse animal contra um microrganismo patogênico, ou seja, induzir uma proteção bem-sucedida contra o microrganismo.

[024] Um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis é uma enzima que degrada especificamente a IgM porcina (e não a IgG porcina ou IgA porcina; Seele et al, in Journal of Bacteriology, 2013, 195 930-940; e em Vaccine 33:2207-2212; 5 de maio de 2015), uma proteína denotada como

IdeS.suis ou uma parte imunogênica do mesmo (tipicamente tendo um comprimento de pelo menos cerca de 30-35% da enzima de comprimento total). A enzima inteira tem um peso de cerca de 100-125 kDa, correspondendo a cerca de 1000-1150 aminoácidos, o tamanho dependendo do sorotipo de S. suis. Em WO 2015/181356 são dadas várias sequências que representam um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, a saber SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:5, sendo a última uma parte imunogênica da enzima de comprimento total (denotada como o domínio Mac- 1, ou seja, aminoácidos 80-414 da SED ID NO:7). Outros exemplos de partes imunogênicas da enzima de comprimento total são fornecidos em WO2017/005913. Em particular, a protease de IgM pode ser a protease de acordo com SEQ ID NO:1 de WO2015/1818356 ou uma proteína com pelo menos 90%, ou mesmo 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% até 100% de identidade de sequência nas regiões sobrepostas. A identidade de sequência de aminoácidos pode ser estabelecida com o programa BLAST usando o algoritmo blastp com parâmetros padrão. Espera-se que a protease de IgM de Streptococcus suis de vários sorotipos tenha uma identidade de sequência superior a 90%, em particular espera-se que seja 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% até 100%. Uma proteína artificial, por exemplo, feita para otimizar o rendimento em um sistema de produção recombinante do antígeno, pode levar a uma identidade de sequência de aminoácidos mais baixa, como 85%, 80%, 75%, 70% ou mesmo 60% em comparação com a enzima inteira, enquanto mantendo a função imunogênica necessária, e é entendido como sendo um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis no sentido da presente invenção.

[025] Proteção contra um microrganismo é ajudar a prevenir, melhorar ou curar uma infecção patogênica por esse microrganismo ou um distúrbio decorrente dessa infecção, por exemplo, para prevenir ou reduzir um ou mais sinais clínicos resultantes da infecção com o patógeno.

[026] Uma “quantidade imunologicamente eficaz” conforme usado na presente invenção refere-se à quantidade de antígeno ou toxoide que é necessária para induzir uma resposta imune em porcos na medida em que diminui uma infecção ou os efeitos patológicos causados pela infecção com um agente infeccioso de tipo selvagem, ou seja, S. suis, E. coli ou Clostridium, quando comparados aos efeitos patológicos causados pela infecção por um agente infeccioso de tipo selvagem em porcos não imunizados. A quantidade imunologicamente eficaz pode ser estabelecida pelo técnico no assunto via métodos de rotina comumente conhecidos no estado da técnica, por exemplo, administrando uma infecção de inoculação experimental a animais vacinados e em seguida determinando os sinais clínicos de doença, parâmetros serológicos ou medindo o reisolamento do patógeno de um animal alvo, seguido pela comparação desses achados com aqueles observados em porcos infectados em campo.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

[027] O componente (a) da vacina de acordo com a invenção compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis a fim de fornecer proteção contra uma infecção por S. suis.

[028] O componente (a) é, portanto, convencionalmente incluído para conferir proteção contra sinais clínicos associados a uma infecção patogênica por Streptococcus suis. Sinais clínicos típicos associados a uma infecção patogênica por Streptococcus suis são temperatura retal aumentada, locomoção prejudicada (mancar, articulações inchadas), frequência respiratória aumentada e sinais neurológicos (por exemplo, tremores, convulsões, torticolose, ataxia). Prevenir, melhorar ou curar um ou mais desses sinais será benéfico para o porco, não apenas por ser uma indicação de que a infecção patogênica está sendo suprimida. Em ainda outra modalidade, a vacina é para conferir proteção contra um aumento da mortalidade associada a uma infecção patogênica por Streptococcus suis.

[029] A vacina de acordo com a presente invenção compreende tipicamente o antígeno de protease de IgM em uma quantidade abaixo de 250 µg por dose da vacina, preferencialmente a 120 µg por dose ou abaixo. A quantidade mínima é aquela na qual a imunidade protetora ainda pode ser obtida. Isso pode ser estabelecido por experimentação de rotina e depende, entre outras coisas, das propriedades imunogênicas do antígeno de protease de IgM escolhido, mas também do nível de proteção necessário. Para a vacina atual, acredita-se que uma quantidade mínima seja de 1 µg do antígeno por dose, mas pode ser qualquer dose maior, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 ou qualquer número inteiro superior no intervalo de 61-119 até e incluindo 120 µg por dose.

[030] O componente (b) da vacina de acordo com a invenção compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno fimbrial E. coli e, opcionalmente, um toxoide, a fim de fornecer proteção contra uma infecção por E. coli. O componente (b) é, portanto, convencionalmente incluído para conferir proteção contra sinais clínicos associados a uma infecção patogênica por E. coli incluindo diarreia aquosa profusa com desidratação rápida, acidose e morte são comuns. Raramente, os porcos podem entrar em colapso e morrer antes do início da diarreia.

[031] Infecção patogênica por E. coli tipicamente compreende, sem estar limitada a isso, infecção causada por enterotoxigênicos E. coli bem como infecção causada por cepas de enteropatogênicos E. coli.

[032] E. coli pode ser categorizado com base em elementos que podem desencadear uma resposta imunológica em animais, ou seja, antígenos E. coli. Esses antígenos podem ser usados para vacinação isoladamente ou em combinação a fim de fornecer proteção contra infecção por E. coli. Antígenos E. coli compreendem os antígenos O que fazem parte da camada de lipopolissacarídeo, o antígeno K formando a cápsula, os antígenos H que formam a flagelina e os antígenos F fimbriais. O componente (b) da vacina de acordo com a invenção compreende pelo menos um ou mais antígenos F.

[033] Além disso, uma ou mais das toxinas de E. coli, tais como enterotoxinas, podem ser usadas como toxoides em uma vacina de acordo com a invenção. Enterotoxinas de E. coli incluem, mas não estão limitadas a, enterotoxina ST e enterotoxina LT. Os antígenos e enterotoxinas mais importantes que causam colibacilose entérica são, por exemplo, descritos em Luppi A., Swine enteric colibacillosis: diagnosis, therapy and antimicrobial resistance, Porcine Health Manag. 2017; 3: 16; Zhang W. Progress and Challenges in Vaccine development against enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) – Associated porcine Post-weaning Diarrhea (PWD) J Vet Med Res. 2014;1(2):1006.

[034] Tipicamente, a vacina de acordo com a invenção compreende um ou mais antígenos F E. coli e, opcionalmente, toxoide LT de E. coli. Em uma modalidade preferencial, a vacina compreende um ou mais antígenos selecionados a partir de proteínas fimbriais F4, incluindo F4ab (=K88ab) e F4ac (=K88ac), F5 (=K99), F6 (=987P), F18, F41 e opcionalmente, toxoide LT de Escherichia coli. Mais preferencialmente, compreende pelo menos os antígenos F4 fimbrial E. coli, incluindo F4ab (=K88ab) e F4ac (=K88ac), F5 e F6. Em outra modalidade preferencial, a vacina compreende os antígenos fimbriais F4,

incluindo F4ab (=K88ab) e F4ac (=K88ac), F5, F6 e, opcionalmente, toxoide LT de E. coli.

[035] O componente (c) da vacina de acordo com a invenção compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de toxoide de Clostridium a fim de fornecer proteção contra uma infecção por Clostridium. O componente (c) é, portanto, convencionalmente incluído para conferir proteção contra sinais clínicos associados a uma infecção patogênica por Clostridium incluindo diarreia, dispneia, distensão abdominal e edema escrotal.

[036] Preferencialmente, o componente (c) compreende um ou mais toxoides de Clostridium selecionados a partir de toxoide de Clostridium B e toxoide de Clostridium C. Mais preferencialmente, o componente (c) compreende um ou mais toxoides selecionados a partir de Clostridium perfringens toxoide tipo B (perfB), toxoide de Clostridium perfringens tipo C (perfC) e toxoide de Clostridium novyi tipo B (novyiB) e mais preferencialmente o toxoide de Clostridium perfringens tipo C (perfC). Em uma modalidade mais preferencial, o componente (c) compreende toxoide de Clostridium perfringens tipo C e pode opcionalmente compreender adicionalmente toxoide de Clostridium perfringens tipo B.

[037] Em uma modalidade particularmente preferencial de acordo com a invenção, o componente (b) compreende pelo menos os antígenos fimbriais de E. coli F4, F5 e F6 e o componente (c) compreende o toxoide de Clostridium perfringens tipo C.

[038] Em uma outra modalidade preferencial, o componente imunologicamente eficaz da vacina de acordo com a invenção consiste no antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, nos antígenos de E. coli F4, F5 e F6 e, opcionalmente, toxoide LT, e o toxoide de Clostridium perfringens tipo C.

[039] Em uma vacina de acordo com a invenção, o antígeno é tipicamente combinado com um carreador farmaceuticamente aceitável, ou seja, um meio biocompatível, ou seja, um meio que após a administração não induz reações adversas significativas no indivíduo animal, capaz de apresentar o antígeno ao sistema imunológico do animal hospedeiro após a administração da vacina. Tal carreador farmaceuticamente aceitável pode ser, por exemplo, um líquido contendo água e/ou qualquer outro solvente biocompatível ou um veículo sólido, tal como comumente usado para obter vacinas liofilizadas (com base em açúcares e/ou proteínas), opcionalmente compreendendo agentes imunoestimulantes (adjuvantes) Opcionalmente, outras substâncias, como estabilizadores, modificadores de viscosidade ou outros componentes, são adicionados dependendo do uso pretendido ou das propriedades necessárias para a vacina.

[040] A vacina de acordo com a presente invenção tipicamente compreende um adjuvante. Adjuvantes convencionais, conhecidos no estado da técnica são, por exemplo, adjuvante Completo e Incompleto de Freund, tocoferol-alfa, vitamina E, polímeros de bloco não iônicos, dipeptídeos muramil, Quill A®, óleo mineral, por exemplo, Bayol® ou Markol®, óleo vegetal, e Carbopol® (um homopolímero) ou Diluvac® Forte.

[041] A vacina também pode compreender um denominado “veículo”. Um veículo é um composto ao qual o polipeptídeo adere, sem estar covalentemente ligado a ele. Os compostos veículos frequentemente usados são, por exemplo, hidróxido de alumínio, -fosfato ou -óxido, sílica, caulino e bentonita.

[042] A vacina de acordo com a presente invenção pode ser administrada por qualquer rota de administração adequada, incluindo administração parenteral, por exemplo, através de todas as rotas de injeção na ou através da pele, por exemplo, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, submucosa ou subcutânea, mas é tipicamente adaptada, ou seja, adequada, para injeção intramuscular.

[043] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a uma vacina conforme descrito na presente invenção para uso em um método para proteger porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, Escherichia coli e Clostridium.

[044] Em outra modalidade, a presente invenção se refere ao uso de uma vacina conforme descrito na presente invenção para a fabricação de um medicamento para uso na proteção de porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, Escherichia coli e Clostridium.

[045] A vacina da presente invenção é, em particular, usada para a imunização passiva da progênie por imunização ativa de porcas e marrãs para reduzir a mortalidade e/ou sinais clínicos de infecções patogênicas causadas por S. suis, causado por aquelas cepas E. coli, que expressam em particular as adesinas F4ab (K88ab), F4ac (K88ac), F5 (K99) e/ou F6 (987P), e causadas por C. perfringens tipo C.

[046] Uma vacina disponível comercialmente para fornecer proteção contra tais infecções causadas por E. coli e Clostridium é Porcilis ColiClos® disponível na MSD Animal Health, incluindo os componentes de E. coli fimbrial F4ab, adesina fimbrial F4ac, adesina fimbrial F5, adesina fimbrial F6, toxoide LT; e o componente de Clostridium perfringens Tipo C (cepa 578) beta. Assim, em outra modalidade preferencial, a vacina de acordo com a invenção pode ser preparada misturando a vacina comercialmente disponível Porcilis ColiClos® com uma quantidade adequada de antígeno de IgM de S. suis.

[047] Surpreendentemente, foi descoberto que ao usar um antígeno de protease de IgM (assim, mesmo quando se usa uma vacina que compreende como antígeno porcino apenas o antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis), para induzir anticorpos em um animal fêmea, leitões obtêm proteção adequada contra Streptococcus suis pela ingestão de colostro do animal vacinado. Portanto, um antígeno que demonstrou ter um efeito protetor em leitões, mostrou-se útil para vacinar porcas para chegar a um efeito protetor claro em leitões, tipicamente pelo menos na janela de 2-3 semanas após o desmame.

[048] A invenção, portanto, também se refere ao uso de um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis para a fabricação de uma vacina de combinação para proteger um leitão contra Streptococcus suis, E. coli e Clostridium administrando a vacina de combinação a uma porca fêmea e permitindo que o leitão absorva o colostro da porca fêmea vacinada. Conforme indicado acima, para atingir a proteção ideal, o colostro é tipicamente absorvido dentro de 48 horas, em particular nas 24 horas após o nascimento do leitão.

[049] Em outra modalidade preferencial, a vacina de acordo com a invenção é administrada a uma porca fêmea a fim de proteger um leitão contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, Escherichia coli e Clostridium através da ingestão de colostro da porca fêmea vacinada.

[050] Adicionalmente, a presente invenção é descrita por meio dos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1:

OBJETIVO

[051] O objetivo deste estudo foi testar a eficácia de uma vacina de subunidade de protease de IgM em porcas prenhas contra inoculação de Streptococcus suis da prole em diferentes idades, a saber às 4, 6, 8 e 10 semanas de idade.

PROJETO DE ESTUDO

[052] Para este estudo, foram usadas 12 marrãs prenhas. Seis marrãs foram vacinadas em 6 e 2 semanas antes do parto estimado com um antígeno de protease de IgM de rIdeS.suis recombinante (Seele et al: Vaccine 33: 2207- 2212; 5 de maio de 2015, par. 2.2.) a 120 µg por dose (conforme estabelecido por um ensaio de proteína de Bradford usando BSA como padrão) em adjuvante XSolve (MSD Animal Health, Boxmeer, Holanda). Seis marrãs foram deixadas como controles não vacinados. Após o parto, os leitões das porcas foram divididos em quatro grupos de inoculação de 20 leitões cada (10 leitões de porcas vacinadas e 10 leitões de porcas controle), fornecendo uma distribuição uniforme das diferentes ninhadas entre os grupos. Os quatro grupos foram inoculados às 4, 6, 8 e 10 semanas de idade, respectivamente com uma cultura virulenta de S. suis sorotipo 2. Durante 9-11 dias após a inoculação os leitões foram observados diariamente para sinais clínicos de infecção por S. suis, tais como depressão, problemas locomotores e/ou sinais neurológicos, usando um sistema de pontuação regular de 0 (sem sinais) a 3 para os casos graves. O mesmo sistema de pontuação (0 para parâmetro não visível, o número mais alto para casos graves) foi usado para cada parâmetro. Os animais que atingiram o ponto final humano foram eutanasiados. Em tempos regulares antes e depois da vacinação (porcas) e logo antes da inoculação (leitões), sangue sérico foi coletado para determinação de anticorpos. Em tempos regulares, antes e depois da inoculação sangue de heparina foi coletado dos leitões para o reisolamento da cepa de inoculação. Treze semanas após a vacinação de reforço, 4 porcas foram necropsiadas e o sítio da injeção foi examinado para reações locais ou remanescentes da vacina.

RESULTADOS

[053] Quatro porcas vacinadas foram submetidas a um exame pós-morte do sítio da injeção. Dois animais tiveram uma pequena reação local (2-3 cm de diâmetro) no sítio da injeção de reforço consistindo em uma descoloração com aumento da consistência do tecido. Não foram observados abscessos ou resquícios de vacina. Portanto, pode-se concluir que a vacina é segura para administração.

[054] No dia da primeira vacinação (6 semanas antes do parto estimado), as marrãs tinham títulos de anticorpos de IgG (baixos) contra o antígeno. Após a vacinação, as marrãs vacinadas mostraram uma clara soroconversão, considerando que os animais de controle permaneceram em um nível baixo. Os títulos de IgG médios no colostro foram de 8,8 log2 mais altos em animais vacinados em comparação com os controles. Após a amamentação, os leitões das mães vacinadas tiveram títulos séricos aproximadamente 7,7 log2 mais altos em comparação com os animais de controle. A diferença no título médio às 4, 6, 8 e 10 semanas de idade foi de 6,7, 5,3, 4,8 e 3,6 log2, respectivamente. Os dados pós-inoculação para o período antes da eutanásia (dias 9-11) são indicados na Tabela 1. Tabela 1 Resultados pós-inoculação Idade Grupo Pontuação clínica Nº de eutanasiados Tempo de (média) por total sobrevivência (média-dias) 4 semanas Vacina 17,1 3/10 9,5 Controle 31,6 6/10 8,0 6 semanas Vacina 5,8a 2/10 b 8,8a Controle 59,7 9/10 2,7 8 semanas Vacina 2,3a 0/10 b 11,0a Controle 59,5 8/10 4,7 10 semanas Vacina 0,7a 0/10 10,0 Controle 15,6 2/10 8,8 a significativamente diferente do grupo de controle (teste U de Mann Whitney, p <0,05) b significativamente diferente do grupo controle (teste exato de Fisher, p <0,05)

CONCLUSÃO

[055] A partir dos resultados pode-se concluir que a vacinação de porcas com a vacina de subunidade de protease de IgM é uma estratégia de vacinação adequada para o controle de infecções de Streptococcus suis em leitões. A vacina induziu proteção marcadamente melhor contra inoculação de Streptococcus suis até as 10 semanas de idade quando comparado com a proteção alcançada em leitões que receberam colostro de mães animais naturalmente infectadas. Isto mostra que os leitões podem ser protegidos no período completo de 2-3 semanas após o desmame, ou seja, dentro do período em que os leitões têm uma idade de 4-7 semanas, e mesmo depois desse período. Exemplo 2:

OBJETIVO

[056] O objetivo deste estudo foi testar a resposta sorológica de diferentes vacinas de combinação, incluindo o rIdeS.suis de antígeno de IgM de S. suis recombinante em comparação com as vacinas individuais. Em particular, a combinação com uma vacina de E coli/Clostridium combinada (compreendendo antígenos fimbriais E. coli e Toxoide Clostridium perfringens tipo C), bem como com uma vacina de Pasteurella/Bordetella combinada (compreendendo toxina Pasteurella e células Bordetalla inativada) foi avaliada. Especificamente, a resposta sorológica foi testada após o uso misto associado de uma vacina de subunidade de rIdeS.suis com as vacinas comerciais Porcilis® ColiClos ou Porcilis® AR-T DF em comparação com as vacinas únicas.

PROJETO DE ESTUDO

[057] Para este estudo foram usados 48 porcos saudáveis de 17 semanas de idade, distribuídos em seis grupos de 8 animais cada. O grupo 1 foi vacinado com o antígeno de subunidade em adjuvante Diluvac® Forte, o grupo 2 foi vacinado com o antígeno de subunidade em Porcilis® ColiClos, o grupo 3 foi vacinado com o antígeno de subunidade em Porcilis® AR-T DF e os grupos 4 e 5 foram vacinados com Porcilis® ColiClos ou Porcilis® AR-T DF, respectivamente. As vacinas foram administradas por via intramuscular no pescoço às 17 semanas de idade e 21 semanas de idade. Às 23 semanas de idade, todos os animais foram examinados pós-morte para reações locais nos sítios de injeção. Amostras de sangue foram coletadas pouco antes de cada vacinação e durante a eutanásia no pós-morte.

MATERIAIS E MÉTODOS Antígeno de subunidade rIdeS.suis concentrado Nome do Produto: Antígeno de subunidade (rIdeS.suis) Forma farmacêutica: Suspensão contendo 0,64 mg/mL de antígeno Apresentação: 1,50 mL de enchimento (criotubos de 1,8 mL) Adjuvante Diluvac® Forte Nome do Produto: Diluvac® Forte Forma farmacêutica: Emulsão para aplicação intramuscular Apresentação: 20 mL de enchimento (frasco PET de 20 mL) Vacina Porcilis® ColiClos Nome do Produto: Porcilis® ColiClos Forma farmacêutica: Emulsão para aplicação intramuscular Apresentação: 20 mL de enchimento (frasco PET de 20 mL) Vacina Porcilis® AR-T DF Nome do Produto: Porcilis® AR-T DF Forma farmacêutica: Emulsão para aplicação intramuscular Apresentação: 20 mL de enchimento (frasco PET de 20 mL) Vacinas de rIdeS.suis vacinas de rIdeS.suis em Diluvac Forte, Porcilis ColiClos e Porcilis AR-T DF foram preparadas logo antes do uso adicionando 1,3 mL de rIdeS.suis purificado (concentração de 0,64 mg/mL) para um frasco (20 mL) de Diluvac Forte, Porcilis ColiClos ou Porcilis AR-T DF, resultando em uma vacina contendo 40 µg/mL = 80 µg por dose. A vacina foi transportada a 2-8 °C. Sistema de teste Animais, identificação, alojamento e maneio

[058] Foram usados quarenta e oito porcos, identificados por etiquetas auriculares numeradas. No dia da primeira vacinação os porcos tinham 17 semanas de idade. Uma semana antes do primeiro tratamento os porcos foram alojados. Durante o experimento os porcos foram alimentados de acordo com os procedimentos padrão e tiveram acesso a água da torneira fresca ad libitum. A aclimatação foi de uma semana. Apenas animais saudáveis foram incluídos no experimento. Os porcos foram atribuídos aos 5 grupos de tratamento e vacinados à medida que apareciam. Tratamento

[059] Os porcos foram vacinados conforme descrito abaixo. vacinação grup nº de volume/rota/ida amostra de o porcos vacina de sangue 1 8 rIdeS.suis + Diluvac Forte 2 8 rIdeS.suis + Porcilis ColiClos 2 mL/IM/ 17 sem., 21 sem., 3 8 rIdeS.suis + Porcilis AR-T DF 17 sem. e 21 23 sem. 4 8 Porcilis ColiClos sem. 5 8 Porcilis AR-T DF

[060] Portanto, o grupo 2 representa uma vacina de combinação de acordo com a invenção, enquanto os grupos 1 e 3 a 5 representam vacinas comparativas (grupos de controle). Procedimentos experimentais em animais

[061] Durante o experimento os porcos foram observados diariamente quanto a quaisquer anormalidades de saúde geral e comportamento pelo técnico de animais responsável ou tratador de animais de acordo com os procedimentos padrão. Todas as anormalidades (incluindo a presença de quaisquer reações locais) foram registradas. Em caso de anormalidades o veterinário responsável foi consultado. Amostras de sangue (soro) foram coletadas imediatamente antes de cada vacinação e duas semanas após a vacinação de reforço. As amostras foram transportadas para coleta de sangue em temperatura ambiente. Após a coagulação, os soros foram armazenados congelados até o teste em um ELISA de anticorpo rIdeS.suis experimental. Três semanas após a vacinação de reforço, todos os animais foram submetidos a um exame pós-morte dos sítios de injeção de acordo com os procedimentos padrão. Procedimentos experimentais de laboratório Sorologia de rIdeS.suis

[062] As amostras de soro foram testadas em um ELISA de rIdeS.suis experimental. Em suma, o antígeno rIdeS.suis foi revestido em placas de microtitulação. Após o revestimento, as placas foram lavadas e foram feitas diluições em série dos soros. Após incubação e lavagem subsequente, os anticorpos ligados foram quantificados usando conjugado de IgG anti-porco e TMB como substrato. Os títulos foram expressos em log2. Neste teste, <4,3 é considerado negativo. Para fins de cálculo, <4,3 é substituído por 3,3. Sorologia de E. coli

[063] As amostras de soro foram testadas para títulos de anticorpos K88ab, K88ac, K99, 987P e LT. Em suma, os respectivos antígenos E. coli foram revestidos em placas de microtitulação. Após o revestimento, as placas foram lavadas e foram feitas diluições em série dos soros. Após incubação e lavagem subsequente, os anticorpos ligados foram quantificados usando conjugado de IgG anti-suíno e TMB como substrato. Os títulos foram expressos em log2. Neste teste títulos <5,6 são considerados negativos. Para fins de cálculo, <5,6 é substituído por 4,6. Sorologia de C. Perfringens

[064] Para beta-toxina de C. perfringens títulos de anticorpo foram testados em um método ELISA. Em suma, β-toxina de C. perfringens (cepa 578) foi revestida em placas de microtitulação. Após o revestimento e subsequente bloqueio das placas, as placas foram lavadas e foram feitas diluições em série de duas vezes dos soros. Após incubação e lavagem subsequente, os anticorpos ligados foram quantificados usando conjugado anti-ruminante e TMB como substrato. Os títulos são expressos em log2. Neste teste títulos <4,6 são considerados negativos. Para fins de cálculo, <4,6 é substituído por 3,6. Sorologia de P. multocida

[065] Anticorpos neutralizantes de toxina de P. multocida (PMT) foram medidos da seguinte forma: diluições em série de duas vezes dos soros foram pré-incubadas com toxina de P. multocida tipo 1 em placas de microtitulação e, em seguida, inoculadas em uma monocamada VERO. As células foram incubadas e a inibição do efeito citopático (CPE) da toxina foi medida. Os títulos são expressos como log2 da diluição mais alta recíproca em que nenhum CPE é observado. Neste teste um título <3 é considerado negativo. Para fins de cálculo, <3 é substituído por 2. Sorologia de B. bronchiseptica

[066] Anticorpos aglutinantes de B. bronchiseptica foram medidos no teste de Blobel. Em suma, diluições em série de duas vezes dos soros foram incubadas com uma suspensão de B. bronchiseptica e aglutinação é lida. Os títulos foram expressos como o log2 recíproco da diluição de soro mais alta que deu aglutinação completa. Neste teste um título <1 é considerado negativo. Para fins de cálculo, <1 é substituído por 0. Avaliação de resultados e análise estatística

[067] Os resultados serológicos para todos os componentes da vacina serão comparados entre os grupos, ou seja, os grupos de uso misto associados serão comparados com os respectivos grupos de vacina única. Os grupos selecionados foram comparados usando o teste-t bilateral de duas amostras e o programa estatístico Minitab 17. O teste era válido se uma soroconversão clara fosse observada nos grupos de vacina única pós-vacinação.

RESULTADOS Sorologia de rIdeSsuis

[068] No início do estudo, todos os porcos eram soronegativos para rIdeSsuis (Tabela 2). Os dois grupos de uso associados com Porcilis ColiClos e Porcilis AR-T DF foram 3,3 e 2,1 log2 menor em comparação com as vacinas únicas, respectivamente. Essas diferenças foram estatisticamente significativas: p=0,003 e p=0,020, respectivamente. Os dois grupos de controle 4 e 5 permaneceram soronegativos durante o estudo. Sorologia de Porcilis ColiClos: K88ab, K88ac, K99, 987P, LT e antígenos de β-toxina

[069] A adição de rIdeS.suis não teve efeito negativo na resposta sorológica contra os antígenos em Porcilis ColiClos (Tabela 3-8). Foi observada uma tendência negativa para a resposta de 987P no grupo de uso misto associado (p=0,061), mas a diferença no título de 987P foi muito pequena (apenas 1log 2) e provavelmente não relevante biologicamente.

[070] Os respectivos grupos de controle eram soronegativos no início do estudo e permaneceram em um nível baixo durante o estudo. Sorologia de Porcilis AR-T DF: Toxina PMT e B. bronchiseptica

[071] No início do estudo os porcos eram soronegativos para toxina PMT (Tabela). Um efeito negativo significativo estatisticamente aparente do antígeno rIdeS.suis no desenvolvimento de anticorpo de toxina PMT foi encontrado (p=0,021) e que impede o uso combinado desses dois antígenos de vacina.

[072] Após a vacinação, nenhum efeito negativo do uso misto associado foi observado nos títulos de anticorpos de Bordetella. Sítio de injeção de reações locais

[073] A necropsia dos sítios de injeção de vacina foi realizada 2 semanas pós-vacinação, quando são esperadas reações máximas/de pico, e mostrou a presença de reações locais após a vacinação inicial (lado direito) e/ou de reforço (lado esquerdo) (não mostrado). A adição de rIdeS.suis a Porcilis ColiClos ou Porcilis AR-T DF não exacerba a reação local em comparação com a das vacinas únicas.

[074] Os resultados de testes de serologia são mostrados nas seguintes Tabelas 2-10. Como cada grupo consistia em oito porcos, os títulos de anticorpos dados nas tabelas para os grupos 1 a 5 (os grupos 1 e 3-5 representam exemplos comparativos) são uma média de oito valores. Tabela 2 título de anticorpo rIdeSsuis título de anticorpo (log2) no dia pós- vacinação Grupo 0 28 42 Grupo 1 rIdeS.suis + Diluvac Forte 3,3 7,8 10,1 Grupo 2 rIdeS.suis + Porcilis ColiClos 3,8 7,4 8,7 Grupo 3 rIdeS.suis + Porcilis AR-T DF 3,6 5,1 8,0 Grupo 4 Porcilis ColiClos 3,4 3,3 3,3 Grupo 5 Porcilis AR-T DF 3,7 3,6 3,4

Tabela 3 título de anticorpo de E. coli F4ab (= K88ab) título de anticorpo (log2) no dia pós- vacinação Grupo 0 28 42 Grupo 1 rIdeS.suis + Diluvac Forte 4,6 4,6 4,8 Grupo 2 rIdeS.suis + Porcilis ColiClos 4,6 6,8 9,9 Grupo 3 rIdeS.suis + Porcilis AR-T DF 4,6 4,6 4,6 Grupo 4 Porcilis ColiClos 4,6 5,7 9,1 Grupo 5 Porcilis AR-T DF 4,6 4,6 4,6 Tabela 4 título de anticorpo de E. coli F4ac (= K88ac) título de anticorpo (log2) no dia pós- vacinação Grupo 0 28 42 Grupo 1 rIdeS.suis + Diluvac Forte 4,7 4,8 4,9 Grupo 2 rIdeS.suis + Porcilis ColiClos 4,6 5,5 9,7 Grupo 3 rIdeS.suis + Porcilis AR-T DF 4,6 5,9 4,6 Grupo 4 Porcilis ColiClos 4,6 5,1 9,0 Grupo 5 Porcilis AR-T DF 4,6 4,6 4,6 Tabela 5 título de anticorpo de E. coli F5 (=K99) título de anticorpo (log2) no dia pós- vacinação Grupo 0 28 42 Grupo 1 rIdeS.suis + Diluvac Forte 5,5 5,6 6,3 Grupo 2 rIdeS.suis + Porcilis ColiClos 4,6 7,3 9,8 Grupo 3 rIdeS.suis + Porcilis AR-T DF 4,6 5,0 5,3 Grupo 4 Porcilis ColiClos 4,6 7,0 9,5

Grupo 5 Porcilis AR-T DF 4,6 5,0 5,6 Tabela 6 título de anticorpo E. coli F6 (=987P) título de anticorpo (log2) no dia pós- vacinação Grupo 0 28 42 Grupo 1 rIdeS.suis + Diluvac Forte 6,3 8,5 9,7 Grupo 2 rIdeS.suis + Porcilis ColiClos 5,5 10,4 14,1 Grupo 3 rIdeS.suis + Porcilis AR-T DF 5,0 7,1 8,6 Grupo 4 Porcilis ColiClos 4,8 10,8 15,3 Grupo 5 Porcilis AR-T DF 4,7 7,9 8,6 Tabela 7 título de anticorpo E. coli LT título de anticorpo (log2) no dia pós- vacinação Grupo 0 28 42 Grupo 1 rIdeS.suis + Diluvac Forte 6,1 7,2 7,5 Grupo 2 rIdeS.suis + Porcilis ColiClos 5,6 7,8 10,1 Grupo 3 rIdeS.suis + Porcilis AR-T DF 5,1 5,6 6,1 Grupo 4 Porcilis ColiClos 4,9 7,6 9,6 Grupo 5 Porcilis AR-T DF 5,2 6,0 5,9 Tabela 8 título de anticorpo beta-toxina de C. perfringens título de anticorpo (log2) no dia pós- vacinação Grupo 0 28 42 Grupo 1 rIdeS.suis + Diluvac Forte 3,6 3,6 3,6 Grupo 2 rIdeS.suis + Porcilis ColiClos 3,6 5,7 8,9 Grupo 3 rIdeS.suis + Porcilis AR-T DF 3,6 3,6 3,6

Grupo 4 Porcilis ColiClos 3,6 6,0 8,7 Grupo 5 Porcilis AR-T DF 3,6 3,6 3,8 Tabela 9 título de anticorpo toxina de P. multocida tipo 1 título de anticorpo (log2) no dia pós- vacinação Grupo 0 28 42 Grupo 1 rIdeS.suis + Diluvac Forte 0,0 0,0 0,0 Grupo 2 rIdeS.suis + Porcilis ColiClos 0,0 0,0 0,0 Grupo 3 rIdeS.suis + Porcilis AR-T DF 0,0 0,0 1,0 Grupo 4 Porcilis ColiClos 0,0 0,0 0,0 Grupo 5 Porcilis AR-T DF 0,0 0,0 2,8 Tabela 10 título de anticorpo B. bronchiseptica aglutinante título de anticorpo (log2) no dia pós- vacinação Grupo 0 28 42 Grupo 1 rIdeS.suis + Diluvac Forte 1,8 2,3 2,1 Grupo 2 rIdeS.suis + Porcilis ColiClos 1,6 1,0 0,8 Grupo 3 rIdeS.suis + Porcilis AR-T DF 1,0 4,6 7,1 Grupo 4 Porcilis ColiClos 0,8 0,4 0,0 Grupo 5 Porcilis AR-T DF 1,4 5,3 8,1

CONCLUSÕES

[075] Como pode ser visto a partir dos resultados nas Tabelas 2-10, a adição de rIdeS.suis não teve efeito negativo na resposta sorológica dos antígenos em Porcilis ColiClos. A adição de rIdeS.suis também não teve efeito negativo na resposta sorológica contra o antígeno Bordetella em Porcilis AR-T DF, mas teve um efeito negativo significativo no título P. multocida.

[076] Em particular, no primeiro ponto de tempo de 28 dias após a vacinação, a resposta contra o antígeno rIdeS.suis está quase no mesmo nível para a vacina de combinação com Porcilis ColiClos quando comparada com o controle positivo (apenas rIdeS.suis), mas substancialmente inferior para a vacina de combinação com Porcilis ART-DF (Tabela 2). Portanto, os antígenos de Porcilis ColiClos têm influência menos negativa na resposta contra rIdeS.suis do que os antígenos de Porcilis ART. Além disso, no segundo ponto de tempo de 42 dias após a vacinação, a resposta contra P. multocida é substancialmente menor para a combinação de rIdeS.suis e Porcilis AR-T DF em comparação com Porcilis AR-T DF (Tabela 9). Portanto, a presença de rIdeS.suis na vacina de combinação tem uma influência negativa significativa na resposta contra P. multocida.

[077] Estas descobertas mostram que a combinação do antígeno rIdeS.suis com os antígenos e toxoides P. multocida e B. bronchisepta incluídos em Porcilis AR-T DF não é viável, considerando que a combinação de rIdeS.suis com antígenos e toxoides E. coli e Clostridium incluídos em Porcilis ColiClos resulta em resultados excelentes, tornando esta combinação particularmente adequada para o fornecimento de uma vacina de combinação. Inerentemente, o mesmo pode ser concluído para uma vacina de combinação compreendendo menos antígenos, por exemplo, apenas os antígenos fimbriais de Eschericha coli que são os antígenos essenciais para fornecer proteção adequada contra E. coli.

[078] A partir dos resultados, pode-se concluir assim que a combinação de rIdeS.suis com antígenos e toxoides E. coli e Clostridium é adequada para uso em uma vacina de combinação para fornecer proteção contra infecções patogênicas causadas por S. suis, E. coli e Clostridium. Assim, tornou-se surpreendentemente possível na presente invenção fornecer uma vacina, que fornece proteção contra uma combinação de doenças, incluindo infecções patogênicas causadas por S. suis, E. coli e Clostridium e que é adequada para vacinação de porcas.

Além disso, dado o fato de que foi mostrado que a prole poderia ser adequadamente protegida contra uma infecção com Streptococcus suis via ingestão de colostro (para os outros antígenos este efeito é conhecido do estado da técnica), acredita-se que a vacina de combinação, fornecendo títulos elevados nos animais fêmeas vacinados, é capaz de fornecer proteção adequada contra todos os três patógenos via ingestão de colostro.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende componentes (a), (b) e (c) de: (a) uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, (b) uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno fimbrial de Escherichia coli, e (c) uma quantidade imunologicamente eficaz de um toxoide de Clostridium.

2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o componente (b) compreende um ou mais antígenos fimbriais de Escherichia coli selecionados a partir de F4, F5, F6, F18 e F41.

3. Vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o componente (b) compreende pelo menos os antígenos fimbriais F4, F5 e F6 de Escherichia coli.

4. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o componente (b) compreende adicionalmente um toxoide de Escherichia coli.

5. Vacina de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o toxoide de Escherichia coli é toxoide LT de Escherichia coli.

6. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o componente (c) compreende toxoide de Clostridium perfringens do tipo C.

7. Vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o componente (c) compreende adicionalmente toxoide de Clostridium perfringens do tipo B.

8. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,

caracterizada pelo fato de que o componente (b) compreende os antígenos fimbriais F4, F5 e F6 de Escherichia coli e o componente (c) compreende o toxoide de Clostridium perfringens do tipo C.

9. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a vacina compreende um adjuvante.

10. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a vacina é adaptada para injeção intramuscular.

11. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método para proteger porcos contra Streptococcus suis, Escherichia coli e Clostridium.

12. Vacina para uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de ser em um método para proteger porcos contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis, Escherichia coli e Clostridium, em que a vacina é administrada a uma porca fêmea, a fim de proteger um leitão contra uma infecção patogênica por Streptococcus suis através da ingestão de colostro da porca fêmea vacinada.

13. Kit de partes, caracterizado pelo fato de que compreende múltiplos recipientes de vacina separados, um dos quais compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis e um ou mais recipientes adicionais que em combinação compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno fimbrial de Escherichia coli e uma quantidade imunologicamente eficaz de um toxoide de Clostridium.

14. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, para uso em um método para proteger um animal contra infecção por Streptococcus suis, infecção por Escherichia coli e infecção por Clostridium, em que o antígeno de protease de IgM é misturado com uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno fimbrial de Escherichia coli e uma quantidade imunologicamente eficaz de um toxoide de Clostridium, antes da administração da vacina.

15. Uso de (a) um antígeno de protease de IgM de Streptococcus suis, (b) um antígeno fimbrial de Escherichia coli, (c) um toxoide de Clostridium, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina para proteger um animal contra infecção por Streptococcus suis, infecção por Escherichia coli e infecção por Clostridium, em que o antígeno de protease de IgM é misturado com um antígeno fimbrial de Escherichia coli e um toxoide de Clostridium, antes da administração da vacina.

16. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.