CN112638409A

CN112638409A - 组合疫苗

Info

Publication number: CN112638409A
Application number: CN201980056924.4A
Authority: CN
Inventors: A·A·C·雅各布斯
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2018-08-27
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2039-08-26
Also published as: BR112021002900A2; US11607447B2; WO2020043637A1; CN112638409B; JP2021535138A; EP3843780A1; JP7295223B2; US20210252124A1

Abstract

本发明涉及一种疫苗，其包含(a)免疫学有效量的猪链球菌(Streptococcus suis)IgM蛋白酶抗原，(b)免疫学有效量的大肠杆菌(Escherichia coli)纤毛抗原，和(c)免疫学有效量的梭状芽孢杆菌属类毒素，并且还涉及所述疫苗在保护猪免受猪链球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌属致病性感染的方法中的用途。

Description

组合疫苗

技术领域

本发明涉及一种保护猪免受猪链球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌属(Clostridium)致病性感染的组合疫苗。

背景技术

本发明涉及兽医疫苗学领域，即用于猪的组合疫苗。特别地，本发明涉及一种组合疫苗，其包含来自猪链球菌(S.suis)、大肠杆菌(E.coli)和梭状芽孢杆菌属的抗原。

如今，集约化养猪业严重依赖于兽药产品来保持动物健康，并实现经济运行。除了优化饲料和农场管理系统以外，还经常使用各种治疗方法：激素或抗生素等药物，以及针对细菌或病毒病原体的疫苗接种。

目前用于预防细菌病原体的疫苗主要是全细胞菌苗。然而，现场报告描述了疾病控制和管控中的困难，并且特别地，“疫苗失败”是常见的。携带者猪是主要的感染源，并且垂直传播和水平传播两者均参与疾病在畜群内的散播。在应激条件(诸如断奶和运输)下，携带者动物与易感动物的混合通常导致临床疾病。因此，用于预防疾病的有效控制措施将取决于预防/中期预防(metaphylactic)程序(在允许的情况下)和接种疫苗。目前，现场免疫工作的重点是商业或自体菌苗的使用。这些疫苗策略已应用于仔猪或母猪。母猪接种疫苗成本较低且劳动强度较低，因此代表了对仔猪接种疫苗的经济替代方案。然而，可得的结果似乎表明用菌苗进行母猪接种疫苗也是一个有争议的问题。在许多情况下，甚至当分娩前接种疫苗两次时，接种疫苗的母猪对接种疫苗应答也不佳或根本没有应答，这导致转移至幼崽的母体免疫低下。而且即使母体免疫以足够的水平转移，在许多情况下，母体抗体仍然太低，从而无法在4-7周龄的最关键时段中提供保护。母猪疫苗接种通常用于预防多种致病性感染，如由E.coli、梭状芽孢杆菌属、多杀性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、猪圆环病毒等引起的感染。

猪链球菌是猪的常见和机会性病原体。特别是在应激下，细菌可引起致病性感染并诱发疾病。早期用药断奶和隔离的早期断奶方法不能消除猪链球菌感染。从断奶开始，仔猪更容易受到猪链球菌感染，这是由于与断奶有关的应激以及随后常见的运输问题所致。因此，母猪的产前免疫通常被用来尝试对仔猪进行被动免疫，并在生命早期的这些应激情况下提供针对猪链球菌的保护。

在现代养猪条件下，例如，主要的应激由仔猪断奶和小猪运输诱导。这使得猪链球菌成为主要的猪病原体。其也是人脑膜炎和链球菌中毒性休克样综合征的新兴动物源性病原体。猪链球菌是一种包膜良好的病原体，并且已经基于荚膜多糖抗原多样性描述了多种血清型。猪链球菌使用毒力因子的武器库(arsenal)来逃避宿主免疫系统。这些特征已经一起为对抗这种重要病原体的有效疫苗的开发带来挑战。近来，已经出版了关于针对猪链球菌的疫苗的综述文章(Mariela Segura:“Streptococcus suis vaccines:candidateantigens and progress,于Expert Review of Vaccines,第14卷,2015,第12期,第1587-1608页)。在该综述中，已经汇编并比较了临床现场信息和实验数据，以提供针对猪链球菌的疫苗开发的现状的概览，如下所概述。

在猪中，自体菌苗经常在现场使用用于预防猪链球菌，特别是在欧洲。它们由在具有临床问题的农场分离的毒性菌株制备，并应用于同一农场。自体菌苗的缺点之一是缺乏疫苗安全性数据并且可能发生严重的不良反应。采样误差(由于仅使用一只或两只猪或样品)可能导致鉴别与近来暴发相关的菌株或血清型的失败。这种失败在地方性畜群中可能尤其成问题。最后，自体菌苗的最重要的困境是对它们的实际效力研究不足。由于自体疫苗的应用是经验性的，因此用这些疫苗获得的结果不一致也就不令人惊讶了。

本领域中还描述了其他实验疫苗。Kai-Jen Hsueh等人显示(“Immunization withStreptococcus suis bacterin plus recombinant Sao protein in sows conveyspassive immunity to their piglets”,于：BMC Veterinary Research,BMC series-open,inclusive and trusted,13:15,2017年1月7日)菌苗+亚基可能是给母猪成功接种疫苗以给它们的仔猪赋予保护性免疫的基础。

本领域中也已考虑活减毒疫苗。猪链球菌血清型2的无包膜的同基因(isogenic)突变体已被明确显示是无毒的。然而，基于无包膜的血清型2突变体的活疫苗制剂仅诱导针对死亡的部分保护，并且不能阻止用野生型菌株攻击的猪中的临床症状的发展(WisselinkHJ,Stockhofe-Zurwieden N,Hilgers LA等，“Assessment of protective efficacy oflive and killed vaccines based on a non-encapsulated mutant of Streptococcussuis serotype 2.”于：Vet Microbiol.2002,84:155–168)。

在过去的几年中，已报道了抗原性或免疫原性猪链球菌分子的广泛列表，并且这些中的大多数已通过使用来自受感染猪或人的恢复期血清和/或实验室产生的免疫血清的免疫蛋白质组学发现。WO2015/181356(IDT Biologika GmbH)已显示，IgM蛋白酶抗原(整个蛋白或仅代表完整蛋白的约35％的高度保守的Mac-1结构域)可以在一种接种疫苗方案中在仔猪中引发保护性免疫应答，所述接种疫苗方案是施用两剂IgM蛋白酶抗原，其任选地与含有菌苗的引发疫苗接种组合。注意到WO2017/005913(Intervacc AB)也描述了使用IgM蛋白酶抗原(特别是与核苷酸酶融合的IgM蛋白酶多肽)，但是已显示仅能够引发血清应答的特性。在该国际专利申请中未显示IgM蛋白酶抗原的保护作用。

大肠杆菌是属于肠杆菌科的革兰氏阴性周毛(peritrichously)鞭毛细菌，是猪中多种疾病的病原体，是在世界范围内引起乳猪和断奶猪死亡的重要原因。E.coli感染或大肠杆菌病会影响室内和室外的畜群，无论是长期发生的，还是零星的。E.coli感染发生在三个主要阶段：新生儿腹泻(在分娩后的前几天)、仔猪幼体腹泻(从分娩后第一周到断奶)和断奶后的腹泻(在断奶后的最初几周)。其还可以与其他病原体(包括轮状病毒)联合存在，并引起其他疾病，如水肿病和尿路感染。

某些E.coli菌株具有鞭毛或菌毛，这使其能够粘附或定植在空肠和回肠的吸收性上皮细胞上。与致病性相关的菌毛的常见抗原类型是F4(＝K88)、F5(＝K99)、F6(987P)和F41。致病性菌株产生肠毒素，肠毒素会导致体液和电解质分泌到肠腔中，导致腹泻、脱水和酸中毒。新生儿感染通常是由K88和987P株引起，而断奶后大肠杆菌病几乎总是由K88株引起。参见Vet Rec.2002Jan12；150(2):35-7。

已经采取了多种方法来预防大肠杆菌病，特别是断奶后腹泻，包括被动施用特定抗体、膳食补充剂(如益生元和益生菌)以及饮食预防措施、ETEC抗性畜群的遗传育种以及口服无毒E.coli活疫苗(Luppi A.,Swine enteric colibacillosis:diagnosis,therapyand antimicrobial resistance,Porcine Health Manag.2017；3:16；Zhang W.Progressand Challenges in Vaccine development against enterotoxigenic Escherichiacoli(ETEC)–Associated porcine Post-weaning Diarrhea(PWD)J Vet Med Res.2014；1(2):1006)。可以买到的商业疫苗是例如，

ColiClos(MSD Animal Health)、

和

(均为Zoetis)、

(IDT Biologika)、

(Boehringer Ingelheim)。通过摄入接种过疫苗的母体动物的初乳，可以充分保护仔猪免受E.coli。

梭状芽孢杆菌是一种厌氧、革兰氏阳性的孢子形成棒，这是一种重要的新兴病原体，主要在新生猪中引起腹泻。该物质最初被认为是在人中引起与抗生素相关的腹泻的原因。其最常见于1-7天大的仔猪以及其他家养和实验室动物中引起疾病。梭状芽孢杆菌属感染包括由C.difficile和C.perfringens引起的感染。可以通过直接革兰氏涂片染色在肠道中证明该生物体。梭状芽孢杆菌属在环境中的存活和从携带母猪上脱落被认为对传播很重要。C型和(在较小程度上)B型产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)是猪的重要病原体。已知相应的类毒素能够在猪中诱导保护性免疫应答。可以买到的各种商业疫苗是

ColiClos(MSD Animal Health)、

和

(均为Zoetis)、

(IDT Biologika)、

(Boehringer Ingelheim)。通过摄入接种过疫苗的母体动物的初乳，可以充分保护仔猪免受梭状芽孢杆菌。

为了限制对动物的应激以及照顾者的成本和劳动力，通常期望提供针对多种疾病的保护。因此，除了提供针对其他猪疾病的保护以外，还需要提供一种针对猪链球菌的保护的猪疫苗。然而，由于疫苗组分之间可能的不相容性，如抗原或其他疫苗组分之间的负面干扰，可能导致疫苗接种有效性降低或不良反应增加，因此，事先无法预期组合疫苗的有效性。尽管在一种组合疫苗中将抗原组合一直是并且仍然是普遍愿望，但是对于任何组合疫苗而言，尤其是抗原之间的干扰问题是非常普遍的问题，其阻止了在多价疫苗开发中的很多(即使不是大多数)抗原的组合。对此，我们参见2016年3月Michel De Wilde的报告，题目是“Combination vaccines:how and why？Lessons learned”，其可以通过世界卫生组织的网站访问。该报告确证了人们共同追求组合疫苗的愿望，但是除了其他问题以外，还有很多科学和技术问题需要解决。给出了使用普通抗原的组合疫苗研发失败的实例。

发明目的

因此，本发明的目的是找到一种组合疫苗，以保护猪(特别是仔猪)免受包括猪链球菌在内的致病性感染。此外，本发明的目的是找到一种组合疫苗，以保护仔猪免受一种以上致病性感染，其中通过母猪疫苗接种来保护仔猪免受这些感染。

发明内容

在本发明中令人吃惊地发现，可以提供一种组合疫苗以保护猪免受猪链球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌属的致病性感染。此外，令人吃惊地发现，可以通过向雌猪施用疫苗，以通过摄入已接种疫苗的雌猪的初乳，来保护仔猪免受猪链球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌属的致病性感染。

为了实现本发明的目的，提供了根据权利要求1的疫苗，其包含以下组分(a)、(b)和(c)：

(a)免疫学有效量的猪链球菌IgM蛋白酶抗原，

(b)免疫学有效量的大肠杆菌纤毛抗原，和

(c)免疫学有效量的梭状芽孢杆菌属(Clostridium)类毒素。

在从属权利要求中定义了本发明的优选实施方式。

因此，本发明首次提供了一种组合疫苗(简称：根据本发明的疫苗)，其提供了针对多种致病性感染的保护，包括由S.suis引起的感染。此外，使用本发明，使通过母猪接种疫苗保护仔猪免受多种致病性感染(包括由S.suis引起的感染)成为可能。

因此，本发明还提供了一种试剂盒，其包括多个单独的疫苗容器，其中一个容器包含免疫学有效量的猪链球菌IgM蛋白酶抗原，和一个或多个另外的容器组合包含免疫学有效量的大肠杆菌纤毛抗原，以及免疫学有效量的梭状芽孢杆菌属类毒素(例如，一个容器包含E.coli和梭状芽孢杆菌抗原，或者两个或更多个单独的容器，每个容器包含一种或多种相应抗原)。

本发明还提供了一种包含免疫学有效量的猪链球菌IgM蛋白酶抗原的疫苗，其用于保护动物免受猪链球菌感染、大肠杆菌感染和梭状芽孢杆菌属感染的方法中，其中在接种所述疫苗之前，将所述IgM蛋白酶抗原与免疫学有效量的大肠杆菌纤毛抗原和免疫学有效量的梭状芽孢杆菌属类毒素混合。

定义

疫苗是一种药物组合物，其对于施用于受试者动物是安全的，并且能够在该动物中诱导针对致病性微生物的保护性免疫，即诱导针对微生物的成功保护。

猪链球菌的IgM蛋白酶抗原是一种特异性降解猪IgM(而不是猪IgG或猪IgA；Seele等，在Journal of Bacteriology,2013,195 930-940中；和在Vaccine 33:2207-2212；2015年5月5日中)的酶，表示为IdeSsuis的蛋白，或其免疫原性部分(通常具有全长酶的至少约30-35％的长度)。完整酶具有约100-125kDa的重量，对应于约1000-1150个氨基酸，大小取决于S.suis的血清型。在WO 2015/181356中，给出代表猪链球菌的IgM蛋白酶抗原的几种序列，即，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:5，后者是全长酶的免疫原性部分(表示为Mac-1结构域，即SEQ ID NO:7的氨基酸80-414)。全长酶的免疫原性部分的其他实例在WO2017/005913中给出。具体而言，IgM蛋白酶可以是根据WO2015/1818356的SEQ ID NO:1的蛋白酶或在重叠区域中具有至少90％或甚至91、92、93、94、95、96、97、98、99％直至100％序列同一性的蛋白。可以使用具有默认参数的blastp算法用BLAST程序建立氨基酸序列同一性。预期各种血清型的猪链球菌的IgM蛋白酶具有高于90％的序列同一性，特别是预期为91、92、93、94、95、96、97、98、99％直至100％的序列同一性。例如，为了优化抗原的重组生产系统中的产量而制成的人工蛋白，可能导致与完整酶相比较低的氨基酸序列同一性，例如85％、80％、75％、70％或甚至60％，同时维持所需的免疫原性功能，并且在本发明的意义上被理解为猪链球菌的IgM蛋白酶抗原。

针对微生物的保护有助于预防、改善或治愈该微生物的致病性感染或由该感染产生的病症，例如，预防或减少由病原体的感染导致的一种或多种临床症状。

如本文所用，“免疫学有效量”是指在猪中诱导免疫应答至一定程度所需的抗原或类毒素的量，所述程度是当与由野生型感染物感染未经免疫的猪引起的病理学作用相比，其降低由野生型感染物(即，S.suis、E.coli或梭状芽孢杆菌属)引起的感染或由感染引起的病理学作用。免疫学有效量可以由本领域技术人员通过本领域公知的常规方法来确定，例如，通过对已接种疫苗的动物施用实验性攻击感染，然后确定目标动物的疾病临床指征、血清学参数或者通过测量病原体的重新分离物，然后将这些发现与现场(field)感染的猪中观察到的那些进行比较。

具体实施方式

根据本发明的疫苗的组分(a)包含免疫学有效量的猪链球菌IgM蛋白酶抗原，以提供针对S.suis感染的保护。

因此，通常包含组分(a)以赋予针对猪链球菌致病性感染相关的临床症状的保护。与猪链球菌致病性感染相关的典型临床症状是直肠温度升高、运动能力减退(跛行、关节肿胀)、呼吸频率增加和神经系统症状(例如，震颤、抽搐、斜颈、共济失调)。预防、改善或治愈这些症状中的一个或多个对猪将是有益的，不仅因为这表明致病性感染正在被抑制。在又一个实施方式中，疫苗用于赋予针对与猪链球菌致病性感染相关的死亡率增加的保护。

根据本发明的疫苗通常包含IgM蛋白酶抗原，其量为每剂疫苗低于250μg，优选地为每剂120μg或更低。最小量是仍能获得保护性免疫的量。这可以通过常规实验确定，并且取决于所选择的IgM蛋白酶抗原的免疫原性性质以及期望的保护水平。对于目前的疫苗，据信最小量是每剂1μg抗原，但其可以是任何更高的剂量，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或在61-119范围内的任何整数，高达并包括每剂120μg。

根据本发明的疫苗的组分(b)包含免疫学有效量的E.coli纤毛抗原以及任选地类毒素，以提供针对E.coli感染的保护。因此，常规地包含组分(b)以赋予针对与E.coli致病性感染相关的临床症状的保护，所述临床症状包括具有快速脱水的大量水样腹泻、酸中毒，并且死亡是常见的。罕见地，猪可能在腹泻开始之前倒下并死亡。

E.coli的致病性感染通常包括但不限于由肠毒素E.coli引起的感染以及由肠致病性E.coli菌株引起的感染。

可以基于能够在动物中引发免疫应答的成分(即，E.coli抗原)对E.coli进行分类。这些抗原可单独或组合用于疫苗接种，以提供针对E.coli感染的保护。E.coli抗原包括形成脂多糖层的一部分的O抗原，形成荚膜的K抗原，形成鞭毛蛋白的H抗原和纤毛F抗原。根据本发明的疫苗的组分(b)至少包含一种或多种F抗原。

此外，可以将一种或多种E.coli毒素(如肠毒素)用作根据本发明的疫苗中的类毒素。E.coli肠毒素包括但不限于ST肠毒素和LT肠毒素。例如，在Luppi A.,Swine entericcolibacillosis:diagnosis,therapy and antimicrobial resistance,Porcine HealthManag.2017；3:16；Zhang W.Progress and Challenges in Vaccine developmentagainst enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC)–Associated porcine Post-weaning Diarrhea(PWD)J Vet Med Res.2014；1(2):1006中描述了引起肠道大肠杆菌病的最重要的抗原和肠毒素。

通常，根据本发明的疫苗包含一种或多种E.coli F抗原和任选地E.coli LT类毒素。在一个优选的实施方式中，疫苗包含一种或多种选自纤毛蛋白F4的抗原，包括F4ab(＝K88ab)和F4ac(＝K88ac)、F5(＝K99)、F6(＝987P)、F18、F41，以及任选地大肠杆菌LT类毒素。更优选地，其至少包含纤毛E.coli抗原F4，包括F4ab(＝K88ab)和F4ac(＝K88ac)、F5和F6。在另一个优选的实施方式中，疫苗包含纤毛抗原F4，包括F4ab(＝K88ab)和F4ac(＝K88ac)、F5和F6，以及任选地E.coli LT类毒素。

根据本发明的疫苗的组分(c)包含免疫学有效量的梭状芽孢杆菌属类毒素，以提供针对梭状芽孢杆菌属感染的保护。因此，通常包含组分(c)，以赋予针对与梭状芽孢杆菌属致病性感染相关的临床症状的保护，所述临床症状包括腹泻、呼吸困难、腹胀和阴囊水肿。

优选地，组分(c)包含一种或多种选自梭状芽孢杆菌类毒素B和梭状芽孢杆菌类毒素C的梭状芽孢杆菌类毒素。更优选地，组分(c)包含一种或多种类毒素，其选自产气荚膜梭状芽孢杆菌B型类毒素(perfB)、产气荚膜梭状芽孢杆菌C型类毒素(perfC)和诺维氏梭状芽孢杆菌(Clostridium novyi)B型类毒素(novyiB)，以及最优选产气荚膜梭状芽孢杆菌C型类毒素(perfC)。在一个最优选的实施方式中，组分(c)包含产气荚膜梭状芽孢杆菌C型类毒素，以及可以任选地还包含产气荚膜梭状芽孢杆菌B型类毒素。

在根据本发明的一个特别优选的实施方式中，组分(b)至少包含E.coli纤毛抗原F4、F5和F6，以及组分(c)包含产气荚膜梭状芽孢杆菌C型类毒素。

在一个进一步优选的实施方式中，根据本发明的疫苗的免疫学有效组分由猪链球菌IgM蛋白酶抗原，E.coli抗原F4、F5和F6和任选地LT类毒素，以及产气荚膜梭状芽孢杆菌C型类毒素组成。

在根据本发明的疫苗中，抗原通常与药学上可接受的载体组合，即，生物相容性介质，即，在施用后不会在受试动物中诱导显著的不良反应，能够在施用疫苗后向宿主动物的免疫系统呈递抗原的介质。例如，此类药学上可接受的载体可以是包含水和/或任何其他生物相容性溶剂的液体或固体载体，如常用于获得冻干疫苗(基于糖和/或蛋白)的固体载体，任选地包含免疫刺激剂(佐剂)。根据疫苗的预期用途或所需性质，可以任选地添加其他物质，如稳定剂、粘度调节剂或其他组分。

根据本发明的疫苗通常包含佐剂。本领域熟知的常规佐剂是，例如，弗氏完全佐剂和不完全佐剂、生育酚α、维生素E、非离子嵌段共聚物、胞壁酰二肽、

矿物油，例如，

或

植物油、和

(均聚物)或

Forte。

疫苗还可以包含所谓的“载剂”。载剂是多肽所附着但不与之共价结合的化合物。通常使用的载剂化合物是例如，氢氧化铝、-磷酸盐或-氧化物，二氧化硅，高岭土和膨润土。

可以通过任何适宜的施用途径施用本发明的疫苗，包括胃肠外施用，例如，通过注射的所有途径或通过皮肤，例如，肌内、静脉内、腹腔内、皮内、粘膜下或皮下，但通常适于(即，适合于)肌内注射。

在另一个实施方式中，本发明涉及如本文所述的疫苗，其用于保护猪免受猪链球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌属致病性感染的方法中。

在另一个实施方式中，本发明涉及如本文所述的疫苗在制备用于保护猪免受猪链球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌属致病性感染的药物中的用途。

本发明的疫苗特别地用于通过母猪和小母猪(gilts)的主动免疫使子代被动免疫以降低由S.suis引起的、由那些E.coli菌株(特别地，其表达粘附素F4ab(K88ab)、F4ac(K88ac)、F5(K99)和/或F6(987P))引起的以及由C型C.perfringens引起的致病性感染的死亡率和/或临床症状。

用于提供针对由E.coli和梭状芽孢杆菌属引起的此类感染的保护的商业上可购得的疫苗是可以从MSD Animal Health获得的Porcilis

其包含E.coli组分F4ab纤毛、F4ac纤毛粘附素、F5纤毛粘附素、F6纤毛粘附素、LT类毒素；以及产气荚膜梭状芽孢杆菌组分C型(菌株578)β。因此，在另一个优选的实施方式中，根据本发明的疫苗可以通过将市售疫苗Porcilis

与适宜量的猪链球菌IgM抗原混合来制备。

令人吃惊的是，已发现通过使用IgM蛋白酶抗原(因此，即使当使用仅包含猪链球菌IgM蛋白酶抗原作为猪抗原的疫苗时)在雌性动物中诱导抗体，仔猪通过摄入已接种疫苗的雌猪的初乳也获得了针对猪链球菌的充分保护。因此，已显示，在仔猪中具有保护作用的抗原可用于给母猪接种以在仔猪中获得明显的保护作用，所述保护作用通常至少在断奶后2-3周的窗口内。

因此，本发明还涉及猪链球菌的IgM蛋白酶抗原在制备组合疫苗中的用途，其用于通过向雌猪施用组合疫苗并使仔猪摄入已接种疫苗的雌猪的初乳来保护仔猪免受猪链球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌属。如上所述，为了获得最佳保护，通常在仔猪出生后48小时内(特别是24小时内)摄入初乳。

在另一个优选的实施方式中，将根据本发明的疫苗施用至雌猪，以通过摄入已接种疫苗的雌猪的初乳来保护仔猪免受猪链球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌属的致病性感染。

此外，通过下述非限制性实施例的方式对本发明进行了描述。

实施例

实施例1：

目的

本研究的目的是检测在妊娠母猪中接种IgM蛋白酶亚单位疫苗针对猪链球菌攻击不同年龄(即，在4、6、8和10周龄)后代的有效性。

研究设计

在本研究中，使用了12只妊娠小母猪。在估计分娩前6周和2周给6只小母猪接种在XSolve佐剂(MSD Animal Health,Boxmeer,The Netherlands)中的重组rIdeSsuis IgM蛋白酶抗原(Seele等，Vaccine 33:2207-2212；2015年5月5日，par.2.2.)，每剂120μg(通过Bradford蛋白测定，使用BSA作为标准品确定)。将6只小母猪作为未接种对照。分娩后，将母猪的仔猪分成四个攻击组，每组20只仔猪(10只仔猪来自接种母猪和10只仔猪来自对照母猪)，使不同窝的胎仔在各组之间均匀分布。分别在4、6、8和10周龄时使用S.suis血清型2强毒力培养物攻击四个组。在攻击后的9-11天内，每天使用常规评分系统(0(无症状)至3(严重情况))对S.suis感染的临床症状进行观察，如抑郁、运动问题和/或神经系统症状。每个参数使用相同的评分系统(参数不可见为0，严重情况为最高数)。将达到人道终点的动物处死。在接种前后定期(母猪)和攻击前即刻(仔猪)收集血清用于抗体测定。在攻击前后定期从仔猪中收集肝素血液用于攻击菌株的重新分离。强化免疫接种后13周，对4只母猪进行尸检，检查注射部位的局部反应或疫苗残留。

结果

对四只接种疫苗的母猪进行注射部位的尸检。两只动物在强化注射部位有小的(直径2-3cm)局部反应，由组织一致性增加的变色组成。未见脓肿或疫苗残留。因此，可以得出结论，该疫苗可以安全施用。

在首次接种当天(估计分娩前6周)，小母猪具有针对抗原的(较低)IgG抗体效价。接种疫苗后，接种的小母猪显示出明显的血清转化，而对照动物则保持较低水平。与对照相比，在接种疫苗动物的初乳中平均IgG滴度高8.8log₂。哺乳后，与对照动物相比，接种母畜(dam)的仔猪具有约7.7log₂更高的血清效价。在4、6、8和10周龄时，平均效价的差异分别为6.7、5.3、4.8和3.6log₂。处死前时间段(第9-11天)攻击后的数据如表1中所示。

表1攻击后的结果

^a与对照组相比的显著性差异(Mann Whitney U检验，p<0.05)

^b与对照组相比的显著性差异(Fisher精确检验，p<0.05)

结论

从结果可以得出结论，用IgM蛋白酶亚蛋白疫苗进行母猪疫苗接种是控制在仔猪中猪链球菌感染的适当疫苗接种策略。与在接受自然感染母体动物初乳的仔猪中达到的保护比较时，该疫苗在长达10周龄对猪链球菌的攻击具有明显更好的保护作用。这表明在断奶后2-3周的整个时期内(即，在仔猪4-7周龄的时期内)，甚至在该时期之后，都可以对仔猪进行保护。

实施例2：

目的

本研究的目的是检测与单一疫苗相比包含重组S.suis IgM抗原rIdeSsuis的不同组合疫苗的血清学应答。特别地，评估了与E coli/梭状芽孢杆菌属联合疫苗(包含纤毛E.coli抗原和产气荚膜梭状芽孢杆菌C型类毒素)，以及与巴斯德氏菌/博德特氏菌联合疫苗(包含巴斯德氏菌毒素和灭活的博得塔拉细胞)的组合。具体而言，检测了与单一疫苗相比，将rIdeSsuis亚单位疫苗与商业疫苗

ColiClos或

AR-T DF混合使用后的血清学应答。

研究设计

在本研究中，使用了48只健康的17周龄猪，将其分配为6组，每组8只动物。第1组接种在

Forte佐剂中的亚单位抗原，第2组接种在

ColiClos中的亚单位抗原，第3组接种在

AR-T DF中的亚单位抗原，以及第4组和第5组分别接种

ColiClos或

AR-T DF。在17周龄和21周龄时，在颈部肌内进行疫苗接种。在23周龄时，对所有动物进行尸检，以检查注射部位的局部反应。在每次疫苗接种之前和处死期间尸检时收集血液样品。

材料和方法

浓缩的rIde_Ssuis亚单位抗原

产品名称：亚单位抗原(rIde_Ssuis)

制剂形式：含0.64mg/ml抗原的混悬剂

介绍：1.50ml填充液(1.8ml冷冻管)

Forte佐剂

产品名称：

Forte

制剂形式：供肌内应用的乳剂

介绍：20ml填充液(20ml PET小瓶)

疫苗

ColiClos

产品名称：

ColiClos

制剂形式：供肌内应用的乳剂

介绍：20ml填充液(20ml PET小瓶)

疫苗

AR-T DF

产品名称：

AR-T DF

制剂形式：供肌内应用的乳剂

介绍：20ml填充液(20ml PET小瓶)

rIde_Ssuis疫苗

在临用前，在Diluvac Forte、Porcilis ColiClos和Porcilis AR-T DF中制备rIde_Ssuis疫苗，方法是将1.3ml纯化的rIde_Ssuis(浓度为0.64mg/ml)添加到一小瓶(20ml)Diluvac Forte、Porcilis ColiClos或Porcilis AR-T DF中，得到每剂含40μg/ml＝80μg的疫苗。疫苗在2-8℃下运输。

检测系统

动物、标识、房舍和饲养

使用通过编号的耳部标签而标识的48只猪。在首次接种当天，猪为17周龄。首次给药前一周将猪圈养。在实验期间，按照标准程序喂养猪，并且其可以随意饮用新鲜自来水。适应期为一周。在实验中仅包括健康动物。将猪分配到5个治疗组，并且其到手时已接种疫苗。

处理

如下所述给猪接种疫苗。

因此，第2组代表根据本发明的组合疫苗，而第1组和第3-5组代表比较疫苗(对照组)。

动物实验程序

在实验期间，负责的动物技术人员或动物管理员每天会按照标准程序观察猪的总体健康状况和行为是否有异常。记录所有异常(包括存在的任何局部反应)。如有异常，需咨询负责的兽医。在每次接种前即刻和强化接种后两周收集血液样本(血清)。在环境温度下运输用于血液取样的样品。凝血后，将血清冷冻保存，直至在实验性rIde_Ssuis抗体ELISA中进行检测。强化疫苗接种后三周，根据标准程序对所有动物进行注射部位的尸检。

实验室实验程序

血清学rIde_Ssuis

在实验性rIde_Ssuis ELISA中检测血清样品。简言之，将rIde_Ssuis抗原包被在微量滴定板上。包被后，洗涤板并对血清进行系列稀释。孵育并随后洗涤后，使用抗猪IgG缀合物和TMB作为底物对结合的抗体进行定量。效价以log₂表示。在该检测中，将<4.3认为是阴性的。出于计算目的，将<4.3替换为3.3。

血清学E.coli

针对K88ab、K88ac、K99、987P和LT抗体效价对血清样品进行检测。简言之，将相应的E.coli抗原包被在微量滴定板上。包被后，洗涤板并对血清进行系列稀释。孵育并随后洗涤后，使用抗猪IgG缀合物和TMB作为底物对结合的抗体进行定量。效价以log₂表示。在该检测中，将效价<5.6认为是阴性的。出于计算目的，将<5.6替换为4.6。

血清学C.perfringens

对于C.perfringens，以ELISA法检测了β毒素抗体的效价。简言之，将C.perfringens(菌株578)β毒素包被在微量滴定板上。包被并随后封闭板后，洗涤板并对血清进行两倍系列稀释。孵育并随后洗涤后，使用抗反刍动物缀合物和TMB作为底物对结合的抗体进行定量。效价以log₂表示。在该检测中，将效价<4.6认为是阴性的。出于计算目的，将<4.6替换为3.6。

血清学P.multocida

如下所示测量P.multocida毒素(PMT)中和抗体：在微量滴定板中将血清的两倍系列稀释液与P.multocida 1型毒素预孵育，然后接种在VERO单层上。孵育细胞并测量对毒素的细胞病变作用(CPE)的抑制。将效价表示为未观察到CPE的最高稀释度的倒数的log₂。在该检测中，将效价<3认为是阴性的。出于计算目的，将<3替换为2。

血清学B.bronchiseptica

在Blobel检测中测量B.bronchiseptica的凝集抗体。简言之，将血清的两倍系列稀释液与B.bronchiseptica混悬液一起孵育并读取凝集。将效价表示为完全凝集的最高血清稀释度的倒数的log₂。在该检测中，将效价<1认为是阴性的。出于计算目的，将<1替换为0。

结果评价和统计学分析

将在各组之间比较所有疫苗组分的血清学结果，即将相关的混合使用组与相应的单一疫苗组进行比较。使用双侧双样本t检验和统计程序Minitab 17对选定的组进行比较。如果在接种后的单一疫苗组中观察到明确的血清转化，则该检测是有效的。

结果

rIdeSsuis血清学

在研究开始时，所有猪的rIde_Ssuis是血清阴性的(表2)。与单一疫苗相比，含有Porcilis ColiClos和Porcilis AR-T DF的两个相关使用组分别降低了3.3和2.1log₂。这些差异具有统计学显著性，分别为：p＝0.003和p＝0.020。在研究期间，两个对照第4组和第5组保持血清阴性。

Porcilis ColiClos血清学：K88ab、K88ac、K99、987P、LT和抗原β毒素

添加rIde_S.suis对针对Porcilis ColiClos中的抗原的血清学应答没有负面影响(表3-8)。在相关的混合使用组中，观察到987P应答呈负向趋势(p＝0.061)，但是987P效价的差异很小(仅1log₂)，这很可能不具有生物学相关性。

各个对照组在研究开始时是血清阴性的，并且在研究期间保持在较低水平。

Porcilis AR-T DF血清学：PMT毒素和B.bronchiseptica

在研究开始时，猪针对PMT毒素是血清阴性的(表)。发现rIde_Ssuis抗原对PMT毒素抗体生成具有明显的统计学显著的负面影响((p＝0.021)，使得排除将这两种疫苗抗原联合使用。

接种疫苗后，未观察到相关的混合使用对博德特氏菌抗体效价的负面影响。

注射部位的局部反应

在疫苗接种后2周(预期最大/峰值反应时)进行疫苗注射部位的尸检，并且在初次(右侧)和/或强化(左侧)接种后显示出存在局部反应(未显示)。与单一疫苗的那些相比，将rIde_Ssuis添加至Porcilis ColiClos或Porcilis AR-T DF未使得局部反应恶化。

在下表2-10中显示了血清学检测的结果。因为每组由8只猪组成，所以表1至表5(第1组和第3-5组为比较实施例)中给出的抗体效价是8个值的平均值。

表2 rIde_Ssuis抗体效价

表3 E.coli F4ab(＝K88ab)抗体效价

表4 E.coli F4ac(＝K88ac)抗体效价

表5 E.coli F5(＝K99)抗体效价

表6 E.coli F6(＝987P)抗体效价

表7 E.coli LT抗体效价

表8 C.perfringensβ毒素抗体效价

表9 P.multocida 1型毒素抗体效价

表10 B.bronchiseptica凝集抗体效价

结论

从表2-10中的结果可以看出，添加rIde_S.suis对Porcilis ColiClos中抗原的血清学应答没有负面影响。添加rIde_S.suis对Porcilis AR-T中博德特氏菌抗原的血清学应答没有负面影响，但确实对P.multocida的效价具有显著负面影响。

特别是在疫苗接种后28天的第一个时间点，与阳性对照(仅rIde_S.suis)相比，与Porcilis ColiClos的组合疫苗对rIde_S.suis抗原的应答几乎处于相同水平，但是与Porcilis ART-DF的组合疫苗则要低得多(表2)。因此，与Porcilis ART抗原相比，PorcilisColiClos抗原对针对rIde_S.suis的应答具有更低的负面影响。此外，在疫苗接种后42天的第二个时间点，与Porcilis AR-T DF相比，rIdeS.suis和Porcilis AR-T DF的组合针对P.multocida的应答显著更低(表9)。因此，在组合疫苗中存在rIde_S.suis对针对P.multocida的应答具有显著的负面影响。

这些发现表明，将rIde_S.suis抗原与在Porcilis AR-T DF中包含的P.multocida和B.bronchisepta抗原以及类毒素组合是不可行的，而将rIde_S.suis与在Porcilis ColiClos中包含的E.coli和梭状芽孢杆菌属抗原以及类毒素组合产生了优异的结果，使得这种组合特别适于提供组合疫苗。从本质上将，对于包含更少抗原的组合疫苗可以得出相同的结论，例如仅大肠杆菌的纤毛抗原，其是对E.coli提供足够保护的必需抗原。

从这些结果中由此能够得出结论，rIde_S.suis与E.coli和梭状芽孢杆菌属抗原以及类毒素的组合适用于组合疫苗，以提供针对由S.suis、E.coli和梭状芽孢杆菌属引起的致病性感染的保护。因此，令人吃惊的是，在本发明中使得提供一种疫苗成为了可能，所述疫苗针对包括由S.suis、E.coli和梭状芽孢杆菌属引起的致病性感染在内的疾病的组合提供了保护，并且其适于母猪接种。另外，考虑到有事实表明可以通过摄入初乳而充分保护后代免受猪链球菌感染(对于其他抗原，这种作用是本领域所公知的)，因此认为在已接种疫苗的雌性动物中提供高效价的组合疫苗能够通过初乳摄入对所有三种病原体提供充分的保护。

Claims

1.一种疫苗，其包含以下组分(a)、(b)和(c)：

(a)免疫学有效量的猪链球菌IgM蛋白酶抗原，

(b)免疫学有效量的大肠杆菌纤毛抗原，和

(c)免疫学有效量的梭状芽孢杆菌属(Clostridium)类毒素。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：组分(b)包含一种或多种选自以下的大肠杆菌纤毛抗原：F4、F5、F6、F18和F41。

3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于：组分(b)至少包含所述大肠杆菌纤毛抗原F4、F5和F6。

4.根据前述任一项权利要求所述的疫苗，其特征在于：组分(b)还包含大肠杆菌类毒素。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述大肠杆菌类毒素是大肠杆菌LT类毒素。

6.根据前述任一项权利要求所述的疫苗，其特征在于：组分(c)包含产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)C型类毒素。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于：组分(c)还包含产气荚膜梭状芽孢杆菌B型类毒素。

8.根据前述任一项权利要求所述的疫苗，其特征在于：组分(b)包含所述大肠杆菌纤毛抗原F4、F5和F6和组分(c)包含所述产气荚膜梭状芽孢杆菌C型类毒素。

9.根据前述任一项权利要求所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗包含佐剂。

10.根据前述任一项权利要求所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗适合肌肉注射。

11.根据前述任一项权利要求所述的疫苗，其用于保护猪对抗猪链球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌属的方法中。

12.疫苗，其用于根据权利要求11用于保护猪免受猪链球菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌属致病性感染的方法中，其特征在于：将所述疫苗施用至雌猪，以通过摄入已接种疫苗的雌猪的初乳来保护仔猪免受猪链球菌的致病性感染。

13.一种试剂盒，其包括多个单独的疫苗容器，其中一个容器包含免疫学有效量的猪链球菌IgM蛋白酶抗原，和一个或多个另外的容器组合包含免疫学有效量的大肠杆菌纤毛抗原，以及免疫学有效量的梭状芽孢杆菌属类毒素。

14.一种包含免疫学有效量的猪链球菌IgM蛋白酶抗原的疫苗，其用于保护动物免受猪链球菌感染、大肠杆菌感染和梭状芽孢杆菌属感染的方法中，其中在施用所述疫苗之前，将所述IgM蛋白酶抗原与免疫学有效量的大肠杆菌纤毛抗原和免疫学有效量的梭状芽孢杆菌属类毒素混合。