JP7295223B2 - 混合ワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、豚レンサ球菌(Streptococcus suis)、大腸菌(Escherichia coli)およびクロストリジウム(Clostridium)による病原性感染に対する、豚の保護のための混合ワクチンに関するものである。
本発明は、獣医ワクチン学の分野、すなわち、豚用の混合ワクチンに関するものである。特に、本発明は、豚レンサ球菌(Streptococcus suis(S. suis))、大腸菌(Escherichia coli(E. coli))およびクロストリジウム(Clostridium)由来の抗原を含む混合ワクチンに関する。
したがって、本発明の目的は、豚レンサ球菌を含む病原性感染から、豚、特に子豚を保護するための混合ワクチンを見出すことである。さらに、複数の病原性感染から子豚を保護するための混合ワクチンを見出すことが本発明の目的であり、ここで、これらの感染に対する子豚の保護は、雌豚のワクチン接種によって達成される。
驚くべきことに、本発明において、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる病原性感染に対する豚の防御のための混合ワクチンが提供できることが見出されている。さらに、驚くべきことに、ワクチン接種した雌豚の初乳の摂取を介して、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる病原性感染から子豚を防御するために、このワクチンを雌豚に投与することができることが見出だされた。
(a)免疫学的有効量の豚レンサ球菌IgMプロテアーゼ抗原、
(b)免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原、および
(c)免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイド。
ワクチンは、被験動物に投与するのに安全であり、病原性微生物に対してその動物に防御免疫を誘導すること、すなわち、微生物に対する防御を成功的に誘導することができる医薬組成物である。
本発明によるワクチンの成分(a)は、免疫学的有効量の豚レンサ球菌IgMプロテアーゼ抗原を含み、豚レンサ球菌による感染に対する防御を提供する。
例1:
本研究の目的は、異なる年齢、4、6、8および10週齢で、子豚の豚レンサ球菌攻撃に対する妊娠豚におけるIgMプロテアーゼサブユニットワクチンの有効性を検証することであった。
本研究のために、12頭の妊娠未経産雌豚を用いた。6頭の未経産雌豚に組換えrIdeSsuis IgMプロテアーゼ抗原(Seele et al: Vaccine 33:2207-2212; 5 May 2015, par. 2.2.)を、XSolveアジュバント(MSD Animal Health, Boxmeer, The Netherlands)中、1用量あたり120μg(BSAを標準としたBradford蛋白質アッセイにより確立)で、推定分娩前6週および2週に接種した。未経産雌豚6頭をワクチン未接種の対照群とした。出産後、雌豚の子豚を20頭ずつ4つの攻撃群に分け(ワクチン接種した雌豚からの子豚10頭と対照雌豚からの子豚10頭)、各群の同腹仔の均等な分布を得た。4群はそれぞれ4、6、8および10週齢時に、豚レンサ球菌血清型2の病原性培養物で攻撃感染(challenge)させた。攻撃接種後9~11日間、子豚のうつ病、自発運動障害および/または神経学的徴候などの豚レンサ球菌感染の臨床徴候を毎日観察し、0(徴候なし)から、重症例については3までの通常のスコアリングシステムを用いた。パラメータごとに同じスコアリングシステム(パラメータが見えない場合は0、重症例の場合は最高数)を用いた。ヒトのエンドポイントに達した動物は安楽死させた。ワクチン接種前後(雌豚)および攻撃直前(子豚)の定期的な時期に、血清を採取し、抗体測定を行った。攻撃感染(challenge)前後の定期的な時期に、攻撃株の再分離のために子豚からヘパリン血液を採取した。追加ワクチン接種から13週間後、雌豚4頭を剖検し、注射部位の局所反応またはワクチン残留物の有無を調べた。
ワクチン接種した雌豚4頭を、注射部位の剖検に供した。2頭では、追加投与(booster injection)部位に、組織の硬さが増した変色からなる小さな(直径2~3cm)局所反応が認められた。膿瘍やワクチン遺残は認められなかった。したがって、ワクチンの投与は安全であると結論づけることができた。.
以上の結果から、IgMプロテアーゼサブユニットワクチンの雌豚への接種は、子豚の豚レンサ球菌感染を抑制するための適切なワクチン接種戦略であると結論付けることができる。このワクチンは、自然感染した母動物から初乳を受け取った子豚において到着した防御と比較して、10週齢までの豚レンサ球菌攻撃に対する顕著に良好な防御を誘導した。このことは、離乳後2~3週間の完全な期間、すなわち子豚が4~7週齢の期間内、さらにはその期間を過ぎても防御可能であることを示している。
目的
本研究の目的は、組換え豚レンサ球菌のIgM抗原rIde Ssuisを含む様々な併用ワクチンの血清学的反応を、単一ワクチンと比較して検査することであった。特に、大腸菌/クロストリジウム混合ワクチン(線毛大腸菌抗原およびクロストリジウム・パーフリンジェンスC型トキソイドを含む)、ならびに、パスツレラ/ボルデテラ混合ワクチン(パスツレラ毒素および不活化ボルデテラ細胞を含む)との併用について評価した。具体的には、単一ワクチンと比較して、rIde Ssuisサブユニットワクチンと市販ワクチンPorcilis(登録商標)ColiClosまたはPorcilis(登録商標)AR-T DFとの関連混合使用後に、血清学的反応を試験した。
本研究では、健康な17週齢の豚48頭を用い、それぞれ8頭ずつ6群に割り付けた。第1群は、Diluvac(登録商標)フォルトアジュバント中のサブユニット抗原でワクチン接種し、第2群は、Porcilis(登録商標)ColiClos中のサブユニット抗原でワクチン接種し、第3群は、Porcilis(登録商標)AR-T DF中のサブユニット抗原でワクチン接種し、第4群および第5群はそれぞれ、Porcilis(登録商標)ColiClosまたはPorcilis(登録商標)AR-T DFのいずれかでワクチン接種した。ワクチン接種は、17週齢および21週齢時に頸部筋肉内に投与した。23週齢時に、全動物を剖検し、注射部位の局所反応を調べた。各ワクチン接種の直前および剖検時の安楽死中に血液サンプルを採取した。
濃縮rIde Ssuis 抗原
商品名:サブユニット抗原(rIde Ssuis)
医薬形態:抗原0.64mg/mlを含む懸濁液
プレゼンテーション:1.50ml充填(1.8mlクライオチューブ)
商品名:Diluvac(登録商標)Forte
医薬形態:筋肉内適用のエマルション
プレゼンテーション:20ml充填(20ml PETバイアル)
商品名:Porcilis(登録商標)ColiClos
医薬形態:筋肉内適用のエマルション
プレゼンテーション:20ml充填(20ml PETバイアル)
商品名:Porcilis(登録商標) AR-T DF
医薬形態:筋肉内適用のエマルション
プレゼンテーション:20ml充填(20ml PETバイアル)
Diluvac Forte、Porcilis ColiClosおよびPorcilis AR-T DF中のSsuisワクチンを、1バイアル(20ml)のDiluvac Forte、Porcilis ColiClosまたはPorcilis AR-T DFのいずれかに1.3mlの精製rIde Ssuis(濃度0.64mg/ml)を添加して使用直前に調製し、1回当たり40μg/ml=80μgを含むワクチンとした。ワクチンは2~8℃で輸送した。
動物、個体識別、飼育および飼育
番号付き耳標で識別した48頭の豚を用いた。初回ワクチン接種日の豚は17週齢であった。最初の治療の1週間前に豚を飼育した。実験期間中、標準的な手順に従って豚に給餌し、淡水道水を自由に摂取させた。馴化は1週間とした。実験には健常動物のみを対象とした。豚を5つの治療群に割り付け、手元に来たときにワクチン接種した。
豚には以下のようにワクチンを接種した。
実験期間中、豚の全身の健康状態および行動に異常がないか、標準的な手順に従って担当動物技術者または動物飼育者が毎日観察した。すべての異常(局所反応の有無を含む)を記録した。異常が認められた場合は、担当獣医師に相談した。血液サンプル(血清)は、各ワクチン接種の直前と追加ワクチン接種の2週間後に採取した。検体は常温で採血のために搬送した。凝固後、血清を実験的rIdeSsuis抗体ELISAで試験するまで凍結保存した。追加ワクチン接種の3週間後に、標準的な手順に従って、すべての動物を注射部位の剖検に供した。
rIde Ssuis の血清学
美容液サンプルを、実験的なrIdeSsuis ELISAで試験した。要するに、rIdeSsuis抗原をマイクロタイタープレート上に被覆した。コーティング後、プレートを洗浄し、血清の連続希釈を行った。インキュベーションおよびその後の洗浄の後、抗豚IgG結合体および基質としてTMBを用いて結合抗体を定量した。力価はlog2で表された。この試験では4.3未満は陰性と考えられる。計算のため、<4.3を3.3に置き換える。
美容液サンプルをK88ab、K88ac、K99、987PおよびLT抗体力価について検査した。要するに、それぞれの大腸菌抗原をマイクロタイタープレート上にコーティングした。コーティング後、プレートを洗浄し、血清の連続希釈を行った。培養後およびその後の洗浄後、抗豚IgG抱合体および基質としてTMBを用いることにより、結合した抗体を定量した。力価はlog2で表された。この試験では、力価5.6未満は陰性であると考えられる。計算のため、<5.6を4.6に置き換える。
クロストリジウム・パーフリンジェンスベータ毒素抗体価をELISA法で検査した。要するに、クロストリジウム・パーフリンジェンス(578株)ベータ毒素をマイクロタイタープレート上にコーティングした。プレートをコーティングし、続いてブロックした後、プレートを洗浄し、血清の2倍連続希釈を行った。インキュベーションおよびその後の洗浄の後、基質として抗反芻動物結合体およびTMBを用いることにより、結合した抗体を定量した。力価はlog2で表された。この試験では、力価4.6未満は陰性であると考えられる。計算のため、<4.6を3.6に置き換える。
パスツレラ・ムルトシダ(P. Multocida)毒素(PMT)中和抗体を以下のように測定した:血清の2倍連続希釈液をマイクロタイタープレートでパスツレラ・ムルトシダ 1型毒素とプレインキュベートした後、VERO単層上に接種した。細胞をインキュベートし、毒素の細胞変性効果(CPE)の阻害を測定した。力価は、CPEが観察されない相反最高希釈のlog2として表される。この試験では、力価3未満は陰性であると考えられる。計算のため、<3を2に置き換える。
Blobel試験にて、気管支敗血症菌(bronchiseptica)凝集抗体を測定した。要するに、血清の2倍段階希釈液を気管支敗血症菌の懸濁液とインキュベートし、凝集反応を読み取る。力価は、完全な凝集を与えた最高血清希釈液のlog2逆数で表した。この試験では、力価1未満は陰性であると考えられる。計算のため、<1を0に置き換える。
ワクチン成分のすべてについて血清学的結果を群間で比較する。すなわち、関連混合使用群をそれぞれの単一ワクチン群と比較する。選択したグループは、2面2標本t検定と統計プログラムMinitab 17を用いて比較した。ワクチン接種後に単一ワクチン群で明確な血清変換が認められた場合、本試験は有効であった。
rIdeSsuisの血清学
試験開始時、全頭がrIde Ssuis に対して血清陰性を示した(表2)。Porcilis ColiClosおよびPorcilis AR-T DFとの2つの関連使用群は、単一ワクチンと比較してそれぞれ3.3および2.1 log 2低かった。これらの差はそれぞれp=0.003、p=0.020と統計学的に有意であった。2つの対照群4および5は、試験期間中、血清陰性のままであった。
rIde S.suisの追加は、ブタ大腸菌の抗原に対する血清学的反応に負の影響を及ぼさなかった(表3-8)。関連混合使用群における987P反応の負の傾向が観察された(p=0.061)が、987P力価の差は非常に小さく(1log2のみ)、おそらく生物学的に関連性がないであろう。
試験開始時、豚はPMT毒素に対して血清陰性を示した(表)。rIdeSsuisがPMT毒素抗体産生に及ぼす明らかな統計的有意な負の影響が認められ(p=0.021)、これら2種のワクチン抗原を併用することは不可能であった。
ワクチン注射部位の剖検は、最大/ピーク反応が予測されるワクチン接種から2週間後に実施し、初回免疫(priming)(右側)および/または追加免疫(booster)(左側)ワクチン接種後に局所反応の存在を示した(図示せず)。Porcilis ColiClosまたはPorcilis AR-T DFへのrIde Ssuisの追加は、単一ワクチンの場合と比較して局所反応を悪化させなかった。
表2~10の結果からわかるように、rIde S.suisを加えても、ブタ大腸菌の抗原の血清学的反応に負の影響は認められなかった。rIde Ssuis の追加は、Porcilis ART-DFにおけるボルデテラ抗原に対する血清学的反応にも負の影響を及ぼさなかったが、パスツレラ・ムルトシダの力価には有意な負の影響を及ぼした。
Claims (12)
- 以下の成分(a)、(b)及び(c):
(a)免疫学的有効量の豚レンサ球菌(Streptococcus suis)IgMプロテアーゼ抗原、
(b)免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原、および
(c)免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイド
を含み、
前記成分(b)が、少なくとも線毛大腸菌抗原F4、F5およびF6を含むことを特徴とする、ワクチン。 - 前記成分(b)が、大腸菌トキソイドをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載のワクチン。
- 前記大腸菌トキソイドが、大腸菌LTトキソイドであることを特徴とする、請求項2に記載のワクチン。
- 前記成分(c)が、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)C型トキソイドを含むことを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記成分(c)が、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)B型トキソイドをさらに含むことを特徴とする、請求項4に記載のワクチン。
- 前記成分(b)が、大腸菌線毛抗原F4、F5、およびF6を含み、
前記成分(c)が、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)C型トキソイドを含むことを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項に記載のワクチン。 - アジュバントを含むことを特徴とする、請求項1~6のいずれか一項に記載のワクチン。
- 筋肉内注射に適応されることを特徴とする、請求項1~7のいずれか一項に記載のワクチン。
- 豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムから豚を保護する方法において使用するための、請求項1~8のいずれか一項に記載のワクチン。
- 豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる病原性感染から豚を保護するための方法において使用するための請求項9に記載のワクチンであって、
当該ワクチンを雌豚に投与して、ワクチン接種した当該雌豚の初乳の摂取を介して、豚レンサ球菌による病原性感染から子豚を保護することを特徴とするワクチン。 - 複数の別個のワクチン容器を含む部分のキットであって、
そのうちの1つが、免疫学的有効量の豚レンサ球菌IgMプロテアーゼ抗原を含み、
組み合わせた1以上の追加の容器が、免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原と免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイドとを含み、
前記大腸菌線毛抗原が、少なくとも線毛大腸菌抗原F4、F5およびF6を含むことを特徴とする、キット。 - 動物を豚レンサ球菌感染、大腸菌感染およびクロストリジウム感染から保護する方法において使用するためのワクチンであって、
免疫学的有効量の豚レンサ球菌IgMプロテアーゼ抗原を含み、
当該IgMプロテアーゼ抗原が、ワクチンの投与前に、免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原と免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイドと混合され、
前記大腸菌線毛抗原が、少なくとも線毛大腸菌抗原F4、F5およびF6を含むことを特徴とする、ワクチン。
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