RU2780233C2

RU2780233C2 - Способ профилактического лечения свиней

Info

Publication number: RU2780233C2
Application number: RU2019120045A
Authority: RU
Inventors: Эрвин ВАН ДЕН БОРН; Антониус Арнольдус Кристиан ЯКОБС; Мелани СНО
Original assignee: Интервет Интернэшнл Б.В.
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2022-09-21

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к вакцине, содержащей комбинацию не реплицирующихся иммуногенов Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans и живого аттенуированного вируса PRRS, и фармацевтически приемлемый носитель, для применения в способе профилактического лечения свиней от инфекции Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans и вируса PRRS. Изобретение позволяет защитить свиней против инфекции Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans и вируса PRRS. 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

Description

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ ОБЛАСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение, главным образом, относится к области здоровья свиней. Свиньи подвержены воздействию многих патогенных микроорганизмов. Контроль инфекций обычно проводят посредством контроля за хлевом и кормом, лечения фармацевтическими препаратами, такими как противовирусные лекарственные средства и антибиотики, или профилактического лечения с использованием вакцин. В частности, изобретение относится к вакцинам против вируса PRRS (репродуктивно-респираторный синдром свиней), Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней и Leptospira interrogans (в широком смысле), и к способу защиты животного от таких инфекций с использованием таких вакцин.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Первое сообщение о вирусе PRRS в Северной Америке и Центральной Европе датируется 1987 годом. Вирус PRRS представляет собой мелкий оболочечный РНК-вирус. Он содержит одноцепочечный РНК-геном с положительной цепью, имеющий размер приблизительно 15 тысяч пар оснований. Геном содержит девять открытых рамок считывания. Вирус является представителем рода Arterivirus, семейства Arteriviridae, отряда Nidovirales. Двумя прототипными штаммами PRRSV являются североамериканский штамм VR-2332 и европейский штамм, вирус Lelystad (LV). Европейский и североамериканский штаммы PRRSV вызывают сходные клинические симптомы. В ранних 2000-х годах в Китае появился высокопатогенный штамм североамериканского генотипа. Этот штамм, HP-PRRSV, является более вирулентным, чем все другие штаммы, и вызывает значительные потери в странах Азии. Клинические признаки включают неспособность к размножению у свиноматок, такую как выкидыши и рождение мертворожденных или мумифицированных плодов, и цианоз уха и вульвы. У новорожденных свиней заболевание вызывает расстройство дыхания с увеличением предрасположенности к респираторным инфекциям, таким как болезнь Глассера. Что касается вируса PRRS, хотя были описаны и являются коммерчески доступными инактивированные вирусные вакцины, основным иммунологическим инструментом его контроля является модифицированный живой вирус (MLV), содержащий либо европейский тип (тип I), либо североамериканский тип (тип II) в живой аттенуированной форме. В данной области несколько вакцин являются коммерчески доступными. Porcilis® PRRS (доступная от MSD Animal Health, Boxmeer, Нидерланды) представляет собой вакцину, содержащую живой аттенуированный вирус PRRS типа I, она зарегистрирована для снижения инфекции (виремии), вызываемой инфицированием вирусом PRRS. Ingelvac PRRS® MLV (доступная от Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Германия) представляет собой вакцину, которая способствует уменьшению заболевания, вызываемого вирусом PRRS. Fostera® PRRS (доступная от Zoetis, Florham Park, New Jersey, США) также представляет собой вакцину MLV и зарегистрирована для защиты как от респираторных, так и репродуктивных форм заболевания, вызываемого вирусом PRRS. Другие вакцины против PRRS описаны, например, в WO2006/074986, US 8728487 и WO2014/048955.

Инфекционное заболевание, вызываемое Erysipelothrix rhusiopathiae (Ery), у свиней известно как рожа свиней и является одним из наиболее старых известных заболеваний, которые поражают растущих и взрослых свиней. Вплоть до 50% свиней в областях интенсивного выращивания свиней считаются колонизированными Ery. Организм обычно находится в ткани миндалевидных желез. Эти типичные здоровые носители могут выделять организм с их фекалиями или ороназальными секретами и являются значимым источником инфекции для других свиней. Вспышки заболевания могут быть острыми или хроническими, а также могут встречаться клинически бессимптомные инфекции. Острые вспышки характеризуются внезапной и неожиданной смертью, эпизодами лихорадки, болезненностью суставов и очагами повреждения на коже, которые отличаются от генерализованного цианоза при часто описываемых ромбовидных очагах повреждения кожи (ромбовидная крапивница). Хроническая рожа в основном следует после острых вспышек и характеризуется увеличением суставов и хромотой. Второй формой хронической рожи является вегетативный вальвулярный эндокардит. У свиней с поражениями клапанов может выявляться мало клинических признаков; однако при физической нагрузке они могут демонстрировать признаки затрудненности дыхания, вялости и цианоза, и могут внезапно умереть от инфекции. У беременных свиней с острой инфекцией может произойти выкидыш, возможно вследствие лихорадки. Вакцинация является в высокой степени эффективной в отношении контроля вспышек заболевания. Известны инъекционные бактерины и другие не реплицирующиеся иммуногены, и они обеспечивают длительный иммунитет. Коммерчески доступные вакцины, содержащие не реплицирующиеся иммуногены Erysipelothrix rhusiopathiae, представляют собой Porcilis® ERY+Parvo (MSD Animal Health), FarrowSure® Gold (Zoetis), ErySeng® Parvo (Hipra) и PARVORUVAX® (Merial). Оптимальное время вакцинации может варьироваться от фермы к ферме. Предрасположенные свиньи могут быть вакцинированы до отлучения от матери, во время отлучения от матери или через несколько недель после отлучения от матери. Самцов и самок свиней, отобранных для включения в пленное стадо, предпочтительно следует вакцинировать вспомогательной иммунизацией через от 3 до 5 недель. После этого, племенное поголовье следует вакцинировать два раза в год. Как правило, существует хорошая перекрестная защита против основных штаммов Erysipelothrix rhusiopathiae, инфицирующих свиней.

Парвовирус свиней широко распространен у свиней по всему миру. Практически все самки естественным образом инфицируются до их второй беременности, и иммунитет является пожизненным. Следовательно, это заболевание является типичным для свиней при первых родах. Молодые свиньи, которые являются иммунологически наивными и имеют высокие титры пассивных антител, имеют наиболее высокий риск репродуктивных нарушений, вызываемых вирусом. Инфицирование до 30 суток беременности приводит к ранней потере эмбрионов. Инфицирование плода на сроке беременности от 30 до 70 суток может приводить к смерти плода и мумификации. Не все плоды инфицируются одновременно и является типичной смерть на различных стадиях беременности. Некоторые плоды выживают и рождаются живыми, но несущими персистентную инфекцию. У большинства плодов, инфицированных на сроке беременности после 70 суток, индуцируется иммунный ответ, вирус выводится, и они являются здоровыми при рождении. Помет с мертвыми плодами различных размеров, включая мумифицированные плоды, а также мертворожденными и здоровыми свиньями, рожденными молодыми свиньями при первых родах, являются признаком парвовируса свиней. Диагноз ставится по тестированию с использованием флуоресцентных антител, посредством выделения вируса с использованием легкого из мумифицированных плодов, или посредством демонстрации преколостральных антител у мертворожденных свиней. Дикие свиньи выделяют вирус различными путями, включая сперму, в течение пары недель после острой инфекции, и могут распространять вирус в стадо. Эффективные вакцины, содержащие не реплицирующиеся иммуногены, являются широко доступными, например, такие как Porcilis® ERY+Parvo (MSD Animal Health), FarrowSure® Gold (Zoetis) и PARVORUVAX® (Merial).

Leptospira interrogans (в широком смысле, т.е. все патогенные бактерии-лептоспиры), особенно серогруппа Pomona, являются основной причиной неспособности к размножению у свиней (бесплодие, выкидыши, мертворождение и рождение слабых поросят). Хотя острый лепотспироз возникает у взрослых свиней, в большинстве случаев он является бессимптомным. Свиньи, инфицированные серогруппами Pomona и Australis, серовар Bratislava, могут стать хроническими носителями инфекции в почках. Выкидыш происходит через 1-4 недели после инфицирования и плоды подвергаются аутолизу. Также наблюдается мумификация, мацерация, мертворождение и слабые свиньи. Диагноз основан на демонстрации лептоспир в тканях плодов или в содержимом желудка. Однако подвергнутые аутолизу в значительной степени плоды могут приводить к плохим результатам исследования флуоресцентных антител и иммуногистохимии. Тестирование методом ПЦР имеет лучшую чувствительность и специфичность. Вакцинация (поливалентным) бактерином или другим не реплицирующимя иммуногеном, обычно каждые 6-12 месяцев, помогает смягчать или даже предупреждать лептоспироз. Результаты исследований в полевых условиях указывают на то, что инфекция Leptospira не может быть достоверно устранена посредством антибиотиков. Эффективные вакцины можно получать из коммерческих источников, например, FarrowSure® Gold и Lepto-Eryvac® (Zoetis), и Porcilis® Ery+Parvo+Lepto (MSD Animal Health).

ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует постоянная потребность в удобных, безопасных и эффективных способах контроля здоровья свиней. В частности, существует необходимость в удобной, безопасной и эффективной вакцине, которую можно использовать для профилактического лечения свиней от инфекции Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans и вируса PRRS. Инфекции этими патогенами, в частности, могут снижать репродуктивные возможности самок свиней.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для решения задачи изобретения разработана новая вакцина для защиты свиней от инфекций различными вызывающими заболевания микроорганизмами, причем вакцина содержит комбинацию не реплицирующихся иммуногенов Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans и живого аттенуированного вируса PRRS, и фармацевтически приемлемый носитель, где вакцину вводят в однократной дозе для лечения инфекции вирусом PRRS. Эта вакцина является в высокой степени пригодной для применения у самок свиней с целью повышения их репродуктивных возможностей.

Согласно изобретению, вакцину вводят в однократной дозе для лечения инфекции вирусом PRRS. Было обнаружено преимущество, что свиньи могут быть успешно вакцинированы комбинацией вакциной против инфекции вирусом PRRS даже после однократного введения вакцины. Это не исключает проведение последующей вакцинации, например, через 6-12 месяцев после первой вакцинации, для обновления уровня защиты. Эта последующая вакцинация отличается от буст-вакцинации по схеме прайм-буст вакцинация, где, как полагают, защита достигается только после вспомогательной вакцинации. В схеме прайм-буст иммунизация обычно проводят две вакцинации с интервалом 2-4 недели.

Хотя вакцины для лечения инфекций Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans и вирусом PRRS известны и являются коммерчески доступными, существует постоянная потребность в новых способах обеспечения хорошей защиты безопасным и удобным образом. Комбинированная вакцина против всех из этих патогенов является коммерчески доступной в США (ReproCyc® PRRS-PLE от Boehringer Ingelheim). Однако эта вакцина вводится двукратно для всех из антигенов, чтобы достигнуть достаточной защиты (вакцинация должна быть повторена в пределах 3-4 недель). Более того, даже режим с двукратным введением, как описано в данной области, является успешным, только когда животные являются положительными по вирусу PRRS, т.е. когда очевидно, что их иммунная система уже (предварительно-) первично иммунизирована вирусом. Таким образом, известная схема введения в действительности является схемой трехкратной иммунизации. Действительно, вирус PRRS является вирусом, ускользающим от иммунитета, адекватной защиты против которого достигнуть нелегко. Неожиданно, заявитель обнаружил, что однократная вакцинация является достаточной при использовании живого аттенуированного вируса PRRS в комбинации с антигенами Ery, paro и Lepto, даже у негативных в отношении вируса PRRS животных. Это является непонятным, но может быть результатом положительной интерференции антигенов. Более того, всегда неясно, могут ли предусматриваемые или предполагаемые антигены приводить к безопасной и эффективной комбинированной вакцине при любом новом режиме введения, в основном вследствие непредсказуемых эффектов интерференции антигенов. В действительности, всегда существует некоторая степень неясности в отношении безопасности и эффективности какой-либо предусматриваемой комбинированной вакцины в каком-либо конкретном режиме введения.

Комитет по ветеринарным медицинским продуктам Европейского агентства по аттестации лекарственных препаратов (EMEA) в его публикации "Note for guidance: requirements for combined veterinary products" (EMEA, 2000, CVMP/IWP/52/97-FINAL), утверждает (стр.2/6), что "разработка комбинированных вакцин является непростой. Каждая комбинация должна быть разработана и исследована индивидуально с точки зрения качества, безопасности и эффективности". Кроме того, комитет указывает на то, что поиск хорошей комбинированной вакцины обычно включает совместимость между индивидуальными компонентами в комбинированной вакцине, включая, например, консерванты, эксципиенты и стабилизаторы, инактивирующие средства и адъюванты. На стр.3, верхний абзац, утверждается, что "в комбинированных вакцинах присутствие более одного компонента часто может вызывать взаимодействие, что приводит либо к снижению, либо к увеличению ответа на индивидуальные компоненты по сравнению с тем, когда конкретный компонент(ы) вводят отдельно… Природа таких взаимодействий часто является иммунологической, однако также они могут вызываться другими факторами с менее прямыми эффектами на иммунную систему".

Министерство здравоохранения и социальных служб США, Управление по контролю за продуктами и лекарственными средствами, Центр биологических оценок и исследований, опубликовали в апреле 1997 года "Руководство для отрасли для оценки комбинированных вакцин для заболеваний, предупреждаемых вакцинацией: Производство, тестирование и клинические испытания", и в этом руководстве утверждается (стр.3, под заголовком "Совместимость компонентов"), что "опыт показал, что комбинирование одновалентных вакцин может приводить к новой комбинации, которая является менее безопасной или эффективной, чем желательно. Иногда компоненты инактивированных вакцин могут действовать неблагоприятным образом на один или несколько активных компонентов", что указывает на то, что, в частности, инактивированная вакцина может негативно влиять на эффективность живой вакцины, например, как происходит при комбинировании живой вакцины против коклюша и инактивированной вакцины против вируса полиомиелита, результатом которого является снижение эффективности против коклюша. Указывается, что какие-либо дополнительные компоненты в вакцине могут ухудшать безопасность и эффективность конечного продукта по сравнению с индивидуальными вакцинами.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) опубликовала мультимедийный курс под названием "Vaccine Safety Basics", МОДУЛЬ 2 которого предусматривает комбинированные вакцины. Этот модуль начинается со следующего: "Лицензированные комбинированные вакцины подвергаются тщательному тестированию перед одобрением органами государственной власти, чтобы убедиться, что продукты являются безопасными, эффективными и имеют приемлемое качество". Также в нем утверждается, что "для всех комбинаций производители, таким образом, должны оценивать эффективность каждого антигенного компонента, эффективность компонентов вакцины в комбинации в отношении индукции иммунитета, риск возможного восстановления токсичности и реакцию с другими компонентами вакцины".

В общем, любая комбинация конкретных антигенов не является простой и требует экспериментирования для определения безопасности и эффективности.

Настоящее изобретение, помимо самой вакцины, также относится к комбинированной вакцине для применения в способе профилактического лечения свиней от инфицирования Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовирусом свиней, Leptospira interrogans и вирусом PRRS, к способу получения такой вакцины и к способу профилактического лечения свиней от инфицирования Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовирусом свиней, Leptospira interrogans и вирусом PRRS, включающему введение указанной вакцины животному, в частности, в однократной дозе в отношении вируса PRRS, парентерально, в частности, внутримышечно.

Также изобретение относится к комбинации первой вакцины, содержащей не реплицирующиеся иммуногены Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней и Leptospira interrogans, и фармацевтически приемлемый носитель, и второй вакцины, содержащей лиофилизированный живой аттенуированный вирус PRRS, и инструкции, в которой указано, что вторую вакцину можно смешивать с первой вакциной с получением вакцины по изобретению. На практике первая и вторая вакцины могут продаваться в качестве отдельных независимых вакцин, но имеющих указание на ярлыке, вкладыше в упаковку или иным образом, что две вакцины могут быть смешаны с получением одной множественной комбинированной вакцины, где вакцину вводят в однократной дозе в отношении лечения инфекции вирусом PRRS.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Вакцина представляет собой фармацевтическую композицию, которая является безопасной для введения животному и способна индуцировать защитный иммунитет у этого животного против патогенного микроорганизма ("патогена"), т.е. индуцировать успешное профилактическое лечение против инфекции патогеном, как определено в настоящем описании ниже. Вакцину можно использовать совместно с адъювантом, т.е. веществом или композицией, которые способны повышать иммунный ответ, индуцируемый вакциной.

Не реплицирующийся иммуноген патогена представляет собой любое вещество или соединение, соответствующее патогену, отличное от живого реплицирующегося патогена в целом (либо в форме дикого типа, либо в аттенуированной форме), против которого индуцируется иммунологический ответ, так что соответствующий вирулентный патоген или один или несколько его факторов вирулентности распознаются иммунной системой хозяина в результате этого иммунного ответа и в конечном итоге по меньшей мере частично нейтрализуются. Типичными примерами не реплицирующихся иммуногенов являются инактивированные (убитые) целые патогены и субъединицы этих патогенов, такие как капсидные белки и экспрессируемые на поверхности белки, например, рекомбинантно экспрессируемые белки. Не реплицирующиеся иммуногены (например, убитый целый патоген, клеточный лизат, субъединица и т.д.) индуцируют иммунный ответ, который в основном является гуморальным (т.е. индукция антител).

Профилактическое лечение инфекции патогеном представляет собой способствование предупреждению или смягчению инфекции этим патогеном или нарушения вследствие этой инфекции, возникающих в результате заражения патогенов после лечения, в частности, для снижения его нагрузки у хозяина после такого заражения и необязательно для способствования предупреждению или смягчению одного или нескольких клинических проявлений в результате инфицирования патогеном после лечения.

Живой аттенуированный патоген является жизнеспособной компетентной в отношении репликации формой патогена, имеющей сниженную вирулентность. Процесс аттенуации включает использование инфекционного патогена и изменение его таким образом, чтобы он становился безвредным или менее вирулентным, как правило, либо посредством многократного пассирования патогена через клеточные системы, либо посредством генной модификации патогена.

Введение однократной дозы вакцины для применения в профилактическом лечении означает, что для обеспечения защитного иммунитета вакцинация не требует вспомогательной иммунизации посредством второго введения вакцины. В режиме с двукратным введением первая (примирующая) вакцинация обычно усиливается в течение 6 недель после первого введения, обычно в течение 3 или даже 2 недель после первого введения, и только после второго (усиливающего) введения может быть достигнут защитный иммунитет, т.е. успешное профилактическое лечение, как определено в настоящем описании выше.

Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой биосовместимую среду, а именно, среду, которая после введения не индуцирует значительные неблагоприятные реакции у данного животного, способного презентировать антиген иммунной системе животного-хозяина после введения вакцины. Такой носитель может представлять собой содержащую жидкость воду и/или любой другой биологически совместимый растворитель, возможно образующую эмульсию с одной или несколькими гидрофобными жидкостями, такими как масло. Однако носитель также может представлять собой твердое вещество, такое как обычно исопльзуемое вещество для получения лиофилизированных вакцин (ни основе сахаров и/или белков).

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления не реплицирующиеся иммуногены Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans представляют собой инактивированные патогены Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней и Leptospira interrogans, соответственно. Например, посредством простого уничтожения патогенов обеспечивается простой путь к наличию (всех) иммуногенов, доступных в не реплицирующейся форме. Хотя любая субъединичная вакцина также может быть пригодной для применения в вакцине по настоящему изобретению, путем наличия доступных инактивированных патогенов соответствующие иммуногены присутствуют сами по себе и таким образом, как (аналогично тому, как) они присутствуют в живом встречающемся в природе патогене.

В следующем варианте осуществления патоген Leptospira interrogans содержит бактерии серогруппы Pomona, которые являются наиболее важным лептоспирозным патогеном свиней. Необязательно также присутствуют бактерии по меньшей мере одной из серогрупп Tarassovi, Australis, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae и Canicola, где бактерии серогруппы Australis, в частности, представляют собой бактерии серовара Bratislava.

Как указано в настоящем описании выше, также в следующем варианте осуществления вакцин для применения в способе профилактического лечения свиней против инфицирования Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовирусом свиней, Leptospira interrogans и вирусом PRRS, не реплицирующиеся иммуногены Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans представляют собой инактивированные (например, убитые) патогены. В частности, патоген Leptospira interrogans включает бактерии серогруппы Pomona, и необязательно бактерии по меньшей мере одной из серогрупп Tarassovi, Australis, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae и Canicola, где бактерии серогруппы Australis, в частности, представляют собой бактерии серовара Bratislava.

В другом варианте осуществления вакцину вводят парентерально, т.е. вводят путем, отличным от введения через рот и пищеварительный тракт. Вакцину можно вводить, например, внутримышечно.

Как утверждается в настоящем описании выше, изобретение также относится к способу составления комбинированной вакцины, где способ включает смешение первой композиции, содержащей живой аттенуированный вирус PRRS, со второй композицией, содержащей иммуногены Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней и Leptospira interrogans, в фармацевтически приемлемом носителе. В следующем варианте осуществления первая композиция содержит лиофилизированный вирус PRRS, например, в стабилизаторе, таком как стабилизаторы, известный из Porcilis® PRRS. Смешение предпочтительно происходит в течение не более 24 часов до введения вакцины животными и не более чем за 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или ½ часа до намеченного введения.

Далее изобретение объяснено более подробно с использованием следующих примеров.

ПРИМЕРЫ

Эксперимент 1: комбинация неживых иммуногенов Ery, parvo и lepto

В первом эксперименте оценивали безопасность и эффективность комбинации не реплицирующихся иммуногенов Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans. Для такой комбинации неживых антигенов важным аспектом, в частности, является безопасность. Это является следствием относительно высокого количества антигенов, которые обычно используются в такой (неживой) вакцине, с риском эндотоксинового шока, в частности, когда иммуногены включают инактивированные патогены грамотрицательных бактерий (клеточные стенки которых содержат эндотоксические липополисахариды).

Исследование было запланировано как контролируемое историческими данными исследование в полевых условиях. Оно было проведено на ферме с предшествующим увеличением уровня выкидышей, ассоциированным с инфекцией лептоспирами. Высокие титры антител против серогруппы Pomona были обнаружены у ряда животных, что указывало на недавнюю инфекцию посредством Leptospira серогруппы Pomona. Результаты исследования на инфекцию вирусом PRRS на ферме были отрицательными.

В начале исследования всех племенных свиноматок и ремонтных свиней на ферме вакцинировали в мышцу шеи два раза с интервалом 4 недели, причем вакцина содержала не реплицирующиеся иммуногены Erysipelothrix rhusiopathiae (инактивированные формалином бактерии штамма M2), парвовируса свиней (BPL-инактивированный вирус штамма 014) и Leptospira interrogans (BPL-инактивированная бактерия серогрупп Pomona, Tarassovi, Australis (серовар Bratislava), Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae и Canicola) в водном адъюванте на основе dl-α-токоферол-ацетата. Эта вакцинная композиция обозначается как "Ery/parvo/lepto". Животных ревакцинировали Ery/parvo/lepto на второй недели каждой последующей лактации. Новых ремонтных свиней вакцинировали с использованием той же схемы.

В исследовании проводили мониторинг репродуктивной способности свиней. Результаты в виде помета поросят и соответствующих данных о размножении собирали для определения того, имела ли вакцинация какой-либо эффект на частоту выкидышей. Результаты, полученные в ходе периода исследования, сравнивали с историческими данными. Поскольку парвовирус и Ery также оказывали значительное отрицательное воздействие на размножение (парвовирус может убивать плоды и Ery может вызывать выкидыш), значительное улучшение в этом отношении является верным указанием на то, что вакцина также является эффективной против этих патогенов.

Не сообщалось ни о каких неблагоприятных явлениях в ходе исследования, что указывает на то, что вакцинация была безопасной. Что касается эффективности, проводили сравнение процента выкидышей между периодом исследования и периодом до исследования, учитывая эффект сезона. После вакцинации наблюдалось быстрое улучшение в отношении выкидышей от 12,6% до вакцинации до 0,5% после начала вакцинации. Это соответствуют снижению уровня выкидышей на 96%. Общее количество выкидышей на ферме снижалось от 55 до 6. Тенденция к низкому количеству выкидышей на ферме была стабильной после начала программы вакцинации и на следующий сезон. Частота выкидышей оставалась низкой, а именно, 0,6%. Безопасность и эффективность вакцин были подтверждены в другом исследовании, описанном в Porcine Health management в ноябре 2015 года (Porcine Health Management 2015 1:16/DOI: 10.1186/s40813-015-0011-0). Это исследование было сфокусировано на виремии, почечной инфекции и выделении с мочой.

Таким образом, может быть сделано заключение, что вакцина, содержащая комбинацию не реплицирующихся иммуногенов Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней и Leptospira interrogans, является безопасной и эффективной против всех этих патогенов. Не ожидается негативного эффекта добавления живого вируса PRRS к этой вакцине, который (по свой природе) содержит относительно низкое количество антигена по сравнению с инактивированными патогенами ery/parvo/lepto, на эффективность иммуногенов ery/parvo/lepto. Однако безопасность может быть снижена и эффект инактивированные иммуногены живого вируса PRRS не известен и должен быть оценен. Это проводили в другом эксперименте, результаты которого приведены в настоящем описании ниже.

Эксперимент 2: Эффект комбинированной вакцины против EPL на живую вакцину против PRRS

Задачей этого исследования была оценка эффективности у поросят SPF в возрасте шести недель вакцины из вакцины 1 типа на основе живого аттенуированного вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) (Porcilis PRRS), разбавленной в вакцине, содержащей комбинацию не реплицирующихся иммуногенов Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней и Leptospira interrogans.

Исследование проводили на сорока негативных в отношении антител против PRRSV поросятах, случайным образом распределенных на 2 группы. Группы 1 и 2 вакцинировали один раз внутримышечно (в/м) посредством 2 мл Porcilis PRRS, разбавленного до 4,5log₁₀ TCID₅₀ на дозу (эта доза соответствует дозе, немного превышающую минимальную дозу 4,0log₁₀ TCID₅₀ для Porcilis® PRRS). В группе 1 вводили вакцину против PRRS, разбавленную в экспериментальной комбинированной вакцине против Ery/Parvo/Lepto, как указано в настоящем описании выше в эксперименте 1. Вакцины смешивали при температуре 25°C и оставляли по меньшей мере на 1 час до фактического введения животным. В группе 2 вводили живой аттенуированный вирус, разбавленный в Diluvac Forte, и, таким образом, фактически вводили обычную вакцину Porcilis® PRRS в дозе, несколько превышающей ее минимальную дозу. Эта группа фактически служила в качестве положительного контроля.

Определяли следующие параметры: местные и системные реакции, виремию PRRSV и серологию PRRSV. Таким образом, можно было установить, способен ли вакцинный штамм нормально реплицироваться в животном-хозяине, что необходимо для индукции эффективного иммунного ответа. Начиная с дня вакцинации до конца эксперимента (28 суток после вакцинации, dpv), всех поросят наблюдали каждые сутки в отношении клинических признаков. Взятие образцов крови проводили непосредственно перед вакцинацией и через 2 и 4 недели после вакцинации. Образцы сыворотки, полученные в моменты времени после вакцинации, использовали для определения PRRSV-специфической виремии и серологических ответов.

Ветеринарное обследование показало, что все поросята были здоровыми в день вакцинации. Не было обнаружено неблагоприятных явлений, которые могли быть связаны с вакцинацией. Один поросенок в группе 2 был найден мертвым после взятия образца крови вечером на 14 сутки после вакцинации. Провели некропсию и причиной смерти, наиболее вероятно, была гематома шеи вследствие взятия образца крови.

Результаты серологического исследования в отношении вируса PRRS указаны в таблице 1. Результаты виремии в отношении вируса PRRS указаны в таблице 2.

Таблица 1. Результаты серологического исследования в отношении PRRSV: процент положительных животных, 0, 14 и 28 dpv

Группа	0 dpv	14 dpv	28 dpv
1	0	80	100
2 (положительный контроль)	10	100	100

Таблица 2. Результаты виремии в отношении PRRSV: процент положительных животных, 14 и 28 dpv

Группа	14 dpv	28 dpv
1	70	100
2 (положительный контроль)	100	100

Оказалось, что результаты серологических исследований, а также результаты исследования виремии для вируса PPRS в случае комбинированной вакцины были сравнимыми с результатами для положительного контроля (Porcilis® PRRS в качестве обособленной вакцинации), в обоих случаях при минимальной защитной дозе, а также при более высокой дозе. Таким образом, эти данные указывают на то, что вирус PRRS способен выдерживать инкубацию в вакцине, содержащей комбинацию не реплицирующихся иммуногенов Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней и Leptospira interrogans. Исходя из этих данных, понятно, что (двухсторонняя) комбинированная вакцина, содержащая не реплицирующиеся иммуногены Erysipelothrix rhusiopathiae и живой аттенуированный вирус PRRS, также является безопасной и эффективной. К этой вакцине можно добавлять не реплицирующиеся иммуногены парвовируса свиней для обеспечения также защиты против инфицирования парвовирусом свиней. Представленные результаты подразумевают, что такая тройная вакцина также является безопасной и эффективной. Все это обеспечивает ряд различных вакцин, которые могут способствовать предоставлению следующих схем вакцинации для свиней, в частности предназначенных для повышения репродуктивной способности у этих животных: базовая вакцинация, например прайм-буст вакцинация, животного до его первой беременности (как правило, в возрасте от 20 до 30 недель) комбинированной вакциной, содержащей не реплицирующиеся иммуногены Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовирус свиней и Leptospira interrogans, где, если используют схему прайм-буст, либо первичную, либо вспомогательную вакцину комбинируют с аттенуированным вирусом PRRS в рамках настоящего изобретения (вакцины с компонентом PRRS в любом случае используются в качестве однократной вакцины). Прайм-буст вакцинация может быть проведена, например, в возрасте от 20 до 24 недель. Затем эту базовую вакцинацию можно повторять каждый год против инфекции ery/parvo/lepto/prrs посредством однократной дозы комбинированной вакцины в соответствии с настоящим изобретением, или комбинированной вакцины, в которой, в зависимости от обстоятельств один или несколько антигенов отсутствуют (например, отсутствуют антигены лептоспир, если предполагается, что ферма не будет инфицирована лептоспирами). Что касается PRRS, в зависимости от давления инфекции PRRS на ферму, вакцинацию при необходимости можно повторять каждые 6 месяцев (или даже каждые 3 месяца). Такая ревакцинация с более коротким интервалом может быть проведена посредством комбинированной вакцины, содержащей, помимо живого аттенуированного вируса PRRS, не реплицирующиеся иммуногены Erysipelothrix rhusiopathiae. Для лептоспир и парвовируса, такая кратковременная ревакцинация, как правило, не считается необходимой, поскольку у свиней иммунитет после вакцин против лептоспир и парвовируса может длиться приблизительно один год.

В заключение, можно сказать, что безопасность, а также эффективность новой комбинированной вакцины, являются достаточными. Для подтверждения эффективности новой комбинированной вакцины в отношении каждого из соответствующих патогенов можно использовать дополнительные данные серологических исследований (в частности, для парвовируса свиней и лептоспир) и/или данные контрольного заражения (в частности, для вируса PRRS и Erysipelothrix rhusiopathiae).

Эксперимент 3: Результаты серологических исследований для комбинированной вакцины против EPL/PRRS

Задачей этого эксперимента было подтверждение серологического ответа объединенного смешанного применения вакцины против Ery+Parvo+Lepto (Porcilis® Ery+Parvo+Lepto) с живой вакциной против PRRS (Porcilis® PRRS) по сравнению с вакцинами, использованными по отдельности. Обычно Porcilis® PRRS вводят один раз, в то время как базовая вакцинация Porcilis® Ery+Parvo+Lepto (EPL) состоит из двух вакцинаций с интервалом 4 недели. Таким образом, Porcilis® PRRS можно вводить совместно в ходе первичной вакцинации против EPL или в ходе вспомогательной вакцинации против EPL. Оба варианта смешения были протестированы в этом исследовании.

Для этого исследования использовали шестьдесят четыре свиньи в возрасте 20 недель (серонегативные в отношении всех компонентов вакцины), и распределяли на 4 группы по 16 животных в каждой. Группу 1 вакцинировали Porcilis EPL+Porcilis PRRS в возрасте 20 недель и Porcilis EPL в возрасте 24 недели. Группу 2 вакцинировали Porcilis EPL в возрасте 20 недель и Porcilis EPL+Porcilis PRRS в возрасте 24 недели. Группу 3 вакцинировали Porcilis EPL в возрасте 20 недель и в возрасте 24 недель. Группу 4 вакцинировали Porcilis PRRS в возрасте 20 недель. В ходе 20 недель после вакцинации регулярно проводили взятие образцов крови и сыворотки тестировали в соответствующих серологических испытаниях.

Этот тест был достоверным, если животные были серонегативными в начале исследования и если по меньшей мере 10 животных в каждой контрольной группе оставались серонегативными в отношении компонента, исключенного из вакцинаций, т.е. группа 4 оставалась негативной в отношении Ery, парвовируса и лептоспир и группа 3 оставалась негативной в отношении PRRS. Эти критерии удовлетворялись. Общие результаты в отношении каждого антигена описаны в настоящем описании ниже.

Серологическое исследование в отношении PRRS (с использованием теста PRRS X3, IDEXX)

В начале исследования большинство животных были серонегативными. Ответы после объединенного смешанного применения вакцинаций (группы 1 и 2) были по меньшей мере настолько же хорошими, как и для Porcilis PRRS отдельно (группа 4), в то время как в случае группы 3, в которой вводили Porcilis Ery+parvo+Lepto отдельно, они оставались на низком уровне. Таким образом, можно сделать заключение, что объединенное смешанное применение в возрасте 20 недель или 24 недели не имело негативного эффекта на PRRS-компонент Porcilis PRRS.

Серологическое исследование в отношении Ery (с использованием CIVTEST suis SE/MR, Hipra)

В начале исследования большинство животных были серонегативными. Ответы после объединенного смешанного применения вакцинаций (группы 1 и 2) были по меньшей мере настолько же хорошими, как и для Porcilis Ery+Parvo+Lepto отдельно (группа 3), в то время как в случае группы 4, в которой вводили Porcilis PRRS отдельно, они оставались на низком уровне. Таким образом, можно сделать заключение, что объединенное смешанное применение в возрасте 20 недель или 24 недели не имело негативного эффекта на Ery-компонент Porcilis Ery+Parvo+Lepto.

Серологическое исследование в отношении Parvo (с использованием собственного теста HI и теста INgezim PPV, Ingenasa)

Хотя тест HI часто используют для обнаружения антител против Parvo после инфицирования, он является менее пригодным для серологических исследований после вакцинации, поскольку после вакцинации выявляется случаев отсутствия ответа. Таким образом, этот антиген тестировали в испытании HI, а также в более чувствительном коммерчески доступном ELISA.

В начале исследования большинство животных были серонегативными в обоих тестах. Ответы после объединенного смешанного применения вакцинаций (группы 1 и 2) были по меньшей мере настолько же хорошими, как и для Porcilis Ery+Parvo+Lepto отдельно (группа 3), в то время как в случае группы 4, в которой вводили Porcilis PRRS отдельно, они оставались на низком уровне. Таким образом, можно сделать заключение, что объединенное смешанное применение в возрасте 20 недель или 24 недели не имело негативного эффекта на Ery-компонент Porcilis Ery+Parvo+Lepto.

Серологическое исследование в отношении Lepto (с использованием собственных специфических для серогрупп ELISA)

Тест MAT (микроагглютинация) обычно используют для обнаружения антител против лептоспир после инфицирования. Однако в этом тесте в основном определяют IgM-антитела, которые являются короткоживущими и в основном индуцируются после первичной вакцинации, в то время как IgG-антитела в основном индуцируются после вспомогательной вакцинации. Кроме того, некоторые серотипы плохо отвечают в тесте MAT, что также делает этот тест менее пригодным для серологических исследований. Поскольку IgG вовлечен в защиту и поскольку тест MAT является менее пригодным, были самостоятельно разработаны специфические для серотипов антител ELISA и валидированы. Эти ELISA в отношении серотип-специфического ингибирования использовали для определения ответов серотип-специфических IgG в этом исследовании.

В начале исследования все животные были серонегативными. Ответы после объединенного смешанного применения вакцинаций (группы 1 и 2) были по меньшей мере настолько же хорошими, как и для Porcilis Ery+Parvo+Lepto отдельно (группа 3), в то время как в случае группы 4, в которой вводили Porcilis PRRS отдельно, они оставались на низком уровне. Таким образом, можно сделать заключение, что объединенное смешанное применение в возрасте 20 недель или 24 недели не имело негативного эффекта на Ery-компонент Porcilis Ery+Parvo+Lepto. Кроме того, снижение титра антител с течением времени имело сходные профили, что указывает на то, что отсутствует влияние также и на длительность иммунитета.

В заключение, ответа антител после объединенного смешанного применения Porcilis PRRS и Porcilis Ery+Parvo+Lepto были по меньшей мере настолько же высокими, как и после вакцинации либо вакциной отдельно и, таким образом, можно сделать заключение, что объединенное смешанное применение не оказывает отрицательное влияние на уровень иммунитета. Аналогично, снижение титра антител с течением времени продемонстрировало сходные профили, что указывает на то, что объединенное применение также не оказывает отрицательного влияния на длительность иммунитета в отношении всех компонентов вакцин.

Эксперимент 4: Эффективность в отношении PRRS в минимальной дозе комбинированной вакцины Ery+Parvo+Lepto

Задачей этого эксперимента была оценка эффективности живой аттенуированной вакцины PRRSV 2 типа (Prime Pac® PRRS), разбавленной в минимальной дозе 4,0 log10 TCID50/животное в вакцине против EPL.

В это исследование было включено шестьдесят шесть поросят в возрасте 5 недель, серонегативных в отношении PRRSV. Поросят вакцинировали в минимальной дозе Prime Pac® PRRS, разбавленной либо в составе EPL (группа 1; время ожидания между разбавлением и вакцинацией один час при 25°C) или Diluvac Forte (группа 2), внутримышечно в правую сторону шеи. Поросят в 3 группе вакцинировали внутримышечно в правую сторону шеи посредством 2 мл того же состава EPL, и они служили в качестве контролей с заражением PRRSV. Через 4 недели после вакцинации поросят заражали дозой 5,0 log10 TCID50 вирулентного штамма PRRSV 2 типа, Nebraska-1, интраназальным (и/н) путем, по 1 мл на ноздрю. Взятие образцов крови поросят проводили в день вакцинации, в день заражения и через 5, 7, 10, 14 и 28 суток после заражения. Ректальную температуру измеряли за 1 сутки до заражения, непосредственно перед заражением, через 4 часа после заражения и после этого каждые сутки с 1 по 10 сутки после заражения. Массу тела определяли за сутки до заражения, через 9 и 25 суток после заражения. Через 10 суток после заражения 11 свиней на группу умерщвляли и наблюдали в отношении очагов повреждения в легких. Через 28 суток после заражения остальных свиней умерщвляли.

Температура тела и масса тела

Что касается температуры тела, в каждой группе вакцин температура была более низкой, чем в контрольной группе 3. Также было обнаружено, что отсутствовали различия между группой смешанного применения 1 и группой только Prime Pac® PRRS (группа 2). Что касается массы тела, вакцинированные животные росли быстрее, чем невакцинированные животные в группе 3. Также было обнаружено, что животные в группе смешанного применения 1 росли со сходной скоростью с животными в группе только Prime Pac® PRRS (группа 2).

Оценка очагов повреждения в легких

Половину животных, всего 11 животных на группу, умерщвляли через 10 суток после заражения для исследования их легких в отношении связанной с PRRS пневмонии. В таблице 3 представлен средний оцененный процент легких, пораженных видимой пневмонией, на группу. Из этой таблицы можно сделать заключение, что обычно заражение штаммом PRRSV не вызывало практически никаких очагов повреждения в легких. Тем не менее, через 10 суток после вакцинации вакцинированные животные продемонстрировали меньше очагов повреждения в легких, чем контроли. В целом не наблюдали значительного отличия между группу смешанного применения и группой только Prime Pac® PRRS.

Таблица 3 Средние показатели очагов повреждения на группу, 10 dpc

Группа	10 dpc
PrimePac+EPL	0
PrimePac	0,2
Контроль	0,85

Серологический ответ

В день вакцинации все животные были серонегативными в отношении PRRSV, что демонстрирует, что для этого исследования использовались PRRSV-негативные животные. Животные в контрольной группе без вакцинации оставались серонегативными до дня заражения (т.е. через 4 недели после вакцинации). Напротив, в день заражения антительный ответ определялся для вакцинированных групп, что указывает на то, что животные как в группе смешанного применения 1, так и в группе только Prime Pac® PRRS (группа 2) успешно первично иммунизировались посредством вакцинации PRRS. В последующие моменты времени после заражения, т.е. через 10 и 28 dpc, наблюдалось увеличение уровня антител, наиболее вероятно, вызванное контрольной инфекцией.

Виремия PRRS

Средний титр вируса на группу представлен в таблице 4. В таблице отчетливо показано, что вакцинированные животные (группа 1 и 2) имеют в среднем сниженную вирусную нагрузку в их сыворотке по сравнению с контрольными животными (группа 3). Существует небольшое отличие в уровне виремии каждой из вакцинированных групп.

Таблица 4 Титр PRRS dpc, log10 TCID 50/мл

Группа	5	7	10	14	28
1	0,6	0,5	0,7	0,6	0
2	0,1	0,2	0,2	0,3	0
3	2,0	1,8	2,2	2,1	0

В заключение, было установлено, что даже в наиболее низкой дозе (т.е. нижний предел в соответствии с этикеткой) коммерческая вакцина Prime Pac® PRRS, разбавленная в составе EPL, вызывала достаточную сероконверсию животных и достигалась защита против патогенного PRRSV.

Claims

1. Способ профилактического лечения свиней, серонегативных в отношении PRRSV, против инфекции Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans и вируса PRRS, включающий введение вакцины, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и не реплицирующийся иммуноген Erysipelothrix rhusiopathiae, не реплицирующийся иммуноген парвовируса свиней, не реплицирующийся иммуноген Leptospira interrogans и живой аттенуированный вирус PRRS; причем вакцину вводят в однократной дозе в отношении лечения инфекции вируса PRRS.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что не реплицирующиеся иммуногены Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней, Leptospira interrogans представляют собой инактивированные патогены Erysipelothrix rhusiopathiae, парвовируса свиней и Leptospira interrogans, соответственно.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что патоген Leptospira interrogans содержит бактерии серогруппы Pomona, и необязательно бактерии по меньшей мере одной из серогрупп Tarassovi, Australis, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae и Canicola, где бактерии серогруппы Australis, в частности, представляют собой бактерии серовара Bratislava.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что вакцину вводят парентерально.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что вакцину вводят внутримышечно.