HRP20140956A2 - Kombinirano cjepivo protiv pcv, bakterije mycoplasma hyopneumoniae i prrs - Google Patents

Kombinirano cjepivo protiv pcv, bakterije mycoplasma hyopneumoniae i prrs Download PDF

Info

Publication number
HRP20140956A2
HRP20140956A2 HRP20140956AA HRP20140956A HRP20140956A2 HR P20140956 A2 HRP20140956 A2 HR P20140956A2 HR P20140956A A HRP20140956A A HR P20140956AA HR P20140956 A HRP20140956 A HR P20140956A HR P20140956 A2 HRP20140956 A2 HR P20140956A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
hyo
preparation
pcv2
antigen
lys
Prior art date
Application number
HRP20140956AA
Other languages
English (en)
Inventor
Gregory P. Nitzel
Jeffrey E. Galvin
John Keith GARRETT
James R. Kulawik Ii
Tracy L. RICKER
Megan Marie SMUTZER
Original Assignee
Zoetis Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48140160&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HRP20140956(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Zoetis Llc filed Critical Zoetis Llc
Publication of HRP20140956A2 publication Critical patent/HRP20140956A2/hr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0208—Specific bacteria not otherwise provided for
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Ovaj izum osigurava trovalentni imunogeni pripravak koji sadrži topljivi dio cjelostaničnog pripravka bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); antigen iz svinjskog cirkovirusa tip 2 (PCV2); i antigen iz virusa PRRS, gdje topljivi dio pripravka M.hyo uglavnom ne sadrži ni (i) IgG niti (ii) imunokomplekse koji se sastoje od antigena vezanog na imuoglobulin.

Description

Područje izuma
Ovaj izum odnosi se na svinjski cirkovirus, bakteriju Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae ili M.hyo) i virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS). Specifičnije, ovaj izum se odnosi na trovalentni imunogeni pripravak koji sadrži topljivi dio cjelostaničnog pripravka M.hyo, antigen iz PCV2 i antigen iz virusa PRRS, te na njegovu upotrebu u cjepivu za zaštitu prasadi od u najmanju ruku enzootske pneumonije i sindroma multisistemskog propadanja nakon prestanka dojenja.
Pozadina izuma
Enzootsku pneumoniju kod svinja, poznatu i kao mikoplazmatsku pneumoniju, uzrokuje M.hyo. Ta bolest je kronična, neletalna bolest od koje može oboljeti prasad svih uzrasta. Inficirana prasad pokazuje tek blage simptome kašlja i groznice, no ta bolest ima značajan ekonomski utjecaj zbog smanjene djelotvornosti hranjenja i smanjenog prirasta na težini. Enzootska pneumonija prenosi se od praseta do praseta kroz nosne puteve zrakom nošenim organizmima izbačenim iz pluća inficiranih prasadi. Primarnu infekciju s M.hyo može slijediti sekundarna infekcija drugim mikoplazmatskim vrstama (Mycoplasma hyorhinis i Mycoplasma floculare), kao i drugim bakterijskim patogenima.
M.hyo je maleni, prokariotski mikroorganizam, koji može živjeti samostalno, iako se često nađe vezan uz eukariotske stanice zbog apsolutne potrebe za egzogenim sterolima i masnim kiselinama. Zbog tih potreba nužan je uzgoj u medijima koji sadrže serum. M.hyo se veže na staničnu membranu, no ne i za staničnu stijenku.
Fizička povezanost M.hyo s površinom stanice domaćina osnova je za razvoj i trajanje enzootske pneumonije. M.hyo inficira dišni sustav svinja, kolonizirajući dušnik, bronhe i bronhiole. Ta mikoplazma proizvodi ciliostatski čimbenik, koji uzrokuje prestanak gibanja cilija koje oivičuju dišne puteve. Na kraju cilije degeneriraju, zbog čega prase postane podložno infekciji sekundarnim patogenima. Kod inficiranioh životinja opažaju se karakterisične lezije s purpurnim do sivim područjima konsolidacije. Pretrage zaklanih životinja otkrivaju lezije kod 30 do 80% svinja. Rezultati iz 37 krda u 13 država ukazuju da je 99% krda imalo grla s pneumoničnim lezijama tipičnim za enzootsku pneumoniju. Prema tome, potreba za djelotvornim mjerama sprječavanja i liječenja je velika.
Antibiotici poput tiamulina, trimetoprima, tetraciklina i linkomicina pokazuju ponešto povoljan učinak, no skupi su i zahtijevaju dugu upotrebu. Uz to, pokazalo se da antibiotici nisu djelotvorni u zaustavljanju širenja ili reinfekcije s M.hyo. Sprječavanje održavanjem krda koja ne sadrže patogene je ponekad moguće, no često dolazi do reintrodukcije M.hyo. Zbog ozbiljnih ekonomskih posljedica svinjske pneumonije često su tražena cjepiva protiv M.hyo. na tržištu ima cjepiva koja sadrže pripravke mikoplazmatskih organizama uzgajanih u mediju koji sadrži serum, no takva cjepiva uzrokuju zabrinutost zbog štetnih reakcija na komponente seruma (poput imunokompleksa ili neimunogenih specifičnih proteina) prisutnih u imunizirajućem materijalu. Drugi pokušaji osiguravanja cjepiva protiv M.hyo su bili uspješni, no bolest je i dalje vrlo raširena.
M.hyo i svinjski cirkovirus tip 2 (PCV2) su dva najprisutnija patogena koja se sreće u svinjskoj industriji. Svinje inficirane s PCV2 pokazuju sindrom koji se obično navodi kao sindrom multisistemskog propadanja nakon prestanka dojenja (PMWS). Kliničke značajke PMWS su propadanje, bljedilo kože, izostanak prirasta, dišni problemi, ikterus i žutica. Uz PMWS, PCV2 prate i neke druge infekcije, uključujući lažnu bjesnoću, svinjski reproduktivni i respiratorni sindrom, Glasserovu bolest, streptokokni meningitis, salmonelozu, kolibacilozu nakon prestanka dojenja, dijetetsku hepatozu, te gnojnu bronhopneumoniju. M.hyo je povezana s enzootskom pneumonijom, a također je implicirana i kao jedan od glavnih sučimbenika u razvoju bolesti povezane sa svinjskim cirkovirusom (PCVAD).
Uzročnik svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma je arterivirus, koji ima osobiti afinitet prema makrofazima, a osobito onima koji se nalaze u plućima (alveolarni makrofazi). Ti makrofazi gutaju i uklanjaju invadirajuće bakterije i viruse, no ne i u slučaju virusa PPRS. U slučaju virusa PPRS taj virus se razmnožava unutar makrofaga, proizvodi još virusa, te ubija makrofage. Kad PPRSV jednom uđe u krdo običava ostati tamo i biti aktivan neograničeno dugo. Do 40% makrofaga biva uništeno, što omogućuje da se bakterije i dugi virusi razmnožavaju i čine štetu. Uobičajeni primjer toga je opazivi porast težine enzootske pneumonije u jedinicama za uzgoj i finiširanje kada dođe do infekcije virusom PPRS. Preko polovice prasadi u dobi prestanka dojenja koja ne sadrže virus biva zaraženo prije nego dospiju na tržište.
Ono što je potrebno je poboljšano trovalentno cjepivo protiv PCV2, M.hyo i PRRS, namijenjeno protiv infekcije s PCV2, mikoplazmama i PRRSV kod svinja. Bilo bi vrlo poželjno osigurati jednodoznotrovalentno cjepivo. Po mogućnosti, komponentu cjepivo protiv PCV i M.hyo bi se osiguralo kao tekući pripravak spreman za upotrebu u jednoj bočici, kojeg se lako kombinira s PRRS kao komponentom, tako da se sve antigene može istodobno primijeniti na prasetu.
Bit izuma
Ovaj izum osigurava trovalentni imunogeni pripravak koji sadrži topljivi dio cjelostaničnog pripravka bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); antigen iz svinjskog cirkovirusa tip 2 (PCV2); i virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS), gdje topljivi dio pripravka M.hyo uglavnom ne sadrži ni (i) IgG niti (ii) imunokomplekse koji se sastoje od antigena vezanog na imuoglobulin. U jednom aspektu topljivi dio cjelostaničnog pripravka M.hyo se obradi proteinom A ili proteinom G prije dodavanja imunogenom pripravku. U daljnjem aspektu topljivi dio cjelostaničnog pripravka M.hyo i antigen iz PCV2 su u obliku tekućeg pripravka spremnog za upotrebu.
U jednoj izvedbi antigen iz virusa PRRS je genetički modificirani živi virus. U daljnjoj izvedbi genetički modificirani živi virus PRRS je u obliku liofiliziranog pripravka.
U jednoj izvedbi topljivi dio pripravka M.hyo sadrži najmanje jedan proteinski antigen iz M.hyo. U daljnjoj izvedbi topljivi dio pripravka M.hyo sadrži dva ili više proteinskih antigena.
U jednoj izvedbi antigen iz PCV2 je u obliku kimernog cirkovirusa tip 1-tip 2, gdje navedeni kimerni cirkovirus uključuje inaktivirani rekombinantni svinjski cirkovirus koji eksprimira protein ORF2 iz svinjskog cirkovirusa tip 2. U daljnjoj izvedbi antigen iz PCV2 je u obliku rekombinantnog proteina ORF2. U još daljnjoj izvedbi rekombinantni protein ORF2 se eksprimira iz bakulovirusnog vektora.
U nekim izvedbama trovalentni imunogeni pripravak prema ovom izumu izaziva zaštitni imunosni odgovor protiv M.hyo, PCV2 i virusa PRRS. U daljnjim izvedbama imunogeni pripravak prema ovom izumu dodatno sadrži najmanje jedan dodatni antigen. U jednoj izvedbi najmanje jedan dodatni antigen štiti protiv mikroorganizma koji može uzrokovati bolest kod prasadi.
U jednoj izvedbi mikroorganizam uključuje bakterije, viruse ili protozoe. U dakjnjoj izvedbi mikroorganizam se bira između, no ne ograničuje se na sljedeće: svinjski cirkovirus tip 2 (PCV2), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjski parvovirus (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, leptospirne bakterije, Lawsonia intracellularis, virus svinjske influence (SIV), antigen iz bakterije Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, svinjski respiratorni koronavirus, virus svinjske epidemijske dijareje (PED), rotavirus, virus Torque teno (TTV), svinjski citomegalovirus, svinjske enteroviruse, virus encefalomiokarditisa, patogeni uzročnik Aujeszkyjeve bolesti, klasičnu svinjsku groznicu (CSF) i patogeni uzročnik svinjskog zaraznog gastroenteritisa, ili njihove kombinacije.
U nekim izvedbama pripravak prema ovom izumu dodatno sadrži adjuvans. U jednoj izvedbi adjuvans se bira između, no ne ograničuje se na sljedeće: ulje u vodi kao adjuvans, polimer i vodu kao adjuvans, vodu u ulju kao adjuvans, aluminijev hidroksid kao adjuvans, vitamin E kao adjuvans i njihove kombinacije. U daljnjoj izvedbi pripravak prema ovom izumu dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
U izvjesnim izvedbama pripravak prema ovom izumu izaziva zaštitni imunosni odgovor protiv M.hyo, PCV2 i virusa PRRS kada se primijenjuje u jednoj dozi.
Ovaj izum također osigurava postupak imuniziranja praseta protiv M.hyo, PCV2 i virusa PRRS. Taj postupak uključuje primjenu na prasetu trovalentnog imunogenog pripravka koji sadrži topljivi dio cjelostaničnog pripravka M.hyo; antigen iz svinjskog cirkovirusa tip 2 (PCV2) i antigen iz virusa PRRS, gdje topljivi dio pripravka M.hyo uglavnom ne sadrži ni (i) IgG niti (ii) imunokomplekse koji se sastoje od antigena vezanog na imuoglobulin. U jednoj izvedbi topljivi dio pripravka M.hyo u primijenjenom pripravku sadrži najmanje jedan proteinski antigen iz M.hyo.
U jednoj izvedbi postupka prema ovom izumu trovalentni pripravak se primijenjuje intramuskularno, intradermalno, transdermalno ili supkutano. U daljnjoj izvedbi postupka prema ovom izumu trovalentni pripravak se primijenjuje u jednoj dozi.
U daljnjoj izvedbi pripravak se primijenjuje na prasadi koja ima protutijela protiv najmanje jednog od M.hyo, PCV2 i virusa PRRS dobivena od majke. U još daljnjoj izvedbi pripravak se primijenjuje na prasadi koja ima protutijela i protiv M.hyo, PCV2 i virusa PRRS dobivena od majke.
U jednoj izvedbi pripravak se primijenjuje na prasadi staroj 3 tjedna ili starijoj.
Uz to, ovaj izum osigurava postupak priprave imunogenog pripravka prema ovom izumu. Taj postupak uključuje i) uzgoj M.hyo u pogodnim medijima u vremenskom rasponu od 18-144 sati; ii) naknadno inaktiviranje kulture M.hyo; iii) prikupljanje tekućine iz inaktivirane kulture M.hyo, gdje tekućina iz inaktivirane kulture M.hyo sadrži cjelostanični pripravak M.hyo, koji sadrži i topljivu tekuću frakciju i netopljivi stanični materijal; iv) odvajanje topljive tekuće frakcije od netopljivog staničnog materijala; v) uglavnom uklanjanje i IgG i imunokompleksa između antigena i imunoglobulina iz odvojene topljive tekuće frakcije; i vi) naknadno kombiniranje tekućeg dijela cjelostaničnog pripravka M.hyo s antigenom iz PCV2 i antigenom iz virusa PRRS. U jednoj izvedbi korak vi) uključuje kombiniranje tekućeg pripravka spremnog za upotrebu koji sadrži i antigen iz PCV2 i tekući dio cjelostaničnog pripravka M.hyo s liofiliziranim antigenom iz virusa PRRS.
U jednoj izvedbi komplet prema ovom izumu sadrži prvu bočicu (ili koji drugi pogodni spremnik) koja sadrži pripravak koji sadrži i antigen iz PCV2 i topljivi dio cjelostaničnog pripravka bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), gdje topljivi dio pripravka M.hyo uglavnom ne sadrži ni (i) IgG niti (ii) imunokomplekse koji se sastoje od antigena vezanog na imuoglobulin; i drugu bočicu koja sadrži antigen iz virusa PRRS. U daljnjoj izvedbi pripravak u prvoj bočici se osigurava kao tekući pripravak spreman za upotrebu. U daljnjoj izvedbi antigen iz virusa PRRS kao komponenta kompleta je u obliku liofiliziranog pripravka. U daljnjoj izvedbi komplet dodatno sadrži informacije o primjeni kombiniranog sadržaja prve i druge bočice na prasetu.
Kratak opis slika
Slika 1 je dijagram koji prikazuje djelotvornost jednovalentnih cjepiva protiv M.hyo pripravljenih s antigenima iz M.hyo iz različitih obrada (T02-T10, opisanih u Primjeru 3) u usporedbi s placebom (T01). Rezultati su prikazani kao vrijednosti najmanjih kvadrata za % plućnih lezija.
Slika 2 je dijagram koji prikazuje rezultate potentnosti antigena iz PCV2 (ELISA na antigen iz PCV2) iz cjepiva protiv M.hyo u kombinaciji s usmrćenim kimernim virusom PCV tip 1-tip 2. Kimerni virus uključen je u pripravak u početnoj količini od otprilike 1,6 ≤ RP. Status svakog uzorka izražen je kao relativna potentnost (RP).
Slika 3 je dijagram koji prikazuje rezultate viremije za PCV2 (kvantnitativni PCR PCV2) opažene za cjepivne formulacije protiv PCV i M.hyo, uz upotrebu različitih adjuvantnih platformi.
Slika 4 je dijagram koji prikazuje serološke rezultate ELISA na protutijelo protiv PCV2 (S/P) opažene za cjepivne formulacije protiv PCV i M.hyo, uz upotrebu različitih adjuvantnih platformi, 1., 20. i 42. dana izlaganja.
Slika 5 je dijagram koji prikazuje izlučivanje PCV2 izmetom dobivene za obrade T02-T04 opisane u Primjeru 7 u usporedbi s placebom (T01). Rezultati su izraženi kao broj kopija DNA iz PCV2 po ml.
Slika 6 je dijagram koji prikazuje nazalno izlučivanje PCV2 dobivene za obrade T02-T04 opisane u Primjeru 7 u usporedbi s placebom (T01). Rezultati su izraženi kao broj kopija DNA iz PCV2 po ml.
Slika 7 (A i B) su dijagrami koji prikazuju rezultate testa na interferon-gama (IFN-γ) u kojem se mjeri stanične imunosne (CMI) odgovore specifične za PCV2. Rezultati za nakon cijepljenja/prije izlaganja prikazani su na Slici 7A, a rezultati za nakon cijepljenja/nakon izlaganja prikazani su na Slici 7B. Stimuliranje 5 × 106 stanica smatrano je značajnim.
Slika 8 je dijagram koji prikazuje djelotvornost protiv M.hyo eksperimentalnih cjepivnih formulacija protiv M.hyo i PCV2 u SP-ulju. Plućni bodovi za formulacije kod kojih se upotrebljavaju obrade T02-T08 M.hyo u usporedbi s placebom (T01) prikazani su grafički na Slici 8A. Tablica na Slici 8B prikazuje usporedbu obrada T02-T08 s placebom.
Slika 9 je blok dijagram koji prikazuje jednu izvedbu proizvodnog postupka upotrijebljenog za pripravu antigena iz M.hyo obrađenog proteinom A i kompatibilnog s PCV2.
Slika 10 je tablica koja prikazuje procjenu adjuvansa na virucidnu aktivnost protiv virusa PRRS.
Slika 11 je dijagram koji prikazuje rezultate viremije za PCV2 (kvantnitativni PCR PCV2) opažene za eksperimentalne cjepivne formulacije protiv PCV2 i M.hyo i PRRS.
Slika 12 je dijagram koji prikazuje serološke rezultate ELISA opažene za eksperimentalne cjepivne formulacije protiv PCV2, M.hyo i PRRS, –1., 7., 13., 20., 28, 35. i 42. dana studije (izlagenje je provedeno 21. dan).
Slika 13 je dijagram koji prikazuje izlučivanje PCV2 izmetom dobivene za obrade T02 i T03 (eksperimentalne cjepivne formulacije protiv PCV2 i M.hyo i PRRS) opisane u Primjeru 14 u usporedbi s placebom (T01).
Kratak opis sljedova
SEQ ID NO: 1 je jedna izvedba nukleotidnog slijeda koji kodira p46 iz soja P-5722 M.hyo;
SEQ ID NO: 2 je jedna izvedba aminokiselinskog slijeda koji odgovara p46 iz soja P-5722 M.hyo;
SEQ ID NO: 3 je jedna izvedba nukleotidnog slijeda koji kodira p97 iz soja P-5722 M.hyo;
SEQ ID NO: 4 je jedna izvedba aminokiselinskog slijeda koji odgovara p97 iz soja P-5722 M.hyo;
SEQ ID NO: 5 je jedna izvedba genomskog slijeda koji kodira kimerni virus PCV1-2;
SEQ ID NO: 6 je jedna izvedba nukleotidnog slijeda koji odgovara ORF2 iz svinjskog cirkovirusa;
SEQ ID NO: 7 je jedna izvedba aminokiselinskog slijeda koji odgovara polipeptidu ORF2 iz svinjskog cirkovirusa;
SEQ ID NO: 8 je jedna izvedba genomskog slijeda koji kodira kimerni virus PCV1-2;
SEQ ID NO: 9 je jedna izvedba nukleotidnog slijeda koji odgovara ORF2 iz svinjskog cirkovirusa;
SEQ ID NO: 10 je jedna izvedba aminokiselinskog slijeda koji odgovara polipeptidu ORF2 iz svinjskog cirkovirusa;
SEQ ID NO: 11 je jedna izvedba aminokiselinskog slijeda koji odgovara polipeptidu ORF2 iz svinjskog cirkovirusa;
SEQ ID NO: 12 je jedna izvedba nukleotidnog slijeda koji kodira aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 11;
SEQ ID NO: 13 je jedna izvedba aminokiselinskog slijeda koji odgovara polipeptidu ORF2 iz svinjskog cirkovirusa;
SEQ ID NO: 14 je jedna izvedba nukleotidnog slijeda koji kodira aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 13;
SEQ ID NO: 15 je jedna izvedba aminokiselinskog slijeda koji odgovara polipeptidu ORF2 iz svinjskog cirkovirusa;
SEQ ID NO: 16 je jedna izvedba genomskog slijeda iz nevirulentnog oblika sjevernoameričkog izolata virusa PRRS, označenog s P129; i
SEQ ID NO: 17 je jedna izvedba nukleotidnog slijeda koji odgovara ORF2 do ORF5 iz izolata virusa PRRS označenog s ISU-55.
SEQ ID NO: 18 je jedna izvedba nukleotidnog slijeda koji odgovara ORF6 i ORF7 iz izolata virusa PRRS označenog s ISU-55.
Detaljni opis izuma
Ovaj izum osigurava trovalentni imunogeni pripravak koji sadrži topljivi dio cjelostaničnog pripravka M.hyo; antigen iz svinjskog cirkovirusa tip 2 (PCV2) i antigen iz virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS), gdje topljivi dio pripravka M.hyo uglavnom ne sadrži ni (i) IgG niti (ii) imunokomplekse s vezanim antigenom. U jednoj izvedbi trovalentni imunogeni pripravak izaziva zaštitni imunosni odgovor kod praseta protiv PCV2, M.hyo i virusa PRRS.
Podnositelji su neočekivano otkrili da netopljiva frakcija cjelostaničnog pripravka M.hyo nije imunogena. Nasuprot tome, topljivi pripravak M.hyo koji ne sadrži IgG je imunogen i može se djelotvorno kombinirati s antigenima iz drugih patogena, poput PCV2, bez analitičke ili imunološke interferencije između antigena. Zato je topljivi pripravak M.hyo prema ovom izumu djelotvorna platforma za viševalentna cjepiva prema ovom izumu. Podnositelji su također neočekivano otkrili da uklanjanje imunoglobulina i netopljivog staničnog taloga povećava sigurnost imunogenog pripravaka.
Kao što se upotrebljava u specifikaciji i patentnim zahtjevima, oblici u jednini "jedan", "neki" i "taj" uključuje množinu, ukoliko kontekst jasno ne zahtijeva drugačije. Kao primjer, termin "proteinski antigen" uključuje više proteinskih antigena, uključujući njihove smjese.
Kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji, termin "sadrži" treba značiti da pripravci i postupci uključuju spomenute elemente, no ne isključuje druge elemente.
Kao što je definirano u ovoj specifikaciji, topljivi dio cjelostaničnog pripravka M.hyo se odnosi na topljivu tekuću frakciju cjelostaničnog pripravka M.hyo nakon odvajanja netopljivog materijala i uglavnom uklanjanja IgG i imunokompleksa s vezanim antigenom. Topljivi dio M.hyo može se alternativno navoditi u ovoj specifikaciji kao supernatantnu frakciju, supernatant kulture i slično. To uključuje topljive proteine koje eksprimira M.hyo (proteinske antigene iz M.hyo) odvojene ili izdvojene od netopljivih proteina, cijelih bakterija i drugog netopljivog materijala iz stanica M.hyo konvencionalnim načinima, poput centrifugiranja, filtriranja ili taloženja. Uz to što uključuje topljive proteine specifične za M.hyo, topljivi dio cjelostaničnog pripravka M.hyo također uključuje heterologne proteine, poput onih koji se nalaze u mediju za kulturu koji se upotrebljava za fermentiranje M.hyo.
Termin "antigen" odnosi se na spoj, pripravak ili imunogenu tvar koja može stimulirati proizvodnju protutijela ili odgovor T-stanica, ili oboje, kod životinje, uključujući pripravke koje se injicira ili apsorbira u životinju. Imunosni odgovor može se dobiti na cijelu molekulu, ili na dio molekule (primjerice epitop ili hapten).
Kao što je definirano u ovoj specifikaciji, "imunogeni ili imunološki pripravak" se odnosi na pripravak kao predmet ovog izuma koji sadrži najmanje jedan antigen koji izaziva imunološki odgovor kod domaćina staničnog i/ili protutijelnog imunosnog odgovora na pripravak ili cjepivo od interesa.
Termin "imunosni odgovor", kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji, odnosi se na odgovor izazvan kod životinje. Imunosni odgovor može se odnositi na staničnu imunost (CMI), humoralnu imunost ili može uključivati oboje. Ovaj izum također razmatra odgovor ograničen na dio imunosnog sustava. Obično "imunološki odgovor" uključuje, no ne ograničuje se na jedan ili više sljedećih učinaka: proizvodnju ili aktiviranje protutijela, B-stanica, pomoćničkih T-stanica, supresorskih T-stanica i/ili citotoksičnih T-stanica i/ili γδ T-stanica, specifično usmjerenih na jedan ili više antigena koje sadrži pripravak ili cjepivo od interesa. Po mogućnosti, domaćin će pokazivati bilo terapijski ili zaštitni imunološki odgovor, tako da otpornost na novu infekciju bude veća i/ili da klinička težina bolesti bude manja. Takva zaštita očitovat će se bilo blažim simptomima ili izostankom simptoma koje normalno pokazuje inficirani domaćin, kraćim vremenom oporavka i/ili smanjenim virusnim titrom kod inficiranog domaćina.
Kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji, termin "imunogenost" znači sposobnost dobivanja imunosnog odgovora kod životinje domaćina protiv jednog ili više antigena. Taj imunosni odgovor osnova je zaštitne imunosti izazvane cjepivom protiv specifičnog infektivnog organizma.
"Adjuvans", kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji, znači pripravak koji se sastoji od jedne ili više tvari koje pojačavaju imunosni odgovor na jedan ili više antigena. Mehanizam djelovanja adjuvansa nije posve jasan. Smatra se da neki adjuvansi pojačavaju imunosni odgovor sporim otpuštanje antigena, dok su drugi adjuvansi jako imunogeni sami po sebi, te se smatra da funkcioniraju sinergistički.
Kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji, termin "viševalentni" se odnosi na cjepivo koje sadrži više od jednog antigena, bilo iz iste vrste (tj. različitih izolata bakterije Mycoplasma hyopneumoniae), iz različitih vrsta (tj. izolata i iz bakterije Pasteurella hemolytica i iz bakterije Pasteurella multocida), ili cjepivo koje sadrži kombinaciju antigena iz različitih rodova (primjerice cjepivo kopje sadrži antigene iz bakterija Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus i Clostridium).
Termin "prase" ili "praščić", kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji, znači životinja svinjskog podrijetla, dok se "krmača" odnosi na ženku reproduktivne dobi i sposobnu za reprodukciju. "Mlada krmača" je ženka svinje koja još nije bila skotna.
Kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji, termin "virulentan" se odnosi na izolat koji zadržava svoju sposobnost infektivnosti kod životinje domaćina.
"Inaktivirano cjepivo" znači cjepivni pripravak koji sadrži infektivni organizam ili patogen koji se više ne može razmnožavati ili rasti. Patogen može biti bakterijskog, virusnog, protozojskog ili gljivičnog podrijetla. Inaktiviranje se može postići različitim postupcima, uključujući smrzavanje s odmrzavanjem, kemijsku obradu (primjerice obradu tiomersalom ili formalinom), sonificiranje, zračenje, toplinsku obradu ili bilo koji drugi konvencionalan način dovoljan da spriječi razmnožavanje ili rast organizma, uz zadržavanje njegove imunogenosti.
Termin "varijanta", kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji, odnosi se na polipeptid ili nukleinskokiselinski slijed koji kodira polipeptid, koji sadrži jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih varijacija ili druge manje modifikacije, tako da odgovarajući polipeptid ima uglavnom ekvivalentnu funkciju u usporedbi s divljim tipom polipeptida.
"Konzervativna varijacija" označuje zamjenu jednog aminokiselinskog ostatka drugim, biološki sličnim ostatkom, ili zamjenu nukleotida u nukleinskokiselinskom slijedu, tako da se kodirani aminokiselinski ostatak ne mijenja ili je zamijenjen drugim, biološki sličnim ostatkom. Primjeri konzervativnih varijacija uključuju zamjenu jednog hidrofobnog ostatka, poput izoleucina, valina, leucina ili metionina, drugim hidrofobnim ostatkom, ili zamjenu jednog polarnog ostatka, poput zamjene lizina argininom, asparaginske kiseline glutaminskom kiselinom ili asparagina glutaminom i slično. Termin "konzervativna varijacija" također uključuje upotrebu zamijenjenske aminokiseline umjesto izvorne, osnovne aminokiseline, uz uvjet da protutijela dobivena na zamjenski polipeptid također imunološki reagiraju s izvornim polipeptidom.
Kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji, termini "farmaceutski prihvatljiv nosač" i "farmaceutski prihvatljiv vehikulum" su sinonimi i odnose se na tekući vehikulum za cjepivne antigene koje se može injicirati u domaćina bez štetnih učinaka. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači poznati u struci uključuju, no ne ograničuju se na sterilnu vodu, fiziološku otopinu, glukozu, dekstrozu ili na puferirane otopine. Nosači mogu sadržavati pomoćna sredstva, uključujući, no ne ograničujući se na razrjeđivače, stabilizatore (tj. šećere i aminokiseline), konzervanse, humektanse, emulgatore, sredstva za puferiranje pH, aditive za povećavanje viskoznosti, boje i slično.
Kao što se upotrebljava u ovoj specifikaciji, termin "cjepivni pripravak" sadrži najmanje jedan antigen ili imunogen u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu kojeg se može upotrijebiti za poticanje imunosnog odgovora kod domaćina. Cjepivne pripravke može se primijeniti u doziranjima i tehnikama dobro poznatim stručnjacima u području medicine ili veterine, uzevši obzir čimbenike poput dobi, spola, težine, vrste i stanja životinje primatelja, te načina primjene. Način primjene može biti perkutani, primjenom preko sluznice (primjerice oralno, nazalno, analno, vaginalno) ili parenteralnim načinom (intradermalno, transdermalno, intramuskularno, supkutano, intravenski ili intraperitonealno). Cjepivne pripravke može se primijeniti same, ili ih se može suprimijeniti ili primijeniti naizmjence s drugim oblicima liječenja ili terapije. Oblici primjene mogu uključivati suspenzije, sirupe ili ljekovite napitke, te pripravke za parenteralnu, supkutanu, intradermalnu, intramuskularnu ili intravensku primjenu (primjerice primjenu injiciranjem), poput sterilnih suspenzija ili emulzija. Cjepivne pripravke može se primijeniti u obliku spreja ili umiješane u hranu i/ili vodu, ili unijeti u smjesi s pogodnim nosačem, razrjeđivačem ili pomoćnom tvari, poput sterilne vode, fiziološke otopine, glukoze i slično. Pripravci mogu sadržavati pomoćne tvari, poput humektansa ili emulgatora, sredstava za puferiranje pH, adjuvansa, aditiva za želiranje ili povećavanje viskoznosti, konzervansa, aroma, boja i slično, ovisno o načinu primjene i željenom pripravku. Kako bi se pripravilo pogodne pripravke, bez nepotrebnog eksperimentiranja, može se konzultirati standardne priručnike iz područja farmaceutike, poput "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1990.
"Sjevernoamerički virus PRRS" znači bilo koji virus PRRS koji ima genetičke značajke povezane sa sjevernoameričkim izolatom virusa PRRS, poput, no bez ograničavanja na virus PRRS koji je najprije izoliran u Sjedinjenim Državama u ranim 1990-ima (vidjeti, primjerice, J.E. Collins i sur., 1992., J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126); sjevernoamerički izolat virusa PRRS MN-1b (J. Kwang i sur., 1994., J. Vet. Diagn. Invest., 6:293-296); soj Quebec LAF-exp91 virusa PRRS (H. Mardassi i sur., 1995., Arch. Virol., 140:1405-1418); i sjevernoamerički izolat VR 2385 virusa PRRS (X.-J Meng i sur., 1994., J. Gen. Virol., 75:1795-1801). U ovoj specifikaciji opisani su i drugi primjeri sjevernoameričkih sojeva virus PRRS. Genetičke značajke odnose se na genomsku sličnost nukleotidnih sljedova i sličnost aminokiselinskih sljedova koju među sobom dijele sjevernoamerički sojevi virusa PRRS. Kineski sojevi virusa PRRS općenito pokazuju sličnost nukleotidnih sljedova od otprilike 80-93% sa sjevernoameričkim sojevima.
"Evropski virus PRRS" odnosi se na bilo koji soj virusa PRRS koji ima genetičke značajke povezane s virusom PRRS koji je najprije izoliran u Evropi oko 1991. godine (vidjeti, primjerice, G. Wensvoort i sur., 1991., Vet. Q., 13:121-130). "Evropski virus PRRS" također se ponekad navodi u struci kao "lelystadski virus". U ovoj specifikaciji opisani su i drugi primjeri evropskih sojeva virusa PRRS.
Genetički modificirani virus je "ublažen" ako je manje virulentan nego njegov nemodificirani roditeljski soj. Soj je "manje virulentan" ako pokazuje statistički značajno smanjenje jednog ili više parametara koji određuju težinu bolesti. Takvi parametri mogu uključivati razinu viremije, groznicu, težinu dišnih problema, težinu reproduktivnih simptoma, ili broj ili težinu plućnih lezija itd.
"Infektivni klon" je izolirani ili klonirani genom uzročnika bolesti (primjerice virusa) koji može biti specifično i ciljano modificiran u laboratoriju, te upotrijebljen za ponovno stvaranje živog, genetički modificiranog organizma. Živi, genetički modificirani virus, proizveden iz infektivnog klona, može se upotrijebiti u cjepivu sa živim virusom. Alternativno se može pripraviti cjepiva s inaktiviranim virusom, obradom živog virusa dobivenog iz infektivnog klona sredstvima za inaktiviranje, poput formalina ili hidrofobnih otapala, kiselina itd., ozračivanjem ultraljubičastim svjetlom ili rendgenskim zrakama, toplinskom obradom itd.
Sva trenutno dostupna kombinacijska cjepiva protiv M.hyo načinjena su iz cjelostaničnih pripravaka usmrćenih mikoplazma (bakterina). Nasuprot tome, ovaj izum upotrebljava topljivi dio cjelostaničnog pripravka bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), gdje topljivi dio pripravka M.hyo uglavnom ne sadrži ni (i) IgG niti (ii) imunokomplekse koji se sastoje od antigena vezanog na imunoglobulin.
M.hyo ima apsolutnu potrebu za egzogenim sterolima i masnim kiselinama. Zbog tih potreba općenito je nužan uzgoj M.hyo u medijima koji sadrže serum, poput svinjskog seruma. Odvajanjem netopljivog materijala od topljivog dijela cjelostaničnog pripravka M.hyo (primjerice centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem) se ne uklanjaju svinjski IgG ili imunosni kompleksi. U jednoj izvedbi ovog izuma topljivi dio M.hyo se obradi proteinom A ili proteinom G kako bi se uglavnom uklonilo IgG i imunosne komplekse koji se nalaze u supernatantu kulture. U ovoj izvedbi podrazumijeva se da obradu proteinom A provodi nakon fermentiranja M.hyo. To se alternativno navodi u ovoj specifikaciji kao nizvodna obrada proteinom A. U daljnjoj izvedbi može se upotrijebiti uzvodna obrada medija za uzgoj proteinom A (tj. prije fermentiranja M.hyo). Protein A veže se na Fc dio IgG. Protein G preferencijalno se veže na Fc dio IgG, no također se može vezati na područje Fab. U struci su poznati postupci pročišćavanja odnosno uklanjanja ukupnog IgG iz sirovih proteinskih smjesa, poput supernatanta kulture tkiva, seruma i ascitesne tekućine.
U nekim izvedbama topljivi dio pripravka M.hyo sadrži najmanje jedan proteinski antigen iz M.hyo. U daljnjim izvedbama topljivi dio pripravka M.hyo sadrži dva ili više proteinskih antigena iz M.hyo.
U jednoj izvedbi supernatantna frakcija M.hyo sadrži jedan ili više sljedećih proteinskih antigena specifičnih za M.hyo: proteine iz M.hyo molekulskih težina od približno 46 kDa (p46), 64 kDa (p64) i 97 kDa (p97). U daljnjoj izvedbi supernatantna frakcija u najmanju ruku sadrži proteinske antigene p46, p64 i p97 iz M.hyo. Protein iz M.hyo od približno 64 kDa (p64) može se alternativno navoditi u ovoj specifikaciji kao površinski antigen p65 iz M.hyo kojeg su opisali Kim i sur. [Infect. Immun., 58(8):2637-2643 (1990.)], kao i u US patentu br. 5,788,962.
Futo i sur. opisali su kloniranje i okarakterizirali površinski protein od 46 kDa iz M.hyo, kojeg se može upotrijebiti u pripravcima prema ovom izumu [J. Bact., 177: 1915-1917 (1995.)]. U jednoj izvedbi supernatant kulture M.hyo sadrži p46, čiji su odgovarajući nukleotidni i aminokiselinski slijed iz soja P-5722 iznijeti u SEQ ID NO: 1 odnosno 2. Daljnje je razmatrana mogućnost upotrebe varijanti takvih sljedova p46 u pripravcima prema ovom izumu, kao što je opisano niže.
Zhang i sur. opisali su i okarakterizirali adhezinski protein p97 iz M.hyo [Infect. Immun., 63: 1013-1019, 1995.]. Uz to, King i sur. su opisali protein od 124 kDa nazvan Mhp1 iz soja P-5722 M.hyo i iznijeli podatke koji ukazuju da su Mhp1 i p97 isti protein [Vaccine, 15:25-35 (1997)]. Takve proteine p97 može se upotrijebiti u pripravcima prema ovom izumu. U jednoj izvedbi supernatant kulture M.hyo sadrži p97, čiji su odgovarajući nukleotidni i aminokiselinski slijed iz soja P-5722 iznijeti u SEQ ID NO: 3 odnosno 4. Daljnje je razmatrana mogućnost upotrebe varijanti takvih sljedova p97 u pripravcima prema ovom izumu, kao što je opisano niže.
Supernatant kulture M.hyo dodatno može sadržavati proteinske antigene specifične za M.hyo poput, no bez ograničavanja na proteine od približno 41 kDa (p41), 42 kDa (p42), 89 kDa (p89) i 65 kDa (p65). Vidjeti Okada i sur., 2000., J. Vet. Med. B, 47:527-533; i Kim i sur., 1990., Infect. Immun., 58(8):2637-2643. Uz to, supernatant kulture M.hyo može sadržavati proteinske antigene specifične za M.hyo od približno 102 kDa (p102) i 216 kDa (p216). Vidjeti US patente br. 6,162,435 i 7,419,806 u vlasništvu Minniona i sur.
Bilo koji soj M.hyo može se upotrijebiti kao polazni materijal za dobivanje topljivog dijela pripravka M.hyo prema ovom izumu. Pogodni sojevi M.hyo može se dobiti iz komercijalnih ili akademskih izvora, uključujući depozitorije, poput Zbirke američkog tipa kultura (ATCC) (Manassas, Va.) i Zbirke NRRL kultura (Služba za istraživanja u poljoprivredi, Američko ministarstvo poljoprivrede, Peoria, Ill.). ATCC sam ima sljedećih šest sojeva M.hyo za prodaju: M.hyo ATCC 25095, M.hyo ATCC 25617, M.hyo ATCC 25934, M.hyo ATCC 27714, M.hyo ATCC 27715 i M.hyo ATCC 25934D. Poželjni soj M.hyo, namijenjen upotrebi u izvedbama ovog izuma identificiran je kao soj P-5722-3, ATCC br. 55052, deponiran 30. svibnja 1990. prema pravilima dostupnosti koje zahtijeva Američki ured za patente i žigove. S obzirom na široku rasprostranjenost bolesti, sojeve se također može dobiti prikupljanjem M.hyo iz izlučina iz pluća ili tkiva iz svinja inficiranih poznatim sojevima koji uzrokuju mikoplazmatsku pneumoniju kod svinja.
Stručnjaci podrazumijevaju da se u pripravcima prema ovom izumu mogu upotrijebiti varijante sljedova iz M.hyo. Takve varijante mogu varirati i do 10-20% u identičnosti sljedova, a da još uvijek zadrže antigenske karakteristike zbog kojih su korisni u imunogenim pripravcima. Po mogućnosti, varijante M.hyo imaju najmanje 80%, po mogućnosti najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, te još poželjnije najmanje 95% identičnosti slijeda s genomskim slijedom pune duljine iz divljeg tipa soja M.hyo. Antigenske karakteristike imunološkog pripravka može se, primjerice, procijeniti u eksperimentu s izlaganjem, kao što je dano u Primjerima. Osim toga, antigenska karakteristika modificiranog antigena iz M.hyo je još uvijek zadržana kada modificirani antigen pruža najmanje 70%, po mogućnosti 80%, poželjnije 90% zaštitne imunosti u usporedbi s proteinom iz divljeg tipa M.hyo.
U jednoj izvedbi pripravci prema ovom izumu sadrže topljivi antigen p46 iz M.hyo, u konačnoj koncentraciji od otprilike 1,5 µg/ml do otprilike 10 µg/ml, po mogućnosti od otprilike 2 µg/ml do otprilike 6 µg/ml. Zapaženo je da je p46 protein koji je upotrijebljen u ispitivanju potentnosti M.hyo (vidjeti odjeljak primjera, niže). U daljnjoj izvedbi pripravci mogu sadržavati antigen iz M.hyo u konačnoj količini od otprilike 5,5% do otprilike 35% supernatanta cijele kulture M.hyo obrađenog proteinom A.
Topljivi pripravak M.hyo prema ovom izumu je i siguran i djelotvoran protiv M.hyo i pogodan je za primjenu u jednoj dozi. Uz to, Podnositelji su neočekivano otkrili da se topljivi pripravak M.hyo može djelotvorno kombinirati s antigenima iz drugih patogena bez imunološke interferencije između antigena. Zato je topljivi pripravak M.hyo prema ovom izumu djelotvorna platforma za viševalentna cjepiva, uključujući kombinacijsko cjepivo protiv PCV2, M.hyo i PRRS prema ovom izumu. Antigene iz PCV2 i virusa PRRS može se dati istodobno s pripravkom protiv M.hyo (tj. kao tri odvojena pojedinačna cjepiva), no po mogućnosti se tekući pripravak M.hyo kombinira zajedno s antigenom iz PCV2 u obliku tekućeg pripravka spremnog za upotrebu. Taj tekući pripravak protiv PCV2 i M.hyo spreman za upotrebu može se zatim kombinirati s antigenom iz virusa PRRS, tako da se sve antigene može primijeniti istodobno na prasetu. U nekim izvedbama antigen iz virusa PRRS je u liofiliziranom stanju, a tekući pripravak protiv PCV2 i M.hyo se može upotrijebiti za rehidriranje liofiliziranog antigena iz virusa PRRS, čime se dobije trovalentni pripravak.
U jednoj izvedbi imunogeni pripravci protiv PCV2, M.hyo i PRRS prema ovom izumu sadrže najmanje jedan dodatni antigen. U jednoj izvedbi najmanje jedan dodatni antigen štiti protiv mikroorganizma koji može uzrokovati bolest kod prasadi.
U nekim izvedbama najmanje jedna dodatna antigenska komponenta štiti protiv bakterija, virusa ili protozoa za koje se zna da inficiraju prasad. Primjeri takvih mikroorganizama uključuju, no ne ograničuju se na sljedeće: svinjski parvovirus (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, leptospirne bakterije, Lawsonia intracellularis, virus svinjske influence (SIV), antigen iz bakterije Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, svinjski respiratorni koronavirus, virus svinjske epidemijske dijareje (PED), rotavirus, virus Torque teno (TTV), svinjski citomegalovirus, svinjske enteroviruse, virus encefalomiokarditisa, patogeni uzročnik Aujeszkyjeve bolesti, klasičnu svinjsku groznicu (CSF) i patogeni uzročnik svinjskog zaraznog gastroenteritisa, ili njihove kombinacije.
U jednoj izvedbi komponenta protiv protiv PCV2 i M.hyo trovalentnog cjepiva prema ovom izumu je osigurana kao pripravak spreman za upotrebu u jednoj bočici. Takav pripravak spreman za upotrebu ne zahtijeva miješanje odvojenih jednovalentnih cjepiva protiv PCV2 i M.hyo, tako da nema opasnosti od zagađenja ili dodatnog napora povezanog s miješanjem, te nije potrebno upotrijebiti smjesu unutar nekoliko sati. Isto tako, komponenta protiv protiv PCV2 i M.hyo u jednoj bočici smanjuje otpad i skladišni prostor u hladnjaku na polovicu.
U nekim izvedbama antigenska komponenta iz PCV2 kombinacijskog cjepiva protiv PCV2, M.hyo i PRRS je u obliku kimernog cirkovirusa tip 1-tip 2. Kimerni virus uključuje inaktivirani rekombinantni svinjski cirkovirus tip 1 koji eksprimira protein ORF2 iz svinjskog cirkovirusa tip 2. Kimerni svinjski cirkovirusi i postupci njihove priprave opisani su u dokumentu WO 03/049703 A2, te također u US patentima br. 7,279,166 i 7,575,752, uključenima u ovu specifikaciju kao reference u svojoj cijelosti.
U jednoj izvedbi DNA slijed pune duljine genoma kimernog virusa PCV1-2 odgovara SEQ ID NO: 5 ili njegovim varijantama, kao što je opisano niže. U daljnjoj izvedbi gen za imunogeni kapsidni protein ORF2 iz kimernog virusa PCV1-2 odgovara SEQ ID NO: 6. U daljnjoj izvedbi aminokiselinski slijed imunogenog proteina ORF2 kojeg eksprimira kimerni virus PCV1-2 odgovara SEQ ID NO: 7.
U još daljnjoj izvedbi DNA slijed pune duljine genoma kimernog virusa PCV1-2 odgovara SEQ ID NO: 8. U jednoj izvedbi gen za imunogeni kapsidni protein ORF2 iz kimernog virusa PCV1-2 odgovara SEQ ID NO: 9. U daljnjoj izvedbi aminokiselinski slijed imunogenog proteina ORF2 kojeg eksprimira kimerni virus PCV1-2 odgovara SEQ ID NO: 10.
Međutim, PCV2 ORF2 DNA i protein iz kimernog virusa PCV1-2 se ne ograničuju na sljedove opisane gore jer je PCV2 ORF2 DNA i protein visoko konzervirana domena među izolatima PCV2.
U nekim izvedbama antigenska komponenta iz PCV2 kombinacijskog cjepiva protiv M.hyo i PCV2 je u obliku rekombinantnog proteina ORF2. U jednoj izvedbi rekombinantni protein ORF2 se eksprimira iz bakulovirusnog vektora. Alternativno se može upotrijebiti i druge poznate ekspresijske vektore, primjerice uključujući, no bez ograničavanja na parapoks vektore.
U jednoj izvedbi rekombinantni protein ORF2 iz PCV2 je onaj SEQ ID NO: 11, kojeg kodira SEQ ID NO: 12 (GenBank pristupni br. AF086834). U daljnjoj izvedbi rekombinantni protein ORF2 je onaj SEQ ID NO: 13, kojeg kodira SEQ ID NO: 14. U još daljnjoj izvedbi rekombinantni protein ORF2 odgovara SEQ ID NO: 15. U još daljnjoj izvedbi rekombinantni protein ORF2 iz PCV2 odgovara SEQ ID NO: 7. U još daljnjoj izvedbi rekombinantni protein ORF2 iz PCV2 odgovara SEQ ID NO: 10.
Međutim, ovaj izum se ne ograničuje na određenu ORF2 DNA i proteinske sljedove opisane gore. Kako je PCV2 ORF2 DNA i protein visoko konzervirana domena među izolatima PCV2, any PCV2 ORF2 jako je vjerojatno da će biti djelotvoran kao izvor PCV2 ORF2 DNA i/ili polipeptida kao što se upotrebljava u kimernom virusu PCV1-2 ili u rekombinantnom proteinu iz PCV2.
Primjer pogodnog izolata PCV2 iz kojeg se može dobiti PCV2 ORF2 DNA i proteinske sljedove je izolat PCV2 broj 40895 (deponiran u ATCC 7. prosinca 2001., te mi je pridodana ATCC patentma depozitna oznaka PTA-3914). Genomski (nukleotidni) slijed iz izolata PCV2 broj 40895 dostupan je pod GenBank pristupnim brojem AF264042. Drugi primjeri pogodnih izolata PCV2 iz kojih se može dobiti PCV2 ORF2 DNA i proteinske sljedove uključuju, no ne ograničuju se na sljedeće: Imp.999, Imp.1010-Stoon, Imp. 1011-48121 i Imp. 1011-48285. GenBank pristupni brojevi genomskih sljedova koji odgovaraju tim izolatima PCV2 su AF055391, AF055392, AF055393 odnosno AF055394.
U nekim oblicima, imunogene dijelove proteina ORF2 iz PCV2 se upotrebljava kao antigensku komponentu u pripravku. Kao primjer, u pripravcima prema ovom izumu mogu se upotrijebiti skraćeni i/ili supstituirani oblici ili fragmenti proteina ORF2 iz PCV2.
Stručnjaci podrazumijevaju da se u pripravcima prema ovom izumu mogu upotrijebiti varijante sljedova iz PCV2. Takve varijante mogu varirati i do 10-20% u identičnosti sljedova, a da još uvijek zadrže antigenske karakteristike zbog kojih su korisni u imunogenim pripravcima. Po mogućnosti, varijante PCV2 imaju najmanje 80%, po mogućnosti najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, te još poželjnije najmanje 95% identičnosti slijeda s genomskim slijedom pune duljine iz izolata divljeg tipa PCV2. Antigenske karakteristike imunološkog pripravka može se, primjerice, procijeniti u eksperimentu s izlaganjem, kao što je dano u Primjerima. Osim toga, antigenska karakteristika modificiranog antigena iz PCV2 je još uvijek zadržana kada modificirani antigen pruža najmanje 70%, po mogućnosti 80%, poželjnije 90% zaštitne imunosti u usporedbi s proteinom ORF2 iz divljeg tipa PCV2.
Antigenska komponenta iz PCV2 je osigurana u imunogenom pripravku u razini uključenosti antigena koja djelotvorno potiče željeni imunosni odgovor, a to je smanjivanje incidencije ili ublažavanje težine kliničkih znakova koji su posljedica infekcije s PCV2.
U jednoj izvedbi pripravcu prema ovom izumu sadrže kimerni virus PCV1-2 u razini od najmanje 1,0 ≤ RP ≤ 5,0, gdje je RP jedinica relativne potentnosti određena kvantificiranjem antigena ELISA-om (ispitivanje potentnosti in vitro), u usporedbi s referentnim cjepivom. U daljnjoj izvedbi pripravak prema ovom izumu sadrži kimerni virus PCV1-2 u konačnoj koncentraciji od otprilike 0,5% do otprilike 5% 20-ostruko (20 ×) koncentrirane glavnine antigena iz PCV1-2.
U daljnjoj izvedbi pripravci prema ovom izumu sadrže rekombinantni protein ORF2 iz PCV2 u razini od najmanje 0,2 µg antigena po ml konačnog imunogenog pripravka (µg/ml). U daljnjoj izvedbi razina uključenosti rekombinantnog proteina ORF2 iz PCV2 je od otprilike 0,2 do otprilike 400 µg/ml. U još daljnjoj izvedbi razina uključenosti rekombinantnog proteina ORF2 iz PCV2 je od otprilike 0,3 do otprilike 200 µg/ml. U još daljnjoj izvedbi razina uključenosti rekombinantnog proteina ORF2 iz PCV2 je od otprilike 0,35 do otprilike 100 µg/ml. U još daljnjoj izvedbi razina uključenosti rekombinantnog proteina ORF2 iz PCV2 je od otprilike 0,4 do otprilike 50 µg/ml.
U jednoj izvedbi imunogeni pripravak prema ovom izumu sadrži kombinaciju najmanje jednog topljivog antigena iz M.hyo (primjerice dva ili više), antigena iz svinjskog cirkovirusa tip 2 (PCV2) i antigena iz virusa PRRS. U daljnjoj izvedbi pripravak izaziva zaštitni imunosni odgovor kod praseta protiv M.hyo, PCV2 i virusa PRRS.
U jednoj izvedbi kombinacijsko cjepivo protiv M.hyo, PCV2 i PRRS prema ovom izumu je osigurano kao cjepivo u jednoj dozi u dvije bočice. Kao primjer, u nekim izvedbama, kombinacija protiv M.hyo i PCV2 je osigurana kao stabilni tekući pripravak u prvoj bočici, a virus PRRS je osiguran u liofiliziranom stanju u drugoj bočici. U nekim izvedbama dodatne svinjske antigene se može dodati bilo u prvu ili u drugu bočicu.
U jednoj izvedbi virus PRRS kao komponenta je osiguran kao liofilizirani, genetički modificirani živi virus. Prije primjene, tekućinu s M.hyo i PCV2 iz prve bočice se može upotrijebiti za rehidriranje virusa PRRS u drugoj bočici, tako da se sva tri antigena može primijeniti na životinji u jednoj dozi. Zapaženo je da iako trenutno postoje kombinacijska cjepiva protiv PCV2, M.hyo i PRRS, osigurana su kao cjepivo u jednoj dozi u tri bočice, koje zahtijeva istodobnu primjenu tri odvojena cjepiva (primjerice Ingelvac CircoFLEX®, Ingelvac MycoFLEX® i Ingelvac®PRRS MLV).
Etiološki uzročnik PRRS izoliran je po prvi puta u Nizozemskoj, te nazvan lelystadski virus. Taj virus opisan je u dokumentu WO 92/21375 (Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut). Izolat evropskog virusa PRRS deponiran je u Pasteurovom institutu u Parizu, pod brojem I-1102. Sjevernoamerički tip izoliran je gotovo istodobno s izoliranjem evropskog tipa virus, te je opisan u dokumentu WO-93/03760 (Collins i sur.). Izolat sjevernoameričkog tipa virusa deponiran je u Zbirci američkog tipa kultura (ATCC), pod brojem VR-2332.
Izolirani su različiti sojevi i evropskog i sjevernoameričkog tipa virusa. Dokument WO 93/07898 (Akzo) opisuje evropski soj, te cjepiva dobivena iz njega, deponiran u CNCM (Pasteurov institut), pod brojem I-1140. Isto tako, dokument WO 93/14196 (Rhone-Merieux) opisuje novi soj izoliran u Francuskoj, deponiran u CNCM (Pasteurov institut), pod brojem I-1153. Nadalje, dokument EP0595436 B1 (Solvay) opisuje novi soj sjevernoameričkog tipa, virulentniji od onog opisanog na početku, te cjepiva protiv njega. Taj soj deponiran je u ATCC, no u patentnoj prijavi nije naveden njegov depozitni broj. Uz to, dokument ES2074950 BA (Cyanamid Iberica) i njegov ekvivalent GB2282811 B2 opisuju tzv. "španjolski soj", koji se razlikuje od drugih evropskih i od sjevernoameričkih sojeva. Taj "španjolski soj" deponiran je u Evropskoj zbirci kultura životinjskih stanica (EACCC), pod brojem V93070108.
Antigeni iz virusa PRRS pogodni za upotrebu u pripravcima protiv M.hyo, PCV2 i PRRS prema ovom izumu uključuju sjevernoameričke izolate virusa PRRS, kineske sojeve virusa PRRS i evropske sojeve virusa PRRS, kao i genetički modificirane verzije takvih izolata odnosno sojeva. U jednoj izvedbi antigenska komponenta iz virusa PRRS upotrijebljena u pripravcima prema ovom izumu je sjevernoamerički virus PRRS.
U nekim izvedbama antigenska komponenta iz virusa PRRS upotrijebljena u pripravcima prema ovom izumu je sjevernoamerički izolat virusa PRRS označen kao P129 ili njegova živa, genetički modificirana verzija. Po mogućnosti, genetički modificirani virus PRRS ne može uzrokovati patogenu infekciju, no ipak može izazvati djelotvorni imunološki zaštitni odgovor protiv infekcije divljim tipom virusa PRRS.
Genetički modificirani virus PRRS, namijenjen upotrebi u pripravcima prema ovom izumu, može se dobiti iz infektivnog klona. Priprava infektivnog cDNA klona sjevernoameričkog izolata virusa PRRS označenog kao P129 opisana je u US patentu br. 6,500,662, uključenom u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti. Slijed P129 cDNA razotkriven je pod GenBank pristupnim brojem AF494042 i u US patentu br. 6,500,662.
U jednoj izvedbi nukleotidni slijed iz nevirulentnog oblika P129, namijenjen upotrebi u pripravcima prema ovom izumu, predstavljen je sa SEQ ID NO: 16. Međutim, ovaj izum se ne ograničuje na taj slijed. Taj slijed i sljedovi drugih nevirulentnih oblika P129 opisani su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/IB2011/055003, podnesenoj 9. studenog 2011., čiji sadržaj (uključujući sve podneske u američkoj nacionalnoj fazi utemeljene na toj Međunarodnoj patentnoj prijavi) je uključen u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti. Po mogućnosti, virus PRRS je modificiran da spriječi prilagodbu na niže interferonske funkcije.
U daljnjim izvedbama antigenska komponenta iz virusa PRRS upotrijebljena u pripravcima prema ovom izumu je izolat virusa PRRS označen kao ISU-55. Izolat ISU-55 deponiran je u Zbirci američkog tipa kultura (ATCC), pod pristupnim brojem VR2430. Nukleotidni slijed gena za ORF2 do ORF5 iz izolata ISU-55 predstavljen je sa SEQ ID NO: 17. Nukleotidni slijed gena za ORF6 i ORF7 iz izolata ISU-55 predstavljen je sa SEQ ID NO: 18.
Daljnji sjevernoamerički izolat virusa PRRS pogodan za upotrebu u pripravcima je ISU-12, deponiran je u ATCC pod pristupnim brojevima VR2385 [trostruko pročišćen kroz plakove] i VR2386 [nije pročišćen kroz plakove]. Slijede još daljnji sjevernoamerički izolati virusa PRRS pogodni za upotrebu u pripravcima prema ovom izumu: ISU-51, ISU-3927, ISU-1894, ISU-22 i ISU-79, deponirani u ATCC pod pristupnim brojevima VR2498, VR2431, VR2475, VR2429 odnosno VR2474. U pripravcima prema ovom izumu može se upotrijebiti genetički modificirane verzije bilo kojeg od tih ISU izolata. Ti ISU izolati i izolat ISU-55 detaljno su opisani u sljedećim US patentima, u vlasništvu Paula i sur.: US 5,695,766, 6,110,467, 6,251,397, 6,251,404, 6,380,376, 6,592,873, 6,773,908, 6,977,078, 7,223,854, 7,264,802, 7,264,957 i 7,517,976, od kojih su svi uključeni u ovu specifikaciju kao reference u svojoj cijelosti.
U još daljnjim izvedbama antigenska komponenta iz virusa PRRS upotrijebljena u pripravcima prema ovom izumu je sjevernoamerički tip deponiran u Zbirci američkog tipa kultura (ATCC), pod brojem VR-2332 ili njegova genetički modificirana verzija. Kao primjer, virus PRRS može biti modificirani živi virus baziran na izolatu identificiranom kao ATCC VR2332, upotrijebljen u INGELVAC® PRRS ATP i INGELVAC® PRRS MLV, od strane Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.
U još daljnjim izvedbama antigenska komponenta iz virusa PRRS upotrijebljena u pripravcima prema ovom izumu je evropski izolat virusa PRRS ili lelystadski virus ili njegova genetički modificirana verzija. Primjer pogodnog soja virusa PRRS identificiran je kao depozitni br. I-1102, opisan gore. Nukleotid i aminokiselinski sljedovi koji odgovaraju onom pod depozitnim brojem I-1102 opisani su u US patentu br. 5,620,691, u vlasništvu Wensvoorta i sur., uključenim u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti. Priprava infektivnog klona evropskog izolata virusa PRRS ili lelystadskog virusa opisana je u US patentu br. 6,268,199, uključenom u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti.
Drugi primjeri pogodnih izolata virusa PRRS uključuju, no ne ograničuju se na one opisane gore. Isto tako, u pripravcima prema ovom izumu se mogu upotrijebiti žive, genetički modificirane verzije izolata virusa PRRS. Infektivni klon može se upotrijebiti za ponovno stvaranje takvih živih, genetički modificiranih organizama.
Stručnjaci podrazumijevaju da se u pripravcima prema ovom izumu mogu upotrijebiti varijante sljedova iz virusa PRRS. Takve varijante mogu varirati i do 10-20% u identičnosti sljedova, a da još uvijek zadrže antigenske karakteristike zbog kojih su korisni u imunogenim pripravcima. Po mogućnosti, virus PRRS varijante imaju najmanje 80%, po mogućnosti najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, te još poželjnije najmanje 95% identičnosti slijeda s genomskim slijedom pune duljine iz izolata divljeg tipa virus PPRS. Antigenske karakteristike imunološkog pripravka može se, primjerice, procijeniti u eksperimentima s izlaganjem. Osim toga, antigenska karakteristika modificiranog antigena iz virusa PRRS je još uvijek zadržana kada modificirani antigen pruža najmanje 70%, po mogućnosti 80%, poželjnije 90% zaštitne imunosti u usporedbi s antigenom iz divljeg tipa virusa PRRS.
U jednoj izvedbi antigenska komponenta iz virusa PRRS je genetički modificirani, živi virus, kojeg pripravci prema ovom izumu sadrže u razini od najmanje 2,1 ≤ TCID50 ≤ 5,2, gdje je TCID50 50%-tna infektivna doza za kulturu tkiva, određena kvantificiranjem antigena (ispitivanje potentnosti in vitro).
Antigenska komponenta iz PCV2 u pripravcima protiv M.hyo, PCV2 i PRRS prema ovom izumu može biti u obliku kimernog cirkovirusa tip 1-tip 2, gdje kimerni virus uključuje inaktivirani rekombinantni svinjski cirkovirus tip 1 koji eksprimira protein ORF2 iz svinjskog cirkovirusa tip 2. U daljnjoj izvedbi antigenska komponenta iz PCV2 u pripravcima protiv M.hyo, PCV2 i PRRS prema ovom izumu je u obliku rekombinantnog proteina ORF2.
Antigene iz PCV2 pogodne za upotrebu u pripravcima protiv M.hyo, PCV2 i PRRS može se dobiti iz bilo kojeg od izolata PCV2 opisanih gore, kao i iz drugih izolata PCV2. Antigeni iz PCV2 pogodni za upotrebu u pripravcima prema ovom izumu uključuju, no ne ograničuju se na sljedove iz PCV2 opisane gore i njihove varijante.
Cjepiva prema ovom izumu može se formulirati prema prihvaćenoj konvenciji da sadrže nosače prihvatljive za životinje, uključujući ljude (ako vrijedi i za njih), poput standardnih pufera, stabilizatora, razrjeđivača, konzervansa i/ili solubilizatora, te ih se također može tako formulirati da omoguće produljeno otpuštanje. Razrjeđivači uključuju vodu, fiziološku otopinu, dekstrozu, etanol, glicerol i slično. Aditivi za izotoničnost uključuju natrijev klorid, dekstrozu, manitol, sorbitol i laktozu, između ostalog. Stabilizatori uključuju albumin, između ostalog. Drugi vehikulumi i aditivi pogodni za cjepiva, uključujući one koji su osobito korisni u formuliranju modificiranih živih cjepiva, su poznati ili će biti očigledni stručnjacima. Vidjeti primjerice, priručnik Remington's Pharmaceutical Science, 18. izd., 1990., Mack Publishing, uključen u ovu specifikaciju kao referenca.
Cjepiva prema ovom izumu mogu dodatno sadržavati jednu ili više dodatnih imunomodulacijskih komponenata, poput, primjerice, adjuvansa ili citokina, između ostalog. Oblici pogodnih adjuvansa, namijenjenih upotrebi u pripravcima prema ovom izumu, uključuju sljedeće: ulje u vodi kao adjuvans, polimer i vodu kao adjuvans, vodu u ulju kao adjuvans, aluminijev hidroksid kao adjuvans, vitamin E kao adjuvans i njihove kombinacije. Neki specifični primjeri adjuvansa uključuju, no ne ograničuju se na potpuni Freundov adjuvans, nepotpuni Freundov adjuvans, Corynebacterium parvum, Calmette-Guérinov bacil, gel od aluminijevog hidroksida, glukan, dekstran-sulfat, željezni oksid, natrijev alginat, Bacto-Adjuvant, izvjesne sintetske polimere, poput poliaminokiselina i kopolimera aminokiselina, blok-kopolimera (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), adjuvans AMPHIGEN®, saponin, Quil A ili drugu saponinsku frakciju, monofosforilni lipid A, te lipidno-aminski adjuvans Avridine (N,N-dioktadecil-N′,N′-bis(2-hidroksietil)propandiamin), "REGRESSIN" (Vetrefarm, Athens, Ga.), parafinsko ulje, adjuvantni sustav RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), muramildipeptid i slično.
Neograničavajući primjeri emulzija ulja u vodi korisnih za cjepivo prema ovom izumu uključuju formulacije s modificiranim SEAM62 i SEAM 1/2. Modificirani SEAM62 je emulzija ulja u vodi koja sadrži 5% (vol./vol.) skvalena (Sigma), 1% (vol./vol.) detergenta SPAN® 85 (ICI Surfactants), 0,7% (vol./vol.) detergenta TWEEN® 80 (ICI Surfactants), 2,5% (vol./vol.) etanola, 200 µg/ml Quil A, 100 µg/ml kolesterola i 0,5% (vol./vol.) lecitina. Modificirani SEAM 1/2 je emulzija ulja u vodi koja sadrži 5% (vol./vol.) skvalena, 1% (vol./vol.) detergenta SPAN® 85, 0,7% (vol./vol.) detergenta Tween 80, 2,5% (vol./vol.) etanola, 100 µg/ml Quil A i 50 µg/ml kolesterola.
Daljnji primjer adjuvansa korisnog za pripravke prema ovom izumu je SP-ulje. Kao što se upotrebljava u specifikaciji i patentnim zahtjevima, termin "SP-ulje" označuje uljnu emulziju koja sadrži polioksietilen-polioksipropilenski blok-kopolimer, skvalan, polioksietilen-sorbitan-monooleat i puferiranu otopinu soli. Polioksietilen-polioksipropilenski blok-kopolimeri su surfaktanti koji olakšavaju suspendiranje čvrstih i tekućih komponenata. Ti surfaktanti dostupni su na tržištu kao polimeri pod trgovačkim nazivom Pluronic®. Poželjni surfaktant je poloksamer 401, dostupan na tržištu pod trgovačkim nazivom Pluronic® L-121. Općenito, emulzija SP-ulja je imunostimulirajuća adjuvantna smjesa koja sadrži otprilike 1 do 3% vol./vol. blok-kopolimera, otprilike 2 do 6% vol./vol. skvalana, specifičnije otprilike 3 do 6% skvalana, te otprilike 0,1 do 0,5% vol./vol. polioksietilen-sorbitan-monooleata, gdje ostatak čini puferirana otopina soli. U jednoj izvedbi emulzija SP-ulja prisutna je u konačnom pripravku u vol./vol. količinama od otprilike 1% do 25%, po mogućnosti otprilike 2% do 15%, poželjnije otprilike 5% do 12% vol./vol.
Još daljnji primjer pogodnog adjuvansa, namijenjenog upotrebi u pripravcima prema ovom izumu, je adjuvans AMPHIGEN™, koji se sastoji od lecitina očišćenog od ulja, te otopljenog u ulju, obično lakom tekućem parafinu.
Drugi primjeri adjuvansa korisni u pripravcima prema ovom izumu su sljedeći zakonski zaštićeni adjuvansi: Microsol Diluvac Forte® dvojni emulzijski adjuvantni sustav, adjuvans Emunade, te adjuvans XSolve. I adjuvans Emunade i adjuvans XSolve su emulzije lakog mineralnog ulja u vodi, no Emunade također sadrži alhidrogel, a adjuvans XSolve sadrži d,l-α-tokoferil-acetat. Još daljnji primjer pogodnog adjuvansa, namijenjenog upotrebi u pripravcima prema ovom izumu, je adjuvans ImpranFLEX™ (voda u ulju kao adjuvans). Još daljnji primjer pogodnog adjuvansa je adjuvans na bazi karbomera (Carbopol®). Poželjni adjuvansi na bazi Carbopol® uključuju polimer Carbopol® 934 i polimer Carbopol®941.
U jednoj izvedbi adjuvans ili adjuvantnu smjesu se dodaje u količini od otprilike 100 µg do otprilike 10 mg po dozi. U daljnjoj izvedbi adjuvans odnosno adjuvantnu smjesu se dodaje u količini od otprilike 200 µg do otprilike 5 mg po dozi. U još daljnjoj izvedbi adjuvans odnosno adjuvantnu smjesu se dodaje u količini od otprilike 300 µg do otprilike 1 mg po dozi.
Adjuvans ili adjuvantna smjesa u pravilu je prisutna u cjepivnom pripravku prema ovom izumu u vol./vol. količinama od otprilike 1% do 25%, po mogućnosti otprilike 2% do 15%, poželjnije otprilike 5% do 12% vol./vol.
Drugi "imunomodulatori" koje može sadržavati cjepivo uključuju, primjerice, jedan ili više interleukina, interferona ili druge poznate citokine. U jednoj izvedbi adjuvans može biti ciklodekstrinski derivat ili polianionski polimer, poput onih opisanih in US patentima br. 6,165,995 odnosno 6,610,310.
Daljnji aspekt odnosi se na postupak priprave imunogenog pripravka prema ovom izumu. Taj postupak sastoji se u i) uzgoju M.hyo u pogodnim medijima u vremenskom rasponu od 18-144 sati; ii) naknadnom inaktiviranju kulture M.hyo; iii) prikupljanju tekućine iz inaktivirane kulture, gdje tekućina iz inaktivirane kulture sadrži cjelostanični pripravak M.hyo koji sadrži i topljivu tekuću frakciju i netopljivi stanični materijal; iv) odvajanju topljive tekuće frakcije od netopljivog staničnog materijala; v) uglavnom uklanjanju i IgG i imunokompleksa između antigena i imunoglobulina iz odvojene topljive tekuće frakcije; te vi) naknadnom kombiniranju topljivog dijela cjelostaničnog pripravka M.hyo s antigenom iz PCV2 i antigenom iz virusa PRRS. U nekim izvedbama korak vi) uključuje kombiniranje tekućeg pripravka spremnog za upotrebu koji sadrži i antigen iz PCV2 i topljivi dio M.hyo s liofiliziranim antigenom iz virusa PRRS.
Primjer medija pogodnih za uzgoj M.hyo je PPLO bujon (bujonska podloga za mikoplazme), kojeg se nakon dodavanja nutricijenata upotrebljava za izoliranje i uzgoj mikoplazma.
U nekim izvedbama kulturu M.hyo se uzgaja do rasta u kasnoj logaritamskoj fazi, nakon čega se kulturu inaktivira. U nekim daljnjim izvedbama kulturu se inaktivira podizanjem pH (primjerice do otprilike 7,8). To se provodi izlaganjem proizvodne kulture sredstvu za inaktiviranje, poput binarnog etilenimina (BEI). BEI se dobije na licu mjesta tijekom inkubiranja l-brometilamin-hidrobromida (BEA) u proizvodnoj kulturi. Zatim se pH inaktivirane kulture neutralizira, poput dodavanjem ekvivalentne količine sredstva koje neutralizira sredstvo za inaktiviranje u otopini. U nekim izvedbama sredstvo za inaktiviranje je BEI, a sredstvo za neutraliziranje je natrijev tiosulfat. U jednoj izvedbi pH inaktivirane kulture se podesi do otprilike 7,4 dodavanjem natrijevog tiosulfata.
U nekim izvedbama topljivu tekuću frakciju cjelostaničnog pripravka M.hyo se konvencionalnim postupcima odvoji od netopljivog staničnog materijala. U jednoj izvedbi to odvajanje se provodi u koraku filtriranja. U daljnjoj izvedbi to odvajanje se provodi u koraku centrifugiranja. U još daljnjoj izvedbi odvajanje se provodi u koraku taloženja.
U jednoj izvedbi topljivu tekuću frakciju inaktiviranog, neutraliziranog cjelostaničnog pripravka M.hyo se obradi smolom s proteinom A kako bi se uglavnom uklonilo i IgG i imunokomplekse između antigena i imunoglobulina prisutne u toj frakciji. U daljnjim izvedbama može se upotrijebiti smola s proteinom G kako bi se uglavnom uklonilo i IgG i imunokomplekse između antigena i imunoglobulina koje sadrži topljiva tekuća frakcija. Postupci uklanjanja i IgG i imunokompleksa između antigena i imunoglobulina smolama s bilo proteinom A ili s proteinom G su dobro poznati u struci.
Prema daljnjem aspektu postupak priprave trovalentnog imunogenog pripravka prema ovom izumu sastoji se u pripravi topljivog antigena iz M.hyo, kao što je opisano gore, i njegovom miješanju s antigenom iz PCV2, antigenom iz virusa PRRS, pogodnim adjuvansom i jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Taj postupak izborno uključuje kombiniranje antigena iz PCV2 i topljivog antigena iz M.hyo u dvovalentni pripravak, te naknadno dodavanje jednovalentnog pripravka s antigenom iz virusa PRRS tom dvovalentnom pripravku kako bi se dobilo trovalentni pripravak.
Daljnji aspekt ovog izuma odnosi se na komplet. "Komplet" se odnosi na više komponenata skupljenih zajedno. U jednoj izvedbi komplet prema ovom izumu sadrži prvu bočicu (ili koji drugi pogodni spremnik) koja sadrži imunogeni pripravak koji sadrži topljivi dio cjelostaničnog pripravka bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), gdje topljivi dio pripravka M.hyo uglavnom ne sadrži ni (i) IgG niti (ii) imunokomplekse između antigena i imunoglobulina, i drugu bočicu koja sadrži antigen iz virusa PRRS. U jednoj izvedbi komplet dodatno sadrži upute.
U nekim izvedbama kombinacija protiv PCV2 i M.hyo u prvoj bočici kompleta je osiguran kao tekući pripravak spreman za upotrebu. U daljnjim izvedbama antigen iz virusa PRRS je u obliku genetički modificiranog živog virusa, osiguranog u liofiliziranom stanju. U takvim slučajevima upute će sadržavati informacije o rehidriranju virusa PRRS kao komponente u drugoj bočici tekućim sadržajem iz prve bočice koja sadrži kombinaciju protiv M.hyo i PCV2. Upute će također sadržavati informacije o primjeni kombiniranog sadržaja iz prve i druge bočice na prasetu.
U nekim izvedbama imunogeni pripravak prema ovom izumu se primijenjuje na prasadi koja ima protutijela protiv najmanje jednog od M.hyo, PCV2 i virusa PRRS dobivena od majke. U daljnjim izvedbama imunogeni pripravak prema ovom izumu se primijenjuje na prasadi koja ima dobivena od majke protutijela i protiv M.hyo, PCV2 i virusa PRRS.
U nekim izvedbama trovalentni imunogeni pripravak prema ovom izumu se primijenjuje na praščiću starom 3 tjedna ili starijem. Međutim, razmatra se i mogućnost upotrebe trovalentnog cjepivnog pripravka prema ovom izumu u precjepljivanju mladih krmača prije rasploda. Kao što je poznato u struci, mlada krmača je ženka svinje koja još nije bila skotna. Cijepljene mlade krmače prenijet će majčinska protutijela svoju sisančad putem mljeziva.
Daljnje je razmatrana mogućnost upotrebe trovalentnog cjepiva prema ovom izumu u godišnjem precjepljivanju rasplodnih krda. Po mogućnosti, trovalentno cjepivo prema ovom izumu se primijenjuje na prasadi (primjerice praščićima ili mladim krmačama) u jednoj dozi. U jednoj izvedbi viševalentno cjepivo prema ovom izumu ne zahtijeva miješanje odvojenih jednovalentnih cjepiva prije primjene, tj. osigurano je kao formulacija spremna za upotrebu u jednoj bočici. U daljnjoj izvedbi viševalentna formulacija zahtijeva miješanje dvovalentnog cjepiva protiv PCV2 i M.hyo kojeg sadrži prva bočica s jednovalentnim cjepivom protiv PRRS kojeg sadrži druga bočica. Izborno se dodatne antigene može dodati u bilo koju od tih bočica.
U nekim izvedbama početak imunosti je od 2-3 tjedna nakon cijepljenja trovalentnim cjepivnim pripravkom prema ovom izumu. U daljnjim izvedbama trajanje imunosti je otprilike 17-23 tjedna nakon cijepljenja jednovalentnim ili viševalentnim cjepivni pripravkom prema ovom izumu.
U sljedećim primjerima iznijeti su poželjni materijali i postupci prema ovom izumu. Međutim, treba imati na uzmu da su ti primjeri dani samo kao ilustracija, te ništa u njima ne treba uzeti kao ograničenje ukupnog opsega zaštite ovog izuma.
Primjeri
Primjer 1
Postupci proizvodnje Mycoplasma hyopneumoniae za antigen iz M.hyo koji se može kombinirati s PCV2
Fermentiranje i inaktiviranje M.hyo
Mediji za umnažanje sjemena i proizvodnju antigena pripravljeni su na sljedeći način. PPLO (organizam sličan uzročniku pleuropneumonije) bujon (BD Biosciences, kataloški br. 21498) dobiven iz svinjskog srca načinjen je prema proizvođačevim uputama (tj. 21 g/l), a otopina ekstrakta kvasca je načinjena u 21 g/l u USP. Otopina ekstrakta kvasca je zatim dodana u PPLO od 6,25%, a smjesa je sterilizirana grijanjem do 121 °C u trajanju od ≥ 30 minuta. Cistein-hidroklorid je pripravljen u 90 g/l, te steriliziran filtriranjem. Otopina dekstroze načinjena je dodavanjem 450 g dekstroze po litri USP vode, uz naknadno steriliziranje toplinom. Kako bi se pripravilo konačni medij, u osnovni medij je dodan svinjski serum od 10%, zatim cistein od 0,01% i dekstroza od 1,0%. Taj medij inokuliran je s 10% vol./vol. kulture bakterije M. hyopeumoniae (soj P-5722-3) u logaritamskoj fazi. Kultura je držana na 37 °C, a pH i dO su održavani na 7,0 odnosno 25%. Kod rasta u kasnoj logaritamskoj fazi kultura je inaktivirana binarnim etileniminom (BEI), aziridinskim spojem dobivenim iz 2-brometilamin-hidrobromida. Specifično, inaktiviranje je provedeno povišenjem pH do 7,8 dodavanjem 2-brometilamin-hidrobromida (BEA) do konačne koncentracije od 4 mM i inkubiranjem u trajanju od 24 sata. BEI je neutraliziran dodavanjem natrijevog tiosulfata u molarnom omjeru od 1:1, uz naknadno inkubiranje u trajanju od 24 sata. Tekućina iz inaktivirane kulture držana je na 2-8 °C do daljnje obrade.
Primjer 2
Postupci proizvodnje kimernog svinjskog cirkovirusa (cPCV)1-2
cPCV1-2 je konstruiran kloniranjem gena za imunogeni kapsidni protein iz patogenog svinjskog cirkovirusa tip 2 (PCV2) u genomsku okosnicu nepatogenog svinjskog cirkovirusa tip 1 (PCV1). Postupak konstruiranja klona kimerne DNA opisan je, primjerice, u US patentu br. 7,279,166, uključenom u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti. Infektivna zaliha kimernog virusa dobivena je od strane dr. X.J. Menga, s Virginijskog politehničkog instituta i Državnog sveučilišta u Blacksburgu, VA, te upotrijebljena za inficiranje stanica (PK)-15 iz svinjskog bubrega, uzgajanih u minimalnom esencijalnom mediju (MEM), uz dodatak 0,05% hidrolizata laktalbumina (LAH), 30 µg/ml gentamicin-sulfata i 5% fetalnog goveđeg seruma. Dobivene stanice PK-15 inficirane s cPCV1-2 su daljnje ekspandirane s još četiri serijske pasaže uz upotrebu istog medija za uzgoj, s izuzetkom 2-3% fetalnog goveđeg seruma. Peta pasaža je zamrznuta, odmrznuta, te filtrirana, a dobiveni lizati su upotrijebljeni za dobivanje predglavnog sjemena, a zatim i glavnog sjemena.
Medij upotrijebljen za proizvodnju virusnog sjemena bio je isti kao onaj upotrijebljen u proizvodnji zalihe virusa. Medij za uzgoj je MEM, OptiMEM, ili koji ekvivalentni, kao osnovni medij kojeg se može upotrijebiti za nasađivanje stanične linije PK-15 za rast. U medij za uzgoj može se dodati do 10% goveđeg seruma, do 0,5% hidrolizata laktalbumina, do 0,5% goveđeg seralbumina, te do 30 µg/ml gentamicina. Kao medij za razmnožavanje virusa upotrijebljen je MEM, OptiMEM, ili koji ekvivalentni. U medij za razmnožavanje virusa može se dodati do 0,5% hidrolizata laktalbumina, do 2% goveđeg seruma, do 0,5% goveđeg seralbumina, te do 30 µg/ml gentamicina. U medij za uzgoj i/ili medij za razmnožavanje virusa može se dodati do 5 g/l glukoze i do 5 mmol/l l-glutamina, što je nužno za održavanje stanica.
cPCV1-2 kao glavno virusno sjeme doda se u suspenziju stanica PK-15, te adsorbira u trajanju do 3 sata. Virusno sjeme se razrijedi u osnovnom mediju za uzgoj kako bi se postiglo multiplicitet infekcije (MOI) od 0,1-0,0001.
Kulture stanica PK-15 najprije se inokulira radnim virusnim sjemenom za vrijeme nasađivanja stanica, ili kada stanice dosegnu konfluentnost od približno 20% do 50%. Ovu početnu pasažu može se navesti kao "Postupak inficiranja u jednom koraku", namijenjen proizvodnji zalihe antigena, ili se može dalje upotrijebiti za serijske pasaže. Radi serijskih pasaža stanice PK-15 inficirane s cPCV1-2 su daljnje ekspandirane do sedme pasaže serijskim dijeljenjem u omjeru od 1:5-20 radi razmnožavanja virusa. Medij za kultura koji sadrži suspenziju inficiranih stanica iz prethodne pasaže služi kao sjemenski materijal za sljedeću pasažu. Stanice inficirane s cPCV1-2 inkubirane su tri (3) do 14 dana za svaku pasažu na 36 ± 2 °C kada stanice dosegnu konfluentnost ≥ 90%. Virus cPCV1-2 uzrokuje opazive citopatološke poimjene tijekom svog repliciranja. Kod prikupljanja je opaženo zaobljivanje stanica i značajni plutajući talog. Kulture su također promatrane na vidljivi dokaz bakterijskog ili gljivičnog zagađenja. Vrijeme inkubiranja između prikupljanja antigena iz cPCV dano je u Tablici 1, niže:
Tablica 1
Najkraća i najdulja vremena prikupljanja antigena iz cPCV
[image]
Tekućine iz kulture cPCV1-2 prikupljene su u sterilne posude, te su uzeti uzorci za testiranje na mikoplazme upotrebom poznatih postupaka. Više prikupljanja može se provesti iz boca za tresilicu, bioreaktora i perfuzijskih posuda.
Prije inaktiviranja prikupljenog virusa cPCV1-2 ultrafiltriranjem se može koncentrirati jednu ili više šarži antigena (primjerice do 60 ×). Koncentrate se može isprati uravnoteženom otopinom soli kako bi se smanjilo količinu serumskih proteina.
Ovdje će biti opisan postupak inaktiviranja, ublažavanja ili detoksiciranja virusa cPCV1-2. Nakon koncentriranja antigena iz cPCV u prikupljeni cPCV1-2 virusni materijal se doda β-propiolakton (BPL) kako bi se postiglo približnu koncentraciju od 0,2% vol./vol. Prikupljene virusne tekućine se zatim trese najmanje 15 minuta, a zatim se inaktiviranu glavninu antigenske tekućine prebaci u drugu sterilnu posudu. Prebačene antigenske tekućine održava se na 2-7 °C, uz stalno tresenje, najmanje 24 sata. Nakon najmanje 24 sata, u prikupljenu suspenziju se doda drugo dodavanje 0,2% vol./vol. BPL. Sadržaj se zatim trese, prebaci u treću posudu, te održava na 2-7 °C, uz stalno tresenje, još najmanje 84 sata. Općenito, ukupno vrijeme inaktiviranja je najmanje 108 sati, a najviše 120 sati. Postupak inaktiviranja sažeto je prikazan u Tablici 2, niže.
Tablica 2
Postupak inaktiviranja
[image]
Inaktiviranje se prekida dodavanjem konačne koncentracije od najviše 0,1 M otopine natrijevog tiosulfata. pH inaktivirane zalihe antigena podesi se do otprilike 6,8 uz pomoć NaOH ili HCl. Nakon inaktiviranja, reprezentativni uzorak se uzme iz prikupljenog materijela, te ispita je li inaktiviranje gotovo. Inaktivirani antigenski proizvod cPCV1-2 se standardizira kako bi se postiglo ciljanu vrijednost veću od 1,0 RP, što se izmjeri ELISA-om na potentnost.
Primjer 3
Nizvodna obrada antigena iz M. hyo i analitičko ispitivanje tih obrađenih antigena
Nizvodna obrada antigena iz M.hyo:
Inaktivirana fermentacijska tekućina (pripravljen kao što je opisano gore, u Primjeru 1) obrađena je za svaku naznačenu skupinu na sljedeći način. Ti obrađeni antigeni iz M.hyo upotrijebljeni su u Primjeru 4, niže.
T02: (Cijela glavnina) Nije obrađeno.
T03: (10 × UF koncentrirano) Koncentriran filtriranjem tangencijalnim protokom kroz graničnu membranu za molekulsku težinu od 100 kDa (šuplja vlakna). Konačno smanjenje volumena iznosilo je 10 ×.
T04 i T05: (10 × UF koncentrirano i centrifugirano) Koncentrirane mikoplazmatske stanice (from T03) su prikupljene, te isprane jednom PBS-om uz pomoć centrifugiranja na ~20.000 × g (Sorvall model RC5B).
T06 i T07: (10 × centrifugirano) Inaktivirana fermentacijska tekućina centrifugirana je na ~20.000 × g (Sorvall RC5B), te isprana jednom resuspendiranjem stanica u PBS-u, uz naknadno dodatno centrifugiranje. Konačno smanjenje volumena iznosilo je 10 ×.
T08: (10 × centrifugirano i grijano) Mikoplazmatske stanice su koncentrirane, isprane prema T06, te grijane do 65 °C u trajanju od 10 minuta.
T09: (Supernatant bez stanica) Supernatant prikupljen iz prvog centrifugiranja kao što je opisano za T06 je steriliziran filtriranjem kroz 0,2 mikrometarski filtar (Nalgene).
T10: (Supernatant bez stanica; obrada proteinom A) Sterilni supernatant (pripravljen prema T09) pomiješan je sa smolom s proteinom A (Protein A Sefaroza, Pharmacia Inc) u volumnom omjeru od 10:1 u trajanju od 4 sata. Smola je uklonjena sterilnim filtriranjem, a filtrirana tekućina je uskladištena na 2-8 °C. U tom postupku upotrebljava se "nizvodna" obrada proteinom A nakon fermentiranja kako bi se uklonilo protutijela i imunokomplekse. Iako ovaj izum ne isključuje uzvodnu obradu proteinom A, izumitelji ovog izuma su otkrili da u slučaju M.hyo uzvodna obrada proteinom A medija za uzgoj daje rezultate s p46 koji su lošiji i nekonzistentni u usporedbi s neobrađenim medijima (podaci nisu prikazani).
Analitičko ispitivanje nizvodno obrađenih antigena iz M.hyo
Nizvodno obrađeni pripravci antigena iz M.hyo (pripravljeni kao što je opisano gore) ispitani su na prikupljanje antigena p46 specifičnog za M.hyo i prisutnost protutijela protiv PCV2. Uz to, ti pripravci antigena M.hyo su ispitani na prisutnost virusa Torque teno (TTV), uključujući genotip 1 (g1TTV) i genotip 2 (g2TTV). Rezultati su prikazani niže, u Tablici 3.
Tablica 3
Karakteriziranje nizvodno obrađenih antigena iz M.hyo
[image]
Prema Tablici 3, gore, prikupljanje antigena p46 specifičnog za M.hyo je dokazano za svaki od nizvodno obrađenih pripravaka antigena iz M.hyo. Uz to, protutijelo protiv PCV2 je uspješno uklonjeno sljedećim obradama: 10 × UF koncentriranje i centrifugiranje, 10 × centrifugiranje, 10 × centrifugiranje i grijanje, te Supernatant bez stanica (obrađen proteinom A). S obzirom na TTV, g1TTV je uspješno uklonjen sljedećim obradama: 10 × UF koncentriranje i centrifugiranje, 10 × centrifugiranje i grijanje, te Supernatant bez stanica (obrađen proteinom A). g2TTV je uklonjen samo obradom označenom kao 10 × UF koncentriranje i centrifugiranje. Izolati virusa Torque teno, uključujući genotipove 1 i 2, opisani su u dokumentu US20110150913, uključenom u ovu specifikaciju kao referenca u svojoj cijelosti.
Kako je u struci poznato da se protein A veže na IgG, prosječni stručnjaci znaju da će obrada proteinom A djelotvorno ukloniti ne samo protutijelo protiv PCV2, već i druga svinjska protutijela, uključujući protutijelo protiv PRRS, protutijelo protiv HPS, te protutijelo protiv SIV. Zato je supernatant M.hyo obrađen proteinom A koji ne sadrži stanice prema ovom izumu kompatibilan ne samo s antigenom iz PCV2, već također i s drugim svinjskim antigenima jer nema imunološke interferencije između antigena. Uz to, razumno je očekivati da će uklanjanje nezaštićujućeg staničnog taloga i uklanjanje immunoglobulina i kompleksa između antigena i immunoglobulina učiniti cjepivo sigurnijim.
Primjer 4
Priprava eksperimentalnih cjepivnih formulacija protiv M.hyo
Sva eksperimentalna cjepiva protiv M.hyo formulirana su uz konačnu koncentraciju od 5% adjuvansa Amphigen. Uz to, sva cjepiva su standardizirana ELISA-om na p46 i konzervirana tiomersalom. Eksperimentalne cjepivne formulacije pripravljene su s antigenima iz M.hyo obrađenim prema obradama T02-T10, gore. Uz to, Obrada T01 odgovara placebu (bez antigena iz M.hyo, samo 5%-tni Amphigen kao adjuvans), dok je Obrada T11 pozitivna kontrola, koja odgovara zastarjelom cjepivu protiv M.hyo na bazi bakterina (RespiSure-ONE®, Pfizer Animal Health). Te formulacije opisane su u Tablici 4, niže.
Tablica 4
Eksperimentalne cjepivne formulacije protiv M.hyo
[image] *Serija Ispitivanog veterinarskog proizvoda (IVP)
Primjer 5
Procjenjivanje djelotvornosti cjepiva protiv M.hyo in vivo na antigenima iz M.hyo iz različitih nizvodnih postupaka
Ta studija je provodena kako bi se procijenilo djelotvornost in vivo cjepiva protiv bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) s antigenima iz M.hyo iz različitih nizvodnih postupaka (DSP). Prasad stara 3 tjedna je intramuskularno inokulirana jednom dozom različitih cjepivnih formulacija opisanih u Tablici 4, gore. U svaku od obrađenih skupina uključeno je po 16 životinja. Životinje su 21 dan nakon cijepljenja izložene virulentnom terenskom izolatu M.hyo. Životinje su nekropsirane 28 dana nakon izlaganja, a zatim su pluća izvađena i bodovana na konsolidaciju konzistentnu s infekcijom bakterijom M.hyo. Primarni kriterij za zaštitu od izlaganja bakteriji M.hyo bili su bodovi plućne konsolidacije. Općenito je prihvaćeno da postoji odnos između veličine plućnih lezija uzrokovanih enzootskom pneumonijom i štetnog učinka na stopu rasta. Tablica 5, niže, prikazuje bodove plućnih lezija za odgovarajuće obrađene skupine. Statistički značaj određen je Analizom miješanog modela plućnih bodova za svaku skupinu.
Tablica 5
Rezultati za plućne lezije
[image]
Prema Tablici 5, gore, rezultati s antigenima iz M.hyo iz različitih nizvodnih postupaka ukazuju da se sva eksperimentalna cjepiva osim T04 značajno razlikuju od placeba. Ti rezultati za lezije uzrokovane bakterijom M.hyo prikazani su grafički na Slici 1. Kao što je prikazano na Slici 1, T04 daje neprihvatljive rezultate. Sve druge obrade značajno su se razlikovale od placeba (T01). Bodovi plućne konsolidacije ukazuju da T02, T03 i T09-T11 pružaju najdjelotvorniju zaštitu od izlaganja bakteriji M.hyo.
Relativna potentnost eksperimentalnih cjepiva protiv p46 procijenjena je uz pomoć sendvič enzimski vezanog imunosorpcijskog testa s dva protutijela (DAS ELISA). Rezultati DAS ELISA-e na p46 prikazani u Tablici 5, gore, ukazuju da sva eksperimentalna cjepiva nadilaze ciljanu potentnost. Uz to, relativna potentnost protiv p46 je ili zadržana ili je povećana tijekom skladištenja cjepiva u trajanju od mjesec dana (podaci nisu prikazani). Primijećeno povećanje potentnosti s vremenom opaženo je za centrifugirane antigene, osim za antigene izložene toplini. Bez želje za ograničavanje na bilo koju teoriju, vjerojatno je da se "leševi" stanica raspadnu s vremenom i otpuste više membranski vezanog antigena p46 u slučaju centrifugiranih antigena.
Primjer 6
Procjenjivanje kompatibilnosti eksperimentalnih cjepiva protiv M.hyo s antigenom iz PCV2
Ta studija je provodena kako bi se procijenilo kompatibilnost eksperimentalnih cjepiva protiv M.hyo s antigenima iz M.hyo iz različitih nizvodnih postupaka s antigenom iz PCV2. Eksperimentalne cjepivne formulacije protiv M.hyo opisane su u Tablicama 4 i 5, gore. Opažene relativne potentnosti tih cjepiva protiv p46 prikazane su u Tablici 5, gore. Svako od tih eksperimentalna cjepiva protiv M.hyo je kombinirano s antigenom iz PCV2. U ovom primjeru antigen iz PCV2 je bio usmrćeni kimerni virus PCV tip 1-tip 2 (Fostera PCV) pripravljen kao što je opisano gore, u Primjeru 2. Pripravci su sadržavali kimerni virus u početnoj razini od otprilike 1,6 ≤ RP, gdje je RP jedinica relativne potentnosti određene ELISA-om na PCV2 za kvantificiranje antigena (test na potentnost in vitro) u usporedbi s djelotvornim referentnim cjepivom.
Eksperimentalne kombinacijske formulacije protiv M.hyo i PCV2 su procijenjene ELISA-om na PCV2. Rezultati su prikazani na Slici 2. Kao što je prikazano na Slici 2, samo pripravci s antigenom iz M.hyo iz sljedećih nizvodnih postupaka su bili kompatibilni s antigenom iz PCV2: Ultrafiltriranje i centrifugiranje (T04 i T05), Centrifugiranje (T06 i T07), Centrifugiranje i grijanje (T08) i Supernatant obrađen proteinom A (T10). Od tih, supernatant M.hyo obrađen proteinom A je bio najkompatibilniji s antigenom iz PCV2 usporedbi s placebom kao kontrolom koja je sadržavala kimerni virus i adjuvans Amphigen, no ne i antigen iz M.hyo. Razina kimernog virusa PCV u supernatantu obrađenom proteinom A bila je 1,5 RP u usporedbi s 1,69 RP za placebo. Stoga je zaključeno da imunološke interferencije između topljivog pripravka antigena iz M.hyo obrađenog proteinom A i antigena iz PCV2 kimernog virusa nema ili je minimalna.
Djelotvornost in vivo supernatanta M.hyo obrađenog proteinom A prikazana u Primjeru 5, gore, zajedno s rezultatima opisanim u ovom primjeru ukazuju da bi supernatant obrađen proteinom A mogao biti djelotvorna platforma za kombinacije protiv M.hyo i PCV2.
Primjer 7
Procjenjivanje djelotvornosti protiv PCV2 kombinacijskog cjepiva protiv PCV2 i M.hyo u jednoj bočici u formulacijama s različitim adjuvansima
Ta studija je osmišljena kako bi se procijenilo djelotvornost protiv PCV2 u kombinacijskom cjepivu protiv PCV2 i M.hyo u jednoj bočici u različitim adjuvantnim formulacijama. U ovom primjeru antigen iz PCV2 je bio usmrćeni kimerni virus PCV tip 1-tip 2 (Fostera PCV). Kimerni virus kombiniran je s topljivim pripravkom antigena iz M.hyo koji uglavnom ne sadrži IgG (tj. supernatant obrađen proteinom A).
Obrada tekućina:
Inaktivirana M.hyo fermentacijska tekućina (opisana gore, u Primjeru 1) obrađena je za svaku naznačenu skupinu na sljedeći način.
T02-T04: Cijela fermentacijska tekućina koja sadrži žive stanice bakterije M. hyopneumoniae (opisano gore) centrifugirana je na ~20.000 × g (Sorvall RC5B), a supernatant je prikupljen i steriliziran kroz 0,2 µM filtar. Sefaroza s proteinom A (parcijalni broj 17-5199-03, GE Healthcare) pakirana je u kromatografsku kolonu od 1 l. Nakon uklanjanja pufera za skladištenje i obrade s 2 kolonska volumena 1M octene kiseline, smola je uravnotežena s 5 kolonskih volumena pufera 50 mM NaPO4/1M NaCl, pH 7,04. Približno 2 l pročišćenih odnosno filtriranih tekućina koje sadrže antigen iz bakterije M. hyopneumoniae je propušteno kroz smolu s proteinom A uz brzinu protoka od 100 cm na sat. Propuštena tekućina je prikupljena i sterilizirana kroz 0,2 µM filtar.
T05: To je pozitivna kontrola, koja odgovara Fostera-inoj formulaciji sličnoj onoj s PCV-om (bez antigena iz M.hyo). Razina kimernog virusa u toj Fostera-inoj formulaciji sličnoj onoj s PCV-om bila je približna formulacijskim razinama s najmanjom imunizirajućom dozom (MID). Eksperimentalna cjepiva protiv PCV2 i M.hyo sadrže kimerni virus u sličnim formulacijskim razinama.
Sva eksperimentalna cjepiva protiv PCV2 i M.hyo formulirana su s različitim adjuvantnim formulacijama. Eksperimentalne cjepivne formulacije pripravljene su s antigenima iz M.hyo obrađenim prema obradama T02-T04, gore. Uz to, Obrada T01 odgovara placebu (sterilna fiziološka otopina).
Sva cjepiva su standardizirana ELISA-om na p46 i konzervirana tiomersalom. Te eksperimentalne formulacije opisane su u Tablici 6, niže, gdje simbol * prikazuje antigen iz M.hyo iz globalnog M.hyo sjemena, supernatanta obrađenog proteinom A, a simbol ** prikazuje seriju Ispitivanog veterinarskog proizvoda (IVP).
Tablica 6
Eksperimentalne cjepivne formulacije protiv PCV2 i M.hyo
upotrijebljene u studiji djelotvornosti protiv PCV2
[image]
Prasad stara 3 tjedna je intramuskularno inokulirana jednom dozom različitih cjepivnih formulacija opisanih u Tablici 6 gore. U svaku od obrađenih skupina uključeno je po 16 životinja. Životinje su 21 dan nakon cijepljenja izložene virulentnom terenskom izolatu PCV2.
Slika 3 je dijagram koji prikazuje rezultate viremije za PCV2 (kvantitativni PCR za PCV2) opažene uz različite adjuvantne platforme. Opaženo je da je viremija PCV2 upotrijebljena kao primarna varijabla djelotvornosti. Rezultati viremije za PCV2 su prikazani kao broj kopija DNA na ml. Kao što je prikazano na Slici 3, sve obrade su imale značajno manju viremiju u usporedbi s placebom 28., 35. i 42. dana (izlaganje je provedeno 21. dan). 10%-tno SP-ulje kao adjuvans imalo je značajno manju viremiju u usporedbi s 5%-tnim Amphigen-om 28. i 35. dana. 5%-tni Amphigen i 5%-tni SLCD kao adjuvans imali su značajno manju viremiju u usporedbi s 5%-tnim Amphigen-om 28. i 35. dana. 20%-tni SLCD kao adjuvantna platforma imao je značajno manju viremiju u usporedbi s 5%-tnim Amphigen-om 28., 35. i 42. dana.
Serologija PCV2, izlučivanje PCV2 izmetom, nazalno izlučivanje PCV2, stanični imunosni (CMI) odgovori, gubitak limfnih stanica, te imunohistokemija (IHC) također su praćeni kao sekundarne varijable djelotvornosti. Ti rezultati ovdje će biti opisani niže.
Slika 4 je dijagram koji prikazuje rezultate ELISA-e na PCV2 1., 20. i 42. dana studije (izlaganje je provedeno 21. dan). Status svakog uzorka izražen je kao omjer uzorak/pozitivno (S/P). Kao što je prikazano na Slici 4, 20%-tni SLCD je bio jedina obrada koja se značajno razlikovala od placeba (T01) i 20. dana i 42. dana. Isto tako, 5%-tni Amphigen je bio jedina obrada koje se nije značajno razlikovala od placeba 20. dana.
Slika 5 je dijagram koji prikazuje izlučivanje PCV2 izmetom dobiveno uz obrade T02-T04 u usporedbi s placebom (T01). Ti rezultati su izraženi kao broj kopija DNA iz PCV2 na ml. Rezultati na Slici 5 ukazuju da su sve obrade imale značajno manje izlučivanje izmetom usporedbi s placebom 42. dana. Uz to, 5%-tni Amphigen i 5%-tni SLCD (T04) su imali značajno manje izlučivanje izmetom u usporedbi s 5%-tnim Amphigen-om (T03) 42. dana. Između obrada nisu opažene nikakve druge razlike.
Slika 6 je dijagram koji prikazuje nazalno izlučivanje PCV2 dobiveno uz obrade T02-T04 u usporedbi s placebom (T01). Ti rezultati su izraženi kao broj kopija DNA iz PCV2 na ml. Rezultati na Slici 6 ukazuju da su sve obrade imale značajno manje nazalno izlučivanje usporedbi s placebom 42. dana. Uz to, 20%-tni SLCD (T05) had značajno manje nazalno izlučivanje u usporedbi s 5%-tnim Amphigen-om (T03) 42. dana. Između obrada nisu opažene nikakve druge razlike.
Slika 7 (A i B) su dva dijagrama koji prikazuju rezultate ispitivanja na interferon-gama (IFN-γ) u kojem se mjeri stanične imunosne (CMI) odgovore specifične za PCV2. CMI rezultati su prikazani nakon cijepljenja/prije izlaganja (Slika 7A), te nakon cijepljenja/nakon izlaganja (Slika 7B). U tim dijagramima stimulacije od 5 × 106 stanica su smatrane značajnima (...). Sva eksperimentalna cjepiva protiv PCV2 i M.hyo su dala opazivi IFN-γ odgovor nakon cijepljenja. 10%-tno SP-ulje (T02) dalo je najjači IFN-γ odgovor nakon cijepljenja. 20%-tni SLCD (T05) potaknuo je raniji odgovor, no najslabiji odgovor 20. dana. Opažen je jak odgovor nakon izlaganja, osobito u slupini s placebom. Uz to, odgovor nakon izlaganja je bio slabiji kod cijepljenih obrađenih skupina prasadi u usporedbi sa skupinom s placebom.
Tablica 7, niže, prikazuje gubitak limfnih stanica dobiven uz eksperimentalne obrade u usporedbi s placebom.
Tablica 7
Histopatologija PCV2 (gubitak limfnih stanica)
[image]
Rezultati iznijeti u Tablici 7, gore, ukazuju da su sva cjepiva pružila jaku zaštitu od gubitka limfnih stanica. Isto tako, nisu opažene nikakve statistički značajne razlike između obrada s cjepivom. Tablica 8, niže, prikazuje imunohistokemiju dobivenu uz eksperimentalne obrade u usporedbi s placebom.
Tablica 8
Histopatologija PCV2 (imunohistokemija)
[image]
Rezultati iznijeti u Tablici 8, gore, ukazuju da su sva cjepiva pružila jaku zaštitu od koloniziranja virusa PCV2, što je dokazano imunohistokemijom. Isto tako, nisu opažene nikakve statistički značajne razlike između obrada s cjepivom.
Za zaključak, rezulati prikazani u ovom primjeru ukazuju da topljivi pripravak antigena iz M.hyo ne interferira s djelotvornošću protiv PCV2. Rezultati također ukazuju da sve eksperimentalne cjepivne formulacije protiv PCV i M.hyo osiguravaju djelotvornost protiv izlaganja virusu PCV2. Uz to, rezultati ukazuju da postoje neke statističke i numeričke razlike kod različitih adjuvantnih formulacija, gdje 10%-tno SP-ulje daje najveću djelotvornost.
Primjer 8
Procjenjivanje djelotvornosti protiv M.hyo kombinacijskog cjepiva protiv PCV2 i M.hyo u jednoj bočici u formulacijama s različitim adjuvansima
Ta studija je osmišljena kako bi se procijenilo djelotvornost protiv M.hyo kombinacijskog cjepiva protiv PCV2 i M.hyo u jednoj bočici s različitim adjuvantnim formulacijama. Antigen iz M.hyo kombiniran je sa svinjskim cirkovirusom (usmrćeni kimerni virus tip 1-tip 2 odnosno PCV1-2) u jednoj bočici.
Obrada tekućina:
Inaktivirana M.hyo fermentacijska tekućina (opisana gore, u Primjeru 1) obrađena je za svaku naznačenu skupinu na sljedeći način.
T02-T04: Te obrade bile su iste kao one opisane za obrađene skupine T02-T04 u Primjeru 7, gore.
T05: Ta je formulirana s inaktiviranim stanicama bakterije M.hyo (M.hyo bakterin) kao što je opisano u Primjeru 1, gore, pod naslovom "Fermentiranje i inaktiviranje".
Sva eksperimentalna cjepiva protiv PCV2 i M.hyo formulirana su s različitim adjuvantnim formulacijama. Eksperimentalne cjepivne formulacije pripravljene su s antigenima iz M.hyo obrađenim prema obradama T02-T04. Uz to, Obrada T01 odgovara placebu (sterilna fiziološka otopina). Obrada T05 je pozitivna kontrola, koja odgovara zastarjelom cjepivu RespiSure®, koje je cjepivo na bazi M.hyo bakterina (Pfizer Animal Health).
Te eksperimentalne formulacije opisane su u Tablici 9, niže, gdje simbol * prikazuje antigen iz M.hyo iz globalnog M.hyo sjemena, supernatanta obrađenog proteinom A, a simbol ** prikazuje seriju Ispitivanog veterinarskog proizvoda (IVP).
Tablica 9
Eksperimentalne cjepivne formulacije protiv PCV2 i M.hyo upotrijebljene u
studiji djelotvornosti protiv M.hyo u formulacijama s različitim adjuvansima
[image]
Prasad stara 3 tjedna je intramuskularno inokulirana jednom dozom različitih cjepivnih formulacija opisanih u Tablici 9 gore. Četrnaest životinja je uključeno i u skupinu s placebom i u skupinu s 10%-tnim SP-uljem, trinaest životinja je uključeno u pozitivnu kontrolnu skupinu, a šesnaest životinja je uključeno i u skupinu s 5%-tnim Amphigen-om i u skupinu s 5%-tnim Amphigen-om i 5%-tnim SLCD-om.
Životinje su 21 dan nakon cijepljenja izložene virulentnom terenskom izolatu M.hyo. Životinje su nekropsirane 28 dana nakon izlaganja, a zatim su pluća izvađena i bodovana na konsolidaciju konzistentnu s infekcijom bakterijom M.hyo. Tablica 10, niže, prikazuje bodove plućnih lezija za odgovarajuće obrađene skupine. Statistički značaj određen je Analizom miješanog modela plućnih bodova za svaku skupinu.
Tablica 10
Plućne lezije uzrokovane bakterijom M.hyo
[image]
Kao što je naznačeno u Tablici 10, gore, skupina s placebom je imala srednju vrijednost bodova plućnih lezija od 13,1%, u usporedbi s obrađenim skupinama s 10%-tnim SP-uljem i 5%-tnim Amphigen-om koje su imale srednju vrijednost plućnih bodova od 4,3% odnosno 4,7%. Obje formulacije s 10%-tnim SP-uljem i 5%-tnim Amphigen-om su smanjile i/ili spriječile plućne lezije. Prema tome, eksperimentalna cjepiva protiv PCV i M.hyo formulirana s 10%-tnim SP-uljem ili 5%-tnim Amphigen-om se smatra djelotvornima. Antigen iz PCV2 očigledno nije interferirao s djelotvornošću protiv M.hyo tih formulacija.
Nasuprot tome, skupina s 5%-tnim Amphigen-om i 5%-tnim SLCD-om je imala srednju vrijednost bodova plućnih lezija od 12,0%, što je bio neprihvatljivi rezultat, jer se nije razlikovao od placeba. Prema tome, eksperimentalno cjepivo protiv PCV i M.hyo formulirano s 5%-tnim Amphigenom i 5%-tnim SLCD-om se ne smatra djelotvornim.
Opaženo je da zbog smanjenog broja životinja i visoke varijabilnost u bodovima plućna lezija u ovoj studiji ne može definitivno dokazati statistički učinak obrade. Zato je odlučeno da treba osmisliti drugu studiju da se ispita djelotvornost protiv M.hyo eksperimentalnih formulacija protiv PCV i M.hyo u 10%-tnom SP-ulju. Ta ponovljena studija prikazana je u Primjeru 9, niže.
Primjer 9
Procjenjivanje djelotvornosti protiv M.hyo kombinacijskog cjepiva protiv PCV2 i M.hyo u jednoj bočici u 10%-tnom SP-ulju
Ta studija je dokaz koncepta osmišljenog za procjenu djelotvornost frakcije M.hyo kod četiri eksperimentalna cjepiva protiv PCV2 i M.hyo (serije L0711RK11, L0711RK12, L0711RK13 i L0711RK14 u Tablici 11, niže), pripravljenih različitim proizvodnim postupcima za M.hyo u kojima se upotrebljava protein A za uklanjanje IgG u usporedbi s kontrolnim cjepivima pripravljenim standardim proizvodnim postupkom za M.hyo. Svako od ta četiri eksperimentalna cjepiva protiv PCV2 i M.hyo sadržavalo je 10%-tno SP-ulje kao adjuvans.
Obrada tekućina:
T02: Inaktivirani antigen iz bakterije M. hyopneumoniae, kao što je opisano pod "Fermentiranje i inaktiviranje" u Primjeru 1, gore.
T03 i T04: Formulirano s inaktiviranim stanicama bakterije M. hyopneumoniae, kao što je opisano pod "Fermentiranje i inaktiviranje" u Primjeru 1, gore.
T05: Obrada medija upotrijebljenog za uzgoj bakterije M. hyopneumoniae proteinom A. PPLO (od svinjskog srca) načinjen je prema proizvođačevim uputama (tj. 21 g/l), a otopina ekstrakta kvasca je načinjena u 21 g/l u USP. Otopina ekstrakta kvasca je dodana u PPLO od 6,25%, a smjesa je sterilizirana grijanjem do 121 °C u trajanju od ≥ 30 minuta. Cistein-hidroklorid je pripravljen u 90 g/l, te steriliziran filtriranjem. Otopina dekstroze načinjena je dodavanjem 450 g dekstroze po litri USP vode, uz naknadno steriliziranje toplinom. Kako bi se pripravilo konačni medij, u osnovni medij je dodan svinjski serum od 10%, zatim cistein od 0,01% i dekstroza od 1,0%. Protutijela u kompletnim PPLO medijima uklonjena su obradom proteinom A. Ukratko, jedan l Sefaroze s proteinom A (parcijalni broj 17-5199-03 GE Healthcare) pakiran je u staklenu kolonu (10 × 11,5 cm). Nakon uklanjanja pufera za skladištenje, kolona je obrađena s 2 kolonska volumena 1M octene kiseline. Smola je uravnotežena s 5 kolonskih volumena pufera 50 mM NaPO4/1M NaCl (pH 7,0). Petnaest l kompletnog PPLO medija dodano je na smolu pri brzini linearnog protoka od 140 cm na sat. Tekućina koja je prošla kroz kolonu je prikupljena, te sterilizirana filtriranjem kroz 0,2 mikrometarski filtar (Sartorius). Obrađeni medij je upotrijebljen za razmnožavanje stanica bakterije M. hyopneumoniae, kao što je opisano pod "Fermentiranje i inaktiviranje", gore. Cijela inaktivirana kultura (uključujući stanice) je formulirana u konačno cjepivo.
T06: Inaktivirane stanice bakterije M. hyopneumoniae pripravljene su kao što je opisano pod "Fermentiranje i inaktiviranje" u Primjeru 1, gore. Inaktivirana fermentacijska tekućina centrifugirana je na ~20.000 × g (Sorvall RC5B) 30 minuta, a supernatant je steriliziran 0,2 µM filtriranjem. Sto i petnaest ml smole s proteinom A (parcijalni broj 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) pakirano je u kromatografsku kolonu (5 × 6 cm). Nakon uklanjanja pufera za skladištenje i obrade s 2 kolonska volumena 1M octene kiseline, smola je uravnotežena s 5 kolonskih volumena pufera 50 mM NaPO4/1M NaCl, pH 7,01. Približno 1,2 l pročišćenih odnosno filtriranih tekućina koje sadrže antigen iz bakterije M. hyopneumoniae je propušteno kroz smolu uz brzinu protoka od 120 cm na sat. Propuštena tekućina je prikupljena i sterilizirana kroz 0,2 µM filtar.
T07: Inaktivirane stanice bakterije M. hyopneumoniae pripravljene su kao što je opisano pod "Fermentiranje i inaktiviranje" u Primjeru 1, gore. Inaktivirana fermentacijska tekućina je pročišćena filtriranjem uz tangencijalni protok. Ukratko, polieter-sulfonski filtar (GE HealthCare, parcijalni broj 56-4102-71) s nominalnom veličinom pora od 0,2 µM steriliziran je 0,5N otopinom natrijevog hidroksida, a zatim dobrano ispran sterilnom USP vodom. Inaktivirana tekućina iz mikoplazmatske kulture dodana je u aparat pri ciljanoj brzini recirkulacije od 14,6 l u minuti i transmembranski tlak od 2-3,4 PSI (13,8-23,4 kPa). Pročišćavanje je provedeno na sobnoj temperaturi. Filtarski permeat je prikupljen i uskladišten na 2-8 °C do daljnje obrade. Sto i petnaest ml smole s proteinom A (parcijalni broj 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) pakirano je u kromatografsku kolonu (5 × 6 cm). Nakon uklanjanja pufera za skladištenje i obrade s 2 kolonska volumena 1M octene kiseline, smola je uravnotežena s 5 kolonskih volumena pufera 50 mM NaPO4/1M NaCl, pH 7,01. Približno 2,3 l pročišćenih odnosno filtriranih tekućina koje sadrže antigen iz bakterije M. hyopneumoniae je propušteno kroz smolu uz brzinu protoka od 120 cm na sat. Propuštena tekućina je prikupljena i sterilizirana kroz 0,2 µM filtar.
T08: Inaktivirane stanice bakterije M. hyopneumoniae pripravljene su kao što je opisano pod "Fermentiranje i inaktiviranje", gore. Inaktivirana fermentacijska tekućina centrifugirana je na ~20.000 × g (Sorvall RC5B) 30 minuta, a supernatant je steriliziran 0,2 µM filtriranjem. Sto i petnaest ml Sefaroze s proteinom A (parcijalni broj 17-5199-03 GE Healthcare) pakirano je u kromatografsku kolonu (5 × 6 cm). Nakon uklanjanja pufera za skladištenje i obrade s 2 kolonska volumena 1M octene kiseline, smola je uravnotežena s 5 kolonskih volumena pufera 50 mM NaPO4/1M NaCl, pH 7,01. Približno 1,2 l pročišćenih odnosno filtriranih tekućina koje sadrže antigen iz bakterije M. hyopneumoniae je propušteno kroz smolu uz brzinu protoka od 120 cm na sat. Propuštena tekućina je prikupljena i sterilizirana kroz 0,2 µM filtar.
Eksperimentalne cjepivne formulacije pripravljene su s antigenima iz M.hyo obrađenim prema obradama T02-T08, gore. T02, T03 i T04 odgovaraju pozitivnim kontrolama. Uz to, Obrada T01 odgovara placebu (sterilna fiziološka otopina).
Te eksperimentalne formulacije opisane su u Tablici 11, niže. Antigen iz M.hyo odgovara antigenu iz M.hyo iz globalnog M.hyo sjemena, supernatanta obrađenog proteinom A. Informacije u stupcu "Obrada proteinom A" ukazuju je li supernatant M.hyo obrađen proteinom A prije ili nakon fermentiranja.
Tablica 11
Eksperimentalne cjepivne formulacije protiv PCV2 i M.hyo upotrijebljene
u studiji djelotvornosti protiv M.hyo, u SP-ulju kao adjuvansu
[image]
Prasad stara 3 tjedna je intramuskularno inokulirana jednom dozom različitih cjepivnih formulacija opisanih u Tablici 11, gore. U svaku obrađenu skupinu uključeno je po 18 prasadi. Životinje su 21 dan nakon cijepljenja izložene virulentnom terenskom izolatu M.hyo. Životinje su nekropsirane 28 dana nakon izlaganja, a zatim su pluća izvađena i bodovana na konsolidaciju konzistentnu s infekcijom bakterijom M.hyo. Slika 8 (A i B) prikazuje bodove plućnih lezija za odgovarajuće obrađene skupine. Statistički značaj određen je Analizom miješanog modela plućnih bodova za svaku skupinu.
Rezultati plućnih lezija opisani na Slikama 8A i 8B ukazuju da su od svih obrada samo dvije (T07 i T08) imale 100% prasadi u kategoriji s <5% plućnih lezija. Opaženo je da u ovoj studiji postoji velika statistička razlika.
Rezultati u ovom primjeru dokazuju značajnu djelotvornost protiv M.hyo eksperimentalne formulacije protiv PCV2 i M.hyo u jednoj bočici u kojoj se upotrebljava supernatant M.hyo obrađen proteinom A i SP-ulje kao adjuvans. Uz to, Primjer 7, gore, dokazuje djelotvornost protiv PCV2 formulacije protiv PCV2 i M.hyo u jednoj bočici u kojoj se upotrebljava supernatant M.hyo obrađen proteinom A i SP-ulje kao adjuvans. Sveukupno, dokazana je djelotvornost i protiv M.hyo i protiv PCV2 kombinacija protiv PCV2 i M.hyo u jednoj bočici u kojima se upotrebljava supernatant obrađen proteinom A M.hyo.
Primjer 10
Sigurnost in vivo eksperimentalnih cjepiva protiv PCV2 i M.hyo
Ta studija je provodena kako bi se procijenilo sigurnost in vivo eksperimentalnih cjepiva protiv PCV2 i M.hyo formuliranih za najvišu dozu antigena u različitim adjuvantnim formulacijama kod životinje domaćina prilikom davanja kod najmanje starosti (3 tjedna). Procijenjene su različite adjuvantne platforme kako bi se odredilo koja od tih platformi daje prihvatljivi sigurnosni profil na bazi temperature, reakcije na mjestu injekcije i kliničkih opažanja. Formulacija s 20%-tnim SLCD-om i 10%-tnim SP-uljem je upotrijebljena kao pozitivna ("nesigurna") kontrola zbog povijesnih problema s reakcijama na mjestu injekcije opaženim kod te ispitivane skupine i drugih.
Obrada tekućina:
Sva cjepiva su pripravljena s inaktiviranim antigenom iz bakterije M. hyopneumoniae, kao što je opisano pod "Fermentiranje i inaktiviranje" u Primjeru 1. Upotrijebljena je cijela glavnina antigena iz M.hyo jer se znalo da sadrži topljive i netopljive antigene iz M.hyo, uz imunoglobuline i imunokomplekse koje će se ukloniti obradom proteinom A. Razuman je zaključak da će uklanjanje netopljivog staničnog taloga, te immunuoglobulina i imunokompleksa samo dodatno povećati sigurnost cjepivnih formulacija. Cilj ove studije bio je strogo ispitivanje sigurnosti različitih adjuvantnih formulacija koje sadrže antigen iz PCV2 i antigen iz M.hyo. Antigeni iz PCV2 i M.hyo formulirani su za najveće razine otpuštanja kako bi se dodatno procijenilo sigurnost. Te eksperimentalne formulacije opisane su u Tablici 12, niže. IVP se odnosi na Ispitivani veterinarski proizvod (IVP).
Tablica 12
Eksperimentalne cjepivne formulacije protiv PCV2 i M.hyo upotrijebljene u studiji sigurnosti
[image] * Antigen iz M.hyo = iz globalnog sjemena M.hyo (cijela glavnina antigena).
Sigurnosni parametri upotrijebljeni u ovoj studiji su bili profil rektalne temperature i reakcija na mjestu injekcije. Rezultati ove studije ukazuju da sve kandidatske adjuvantne platforme daju prihvatljivi sigurnosni profil u terminima profila rektalne temperature i kliničkih opažanja (rezultati nisu prikazani). Samo 20%-tni SLCD i 10%-tno SP-ulje (tj. pozitivna kontrola) se značajno razlikovalo od placebnog cjepiva i uzrokovalo je više jakih reakcija na mjestu injekcije (rezultati nisu prikazani).
Primjer 11
Priprava antigena iz M.hyo obrađenog proteinom A u ključnim studijama
Slika 9 je blok dijagram koji prikazuje jednu izvedbu proizvodnog postupka upotrijebljenog za pripravu antigena iz M.hyo obrađenog proteinom A i kompatibilnog s PCV2. Inaktivirane cijele kulture M.hyo su pročišćene od stanica filtriranjem tangencijalnim protokom. Ukratko, polieter-sulfonski filtar (GE Healthcare, parcijalni broj 56-4102-49) s nominalnom veličinom pora od 0,45 µM steriliziran je 0,5N otopinom natrijevog hidroksida, a zatim dobrano ispran sterilnom USP vodom. Inaktivirana tekućina iz mikoplazmatske kulture dodana je u aparat pri ciljanoj brzini recirkulacije od 11,0 l u minuti i transmembranski tlak od ~5 PSI (34,5 kPa). Pročišćavanje je provedeno na sobnoj temperaturi. Filtarski permeat je prikupljen i uskladišten na 2-8 °C do daljnje obrade.
Nakon čišćenja tekućine koje sadrže antigene su obrađene smolom s proteinom A kako bi se smanjilo razine protutijela. Ukratko, MAbSelect smola s proteinom A (GE Healthcare) je pakirana u staklenu kolonu do visine od 12 cm. Smola je uravnotežena s 5 kolonskih volumena pufera od 50 mM natrijevog fosfata 250 mM NaCl (pH 7,0). Tekućina s antigenima, ekvivalentna 10 kolonskih volumena, dodana je na smolu pri brzini linearnog protoka od 100 cm na sat. Tekućina koja je prošla kroz kolonu je prikupljena, te sterilizirana filtriranjem kroz 0,2 mikrometarski filtar. Kolona je regenerirana propuštanjem 3 kolonska volumena 25 mM otopine acetata na pH 3,7, a zatim 4 kolonska volumena 1M otopine octene kiseline. Razine protutijela protiv PCV2 i antigena iz bakterije M. hyopneumoniae su izmjerene u konačnoj antigenskoj tekućini uz pomoć ELISA-e na protutijelo specifično za PCV2 odnosno ELISA-e za kvantificiranje antigena p46.
Primjer 12
Procjenjivanje virucidne aktivnosti protiv virusa PRRS
Studije prikazane u ovom primjeru su osmišljene za procijenjivanje različitih adjuvantnih platforma za virucidnu aktivnost protiv virusa PRRS. Početni eksperimenti usmjereni samo na adjuvans (tj. formulacije ne sadrže antigene iz PCV ili iz M.hyo). Procjena adjuvansa na virucidna aktivnost protiv PRRS prikazana je na Slici 10. Preliminarna procjena virucidnosti ukazuje da su 10%-tno SP-ulje, 0,2%-tni Carbopol i 2,5%-tni Amphigen nevirucidni za virus PRRS. Nasuprot tome, pokazalo se da je 20%-tni SLCD kao adjuvans virucidan za virus PRRS.
Provedene su daljnje studije kako bi se procijenilo jesu li formulacije protiv PCV i M.hyo adjuvantirane s različitim adjuvantnim platformama nevirucidne za virus PRRS. Ti rezultati su prikazani u Tablici 13, gdje simbol * ukazuje na serije cjepiva virucidne za PRRSV.
Tablica 13
Rezultati ispitivanja na virucidnost protiv virusa PRRS za različite formulacije
[image] *Označuje virucidnost (>0,7 logaritamski gubitak)
A - Kontrola u ispitivanju na virucidnost GMT ~5,53 log/ml
B - Kontrola u ispitivanju na virucidnost GMT ~6,42 log/ml
Rezultati iznijeti u Tablici 13, gore, ukazuju da je 10%-tno SP-ulje nevirucidno za virus PRRS. Daljnje serije cjepiva protiv PCV i M.hyo su pripravljene s 10%-tnim SP-uljem kao adjuvansom (Tablica 14). Antigenska potentnost tih serija cjepiva uspoređena je s Referentnom serijom cjepiva protiv PCV i M.hyo (L1211RK15) koja sadrži 0,688% 20 × koncentrata antigena iz PCV2 (pripravljenog kao što je opisano u Primjeru 2); i 9,40% antigena iz M.hyo pripravljenog kao što je opisano u Primjeru 11. Rezultati prikazani u Tablici 14, niže, dodatno dokazuju da je 10%-tno SP-ulje nevirucidno za virus PRRS. Svaka od vrijednosti za ispitivani uzorak u Tablici 14 je bila viša (znak +) od kontrole u ispitivanju na virucidnost, koja je imala geometrijsku sredinu titra (GMT) od otprilike 5,9 ± 0,5 log/ml.
Tablica 14
Rezultati ispitivanja virucidnosti za različite formulacije
protiv PCV i M.hyo adjuvantirane 10%-tnim SP-uljem
[image] Kontrolni GMT za ispitivanje virucidnosti ~ 5,9 ± 0,5 log/ml
Rezultati iznijeti u ovom primjeru pokazuju da je 10%-tno SP-ulje nevirucidno za virus PRRS. Rezultati iznijeti u ovom primjeru daljnje ukazuju da je formulacija protiv PCV i M.hyo adjuvantirana 10%-tnim SP-uljem bila među serijama cjepiva koje se smatralo nevirucidnim za virus PRRS (Tablica 13 i Tablica 14). Za zaključak, smatra se da je formulacija protiv PCV i M.hyo adjuvantirana 10%-tnim SP-uljem djelotvorna platforma za trovalentnu kombinaciju koja sadrži PCV, M.hyo i virus PRRS.
Primjer 13
Priprava kombinacijskog cjepiva protiv PCV, M.hyo i PRRS
Formulacija protiv PCV i M.hyo adjuvantirana adjuvantnom platformom nevirucidnom za virus PRRS (vidjeti Tablice 13 i 14, gore) se daje kao tekući pripravak spreman za upotrebu u jednoj bočici. U toj formulaciji protiv PCV i M.hyo u jednoj bočici upotrebljava se supernatant obrađen proteinom A M.hyo. Djelotvornost i protiv M.hyo i protiv PCV2 je dokazana za takve formulacije protiv PCV2 i M.hyo u kojima se upotrebljava supernatant M.hyo obrađen proteinom A (vidjeti Primjere 7-9). U ovom primjeru tu dvovalentnu formulaciju protiv PCV2 i M.hyo se kombinira s jednovalentnim antigenom iz virusa PRRS.
U jednoj izvedbi kombinacija protiv PCV i M.hyo u 10%-tnom SP-ulju, koja odgovara jednoj od serija cjepiva L0711RK11, L0711RK12, L0711RK13 i L0711RK14 u Tablici 11, gore, se daje kao tekući pripravak spreman za upotrebu u jednoj bočici. Rezultati iznijeti u Primjeru 12, gore, pokazuju da je 10%-tno SP-ulje nevirucidno za virus PRRS. Primjer 12 također pokazuje da su formulacije protiv PCV2 i M.hyo adjuvantirane 10%-tnim SP-uljem bile među serijama cjepiva koje se smatralo nevirucidnim za virus PRRS. U ovom primjeru takav tekući pripravak protiv PCV2 i M.hyo u jednoj bočici je upotrijebljen za rehidriranje liofiliziranog pripravka genetički modificiranog živog virusa PRRS sadržanog u drugoj bočici, tako da su svi antigeni sadržani u jednoj bočici prije primjene na prasetu pogodne starosti (primjerice starom 3 tjedna ili starijem).
U jednoj izvedbi virus PRRS ima genomski slijed koji odgovara SEQ ID NO: 16 ili njegovoj varijanti. U daljnjoj izvedbi virus PRRS upotrijebljen u trovalentnom pripravku je izolat virusa PRRS označen kao ISU-55, deponiran u ATCC pod pristupnim brojem VR 2430. U ovoj specifikaciji opisane su pogodne količine odgovarajućih antigena. Poželjno je da se sve antigene primijeni u jednoj dozi na prasetu.
Primjer 14
Procjenjivanje djelotvornosti protiv M.hyo kombinacijskog cjepiva protiv PCV2, M.hyo i PRRS, nakon čega slijedi izlaganje virusu PCV2
Ova studija osmišljena je za procjenjivanje djelotvornosti frakcije s usmrćenim kimernim virusom PCV1-2 eksperimentalnog kombinacijskog cjepiva protiv PCV2, M.hyo i PRRS, primijenjenog jednom intramuskularno kod prijemčive prasadi stare 3 tjedna, te izložene virulentnom izolatu PCV2 tri tjedna nakon cijepljenja. Ta trovalentna cjepiva sadrže usmrćeni kimerni svinjski cirkovirus tip 1-tip 2, cjepivo s respiratornim oblikom modificiranog živog virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma i ekstrakt bakterije Mycoplasma hyopneumoniae.
Ovo trovalentno cjepivo pripravljeno je rehidriranjem liofiliziranog genetički modificiranog živog virusa PRRS (PRRS-MLV) tekućom formulacijom u jednoj bočici koja sadrži kombinaciju usmrćenog kimernog svinjskog cirkovirusa tip 1-tip 2 i ekstrakta bakterije M.hyo (PCV2 i M.hyo), adjuvantiranu 10%-tnim SP-uljem (vidjeti Primer 13, gore). Eksperimentalne formulacije primijenjene tijekom ove studije opisane su u Tablici 15, niže.
Tablica 15
Eksperimentalne cjepivne formulacije protiv PCV2, M.hyo i PRRS
upotrijebljene u studiji djelotvornosti protiv PCV2
[image]
Prasad stara 3 tjedna intramuskularno je inokulirana jednom dozom različitih cjepivnih formulacija opisanih u Tablici 15, gore. U svaku od obrađenih skupina uključeno je po 24 životinje. Životinje su 21 dan nakon cijepljenja izložene virulentnom terenskom PCV2a.
Rezultati viremije za PCV2 (kvantitativni PCR za PCV2) opaženi u ovoj studiji prikazani su na Slici 11. Opaženo je da je viremija PCV2 upotrijebljena kao primarna varijabla djelotvornosti. Rezultati viremije za PCV2 prikazani su kao broj kopija DNA na ml. Kao što je prikazano na Slici 11, sve obrade su imale značajno manju viremiju (P < 0,001) u usporedbi s placebom 28., 35. i 42. dana (izlaganje je provedeno 21. dan).
Serologija PCV2, izlučivanje PCV2 izmetom, nazalno izlučivanje PCV2, gubitak limfnih stanica, te imunohistokemija (IHC) također su praćeni kao sekundarne varijable djelotvornosti. Ti rezultati ovdje će biti opisani niže.
Serološki rezultati prikazani su na Slici 12 koja prikazuje serološke rezultate ELISA–1., 7., 13., 20., 28, 35. i 42. dana studije (izlaganje je provedeno 21. dan). Status svakog uzorka izražen je kao omjer uzorak/pozitivno (S/P). Ti rezultati dokazuju da za razliku od skupine s placebom obje obrađene skupine imaju značajno veće titre protutijela protiv PCV2 nakon izlaganja (P < 0,0345).
Izlučivanje PCV2 izmetom dobiveno uz obrade T02 i T03 u usporedbi s placebom (T01) prikazano je na Slici 13. Ti rezultati izraženi su kao broj kopija DNA iz PCV2 po ml. Rezultati na Slici 13 ukazuju da su obrade T02 i T03 obje imale znatno manje izlučivanje izmetom (P < 0,0001) u usporedbi s placebom 35. i 42. dana.
Tablica 16, niže, prikazuje značajnu zaštitu od gubitka limfnih stanica dobivenu za eksperimentalnu obradu (T02) za razliku od placeba.
Tablica 16
Histopatologija PCV2 (gubitak limfnih stanica)
[image]
Rezultati prikazani u Tablici 17, niže, prikazuju značajnu zaštitu od histocitne zamjene dobivenu za eksperimentalnu obradu (T02) za razliku od placeba.
Tablica 17
Histopatologija PCV2 (histocitna zamjena)
[image]
Tablica 18, niže, prikazuje imunohistokemiju dobivenu uz eksperimentalne obrade u usporedbi s placebom.
Tablica 18
Histopatologija PCV2 (imunohistokemija)
[image]
Za zaključak, rezulati prikazani u ovom primjeru ukazuju da eksperimentalna cjepiva upotrijebljena u ovoj studiji osiguravaju zaštitu od izlaganja virusu PCV2. Obje razine potentnosti cjepiva osiguravaju značajnu zaštitu od primarne varijable kao i od koloniziranja PCV2. Međutim, skupina T02 također osigurava značajnu zaštitu od lezija uzrokovanih virusom PCV2 (gubitka limfnih stanica i histocitne zamjene).
Primjer 15
Procjenjivanje djelotvornosti protiv PCV2 kombinacijskog cjepiva protiv PCV2, M.hyo i PRRS, nakon čega slijedi izlaganje bakteriji M.hyo
Ova studija osmišljena je za procjenjivanje djelotvornosti frakcije s M.hyo eksperimentalnog kombinacijskog cjepiva protiv PCV2, M.hyo i PRRS, primijenjenog intramuskularno kod prijemčive prasadi stare 3 tjedna, te izložene virulentnom izolatu bakterije Mycoplasma hyopneumoniae tri tjedna nakon cijepljenja. Ta trovalentna cjepiva sadrže usmrćeni kimerni svinjski cirkovirus tip 1-tip 2, cjepivo s respiratornim oblikom modificiranog živog virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma i ekstrakt bakterije Mycoplasma hyopneumoniae.
Obrada tekućina:
Inaktivirana i izbistrena fermentacijska tekućina (opisano gore, u Primjeru 11) upotrijebljena je za svaku obrađenu skupinu na sljedeći način.
T01: Obrada negativne kontrole je cjepivo protiv PCV1-2 bez antigena iz bakterije M. hyopneumoniae koje je upotrijebljeno kao razrjeđivač za modificirano živo cjepivo protiv PRRSV.
T02: Inaktivirani antigen iz bakterije M. hyopneumoniae kombiniran je sa svinjskim cirkovirusom (usmrćeni kimerni virus tip 1-tip 2 odnosno PCV1-2) u jednoj bočici. Kombinacija protiv PCV1-2 i M.hyo upotrijebljena je kao razrjeđivač za modificirano živo cjepivo protiv PRRSV.
T03: Inaktivirani antigen iz bakterije M. hyopneumoniae, kao što je opisano gore, u Primjeru 11, uz dodatni korak koncentriranja antigena 20 × molekulskim filtriranjem kombiniran je sa svinjskim cirkovirusom (usmrćeni kimerni virus tip 1-tip 2 odnosno PCV1-2) u jednoj bočici. Kombinacija protiv PCV1-2 i M.hyo upotrijebljena je kao razrjeđivač za modificirano živo cjepivo protiv PRRSV.
Te eksperimentalne formulacije opisane su u Tablici 19, niže. U Tablici 19 CP je kontrolni proizvod, a IVP je ispitivani veterinarski proizvod. Antigen iz M.hyo odgovara antigenu iz M.hyo iz globalnog sjemena M.hyo, čiji je supernatant obrađen proteinom A.
Tablica 19
Eksperimentalne cjepivne formulacije protiv PCV2, M.hyo i
PRRS upotrijebljene u studiji djelotvornosti protiv M.hyo
[image]
Prasad stara 3 tjedna intramuskularno je inokulirana jednom dozom različitih cjepivnih formulacija opisanih u Tablici 19, gore. Životinje su 20 dana nakon cijepljenja izložene virulentnom terenskom izolatu M.hyo. Dvadeset i pet životinja prošlo je studiju u skupinama T01 i T03, a 24 ih je prošlo u skupini T02. Životinje su nekropsirane 28 dana nakon izlaganja, zatim su im izvađena pluća, te bodovana na konsolidaciju konzistentnu infekciji s M.hyo. Tablica 20, niže, prikazuje bodove plućnih lezija za odgovarajuće obrađene skupine. Statistički značaj određen je Analizom miješanog modela plućnih bodova za svaku skupinu.
Tablica 20
Plućne lezije uzrokovane bakterijom M.hyo
[image]
Za razliku od negativne kontrolne skupine (T01) obrađena skupina T03 je pokazala značajno smanjenje (P ≤ 0,05) postotka pluća s lezijama u usporedbi s T01. Postotak plućnih lezija za T02 nije se značajno razlikovao bilo od T01 ili T03.
Rezultati u ovim primjeru dokazuju da eksperimentalna trovalentna cjepivna formulacija (obrada T03) upotrijebljena u ovoj studiji osigurava značajnu djeotvornost protiv izlaganja bakteriji M.hyo.
Primjer 16
Procjenjivanje djelotvornosti protiv PRRSV kombinacijskog cjepiva protiv PCV, M.hyo i PRRS
Ova studija osmišljena je za procjenjivanje djelotvornosti frakcije s PRRSV eksperimentalnog kombinacijskog cjepiva protiv PCV, M.hyo i PRRS.
Sažetak studije:
0. dana su otprilike 102 klinički zdrava, tri tjedna stara praseta, seronegativna na PRRSV, SIV i bakteriju M. hyopneumoniae, te bez viremije PCV, prema PCR-u, odabrano i raspoređeno (prema okotu) u jednu od četiri obrađene skupine (24 po skupini) ili u stražarsku (NTX) skupinu (6). Prasad je primila jednu intramuskularnu (IM) dozu od 2 ml eksperimentalnog cjepiva s usmrćenim kimernim svinjskim cirkovirusom tip 1-tip 2 uz ekstrakt bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (T01), ili eksperimentalnog cjepiva s kimernim svinjskim cirkovirusom tip 1-tip 2 i respiratornim oblikom virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma, s modificiranim živim i usmrćenim virusom, uz ekstrakt bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (T02, T03 i T04). ivotinje iz skupine NTX smještene su u obor odvojen od obrađenih skupina tijekom faze cijepljenja za vrijeme studije. Četiri tjedna nakon cijepljenja NTX prasad je eutanazirana i nekropsirana, prije ponovnog smještavanja obrađenih skupina, kako bi se potvrdilo odsutnost plućnih lezija uzrokovanih virusom PRRS. Sva obrađena prasad izložena je virulentnom soju PRRSV namijenjenom za izlaganje (NADC20). Sva preostala prasad je eutanazirana i nekropsirana deset (10) dana nakon izlaganja. Prilikom nekropsije bodovan je postotak konsolidacije za svaki plućni režanj (lijevi kranijalni, lijevi srednji, lijevi kaudalni, desni kranijalni, desni srednji, desni kaudalni i akcesorni), te zabilježen kao postotak režnja s opaženim lezijama. Status negativnosti na PRRSV kod prasadi T01 ispitan je (IDEXX ELISA) prije izlaganja. Klinička opažanja bilježena su jednom dnevno za vrijeme trajanja studije, a tjelesne težine su izmjerene prije izlaganja i prilikom nekropsije.
Eksperimentalne formulacije opisane su niže i u Tablici 21. Kontrolna šarža antigena iz M.hyo pripravljena je kao što je opisano u Primjeru 11, gore. Antigen iz PCV2 je antigen iz usmrćenog cPCV1-2, pripravljen kao što je opisano u Primjeru 2, gore. Prije inaktiviranja kimernog virusa šarža antigena iz PCV2 je koncentrirana 20 ×, a koncentrati su isprani uravnoteženom otopinom soli. Formulacija protiv PCV i M.hyo u jednoj bočici (adjuvantirana 10%-tnim SP-uljem) upotrijebljena je za rehidriranje liofiliziranog modificiranog živog PRRSV.
T01: Eksperimentalni pripravak visokopasažne usmrćene kimere svinjskog cirkovirusa tip 1-tip 2 (1,65% 20 × koncentrirane šarže antigena) i ekstrakt bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (doza 9,0 RP; 153 RU/ml). T01 pripravak odgovara serijskom broju L0912RK12 (PCV i M.hyo) i negativna je kontrola (bez antigena iz PRRSV).
T02: Eksperimentalni pripravak visokopasažne usmrćene kimere svinjskog cirkovirusa tip 1-tip 2 (1,65% 20 × koncentrirane šarže antigena), ekstrakt bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (doza 9,0 RP; 153 RU/ml) i respiratorni oblik modificiranog živog virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (MID ≤ 2,5 log). T02 pripravak odgovara serijskom broju L0912RK12 (PCV i M.hyo) + (PRRS MLV kod MID ≤ 2,5 log).
T03: Eksperimentalni pripravak visokopasažne usmrćene kimere svinjskog cirkovirusa tip 1-tip 2 (1,65% 20 × koncentrirane šarže antigena), ekstrakt bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (doza 9,0 RP; 153 RU/ml) i respiratorni oblik modificiranog živog virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (MID ≤ 3,0 log). T03 pripravak odgovara serijskom broju L0912RK12 (PCV i M.hyo) + (PRRS MLV kod MID ≤ 3,0 log).
T04: Eksperimentalni pripravak visokopasažne usmrćene kimere svinjskog cirkovirusa tip 1-tip 2 (1,65% 20 × koncentrirane šarže antigena), ekstrakt bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (doza 9,0 RP; 153 RU/ml) i respiratorni oblik modificiranog živog virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (MID ≤ 3,5 log). T04 pripravak odgovara serijskom broju L0912RK12 (PCV i M.hyo) + (PRRS MLV kod MID ≤ 3,5 log).
Te eksperimentalne formulacije opisane su u Tablici 21, niže. Antigen iz M.hyo odgovara antigenu iz M.hyo iz globalnog sjemena M.hyo, čiji je supernatant obrađen proteinom A. Serijske brojeve pripravaka PRRSV tek treba odrediti (TO).
Tablica 21
Postava studije
[image] 1 Ispitivani veterinarski proizvod (IVP) = cjepivo s usmrćenim kimernim svinjskim cirkovirusom tip 1-tip 2 (PCV2), ekstrakt bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) adjuvantiran 10%-tnim SP-uljem (razrjeđivač), modificirani živi virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma, respiratorni oblik (PRRSV)
Kontrolni proizvod (CP) = cjepivo s usmrćenim kimernim svinjskim cirkovirusom tip 1-tip 2 (PCV2), ekstrakt bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) adjuvantiran 10%-tnim SP-uljem, bez frakcije s virusom svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma
IM = intramuskularno
NP = nije primijenjivo
SPISAK SLJEDOVA
<110> Pfizer Inc.
Galvin, Jeffrey
Nitzel, Gregory
Garrett, Keith
Kulawik II, James
Ricker, Tracy
Smutzer, Megan
<120> Kombinacijsko cjepivo protiv bakterije PCV/Mycoplasma hyopneumoniae/PPRS
<130> PC71913A
<150> US 61/620,189
<151> 2012-04-04
<160> 18
<170> PatentIn verzija 3.4
<210> 1
<211> 1260
<212> DNA
<213> Mycoplasma hyopneumoniae
<400> 1
atgaaaaaaa tgcttagaaa aaaattcttg tattcatcag ctatttatgc aacttcgctt 60
gcatcaatta ttgcatttgt tgcagcaggt tgtggacaga cagaatcagg ttcgacttct 120
gattctaaac cacaagccga gacgctaaaa cataaagtaa gtaatgattc tattcgaata 180
gcactaaccg atccggataa tcctcgatga attagtgctc aaaaagatat tatttcttat 240
gttgatgaaa cagaggcagc aacttcaaca attacaaaaa accaggatgc acagaataac 300
tgactcactc agcaagctaa tttaagccca gcaccaaaag gatttattat tgcccctgaa 360
aatggaagtg gagttggaac tgctgttaat acaattgctg ataaaggaat tccgattgtt 420
gcctatgatc gactaattac tggatctgat aaatatgatt ggtatgtttc ttttgataat 480
gaaaaagttg gcgaattaca aggtctttca cttgcagcgg gtctattagg aaaagaagat 540
ggtgcttttg attcaattga tcaaatgaat gaatatctaa aatcacatat gccccaagag 600
acaatttctt tttatacaat cgcgggttcc caagatgata ataactccca atatttttat 660
aatggtgcaa tgaaagtact taaagaatta atgaaaaatt cgggaaataa gataattgat 720
ttatctcctg aaggcgaaaa tgctgtttat gtcccaggat gaaattatgg aactgccggt 780
caaagaatcc aatcttttct aacaattaac aaagatccag caggtggtaa taaaatcaaa 840
gctgttggtt caaaaccagc ttctattttc aaaggatttc ttgccccaaa tgatggaatg 900
gccgarcaag caatcaccaa attaaaactt gaaggatttg atacccaaaa aatctttgta 960
actggtcaag attataatga taaagccaaa acttttatca aagacggcga tcaaaatatg 1020
acaatttata aacctgataa agttttagga aaagttgctg ttgaagttct tcgggtttta 1080
attgcaaaga aaaataaagc atccagatca gaagtcgaaa acgaactaaa agcaaaacta 1140
ccaaatattt catttaaata tgataatcaa acatataaag tgcaaggtaa aaatattaat 1200
acaattttag taagtccagt aattgttaca aaagctaatg ttgataatcc tgatgcctaa 1260
<210> 2
<211> 419
<212> PRT
<213> Mycoplasma hyopneumoniae
<400> 2
Met Lys Lys Met Leu Arg Lys Lys Phe Leu Tyr Ser Ser Ala Ile Tyr
1 5 10 15
Ala Thr Ser Leu Ala Ser Ile Ile Ala Phe Val Ala Ala Gly Cys Gly
20 25 30
Gln Thr Glu Ser Gly Ser Thr Ser Asp Ser Lys Pro Gln Ala Glu Thr
35 40 45
Leu Lys His Lys Val Ser Asn Asp Ser Ile Arg Ile Ala Leu Thr Asp
50 55 60
Pro Asp Asn Pro Arg Trp Ile Ser Ala Gln Lys Asp Ile Ile Ser Tyr
65 70 75 80
Val Asp Glu Thr Glu Ala Ala Thr Ser Thr Ile Thr Lys Asn Gln Asp
85 90 95
Ala Gln Asn Asn Trp Leu Thr Gln Gln Ala Asn Leu Ser Pro Ala Pro
100 105 110
Lys Gly Phe Ile Ile Ala Pro Glu Asn Gly Ser Gly Val Gly Thr Ala
115 120 125
Val Asn Thr Ile Ala Asp Lys Gly Ile Pro Ile Val Ala Tyr Asp Arg
130 135 140
Leu Ile Thr Gly Ser Asp Lys Tyr Asp Trp Tyr Val Ser Phe Asp Asn
145 150 155 160
Glu Lys Val Gly Glu Leu Gln Gly Leu Ser Leu Ala Ala Gly Leu Leu
165 170 175
Gly Lys Glu Asp Gly Ala Phe Asp Ser Ile Asp Gln Met Asn Glu Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser His Met Pro Gln Glu Thr Ile Ser Phe Tyr Thr Ile Ala
195 200 205
Gly Ser Gln Asp Asp Asn Asn Ser Gln Tyr Phe Tyr Asn Gly Ala Met
210 215 220
Lys Val Leu Lys Glu Leu Met Lys Asn Ser Gly Asn Lys Ile Ile Asp
225 230 235 240
Leu Ser Pro Glu Gly Glu Asn Ala Val Tyr Val Pro Gly Trp Asn Tyr
245 250 255
Gly Thr Ala Gly Gln Arg Ile Gln Ser Phe Leu Thr Ile Asn Lys Asp
260 265 270
Pro Ala Gly Gly Asn Lys Ile Lys Ala Val Gly Ser Lys Pro Ala Ser
275 280 285
Ile Phe Lys Gly Phe Leu Ala Pro Asn Asp Gly Met Ala Glu Gln Ala
290 295 300
Ile Thr Lys Leu Lys Leu Glu Gly Phe Asp Thr Gln Lys Ile Phe Val
305 310 315 320
Thr Gly Gln Asp Tyr Asn Asp Lys Ala Lys Thr Phe Ile Lys Asp Gly
325 330 335
Asp Gln Asn Met Thr Ile Tyr Lys Pro Asp Lys Val Leu Gly Lys Val
340 345 350
Ala Val Glu Val Leu Arg Val Leu Ile Ala Lys Lys Asn Lys Ala Ser
355 360 365
Arg Ser Glu Val Glu Asn Glu Leu Lys Ala Lys Leu Pro Asn Ile Ser
370 375 380
Phe Lys Tyr Asp Asn Gln Thr Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Ile Asn
385 390 395 400
Thr Ile Leu Val Ser Pro Val Ile Val Thr Lys Ala Asn Val Asp Asn
405 410 415
Pro Asp Ala
<210> 3
<211> 3324
<212> DNA
<213> Mycoplasma hyopneumoniae
<400> 3
atgagtaaaa aatcaaaaac atttaaaatt ggtttgactg ccggaattgt tggtcttgga 60
gtttttggtc taactgtcgg acttagcagc ttggcaaaat acagatcaga aagtccacga 120
aagattgcaa atgattttgc cgcaaaagtt tcaacattag cttttagtcc ttatgctttt 180
gagactgatt ctgattataa aatagtcaaa aggtgactag ttgattctaa taacaatatt 240
agaaataaag aaaaagttat tgattccttt tcctttttta ctaaaaacgg tgatcagtta 300
gaaaaaatta attttcaaga tcctgaatat accaaggcga agataacttt tgagattctt 360
gaaattatcc ctgatgatgt caatcaaaat tttaaggtaa aatttcaggc attacaaaaa 420
cttcataatg gtgatattgc caaatctgat atttatgagc aaacagttgc ttttgccaaa 480
cagtcaaatc ttttagttgc cgaatttaat ttttcgctta aaaaaattac cgaaaaatta 540
aatcaacaaa ttgaaaattt atcaacaaaa attacaaatt ttgctgatga aaaaacaagc 600
agccaaaaag atccctcaac tctaagagct attgacttcc aatacgattt aaatacagcg 660
cgaaatcctg aggatttaga tataaagctt gctaattatt ttccagtact taaaaattta 720
ataaacagac taaataatgc tcctgagaat aaattaccta ataatttggg taatattttt 780
gaatttagct ttgcaaaaga tagttcaact aatcaatatg taagtatcca gaaccaaatt 840
ccttcgctgt ttttaaaagc agatcttagt caaagtgccc gtgaaatttt agctagccca 900
gatgaagttc agccagttat taacatttta agattaatga aaaaagataa ttcttcttat 960
tttctaaatt ttgaggattt tgttaataat ttaacactga aaaatatgca aaaagaagat 1020
ttaaatgcaa agggtcaaaa tctttctgcc tatgaatttc tagcagatat taaatctgga 1080
tttttccctg gagacaagag atccagtcat accaaggcag aaattagtaa tcttttaaat 1140
aaaaaagaaa atatttatga ctttggtaaa tacaatggaa aattcaacga ccgtcttaac 1200
tcgccaaatt tagaatatag cctagatgca gcaagcgcaa gtcttgataa aaaagataaa 1260
tcaatagttt taattcccta ccgccttgaa attaaagata aattttttgc cgatgattta 1320
tatccagata caaaagataa tattctcgta aaagaaggga ttcttaaatt aactggattt 1380
aaaaaaggct caaaaattga tctccctaat atcaatcagc aaatttttaa aaccgaatat 1440
ttaccatttt ttgaaaaagg taaagaagaa caagcaaaat tagactatgg taatatctta 1500
aatccatata atactcaact tgccaaagtt gaagttgaag ctctttttaa agggaataaa 1560
aaccaagaaa tctatcaagc acttgatgga aattatgcct atgaattcgg ggcctttaaa 1620
tccgtgctta attcctgaac aggaaaaatt cagcatcctg aaaaagctga tatccaaaga 1680
tttacaagac atttagaaca agttaaaatt ggttctaatt cagttttaaa tcaaccacaa 1740
acaacaaaag aacaagtaat ttcaagtctt aaaagtaata acttttttaa aaatggacat 1800
caagttgcaa gttatttcca ggatttactc accaaggaca aattaacaat tttagagact 1860
ctttatgatc tagcaaaaaa atggggacta gaaactaaca gagcacaatt cccaaaaggg 1920
gttttccaat atacaaaaga tatttttgca gaagcagata aattaaaatt tttggaattg 1980
aagaaaaagg atccttacaa tcagataaaa gaaattcacc aactttcctt taatatttta 2040
gcccgtaacg atgtaataaa atctgatgga ttttacggag ttttattatt gccccaaagt 2100
gtaaaaactg aattagaagg caaaaatgag gcgcaaattt ttgaagcgct taaaaagtat 2160
tctttaattg agaactcggc ttttaaaact actattttag ataaaaattt acttgaaggg 2220
actgatttta aaaccttcgg tgatttttta aaagcatttt tccttaaagc agcccaattt 2280
aataattttg ctccttgagc aaaattagac gataatcttc agtattcatt tgaagctatc 2340
aaaaaagggg aaactacaaa agaaggtaaa agagaagaag tagataaaaa agttaaggaa 2400
ttggataata aaataaaagg tatattgcct cagcccccag cagcaaaacc agaagcagca 2460
aaaccagtag cggctaaacc agaaacaaca aaaccagtag cagctaaacc tgaagcagct 2520
aaacctgaag cagcaaaacc agtagcggct aaaccagaag cagcaaaacc agtagcggct 2580
aaaccagaag cagcaaaacc agtagcggct aaaccagaag cagcaaaacc agtagcggct 2640
aaaccagaag cagcaaaacc agttgctact aatactggct tttcacttac aaataaacca 2700
aaagaagact atttcccaat ggcttttagt tataaattag aatatactga cgaaaataaa 2760
ttaagcctaa aaacaccgga aattaatgta tttttagaac tagttcatca aagcgagtat 2820
gaagaacaag aaataataaa ggaactagat aaaactgttt taaatcttca atatcaattc 2880
caggaagtca aggtaactag tgaccaatat cagaaactta gccacccaat gatgaccgaa 2940
ggatcttcaa atcaaggtaa aaaaagcgaa ggaactccta accaaggtaa aaaagcagaa 3000
ggcgcgccta accaaggtaa aaaagccgaa ggaactccta accaagggaa aaaagcagag 3060
ggagcaccta gtcaacaaag cccaactacc gaattaacta attaccttcc tgacttaggt 3120
aaaaaaattg acgaaatcat taaaaaacaa ggtaaaaatt gaaaaacaga ggttgaacta 3180
atcgaggata atatcgctgg agatgctaaa ttgctatact ttatcctaag ggatgattca 3240
aaatccggtg atcctaaaaa atcaagtcta aaagttaaaa taacagtaaa acaaagtaat 3300
aataatcagg aaccagaatc taaa 3324
<210> 4
<211> 1108
<212> PRT
<213> Mycoplasma hyopneumoniae
<400> 4
Met Ser Lys Lys Ser Lys Thr Phe Lys Ile Gly Leu Thr Ala Gly Ile
1 5 10 15
Val Gly Leu Gly Val Phe Gly Leu Thr Val Gly Leu Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Lys Tyr Arg Ser Glu Ser Pro Arg Lys Ile Ala Asn Asp Phe Ala Ala
35 40 45
Lys Val Ser Thr Leu Ala Phe Ser Pro Tyr Ala Phe Glu Thr Asp Ser
50 55 60
Asp Tyr Lys Ile Val Lys Arg Trp Leu Val Asp Ser Asn Asn Asn Ile
65 70 75 80
Arg Asn Lys Glu Lys Val Ile Asp Ser Phe Ser Phe Phe Thr Lys Asn
85 90 95
Gly Asp Gln Leu Glu Lys Ile Asn Phe Gln Asp Pro Glu Tyr Thr Lys
100 105 110
Ala Lys Ile Thr Phe Glu Ile Leu Glu Ile Ile Pro Asp Asp Val Asn
115 120 125
Gln Asn Phe Lys Val Lys Phe Gln Ala Leu Gln Lys Leu His Asn Gly
130 135 140
Asp Ile Ala Lys Ser Asp Ile Tyr Glu Gln Thr Val Ala Phe Ala Lys
145 150 155 160
Gln Ser Asn Leu Leu Val Ala Glu Phe Asn Phe Ser Leu Lys Lys Ile
165 170 175
Thr Glu Lys Leu Asn Gln Gln Ile Glu Asn Leu Ser Thr Lys Ile Thr
180 185 190
Asn Phe Ala Asp Glu Lys Thr Ser Ser Gln Lys Asp Pro Ser Thr Leu
195 200 205
Arg Ala Ile Asp Phe Gln Tyr Asp Leu Asn Thr Ala Arg Asn Pro Glu
210 215 220
Asp Leu Asp Ile Lys Leu Ala Asn Tyr Phe Pro Val Leu Lys Asn Leu
225 230 235 240
Ile Asn Arg Leu Asn Asn Ala Pro Glu Asn Lys Leu Pro Asn Asn Leu
245 250 255
Gly Asn Ile Phe Glu Phe Ser Phe Ala Lys Asp Ser Ser Thr Asn Gln
260 265 270
Tyr Val Ser Ile Gln Asn Gln Ile Pro Ser Leu Phe Leu Lys Ala Asp
275 280 285
Leu Ser Gln Ser Ala Arg Glu Ile Leu Ala Ser Pro Asp Glu Val Gln
290 295 300
Pro Val Ile Asn Ile Leu Arg Leu Met Lys Lys Asp Asn Ser Ser Tyr
305 310 315 320
Phe Leu Asn Phe Glu Asp Phe Val Asn Asn Leu Thr Leu Lys Asn Met
325 330 335
Gln Lys Glu Asp Leu Asn Ala Lys Gly Gln Asn Leu Ser Ala Tyr Glu
340 345 350
Phe Leu Ala Asp Ile Lys Ser Gly Phe Phe Pro Gly Asp Lys Arg Ser
355 360 365
Ser His Thr Lys Ala Glu Ile Ser Asn Leu Leu Asn Lys Lys Glu Asn
370 375 380
Ile Tyr Asp Phe Gly Lys Tyr Asn Gly Lys Phe Asn Asp Arg Leu Asn
385 390 395 400
Ser Pro Asn Leu Glu Tyr Ser Leu Asp Ala Ala Ser Ala Ser Leu Asp
405 410 415
Lys Lys Asp Lys Ser Ile Val Leu Ile Pro Tyr Arg Leu Glu Ile Lys
420 425 430
Asp Lys Phe Phe Ala Asp Asp Leu Tyr Pro Asp Thr Lys Asp Asn Ile
435 440 445
Leu Val Lys Glu Gly Ile Leu Lys Leu Thr Gly Phe Lys Lys Gly Ser
450 455 460
Lys Ile Asp Leu Pro Asn Ile Asn Gln Gln Ile Phe Lys Thr Glu Tyr
465 470 475 480
Leu Pro Phe Phe Glu Lys Gly Lys Glu Glu Gln Ala Lys Leu Asp Tyr
485 490 495
Gly Asn Ile Leu Asn Pro Tyr Asn Thr Gln Leu Ala Lys Val Glu Val
500 505 510
Glu Ala Leu Phe Lys Gly Asn Lys Asn Gln Glu Ile Tyr Gln Ala Leu
515 520 525
Asp Gly Asn Tyr Ala Tyr Glu Phe Gly Ala Phe Lys Ser Val Leu Asn
530 535 540
Ser Trp Thr Gly Lys Ile Gln His Pro Glu Lys Ala Asp Ile Gln Arg
545 550 555 560
Phe Thr Arg His Leu Glu Gln Val Lys Ile Gly Ser Asn Ser Val Leu
565 570 575
Asn Gln Pro Gln Thr Thr Lys Glu Gln Val Ile Ser Ser Leu Lys Ser
580 585 590
Asn Asn Phe Phe Lys Asn Gly His Gln Val Ala Ser Tyr Phe Gln Asp
595 600 605
Leu Leu Thr Lys Asp Lys Leu Thr Ile Leu Glu Thr Leu Tyr Asp Leu
610 615 620
Ala Lys Lys Trp Gly Leu Glu Thr Asn Arg Ala Gln Phe Pro Lys Gly
625 630 635 640
Val Phe Gln Tyr Thr Lys Asp Ile Phe Ala Glu Ala Asp Lys Leu Lys
645 650 655
Phe Leu Glu Leu Lys Lys Lys Asp Pro Tyr Asn Gln Ile Lys Glu Ile
660 665 670
His Gln Leu Ser Phe Asn Ile Leu Ala Arg Asn Asp Val Ile Lys Ser
675 680 685
Asp Gly Phe Tyr Gly Val Leu Leu Leu Pro Gln Ser Val Lys Thr Glu
690 695 700
Leu Glu Gly Lys Asn Glu Ala Gln Ile Phe Glu Ala Leu Lys Lys Tyr
705 710 715 720
Ser Leu Ile Glu Asn Ser Ala Phe Lys Thr Thr Ile Leu Asp Lys Asn
725 730 735
Leu Leu Glu Gly Thr Asp Phe Lys Thr Phe Gly Asp Phe Leu Lys Ala
740 745 750
Phe Phe Leu Lys Ala Ala Gln Phe Asn Asn Phe Ala Pro Trp Ala Lys
755 760 765
Leu Asp Asp Asn Leu Gln Tyr Ser Phe Glu Ala Ile Lys Lys Gly Glu
770 775 780
Thr Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val Lys Glu
785 790 795 800
Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys
805 810 815
Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Thr Thr Lys Pro
820 825 830
Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val
835 840 845
Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala
850 855 860
Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala
865 870 875 880
Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Asn Thr Gly Phe Ser Leu
885 890 895
Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro Met Ala Phe Ser Tyr Lys
900 905 910
Leu Glu Tyr Thr Asp Glu Asn Lys Leu Ser Leu Lys Thr Pro Glu Ile
915 920 925
Asn Val Phe Leu Glu Leu Val His Gln Ser Glu Tyr Glu Glu Gln Glu
930 935 940
Ile Ile Lys Glu Leu Asp Lys Thr Val Leu Asn Leu Gln Tyr Gln Phe
945 950 955 960
Gln Glu Val Lys Val Thr Ser Asp Gln Tyr Gln Lys Leu Ser His Pro
965 970 975
Met Met Thr Glu Gly Ser Ser Asn Gln Gly Lys Lys Ser Glu Gly Thr
980 985 990
Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln Gly Lys Lys
995 1000 1005
Ala Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro
1010 1015 1020
Ser Gln Gln Ser Pro Thr Thr Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Pro Asp
1025 1030 1035
Leu Gly Lys Lys Ile Asp Glu Ile Ile Lys Lys Gln Gly Lys Asn
1040 1045 1050
Trp Lys Thr Glu Val Glu Leu Ile Glu Asp Asn Ile Ala Gly Asp
1055 1060 1065
Ala Lys Leu Leu Tyr Phe Ile Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ser Gly
1070 1075 1080
Asp Pro Lys Lys Ser Ser Leu Lys Val Lys Ile Thr Val Lys Gln
1085 1090 1095
Ser Asn Asn Asn Gln Glu Pro Glu Ser Lys
1100 1105
<210> 5
<211> 1773
<212> DNA
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 5
ggtacctccg tggattgttc tccagcagtc ttccaaaatt gcaaagtagt aatcctccga 60
tagagagctt ctacagctgg gacagcagtt gaggagtacc attcctgggg ggcctgattg 120
ctggtaatca aaatactgcg ggccaaaaaa ggaacagtac cccctttagt ctctacagtc 180
aatggatacc ggtcacacag tctcagtaga tcatcccaag gtaaccagcc ataaaaatca 240
tccaaaacaa caacttcttc tccatgatat ccatcccacc acttatttct actaggcttc 300
cagtaggtgt ccctaggctc agcaaaatta cgggcccact ggctcttccc acaaccgggc 360
gggcccacta tgacgtgtac agctgtcttc caatcacgct gctgcatctt cccgctcact 420
ttcaaaagtt cagccagccc gcggaaattt ctcacatacg ttacaggaaa ctgctcggct 480
acagtcacca aagaccccgt ctccaaaagg gtactcacag cagtagacag gtcgctgcgc 540
ttcccctggt tccgcggagc tccacactcg ataagtatgt ggccttcttt actgcagtat 600
tctttattct gctggtcggt tcctttcgct ttctcgatgt ggcagcgggc accaaaatac 660
cacttcacct tgttaaaagt ctgcttctta gcaaaattcg caaacccctg gaggtgagga 720
gttctaccct cttccaaacc ttcctcgcca caaacaaaat aatcaaaaag ggagattgga 780
agctcccgta ttttgttttt ctcctcctcg gaaggattat taagggtgaa cacccacctc 840
ttatggggtt gcgggccgct tttcttgctt ggcattttca ctgacgctgc cgaggtgctg 900
ccgctgccga agtgcgctgg taatactaca gcagcgcact tctttcactt ttataggatg 960
acgtatccaa ggaggcgtta ccgcagaaga agacaccgcc cccgcagcca tcttggccag 1020
atcctccgcc gccgcccctg gctcgtccac ccccgccacc gctaccgttg gagaaggaaa 1080
aatggcatct tcaacacccg cctctcccgc accttcggat atactgtcaa ggctaccaca 1140
gtcagaacgc cctcctgggc ggtggacatg atgagattta atattgacga ctttgttccc 1200
ccgggagggg ggaccaacaa aatctctata ccctttgaat actacagaat aagaaaggtt 1260
aaggttgaat tctggccctg ctcccccatc acccagggtg ataggggagt gggctccact 1320
gctgttattc tagatgataa ctttgtaaca aaggccacag ccctaaccta tgacccatat 1380
gtaaactact cctcccgcca tacaatcccc caacccttct cctaccactc ccgttacttc 1440
acacccaaac ctgttcttga ctccaccatt gattacttcc aaccaaataa caaaaggaat 1500
cagctttgga tgaggctaca aacctctaga aatgtggacc acgtaggcct cggcactgcg 1560
ttcgaaaaca gtatatacga ccaggactac aatatccgtg taaccatgta tgtacaattc 1620
agagaattta atcttaaaga ccccccactt aaaccctaaa tgaataaaaa taaaaaccat 1680
tacgatgtga taacaaaaaa gactcagtaa tttattttat atgggaaaag ggcacagggt 1740
gggtccactg cttcaaatcg gccttcgggt acc 1773
<210> 6
<211> 702
<212> DNA
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 6
atgacgtatc caaggaggcg ttaccgcaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60
cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgctaccg ttggagaagg 120
aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caaggctacc 180
acagtcagaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat ttaatattga cgactttgtt 240
cccccgggag gggggaccaa caaaatctct ataccctttg aatactacag aataagaaag 300
gttaaggttg aattctggcc ctgctccccc atcacccagg gtgatagggg agtgggctcc 360
actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctaac ctatgaccca 420
tatgtaaact actcctcccg ccatacaatc ccccaaccct tctcctacca ctcccgttac 480
ttcacaccca aacctgttct tgactccacc attgattact tccaaccaaa taacaaaagg 540
aatcagcttt ggatgaggct acaaacctct agaaatgtgg accacgtagg cctcggcact 600
gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaaccct aa 702
<210> 7
<211> 233
<212> PRT
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 7
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Met Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro
225 230
<210> 8
<211> 1767
<212> DNA
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 8
ggtacctccg tggattgttc tccagcagtc ttccaaaatt gcaaagtagt aatcctccga 60
tagagagctt ctacagctgg gacagcagtt gaggagtacc attcctgggg ggcctgattg 120
ctggtaatca aaatactgcg ggccaaaaaa ggaacagtac cccctttagt ctctacagtc 180
aatggatacc ggtcacacag tctcagtaga tcatcccaag gtaaccagcc ataaaaatca 240
tccaaaacaa caacttcttc tccatgatat ccatcccacc acttatttct actaggcttc 300
cagtaggtgt cgctaggctc agcaaaatta cgggcccact ggctcttccc acaaccgggc 360
gggcccacta tgacgtgtac agctgtcttc caatcacgct gctgcatctt cccgctcact 420
ttcaaaagtt cagccagccc gcggaaattt ctcacatacg ttacagggaa ctgctcggct 480
acagtcacca aagaccccgt ctccaaaagg gtactcacag cagtagacag gtcgctgcgc 540
ttcccctggt tccgcggagc tccacactcg ataagtatgt ggccttcttt actgcagtat 600
tctttattct gctggtcggt tcctttcgct ttctcgatgt ggcagcgggc accaaaatac 660
cacttcacct tgttaaaagt ctgcttctta gcaaaattcg caaacccctg gaggtgagga 720
gttctaccct cttccaaacc ttcctctccg caaacaaaat aatcaaaaag ggagattgga 780
agctcccgta ttttgttttt ctcctcctcg gaaggattat taagggtgaa cacccacctc 840
ttatggggtt gcgggccgct tttcctgctt ggcattttca ctgacgctgc cgaggtgctg 900
ccgctgccga agtgcgctgg taatactaca gcagcgcact tctttcactt ttataggatg 960
acgtatccaa ggaggcgtta ccgcagaaga agacaccgcc cccgcagcca tcttggccag 1020
atcctccgcc gccgcccctg gctcgtccac ccccgccacc gctaccgttg gagaaggaaa 1080
aatggcatct tcaacacccg cctctcccgc accttcggat atactgtcaa ggctaccaca 1140
gtcagaacgc cctcctgggc ggtggacatg atgagattta atattgacga ctttgttccc 1200
ccgggagggg ggaccaacaa aatctctata ccctttgaat actacagaat aagaaaggtt 1260
aaggttgaat tctggccctg ctcccccatc acccagggtg ataggggagt gggctccact 1320
gctgttattc tagatgataa ctttgtaaca aaggccacag ccctaaccta tgacccatat 1380
gtaaactact cctcccgcca tacaatcgcc caacccttct cctaccactc ccgttacttc 1440
acacccaaac ctgttcttga ctccaccatt gattacttcc aaccaaataa caaaaggaat 1500
cagctttgga tgaggctaca aacctctaga aatgtggacc acgtaggcct cggcactgcg 1560
ttcgaaaaca gtatatacga ccaggactac aatatccgtg taaccatgta tgtacaattc 1620
agagaattta atcttaaaga ccccccactt aaaccctaaa tgaataaaaa taaaaaccat 1680
tacgatgtga taacaaaaaa gactcagtaa tttattttat atgggaaaag ggcacagggt 1740
gggtccactg cttcaaatcg gccttcg 1767
<210> 9
<211> 702
<212> DNA
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 9
atgacgtatc caaggaggcg ttaccgcaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60
cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgctaccg ttggagaagg 120
aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caaggctacc 180
acagtcagaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat ttaatattga cgactttgtt 240
cccccgggag gggggaccaa caaaatctct ataccctttg aatactacag aataagaaag 300
gttaaggttg aattctggcc ctgctccccc atcacccagg gtgatagggg agtgggctcc 360
actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctaac ctatgaccca 420
tatgtaaact actcctcccg ccatacaatc gcccaaccct tctcctacca ctcccgttac 480
ttcacaccca aacctgttct tgactccacc attgattact tccaaccaaa taacaaaagg 540
aatcagcttt ggatgaggct acaaacctct agaaatgtgg accacgtagg cctcggcact 600
gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaaccct aa 702
<210> 10
<211> 233
<212> PRT
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 10
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Ala Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Met Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro
225 230
<210> 11
<211> 233
<212> PRT
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 11
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp
195 200 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro
225 230
<210> 12
<211> 713
<212> DNA
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 12
cagctatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60
ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120
gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtggaga 180
aggaaaaatg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtgacgact 240
ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300
gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360
gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420
acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480
gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540
aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600
gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660
tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttaa accctaaatg aat 713
<210> 13
<211> 233
<212> PRT
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 13
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp
195 200 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro
225 230
<210> 14
<211> 713
<212> DNA
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 14
ccgccatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60
ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120
gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtcaagg 180
ctaccacagt cacaacgccc tcctgggcgg tggacatgat gagatttaat attgacgact 240
ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300
gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360
gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420
acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480
gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540
aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600
gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660
tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttga accctaagaa ttc 713
<210> 15
<211> 233
<212> PRT
<213> Svinjski cirkovirus
<400> 15
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Lys Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro
225 230
<210> 16
<211> 15450
<212> DNA
<213> Svinjski virus reproduktivnog i respiratornog sindroma
<400> 16
atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtggccatt 60
ggcacagccc aaaacttgct gcacggaaaa cgcccttctg tgacagcctt cttcagggga 120
gcttaggggt ctgtccctag caccttgctt ctggagttgc actgctttac ggtctctcca 180
cccctttaac catgtctggg atacttgatc ggtgcacgtg cacccccaat gccagggtgt 240
ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc 300
tgaatctcca agttcctgag cttggggtgc tgggcctatt ttataggccc gaagagccac 360
tccggtggac gttgccacgt gcattcccca ctgtcgagtg ctcccctgcc ggggcctgct 420
ggctttctgc gatctttcca attgcacgaa tgaccagtgg aaacctgaac tttcaacaaa 480
gaatggtgcg ggttgcagct gagatttaca gagccggcca actcacccct gcagttttga 540
aggctctaca agtttatgaa cggggttgtc gctggtaccc cattgtcgga cctgtccctg 600
gagtggccgt ttacgccaac tccctacatg tgagtgacaa acctttcccg ggagcaactc 660
atgtgttaac caacctaccg ctcccgcaga ggcccaagcc tgaagacttt tgcccttttg 720
agtgtgctat ggctaacgtc tatgacattg gccataacgc cgtcatgtat gtggccagag 780
ggaaagtctc ctgggcccct cgtggcgggg atgaagtgaa atttgaaacc gtccccgaag 840
agttgaagtt gattgcgaac cgactccaca tctccttccc gccccaccac gcagtggaca 900
tgtctgagtt tgccttcata gcccctggga gtggtgtctc cttgcgggtc gagcaccaac 960
acggctgcct tcccgctgat actgtccctg atgggaactg ctggtggtac ttgtttgact 1020
tgctcccacc ggaagttcag aataaagaaa ttcgccgtgc taaccaattt ggctatcaaa 1080
ccaagcatgg tgtccatggc aagtacctac agcggaggct gcaagttaat ggtctccgag 1140
cagtgactga tacagatgga cctattgtcg tacagtactt ctctgttagg gagagttgga 1200
tccgccactt cagactggcg gaagaaccta gcctccctgg gtttgaagac ctcctcagaa 1260
taagggtaga gcctaatacg tcgccaatgg gtggcaaggg tgaaaaaatc ttccggtttg 1320
gcagtcacaa gtggtacggt gctggaaaga gagcaaggag agcacgctct ggtgcgactg 1380
ccacggtcgc tcaccgcgct ttgcccgctc gcgaagccca gcaggccaag aagctcgagg 1440
ttgccagcgc caacagggct gagcatctca agtactattc cccgcctgcc gacgggaact 1500
gtggttggca ctgcatttcc gccattacca accggatggt gaattccaaa tttgaaacca 1560
ctcttcccga gagagtgaga ccttcagatg actgggctac tgacgaggat cttgtgaata 1620
ccatccaaat cctcaggctc cccgcggcct tggacaggaa cggtgcttgt gctggcgcca 1680
agtacgtgct caagctggaa ggtgagcact ggaccgtctc tgtgacccct gggatgaccc 1740
cttctttgct cccccttgaa tgtgttcagg gttgttgtga gcataagagc ggtcttggtt 1800
tcccagacgt ggtcgaagtt tccggatttg accctgcctg tcttgaccga cttgctgaga 1860
taatgcactt gcctagcagt gtcatcccag ctgctctggc cgagatgtcc gacgacttca 1920
atcgtctggc ttccccggcc gccactgtgt ggactgtttc gcaattcttt gcccgccaca 1980
gaggaggaga gcatcctgac caggtgtgct tagggaaaat tatcaacctt tgtcaggtga 2040
ttgaggaatg ctgctgttcc cggaacaaag ccaaccgggc taccccggaa gaggttgcgg 2100
caaaagttga ccagtacctc cgtggtgcag caagccttgg agaatgcttg gccaagcttg 2160
agagggctcg cccgccgagc gcgacggaca cctcctttga ttggaatgtt gtgcttcctg 2220
gggttgagac ggcgaatcag acaaccaaac agctccatgt caaccagtgc cgcgctctgg 2280
ttcctgtcgt gactcaagag cctttggaca gagactcggt ccctctgacc gccttctcgc 2340
tgtccaattg ctactaccct gcacaaggtg acgaggtccg tcaccgtgag aggctaaact 2400
ccttgctctc taagttggag ggggttgttc gtgaggaata tgggctcacg ccaactggac 2460
ctggcccgcg acccgcactg ccgaacgggc tcgacgagct taaagaccag atggaggagg 2520
atctgctgaa attagtcaac gcccaggcaa cttcagaaat gatggcctgg gcagccgagc 2580
aggttgatct aaaagcttgg gtcaaaaatt acccacggtg gacaccgcca ccccctccac 2640
caagagttca gcctcgaaaa acgaagtctg tcaagagctt gctagagaac aagcctgtcc 2700
ctgctccgcg caggaaggtc agatctgatt gtggcagccc gattttgatg ggcgacaatg 2760
ttcctaacgg ttgggaagat tcgactgttg gtggtcccct tgatctttcg gcaccatccg 2820
agccgatgac acctctgagt gagcctgtac ttatttccag gccagtgaca tctttgagtg 2880
tgccggcccc agttcctgca ccgcgtagag ctgtgtcccg accgatgacg ccctcgagtg 2940
agccaatttt tgtgtctgca ctgcgacaca aatttcagca ggtggaaaaa gcaaatctgg 3000
cggcagcagc gccgatgtgc caggacgaac ccttagattt gtctgcatcc tcacagactg 3060
aatatgaggc ttccccccta acaccaccgc agaacgtggg cattctggag gtaagggggc 3120
aagaagctga ggaagttctg agtgaaatct cggatattct gaatgatacc aaccctgcac 3180
ctgtgtcatc aagcagctcc ctgtcaagtg ttaagatcac acgcccaaaa tactcagctc 3240
aagccattat cgactcgggc gggccctgca gtgggcacct ccaaagggaa aaagaagcat 3300
gcctccgcat catgcgtgaa gcttgtgatg cggccaagct tagtgaccct gccacgcagg 3360
aatggctttc tcgcatgtgg gatagggtgg acatgctgac ttggcgcaac acgtctgctt 3420
accaggcgtt tcgcacctta gatggcaggt ttgggtttct cccaaagatg atactcgaga 3480
cgccgccgcc ctacccgtgt gggtttgtga tgttgcctca cacccctgca ccttccgtga 3540
gtgcagagag cgaccttacc attggttcag tcgccactga agatattcca cgcatcctcg 3600
ggaaaataga aaataccggt gagatgatca accagggacc cttggcatcc tctgaggaag 3660
aaccggtata caaccaacct gccaaagact cccggatatc gtcgcggggg tctgacgaga 3720
gcacagcagc tccgtccgcg ggtacaggtg gcgccggctt atttactgat ttgccacctt 3780
cagacggcgt agatgcggac ggtggggggc cgttgcagac ggtaagaaag aaagctgaaa 3840
ggctcttcga ccaattgagc cgtcaggttt ttaacctcgt ctcccatctc cctgttttct 3900
tctcacacct cttcaaatct gacagtggtt attctccggg tgattggggt tttgcagctt 3960
ttactctatt ttgcctcttt ttgtgttaca gctacccatt cttcggtttc gttcccctct 4020
tgggtgtatt ttctgggtct tctcggcgtg tgcgcatggg ggtttttggc tgctggctgg 4080
cttttgctgt tggcctgttc aagcctgtgt ccgacccagt cggcactgct tgtgagtttg 4140
actcgccaga gtgcaggaac gtccttcatt cttttgagct tctcaaacct tgggaccctg 4200
ttcgcagcct tgttgtgggc cccgtcggtc tcggtcttgc cattcttggc aagttactgg 4260
gcggggcacg ctacatctgg cattttttgc ttaggcttgg cattgttgca gattgtatct 4320
tggctggagc ttatgtgctt tctcaaggta ggtgtaaaaa gtgctgggga tcttgtataa 4380
gaactgctcc taatgaaatc gccttcaacg tgttcccttt tacacgtgcg accaggtcgt 4440
cactcatcga cctgtgcgat cggttttgtg cgccaacagg catggacccc attttcctcg 4500
ccactgggtg gcgtgggtgc tggaccggcc gaagtcccat tgagcaaccc tctgaaaaac 4560
ccatcgcgtt cgcccagttg gatgaaaaga ggattacggc tagaactgtg gtcgctcagc 4620
cttatgatcc taatcaagcc gtgaagtgct tgcgggtgtt acaggcgggt ggggcgatgg 4680
tggccgaggc agtcccaaaa gtggccaaag tttctgctat tccattccga gccccttttt 4740
ttcccaccgg agtgaaagtt gatcccgagt gcaggatcgt ggttgacccc gatactttta 4800
ctacagccct ccggtctggt tactctacca caaacctcgt ccttggtgtg ggggactttg 4860
cccagctgaa tggactaaag atcaggcaaa tttccaagcc ttcgggagga ggcccacacc 4920
tcattgctgc cctgcatgtt gcctgctcga tggcgttgca catgcttgct ggggtttatg 4980
taacttcagt ggggtcttgc ggtgccggca ccaacgatcc atggtgcact aatccgtttg 5040
ccgttcctgg ctacggacca ggctctctct gcacgtccag attgtgcatc tcccaacatg 5100
gccttaccct gcccttgaca gcacttgtgg cgggattcgg tcttcaggaa atcgccttgg 5160
tcgttttgat tttcgtttcc atcggaggca tggctcatag gttgagttgt aaggctgata 5220
tgctgtgcat tttacttgca atcgccagct atgtttgggt accccttacc tggttgcttt 5280
gtgtgtttcc ttgttggttg cgctggttct ctttgcaccc ccttaccatc ctatggttgg 5340
tgtttttctt gatttctgta aatatgcctt cgggaatctt ggccgtggtg ttattggttt 5400
ctctttggct tttgggacgt tatactaaca ttgctggtct tgtcaccccc tatgatattc 5460
atcattacac cagtggcccc cgcggtgttg ccgccttggc taccgcacca gatggaacct 5520
acttggctgc cgtccgccgc gctgcgttga ctggtcgcac catgctgttc accccgtctc 5580
agcttgggtc ccttcttgag ggcgctttca gaactcgaaa gccctcactg aacaccgtca 5640
atgtggttgg gtcctccatg ggctctggtg gagtgttcac catcgacggg aaaattaggt 5700
gcgtgactgc cgcacatgtc cttacgggta attcggctag ggtttccgga gtcggcttca 5760
atcaaatgct tgactttgat gtgaaagggg acttcgccat agctgattgc ccgaattggc 5820
aaggagctgc tcccaagacc caattctgcg aggacggatg gactggccgt gcctattggc 5880
tgacatcctc tggcgtcgaa cccggtgtta ttgggaatgg attcgccttc tgcttcaccg 5940
cgtgcggcga ttccgggtcc ccagtgatca ccgaagctgg tgagattgtc ggcgttcaca 6000
caggatcaaa taaacaagga ggtggcatcg tcacgcgccc ttcaggccag ttttgtaacg 6060
tggcacccat caagctgagc gaattaagtg aattctttgc tggacccaag gtcccgctcg 6120
gtgatgtgaa ggttggcagc cacataatta aagacacgtg cgaagtacct tcagatcttt 6180
gcgccttgct tgctgccaaa cctgaactgg agggaggcct ctccaccgtc caacttctgt 6240
gtgtgttttt cctactgtgg agaatgatgg gacatgcctg gacgcccttg gttgctgtgg 6300
ggtttttcat tctgaatgag gttctcccag ctgtcctggt tcggagtgtt ttctcctttg 6360
ggatgtttgt gctatcttgg ctcacaccat ggtctgcgca agttctgatg atcaggcttc 6420
taacagcagc tcttaacagg aacagatggt cacttgcctt ttacagcctt ggtgcggtga 6480
ccggttttgt cgcagatctt gcggtaactc aagggcaccc gttgcaggca gtaatgaatt 6540
tgagcaccta tgccttcctg cctcggatga tggttgtgac ctcaccagtc ccagtgattg 6600
cgtgtggtgt tgtgcaccta cttgccatca ttttgtactt gttcaagtac cgcggcctgc 6660
acaatgttct tgttggtgat ggagcgtttt ctgcagcttt cttcttgcga tactttgccg 6720
agggaaagtt gagggaaggg gtgtcgcaat cctgcggaat gaatcatgag tcattgactg 6780
gtgccctcgc tatgagactc aatgacgagg acttggactt ccttacgaaa tggactgatt 6840
ttaagtgctt tgtttctgcg tccaacatga ggaatgcagc aggccaattc atcgaggctg 6900
cctatgcaaa agcacttaga attgaacttg cccagttggt gcaggttgat aaggttcgag 6960
gtactttggc caagcttgag gcttttgctg ataccgtggc accccaactc tcgcccggtg 7020
acattgttgt tgctcttggc catacgcctg ttggcagcat cttcgaccta aaggttggtg 7080
gtaccaagca tactctccaa gtcattgaga ccagagtcct tgccgggtcc aaaatgaccg 7140
tggcgcgcgt cgttgaccca acccccacgc ccccacccgc acccgtgccc atccccctcc 7200
caccgaaagt tctagagaat ggtcccaacg cctgggggga tggggaccgt ttgaataaga 7260
agaagaggcg taggatggaa accgtcggca tctttgtcat gggtgggaag aagtaccaga 7320
aattttggga caagaattcc ggtgatgtgt tttacgagga ggtccatgac aacacagatg 7380
cgtgggagtg cctcagagtt ggtgaccctg ccgactttaa ccctgagaag ggaactctgt 7440
gtgggcatac tactattgaa gataaggatt acaaagtcta cgcctcccca tctggcaaga 7500
agttcctggt ccccgtcaac ccagagagcg gaagagccca atgggaagct gcaaagcttt 7560
ccgtggagca ggcccttggc atgatgaatg tcgacggtga actgacggcc aaagaagtgg 7620
agaaactgaa aagaataatt gacaaacttc agggccttac taaggagcag tgtttaaact 7680
gctagccgcc agcggcttga cccgctgtgg tcgcggcggc ttggttgtta ctgagacagc 7740
ggtaaaaata gtcaaatttc acaaccggac tttcacccta gggcctgtga atttaaaagt 7800
ggccagtgag gttgagctga aagacgcggt cgagcacaac caacacccgg ttgcaagacc 7860
ggttgacggt ggtgttgtgc tcctgcgttc cgcagttcct tcgcttatag atgtcctgat 7920
ctccggtgct gacgcatctc ctaagttact cgctcgtcac gggccgggga acactgggat 7980
cgatggcacg ctttgggact ttgaggccga ggccaccaaa gaggaaattg cgctcagtgc 8040
gcaaataata caggcttgtg acattaggcg cggtgacgca cctgaaattg gtctccctta 8100
caagctgtac cctgttaggg gcaaccctga gcgggtaaaa ggagttttac agaatacaag 8160
gtttggagac ataccttaca aaacccccag tgacactggg agcccagtgc acgcggctgc 8220
ctgcctcacg cccaatgcca ctccggtgac tgatgggcgc tccgtcttgg ctactaccat 8280
gccctccggt tttgaattgt atgtaccgac cattccagcg tctgtccttg attatcttga 8340
ctctaggcct gactgcccca aacagttgac agagcacggc tgtgaggatg ccgcattgag 8400
agacctctcc aagtatgact tgtccaccca aggctttgtt ttacctgggg ttcttcgcct 8460
tgtgcgtaag tacctgtttg cccacgtggg taagtgcccg cccgttcatc ggccttccac 8520
ttaccctgcc aagaattcta tggctggaat aaatgggaac aggtttccaa ccaaggacat 8580
tcagagcgtc cccgaaatcg acgttctgtg cgcacaggcc gtgcgagaaa actggcaaac 8640
tgttacccct tgtaccctca agaaacagta ttgtgggaag aagaagacta ggacaatact 8700
cggcaccaat aatttcattg cgttggccca ccgggcagcg ttgagtggtg tcacccaggg 8760
cttcatgaaa aaggcgttta actcgcccat cgccctcggg aaaaacaaat ttaaggagct 8820
acagactccg atcttaggca ggtgccttga agctgatctt gcatcctgtg atcgatccac 8880
acctgcaatt gtccgctggt ttgccgccaa ccttctttat gaacttgcct gtgctgaaga 8940
gcacctaccg tcgtacgtgc tgaactgctg ccatgaccta ttggtcacgc agtccggcgc 9000
agtgactaag aggggtggcc tgtcgtctgg cgacccgatc acttctgtgt ctaacaccat 9060
ttacagcttg gtgatatatg cacagcacat ggtgcttagt tactttaaaa gtggtcaccc 9120
tcatggcctt ctgttcctac aagaccagct gaagttcgag gacatgctca aagtccaacc 9180
cctgatcgtc tattcggacg acctcgtgct gtatgccgaa tctcccacca tgccgaacta 9240
ccactggtgg gtcgaacatc tgaatttgat gctgggtttt cagacggacc caaagaagac 9300
agccataacg gactcgccat catttctagg ctgtaggata ataaatggac gccagctagt 9360
ccccaaccgt gacaggatcc tcgcggccct cgcttaccat atgaaggcaa acaatgtttc 9420
tgaatactac gccgcggcgg ctgcaatact catggacagc tgtgcttgtt tagagtatga 9480
tcctgaatgg tttgaagagc ttgtggttgg gatagcgcat tgcgcccgca aggacggcta 9540
cagctttccc ggcccgccgt tcttcttgtc catgtgggaa aaactcagat ccaatcatga 9600
ggggaagaag tccagaatgt gcgggtattg cggggccctg gctccgtacg ccactgcctg 9660
tggcctcgac gtctgtattt accacaccca cttccaccag cattgtccag tcacaatctg 9720
gtgtggccac ccggctggtt ctggttcttg tagtgagtgc aaaccccccc tagggaaagg 9780
cacaagccct ctagatgagg tgttagaaca agtcccgtat aagcctccac ggactgtaat 9840
catgcatgtg gagcagggtc tcacccctct tgacccaggc agataccaga ctcgccgcgg 9900
attagtctcc gttaggcgtg gcatcagagg aaatgaagtt gacctaccag acggtgatta 9960
tgctagcacc gccctactcc ccacttgtaa agagatcaac atggtcgctg tcgcctctaa 10020
tgtgttgcgc agcaggttca tcatcggtcc gcccggtgct gggaaaacat actggctcct 10080
tcagcaggtc caggatggtg atgtcattta cacaccgact caccagacca tgctcgacat 10140
gattagggct ttggggacgt gccggttcaa cgtcccagca ggtgcaacgc tgcaattccc 10200
tgccccctcc cgtaccggcc cgtgggttcg catcctagcc ggcggttggt gtcctggtaa 10260
gaattccttc ttggatgaag cagcgtattg taatcacctt gatgtcttga ggctccttag 10320
caaaaccacc ctcacctgtc tgggagactt caaacaactc cacccagtgg gttttgattc 10380
tcattgctat gtttttgaca tcatgcctca gacccagttg aagaccatct ggagattcgg 10440
acagaacatc tgtgatgcca tccaaccaga ttacagggac aaacttgtgt ccatggtcaa 10500
cacaacccgt gtaacccacg tggaaaaacc tgtcaagtat gggcaagtcc tcacccctta 10560
ccacagggac cgagaggacg gcgccatcac aattgactcc agtcaaggcg ccacatttga 10620
tgtggtcaca ctgcatttgc ccactaaaga ttcactcaac aggcaaagag cccttgttgc 10680
tatcaccagg gcaagacatg ctatctttgt gtatgaccca cacaggcaat tgcagagcat 10740
gtttgatctt cctgcgaagg gcacacccgt caacctcgca gtgcaccgtg atgagcagct 10800
gatcgtactg gatagaaata ataaagaatg cacagttgct caggctctag gcaacggaga 10860
taaatttagg gccaccgaca agcgcgttgt agattctctc cgcgccattt gtgctgatct 10920
ggaagggtcg agctctccgc tccccaaggt cgcacacaac ttgggatttt atttctcacc 10980
tgatttgaca cagtttgcta aactcccggt agaccttgca ccccactggc ccgtggtgac 11040
aacccagaac aatgaaaagt ggccggatcg gctggttgcc agccttcgcc ctgtccataa 11100
gtatagccgt gcgtgcattg gtgccggcta tatggtgggc ccctcggtgt ttctaggcac 11160
ccctggggtc gtgtcatact acctcacaaa atttgtcaag ggcgaggctc aagtgcttcc 11220
ggagacagtc ttcagcaccg gccgaattga ggtggattgc cgggagtatc ttgatgacag 11280
ggagcgagaa gttgctgagt ccctcccaca tgccttcatt ggcgacgtca aaggcaccac 11340
cgttggggga tgtcatcatg tcacctccaa ataccttccg cgcttccttc ccaaggaatc 11400
agtcgcggta gtcggggttt cgagccccgg gaaagccgca aaagcagtgt gcacattgac 11460
ggatgtgtac ctcccagacc ttgaggccta cctccaccca gagactcagt ccaagtgctg 11520
gaaagttatg ttggacttca aggaagttcg actgatggtc tggaaagaca agacggccta 11580
tttccaactt gaaggccgct atttcacctg gtatcagctt gcaagctacg cctcgtacat 11640
ccgtgttcct gtcaactcca cggtgtatct ggacccctgc atgggccctg ccctttgcaa 11700
cagaagagtt gtcgggtcca cccattgggg agctgacctc gcagtcaccc cttatgatta 11760
cggtgctaaa atcatcttgt ctagcgctta ccatggtgaa atgcctcctg gatacaagat 11820
tctggcgtgc gcggagttct cgctcgacga cccagtcaag tacaaacaca cctggggttt 11880
tgaatcggat acagcgtatc tgtatgagtt caccggaaac ggtgaggact gggaggatta 11940
caatgatgcg tttcgtgcgc gccagaaagg gaaaatttat aaggccactg ctaccagcat 12000
gaagttttat tttcccccgg gccccgtcat tgaaccaact ttaggcctga attgaaatga 12060
aatggggtct atacaaagcc tcttcgacaa aattggccag ctttttgtgg atgctttcac 12120
ggaatttttg gtgtccattg ttgatatcat catatttttg gccattttgt ttggcttcac 12180
catcgccggt tggctggtgg tcttttgcat cagattggtt tgctccgcgg tattccgtgc 12240
gcgccctgcc attcaccctg agcaattaca gaagatccta tgaggccttt ctttctcagt 12300
gccgggtgga cattcccacc tggggggtaa aacacccttt ggggatgttt tggcaccata 12360
aggtgtcaac cctgattgat gaaatggtgt cgcgtcgaat gtaccgcgtc atggataaag 12420
cagggcaagc tgcctggaaa caggtggtga gcgaggctac gctgtctcgc attagtagtc 12480
tggatgtggt ggctcatttt caacatcttg ccgccattga agccgagacc tgtaaatatt 12540
tggcttctcg actgcccatg ctacacaacc tgcgcatgac agggtcaaat gtaaccatag 12600
tgtataatag cactttaaat caggtgtttg ctatttttcc aacccctggt tcccggccaa 12660
agcttcatga ttttcagcaa tggctaatag ctgtacattc ctccatattt tcctctgttg 12720
cagcttcttg tactcttttt gttgtgctgt ggttgcgggt tccaatgcta cgtactgttt 12780
ttggtttccg ctggttaggg gcaatttttc tttcgaactc atggtgaatt acacggtgtg 12840
tccaccttgc ctcacccgac aagcagccgc tgaggtcctt gaacccggta ggtctctttg 12900
gtgcaggata gggcatgacc gatgtgggga ggacgatcac gacgaactgg ggttcatggt 12960
tccgcctggc ctctccagcg aaagccactt gaccagtgtt tacgcctggt tggcgttcct 13020
gtccttcagc tacacggccc agttccatcc cgagatattt gggataggga acgtgagtga 13080
agtttatgtt gacatcaagc accaattcat ctgcgccgtt catgacgggc agaacaccac 13140
cttgcctcgc catgacaata tttcagccgt atttcagacc tactatcaac atcaggtcga 13200
cggcggcaat tggtttcacc tagaatggct gcgtcccttc ttttcctctt ggttggtttt 13260
aaatgtttcg tggtttctca ggcgttcgcc tgcaagccat gtttcagttc gagtctttca 13320
gacatcaaaa ccaacactac cgcagcatca ggctttgttg tcctccagga catcagctgc 13380
cttaggcatg gcgactcgtc ctttccgacg attcgcaaaa gctctcaatg ccgcacggcg 13440
atagggacac ctgtgtatat caccatcaca gccaatgtga cagatgagaa ttacttacat 13500
tcttctgatc tcctcatgct ttcttcttgc cttttctatg cttctgagat gagtgaaaag 13560
ggattcaagg tggtatttgg caatgtgtca ggcatcgtgg ctgtgtgtgt caactttacc 13620
agctacgtcc aacatgtcaa agagtttact caacgctcct tggtggtcga tcatgtgcgg 13680
ctgcttcatt tcatgacacc tgagaccatg aggtgggcaa ccgttttagc ctgtcttttt 13740
gccatcctac tggcaatttg aatgttcaag tatgttgggg aaatgcttga ccgcgggctg 13800
ttgctcgcga ttgctttctt tgtggtgtat cgtgccgttc tggtttgctg tgctcggcaa 13860
cgccaacagc agcagcagct ctcatttcca gttgatttat aacttgacgc tatgtgagct 13920
gaatggcaca gattggctgg cagaaaaatt tgattgggcg gtggagactt ttgtcatctt 13980
tcccgtgttg actcacattg tttcctattg tgcactcacc accagccatt tccttgacac 14040
agttggtctg gttactgtgt ccaccgccgg gttttatcac gggcggtatg tcttgagtag 14100
catctacgcg gtctgtgctc tggctgcgtt gatttgcttc gttattaggc ttgcgaagaa 14160
ctgcatgtcc tggcgctact cttgtaccag atataccaac ttccttctgg acactaaggg 14220
cagactctat cgttggcggt cgcccgttat catagaaaaa aggggtaagg ttgaggtcga 14280
aggtcatctg atcgacctca aaagagttgt gcttgatggt tccgtggcaa cccctttaac 14340
cagagtttca gcggaacaat ggggtcgtct ctagacgact tttgccatga tagcactgct 14400
ccacaaaagg tgcttttggc gttttccatt acctacacgc cagtaatgat atatgctcta 14460
aaggtaagtc gcggccgact gctagggctt ctgcaccttt tgatctttct gaattgtgct 14520
tttaccttcg ggtacatgac attcgcgcac tttcagagca caaatagggt cgcgctcgct 14580
atgggagcag tagttgcact tctttggggg gtgtactcag ccatagaaac ctggaaattc 14640
atcacctcca gatgccgttt gtgcttgcta ggccgcaagt acattctggc ccctgcccac 14700
cacgtcgaaa gtgccgcggg ctttcatccg attgcggcaa atgataacca cgcatttgtc 14760
gtccggcgtc ccggctccat tacggttaac ggcacattgg tgcccgggtt gaaaagcctc 14820
gtgttgggtg gcagaaaagc tgttaaacag ggagtggtaa accttgtcaa atatgccaaa 14880
taacaacggc aagcagcaaa agaaaaagaa ggggaatggc cagccagtca accagctgtg 14940
ccagatgctg ggtaaaatca tcgcccagca aaaccagtcc agaggcaagg gaccgggcaa 15000
gaaaagtaag aagaaaaacc cggagaagcc ccattttcct ctagcgaccg aagatgacgt 15060
caggcatcac ttcacccctg gtgagcggca attgtgtctg tcgtcgatcc agactgcctt 15120
taaccagggc gctggaactt gtaccctgtc agattcaggg aggataagtt acactgtgga 15180
gtttagtttg ccgacgcatc atactgtgcg cctgatccgc gtcacagcat caccctcagc 15240
atgatgggct ggcattcttt aggcacctca gtgtcagaat tggaagaatg tgtggtggat 15300
ggcactgatt gacattgtgc ctctaagtca cctattcaat tagggcgacc gtgtgggggt 15360
aaaatttaat tggcgagaac catgcggccg caattaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 15420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 15450
<210> 17
<211> 2352
<212> DNA
<213> Svinjski virus reproduktivnog i respiratornog sindroma
<400> 17
cctatcattg aaccaacttt aggcctgaat tgaaatgaaa tggggtctat gcaaagcctt 60
tttgacaaaa ttggccaact tttcgtggat gctttcacgg agttcttggt gtccattgtt 120
gatatcatta tatttttggc cattttgttt ggcttcacca tcgccggttg gctggtggtc 180
ttttgcatca gattggtttg ctccgcgata ctccgtgcgc gccctgccat tcactctgag 240
caattacaga agatcctatg aggcctttct ttctcagtgc caggtggaca ttcccacctg 300
gggaattaaa catcctttgg ggatgctttg gcaccataag gtgtcaaccc tgattgatga 360
aatggtgtcg cgtcgaatgt accgcatcat ggaaaaagca ggacaggctg cctggaaaca 420
ggtggtgagc gaggctacgc tgtctcgcat tagtagtttg gatgtggtgg ctcactttca 480
gcatcttgcc gccattgaag ccgagacctg taaatatttg gcctctcggc tgcccatgct 540
acacaacctg cgcatgacag ggtcaaatgt aaccatagtg tataatagta ctttgaatca 600
ggtgcttgct attttcccaa cccctggttc ccggccaaag cttcatgatt ttcagcaatg 660
gctaatagct gtacattcct ctatattttc ctctgttgca gcttcttgta ctctttttgt 720
tgtgctgtgg ttgcgggttc caatgctacg tattgctttt ggtttccgct ggttaggggc 780
aatttttctt tcgaactcac agtgaactac acggtgtgtc caccttgcct cacccggcaa 840
gcagccacag aggcctacga acctggcagg tctctttggt gcaggatagg gtatgatcgc 900
tgtggggagg acgatcatga tgaactaggg tttgtggtgc cgtctggcct ctccagcgaa 960
ggccacttga ccagtgttta cgcctggttg gcgttcctgt ctttcagtta cacagcccag 1020
ttccatcctg agatattcgg gatagggaat gtgagtcaag tttatgttga catcaggcat 1080
caattcattt gcgccgttca cgacgggcag aacgccactt tgcctcgcca tgacaatatt 1140
tcagccgtgt tccagactta ttaccaacat caagtcgacg gcggcaattg gtttcaccta 1200
gaatggctgc gtcccttctt ttcctcttgg ttggttttaa atgtctcttg gtttctcagg 1260
cgttcgcctg caagccatgt ttcagttcga gtcttgcaga cattaagacc aacaccaccg 1320
cagcggcagg ctttgctgtc ctccaagaca tcagttgcct taggtatcgc aactcggcct 1380
ctgaggcgtt tcgcaaaatc cctcagtgtc gtacggcgat agggacaccc atgtatatta 1440
ctgtcacagc caatgtaacc gatgagaatt atttgcattc ctctgacctt ctcatgcttt 1500
cttcttgcct tttctacgct tctgagatga gtgaaaaggg atttaaagtg gtatttggca 1560
atgtgtcagg catcgtggct gtgtgcgtca actttaccag ctacgtccaa catgtcaagg 1620
aatttaccca acgctccttg gtagtcgacc atgtgcggct gctccatttc atgacacctg 1680
agaccatgag gtgggcaact gttttagcct gtctttttgc cattctgttg gccatttgaa 1740
tgtttaagta tgttggggaa atgcttgacc gcgggctatt gctcgtcatt gctttttttg 1800
tggtgtatcg tgccgtcttg gtttgttgcg ctcgccagcg ccaacagcag caacagctct 1860
catttacagt tgatttataa cttgacgcta tgtgagctga atggcacaga ttggttagct 1920
ggtgaatttg actgggcagt ggagtgtttt gtcatttttc ctgtgttgac tcacattgtc 1980
tcctatggtg ccctcaccac cagccatttc cttgacacag tcggtctggt cactgtgtct 2040
accgccggct tttcccacgg gcggtatgtt ctgagtagca tctacgcggt ctgtgccctg 2100
gctgcgttga tttgcttcgt cattaggttt acgaagaatt gcatgtcctg gcgctactca 2160
tgtaccagat ataccaactt tcttctggac actaagggca gactctatcg ttggcggtcg 2220
cctgtcatca tagagaaaag gggtaaagtt gaggtcgaag gtcatctgat cgacctcaag 2280
agagttgtgc ttgatggttc cgcggcaacc cctataacca aagtttcagc ggagcaatgg 2340
ggtcgtcctt ag 2352
<210> 18
<211> 886
<212> DNA
<213> Svinjski virus reproduktivnog i respiratornog sindroma
<400> 18
atggggtcgt ccttagatga cttctgccat gatagcacgg ctccacaaaa ggtgcttttg 60
gcgttctcta ttacctacac gccagtgatg atatatgccc taaaagtaag tcgcggccga 120
ctgctagggc ttctgcacct tttgatcttc ctaaattgtg ctttcacctt cgggtacatg 180
acattcgtgc actttcagag cacaaacaag gtcgcgctca ctatgggagc agtagttgca 240
ctcctttggg gggtgtactc agccatagaa acctggaaat tcatcacctc cagatgccgt 300
ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattttg gcccctgccc accacgttga aagtgccgca 360
ggctttcatc cgatagcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggctcc 420
actacggtta acggcacatt ggtgcccggg ttgaaaagcc tcgtgttggg tggcagaaaa 480
gctgtcaaac agggagtggt aaaccttgtt aaatatgcca aataacaacg gcaagcagca 540
gaagaaaaag aagggggatg gccagccagt caatcagctg tgccagatgc tgggtaagat 600
catcgctcag caaaaccagt ccagaggcaa gggaccggga aagaaaaaca agaagaaaaa 660
cccggagaag ccccattttc ctctagcgac tgaagatgat gtcagacatc acttcacctc 720
tggtgagcgg caattgtgtc tgtcgtcaat ccagacagcc tttaatcaag gcgctggaac 780
ttgtaccctg tcagattcag ggaggataag ttacactgtg gagtttagtt tgccgacgca 840
tcatactgtg cgcctgatcc gcgtcacagc gtcaccctca gcatga 886

Claims (27)

1. Trovalentni imunogeni pripravak, naznačen time što sadrži topljivi dio cjelostaničnog pripravka bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); antigen iu svinjskog cirkovirusa tip 2 (PCV2); i antigen iz virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS), gdje topljivi dio pripravka M.hyo uglavnom ne sadrži ni (i) IgG niti (ii) imunokomplekse koji se sastoje od antigena vezanog na imunoglobulin.
2. Pripravak u skladu s patentnim zahtjevom 1, naznačen time što je topljivi dio pripravka M.hyo obrađen proteinom A ili proteinom G prije dodavanja imunogenom pripravku.
3. Pripravak u skladu s patentnim zahtjevom 1 ili zahtjevom 2, naznačen time što su topljivi dio pripravka M.hyo i antigen iz PCV2 u obliku tekućeg pripravka spremnog za upotrebu.
4. Pripravak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 3, naznačen time što je antigen iz virusa PRRS genetički modificirani živi virus.
5. Pripravak u skladu s patentnim zahtjevom 4, naznačen time što je genetički modificirani živi virus PRRS u obliku liofiliziranog pripravka.
6. Pripravak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 5, naznačen time što topljivi dio pripravka M.hyo sadrži najmanje jedan proteinski antigen iz M.hyo.
7. Pripravak u skladu s patentnim zahtjevom 6, naznačen time što topljivi dio pripravka M.hyo sadrži dva ili više proteinskih antigena iz M.hyo.
8. Pripravak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 7, naznačen time što pripravak izaziva zaštitni imunosni odgovor kod praseta protiv M.hyo, PCV2 i virusa PRRS.
9. Pripravak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 8, naznačen time što je antigen iz PCV2 u obliku kimernog cirkovirusa tip 1-tip 2, gdje se navedeni kimerni virus sastoji od inaktiviranog rekombinantnog svinjskog cirkovirusa tip 1 koji eksprimira protein ORF2 iz svinjskog cirkovirusa tip 2.
10. Pripravak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 8, naznačen time što je antigen iz PCV2 u obliku rekombinantnog proteina ORF2.
11. Pripravak u skladu s patentnim zahtjevom 10, naznačen time što se rekombinantni protein ORF2 eksprimira iz bakulovirusnog vektora.
12. Pripravak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 11, naznačen time što pripravak dodatno sadrži adjuvans.
13. Pripravak u skladu s patentnim zahtjevom 12, naznačen time što se adjuvans bira iz skupine koju čine ulje u vodi kao adjuvans, polimer i voda kao adjuvans, voda u ulju kao adjuvans, aluminijev hidroksid kao adjuvans, vitamin E kao adjuvans i njihove kombinacije.
14. Pripravak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 13, naznačen time što pripravak dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
15. Pripravak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 14, naznačen time što pripravak izaziva zaštitni imunosni odgovor protiv M.hyo, PCV2 i virusa PRRS kada se primijenjuje u jednoj dozi.
16. Postupak imuniziranja praseta protiv M.hyo, PCV2 i virusa PRRS, naznačen time što se sastoji u primjeni pripravka u skladu s patentnim zahtjevom 1 na prasetu.
17. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 16, naznačen time što se pripravak primijenjuje intramuskularno, intradermalno, transdermalno ili supkutano.
18. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 16 ili zahtjevom 17, naznačen time što se pripravak primijenjuje u jednoj dozi.
19. Postupak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 16 do 18, naznačen time što se pripravak primijenjuje na prasadi koja ima protutijela protiv najmanje jednog od M.hyo, PCV2 i virusa PRRS dobivena od majke.
20. Postupak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 16 do 19, naznačen time što se pripravak primijenjuje na prasadi staroj 3 tjedna ili starijoj.
21. Komplet naznačen time što se sastoji od: prve bočice, koja sadrži pripravak koji sadrži i antigen iz PCV2 i topljivi dio cjelostaničnog pripravka bakterije Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), gdje topljivi dio pripravka M.hyo uglavnom ne sadrži ni (i) IgG niti (ii) imunokomplekse između antigena i imunoglobulina; i druge bočice, koja sadrži antigen iz virusa PRRS.
22. Komplet u skladu s patentnim zahtjevom 21, naznačen time što je pripravak u prvoj bočici iz kompleta osiguran kao tekući pripravak spreman za upotrebu.
23. Komplet u skladu s patentnim zahtjevom 21 ili zahtjevom 22, naznačen time što je antigen iz virusa PRRS u drugoj bočici u obliku liofiliziranog pripravka.
24. Komplet u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 21 do 23, naznačen time što komplet dodatno sadrži upute o kombiniranju sadržaj prve bočice sa sadržajem druge bočice.
25. Komplet u skladu s patentnim zahtjevom 24, naznačen time što upute dodatno govore o primjeni kombiniranog sadržaja prve i druge bočice na prasetu.
26. Postupak priprave imunogenog pripravka, naznačen time što se postupak sastoji u: i) uzgoju M.hyo u pogodnim medijima u vremenskom rasponu od 18-144 sati; ii) naknadnom inaktiviranju kulture M.hyo; iii) prikupljanju tekućine iz inaktivirane kulture M.hyo, gdje tekućina iz inaktivirane kulture M.hyo sadrži cjelostanični pripravak M.hyo, koji sadrži i topljivu tekuću frakciju i netopljivi stanični materijal; iv) odvajanju topljive tekuće frakcije od netopljivog staničnog materijala; v) uglavnom uklanjanju i IgG i imunokompleksa između antigena i imunoglobulina iz odvojene topljive tekuće frakcije kako bi se dobilo topljivi dio cjelostaničnog pripravka M.hyo; i vi) naknadnom kombiniranju topljivog dijela cjelostaničnog pripravka M.hyo s antigenom iz PCV2 i antigenom iz virusa PRRS.
27. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 26, naznačen time što se vi) sastoji u kombiniranju tekućeg pripravka spremnog za upotrebu, koji sadrži i antigen iz PCV2 i topljivi dio M.hyo s liofiliziranim antigenom iz virusa PRRS.
HRP20140956AA 2012-04-04 2014-10-03 Kombinirano cjepivo protiv pcv, bakterije mycoplasma hyopneumoniae i prrs HRP20140956A2 (hr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261620189P 2012-04-04 2012-04-04
PCT/US2013/035091 WO2013152086A1 (en) 2012-04-04 2013-04-03 Pcv/mycoplasma hyopneumoniae/prrs combination vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20140956A2 true HRP20140956A2 (hr) 2015-04-24

Family

ID=48140160

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HRP20140956AA HRP20140956A2 (hr) 2012-04-04 2014-10-03 Kombinirano cjepivo protiv pcv, bakterije mycoplasma hyopneumoniae i prrs
HRP20190466TT HRP20190466T1 (hr) 2012-04-04 2019-03-08 Kombinacijsko cjepivo protiv pcv/mycoplasma hyopneumoniae/prrs

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HRP20190466TT HRP20190466T1 (hr) 2012-04-04 2019-03-08 Kombinacijsko cjepivo protiv pcv/mycoplasma hyopneumoniae/prrs

Country Status (33)

Country Link
US (2) US9125886B2 (hr)
EP (2) EP3508217A1 (hr)
JP (1) JP6271504B2 (hr)
KR (1) KR101808903B1 (hr)
AR (1) AR090614A1 (hr)
AU (1) AU2013243540C1 (hr)
BR (1) BR112014024775B1 (hr)
CA (1) CA2869601C (hr)
CL (1) CL2014002676A1 (hr)
CO (1) CO7160027A2 (hr)
CR (1) CR20140438A (hr)
CY (1) CY1121578T1 (hr)
DK (1) DK2833909T3 (hr)
ES (1) ES2719483T3 (hr)
GT (1) GT201400212A (hr)
HK (1) HK1207283A1 (hr)
HR (2) HRP20140956A2 (hr)
HU (1) HUE042405T2 (hr)
LT (1) LT2833909T (hr)
MX (2) MX336502B (hr)
MY (1) MY168549A (hr)
NI (1) NI201400118A (hr)
PH (1) PH12014502252B1 (hr)
PL (1) PL2833909T3 (hr)
PT (1) PT2833909T (hr)
RS (1) RS58480B1 (hr)
RU (1) RU2644256C2 (hr)
SI (1) SI2833909T1 (hr)
TR (1) TR201905176T4 (hr)
TW (1) TWI504406B (hr)
UA (1) UA114504C2 (hr)
WO (1) WO2013152086A1 (hr)
ZA (1) ZA201407133B (hr)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL209773B1 (pl) 2001-07-02 2011-10-31 Pfizer Prod Inc Zastosowanie bakteryny Mycoplasma hyopneumoniae do wytwarzania szczepionki
US8546149B2 (en) 2010-08-27 2013-10-01 Intervet Inc. Potency test for vaccine formulations
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
UA114504C2 (uk) * 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
UA114503C2 (uk) * 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
EP3730148A3 (en) 2012-12-28 2021-03-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Immunogenic composition comprising mycoplasma antigens
SG11201505089YA (en) 2012-12-28 2015-07-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Method of making a mycoplasma vaccine
US9649370B2 (en) 2013-05-08 2017-05-16 Protatek International, Inc. Vaccine for PCV2 and mycoplasma
JP6434017B2 (ja) * 2013-11-21 2018-12-05 アグリカルチュラル テクノロジー リサーチ インスティテュート マイコプラズマ属菌種の感染を予防する組成物
WO2015082458A1 (en) * 2013-12-03 2015-06-11 Intervet International B.V. Vaccine against porcine circo virus type 2
US20160303219A1 (en) * 2013-12-03 2016-10-20 Intervet Inc. Swine Vaccine Against PRRS and Lawsonia Intracellularis
CN104056265B (zh) * 2014-07-11 2016-04-27 江苏南农高科技股份有限公司 猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法
WO2016038197A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Intervet International B.V. Vaccine for use in protecting offspring of a sow against porcine endemic diarrhea virus
CN107073103A (zh) * 2014-09-12 2017-08-18 英特维特国际股份有限公司 用于保护猪免于猪流行性腹泻病毒的疫苗
EP3229832A1 (en) * 2014-12-11 2017-10-18 Intervet International B.V. Process for ready-to-use pcv2/m.hyo combination vaccine
MY191905A (en) * 2015-12-28 2022-07-18 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc M hyo multivalent vaccine and uses thereof
EP3432920A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Intervet International B.V. A vaccine for intradermal application against pcv2 and prrs virus infection
US20190105385A1 (en) * 2016-03-23 2019-04-11 Intervet Inc. A combination vaccine against pcv2 virus and mycoplasma hyopneumoniae infection
RU2724549C1 (ru) * 2016-08-09 2020-06-23 Эгрикалчурал Текнолоджи Рисерч Инститьют Композиция для профилактики и лечения инфекции mycoplasma hyorhinis и способ получения указанной композиции
EP3554537A2 (en) * 2016-12-14 2019-10-23 Zoetis Services LLC Effective vaccination against european strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus prior to weaning
PL3558351T3 (pl) * 2016-12-23 2022-03-21 Intervet International B.V. Szczepionka skojarzona dla świń
MX2019012220A (es) * 2017-04-13 2019-12-09 Intervet Int Bv Vacunas que contienen patogenos de cerdo para uso no mixto asociado.
CN109280642B (zh) * 2017-07-21 2022-07-22 浙江海隆生物科技有限公司 CHO细胞株及其制备方法和使用该CHO细胞株制备猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用
CA3085535A1 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 Hipra Scientific, S.L.U. Intradermal combination vaccine against mycoplasma and porcine circovirus
CN112088013A (zh) * 2018-03-26 2020-12-15 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 制备免疫原性组合物的方法

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4606918A (en) 1983-08-22 1986-08-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
US4681870A (en) * 1985-01-11 1987-07-21 Imre Corporation Protein A-silica immunoadsorbent and process for its production
JPH0832637B2 (ja) 1985-02-14 1996-03-29 アクゾ・エヌ・ヴエー 合成免疫原
US5084269A (en) 1986-11-06 1992-01-28 Kullenberg Fred W Adjuvant for dose treatment with antigens
ES2052685T3 (es) 1987-03-17 1994-07-16 Akzo Nv Metodo para producir un adyuvante libre.
US5252328A (en) * 1987-03-26 1993-10-12 Martin Marietta Energy Systems, Inc. Mycoplasma hyopneumoniae antigen and uses therefor
EP0283840A3 (en) 1987-03-26 1989-08-09 Ml Technology Ventures, L.P. Mycoplasma hyopneumoniae antigen and uses therefor
AU626271B2 (en) 1987-11-03 1992-07-30 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccine adjuvant
US4985243A (en) 1988-01-20 1991-01-15 Ml Technology Ventures, L.P. Composition and method for protecting against diseases caused by microorganisms
US5240706A (en) 1989-04-07 1993-08-31 Ml Technology Ventures, L.P. Intranasal administration of Mycoplasma hyopneumoniae antigen
ZA906806B (en) 1989-08-31 1991-06-26 Ici Australia Operations Plants
ATE160699T1 (de) 1990-05-29 1997-12-15 American Cyanamid Co Impfstoff gegen die pneumonie bei schweinen und verfahren zu seiner herstellung
US6113916A (en) 1990-05-29 2000-09-05 American Cyanamid Company Method of enhancing cell mediated immune responses
US5695769A (en) 1990-06-13 1997-12-09 Pfizer Inc. Pasteurella multocida toxoid vaccines
US5565205A (en) 1990-08-16 1996-10-15 Solvay Animal Health, Inc. Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof
CA2103460C (en) 1991-06-06 2000-09-26 Gert Wensvoort Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits
US5269315A (en) 1991-08-16 1993-12-14 The Regents Of The University Of California Determining the nature of brain lesions by electroencephalography
DK0601062T4 (da) 1991-08-26 2001-03-14 Univ Minnesota SIRS-vaccine og diagnosefremgangsmåde
ES2083764T5 (es) 1991-10-14 2009-04-01 Intervet International Bv Vacuna para el sindrome respiratorio reproductivo porcino (srrp) y diagnostico.
ES2194841T3 (es) 1991-11-15 2003-12-01 Pfizer Procedimiento de produccion de vacunas bacterianas gram negativas.
FR2686097B1 (fr) 1992-01-14 1994-12-30 Rhone Merieux Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie.
US5338543A (en) 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
US5534256A (en) 1992-07-02 1996-07-09 University Of Saskatchewan Haemophilus somnus outer membrane protein extract enriched with iron-regulated proteins
US6773908B1 (en) 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6380376B1 (en) 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6251397B1 (en) 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
US6592873B1 (en) 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US5695766A (en) 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
CA2189979C (en) 1994-05-10 2011-04-19 Hsien-Jue Chu Improved modified live brsv vaccine
BE1008978A5 (fr) 1994-12-27 1996-10-01 Solvay Adjuvants pour vaccins.
US5788962A (en) 1995-01-17 1998-08-04 The Curators Of The University Of Missouri DNA sequences coding for mycoplasma hyopneumoniae surface antigens, corresponding proteins and use in vaccines and diagnostic procedures
AUPN178995A0 (en) 1995-03-16 1995-04-13 University Of Melbourne, The Antigen composition
US5820869A (en) 1995-06-07 1998-10-13 American Home Products Corporation Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline immunodeficiency virus infection
DE19601754A1 (de) 1996-01-19 1997-07-24 Hoechst Ag Dictyocaulus viviparus Antigen zur Diagnose des Lungenwurmbefalls und zur Vakzinierung
US5846735A (en) 1996-04-18 1998-12-08 University Of Iowa Research Foundation Hepatitis C virus Fc-binding function
GB9622159D0 (en) 1996-10-24 1996-12-18 Solvay Sociutu Anonyme Polyanionic polymers as adjuvants for mucosal immunization
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
KR100615109B1 (ko) 1996-12-20 2006-08-22 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 모렉셀라 카타르할리스의 ｕｓｐａ1, ｕｓｐａ2 항원
WO1999026664A1 (en) 1997-11-26 1999-06-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Recombinant mycoplasma hyopneumoniae vaccine
US6342231B1 (en) 1998-07-01 2002-01-29 Akzo Nobel N.V. Haemophilus parasuis vaccine and diagnostic
CA2440933A1 (en) 1998-12-22 2000-06-22 Pfizer Products Inc. An infectious cdna clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus and uses thereof
US6632439B2 (en) 1999-09-29 2003-10-14 Novartis Animal Health, Inc. Fusobacterium necrophorum vaccine and method for making such vaccine
US6585981B1 (en) 2000-07-27 2003-07-01 Regents Of The University Of Minnesota Temperature-sensitive live vaccine for Mycoplasma hyopneumoniae
MY129765A (en) 2000-12-19 2007-04-30 Wyeth Corp Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
US7018638B2 (en) 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
WO2003004051A2 (en) * 2001-07-02 2003-01-16 Pfizer Products Inc. Mycoplasma hyopneumoniae vaccine and methods for reducing mycoplasma bovis pneumonia in cattle
PL209773B1 (pl) 2001-07-02 2011-10-31 Pfizer Prod Inc Zastosowanie bakteryny Mycoplasma hyopneumoniae do wytwarzania szczepionki
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
BR0312274A (pt) 2002-06-28 2007-06-19 Univ Iowa State Res Found Inc polipeptìdeos imunogênicos de mycoplasma hyopneumoniae
EP1651265B1 (en) 2003-07-24 2008-04-23 Merial Limited Vaccine formulations comprising an oil-in-water emulsion
WO2006074986A2 (en) 2005-01-13 2006-07-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prrs vaccines
CA2620727C (en) * 2005-09-09 2015-06-16 Intervet International B.V. Porcine circovirus type 2 vaccine
EP1792996A1 (en) 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
EP1968630B1 (en) 2005-12-29 2018-01-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multivalent pcv2 immunogenic compositions
KR101358517B1 (ko) 2006-04-10 2014-02-06 인터벳 인터내셔널 비.브이. 마이코플라즈마 ｐｒｒｓｖ에 대한 백신
RU2408386C2 (ru) * 2006-04-10 2011-01-10 Интервет Интернэшнл Б.В. Вакцина против микоплазмы и prrsv
CN101883581A (zh) 2007-11-06 2010-11-10 惠氏有限责任公司 猪肺炎支原体无毒力佐剂化活疫苗
EP2242511A4 (en) 2008-01-23 2012-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmed IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE PCV2, AND METHODS FOR PRODUCING SUCH COMPOSITIONS
TWI449533B (zh) * 2008-04-18 2014-08-21 Intervet Int Bv 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗
US8444989B1 (en) 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
KR20130054466A (ko) 2008-10-16 2013-05-24 화이자 인코포레이티드 토크 테노 바이러스(ｔｔｖ) 분리물 및 조성물
JP5865350B2 (ja) 2010-05-11 2016-02-17 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 母系由来の抗体の存在下での投与に適したマイコプラズマ・ハイオニュ−モニエに対するワクチン
US8546149B2 (en) 2010-08-27 2013-10-01 Intervet Inc. Potency test for vaccine formulations
BR112013004594B1 (pt) * 2010-08-27 2020-07-28 Intervet International B. V. método para a determinação de um conteúdo de antígeno
UA108902C2 (uk) 2010-11-10 2015-06-25 Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування
MX362166B (es) 2012-03-07 2018-12-14 Ceva Sante Animale Nueva vacuna veterinaria.
UA114504C2 (uk) * 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
US9120859B2 (en) * 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
UA114503C2 (uk) * 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae

Also Published As

Publication number Publication date
MX336502B (es) 2016-01-21
DK2833909T3 (en) 2019-04-01
GT201400212A (es) 2015-09-23
AU2013243540A1 (en) 2014-10-09
EP3508217A1 (en) 2019-07-10
PH12014502252A1 (en) 2014-12-15
CO7160027A2 (es) 2015-01-15
MX2014012016A (es) 2014-11-10
MY168549A (en) 2018-11-12
BR112014024775B1 (pt) 2021-06-08
US20130266603A1 (en) 2013-10-10
RU2644256C2 (ru) 2018-02-08
MX354773B (es) 2018-03-20
PT2833909T (pt) 2019-05-13
SI2833909T1 (sl) 2019-05-31
JP2015512450A (ja) 2015-04-27
CA2869601C (en) 2018-06-12
ZA201407133B (en) 2017-02-22
HK1207283A1 (en) 2016-01-29
KR101808903B1 (ko) 2017-12-13
UA114504C2 (uk) 2017-06-26
RS58480B1 (sr) 2019-04-30
US20150284678A1 (en) 2015-10-08
CY1121578T1 (el) 2020-05-29
ES2719483T3 (es) 2019-07-10
CN104271153A (zh) 2015-01-07
JP6271504B2 (ja) 2018-01-31
EP2833909A1 (en) 2015-02-11
TW201345548A (zh) 2013-11-16
PL2833909T3 (pl) 2019-07-31
AU2013243540B2 (en) 2017-10-19
LT2833909T (lt) 2019-04-10
CL2014002676A1 (es) 2014-12-12
CA2869601A1 (en) 2013-10-10
HRP20190466T1 (hr) 2019-05-03
AR090614A1 (es) 2014-11-26
BR112014024775A2 (pt) 2017-07-11
PH12014502252B1 (en) 2014-12-15
WO2013152086A1 (en) 2013-10-10
TWI504406B (zh) 2015-10-21
NI201400118A (es) 2015-03-05
KR20150002748A (ko) 2015-01-07
US9650601B2 (en) 2017-05-16
CR20140438A (es) 2014-11-12
TR201905176T4 (tr) 2019-05-21
US9125886B2 (en) 2015-09-08
EP2833909B1 (en) 2019-02-06
HUE042405T2 (hu) 2019-06-28
AU2013243540C1 (en) 2018-03-01
RU2014140108A (ru) 2016-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11154609B2 (en) PCV/mycoplasma hyopneumoniae vaccine
AU2013243535C1 (en) Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
AU2013243540C1 (en) PCV/Mycoplasma hyopneumoniae/PRRS combination vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
AIPI Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application
PPPP Transfer of rights

Owner name: ZOETIS SERVICES LLC, US

PNAN Change of the applicant name, address/residence

Owner name: ZOETIS SERVICES LLC, US

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20190327

Year of fee payment: 7

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20200320

Year of fee payment: 8

ODBI Application refused