KR100615109B1

KR100615109B1 - 모렉셀라 카타르할리스의 ｕｓｐａ1, ｕｓｐａ2 항원

Info

Publication number: KR100615109B1
Application number: KR1019997005332A
Authority: KR
Inventors: 에릭제이. 한센; 크리스토퍼 에이비; 레즈리디. 코프; 이소벨 멕시버; 마이클제이. 피스크; 로스 프레덴버르그
Original assignee: 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템; 웨이쓰 홀딩스 코퍼레이션
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2006-08-22
Also published as: US6310190B1; WO1998028333A3; JP2001515467A; ATE497004T1; US7344724B2; EP0948625A2; BR9714160A; AU5720198A; AU746442B2; US20050137131A1; AU2011201228A1; EP0948625B1; US20050131221A1; CN1159441C; WO1998028333A2; US20030032772A1; US7569683B2; US7576194B2; CA2274495C; CN1251611A

Abstract

본 발명은 두 개의 신규한 UspA1 및 UspA2 단백질, 이의 각 유전자 uspA1, uspA2의 존재를 설명한다. 각 단백질에는 두 개 단백질간에 보존된 부분을 포함하고, MAb 17C7이 인지하는 에피토프로 구성된다. 이들 한 개 이상의 종이 응집하여 매우 분자량이 큰(200kDa이상) UspA 항원을 만든다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)을 치료 및 연구하는데, 진단 및 치료 방법, 이의 조성물에 대해 설명한다.

Description

모렉셀라 카타르할리스의 ＵＳＰＡ1, ＵＳＰＡ2 항원{USPA1 and USPA2 antigens of Moraxella catarrhalis}

본 발명은 미생물, 임상 세균 분야에 관계한다. 좀더 구체적으로는 각 단백질 USPA1와 USPA2를 인코드하는 uspA1 및 uspA2 유전자 서열에 관계하는데, 이들 두 유전자는 단클론 항체(MAb) 17C7와 에피토프 반응성을 가지고, 이는 면역 진단 및 면역 예방에 유용한 에피토프를 제공한다.

예전에는 브란하멜라 카라르할리스(Branhamella catarrhalis) 또는 나이제리아 카타르할리스(Neisseria catarrhalis)로 알려진 모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)는 상측 호흡기관의 무해한 부패균(비병원균으로 사물(死物)에 기생)으로 알려져 있었다(Catlin, 1990; Berk, 1990). 그러나, 지난 10년 동안에 이들 유기체가 중요한 사람의 병인균이라는 것이 밝혀졌다. 또한, 이와 같은 그램-음성 쌍구균은 상당수의 사람 감염의 원인이 되었다(Murphy, 1989). 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)는 또한 급성 및 만성 이염 매체의 세 번째로 가장 흔한 원인인 것으로 알려졌는데(Catlin, 1990; Faden et al., 1990; 1991; Marchant, 1990), 1989 Consensus Report에 따르면, 중이염은 유아 및 어리이들이 가장 치료를 많이 받는 흔한 질병 중에 하나이다. 이 유기체는 하부 호흡기관에 전반적으로 감염이 되는 상악 부비강염의 원인이 되고(Murphy and Loeb, 1989), 만성 폐 질환에 있는 환자의 기관지-폐 감염의 가장 중요한 원인이 되며, 이보다 빈도는 적지만 면역 절충된 환자의 경우에는 전신 감염의 원인이 된다(Melendez and Johnson, 1990; Sarubbi et al., 1990; Schonheyder and Ejlertsen, 1989; Wright and Wallace, 1989).

1989 Consensus Report에서는 중이염은 유아 및 어린이뿐만 아니라 모든 연령대의 특정 집단에서 발생하기 때문에, 중이염을 예방하는 것이 중요한 치료 목표가 된다고 결론을 내렸다. 사실, 중이염을 치료하는데 총 예산이 매년 적어도 25억불 책정되어있다. 여러 가지 원인으로 인하여 이 질병을 예방하는데 가장 바람직한 백신이 확인되었다. 예를 들면, 백신이 중이염 발생을 약 30% 줄일 수 있을 경우에, 매년 치료비 예산이 적어도 $400만불을 절약할 수 있다. 그러나, 중이염을 일으키는 3개 병인균 중 두 가지인 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae) 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)에 대해서는 백신이 개발되고 있지만, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 백신은 개발되지 않고 있다. 이는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)가 전체 중이염 감염에서 약 17-20%을 차지하는 까다로운 것이고(Murphy, 1989), 또한 어린이에서는 가장 심각한 중이염(van Cauwenberge et al., 1993) 및 지속적인 기침의 원인이 되는 것이다(Gottfarb and Brauner, 1994). 노년층에서는 만성 폐색성 폐 질환(COPD) 및 다른 만성 심장폐 질환(Boyle et al., 1991; Davies and Maesen, 1988; Hager et al., 1987)을 앓고 있는 환자에 감염된다.

이들의 발병력을 인지하고 있음에도 불구하고, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 의해 질병의 발생시키는 과정 또는 이 병인균에 대한 면역성을 지배하는 숙주 인자등에 대해서 연구된 것은 거의 없다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 중이염에 반응하는 항체는 항원으로 전체 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)을 이용하고, 항체 소스로는 급성 및 회복기 혈청 또는 중이 유체를 이용하여 ELISA 시스템으로 증명할 수 있다(Leinonen et al., 1981). 성인에서 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염 동안에 혈청 세균성 항체가 발생되는 것은 통상적인 컴플리먼트 과정에 따라 달라진다(Chapman et al., 1985). 최근에는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 중이염에 걸린 어린이에게서 중이에서 반응하는 항체가 발생었으나 균일한 방법으로 전신 항체 반응을 일으키는데에는 실패하였다고 보고하고 있다(Faden et al., 1992).

감염에 대해 사람 면역 반응의 중요한 표적으로 작용할 수 있는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 항원을 확인하고 특징을 조사하려는 시도가 있었다(Murphy, 1989; Goldblatt et al., 1990; Murphy et al., 1990). 일반적으로, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 표면은 외측 막(OMPs), 리포올리고사카라이드(LOS) 및 털로 구성되어 있다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)는 다른 그람-음성 세균과는 다소 차이가 있어, 세포 외피의 계면활성제 분절을 이용한 이들 유기체의 외측 막을 분리하려는 시도가 있었는데, 이는 일관성있는 결과를 얻지 못하여 실패하였다(Murphy, 1989; Murphy and Loeb, 1989). 또한, 준비물은 세포질 막이 오염된 것으로 나타나, 이는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 세포 외피가 독특한 성질을 가진다는 것을 의미한다.

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 035E의 외측 막 소포에 대해 만든 다클론성 항혈청으로 수동 면역을 시켰을 경우에, 이형 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 TTA24에 의한 폐 공격으로부터 보호할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)으로 능동 면역을 하였을 경우에, 공격 후에 폐에서 이들 유기체가 제거되는 것이 강화되었다. 폐에서 유기체를 제거하는데에 면역화반응의 긍정적인 효과는 항체가 이들 병인균에 대해 면역 보호역할을 한다는 것을 나타낸다. 또한, 이형 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주에 의한 폐 공격에 대해 보호된 것은 하나 이상의 보존된 표면 항원이 폐에서 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)를 제거하는데 기능을 하는 항체의 표적이 된다는 것을 설명하는 것이다.

외측 막 단백질(OMPs)은 이와 같은 포집되지 않은 유기체의 주요 항원 결정부위가 되는데(Bartos and Murphy, 1988), 여러 가지 다른 균주들이 상당히 유사한 OMP 프로파일을 가진다(Bartos and Murphy, 1988; Murphy and Bartos, 1989). 적어도 3가지 다른 표면 노출된 외측 막 항원이 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 간에 잘 보존된 것으로 알려져 있는데, 여기에는 81kDa CopB OMP(Helminen et al., 1993b), 열-변성 CD OMP(Murphy et al., 1993), 고분자량 UspA 항원(Helminen et al., 1994)등이 포함된다. 이들 세 가지 항원중에, CopB 단백질 및 UspA 항원은 동물 모델에서 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대해 생물학적 활성을 나타내는 항체에 결합하는 것으로 보인다(Helminen et al., 1994; Murphy et al., 1993).

MAb(17C7로 지정)는 UspA[SDS-PAGE에서 적어도 250kDa 분자량 수준으로 이동하는 매우 분자량이 큰 단백질(Helminen et al., 1994; Klingman and Murphy, 1994)]에 결합한다. MAb 17C7는 수동 면역화 연구에서 이용하였을 경우에 쥐의 폐로부터 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 제거를 강화시키고, 콜로니 블랏 방사능면역검사 분석에서는 검사를 한 모든 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 분리물에 결합을 한다. 이와 같은 동일한 MAb는 미국 특허 5,552,146에서 설명한 것과 같이 약 100 kDa의 또 다른 항원 밴드와 그 강도는 비록 약하지만 결합을 한다. MAb 17C7에 결합하는 단백질 생성물을 발현시키는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 염색체 DNA 단편을 포함하는 재조합 박테리오파아지가 확인되었고, 이는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 고유 UspA 항원의 것과 유사한 또는 구별되지 않는 속도로 이동한다(Helminen et al., 1994).

호흡기 기관 감염에 이들 병인균의 중요성이 증가되면서, 발병성 발현 및 면역성에 관여하는 이들 유기체의 표면 성분을 확인하는 것도 더욱 비중이 커지고 있다. 현재, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대해 보호성 항체를 유도하는 다른 OMP, LOS 또는 털에 대한 이용할 수 있는 백신은 없다. 따라서, 면역 예방 물질을 준비하는데 이용할 수 있는 유용한 물질을 확인하고, 특징을 조사할 필요가 있다. 또한, 항원등이 확인되면, 백신으로 준비할 수 있는 방법 및 조성물을 제공하고, 이때 그 제공 양은 예방 프로토콜에서 대규모로 이용할 수 있도록 한다.

발명의 요약

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 UspA1 및 UspA2 단백질 및 이를 인코드하는 유전자를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 방법은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염의 치료 및 저해 물질을 준비하는데 있어서, 이들 신규한 단백질을 이용하는 방법을 제공한다. 또한, 항체 치료 및 면역예방과 같은 다른 기술을 통하여 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염을 저해하거나 예방할 수 있다.

이들 목적을 만족시키기 위해, 치료 또는 예방 조성물 또는 백신을 만드는데 기초로 이용할 수 있는 UspA1 및 UspA2 에피토프 핵심 서열을 제공하는데, 조성물은 항원 반응을 유도하는 길이가 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60 아미노산 및 제약학적 수용가능한 완충액 또는 희석제로 구성된다. 이들 펩티드는 담체, 어쥬번트, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 효과적인 항원성 반응을 보유하거나 강화시킬 수 있는 또 다른 분자에 결합되어 있을 수 있다. 또는, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 또는 다른 병인균에 대한 항원성 반응을 유도하는 또 다른 펩티드 또는 다른 분자에 결합되어 있을 경우에 그 자체다 담체로 작용될 수 있다. 예를 들면, UspA2는 올리고사카라이드의 담체로 작용할 수 있다.

한 구체예에서, UspA1 및 UspA2의 에피토프 핵 서열은 아미노산 서열이 AQQQDQH(서열:17)로 된 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60개 아미노산의 하나이상 분리된 펩티드로 구성된다.

또 다른 구체예에서는 핵산 uspA1 및 uspA2를 제공하는데, 이들은 각각 UspA1 및 UspA2를 인코드하고, 뿐만 아니라 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 분리체 O35E, TTA24, TTA37, O46E의 UspA1 및 UspA2 항원의 아미노산 서열도 제공한다. 유전자 uspA1 및 uspA2의 핵산 단편 및 UspA1 및 UspA2 항원은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염을 치료, 저해 또는 예방하는 치료요법적 또는 예방학적 조성물 또는 백신의 준비 및 이용에 가치가 있을 것이다.

또 다른 구체예에서, 포유류에 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 확인된 에피토프 핵 서열을 포함하는 적어도 20 내지 60개 아미노산으로된 분리된 펩티드와 제약학적 수용가능한 완충액 또는 희석제로 구성된 항원 조성물에 제공하는 단계로 구성된다.

또 다른 구체예에서는, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염을 진단하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 샘플에 UspA1 또는 UspA2 항원의 에피토프 핵 서열의 잔기에 상응하는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 아미노산 서열이 존재하는지를 결정하는 단계로 구성된다. 이 방법은 UspA1 또는 UspA2 항원에 대한 면역 반응 또는 핵산 서열의 PCR^TM 감지로 구성된다.

또 다른 구체예에서는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염된 개인을 치료하는 방법을 제공하는데, 이는 UspA1 또는 UspA2 에피토프 핵 서열로 확인된 아미노산 서열의 적어도 10개 연속 잔기로 구성된 약 20 내지 약 60개 아미노산으로 된 분리된 펩티드를 개인에 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 구체예에서, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염을 예방하거나 제한하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 UspA1 또는 UspA2의 확인된 에피토프 핵 부분과 면역학적으로 반응할 수 있는 항체를 개체에 제공하는 것으로 구성된다.

또 다른 구체예에서, UspA1 또는 UspA2 및 두 가지에 면역학적으로 결합할 수 있는 항체와 반응성이 있는 펩티드를 스크린하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 펩티드를 제공하고, 펩티드에 항체를 접촉시키고, 그 다음 펩티드에 항체 결합을 결정하는 단계로 구성된다. 이 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, RIA, 면역 친화성 분리등의 면역 검사로 구성된다.

추가 구체예에서, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 보호성 면역 반응을 유도할 수 있는 UspA1 또는 UspA2 펩티드 능력을 스크린하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 펩티드를 제공하고, 적절한 형태로 실험 동물에 투여하고, 동물에 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)가 공격하도록 하고, 동물에서 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염을 에세이하는 것으로 구성된다. 이용된 동물은 쥐가 될 수 있고, 쥐의 폐에 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)를 노출시켜 공격을 받도록 하고, 검사방법은 쥐에서 폐 정화도를 평가하는 것으로 구성된다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명에 나타낸다. 그러나, 본 발명의 적절한 구체예로 본 발명을 설명하지만, 이는 단지 설명을 하기 위함이고, 본 발명의 범위내에서 다양한 변화 및 수정이 가능하다는 것을 당업자는 인지할 것이다.

다음 도면은 본 명세서의 일부이고, 본 발명의 특정 면을 설명한다. 본 발명은 여기에서 제시한 특정 구체에와 함께 이들 도면을 이용하면 이해에 도움이 될 것이다.

도 1은 uspA1 유전자 프로브를 이용하여, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주로부터 PvuII-절단된 염색체 DNA의 서든 블랏 분석을 한 것이다. 박테리아 균주 명칭은 윗부분에 있고, 좌측에는 킬로베이스(kb) 위치 표식이 있다.

도 2A는 야생형 균주 O35E와 동계 uspA1 돌연변이 균주의 전체 세포 용해물질에 존재하는 단백질을 나타낸다. 이와 같은 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, Coomassie 블루로 착색한다. 좌측 라인(WT)에는 야생형 균주를 나타내고, 우측 라인(MUT)에는 돌연변이를 포함한다. 화살표는 단백질 크기가 120 kDa인 것을 나타내고, 이는 야생형에는 존재하는데, 돌연변이형에는 존재하지 않는다. kDa 표시는 좌측에 있다.

도 2B는 야생형 균주 O35E와 동계 uspA1 돌연변이 균주의 전체 세포 용해물질의 웨스턴 블랏 분석을 한 것이다. 이들 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고, 웨스턴 블랏 분석에서 MAb 17C7로 프로브시킨다. 좌측 라인(WT)에는 야생형 균주를 나타내고, 우측 라인(MUT)에는 돌연변이를 포함한다. kDa 표시는 좌측에 있다. 두 가지 균주 모두 MAb 17C7와 반응성이 있는 매우 분자량이 큰 밴드를 가지지만, MAb에 결합하는 약120kDa 밴드는 야생형에만 존재한다.

도 2C에서는 전체 세포 용해물질(WCL) 및 MAb 17C7를 이용하여, 야생형 균주 O35E(WT) 및 동계 uspA1 돌연변이(MUT)로부터 EDTA-추출한 외측 막 소포(OMV)의 웨 스턴 블랏 분석을 한 것이다. 샘플은 37℃에서 15분(H) 또는 100℃에서 5분간 가열한 후에 SDS-PAGE를 한다. 흰 화살은 매우 분자량이 큰 MAb 17C7-반응성 항원의 위치를 나타내고, 검은 화살은 약 120kDa 단백질 위치를 나타내고, ○는 약 70-80 kDa 단백질의 위치를 나타낸다.

도 3은 야생형 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 및 동계 uspA1 돌연변이로부터 얻은 염색체 DNA의 서든 블랏 분석을 한 것이다. 염색체 DNA는 PvuII로 절단하고, uspA1 유전자의 0.6kb BglII-PvuII으로 프로브시킨다. 도면 상측에 야생형 균주는 O35E로 나타내고, 돌연변이 균주는 O35E-uspA1^-로 나타낸다. kB위치는 좌측에 나타낸다.

도 4는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 외측 막 소포(라벨된 O35E OMV)와 MF-4-1 GST(라벨된 GST 융합 단백질)에서 MAb 17C7에 대한 단백질의 웨스턴 블랏 반응성을 나타낸다.

도 5는 uspA1 돌연변이로부터 얻은 염색체 DNA와 PCR^TM 증폭에 이용되었을 경우에, T3 및 P10 프라이머(중간 라인-0.9kb 생성물), T7 및 P9(우측 라인- 1.7kb 생성물)을 이용하였을 때 얻어지는 PCR^TM 생성물을 나타낸다.

도 6A-6C에서는 정제된 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸다. 도 6A는 정제된 UspA2(라인 2)의 Coomassie 블루 착색된 겔을 나타내고, 도 6B는 샘플의 가열 없이(라인 4) 준비된 정제된 UspA1의 Coomassie 블루 착색된 겔, 100℃에서 3분간 가열한 샘플의 겔(라인 4), 100℃에서 5분간 가열한 샘플의 겔(라인 6), 100℃에서 10분간 가열한 샘플의 겔(라인 7)을 나타낸다. 도 6C는 정제된 UspA2(라인 9)의 웨스턴 블랏, 17C7 MAb로 프로브된 정제된 UspA1(라인 10)의 웨스턴 블랏을 나타낸다. 두 가지 단백질은 모두 10분간 가열하였다. 라인 1, 3, 8에 있는 분자량 표식은 kDa으로 나타낸다.

도 7은 ELISA으로 결정하였을 경우에, 정제된 UspA1, UspA2와 HEp-2의 상호작용을 나타낸 것이다. 96웰 플레이트에서 배양된 HEp-2 세포 단층은 멸균된 UspA1 또는 UspA2으로 연속적으로 희석하여 배양하였다. 양성 기준으로는 O35E 세균 균주를 이용한다. 세균은 유사하게 희석하여 단백질 현탁액이 A₅₅₀이 1.0되도록 한다. 결합된 단백질 또는 부착된 세균은 UspA1 및 UspA2에 대해 1:1 혼합 항혈청으로 감지된다.

도 8은 도트 블랏으로 결정하였을 경우에 피브로넥틴과 비트로넥틴과의 상호작용을 나타낸다. 결합된 비트로넥틴은 토끼 다클론성 항체로 감지할 수 있고, 피브로넥틴에 결합된 단백질은 UspA1 및 UspA2에 대해 만들어진 농축 혈청으로 감지될 수 있다.

도 9는 정상 사람 혈청에서 단백질 UspA1, UspA2 및 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) O35E 균주에 대한 항체 수준을 나타낸다. 데이터는 ELISA로 결정하였을 경우에 IgG(도 9A-9C) 및 IgA(도 9D-9F)의 log₁₀ 변형된 끝점 역가로 나타낸다. 개별 역가는 나이에 따라 플롯하였고, 각 나이 군에 대한 기하학적 평균 역가는 직선으로 나타내었다. 2-18개월된 어린이의 혈청은 10살 어린이 의 연속 샘플이다.

도 10은 정상적인 사람 혈청에서 UspA1 및 UspA2에 대한 IgG 항체의 서브클래스 분포를 나타낸다. 도 10A는 UspA1에 대한 역가를 나타내고, 도 10B는 UspA2에 대한 역가를 나타낸다.

도 11은 로그 회귀(p<0.05)에 이해 결정하였을 경우에 O35E에 대한 세균 리터와 UspA1(도 11A) 및 UspA2(도 11B)의 혈청 IgG 역가 관계를 나타낸 것이다. 직선은 IgG와 세균 리터사이에 비례 관계를 나타낸다. 점선은 선형 피트의 95% 신뢰 범위를 나타낸다.

도 12는 MAb 17C7에 결합하는 UspA1 및 UspA2 부분내에 데카펩티드 10-24의 관련 위치를 그림으로 나타낸 것이다.

도 13은 웨스턴 블랏 분석으로 MAb 17C7와 데카펩티드 10-24의 반응성을 나타낸다.

도 14는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E uspA1(도 14A) 및 uspA2(도 14B)와 이들 유전자의 돌연변이 종의 부분 제한 효소 지도를 나타낸 것이다. 빗금친 부분은 각 유전자의 오픈 리딩 프레임을 나타낸 것이다. 관련 제한효소 위치를 나타내었다. PCR^TM 프라이머 위치(P1-P6)는 화살표로 나타내었다. PCR^TM에 의해 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 염색체 DNA에서 유도하여, pBluescriptII SK+로 클론시킨 부분적인 uspA1 및 uspA2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 DNA 단편은 검정색 막대로 나타내었다. 점선은 이들 DNA 삽입체 및 염색체에서 이에 상응하는 제한효소 부위를 연결한 것이다. uspA1 또는 uspA2에 특이적인 DNA 프로브는 빗금친 막대로 나타내고, 이는 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 이용하여 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 염색체 DNA로부터 PCR^TM으로 증폭시켰다;

P3 (5'-GACGCTCAACAGCACTAATACG-3')(서열:20)/P4

(5'-CCAAGCTGATATCACTACC-3')(서열:21) 및

P5 (5'-TCAATGCCTTTGATGGTC-3')(서열:22)/P6

(5'-TGTATGCCGCTACTCGCAGCT-3')(서열:23).

도 15는 야생형에서 UspA1 및 UspA2 단백질의 감지 및 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 돌연변이 균주에서의 이들 단백질을 감지한 것이다. 야생형(라인 1), uspA1 돌연변이 균주 O35E.1(라인 2), uspA2 돌연변이 균주 O35E.2(라인 3), 동계 uspA1uspA2 이중 돌연변이 균주 O35E.12(라인 4)에서 EDTA-추출한 외측 소포에 존재하는 단백질을 SDS-PAGE로 분리하여, Coomassie 블루(도 15A)로 착색하거나 니트로셀룰로오즈로 옮기고, MAb 17C7로 프로브시키고, 방사능요오드화된 염소 항-쥐 이뮤노글로블린으로 웨스턴 블랏 분석을 한다. 도 15A에서, 짙은 화살은 UspA1 및 UspA2로 구성된 매우 분자량이 큰 UspA 항원을 나타내고, 도 15B에서는 좌측에 괄호는 MAb 17C7에 결합하는 매우 분자량이 큰 UspA1 및 UspA2 단백질을 나타낸다. 개방된 화살은 120kDa의 UspA1 가상 단량체를 나타내고, 닫힌 화살은 85kDa의 UspA2 가상 단량체를 나타낸다. 분자량 표식은 좌측에 나타낸다.

도 16은 야생형 및 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 돌연변이 균주의 생장 속도 및 생장 정도를 비교한 것이다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 야생형 균주 O35E(

), uspA1 돌연변이 O35E.1(

), uspA2 돌연변이 O35E.2(

), uspA1 uspA2 이중 돌연변이 O35E.12(

)를 밀도가 35(Klett/BHI 브로스)가 되도록 희석하고, 연속하여 교반하면서 37℃에서 생장시킨다. 탁도를 측정하면서 생장을 검사한다.

도 17은 정상적인 사람 혈청에 의해 죽는 야생형 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 및 돌연변이 균주의 감응성을 나타낸다. 로그상-BHI 브로스 배양물로부터 야생형 모 균주 O35E(◇), uspA1 돌연변이 O35E.1(△), uspA2 돌연변이 O35E.2(

), uspA1 uspA2 이중 돌연변이 O35E.12(

)를 10%(v/v) 정상 사람 혈청(closed symbol) 또는 열-변성된 사람 혈청(open symbol)에서 배양시킨다. 데이터는 각 시간대에 원래 접종물이 남아있는 비율로 나타낸다.

본 발명은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 유력한 백신을 개발하는데 이용할 수 있는 에피토프를 확인하는 것에 관계한다. 각 작업은 UspA 항원의 분자 특징을 결정하고, MAb 17C7가 인지하는 에피토프를 특징화하는 것이다. 예비 작업에서는 MAb 17C7는 단일 항원 에피토프를 인지하고, 이 에피토프는 한 개 유전자에 인코드된다는 것이다. 그러나, 에피토프를 포함하는 단백질을 분리한다는 것은 기대이상의 결과를 낳는다. MAb 17C7는 한 개 에피토프를 인지하나, 에피 토프와 관련된 단백질의 특징은 한 개가 아닌 두 개 별도 단백질이 존재한다는 것을 의미한다. 추가 분석으로 놀라운 발견을 얻었다. UspA 항원의 한 개 에피토프는 MAb 17C7에 의해 인지되나 이 에피토프는 두 가지 다른 단백질 즉, UspA1과 UspA2로 존재하는데, 이는 각각 uspA1 및 uspA2 상이한 유전자를 인코드하고, 이들 각각은 43%정도만 동일성을 가진다. 본 발명은 uspA1 및 uspA2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 제공하는데, 이들 각 단백질 생성물인 UspA1 및 UspA2는 MAb 17C7에 의해 인지되는 에피토프를 공유한다.

또한, 본 발명은 단백질로 구성된 UspA1 및 UspA2 단백질 서열 분석에 기초하여, UspA 단백질의 항원 구조를 예측할 수 있다. MAb 17C7가 표적으로 하는 분자의 에피토프 부분 특징으로 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염으로부터 보호하는데 유용한 물질을 개발할 수 있는데, 예를 들면, 예방 시약을 준비하는데 이용될 수 있다. 특정 구체예는 UspA1 및 UspA2 단백질에 상응하는 핵산 및 아미노산 서열, 이로부터 유도되는 펩티드, 항원성 조성물, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 질병의 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.

이미 언급한 것과 같이, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염은 건강에 심각한 공격 특히, 어린이에게 심각하다. 따라서, 이 질병의 치료 및 진단에 도움이 될 수 있는 방법 및 그 조성물을 개발할 필요가 있다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 UspA 항원의 구조에 대한 새로운 정보 및 두 개 새로운 단백질 UspA1 및 UspA2의 발견에 기초하여 본 발명은 이와 같은 개선된 조성물 및 방법을 제공한다. UspA1와 UspA2는 중요한 항원 결정부위를 나타내는데, MAb 17C7는 수동 면역화반응으로 폐 정화 모델에서 측정하였을 경우에 실험 동물을 보호하는 것으로 나타나기 때문이다.

제 1 구체예에서, 본 발명은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E에서 UspA1 및 UspA2 단백질을 확인하였다. UspA1 단백질은 약 831 아미노산 잔기로 구성되고, 분자량은 88,271달톤(서열:1)으로 예상된다. UspA2 단백질은 약 576 잔기로 구성되고, 예상 분자량은 62,483달톤(서열:3)으로 예상된다. UspA2는 UspA1의 절두형 또는 프로세스된 형이 아니다.

제 2 구체예에서, 본 발명은 MAb 17C7가 결합하는 특정 에피토프를 확인하였다. "3Q"펩티드라고 지정한 공통 펩티드 서열이 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E의 UspA1 단백질(서열:1)의 아미노산 잔기 480-502 및 582-604와 UspA2 단백질(서열:3)의 355-377에서 발견되는데, 이는 MAb 17C7가 인지하는 부분을 포함하는 것으로 보인다(주; 아미노산 잔기 번호는 서열 3에서 제공되는 것과 같이 균주 O35E에 기초한 것이다). 이 부분은 병인균의 생물학에 중요한 역할을 하고, 이와 같은 정보로부터 MAb 17C7 항체 결합에 중요한 아미노산 잔기를 유추할 수 있을 것이다. 이 정보를 기초하여, MAb 17C7 또는 다른 항체에 친화력이 더 큰 또는 더 작은 에피토프 부분을 고안할 수 있을 것이다. 본 발명의 추가 구체예를 하기에서 설명한다.

또 다른 적절한 구체예에서, 본 발명은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) UspA1 또는 UspA2 단백질, 폴리펩티드, 도메인, 펩티드 또는 임의 융합 단백질을 인코드하는 적어도 한 개의 분리된 유전자, DNA 단편, 코딩 부분으로 구성된 DNA 단편, 벡터 및 이와 유사한 것을 제공한다. 여기에서는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) uspA1 유전자를 인코드하는 분리된 유전자, DNA 단편, 코딩 부분을 제공하는데, 이는 O35E 균주에서 2493(bp)(서열:2), O46E균주에서 약 3381bp(서열:6), TTA24 균쥬에서 3538bp(서열:0), TTA37 균주에서 3292bp(서열:14)로 구성된다. 추가로 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) uspA2를 인코드하는 분리된 유전자, DNA 단편, 코딩 부분을 제공하는데, 이는 O35E 균주의 1728bp(서열:4), O46E 균주의 3295bp(서열:8), TTA24 균주의 2673bp(서열:12), TTA37균주의 4228bp(서열:16)로 구성된다. uspA1 및 uspA2 유전자는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염을 치료, 저해 또는 보호하기 위한 약물 등의 단백질, 항체, 스크린 검사 등에 이용될 수 있다.

본 발명은 다른 박테리아, 바이러스 또는 기생충 감염을 치료, 저해 또는 예방하는데 유용한 다른 물질 면역학적 담체로 UspA1 또는 UspA2 단백질 또는 펩티드를 이용하도록 한다. 이들 UspA1 또는 UspA2 항원 또는 이의 일부분은 링커, 폴리링커, 유도된 아미노산을 통하여 하나이상의 화학물질에 결합, 공액 또는 화학적으로 연결되어, 이중특이적 또는 다기능 조성물 또는 백신은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 및 다른 병인균 치료, 저해 또는 예방할 수 있다. 이들 조성물을 만드는데 이용되는 방법은 당업자에게 친숙한 방법으로, 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)에 공액물을 준비하는데 이용되는 방법과 유사하다.

중요한 것은 진단 및 예방을 위한 스크린 방법은 하기에서 제시한 것과 같이 바로 이용할 수 있다. 따라서, (i)서로에 대한 반응성에 대해 테스트 펩티드, 돌연변이 펩티드 및 항체의 능력; (ii) in vivo에서 감염을 방지하는 테스트 펩티드 및 항체의 능력은 임상적으로 중요한 시약을 개발하는데 중요한 도구가 된다.

1.0 UspA 단백질, 펩티드, 폴리펩티드

한 구체예에서, 본 발명은 새로운 두 가지 단백질 서열, UspA1 및 UspA2을 포함하는데, 펩티드 서열 AQQQDQH(서열:17)이 MAb 17C7의 표적 에피토프로 확인되었다. 또한, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 네 가지 균주로부터 UspA1 및 UspA2 단백질의 아미노산 서열을 조사한 결과 각 단백질에는 Mab 17C7에 결합하는 적어도 한 개 펩티드YELAQQQDQH(서열:18)를 가지거나 한 경우에는 거의 동일한 아미노산 서열 YDLAQQQDQH(서열:19)을 가지는 것을 알 수 있다.

균주 O35E에서는 UspA1의 경우에, 펩티드(YELAQQQDQH, 서열:18)는 잔기 486-495 및 588-597(서열:1)에 2회 존재하고, UspA2의 경우에, 잔기 358-367(서열:3)은 1회 존재된다. TTA24 균주에서 UspA1의 경우에 잔기 497-506(서열:9)에서 1회 존재하고, UspA2의 경우에는 225-234 및 413-422(서열:11)에 2회 존재한다. O35E 균주에서 UspA1의 경우에, 펩티드 YDLAQQQDQH(서열:19)는 잔기 448-457(서열:5) 1회 존재하고, 반면에 펩티드 YELAQQQDQH(서열:18)는 동일한 단백질에서 잔기 649-548(서열:5)에서 1회 존재한다. O46E 균주에서 UspA2의 경우에, 펩티드 YELAQQQDQH(서열:18)는 잔기 416-425(서열:7)에서 1회 존재한다. 펩티드 YELAQQQDQH(서열:18)는 TTA37 균주에서 UspA1의 경우에 잔기 478-487 및 630-639(서열:13)에서 2회 존재하고, UspA2의 경우에 잔기 522-531 및 681-690(서열:15)에서 2회 존재한다.

본 발명에서는 한 개 UspA 단백질의 일부를 포함하는 하이브리드 분자를 포함하는데, 예를 들면, 카나마이신-저항성 등과 같은 확인에 유익한 다른 단백질 또는 백신 스크린 목적으로 다른 단백질 또는 UspA1 및 UspA2 단백질 특징화에 이용하는데 유익한 다른 UspA 단백질의 일부와 융합된 UspA1 단백질(또는 UspA2)로 구성된 하이브리드 분자가 된다. 예를 들면, 임의 UspA1의 1-350 잔기에 임의 UspA2의 잔기 351-576를 융합시킨다. 또는 한 개 UspA 항원에서 3, 4, 5개 펩티드 부분의 서열로 융합을 만들 수 있다. 또는, 설명된 UspA1 및 UspA2 분자의 단편 뿐만 아니라 비-UspA 서열이 도입되는 삽입, 결손, 치환 돌연변이도 포함된다. UspA 서열을 제거하거나 또는 UspA 서열을 비-UspA 서열로 각 대체시킨다.

본 발명에 따르면, UspA1와 UspA2 단백질은 추가 구조 및 기능 분석에 이용하기 위해 절단되는데, UspA-관련 폴리펩티드 및 UspA-특이적인 항체와 같은 시약 발생에 이용될 수 있다. 엔도프로테이나제 glu-C(Boehringer, Indianapolis, IN)와 같은 펩티다제로 정제된 또는 정제안된 UspA1 또는 UspA2을 처리하면 된다. 이들 각 고유 단백질로부터 UspA1 또는 UspA2 단편을 만드는 또 다른 방법은 CNBr로 처리하는 것이다. 재조합 기술을 이용하여, UspA1 또는 UspA2의 특정 단편을 만들 수 있다.

본 발명의 인코드된 UspA1 또는 UspA2 폴리펩티드에 좀더 정교한 변화 및 수정을 할 수 있고, 고유 UspA 항원 특징을 가지는 단백질 또는 펩티드를 인코드하는 분자를 얻을 수 있다. 다음은 등가의 또는 개선된 2세대 분자를 만들기 위해 단백질의 아미노산을 변화시키는데 기초하여 논의한다. 아미노산 변화는 다음의 코드 테이블에 따라 DNA 서열의 코돈을 변화시켜서 만든다.

아미노산 및 약어			코돈
알라닌	Ala	A	GCA GCC GCG GCU
시스테인	Cys	C	UGC UGU
아스파르트산	Asp	D	GAC GAU
글루타민산	Glu	E	GAA GAG
페닐알라닌	Phe	F	UUC UUU
글리신	Gly	G	GGA GGC GGG GGU
히스티딘	His	H	CAC CAU
이소루이신	Ile	I	AUA AUC AUU
리신	Lys	K	AAA AAG
루이신	Leu	L	UUA UUG CUA CUC CUG CUU
메티오닌	Met	M	AUG
아스파라긴	Asn	N	AAC AAU
프롤린	Pro	P	CCA CCC CCG CCU
글루타민	Gln	Q	CAA CAG
아르기닌	Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGU
세린	Ser	S	AGC AGU UCA UCC UCG UCU
트레오닌	Thr	T	ACA ACC ACG ACU
발린	Val	V	GUA GUC GUG GUU
트립토판	Trp	W	UGG
티로신	Tyr	Y	UAC UAU

단백질 구조에서 특정 아미노산은 다른 아미노산으로 치환되어, 이의 항원성 또는 면역원성 활성을 변형 또는 개선시킬 수 있다(Kyte & Doolittle, 1982; Hopp, U.S. patent 4,554,101). 예를 들면, 선택적인 아미노산 치환을 통하여, 적은 모양 변화로 활성 또는 안정성이 증가된 폴리펩티드를 제공한다. 또는 특정 폴리펩티드에서 아미노산 치환을 이용하여, 다른 분자에 연결될 수 있는 잔기를 만들어, 시작 펩티드의 항원성을 충분히 보유하면서도 다른 목적에 이용할 수 있는 펩티드-분자 공액물질을 만들 수 있다. 예를 들면, 고형 서포트에 결합된 선택된 UspA1 또는 UspA2 펩티드를 만들어, 진단에 특정한 장점을 가지도록 한다.

단백질에 서로 작용하는 생물학적 기능에서 아미노산의 치료요법 지수의 중 요성은 Kyte & Doolittle(1982)에서 논의된 것으로 특정 아미노산이 유사한 치료요법 지수 또는 핵을 가지는 다른 아미노산으로 치환되는 경우에 유사한 생물학적 활성을 유지한다는 것이다. 하기 표 2에 나타낸 것과 같이, 아미노산에는 이들의 소수성 및 하전 특징에 기초하여 치료요법 지수가 할당되어 있다. 아미노산의 관련 치료요법 특징은 최종 단백질의 2차 구조를 결정하고, 이는 기질 분자와 단백질간의 상호작용을 결정한다. 항원성이 등가인 펩티드 또는 단백질을 만드는 적절한 치환은 서로 ±2 단위범위내의 지수를 가지는 아미노산, 좀더 적절하게는 ±1 단위내에, 가장 바람직하게는 ±0.5 단위내의 아미노산이 적절하다.

아미노산	치료요법 지수
이소루이신	4.5
발린	4.2
루이신	3.8
페닐알라닌	2.8
시스테인/시스틴	2.5
메티오닌	1.9
알라닌	1.8
글리신	-0.4
트레오닌	-0.7
트립토판	-0.9
세린	-0.8
티로신	-1.3
프롤린	-1.6
히스티딘	-3.2
글루타민산	-3.5
글루타민	-3.5
아스파르트산	-3.5
아스파라긴	-3.5
리신	-3.9
아르기닌	-4.5

따라서 치료요법 지수가 +4.5인 이소루이신은 발린(+4.2) 또는 루이신(+3.8)과 같은 아미노산과 교환하는 것이 적절하다. 또는 리신(-3.9)은 아르기닌(-4.5) 으로 대체되는 것이 적절하다.

친수성에 기초하여, 유사 아미노산으로 치환하는데, 특히 면역학적 구체예에 이용하기 위해서는 생물학적 기능에 등가 단백질 또는 펩티드를 만든다. 미국 특허 4,554,101에서는 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 이의 인접 아미노산에 의해 조절되는데, 이는 단백질의 중요한 생물학적 성질 내에 면역원성 및 항원성과 관련된다.

미국 특허 4,554,101에서, 각 아미노산에 친수성 값을 할당하였다. 이들 값은 다음 표 3에 나타내었다.

아미노산	친수성 지수
아르기닌	+3.0
리신	+3.0
아스파라테이트	+3.0 ±1
글루타메이트	+3.0 ±1
세린	+0.3
아스파라진	+0.2
글루타민	+0.2
글리신	0
트레오닌	-0.4
알라닌	-0.5
히스티딘	-0.5
프롤린	-0.5 ±1
시스테인	-1.0
메티오닌	-1.3
발린	-1.5
루이신	-1.8
이소루이신	-1.8
티로신	-2.3
페닐알라닌	-2.5
트립토판	-3.4

한 개 아미노산는 유사한 친수성 값을 가지는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있는데, 이는 여전히 생물학적 등가, 특히 면역학적으로 등가 단백질을 얻을 수 있을 것으로 보인다. 이와 같이 변화시키는 경우에, 친수성 값이 ±2인 범위의 아미노산으로 치환하는 것이 적절하고, 특히 ±1 범위의 아미노산으로 치환하는 것이 더욱 바람직하고, 가장 적절하게는 ±0.5 범위가 된다.

따라서, 이와 같은 아미노산 치환은 R기 치환체의 상대적인 유사성, 예를들면, 크기, 친전자성 특징, 전하 등에 기초한다. 일반적으로, 전술한 다양한 특징을 고려하여, 당업자가 적절하게 치환할 수 있는데, 다음과 같이 복합될 수 있다; 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파라테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 발린, 루이신, 이소루이신.

또한, 이들 서열에서 적어도 6개 연속 아미노산으로된 펩티드를 포함하는 이들 폴리펩티드에서 유도된 펩티드를 고려할 수 있다. 또는, 이와 같은 펩티드는 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60개 연속 잔기로 구성될 수 있다. 예를 들면, 6개 연속 아미노산으로 구성된 펩티드는 UspA1 또는 UspA2 단백질의 1 내지 6, 2 내지 7, 3 내지 8개 잔기로 구성된다. 이와 같은 펩티드는 다음의 식으로 나타낼 수 있다.

x 내지 (x + n) = 처음과 마지막 연속 잔기의 5' 내지 3'위치

이때, x는 UspA1 또는 UspA2 단백질의 1개 내지 전체 길이의 수를 나타내고, n은 펩티드 길이에 1을 뺀 수와 같다. UspA1의 경우에, x = 1 내지 831이고, UspA2의 경우에, x = 1 내지 576이 된다. 펩티드가 10개 잔기로 된 경우(n = 10- 1), 식은 각 항원에 대해 10-mer을 나타낸다. 예를 들면, x가 1인 경우에, 펩티드는 잔기가 1 내지 (1 + [10-1])이 되거나 1 내지 10이 된다. x가 2인 경우에, 펩티드는 2 내지 (2 + [10-2])가 되거나 또는 2 내지 11이 된다.

고형 상 방법(가령, Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer와 같은 시판되는 펩티드 합성기를 이용하여)과 같은 통상적인 합성 기술을 이용하여 펩티드 합성한다. 이와 같은 방법으로 합성된 펩티드는 예정 량으로 나누어 통상적인 방법으로 저장하는데, 예를 들면, 수용액상에 또는 적절하게는 분말 또는 냉동건조시킨다.

일반적으로, 펩티드의 상대적인 안정성으로 인하여, 원하는 경우 최고 6개월 이상 상당히 오랜 기간동안 수용액에 저장할 수 있고, 이때 실제 항원 활성의 분해 또는 손실 없이 임의 수용액에 저장할 수 있다. 그러나, 상당시간 수용액에 저장할 경우에는 일반적으로 트리스 또는 인산 완충액과 같은 완충액을 포함시켜, pH를 7.0 내지 7.5로 유지시킨다. 또한, 아지드 나트륨 또는 메르티올레이트와 같은 미생물 생장을 저해시킬 수 있는 물질을 포함시키는 것이 바람직하다. 수용액 상태에서 상당시간 저장을 시키기 위해서, 4℃에서 수용액에 저장시키거나 바람직하게는 냉동시키는 것이 좋다. 물론, 펩티드가 냉동건조된 상태 또는 분말형일 경우에는 이들은 무한정으로 저장할 수 있는데, 사용하기 전에 예정된 양의 물(적절하게는 증류된, 탈이온화된) 또는 완충액으로 재수화시킨다.

특히, UspA 항원 내에 있는 에피토프를 나타내는 펩티드가 원하는 부분으로, 본 발명의 UspA1 및 UspA2 단백질에 포함된다. "에피토프"는 T-세포 또는 B-세포의 반응을 자극하는 분자 부분으로, 이들 세포로부터 면역 반응을 유도한다. 여기에서 이용된 것과 같이, 에피토프 핵 서열은 구조적으로 "상보적인" 아미노산의 상대적으로 짧은 아미노산으로, 항체 또는 T-세포 수용체에 있는 결합 부위에 결합할 것이다. 본 발명의 내용에서, "상보적인"이란 용어는 서로 끌어당기는 힘을 발휘하는 아미노산 또는 펩티드를 말하는 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 에피토프 핵 서열은 UspA-관련 항혈청에 상응하는 UspA 항원의 결합부위와 경쟁하는 또는 대체하는 능력을 가지는 것이다.

당업자는 에피토프 핵 서열을 확인하는 방법을 알고 있다. 예를 들면, 미국 특허 4,554,101에서는 친수성 또는 Chou-Fasman 분석에 기초하여 아미노산 서열의 에피토프를 확인하고 준비하는 과정에 대해 설명하고 있다. 단백질의 항원 부분을 예측하는데 이용되는 여러 가지 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있는데, 예를 들면, Jameson-Wolf 분석에 기초한 프로그램(Jameson and Wolf, 1988; Wolf et al., 1988), 프로그램 PepPlot^R(Brutlag et al., 1990; Weinberger et al., 1985), 컴퓨터화된 펩티드 서열 분석 프로그램과 연결하여 이용할 수 있는 단백질 4차 구조 예측용 다른 새로운 프로그램(Fetrow & Bryant, 1993)을 포함한다.

일반적으로, 확인된 핵 서열을 가질 수 있도록 충분한 크기가 된다면, 폴리펩티드 항원의 크기는 실제 중요하지 않다. 본 발명에 의해 예측할 수 있는 최소 유용한 핵 서열은 길이가 약 6개 아미노산이 된다. 따라서, 이 크기는 일반적으로 본 발명에 따라 준비된 최소 펩티드 항원에 상응한다. 그러나, 항원의 크기는 기 본적인 에피토프 핵 서열을 포함하는 한, 클수록 바람직하다.

2.0 UspA1 및 UspA2 핵산

폴리펩티드에 추가하여, 본 발명은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E, O46E, TTA24, TTA37로부터 각각 UspA1(서열:2, 서열:6, 서열:10, 서열:14) 및 UspA2(서열:4, 서열:8, 서열:12, 서열:16) 단백질을 인코드하는 핵산을 포함한다. 유전자 코드의 축중성 때문에, 많은 다른 핵산이 주어진 UspA1 또는 UspA2을 인코드할 수 있다. 예를 들면, 알라닌, 글리신, 프롤린, 트레오닌, 발린을 인코드하는 상이한 3-염기 코돈이 4개 있고, 6개 상이한 코돈이 아르기닌, 루이신, 세린을 인코드하는 상이한 코돈은 6개 있다. 메티오닌 및 트립토판만 1개 코돈에 의해 인코드된다. 표1에서는 이와 같은 구체예에서 이용될 수 있는 아미노산 및 이에 상응하는 코돈 목록을 제시하고 있다. UspA1 또는 UspA2을 인코드하는 임의 핵산을 만들기 위해서는, 여기에서 제시하는 코돈을 사용할 필요가 있다. 동일한 아미노산을 인코드하는 임의 코돈을 원래 코돈 대신에 사용하면, UspA1 또는 UspA2를 인코드하는 별개의 핵산이 만들어진다. 실제, 기존의 uspA1 또는 uspA2 유전자를 부위-직접 돌연변이를 시키거나, 하나이상의 핵산을 de novo 화학적으로 합성하면, 이와 같은 핵산을 얻을 수 있다.

코돈 선택, 부위-직접적인 돌연변이 및 화학적 합성에 관한 이와 같은 간측은 상기에서 제시한 것과 같은 치환 돌연변이 UspA1 또는 UspA2 펩티드에 대한 것과 동일하다. 좀더 구체적으로는, 주어진 폴리펩티드 또는 에피토프에 있는 하나이상의 코돈을 변경시키는 것으로 구성된 핵산 서열에서 부위-직접 돌연변이에 의 해 발생된 치환 돌연변이는 신속한 방법으로 많은 돌연변이를 만들 수 있는 편리한 방법이다. 본 발명의 핵산은 간단한 방법으로 UspA1 또는 UspA2 단편을 만들고(절두), UspA1-UspA2 융합 분자(상기에서 설명함), 다른 분자와 융합된 UspA1 또는 UspA2를 얻을 수 있다. 예를 들면, uspA1 또는 uspA2 유전자에서 제한 효소 및 뉴클레아제를 이용하면 이들 유전자를 조작하여 원하는 유전자 생성물을 얻는다.

본 발명에 의해 제공되는 핵산 정보는 선택된 uspA1 또는 uspA2 유전자의 유전자 서열에 특이적으로 하이브리드할 수 있는 능력을 가지는 상대적으로 짧은 DNA(또는 RNA)을 준비할 수 있다. 이에 대해 적절한 길이의 핵산 프로브는 uspA1 또는 uspA2 유전자의 코딩 서열 또는 uspA1 또는 uspA2 유전자의 인접 부위 즉 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 염색체의 하류 및 상류 부분을 고려하여 준비할 수 있다. uspA1 또는 uspA2 유전자에 특이적으로 하이브리드할 수 있는 핵산 프로브를 다양한 용도에 이용할 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 프로브를 주어진 샘플에 병인성 유기체가 존재하는지를 감지하는 다양한 진단 검사하는데 이용할 수 있다. 또한, 이와 같은 올리고뉴클레오티드를 발현 구조의 in frame에 삽입시켜, 존재하는 항체에 반응성이 있는 이에 상응하는 펩티드를 스크리닝하거나 진단 또는 치료 시약을 만들 수 있다.

본 발명에 따른 장점을 제공하기 위해, 하이브리드 연구 또는 검사에 이용되는 적절한 핵산은 서열에서 뉴클레오티드 길이가 적어도 10 내지 20개에 상보적인 서열을 포함하는데, 30 내지 60개 뉴클레오티드 서열도 이용할 수 있다. 안정적인 그리고 선택성을 가지는 이중나선 문자를 만드는데 뉴클레오티드 길이는 적어도 9 개이면 충분하다. 하이브리드의 안정성 및 선택성을 증가시키기 위해서는, 길이가 10개 염기이상인 상보적인 서열을 가지는 분자가 적절하여 수득된 특정 하이브리드 분자의 질과 그 하이브리드 정도를 개선시킨다. 따라서, 15 내지 20개 또는 더 긴 뉴클레오티드로 된 uspA1 또는 uspA2 유전자를 가지는 핵산분자를 만드는 것이 바람직하다. 화학적 수단을 통하여, 미국 특허 4,603,102의 PCR^TM 기술과 같은 핵산 생산 기술을 응용하거나 재조합 생산을 위해 재조합 벡터 내에 선택된 서열을 도입시켜, 이와 같은 단편을 직접 만들 수 있다.

이용할 수 있는 프로브는 서열:2, 서열:4, 서열:6, 서열:8, 서열:10, 서열:12, 서열:14, 서열:16의 임의 부분에서 유도할 수 있다. 따라서, 1 내지 9개 또는 2 내지 10개 또는 3 내지 11개 뉴클레오티드로 구성된 프로브를 고려할 수 있는데, 프로브는 서열:2 또는 서열:4 또는 서열:6 또는 서열:8 또는 서열:10 또는 서열:12 또는 서열:14 또는 서열:16의 핵산 서열의 적어도 9개 뉴클레오티드로 구성된다. 따라서, 각 프로브는 서열:2 또는 서열:4 또는 서열:6 또는 서열:8 또는 서열:10 또는 서열:12 또는 서열:14 또는 서열:16의 뉴클레오티드 서열중 적어도 9개 직선 뉴클레오티드로 구성되는데, 이는 식으로는 "n 내지 n + 8"으로 나타내는데, 이때, n은 서열의 뉴클레오티드가 1 내지 원하는 수를 나타낸다. 스트린젼스 조건을 하, 중, 중-상, 상 조건하에서, uspA1 또는 uspA2 유전자에 하이브리드할 수 있는 큰 프로브를 고려할 수 있는데, 여기에는 서열:2 또는 서열:4 또는 서열:6 또는 서열:8 또는 서열:10 또는 서열:12 또는 서열:14 또는 서열:16의 전제 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 이와 같은 이론은 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상인 염기를 가지는 프로브에도 적용된다.

본 발명의 UspA 항원성 에피토프가 병인성 모렉셀라종(Moraxella) 균주 O35E, O46E, TTA24, TTA37을 나타낸다는 것으로 간주하여, 본 발명은 임상 샘플에서 UspA1 또는 UspA2 DNA를 감지하는 진단 하이브리드반응 검사에 프로브를 유용하게 이용할 방법을 찾을 것이다. 감염을 진단하는데 이용할 수 있는 임상 시료에는 중이 유체, 가래 점액, 기관기포 유체, 양수 등의 모렉셀라(Moraxella)를 포함할 가능성이 있는 임의 샘플이 된다. 본 발명의 하이브리드 반응에 연관하여 이용할 수 있는 다양한 하이브리드 반응 기술 및 시스템이 공지되어 있는데, 예를 들면, Falkow et al., 미국 특허 4,358,535에서 설명하는 진단 검사이다. 응용하는 용도에 따라, 표적 서열에 대한 프로브의 선택성을 다양하게 하도록 다양한 하이브리드 반응 조건을 이용할 수 있을 것이다. 고도의 선택성을 요구하는 경우에는 하이브리드를 형성시키기 위해 상대적으로 엄격한 스트린젼트 조건을 이용하는데, 예를 들면, 50℃ 내지 70℃에서 0.02M-0.15M NaCl의 상대적으로 저염, 고온 조건을 선택할 것이다. 이와 같은 조건은 특히 선택성이 크고, 프로브와 주형 또는 표적 가닥간에 미스메취(mismatch)를 거의 허용하지 않는다.

물론, 일부 다른 용도에서는, 소위 이형이중나선(heteroduplex)를 만들기 위해서, 다소 스트린젼스 조건이 약한 상태에서 아래 주형에 하이브리드할 수 있는 돌연변이 프라이머 가닥을 이용하는 돌연변이를 준비할 수 있다. 이와 같은 환경 하에서는, 0.15M-0.9M염, 20℃ 내지 55℃ 온도와 같은 조건을 이용한다. 임의 경우에서, 포름아미드 양을 증가시켜 첨가함으로써, 스트린젼트 조건을 강화시키는 것을 이용하는데, 이는 온도를 증가시키는 것과 동일한 방법으로 하이브리드 이중 나선을 불안정하게 하는 원인이 된다. 따라서, 하이브리드 반응 조건은 즉시 즉시 조절할 수 있고, 방법의 선택 또한 원하는 결과에 따라 조절한다.

특정 구체예에서, 돌연변이된 클론을 포함하는 클론 뱅크로부터 변이체를 분리하기 위해 핵산 프로브를 이용한다. 특정 구체예에서, 고형 배지에서 생장시킨 UspA1 또는 UspA2 서열 변이체를 포함하는 돌연변이 클론 콜로니는 콜로니 블랏 검사에서 이용되는 것과 같은 하이브리드 조건 및 방법을 이용하여 이중 필터에서 확인할 수 있고, 서열 변이체를 포함하는 프로브와 특정 콜로니에 포함된 핵산 서열 변이체사이에서만 하이브리드를 시킬 수 있다. 이와 같은 방법으로, uspA1 또는 uspA2 유전자의 짧은 변이체 서열을 포함하는 작은 하이브리드 프로브를 이용하여, 고형 배지에서 생장한 전체 uspA1 또는 uspA2 유전자의 서열 변이체를 포함하는 클론을 확인한다. 이들 클론을 생장시켜, 원하는 양의 변이체 UspA1 또는 UspA2 핵산 서열 또는 이에 상응하는 UspA 항원을 얻을 수 있다.

임상적인 진단 구체예에서, 하이브리드를 결정하기 위해, 라벨과 같은 적절한 수단을 핵산에 함께 이용한다. 당분야에는 다양한 지시 수단이 공지되어 있는데, 예를 들면, 감지가능한 시그날을 발생할 수 있는 방사능활성, 효소 또는 아비딘/바이오틴과 같은 다른 리간드 등이 있다. 적절한 진단 구체예에서는, 당업자는 방사능활성 또는 다른 환경적으로 바람직하지 않는 시약대신에 우레아즈, 알칼리 포스포타제, 퍼옥시다제와 같은 효소 꼬리표를 이용할 수 있다. 효소 꼬리표의 경우에, 사람의 눈 또는 분광광도계로 볼 수 있는 수단을 제공하는 지시 물질이 당분야에 공지되어 있어, 병인균 핵산을 포함하는 샘플과 특정 하이브리드가 일어났는지를 확인할 수 있다.

일반적으로, 여기에서 설명하는 하이브리드 프로브는 용액 하이브리드 반응에 시약으로 유용할 뿐만 아니라 고형 상을 이용하는 구체예에서도 이용할 수 있다. 고형 상이 관련된 구체예에서, 삼출액, 체액(양수, 중이 유출액, 기관 기포 세척액) 또는 조직 등과 같은 의심이 가는 임상 샘플의 DNA 또는 RNA를 흡수시키거나 또는 선택된 매트릭스 또는 표면에 고정시킨다. 이와 같은 고정된 단일-가닥 핵산은 원하는 조건하에서 선택된 프로브와 특정하게 하이브리드시킨다. 선택 조건은 요구하는 특정 기준(예를 들면, G+C 함량, 표적 핵산 형태, 핵산 소스, 하이브리드 프로브 크기등)에 기초하여 특정 환경에 따라 달라진다. 비-특이적으로 결합된 프로브 분자를 제거하기 위해 하이브리드된 표면을 세척한 후에, 라벨을 이용하여 특정 하이브리드를 감지하고, 정량화한다.

UspA1 또는 UspA2 또는 이의 변이체를 인코드하는 핵산 서열은 PCR^TM 방법과 병행하여 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)를 감지한다. 일반적으로 미국 특허 4,603,102에서 제시하는 PCR^TM 기술을 이용하여 샘플에 있는 uspA1 또는 uspA2 서열의 일정 부분의 PCR^TM 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브로 uspA1 또는 uspA2 서열의 다양한 부분을 이용할 수 있다. 증폭된 uspA1 또는 uspA2 서열 일부 분은 상보적인 서열을 포함하는 하이브리드 프로브와 하이브리드시켜 감지할 수 있다. 이와 같은 방법으로 uspA1 또는 uspA2 서열을 이용하여 샘플에서 극소 농도의 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 핵산도 감지할 수 있다.

3.0 UspA1 또는 UspA2 항원을 만들기 위한 벡터, 숙주 세포 또는 배양물

UspA1 또는 UspA2 폴리펩티드를 발현시키기 위해, 발현 카세트에 uspA1 또는 uspA2 유전자를 제공해야 한다. 발현 카세트에는 프로모터의 전사 조절하에 UspA1 또는 UspA2-인코드 핵산을 포함한다. "프로모터"는 세포의 합성 기작에 의해 인지되는 또는 합성기작으로 도입되는 DNA 서열로 유전자의 특정 전사를 개시하는데 필요한 것을 말한다. "전사 조절하에"라는 말은 프로모터가 핵산에 대해 정확한 방향 및 위치에 있어, RNA 폴리메라제 개시 및 유전자 발현을 조절한다는 것을 의미한다. 원핵 재조합 DNA 구조에 이용되는 가장 흔한 프로모터에는 B-락타메이즈(페니실리나제) 및 락토즈 프로모터 시스템(Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979), 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel et al., 1980; EPO Appl. Publ. No. 0036776)등을 포함한다. 이들이 가장 흔히 이용되는 것이지만, 다른 미생물 프로모터가 발견되고 이용될 수 있고, 이들 핵산 서열에 대한 상세한 내용은 공지되어 있어, 당업자가 이들을 플라스미드 벡터에 결찰시킬 수 있다(EPO Appl. Publ. No. 0036776). 추가로 유용한 프로모터는 다음의 표 4에 제시한다.

프로모터	참고문헌
이뮤노글로블린 중 사슬	Hanerji et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl and Baltimore, 1985; Atchinson and Perry, 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1988; Kiledjian et al., 1988; Porton et al., 1990
이뮤노글로블린 경사슬	Queen and Baltimore, 1983; Picard and Schaffner, 1984
T-세포 수용체	Luria et al., 1987, Winoto and Baltimore, 1989; Redondo et al., 1990
HLA DQ a 와 DQ β	Sullivan and Peterlin, 1987
β-인터페론	Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn and Maniatis, 1985
인터루킨-2	Greene et al., 1989
인터루킨-2 수용체	Greene et al., 1989; Lin et al., 1990
MHC Class II 5	Koch et al., 1989
MHC Class II HLA-DRa	Sherman et al., 1989
β-악틴	Kawamoto et al., 1988; Ng et al., 1989
근육 크레아틴 카이나제	Jaynes et al., 1988; Horlick and Benfield, 1989; Johnson et al., 1989a
프레알부민(트란스티레틴)	Costa et al., 1988
엘라스타제 I	Omitz et al., 1987
메탈로티오닌	Karin et al., 1987; Culotta and Hamer, 1989
콜라게나제	Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987
알부민 유전자	Pinkert et al., 1987, Tronche et al., 1989, 1990

프로모터	참고문헌
a-페토프로테인	Godbout et al., 1988; Campere and Tilghman, 1989
t-글로빈	Bodine and Ley, 1987; Perez-Stable and Constantini, 1990
β-글로빈	Trudel and Constantini, 1987
e-fos	Cohen et al., 1987
c-HA-ras	Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985
인슐린	Edlund et al., 1985
신경세포흡착분자(NCAM)	Hirsch et al., 1990
a_{1-Antitrypain}	Latimer et al., 1990
H2B (TH2B) 히스톤	Hwang et al., 1990
쥐 or 타입 I 콜라겐	Ripe et al., 1989
포도당-조절 단백질(GRP94와 GRP78)	Chang ett al., 1989
쥐 생장호르몬	Larsen et al., 1986
사람혈청 아밀로이드 A(SAA)	Edbrooke et al., 1989
트로포닌 I(TN I)	Yutzey et al., 1989
혈소판-유도 생장인자	Pech et al., 1989
뒤센형 근위축증	Klamut et al., 1990
SV40	Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh and Lockett, 1985; Firak and Subramanian, 1986; Herr and Clarke, 1986; Imbra and Karin, 1986; Kadesch and Berg, 1986; Wang and Calame, 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987 Schaffner et al., 1988
폴리오마	Swartzendruber and Lehman, 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; deVilliers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell and Villarreal, 1988
레트로바이러스	Kriegler and Botchan, 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a,b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander and Haseltine, 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Chol et al., 1988; Reisman and Rotter, 1989
파필로마 바이러스	Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos and Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky and Botchan, 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987, Stephens and Hentschel, 1987; Glue et al., 1988
간염 B 바이러스	Bulla and Siddiqui, 1986; Jameel and Siddiqui, 1986; Shaul and Ben-Levy, 1987; Spandau and Lee, 1988; Vannice and Levinson, 1988
사람 면역결핍 바이러스	Muesing et al., 1987; Hauber and Cullan, 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng and Holland, 1988; Takebe et al., 1988; Rowen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp and Marciniak, 1989; Braddock et al., 1989
사이토메갈로바이러스	Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking and Hofstetter, 1986
긴팔 원숭이 루키미아 바이러스	Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989

표준 서브 클로닝 기술을 이용하여, 상업적으로 이용할 수 있는 발현 벡터로 적절한 발현 카세트를 삽입할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따르면, 대장균(E. coli) 벡터 pUC 또는 pBluescript^TM를 이용하여 in vitro에서 재조합 UspA1 또는 UspA2 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 이들 벡터를 조작하는 것은 당분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 숙주 세포와 필적할 수 있는 종으로부터 유도된 기준 서열 및 레플리콘을 포함하는 플라스미드 벡터를 이용한다. 통상적으로 벡터는 복제 부위 및 형질변환된 세포를 표현형으로 선택하게 할 수 있는 표식 서열을 가진다. 예를 들면, 대장균(E. coli)은 일반적으로 대장균(E. coli) 종에서 유도된 플라스미드 pBR322를 이용하여 형질변환된다(Bolivar et al., 1977). pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 저항 유전자를 가지고 있기 때문에 형질변환된 세포를 쉽게 찾을 수 있다. pBR 플라스미드 및 다른 미생물 플라스미드 또는 파아지에는 이들 고유 단백질 발현을 위해 미생물이 이용할 수 있는 프로모터를 포함하거나 이를 포함하도록 변형시켜야 한다.

또한, 숙주 미생물에 필적할 수 있는 레플리콘 및 기준 서열을 포함하는 파아지 벡터를 형질변환 벡터로 이용한다. 예를 들면, 파아지 람다 GEM^TM-11는 대장균(E. coli) LE392와 같은 숙주 세포를 형질변환시키는데 이용되는 재조합 파아지 벡터를 만드는데 이용된다.

한 구체예에서, pGEX4T-2 단백질 융합 시스템(Pharmacia LKB, Piscataway, NJ)을 이용하여 융합 단백질로 UspA 항원이 발현되어, UspA1 및 UspA2 단백질 모두를 포함하는 UspA 항원의 특징을 가진다. 융합 단백질 발현 시스템의 또 다른 예 는 글루타티온 S-전이효소 시스템(Pharmacia, Piscataway, NJ), 말토즈 결합 단백질 시스템(NEB, Beverley, MA), FLAG 시스템(IBI, New Haven, CT), 6xHis 시스템(Qiagen, Chatsworth, CA)등이 포함된다. 이들 융합단백질의 일부는 소수의 추가 아미노산만을 가지는 재조합 단백질을 생산하고, 이는 재조합 단백질의 기능에 좋지않는 영향을 준다. 예를 들면, FLAG 시스템 및 6xHis 시스템은 짧은 서열만을 첨가하는데, 이들은 단백질이 이들의 고유 모양으로 폴드되는데 나쁜 영향을 주지않는 빈약한 항원으로 공지되어 있다. 다른 융합 시스템도 단백질을 만들어 원하는 단백질로부터 융합 짝을 절단해내는 것이 바람직하다. 또 다른 구체예에서, 융합 짝은 프로테아제가 인지하는 특정 인지 서열을 포함하는 펩티드 서열에 의해 재조합 단백질에 연결된다. 적절한 서열을 예로 들면, Tobacco Etch Virus protease(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 또는 Factor Xa(New England Biolabs, Beverley, MA)가 인지하는 것이다.

대장균(E. coli)이 가장 적절한 원핵세포 균주이다. 예를 들면, 대장균(E. coli) 균주 RR1가 특히 유용하다. 이용될 수 있는 다른 미생물 균주에는 대장균(E. coli) LE392, 대장균(E. coli) B, 대장균(E. coli) X 1776(ATCC No. 31537) 뿐만 아니라 대장균 W3110(F-, lambda-, prototrophic, ATCC No. 273325) 같은 대장균종(E. coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스 또는 살로넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라토라 마르세신스(Serratia marcescens)와 같은 다른 엔테로박테리아 및 슈도모나스(Pseudomonas)를 이용할 수 있다. 물론 이와 같은 예들은 설명을 위함 이지 이에 국한시키고자 함은 아니다. 대장균(E. coli)과 같은 재조합 박테리아는 임의 적절한 배지 가령, LB에서 생장시키고, IPTG등을 배지에 첨가하거나 또는 고온으로 배양 온도를 변화시켜 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도한다. 2 내지 24시간동안 추가로 박테리아를 배양하고, 원심분리에 의해 박테리아를 수득하고, 잔류 배지는 제거한다. 박테리아 세포는 그 다음 세포 호모지나이져(homogenizer)에 의해 용해시키고, 원심분리시켜, 조밀한 합체 및 세포 막을 가용성 세포 성분으로부터 분리한다. 조밀한 합체는 완충액에 슈크로즈와 같은 당을 결합시켜면 선택적으로 모을 수 있는 적절한 조건 및 선택 속도에서 원심분리를 한다.

대부분 경우에 재조합 단백질은 합체에서 발현되기 때문에, 오염된 숙주 단백질의 일부를 제거하기 위해 몇 가지 용액중 일부를 이용하여 씻어내고, 고농도 요소(8M)를 포함하는 용액에서 용해시키거나 또는 β-멀캅토에탄올 또는 DTT(디티오트레톨)과 같은 환원제 존재 하에 연화수소 구아니딘과 같은 혼돈제를 포함하는 용액에서 용해시킨다.

일부 조건하에서, 단백질이 고유 단백질과 상당히 닮은 모양으로 리폴드 하는 과정을 거치도록 적합한 조건하에 몇 시간 동안 폴리펩티드를 배양하는 것이 좋다. 이와 같은 조건에는 일반적으로 500㎍/㎖미만의 낮은 단백질, 낮은 수준의 환원제, 2M 미만의 요소 및 단백질 분자 내에 이황화 결합의 상호교환을 실행할 수 있는 환원된 글루타티온 및 산화된 글루타티온 혼합물과 같은 시약 등을 포함한다.

리폴드 과정은 SDS-PAGE에 의해 모니터하거나 고유 분자(박테리아에서 분리한 고유 분자로 백신주사한 동물에서 얻을 수 있는)에 특이적인 항체로 모니터할 수 있다. 리폴드후에, 단백질은 추가 정제하고, 이온 교호나 수지, 겔 침투 수지 또는 다양한 친화력 컬럼을 포함하는 몇 가지 서포트에서 크로마토그래피에 의해 리??드 혼합물로부터 분리하였다.

재조합 UspA 단백질을 생산할 수 있는 적절한 운반체를 제공하는 다른 진핵 벡터도 많이 있다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 발현 구조는 바이러스 또는 바이러스 게놈으로부터 유도된 조작된 구조로 구성될 수 있다. 포유류 세포에 외부 게놈을 전달하는데 매우 유용한 특징은 수용체-중개된 식작용을 통하여 세포로 들어가서, 숙주 세포 게놈에 합체하고, 바이러스 유전자를 안정적으로 효과적으로 발현시키는 특정 바이러스의 능력에 기초하여 이루어진다(Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986). 벡터로 이용된 처음 바이러스는 DNA 바이러스로써 파포바이러스[papoviruses](원숭이 바이러스[simian virus] 40(SV40), 소 파필로마 바이러스[bovine papilloma virus], 폴리오마[polyoma])(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986), 아데노바이러스(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986), 아데노-합체 바이러스등이 있다. 레트로바이러스[Retroviruses]가 유전자를 전단하는 운반체로 유익하고(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986), 벡시니아 바이러스[vaccina virus] (Ridgeway, 1988), 아데노-합체 바이러스[adeno-associated virus](Ridgeway, 1988), 허피스 심플렉스 바이러스[herpes simplex virus(HSV)](Glorioso et al., 1995)등도 유익하게 이용할 수 있다. 이와 같은 벡터를 이용하여, i)원하는 단백질을 발현시킬 목적으로 in vitro에서 세포주를 형질 변형시키고; ii) 세포를 in vivo 또는 in vitro에서 세포를 형질변형시켜, 유전자 치료 시나리오에 맞는 치료요법적 폴리펩티드를 제공한다.

진핵 벡터에 있어서, 여기에서 이용되는 프로모터란 용어는 RNA 중합효소 II의 개시 부위 주변에 모여있는 전사 조절 분자군을 말한다. HSV 티미딘 카이나제(tk), SV40 초기 전사 유닛의 프로모터를 포함하여 몇 가지 바이러스 프로모터를 분석하여, 어떻게 프로모터가 조직되는지에 대해 생각할 수 있다. 최근 작업으로 보강된 이와 같은 연구에 따르면, 프로모터는 별개의 기능 분자로 구성되는데, 각각은 약 7-20 bp DNA로 구성되고, 여기에는 전사 활성물질 또는 억제 단백질이 인지하는 부위가 하나이상 포함되어 있다.

적어도 각 프로모터에 한 모듈은 RNA 합성을 위한 시작 부위에 기능을 한다. 이와 같은 것으로 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이나. TATA 박스가 부족한 일부 프로모터의 경우(가령, 포유류 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자의 프로모터 및 SV40 후기 유전자의 프로모터), 시작 부위에 있는 별도 원소 자체가 개시 위치에 고정되는 것을 돕는다.

추가 프로모터 원소들이 전사 개시 빈도를 조절한다. 일반적으로, 시작 부위의 상류 30-110bp 부분에 이들이 위치하나. 대다수 프로모터는 시작 부위의 하류에 기능 요소를 가지는 것으로 최근에 밝혀졌다. 프로모터 원소간의 공간은 유동적이기 때문에 원소가 서로에 대해 역으로 되었거나 이동된 경우에도 프로모터의 기능은 보유하고 있다. tk 프로모터의 경우에, 프로모터 원소간에 공간은 활성이 감소되기 시작하기 전에 50bp까지 증가된다. 프로모터에 따라, 개별 원소는 공조 하여 또는 개별적으로 기능을 하여, 전사를 개시한다.

표적 세포에서 핵산을 발현시킬 수만 있다면, 핵산의 발현을 조절하는데 이용되는 특정 프로모터가 중요하지는 않는 것으로 보인다. 따라서, 사람 세포가 표적이 되는 경우에, 사람 세포에서 발현될 수 있는 프로모터의 조절 하에 또는 이에 인접하여 핵산 코딩 부위를 위치시키는 것이 바람직하다. 일반적으로, 이와 같은 프로모터는 α4 프로모터를 포함하는 HSV에서 유도된 것을 포함한다. 또 다른 적절한 구체예는 테트라사이클린 조절된 프로모터가 된다.

다양한 다른 구체예에서, 다량의 전이유전자(transgene)를 얻기 위해서는 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 바로 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 살코마 바이러스[Rous sarcoma virus] 긴 말단 반복부위를 이용한다. 당분야에 공지된 다른 바이러스성 또는 포유류 세포 또는 세균성 파아지를 이용하여도 전이유전자를 발현시킬 수 있다. 표 4에는 본 발명에서 전이유전자의 발현을 조절하기 위해 이용할 수 있는 몇 가지 프로모터를 열거하였다. 이 목록에는 전이유전자 발현을 촉진시키기 위해 관계할 수 있는 모든 가능한 원소를 포함하는 것은 아니고, 단지 설명을 위한 예를 든 것이다.

동일한 DNA 분자의 별도 위치에 위치한 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전 원소로 인헨서가 처음으로 감지되었다. 원핵 전사 조절 연구에서 상당한 거리에서도 작용하는 능력에 대해서는 선례가 없다. 후속 작업으로부터 인헨서 활성을 가지는 DNA 부분은 프로모터와 유사하게 조직되는 것으로 보인다. 즉, 이들은 많은 개별 원소로 구성되는데, 각각은 하나이상의 전사 단백질에 결합한다.

인헨서와 프로모터간에 기본적인 구별의 작동에 의한 것이다. 대체로 인헨서 부분은 거리를 두고 있는 전사를 자극할 수 있고, 이들은 프로모터 부분 또는 이의 성분 원소가 될 필요는 없다. 다른 한편, 프로모터는 특정 부위에서, 특정 방향으로 RNA 합성 개시에 관여하는 하나이상의 원소를 가져야 하고, 반면에 인헨서는 이들 특징이 부족하다. 프로모터와 인헨서는 종종 겹쳐지거나 접하고 있어 매우 유사한 분자 조직을 가지는 것으로 간주된다. 표 5에서는 몇 가지 인헨서에 대해 설명하는데, 이는 설명을 위함이지 이에 국한시키고자 하는 의도는 아니다.

인헨서	인듀서	참고문헌
MT II	포르볼 에스테르(TFA) 중금속	Palmiter et al., 1982; Haslinger and Karin, 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987; Karin , 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989
MMTV (쥐 유방 종양 바이러스)	글루코코르티코이드	Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors and Varmus, 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Fonta et al., 1985; Sakai et al., 1986
β-인터페론	poly(rI)Xpoly(rc)	Tavernier et al., 1983
아데노바이러스 5 E2	Ela	Imperiale and Nevins, 1984
콜라게나제	포르볼 에스테르(TPA)	Angle et al., 1987a
스트로멜리신	포르볼 에스테르(TPA)	Angle et al., 1987b
SV40	포르볼 에스테르(TFA)	Angel et al., 1987b
쥐 MX 유전자	인터페론, 뉴케슐 질병 바이러스
GRP78 유전자	A23187	Resendez et al., 1988
a-2-Macroglobulin	IL-6	Kunz et al., 1989
비메틴	혈청	Rittling et al., 1989
MHC Class I 유전자 H-2kb	인터페론	Blanar et al., 1989
HSP70	Ela, SV40 큰 T 항원	Taylor et al.., 1989; Taylor and Kingston, 1990a,b
프로피페린	포르볼 에스테르-TPA	Mordacq and Linzer, 1989
종양 괴사 인자	FMA	Hensel et al., 1989
흉선 자극 호르몬 유전자	티로이드 호르몬	Chatterjee et al., 1989

추가 임의 프로모터/인헨서 복합물(Eukaryotic Promoter Data Base EPDB)을 이용하여 전이유전자의 발현을 유도할 수 있다. T3, T7, SP6 세포질 발현 시스템을 이용할 수도 있다. 적절한 박테리아 중합효소가 운송 복합체의 일부 또는 추가 유전 발현 구조로 제공된다면, 진핵세포는 특정 박테리아 프로모터가 세포질 전사를 지원할 수 있다.

숙주 세포에는 진핵 미생물을 포함하는데, 이스트 배양물이 이용될 수 있다. 사카로마이세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 빵 이스트가 진핵 미생물중에 가장 널리 이용되는 것이지만, 다른 종들도 이용할 수 있다. 사카로마이세스(Saccharomyces)에서 발현되는 경우에, 예를 들면, 플라스미드 YRp7를 흔히 이용한다(Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). 이 플라시미드는 트립토판에서 생장하는 능력이 부족한 이스트 돌연변이 종의 선택성 표식을 제공하는 trpl을 포함한다(ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 (Jones, 1977)). trp1 병소가 이스트 숙주 세포 게놈의 특징으로 존재하는 경우에, 트립토판이 없는 곳에서 생장시킴으로써 형질변환을 감지하는 효과적인 환경을 제공한다.

이스트 벡터에 있는 적절한 프로모터 서열에는 3-포스포글리세레이트 카이나제용 프로모터(Hitzeman et al., 1980) 또는 다른 글리콜 효소(Hess et al., 1968; Holland et al., 1978) 가령, 에놀라제, 글리세알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 헥소카이나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토카이나제, 포도당-6-인산염 이소메라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 카이나제, 트리오제포스페이트 이소메라제, 포스포글루코즈 이소메라제, 글루코카이나제 등이 된다. 적절한 발현 플라스미드를 만드는데 있어서, 이들 유전자에 연합된 말단 서열을 발현되기를 원하는 서열의 3'를 발현 벡터에 결찰을 시켜, mRNA 폴리아데닐화 및 종료를 제공한다. 생장 조건을 조절하여 전사시키는 추가 장점을 가지는 다른 프로모터는 알코올 디하이드로게나제 2의 프로모터 부분, 이소사이토크롬 C, 산 포스포타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 전술한 글리세알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 말토즈 및 갈락토즈 이용하는 효소 등의 프로모터 부분이 된다. 이스트-필적하는 프로모터, 복제 원점, 종료 서열을 포함하는 임의 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다.

진핵 미생물에 추가하여, 다중 세포 유기체로부터 유도된 세포 배양물을 숙주로 이용할 수 있다. 원래, 이와 같은 세포 배양물은 척추 동물 및 무척추동물 배양물에서도 작업을 할 수 있다. 그러나, 최대 관심은 척추동물 세포이므로, 최근에는 배양물(조직 배양)에서 척추동물 세포를 증식시키는 것이 일반적이 과정이 되었다(Tissue Culture, 1973). 이와 같은 유용한 숙주 세포로는 VERO, HeLa 세포, Chinese hamster ovary(CHO), W138, BHK, COS-7, 293, MDCK 세포주가 된다. 이와 같은 세포용 발현벡터에는 복제원점, 발현될 유전자의 앞에 위치한 프로모터와 필요한 리보좀 결합 부위, RNA 접합 부위, 폴리아데닐화 부위, 전사 종료 서열을 보통 포함한다.

4.0 UspA 단백질에 대한 항체 준비

미국 특허 4,196,265에서 설명하는 것과 같이 공지된 기술을 이용하여, UspA1 또는 UspA2 펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 항체를 바로 준비할 수 있다. 일반적으로, 이 기술에는 선택된 이뮤노겐 조성물(정제된 또는 부분적으로 정제된 단백질, 합성 단백질 또는 이의 단편)로 적절한 동물에 면역주사하는 것이다. 면역주사를 맞은 동물은 고양이, 개, 말등과 같은 포유류가 되지만, 일부 종류의 만역 반응을 개시할 수 있는 개체라면 제한을 하지는 않는다. 면역주사하는 조성물은 항체를 생산하는 세포를 자극하는데 충분히 효과적인 방식으로 투여된다. 생쥐및 쥐와 같은 설치류가 적절하나, 토끼, 양, 개구리 세포 등도 가능하다. 쥐를 이용하는 것이 특정한 장점이 있으나, 특히 생쥐가 바람직하고, BALB/c 생쥐가 가장 흔히 이용되는 동물로 가장 적절하고 이는 일반적으로 매우 높은 빈도의 안정한 주입을 제공한다.

면역화시킨 후에, 단클론 항체(MAbs)를 만들기 위해, Mab를 발생시키는 프로토콜에 이용할 수 있도록 항체를 생산할 가능성이 있는 체세포 특히 B 임파세포(B 세포)를 선택한다. 이와 같은 세포는 생검된 지라, 편도선, 임파구 또는 말초 혈액 샘플에서 수득할 수 있다. 지라 세포 및 말초 혈액 세포가 적절한데, 지라세포의 경우에는 분할하는 형질아구 단계에 있는 항체-생산 세포가 많고, 말초 혈액 세포의 경우에는 말초 혈액에 근접성이 용이하기 때문이다. 동물을 면역화시키면, 동물의 지라에서 최대 항체 역가를 얻을 수 있다. 지라 임파세포는 주사기로 지라를 균질화시킴으로써 수득할 수 있다. 일반적으로, 면역화된 쥐의 지라에는 약 5 ×10⁷ 내지 2 ×10⁸ 임파세포를 포함한다.

면역화된 동물에서 항체를 생산하는 B 세포는 면역주사를 맞은 동물과 같은 종의 불사화된 골수 세포주의 세포와 융합된다. 하이브리도마를 생산하는 융합 과정에서 이용하기에 적합한 골수종 세포주는 항체를 생산하지 않는 것(non-antibody-producing)으로 융합 효율이 상당히 높고, 소위 "하이브리도마"라고 불리는 원하는 융합 세포의 생장만을 지원하는 특정 선택 배지에서 생장할 수 있는 효소가 결여된 것이 된다.

다수의 골수종 세포중 하나를 이용할 수 있고, 이들은 당분야에 공지된 것이다. 예를 들면, 면역화된 동물은 생쥐로써, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7, S194/5XX0 Bul을 이용할 수 있고, 쥐의 경우에는 R120.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210을 이용할 수 있고, U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2, UC729-6는 사람 세포 융합에 유용하다.

한 가지 적절한 골수종 세포주는 NS-1 골수종 세포주로써(P3-NS-1-Ag4-1라고 함), 이는 NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository에 수탁번호가 GM3573이다. 이용할 수 있는 또 다른 생쥐 골수종 세포주는 8-아자구아닌-저항성 생쥐 뮤린 골수종 SP2/0 비-생산자 세포주가 된다.

항체를 생산하는 지라 또는 임파구와 골수종 세포 하이브리드를 만드는 방법은 2:1의 비율로 체세포와 골수종 세포를 통상 혼합하는 것인데, 이때 이 비율은 세포 막 융합을 촉진시키는 물질(화학적 또는 전기적) 존재 하에 20:1 내지 약 1:1의 비율로 다양하게 할 수 있다. 센다이 바이러스를 이용하는 융합 방법은 Kohler & Milstein(1975; 1976)에서 설명하고 있고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 가령, 37% (v/v) PEG를 이용하는 방법이 Gefter et al.(1977)에서 설명하고 있다. 전기적으로 유도된 융합 방법을 이용하는 것도 바람직하다.

융합 과정은 일반적으로 낮은 빈도 가령, 1 ×10^-6 내지 1 ×10^-8에서 살아있는 하이브리드를 생산하는 것이다. 그러나, 선택성 배지에 배양시킴으로써 융합안된 모세포(특히, 융합 안된 골수종 세포는 정상적으로 무한정으로 분할된다)로부터 살아있는 융합된 하이브리드를 구별할 수 있기 때문에 문제는 없다. 이와 같은 선택성 배지에는 일반적으로 조직 배양 배지에 de novo 뉴클레오티드 합성을 차단하는 물질을 포함한다. 예를 들면 아미노프테린, 메토트렉세이트, 아자세린등이 된다. 아미노프테린 및 메토프렉세이트는 퓨린 및 피리미딘 de novo 합성을 차단하지만, 아자세린은 퓨린 합성만을 차단한다. 아미노프테린 또는 메토프렉세이트를 이용하는 경우에, 배지에는 하이포산틴 및 티미딘을 뉴클레오티드 원료(HAT 배지)로써 첨가한다. 아자세린을 이용하는 경우에 배지에는 하이포산틴을 보충한다.

적절한 선택성 배지로는 HAT가 된다. 뉴클레오티드 salvage 경로를 작동시킬 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존한다. 골수종 세포는 salvage 경로의 주요 효소 즉, 하이포산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT)가 부족하기 때문에, 생존할 수 없다. B 세포는 이 경로를 작동시킬 수 있지만, 배양물에서 한정된 수명을 가지는데 일반적으로 약 2주내에 죽게된다. 따라서, 선택성 배지에서 생존할 수 있는 세포는 골수종 및 B 세포에서 형성된 하이브리드가 된다.

이와 같이 배양을 하면, 특정 하이브리도마가 선택된 하이브리도마 집단을 제공한다. 일반적으로, 미량적정 플레이트에서 한 개-클론 희석 후에, 원하는 활성에 대해 개별 클론 상청액(약 2 내지 3주후에)을 테스트하여, 하이브리도마 선택할 수 있다. 검사는 감응성있고, 간단하고, 신속해야하는데, 예를 들면, 방사능면역검사, 효소 면역검사, 세포독성 검사, 플락 검사, 도트 면역결합 검사 등이 된다.

그 다음 선택된 하이브리도마는 연속적으로 희석하여 개별 항체를 생산하는 세포주에 클론시키고, 그 다음 클론은 무한정으로 증식시켜, MAbs를 제공한다. 두 가지 기본적인 방법으로 MAb를 생산하는데 세포주를 이용한다. 하이브리도마 샘플은 원래 융합을 위해 체세포 및 골수종 세포를 제공하는데 이용되는 형태의 조직적합성 동물 복강으로 주사한다. 주사된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 만들어지는 특정 단클론 항체를 분비하는 종양이 발생된다. 개별 세포주는 in vitro에서 배양하는데, MAbs는 배양 배지로 자연적으로 분지되어, 고농도를 얻을 수 있다. 임의 수단으로 생산된 MAbs는 원하는 경우에는 여과, 원심분리, HPLC 또는 친화력 크로마토그래피와 같은 다양한 크로마토그래피 수단을 이용하여 추가 정제할 수 있다.

본 발명의 단클론 항체는 당분야에 공지된 방법에 의해 만들어진 항-이디오타입[개체에 따라서 다른 특이한 항원 결정기] 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 단클론 항체는 두 개 이상의 항체 분자 하이브리드와 같은 단클론성 이형공액체가 된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 단클론 항체는 키메라 단클론 항체이다. 한 가지 방법으로 키메라 단클론 항체는 생쥐 항체를 생산하는 세포로부터 프 로보터, 리더, 다양한 부위 서열 및 사람 항체 유전자의 항상(constant)-부분 엑손을 포함하는 재조합 DNA를 클론하여 만들 수 있다. 이와 같은 재조합 유전자에 의해 인코드되는 사람-생쥐 키메라가 된다. 이의 항체 특이성은 생쥐 서열에서 유도된 다양한 부분으로 결정된다. 항상 부분에 의해 결정되는 이의 이소타입(모든 개체에 공통으로 존재하는 항원결정기)는 사람 DNA로부터 유도한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 단클론 항체는 당분야에 공지 기술을 이용하여 만들어진 "인체에 적응시킨[humanised]" 단클론항체이다. 즉, 사람 V-도메인에 생쥐 Ig의 중쇄 및 경쇄 V-사슬을 옮겨 생쥐 상보적인 결정 부분("CDRs")을 만든 다음, 이들의 뮤린 짝부분에 있는 일부 사람 잔기를 대체시킨다. 본 발명에 따른 "인체에 적응시킨" 단클론항체는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염을 치료하는 치료 방법 및 in vivo 진단에 특히 유용하다.

전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 단클론항체 및 이의 단편은 당분야에 공지된 in vitro 및 in vivo 방법에 따라 조절할 수 있다. in vitro 조절하는 것은 Dulbecco's modified Eagle medium 또는 RPMI 1640배지에 태아 송아지 혈청 또는 잔류원소 및 생장 유지 보충물, 가령, 정상적인 생쥐 복막 삼출액 세포, 지라 세포, 골수 대식세포등이 선택적으로 보충된 배지에서 생장시키는 것이다. in vitro 생산으로 상대적으로 순수한 항체 준비물을 제공하고, 원하는 항체를 다량 생산할 수도 있다. 조직 배양 조건하에서 대규모 하이브리도마 배양을 위한 기술이 공지되어 있는데, 여기에는 공기부유 반응기 또는 지속 교반 반응기 또는 불사화 또는 포집 세포 배양을 이용한 균질한 현탁 배양을 포함한다.

본 발명에 따른 다량의 단클론 항체는 in vivo 다중 하이브리도마 세포를 이용하여 얻을 수 있다. 세포 클론은 동계 생쥐와 같은 모 세포와 생체적합성이 있는 포유류에 주사하여, 항체를 생산하는 종양을 생장시킨다. 주사하기 전에, 선택적으로 동물은 탄화수소, 특히 Pristane(테트라메틸펜타데칸)으로 프라임시킨다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 단클론 항체 단편은 상기에서 설명한 것과 같이 생산된 단클론항체로부터 펩신 또는 파파인과 같은 효소로 처리 또는 화학적 환원에 의해 이황화결합을 절단하는 등의 방법으로 수득할 수 있다. 또는, 본 발명에서 포함되는 단클론 항체는 자동화된 펩티드 합성기를 이용하여 합성하거나 또는 공지 방법을 이용하여 수작업으로 생산할 수 있다.

본 발명의 단클론 공액체는 공지의 방법으로 준비할 수 있는데, 가령, 글루타알데히드 또는 과요오드산염등과 같은 결합제 존재 하에 효소와 상기 준비된 단클론항체를 반응시켜 준비할 수 있다. 이와 같은 결합제 존재 하에 플로레신 표식이 있는 공액체를 준비하거나 또는 이소티오시아네이트와 반응시켜 준비할 수 있다. 항체가 공액되는 다른 부분에는 ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶Cl, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, ⁹⁹mTc 등의 방사능뉴클레오티드를 포함하는데, 다른 유용한 라벨이 항체에 공액되는데 이용될 수 있다. 당업자에 공지된 방법에 따라 본 발명의 방사능-라벨된 항체를 만들 수 있다. 예를 들면, 단클론 항체는 요오드나트륨 또는 요오드 칼륨 및 염화수소나트륨염과 같은 화학 산화제 또는 락토퍼옥시다제와 같은 효소적 산화제와 접촉시켜 요오도화시킨다. 본 발명에 따른 단클론항체는 리 간드 교환 과정에 의해 테크네티움-⁹⁹m으로 라벨시키는데, 예를 들면, 퍼테치네이트를 주석 용액으로 환원시키고, Sephadex 컬럼에 환원된 테크네튬을 킬레이트시키고, 항체를 칼럼에 얹어서 실시하고 또는 직접 라벨링 시키는데, 예를 들면, SNCl₂와 같은 환원제, 퍼테치네이트, 인산나트륨 프탈레이트 용액과 같은 완충용액 및 항체를 배양하는 것이다.

5.0 면역검사에서 펩티드 및 단클론항체의 용도

본 발명의 단클론 항체는 ELISA, 웨스턴 블랏 방법과 같은 표준 면역화학 과정 및 CopB 에피토프에 특이적인 항체를 이용할 수 있는 다른 과정에서도 유용하다는 것으로 제시되었다. ELISAs가 적절하지만, 이와 같은 검사에는 RIAs 및 다른 비-효소 연결된 항체 결합 검사 또는 과정이 포함된다는 것을 인지할 것이다. 또한, 특정 UspA 에피토프에 특이저긴 단클론 항체는 다른 유용한 분야에서도 이용할 수 있다. 예를 들면, 고유 또는 재조합 UspA 단백질 또는 이의 변이체를 정제하는데 면역흡수 프로토콜에 유용하다.

본 발명에서 설명하는 UspA1 및 UspA2 펩티드는 항체를 만드는데 항원으로 유용하고, 항-UspA 항원-반응성 항체를 감지하기 위한 면역 검사에도 이용할 수 있다. 이 구체예에서 변화를 줄 경우에, MAb 17C7와 같은 UspA1- 또는 UspA2-특이적인 항체에 대한 반응성에 대해 면역검사 포맷에서 UspA1 및 UspA2 돌연변이 펩티드를 스크린할 수 있다. 이와 같은 방법에서, 다양한 에피토프의 돌연변이 분석을 실행한다. 이와 같은 분석 결과를 이용하여 추가 UspA1 또는 UspA2 에피토프가 항 체에 의해 인지되는 지를 결정하고, 이는 모렉셀라(Moraxella)에 대한 잠재적인 가능성이 있는 백신을 준비하는데 유용하다.

진단 면역검사에는 액체 배양물에 있는 체액 또는 영양 한천과 같은 고형 서포트에서 체액을 배양하는 것에 관계한다. 전형적인 검사는 환자로부터 체액 샘플을 수집하고, 병인균 생장을 위한 최적 조건에 샘플을 두는 것과 관계한다. 그 다음 샘플에 미생물이 존재하는지를 결정한다. 추가 분석을 실행하여 미생물의 균질 성질을 결정한다.

본 발명에 포함되는 면역검사에는 미국 특허 4,367,110(이중 단클론 항체 샌드위치 검사[double monoclonal antibody sandwich assay]) 및 미국 특허 4,452,901(웨스턴 블랏[western blot])을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 다른 검사에는 in vitro 및 in vivo에서 라벨된 리간드의 면역침전 및 면역세포화학등이 포함된다.

가장 간단하고 직접적인 감지를 하는 면역검사는 결합 검사이다. 특정 적절한 면역검사는 본 분야에 공지된 효소 연결된 면역흡착 검사(ELISAs) 및 방사능면역검사(RIAs)등의 다양한 형태가 있다. 그러나, 이와 같은 기술에 국한되어 감지를 하는 것이 아니라, 웨스턴 블랏, 도트 블랏, FACS 분석 등의 방법이 이용될 수 있다.

ELISA의 한 구체예에서, 본 발명의 항-UspA 항체는 폴리스티렌 미량적정판과 같은 공지의 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면 위에 고정시킨다. 그 다음, 원하는 항원을 포함할 것으로 의심이 가는 임상 샘플을 웰에 첨가한다. 결합 및 세척후에, 비-특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위해, 결합된 항원을 감지한다. 일반적으로 원하는 항원에 특이적인 또 다른 항체를 첨가하여 감지하는데, 물론 항체에는 감지가능한 라벨이 연결되어있다. 이와 같은 형태의 ELISA는 간단한 "샌드위치 ELISA"라고 한다. 원하는 항체에 특이적인 제 2 항체를 첨가하고, 제 2 항체에 결합 친화성을 가지는 제 3 항체를 첨가하여 감지하는데, 이때 제 3 항체에는 감지 가능한 라벨이 연결되어 있다.

또 다른 ELISA의 예를 들면, UspA 항원을 포함할 것으로 보이는 샘플은 웰 표면에 고정시키고, 항-UspA 항체에 접촉시킨다. 결합 및 적절히 세척한 후에, 결합된 면역 복합체를 감지한다. 항원 특이적인 항체가 감지 가능한 라벨에 연결되면, 면역 복합체를 직접 감지할 수 있다. 다시, 면역 복합체는 제 1 항원 특이적인 항체에 결합 친화성을 가지는 제 2 항체를 이용하여 감지하고, 이때 제 2 항체는 감지가능한 라벨이 연결되어 있다.

또한 두 단계의 1차 면역 복합체를 감지하는 방법이 포함된다. 항체와 같은 1차 항체에 결합 친화성을 가지는 제 2 결합 리간드를 이용하여 상기에서 설명하는 것과 같은 제 2 면역 복합체를 만든다. 세척후에, 면역 복합체(3차 면역 복합체)를 형성할 수 있는 충분한 시간동안 효과적인 조건하에서 제 2 면역 복합체는 제 2 항체에 결합 친화성을 가지는 제 3 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 제 3 리간드 또는 항체에는 감지 가능한 라벨이 연결되어 있고, 따라서 형성된 3차 면역 복합체를 감지할 수 있다. 이와 같은 시스템은 원하는 경우에 시그날 증폭을 할 수 있다.

라벨된 항원 또는 항체의 양을 알고 있어, 테스트 샘플이 결합에 대해 경쟁하는 경쟁 ELISAs 방법도 가능하다. 피복된 웰에 배양하기전 또는 배양하는 동안에 공지의 라벨 종과 샘플을 혼합하여, 모르는 샘플에서 반응 종의 양을 결정한다(항원 또는 항체는 비드, 막대, 막, 컬럼 매트릭스등의 형태의 고형 서포트에 연결하고, 분석할 샘플을 고정된 항원 또는 항체에 제공한다). 샘플에 반응 종이 존재하는 경우에, 웰에 결합하는데 이용되는 라벨된 종의 양이 감소될 것이고, 따라서 최종 발생 시그날이 감소된다.

이용된 포맷과는 무관하게, ELISAs는 코팅, 배양, 결합 및 비-특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척등의 공통 특징을 가지고, 또한 결합된 면역 복합체를 감지하는 과정도 공통된다. 이들은 다음에서 설명한다.

항원 또는 항체를 플레이트에 피복시킬 경우에, 일반적으로 하룻밤 또는 특정 기간동안 항원 또는 항체 용액을 플레이트 웰에 배양시킨다. 그 다음 플레이트 웰을 씻어내어 불완전하게 흡수된 물질을 제거한다. 웰에 남아있는 이용 가능한 표면은 테스트 항혈청에 대해 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "피복"시킨다. 여기에는 소 혈청 알부민(BSA), 카제인, 우유 분말 용액 등이 포함된다. 이렇게 피복시킴으로써 고정된 표면상에 비특정 흡수 부위를 차단시키고, 따라서, 표면에서 항혈청의 비특이적 결합에 의한 배경을 줄일 수 있다.

웰에 항원성 물질을 결합시킨 후에, 배경을 줄이기 위해 비-반응성 물질로 피복시키고, 결합 안된 물질을 제거하기 위해 세척하고, 고정된 표면은 면역 복합체(항원/항체)를 형성하는데 도움이 되는 방식으로 테스트할 임상 또는 생물학적 추출물 또는 항혈청과 접촉시킨다. 이와 같은 조건에는 BSA, 소 감마 글로블린(BGG), 인산 완충 염(PBS)/Tween과 같은 희석물질로 항혈청을 희석하는 것을 포함한다. 이와 같이 첨가된 물질은 비특정 배경을 줄이는데 도움이 된다. 깔린 항혈청은 2 내지 4시간동안 25℃ 내지 27℃에서 배양한다. 배양 후에, 항혈청이 접촉된 표면은 세척하여 비-면역복합체 물질을 제거한다. 적절한 세척 과정에는 PBS/Tween 또는 붕산염 완충액으로 세척하는 것이 포함된다.

테스트 샘플과 결합된 항원간에 특정 면역복합체를 형성시킨 후에, 연속하여 세척하고, 제 1 항원에 특이성을 가지는 제 2 항체로 면역복합체 형성 및 그 양을 측정한다. 물론, 테스트 샘플은 일반적으로 사람의 것이고, 제 2 항체는 사람 IgG에 일반적인 특이성을 가지는 항체가 바람직하다. 감지 수단을 제공하기 위해, 제 2 항체는 적절한 발색 기질에 배양하는 동안에 색을 생성하는 관련 효소를 가지는 것이 바람직하다. 따라서, 면역 복합체 형성을 선호하는 조건 및 시간(가령, PBS-Tween과 같은 PBS-포함 용액에서 실온 2시간) 우레이즈 또는 퍼옥시다제-공액된 항-사람 IgG와 항-혈청 결합된 표면을 접촉 배양시키는 것이 바람직하다.

제 2 효소가 붙은 항체와 배양한 후에, 결합안된 물질을 제거하기 위해 바로 세척하고, 효소 라벨이 과산화효소인 경우에, 요소, 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2-아지노-디-(3-에틸-벤조티아졸린-6-설폰산[ABTS]), H₂O₂와 같은 발색 기질과 배양하여, 라벨 양을 정량할 수 있다. 가시 광선 분광광도계등을 이용하여, 색이 발생되는 정도를 측정함으로써 정량화할 수 있다. 또는, 라벨은 화학발광물질이 될 수 있다. 이와 같은 라벨을 이용하는 것에 대해서는 미국 특허 5,310,687, 5,238,808, 5,221,605에서 설명하고 있다.

6.0 UspA 펩티드 및 UspA-특이적인 항체의 예방학적 용도.

본 발명의 구체예에서, 능동적인 면역예방 및 수동적인 면역 예방 방법을 제공한다. 능동적인 면역예방을 먼저 논하고, 이어서 수동적인 면역예방에 대해서 논한다. 능동적인 면역치료에서 백신 조성물을 조제하는 것에 대해 논의하는 것은 수동 면역치료 및 진단 방법을 만드는데 실험 동물에서 항체를 생성시키는 것과 관계한다.

6.1. 능동 면역 치료법

본 발명에 따르면, UspA1 또는 UspA2 폴리펩티드 또는 UspA1- 또는 UspA2- 유도된 펩티드를 백신 조제물로 이용하여 in vivo에서 항-모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 보호성 항체 반응을 만들 수 있다. 보호에 의해, 처리된 개체의 면역계는 세균 감염의 임상적인 충격에 대해 어느 정도 감소된 반응을 나타낼 수 있다. 이는 박테라아 양이 최소로 감소되거나 감염을 완전히 예방할 수 있다. 이상적으로, 치료를 받은 개체는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염의 가장 심각한 징후를 나타내지는 않을 것이다.

일반적으로, 위험한 개체에 백신 조성물을 투여하는 것이 면역예방 방법이다. 본 경우에는, 백신 조성물에는 제약학적 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제에 UspA1 또는 UspA2 폴리펩티드 또는 면역원성 유도체를 포함한다. 상기에서 언급한 것과 같이, 당업자는 다양한 메카니즘을 통하여, UspA1 및 UspA2의 적절한 항원성 특징으로 확인할 수 있고, 이렇게 함으로써, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 면역 반응을 얻을 수 있는 백신을 개발할 수 있다.

UspA1 및 UspA2 항원의 안정성 및 면역원성이 다양하기 때문에 담체 분자에 항원을 결합시키는 것이 바람직하다. 담체로는 KLH, BSA, 사람 혈청 알부민, 미오글로빈, β-갈락토시다제, 페니실리나제, CRM₁₉₇, 디프테리아 독소 및 테타누스 독소와 같은 세균성 독성등이 있다. 당업자는 항원의 면역원성 가치를 파괴시키지 않고 담체에 연결하는 적절한 방법을 알고 있을 것이다. 다중-폴리-DL-알라닐-폴리-L-리신 및 폴리-L-리신과 같은 합성 담체도 고려할 수 있다. 일반적으로 결합은 항원의 아미노 또는 카르복시 말단 잔기를 통하여 이루어지고, 결합 후에 상대적으로 "고유"모양을 가질 수 있는 최대 기회를 펩티드 또는 폴리펩티드에 제공한다.

담체 분자로 UspA1 또는 UspA2 항원이 작용할 수 있도록 UspA1 또는 UspA2 항원에 다른 보호기 물질을 결합시킬 수도 있다. 예를 들면, 박테리아, 바이러스 또는 기생충과 같은 다른 병인균 유기체로부터 보호하는 물질을 UspA1 또는 UspA2 항원에 결합시켜 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염 및 다른 병인성 감염을 치료 및 저해하는데 유용한 다가 백신 또는 제약학적 조성물을 만들 수 있다. 특히, UspA1 또는 UspA2 단백질 또는 펩티드는 폐염구균(pneumococcus), 수막염균(menigococcus), 혈호균 인플루엔자(hemophylus influenza)의 사카라이드와 같은 다른 백신 성분에 대한 면역원 담체로 작용하고, 이들 다른 성분에 공유적으로 결합될 수 있다.

조성물에는 어쥬번트로 칭하는 여러 가지 다른 물질이 포함되는 것이 바람직한데, 이와 같은 어쥬번트는 백신화된 동물의 면역계에 적절한 단백질을 자극하는 것으로 알려져 있다. 개체(실험동물 포함)를 백신화하는데 적절한 어쥬번트로는 Freund's 컴플리트 또는 인컴플리트 어쥬번트(가축용으로는 적합하지 않음), Marcol 52:Montanide 888 (Marcol는 Esso의 상표이고, Montanide는 SEPPIC, Paris의 상표이다), 스쿠알렌, Adjuvant 65(땅콩 오일, 마니드 모노올레이트, 모노스테아레이트 알루미늄), MPL^TM(3-O-데아실레이트된 모노포스포릴 리피드 A; RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Utah), Stimulon^TM (QS-21; Aquila Biopharmaceuticals Inc., Wooster, MA)와 같은 오일 에멸젼; 수산화알루미늄, 인산 알루미늄, 인산 칼슘, 알룸과 같은 미네랄 겔; 헥사데실아민, 옥타데실아민, 리조레시틴, 브롬화 디메틸-디옥타데실암모니움, N,N-디옥타데실-N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 메톡시헥사데실글리세롤, 플루로닉 폴리올과 같은 계면활성제; 피란, 덱스트란 설페이트, 폴리아크릴산, 카르보폴과 같은 다가음이온; 무라밀 디펩티드, 디메틸글리신, 투프신, 트레할로즈 디미콜레이트와 같은 펩티드 및 아미노산등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 합성 당 고분자(Carbopol)를 포함하는 물질, 만니드 모노-올레이트(Aracel A)와 같은 생리학적으로 수용가능한 오일 운반체에 포함된 에멸젼 또는 과플로오르화탄소(Fluosol-DA) 20% 용액 에멸젼등을 이용할 수 있다.

활성 성분으로 펩티드 서열을 포함하는 백신을 만드는 것은 일반적으로 미국 특허 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; 4,578,770에 잘 알려져 있다. 일반적으로 이와 같은 백신은 주사용으로 만든다. 액체 용액 또는 현탁액으로 또는 용액 또는 현탁액에 적합한 고체로 만든 후, 주사하기 전에 용액으로 준비한다. 준비물은 에멸젼화할 수 있다. 활성 면역원성 성분은 제약학적 수용가능하고, 활성 성분과 필적할 수 있는 부형제와 혼합한다. 적절한 부형제로는 물, 염, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등이 있다. 또한, 원하는 경우에 백신에는 습윤제, 에멸젼화제, pH 완충제, 백신의 효과를 강화시키는 어쥬번트가 소량 포함될 수 있다.

본 발명의 백신 준비물은 리포좀 또는 다른 적은 담체 물질과 같은 비-독성 담체에 결합시킨 후에 또는 폴리사카라이드, 단백질 또는 고분자 또는 Quil-A와 복합하여, "iscoms(면역자극복합체[immunostimulting complexes])한 후에 투여할 수 있다. 이와 같은 복합체는 항원의 독성을 줄이고, 숙주로부터 제거되는 속도를 지연시키고, 어쥬번트로 작용하여 면역반응을 개선시키는 작용을 한다. 본 발명의 구체예에 이용할 수 있는 다른 적절한 어쥬번트에는 INF, IL-2, IL-4, IL-8, IL-12, 다른 면역 자극 화합물을 포함한다. 또한, 원핵생물 기원의 완전한 막과 함께 이뮤노겐으로 구성된 공액체 가령, TraT(PCT/AU87/00107참고)가 장점을 보여줄 수 있을 것이다.

백신은 통상적으로 피하 또는 근육을 통하여 주사하여 장관외로 투여된다. 다른 투여 방식에 적합한 추가 조제물로는 좌약과 일부 경우에 경구용 조성물이 포함된다. 좌약의 경우에, 통상적인 결합체 및 담체에는 폴리알칼렌 글리콜 또는 트 리글리세리드 등을 포함하고; 이와 같은 좌약은 활성 성분이 0.5% 내지 10%, 적절하게는 1-2% 포함된 혼합물의 형태로 만들어진다. 경구용 조제물에는 제약학적으로 사용할 수 있는 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아레이트 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오즈, 탄산 마그네슘염등과 같은 일반적인 부형제를 포함한다. 이와 같은 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방형 조성물, 분말의 형태로 제조되고, 활성성분이 10-95%, 적절하게는 25-70% 포함된다.

백신에 포함되는 펩티드는 중성 또는 염의 형으로 제조된다. 제약학적 수용가능한 염에는 산 첨가염(펩티드의 자유 아미노기와 함께)이 포함되는데, 이는 염화수소 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델린산등과 같은 유기산으로 만든다. 자유 카르복실 기로 형성된 염은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화철과 같은 무기염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인등과 같은 유기 염기에서 유도할 수 있다.

약량 조제물이 적응할 수 있는 방법으로 백신을 투여하고, 치료요법적 및 면역원상으로 효과적인 양을 투여한다. 투여할 양은 치료할 개체의 나이, 항체를 합성하는 개별적인 면역계 능력, 원하는 보호정도에 따라 달라진다. 투여에 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 실무자의 판단에 따라 달라진다. 그러나, 적절한 약량 범위는 백신화당 수백 미리그램정도가 된다. 초기 투여 및 부스터 주사에 대한 적절한 방법은 다양하나, 일반적으로 초기 투여 후에, 연속하여 접종 또는 다른 투여를 하는 것이다.

응용 방법은 매우 다양하다. 백신을 투여하는 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 고형 생리학적으로 수용 가능한 염기의 구강 투여 또는 생리학적으로 수용 가능한 분산액, 주사 등의 방법이 요구된다. 백신 약량은 투여경로에 따라 달라지는데, 이는 숙주 체구에 따라 다양하다.

많은 경우에, 백신을 여러 차례 투여하는 것이 바람직한데, 통상적으로 6회 백신 접종을 초과하지 않고, 더 일반적으로는 4회를 초과하지 않고, 적절하게는 1회 이상, 적어도 3회 접종을 하는 것이 바람직하다. 백신접종은 2 내지 12주 간격으로, 좀더 적절하게는 3 내지 5주 간격으로 한다. 1-5년 통상, 3년 간격으로 주기적인 부스터 접종을 하여 보호를 할 수 있는 수준의 항체 수준을 유지하는 것이 바람직하다. 면역화 과정은 상청액 항원에 대한 항체 검사로 알 수 있다. 검사를 방사능뉴클리드, 효소, 형광물질 등과 같은 통상적인 라벨을 이용하여 라벨링한다. 이와 같은 기술은 공지된 것이고, 미국 특허 3,791,932; 4,174,384; 3,949,064에서 다양하게 설명하고 있다.

6.2. 수동 면역치료법

본 출원의 목적으로 수동 면역화는 또 다른 유기체에서 만들어진 면역반응 효과물질을 해당 유기체로 이동시키는 것으로 정의할 수 있다. 수동 면역화를 만드는 방법은 한 유기체에서 생산된 항체를 제 2 면역학적으로 적합성이 있는 동물로 이동시키는 것이다. "면역학적으로 적합성이 있는"이란, 항체가 새로운 숙주 동물에서 면역 기능의 적어도 일부를 수행할 수 있다는 것을 의미한다. 최근에 세포 면역 기능에 대한 이해가 이루어지면서, 세포독성, 헬퍼 T 세포, NK 세포 및 다른 면역 효과물질 세포 등을 포함하는 특정 종류의 임파세포와 같은 다른 효과물질을 이동시켜 수동 면역을 이루는 것이 가능하다는 것이다. 본 발명은 이들 방법 모두를 포함한다.

상기에서 설명한 것과 같은 적절한 동물에서 표준 백신접종 과정을 이용하여 만든 항체, 항혈청, 면역 효과물질을 만든다. 1차 동물은 본 발명에 따른 미생물 준비물 또는 한 개 세균성 생성물 또는 부산물(어쥬번트 유무에 관계없이)로 백신주사한다. 표준 ELISA 방법을 이용하여 생산된 항체 수준을 측정함으로써 면역 반응을 모니터한다.

적절한 면역 반응이 발생되면, 피를 뽑아 면역 효과물질 세포을 모은다. 표준 방법 가령, protein A 또는 protein G 크로마토그래피를 이용하여 혈액으로부터 항체 부분을 정제한다. 또 다른 적절한 구체예에서, 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 표준 방법을 이용하여 준비한다(Coligan et al., 1991). 표준 수단을 이용하여 단클론성 항체를 준비한다. 1차 숙주 단클론 항체가 치료를 할 동물과 적응성이 있는 경우에, 세포를 유전공학적으로 조작하여 치료할 동물이 항체에 내성을 가지도록 변형시킬 수 있다. 사람의 경우에는 이와 같은 방식으로 뮤린 항체를 "인체에 적응화(humanized)"할 수 있다.

상기에서 제시하는 항체, 항혈청, 면역효과물질 세포를 숙주에 제공하여, 미생물 침투에 대해 수동 면역화를 제공할 수 있다. 예를 들면, 적어도 한 개 항체와 적어도 한가지 제약학적 또는 수의학적으로 수용 가능한 담체, 희석제, 부형체를 표준방법을 이용하여 균질하게 혼합하여 항체 조성물을 만든다. 단일 약형을 생산하는데 요구되는 항체의 양은 백신에 이용되는 미생물종, 치료받을 개체, 투여 방식등에 따라 달라진다. 임의 특정 개체의 경우에 특정 약량 수준은 나이, 체중, 일반적인 건강, 성, 개체의 식이요법, 투여 시간, 투여 경로, 배설률, 약물 복합물 및 미생물 감염 정도를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라진다.

항체 조성물은 정맥, 피하, 비강, 구강, 근육, 질, 직장, 국소 또는 다른 원하는 경로를 통하여 투여할 수 있다. 반복적인 약량투여가 필수적일 수도 있고, 임상적인 세팅, 특정 미생물, 환자의 상태, 다른 치료법의 이용 등에 따라서 다양하게 변화될 수 있다.

6.3. DNA 면역주사 HC

본 발명은 또한, 서열:17로 구성된 UspA1, UspA2 단백질 또는 펩티드를 인코드하는 핵산으로 구성된 백신에 관계하는데, 이때 UspA1, UspA2 단백질 또는 펩티드는 면역원성을 보유하고 있고, 면역원성 조성물 또는 백신에 결합시켜, 척추동물에 생리학적으로 수용가능한 운반체를 이용하여 투여하면 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 감염되었을 경우에 질병이 강화되지 않고 보호를 할 수 있다.

여기에서 이용된 "유전적 면역화(genetic immunization)"는 생쥐 또는 사람과 같은 포유류 등의 척추동물에 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)와 같은 병인균에 대한 핵산 백신을 접종하여, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대해 척추동물을 보호하게 된다. 여기에서 이용된 것과 같이, "핵산 백신" 또는 "DNA 백신"은 UspA1, UspA2를 인코드하는 핵산 또는 서열:17로 구성된 면역원성 에피토프로 구성된 핵산 구조이다. 핵산 구조에는 전사 프로모터 원소, 인헨서 원소, 접합 원소, 종료 및 폴리아데닐화 시그날, 다른 핵산 서열을 포함한다.

표준 방법을 이용하여 핵산 백신을 만들 수 있다. 예를 들면, 공지의 방법을 이용하여, UspA1 또는 UspA2를 인코드하는 핵산(가령 DNA)를 발현벡터에 삽입하여, 핵산 백신을 만든다(Maniatis et al., 1989). 개별 척추동물에 표준 방법을 이용하여 핵산 백신(가령, 핵산 백신을 투여함)으로 접종한다. 피하, 정맥, 복막, 진피, 근육, 국소, 구강, 직장, 비강, 볼, 질, 흡입 스프레이, 통상적인 비-독성 생리학적으로 수용 가능한 담체 또는 운반제를 포함하는 약량 조성물이 이식된 저장기를 통하여, 척추동물에 이식할 수 있다. 또는, 입자 가속화 장치("gene gun")을 이용하여 핵산 백신을 접종할 수 있다. 투여할 형태(가령, 캡슐, 정제, 용액, 에멸젼)는 투여 경로에 따라 일부 달라진다. 가령, 점막 투여의 경우에, 비점액, 흡입 또는 좌약을 이용할 수 있다.

임의 적절한 어쥬번트와 함께 핵산 백신을 투여할 수 있다. 어쥬번트는 충분한 량으로 투여하는데, 그 양은 핵산 백신에 대한 면역 반응을 강화시키는데 충분한 양이 된다. 어쥬번트는 핵산 백신을 접종하기전(1개월 이상 전에); 핵산 백신과 동시에(24시간이내에); 핵산 백신과 함께(어쥬번트는 핵산 백신과 혼합하고, 혼합물을 척추동물에 투여함) 또는 핵산 백신 접종 후(하루이상 후에)에 투여할 수 있다. 어쥬번트는 또한 1회 이상(핵산 백신과 접종하기전 그리고 핵산 백신 접종후) 투여한다. 여기에서 이용된 것과 같이, "함께"는 여기에서 특정한 시간을 포함한 임의 시간 및 어쥬번트를 투여하는 동안을 포함하여 핵산 백신에 대한 면역 반응을 발생시킨다(가령, 핵산 백신에 의해 인코드되는 항원에 대한 항체 역가가 증가 또는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 항체역가 증가). 어쥬번트와 핵산 백신을 척추동물에서 동일한 위치에 투여할 수 있는데 예를 들면, 척추동물의 사지에 표시된 부위에 어쥬번트와 핵산 백신을 모두 투여한다.

특정 구체예에서, 핵산 구조물은 트랜스펙션-실행 물질과 함께 투여할 수 있다. 적절한 구체예에서, 트랜스펙션-실행 물질은 디옥틸글리실스페르민(DOGS)(PCT WO96/21356)이 된다. 또 다른 구체예에서, 트랜스펙션-실행 물질은 부피비카인[bupivicaine](미국 특허 5,593,972)이다.

6.4. 치료요법의 효과를 테스트하기 위한 동물 모델

적절한 동물 모델이 부족하기 때문에 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 표면 항원에 대한 항체의 기능적 중요성을 평가하지 못하였다. 이와 같은 유기체 동물에 독성이 상대적으로 부족하기 때문에 적절한 모델 시스템을 확인하는 것이 어렵다(Doern, 1986). 친칠라를 포함하는 설치류를 이용하여 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 의한 중이염 감염 치료 연구는 실패하였는데, 그 이유는 이와 같은 유기체는 이들 숙주의 중이에서 생장 또는 생존할 수 없기때문이다(Doyle, 1989).

뮤린 단기 폐 정화 모델이 개발되어(Unhanand et al., 1992; Verghese et al., 1990), 하부 호흡기관과 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)와의 상호작용 뿐만 아니라 폐에서 병인균의 변화를 평가할 수 있다. 이와 같은 모델은 뮤린 폐의 국소 말초 단편에 박테리아 접종물을 반복적으로 수송한다. 박테리아는 폐에 서 증식하나, i) 상주 방어 기작; ii) 염증 반응이 발생되고; iii) 특정 면역 반응이 발생되어; 궁극적으로는 제거된다. 이와 같은 모델을 이용하여, 혈청 IgG 항체는 염증 반응 없이 폐 공간으로 들어가고, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 것과 거의 동일한 숙주 범위 및 질병 스펙트럼을 가지는 병인균인 형태가 없는 H. influenzae(McGehee et al., 1989)를 제거한다.

7.2. 스크리닝 검사

추가 구체예에서, 본 발명은 "추천 물질"로 칭하는 새로운 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 저해 화합물을 확인하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 확인된 면역원성 에피토프 부분에 하나이상의 돌연변이를 포함하는 펩티드와 면역원 활성을 스크린하여 이루어진다. 이와 같은 스크린 기술은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)를 저해하거나 죽이는 목적으로 사용할 수 있는 임의 화합물을 확인하는데 유용하고, 적절한 구체예에서는 추천 백신 화합물을 제공한다.

이에 대해 유용한 화합물에는 단백질성 또는 펩티드성 화합물이 될 것이다. 사실, 스크리닝 검사를 통하여 확인할 수 있는 가장 유력한 제약학적 화합물은 원래 펩티드성 물질이 아닌 것으로 이는 단단한 결합 또는 다른 화학적 작용을 통하여 박테리아 단백질 전사를 저해하는 작용을 할 것이다. 추천 물질은 합성 화합물 라이브러리, 열대 다우림 및 해양 샘플과 같은 천연 샘플에서 구할 수 있다.

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 저해물질을 확인하기 위해, 나란히 또는 비교할 수 있는 조절된 이뮤노에세이를 실시하여, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 표현형을 저해하는 화합물을 간단하게 확인할 수 있다. 당업자는 경쟝 스크린을 하기 위한 이뮤노에세이에 대해 잘 알고 있을 것이다(Sambrook et al. 1989).

일단 추천 물질이 확인되면, 추천 물질 존재 하에 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)를 저해하는 능력을 측정한다. 일반적으로, 추천 물질의 상대적인 저해 능력을 평가하기 위해서 추천 물질 존재하에 활성에 대해 첨가된 추천물질이 없을 경우에 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 활성을 측정하는 것이 바람직하다.

7.1 돌연변이 발생

근원 DNA에 특정 돌연변이 발생을 통하여 개별 펩티드 또는 생물학적으로 기능적 등가체 단백질 또는 펩티드를 준비하는데 가장 유용한 기술이 부위-특이적 돌연변이 발생이다. DNA에 하나이상의 뉴클레오티드를 변화시켜 다양한 변이체 서열을 준비하고 이를 테스트할 수 있다. 충분한 크기의 서열 복합체로 된 1차 서열을 제공하여, 결손-접합 양쪽이 가로지르는 안정된 이중 나선을 만들도록 부위-특이적 돌연변이 발생으로 원하는 돌연변이의 DNA 서열 뿐만 아니라 인접 뉴클레오티드를 인코드하는 특정 올리고뉴클레오티드를 이용하여 돌연변이체를 만든다. 일반적으로 길이가 17 내지 25개 뉴클레오티드로 된 프라이머가 적절하고, 변경된 서열의 접합부 양쪽에는 약 5 내지 10개 잔기가 있는 것이 적절하다.

일반적으로 부위-특이적 돌연변이 발생은 당업자에게 공지된 것으로 이 기술은 일반적으로 단일 가닥 및 이중 가닥 모두로 존재하는 박테리오파아지를 이용한 다. 부위-특이적 돌연변이에 유용한 일반적인 벡터에는 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이와 같은 파아지 벡터들은 시판되고 있으며, 이들을 이용하는 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 부위-특이적인 돌연변이 발생에서 흔히 이중 가닥 플라시미드가 이용되는데, 그 이유는 파아지에서 플라스미드로 원하는 유전자를 전달하는 단계를 생략하기 때문이다.

일반적으로, 부위-특이적 돌연변이 발생은 원하는 단백질을 인코드하는 DNA 서열을 서열내에 포함하는 이중 표준 벡터의 이중 가닥을 용융시키거나 또는 단일-가닥 벡터를 얻어서 실행한다. 원하는 돌연변이된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여 준비할 수 있다. 그 다음, 이와 같은 프라이머에 단일-가닥 DNA 준비물을 어닐시키고, 대장균(E. coli) 중합효소 I Klenow 단편과 같은 DNA 중합효소를 이용하여 돌연변이을 가지는 가닥을 완전하게 합성한다. 따라서, 한 가닥에는 원래 돌연변이안된 서열을 가지고, 다른 가닥에는 원하는 돌연변이를 포함하는 이형 이중 가닥이 형성된다. 이와 같은 이형 이중 가닥 벡터를 이용하여 대장균(E. coli) 세포와 같은 적절한 세포를 형질변환시키고, 돌연변이된 서열을 가지는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선택한다.

부위-특이적 돌연변이 발생을 이용하여 선택된 유전자 서열 변이체는 유용한 종을 생산하는 종의 수단으로 제공되나 이에 국한되는 것은 아니고, 유전자의 다양한 서열 변이체를 얻을 수 있는 다른 수단으로 이용될 수도 있다. 예를 들면, 원하는 유전자를 인코드하는 재조합 벡터는 하이드록실아민과 같은 돌연변이성 물질로 처리하여 서열 변이체를 얻을 수 있다.

7.2. 제 2 세대 저해물질

처음 확인된 저해 화합물에 추가하여, 발명자들은 저해물질 구조에서 주요 부분을 모방한 공간적으로 유사한 화합물을 만드는 것에 대해 고려하였다. 펩티드 저해물질의 펩티드 모방물질을 포함하는 이와 같은 화합물을 초기 저해물질과 동일한 방식으로 이용할 수 있다.

단백질 이차구조의 원소를 모방하는 특정 모방물질을 만드는 것은 단백질의 펩티드 기본 구조는 주로 아미노산 측쇄로부터 기인하여, 분자 상호작용을 실행한다는 이론을 이용한 것이다. 따라서, 펩티드 모방물질은 고유 분자와 유사한 분자 상호작용을 허용하도록 만든다.

펩티드 모방 물질 개념을 성공적으로 사용하기 위해서는 매우 항원성이 강한 것으로 알려진 단백질내에 β-회전 모방체에 초점을 맞춘다. 폴리펩티드내에 β-회전 구조는 여기에서 논의하는 것과 같이 컴퓨터를 이용한 알고리즘으로 예측할 수 있다. 일단 회전에서 아미노산 성분을 결정하고, 모방체를 만들어 아미노산 측쇄의 필수 원소와 유사한 공간 방향을 얻는다.

구조적 등가체 또는 모방체를 만들기 위해서는 당업자에 공지된 모델링 및 화학적 디자인 기술을 이용하는 것이다. 컴퓨터를 이용한 화학적 모델링 기술은 잘 알려진 것이다. 이와 같은 방법을 이용하여, 바이러스 전사 연장을 특이적으로 방해하는 화합물을 디자인하고, RNA 연장을 저해하는 화합물을 우선 확인한 다음 이를 합성하나, 사람 RNA 연장을 저해하기 보다는 바이러스성 RNA 연장을 저해하는데 특이성이 가지지는 않는다. 이와 같은 공간적으로 유사한 구조 및 2 세대 분자 또한 본 발명의 범위에 속한다.

8.0 모렉셀라 카타르할리스( M. catarrhalis ) 감염 진단

8.1 증폭 및 PCR^TM

증폭을 위한 주형으로 이용되는 핵산 서열은 표준 방법에 따라(Sambrook et al., 1989) 생물학적 샘플에서 수득된 세포로부터 얻을 수 있다. 핵산은 게놈 DNA 또는 분절된 DNA 또는 전체 세포 RNA가 된다. RNA를 이용하는 경우에, 이는 RNA를 cDNA로 변환시키는 것이 바람직하다.

UspA1 또는 UspA2 또는 이의 돌연변이에 상응하는 핵산에 선택적으로 하이브리드되는 프라이머 쌍은 선택적인 하이브리드를 하는 조건하에서 분리된 핵산과 접촉시킨다. 여기에서 사용된 "프라이머(primer)"는 주형에 의존하는 공정에서 초기 핵산 합성을 프라이밍시킬 수 있는 능력을 가진 임의 핵산을 포함한다. 일반적으로, 프라이머는 길이가 10 내지 20개 염기쌍의 올리고뉴클레오티드이나 더 긴 서열을 이용할 수도 있다. 프라이머는 이중 가닥 또는 단일 가닥으로 제공될 수 있으나 단일 가닥이 더 바람직하다.

일단 하이브리드되면, 핵산: 프라이머 복합체는 주형-의존성 핵산 합성을 실행하는 하나이상의 효소와 접촉시킨다. 다수의 증폭 단계는 "cycles"이라고 부르는데, 이는 충분한 양의 생성물이 만들어질 때까지 지속한다.

그 다음, 증폭 생성물을 감지한다. 특정 분야에서, 시각적 수단을 이용하여 감지한다. 또는, 감지는 화학적발광, 방사능라벨 또는 형광 라벨이 결합된 방사능 활성 신티그래피(scintigraphy)를 통하여 또는 전기적 또는 열 자극 시그날을 이용하는 시스템(Affymax technology)을 통하여 생성물을 간접적으로 확인할 수 있다.

많은 주형 의존성 과정을 이용하여 주어진 주형 샘플에 존재하는 표식 서열을 증식시킬 수 있다. 가장 잘 알려진 증폭 방법 중에 하나는 폴리메라제 사슬 증식 반응(PCR^TM 라고 칭함)인데, 이는 미국 특허 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159에서 설명한다.

간략하게 PCR^TM를 설명하면, 표식 서열의 마주하는 상보 가닥에 있는 부분이 상보적인 두 개 프라이머 서열을 준비한다. 반응 혼합물에 과량의 데옥시뉴클레오시드 3인산염과 Taq 폴리메라제와 같은 DNA 폴리메라제를 첨가한다. 표식 서열이 샘플에 존재하는 경우에, 프라이머는 표식에 결합할 것이고, 폴리메라제는 뉴클레오티드를 첨가하면서 표식 서열을 따라 프라이머를 연장시킬 것이다. 반응 혼합물의 온도를 상승 또는 하강시켜, 연장된 프라이머를 표식으로부터 분리시켜, 반응 생성물을 만들고, 과량의 프라이머는 표식 및 반응 생성물에 결합하고, 이과정을 반복한다.

증폭된 mRNA 양을 정량화하거나, 원하는 mRNA로부터 cDNA를 준비하기 위해 역전사효소 PCR^TM(RT-PCR^TM) 증폭 과정을 실행할 수 있다. RNA를 cDNA로 역전사하는 방법은 공지된 것이고, 이는 Sambrook et al., 1989에 잘 설명하고 있다. 또 다른 역전사 방법은 열에 안정한 RNA-의존성 DNA 폴리메라제를 이용하는 것이다. 이 방법은 1990년 12월 20일자 출원된 WO 90/07641에서 잘 설명하고 있다. 폴리메라제 사슬 연장 반응은 당분야에 잘 알려진 것이다.

증폭을 위한 또 다른 방법은 리가제 사슬 반응("LCR")으로 EPA No. 320 308에 상술된 것이다. LCR에서, 두 개 상보적인 프로브 쌍을 준비하고, 표적 서열 존재하에, 각 쌍은 표적의 반대쪽 상보가닥에 결합한다. 리가제 존재 하에, 두 개 프로브 쌍은 서로 연결되어 한 개 단위가 된다. PCR^TM에서와 마찬가지로, 온도를 변화시켜, 표적으로부터 결합된 결찰 단위를 분리해내고, 이는 과량의 프로브 쌍의 결찰을 위한 표적서열("target sequences")로 이용한다. 미국 특허 4,883,750에서는 표적 서열에 프로브 쌍을 결합시키기 위한 LCR와 유사한 방법을 설명하고 있다.

Qbeta Replicase(PCT 출원 PCT/US87/00880에서 설명하고 있는)를 본 발명에서 이용하는 증폭의 또 다른 방법에 이용할 수 있다. 이 방법에서, 표적에 상보적인 부분을 가지는 RNA 복제 서열을 RNA 폴리메라제 존재 하에 샘플에 첨가한다. 폴리메라제는 복제 서열을 복사하고 이는 감지된다.

제한효소 및 리가제를 이용하여, 제한효소부위의 한 가닥에 뉴클레오티드 5'-[알파-티오]-삼인산염을 포함하는 표적 분자를 증폭시키는 등온(isothermal) 방법을 이용하여 본 발명의 핵산을 증폭시킬 수 있다.

니크(nick) 해독과 같은 가닥 치환 및 합성을 다수 실행하는 것과 연관된 등온 핵산 증폭을 실행하는 또 다른 방법으로 가닥 치환 증폭[Strand Displacement Amplification(SDA)]이 있다. 복구 사슬 반응[Repair Chain Reaction(RCR)]으로 불리는 유사한 방법은 증폭의 표적이 되는 부분을 통하여 몇 가지 프로브를 어닐링시키고, 4개 염기중 2개만 존재하도록 복구 반응을 하는 것이다. 다른 두 개 염기는 감지를 용이하게 하도록 바이오티닐화된 유도체로 첨가된다. 유사한 방법이 SDA에 이용된다. 표적 특이적 서열은 사이클 프로브 반응(CPR)을 이용하여 감지된다. CPR에서, 비-특이적 DNA의 3' 및 5' 서열 및 특정 RNA의 중간 서열을 가지는 프로브를 샘플에 존재하는 DNA에 하이브리드시킨다. 하이브리드하는 동안에, 반응은 RNase H로 처리하고, 프로브 생성물은 절단후에 방출되는 별개 생성물로 확인된다. 원래 주형은 또 다른 사이클링 프로브에 어닐시키고, 반응은 반복한다.

또 다른 증폭 방법은 GB 출원 2 202 328 및 PCT/US89/01025에서 설명하는데, 이 방법들도 본 발명에서 이용할 수 있다. 전자의 경우에, "변형된" 프라이머를 PCR^TM-유사한 주형 및 효소-의존성 합성에 이용한다. 포집 부분(가령, 바이오틴) 또는 감지 부분(가령 효소)으로 라벨링하여, 프라이머를 변형시킨다. 후자의 겨웅에, 과량의 라벨된 프로브를 샘플에 첨가한다. 표적 서열 존재 하에, 프로브는 결합하고, 촉매작용으로 절단된다. 절단 후에, 표적 서열은 과량의 프로브에 결합된 채로 방출된다. 라벨된 프로브가 절단되면 표적 서열이 존재한다는 신호가 된다.

다른 핵산 증폭 과정에는 전사를 기초로한 증폭 시스템(TAS)으로 핵산 서열을 기초한 증폭(NASBA) 및 3SR Gingeras et al., PCT Application WO 89/10315이 포함된다. NASBA의 경우에, 핵산은 표준 페놀/클로로포름 추출, 임상 샘플의 열 변성, 용해 완충액으로 처리, DNA 및 RNA 또는 RNA 염화구아니디움 추출물을 분리하는 미니스핀 컬럼을 이용하여 증폭시킬 수 있다. 이와 같은 증폭 기술에는 표적 특이적인 서열을 가지는 프라이머를 어닐링시키는 것도 관계한다. 중합다음에, DNA/RNA 하이브리드는 RNase H로 처리하고, 이중 가닥 DNA 분자는 다시 열변성시킨다. 제 2 표적 특이적인 프라이머를 첨가하여 단일 가닥 DNA에서 이중 가닥 DNA를 만들고, 그 다음 중합반응을 한다. 이중 가닥 DNA 분자는 T7 또는 SP6와 같은 RNA 폴리메라제를 이용하여 여러 차례 전사한다. 등온 사이클 반응의 경우에, RNA는 단일 DNA로 역전사되고, 그 다음 이중 DNA로 전환되고, 그 다음 T7 또는 SP6와 같은 RNA 폴리메라제와 함께 전사한다. 절두된 또는 완전한 생성물은 표적 특이적인 서열을 나타낸다.

Davey et al., EPA No. 329 822에서는 핵산 증폭 과정을 설명하는데, 이 과정은 단일 가닥 RNA("ssRNA"), ssDNA 및 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 순환 합성하는 것이다. ssRNA는 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 주형으로 이는 역전사효소(RNA-의존성 DNA 폴리메라제)에 의해 연장된다. 그 다음 생성된 DNA:RNA 이중나선으로부터 리보뉴클레아제 H(RNase H, DNA 또는 RNA이중나선에서 RNA에 특이적인 RNase)의 작용으로 RNA를 제거한다. 생성된 ssDNA는 제 2 프라이머의 주형인데, 주형에 상동성을 가지는 RNA 폴리메라제 프로모터(예를 들면 T7 RNA 폴리메라제) 서열을 포함한다. 이와 같은 프라이머는 DNA 폴리메라제(가령, 대장균[E. coli] DNA polymerase I의 "Klenow" 단편)으로 연장시켜, 프라이머간의 고유 RNA와 동일한 서열을 가지고 또한 한 단부는 프로모터 서열을 가지는 이중 가닥 DNA("dsDNA")를 만든다. 이와 같은 프로모터 서열을 이용하여 적절한 RNA 폴리메라제로 DNA에 대한 많은 RNA 복사체를 만든다. 그 다음 이와 같은 복사본은 다시 사이클을 거치게하여 매우 신속한 증폭을 실행한다. 적절한 효소를 선택하여, 각 과정에서 효소 첨가없이 증폭을 등온적으로 실행할 수 있다. 이와 같은 과정의 사이클 성질 때문에 시작 서열은 DNA 또는 RNA 형을 선택해야 한다.

Miller et al., PCT 출원 WO 89/06700에서는 표적 단일 가닥 DNA("ssDNA")에 대한 프로모터/프라이머 서열의 하이브리드 반응 및 서열의 많은 RNA 복사체를 전사하는 것에 기초하여 핵산 서열 증폭 과정에 대해 상술하고 있다. 이 과정은 순환적인 것은 아니고, 즉 새로운 주형이 생성된 RNA 전사체로부터 만들어지지 않는다. 다른 증폭 방법에는 "RACE" 및 "일방향 PCR"(Frohman, 1990, incorporated by reference)등이 포함된다.

생성된 "디-올리고뉴클레오티드" 서열을 가지는 핵산 존재 하에 두 개(또는 그 이상) 올리고뉴클레오티드 결찰하여, 디-올리고뉴클레오티드를 증폭시키는 방법을 본 발명의 증폭 단계에 이용할 수 있다.

증폭후에, 특정 증폭이 일어났는지를 결정하기 위해 과량의 프라이머 및 주형으로부터 증폭 생성물을 분리한다. 한 구체예에서, 표준 방법을 이용하여, 아가로즈, 아가로즈-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 증폭 생성물을 분리해낸다. Sambrook et al., 1989 참고.

또는 크로마토그래피 기술을 이용하여 분리한다. 본 발명에 이용될 수 있는 크로마토그래피 종류는 많다; 컬럼, 페이퍼, 박층을 포함하는 다양한 기술을 이용하여 흡착, 분리, 이온-교환, 분자 거름, 기체 크로마토그래피.

표식 서열의 증폭을 확인하기 위해 증폭 생성물은 볼 수 있어야 한다. 한가 지 전형적인 시각화방법에는 에티디움 브로마이드로 겔을 착색한 후, UV 광 아래에서 보는 것이다. 또는, 증폭 생성물에 방사능- 및 형광 라벨된 뉴클레오티드로 내부 라벨을 한 경우에, 증폭 생성물은 x-ray 필름에 노출시키거나 또는 분리후에 적절한 자극 스펙트럼하에서 볼 수 있다.

한 구체예에서, 시각화 방법은 간접적으로 얻을 수 있다. 증폭 생성물을 분리한 후에, 라벨된 핵산 프로브는 증폭된 표식 서열과 접촉시킨다. 프로브는 적절하게는 발색물과 공액시키나 방사능라벨을 할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 프로브는 항체 또는 바이오틴과 같은 결합 짝과 공액시키고, 결합 짝의 다른 부분에는 감지 가능한 부분을 가지고 있다.

한 구체예에서, 서던 블랏팅 및 라벨된 프로브를 이용한 하이브리드에 의해 감지가 이루어진다. 서든 블랏팅에 관계하는 기술은 당분야에 공지된 것으로, 많은 교과서에 기술하고 있다(Sambrook et al., 1989). 간략하면, 증폭 생성물은 겔 전기영동으로 분리한다. 그 다음 겔은 니트로셀룰로오즈와 같은 막과 접촉시켜, 핵산 및 비-공유 결합을 전달한다. 연속하여 막은 발색단-공액된 프로브로 배양시키는데, 이때 프로브는 표적 증폭 생성물과 하이브리드할 수 있는 것이다. 막을 x-ray 필름에 노출시키거나 이온 방출 감지 장치에 노출시켜 감지한다.

전술한 것의 예를 들면 미국 특허 5,279,721에서 설명하는데, 여기에는 자동화된 전기영동 및 핵산 전달 장치 및 그 방법에 대해 설명하고 있다. 이 장치는 외부에서 겔을 조작하지 않고 전기영동 및 블랏팅을 할 수 있도록 하고, 본 발명에 따른 방법을 실행하는데 이상적이다.

생물학적 샘플내에 P-TEFb 또는 카이나제 단백질 표식이 존재하는지를 감지하는데 요구되는 모든 필수 물질 및 시약은 키트에 포함된다. 이는 일반적으로 특정 표식에 대해 미리 선택된 프라이머로 구성된다. 다양한 폴리메라제(RT, Taq, etc.), 데옥시뉴클레오티드 및 완충액을 포함하는 핵산을 증폭시키는데 적합한 효소가 포함되어 증폭을 위한 필수적인 반응 혼합물을 제공한다.

이와 같은 키트는 일반적으로 별도 용기에 각 개별 시약 및 효소 뿐만 아니라 각 표식 프라이머쌍을 포함하는 것으로 구성된다. 핵산을 증폭하는데 요구되는 적절한 프라이머 쌍을 선택하여 서열 리스트에 명기된 서열을 증폭하는데; 서열:2 또는 서열:4 또는 서열:6 또는 서열:8 또는 서열:10 또는 서열:12 또는 서열:14 또는 서열:16; 예를 들면 핵산 단편은 서열:2 또는 서열:4 또는 서열:6 또는 서열:8 또는 서열:10 또는 서열:12 또는 서열:14 또는 서열:16의 15, 20, 25, 30, 35등; 48, 49, 50, 51등; 75, 76, 77, 78, 79, 80등; 100, 101, 102, 103등; 118, 119, 120, 121등; 127, 128, 129, 130, 131등; 316, 317, 318, 319; 322, 323, 324, 325, 326등; 361, 362, 363, 364등; 372, 373, 374, 375등과 동일한 인접한 뉴클레오티드 스트레치를 포함하도록 준비하는데, 단 조건은 이와 같은 선택된 스트레치가 공간적으로 별도 부분으로부터 기인된 것이어야 한다. 서열:1에 동일한 또는 상보적인 유사한 단편을 준비할 수 있는데, 이 단편은 서열:3에는 하이브리드하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 이와 같은 키트는 서열:2 또는 서열:4 또는 서열:6 또는 서열:8 또는 서열:10 또는 서열:12 또는 서열:14 또는 서열:16 또는 명시된 서 열의 중간 길이에 상응하는 핵산을 포함하는 군에서 선택된 UspA1 또는 UspA2에 특이적인 하이브리드 프로브로 구성된다. 이와 같은 키트는 일반적으로 적절한 수단, 별도 용기에 각 개별 시약 및 효소 뿐만 아니라 각 표식 하이브리드 반응 프로브로 구성된다.

8.2. 다른 검사

DNA, cDNA, RNA 샘플에서 정상적인 세포 생산 및 프로세싱을 변경시킬 수 있는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염을 정확하게 감지하기 위한 유전공학적 스크리닝 방법은 특정 상황에 따라 달라진다.

예를 들면, 유전적 변화를 스크리닝하는 한 방법은 RNA/DNA 및 RNA/RNA 이형이중나선에서 잘못 짝지어진 염기쌍를 RNase 절단하는 것에 기초한다. 여기에서 언급하는 것과 같이, "mismatch"는 이중 가닥 RNA/RNA, RNA/DNA, DNA/DNA 분자에서 하나이상의 짝을 이루지 않은 또는 잘못 짝지어진 뉴클레오티드 부분을 말한다. 이와 같은 정의에는 삽입/결손 돌연변이 및 단일 및 다중 염기 돌연변이로 인한 잘못짝지어진 것도 포함된다.

미국 특허 4,946,773에서는 RNase A 미스메취 절단 검사에 대해 설명하고 있는데, 이는 RNA 프로브에 단일 가닥 DNA 또는 RNA 테스트 샘플을 어닐링하고, RNase A로 핵산 이중나선을 처리하는 것이다. RNase 절단 반응 후에, RNase는 단백질 분해 및 유기물 추출을 이용하여 비활성화시키고, 절단 생성물은 가열에 의해 변성시키고, 변성된 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 분석하였다. 미스메취를 감지하기 위해서, 크기에 따라 전기영동에 의해 분리된 RNase A 처리된 단일 가 닥 생성물을 유사하게 처리된 기준 이중나선과 비교한다. 기준에서 볼 수 없는 더 작은 단편(절단 생성물)을 포함하는 샘플은 +로 기록한다.

미국 특허 4,946,773를 포함한 현재 이용할 수 있는 RNase 미스메취 절단 검사에서는 방사능라벨된 RNA 프로브를 이용할 것을 권한다. Myers and Maniatis(미국 특허 4,946,773)에서는 RNase A를 이용한 염기쌍 미스메취를 감지하는 것에 대해 설명한다. 미스메취 연구에서 대장균(E. coli) 효소 RNase I를 이용하는 발명자도 있다. 이는 RNase A, RNase I보다 절단 특이성 범위가 넓기 때문에, 성분에서 비-특이적 절단 정도가 감소되고, 미스메취 절단 빈도가 증가된 경우에 염기 쌍 미스메취를 감지하는데 이용할 수 있는 적절한 효소가 된다. 미스메취 감지에 RNase I를 이용하는 것에 대해서는 Promega Biotech 문헌에서 설명한다. Promega는 문헌상에서 보여준 RNase I를 포함하는 키트를 시판하여 네 개 공지의 미스메취중 3개를 절단하는데, 이때 효소 수준은 상당히 높다.

RNase 보호 검사를 우선 이용하여, 용액에서 특정 mRNA 표적의 단부를 감지하고, 지도를 만든다. 검사는 in vitro 전사에 의해 원하는 mRNA에 상보적인 매우 특이 활성이 높은 방사능라벨된 RNA를 용이하게 만들 수 있느냐에 달려 있다. 원래, in vitro 전사를 위한 주형은 박테리오파아지 프로모터를 포함하는 재조합 플라스미드이다. 프로브는 총 세포 RNA 샘플과 혼합하여 이들의 상보적인 표적에 하이브리드되도록 하고, 그 다음 혼합물을 RNase로 처리하여 과도한 하이브리드안된 프로브를 분해한다. 원래 의도한 것과 마찬가지로, 이용된 RNase는 단일-가닥 RNA에 특이적인 것으로 하이브리드된 이중 가닥 프로브는 분해되지 않는다. RNase를 비활성화 및 제거한 후에, 보호된 프로브(존재하는 표적 mRNA의 양에 비례하는 양)를 회수하고, 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다.

단일 염기 돌연변이를 감지하기 위해 RNase 보호 검사를 이용한다. 이와 같은 RNase A 미스메취 절단 검사에서 야생형 서열로부터 in vitro 전사된 방사능라벨된 RNA는 테스트 샘플에서 유도된 상보적인 표적 부분에 하이브리드된다. 테스트 표적은 일반적으로 DNA(게놈 DNA 또는 플라스미드에서 클로닝에 의해 또는 PCR^TM에 의해 증폭된 DNA)로 구성되지만, RNA 표적(내생 mRNA)을 이용할 수도 있다. 하이브리드된 프로브와 표적간에 뉴클레오티드 서열 차이가 한 개 또는 그 이상인 경우에 그 위치("mismatch")에서 Watson-Crick 수소 결합이 파괴된 것이 인지되고, 일부경우에는 단일 가닥 특이적인 리보뉴클레아제에 의해 절단된다. 현재까지, RNase A를 이용하여 배타적으로 단일-염기 미스메취를 절단하였으나 RNase I도 최근에는 미스메취 절단에 이용할 수 있다는 것을 알았다. 단일 염기 미스메취를 감지하기 위한 MutS 단백질 및 다른 DNA-복구 효소를 이용하는 최근 문헌도 있다.

다음의 실시예에는 본 발명의 적절한 구체예를 설명하는 것이다. 당업자는 본 발명을 잘 실행하기 위해 발명자가 발견한 대표적인 기술을 실시예에서 설명하여, 이것이 본 발명을 실행하는데 가장 적합한 방법으로 간주될 수 있다. 그러나, 당업자는 본 발명의 내용을 바탕으로, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 유사한 결과를 얻을 수 있는 특정 구체예의 변형에 대해서도 인지할 것이다.

실시예 1: uspA1 의 서열 분석 및 특징조사

박테리아 균주 및 배양 조건

이미 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 035E, 046E, TTA24, 012E, FR2682, B21에 대해서 설명하였다(Helminen et al., 1993a; Helminen et al., 1994; Unhanand et al., 1992). 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 FR3227, FR2336는 Richard Wallace, University of Texas Health Center, Tyler, TX.에서 구하였다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 B6는 Elliot Juni, University of Michigan, Ann Arbor, MI.에서 구하였다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) TTA1는 Steven Berk, East Tennessee State University, Johnson City, TN.에서 구하였다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 25240는 American Type Culture Collection, Rockville, MD.에서 구하였다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주는 일반적으로 37℃에서 Brain Heart Infusion(BHI) 브로스(Difco Laboratories, Detroit, MI) 또는 95% 공기-5% CO₂ 조건에서 BHI 한천 플레이트에서 배양한다. 대장균(Escherichia coli) 균주 LE392 및 XL1-Blue MRF'(Stratagene, La Jolla, CA)는 말토즈(0.2% w/v) 및 10mM MgSO₄, 37℃에서 Lubria-Bertani 배지(Maniatis et al., 1982)에서 생장시키고, 필요에 따라서는 항균제를 보충시킨다.

단클론항체(MAbs)

MAb 17C7는 지금까지 테스트한 모든 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주의 UspA 단백질성 물질과 반응성이 있는 뮤린 IgG 항체이다(Helminen et al., 1994). UspA 물질에 특이적인 추가 MAbs(가령, 16A7, 17B1, 5C12)는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 035E의 외측 막 소포로 면역주사한 쥐의 지라 세포를 Helminen et al., 1993a에서 설명하는 SP2/0-Ag14 플라즈마사이토마 세포주에 융합시켜 만든 것이다. 이와 같은 MAbs는 웨스턴 블랏 및 도트 블랏 분석에서 하이브리도마 배양물 상청액 유체형으로 이용된다.

클로닝 벡터

본 작업에 이용된 플라스미드 및 박테리오파아지 클로닝 벡터 및 이들 벡터의 재조합 유도체는 다음의 표 6에 나타내었다.

박테리오파아지 또는 플라스미드	설명	소스
박테리오파아지
LambdaGEM-11	클로닝 벡터	Promega Corp.(Madison, WI)
MEH200	UspA 단백질성 물질을 인코드하는 M. catarrhalis 균주 035E DNA의 11kb 삽입체를 포함하는 LambdaGEM-11	(Helminen et al.,1994)
ZAP Express	클로닝 벡터	Stratagene
USP100	M. catarrhalis의 크로모좀에서 증폭시킨 DNA(uspA1 포함) 2.7kb 단편과 ZAP Express	This study
플라스미드
pBluescript II SK+ (pBS)	클로닝 벡터, Amp^R	Stratagene
pJL501.6	MEH200의 1.6kb BglII-EcoRI 단편을 포함하는 pBS	This study
pJL500.5	MEH200의 600-bp BglII 단편을 포함하는 pBS	This study

MEH200는 UspA-특이적인 MAb 17C7와 플락 반응성이 있는 원래 재조합 박테리오파아지 클론으로 설명된 바 있다(Helminen et al., 1994).

유전학적 기술

플라스미드 분리, 제한 효소 절단, DNA 변형, 결찰반응, 대장균(E. coli) 형질변환을 포함하는 표준 재조합 DNA 기술은 당업자에게 공지된 것으로 이미 설명된 바와 같이 실행할 수 있다(Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989).

폴리메라제 사슬 연장반응(PCR ^TM )

PCR^TM은 GeneAmp kit(Perkin-Elmer, Branchberg, NJ)를 이용하여 실행하였다. 모든 반응은 제조업자의 지시에 따라 실행한다. 총 게놈 DNA로부터 생성물을 증폭시키기 위해, 1㎍ 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 염색체 DNA 및 각 프라이머 100ng을 각 100㎕반응에 이용하였다.

뉴클레오티드 서열 분석

재조합 플라스미드에서, 박테리오파아지에서, PCR^TM에 의해 유도된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열 분석은 Applied Biosystems Model 373A automated DNA sequencer(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한다. University of Wisconsin Genetics Computer Group software analysis package(Devereux et al., 1984)의 Intelligenetics suite package and programs를 이용하여, DNA 서열 정보를 분석하였다. Kyte 및 Doolittle(1982) 방법을 이용하여 단백질의 친수성을 분석하고, UspA 단백질 내에 반복 아미노산 서열은 MacVector^TM software protein matrix analysis package(Eastman Kodak Company, Rochester, NY)를 이용하여 분석 하였다.

재조합 박테리오파아지의 확인

Helminen et al., 1994에서 설명하는 플레이트 용해 방법을 이용하여 재조합 박테리오파아지에 감염된 대장균(E. coli) 세포로부터 용해물질을 준비한다. 대장균(E. coli) XL1-Blue MRF' 세포에서 재조합 ZAP Express에 의해 형성된 플락의 MAb-기초한 스크리닝은 제조업자의 지시에 따라 실행하였다(Stratagene, La Jolla, CA). 간략하게 설명하면, 세균 균총에 박테리오파아지를 감염시킨 후에, 10mM IPTG에 잠긴 니트로셀룰로오즈 필터를 5시간동안 한천 플레이트에 얹는다. 37℃에서 하룻밤 배양한 후에, 니트로셀룰로오즈 패드를 제거하고, 0.5%(v/v) Tween 20 및 5%(w/v) 탈지 우유(PBS-T)를 포함하는 PBS로 세척하고, 실온에서 4시간동안 MAb를 포함하는 하이브리도마 배양 상청액으로 배양한다. PBS-T로 4회 세척한 후에, ¹²⁵I-라벨된 염소 항-쥐 IgG를 포함하는 PBS-T를 각 패드에 제공한다. 4℃에서 하룻밤동안 배양한 후에, 패드는 PBS-T로 4회 세척하고, 블랏을 건조시키고, 필름에 노출시킨다.

모렉셀라 카타르할리스( M. catarrhalis ) 단백질 항원의 특징

BHI 브로스에서 생장된 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)세포로부터 EDTA-완충액 방법(Murphy Loeb, 1989)을 이용하여 외측 막 소포를 준비한다. 7.5% (w/v) 폴리아크릴아미드 분리겔을 이용하여, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 이들 소포에 존재하는 단백질을 분리한다. 이와 같은 SDS- PAGE-분리된 단백질은 전기영동적으로 니트로셀룰로오즈에 옮기고, MAb 17C7를 1차 항체로 이용하여, 웨스턴 블랏 분석을 실행한다(Kimura et al., 1985). 재조합 박테리오파아지에 DNA 삽입물에 인코드된 단백질의 웨스턴 블랏 분석을 위해, 박테리오파아지-감염된 대장균(E. coli) 용해물의 일부분은 일부 SDS-분해 완충액(Kimura et al., 1985)과 혼합하고, 이 혼합물은 37℃에서 15분간 배양한 후, SDS-PAGE를 한다.

uspA1 유전자의 특징 및 이의 인코드된 단백질 생성물

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 035E uspA1 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 UspA1 단백질의 유추된 아미노산 서열은 각각 서열:2 및 서열:1에서 제공된다. 2,493개 뉴클레오티드를 포함하는 오픈 리딩 프레임(ORF)은 831개 아미노산 단백질 생성물을 인코드하는데, 이 분자량은 88,271달톤(계산치)이 된다.

uspA1 ORF의 예상 단백질 생성물은 pI가 4.7로 매우 친수성이 크고, 상당히 반복된 모티프를 가진다. 제 1 모티프는 표준 서열 NXAXXYSXIGGGXN(서열:24)로 구성되는데, 이는 아미노산 잔기 80과 170사이가 상당히 반복된다. 제 2 부분은 아미노산 잔기 320부터 460까지로, 전체적으로 3회 반복되는 긴 서열을 포함하지만, 그 자체내에 몇 회 반복되는 더 작은 유닛을 포함할 수도 있다. 이와 같은 "반복부내에 반복부" 배열은 제 3 부분으로 이는 아미노산 460 내지 600까지 연장되어 있다.

이와 같은 마지막 모티프는 작은 모티프 QADI(서열:25)의 많은 반복체 및 그 자체내에 QADI(서열:25) 모티프를 포함하는 두 개 큰 반복부로 구성된다.

다른 단백질에 UspA1 유사성

UspA1에 상당한 유사성을 가지는 단백질에 대한 이용 가능한 데이터베이스의 BLAST-X 연구(Altschul et al., 1990; Gish and States, 1993)에 따르면, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 항원에 가장 유사한 원핵 단백질은 H. influenzae Rd의 추정 어드헤신(adhesin)(GenBank accession number U32792) (Fleischmann et al., 1995); 형태가 없는 H. influenzae의 Hia 어드헤신(adhesin)(GenBank accession number U38617) (Barenkamp and St. Geme III, 1996); Yersinia enterocolitica의 YadA invasin(Skurnik and Wolf-Watz, 1989)(SwissProt:P31489)이다. GAP 배열 프로그램(Devereux et al., 1984)을 이용하여, UspA1 서열과 이들 서열을 비교하였을 경우에, 관련 세균성 어드헤신(adhesin)과 상당히 관련이 있고, UspA1는 장병원성 대장균의 대장균(E. coli) AIDA-I에는 25% 동일하고, 47% 유사한 것으로 증명되었고(Benz and Schmidt, 1989; Benz and Schmidt, 1992b), Hia(Barenkamp and St. Gene III, 1996)와는 23% 동일하고, 46% 유사한 것으로 증명되었고, YadA(Skurnik and Wolf-Watz, 1989)와는 24% 동일하고, 43% 유사한 것으로 증명되었다. UspA1에 상동성을 가지는 것으로 데이터베이스 연구로부터 빼낸 다른 단백질에는 여러 종의 미오신 중쇄를 포함한다.

실시예 2 : UspA1 와 UspA2 단백질을 인코드하는 두 개 유전자

MAb 17C7는 UspA라고 명명된 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 매우 큰 분자량의 단백질 물질에 결합하는데, 이 물질은 SDS-PAGE에서 약 250kDa 분자량 범위로 이동한다. 이와 동일한 MAb는 미국 특허 5,552,146에서 설명하는 것과 같 은 약 100kDa의 또 다른 항원 밴드와 반응을 한다. 이는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 염색체 DNA 단편을 포함하는 재조합 박테리오파아지에 의해 감염된 대장균(E. coli)의 파아지 용해물질에 결합한다. 이 MAb에 결합하는 파아지 용해물질에 있는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 단백질성 물질은 고유 UspA 물질의 것과 거의 유사한 또는 구별할 수 없는 속도로 이동한다(Helminen et al., 1994),

uspA1 분석

uspA1로 지정한 재조합 박테리오파아지에 의해 발현되는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) O35E 유전자의 뉴클레오티드 분석에 따르면, 분자량이 88,271(서열:1)인 예측 단백질 생성물을 인코드하는 ORF가 존재하는 것으로 나타났다. in vitro DNA-관련된 단백질 발현 시스템에서 uspA1 ORF를 이용하면, uspA1 에 의해 인코드된 단백질은 SDS-PAGE에서 약 120kDa 정도의 분자량 거리로 이동하는 것으로 나타났다(당업자는 SDS-PAGE와 같은 변성 과정을 인지할 것이고, 이는 단백질의 이동속도를 변경시키는데, 가령 변성된 단백질은 변성안된 단백질의 예상 분자량과는 다소 차이가 난다). 또한, uspA1 ORF를 박테리오파아지 벡터로 유도하였을 경우에, 단백질을 발현하는 재조합 파아지를 포함하는 재조합 대장균(E. coli)은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 고유 UspA 단백질과 거의 동일한 속도로 SDS-PAGE상에서 이동하였다.

프로브로 클론된 uspA1-유전자로부터 유도된 0.6 kb BglII-PvuII를 이용하여, 몇 가지 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주로부터 염색체 DNA를 서 든 블랏 분석을 하면, uspA1-유도된 프로브에 결합되는 두 개 별개 제한 단편이 있는데, 이는 uspA1 유전자와 유사한 제 2 유전자를 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)가 소유한다는 것을 말한다.

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E에서 유도된 고유 분자량이 매우 큰 UspA 단백질 물질은 SDS PAGE에 의해 분리하고, 전기용출시키고, 프로테아제로 절단한다. 일부 생성 펩티드의 N-말단 산 서열을 분석하면, 몇 가지 펩티드의 아미노산 서열이 UspA1의 유추된 아미노산 서열의 것과 매치가 되지 않는다. 이 실험에서 수득한 다른 펩티드는 유추된 아미노산 서열에 존재하는 것과 유사하나 동일하지는 않다.

고분자량 UspA 단백질 물질의 프로테아제 및 브롬화 시아노겐(CNBr) 절단

정제된 매우 분자량이 큰 UspA 단백질성 물질 0.3㎎(정제단계에서 이 물질은 단일 단백질로 간주됨)을 90% 에탄올로 침전시키고, 펠렛은 12M 요소를 포함하는 88% 포름산 100㎖로 재현탁시킨다. 현탁 후에, 2M CNBr을 포함하는 88% 포름산 100㎖을 첨가하고, 혼합물은 실온에서 어두운 상태에서 배양한다. 정제된 UspA 물질 1㎖(2.0 ㎎)을 트립신 또는 키모트립신 25㎎을 포함하는 바이알에 바로 첨가한다. 반응 혼합물은 ∼48시간동안 37℃에서 배양하였다. 정제된 UspA 1㎖(2.0㎎)을 15㎎ 엔도프로테나제 Lys-C를 포함하는 바이알에 직접 첨가한다. 이 반응 혼합물은 37℃에서 약 48시간동안 배양하였다.

Eppendorf^TM 원심분리기에서 12,000 rpm, 5분간 원심분리하여 절단된 반응 혼 합물을 정화시킨다. 정화된 상청액은 Vydac C4 HPLC 컬럼에 얹고, 이동상으로 0.1%(v/v) 수용성 트리플로오르아세트산(용매 A), 아세토니트릴:H₂O:트리플로오르아세트산 80:20:0.1(v/v/v)(용매 B)을 분당 유속이 1.0 ㎖로 한다. 반응 혼합물은 100% 용매 A로 컬럼에서 씻어내고, 그 다음 용매 B 30분 선형 경사(0-100%)를 이용하여, 절단된 단편을 용출시킨다. 분취물은 손으로 수득하고, Speed-Vac에서 하룻밤동안 건조시키고, House Pure Water로 재현탄시킨다. 재현탁된 HPLC-분리된 분취물은 트리스-트리신 완충 시스템에서 10-18% 경사 겔을 이용하여 SDS-PAGE한다. 한 개 펩티드 밴드를 나타내는 분취물은 바로 N-말단 서열 분석을 한다. 여러개 펩티드 밴드를 나타내는 분취물은 SDS-PAGE로부터 PVDF막으로 옮기고, 개별 밴드는 잘라내어, N-말단 서열 분석을 한다.

그 다음 이들 단편의 N-말단 아미노산 서열은 Applied Biosystems Model 477A PTH Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.)을 이용하여 결정한다. 이들 서열은 표 7에 나타내었다. 서열의 약 절반은 uspA1 유전자에서 유추한 서열과 짝을 이루는 것으로 밝혀졌지만, 나머지 반은 짝을 이루지 못하였다. uspA1 유전자 서열의 리딩 프레임을 이동하려는 시도는 짝을 이루지 못하는 펩티드 서열 때문에 실패하였는데, 그 이유는 고분자량 UspA 단백질이 한 개 이상의 별도 단백질 다량체(multimer) 또는 두 개의 상이한 단백질로된 다량체로 구성된다는 것을 나타낸다.

^a몇 가지 펩티드의 특정 잔기는 확인되지 않았고, 이는 서열:29, 서열:30, 서열:32, 서열:33, 서열:35, 서열:49, 서열:50에서 "X"로 나타내었다. 서열:29에서 확실하지 않는 잔기는 세린이고; 서열:33에서는 위치 13이 아스파르트산인 것 같고; 위치 14는 글리신, 위치 15는 아르기닌인 것 같고; 서열:35에서 13 및 19위치는 모두 세린으로 보이고; 서열:49에서 확실하지 않는 잔기는 아스파라긴이고; 서열:50에서 4번 위치는 세린, 8번 위치는 트레오닌으로 보인다.

SDS-PAGE, 전기용출, 프로테아제로 처리 또는 시아노겐 브로마이드로 처리하여, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) O35E로부터 매우 분자량이 큰 UspA를 분리하는 시도로 서열화된 다수의 서열을 얻는다. 몇 가지 펩티드(펩티드 1-6, 표 8)을 얻는다. uspA1 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 유추된 것과 동일하거나 매우 유사하다. 그러나, 표 8에는 몇 가지 추가 펩티드, 펩티드 7-10은 유추된 아미노산 서열에 있지 않는 것이다. 이와 같은 발견은 UspA 항원 준비물에 제 2 단백질이 존재한다는 것을 증명하는 것이다.

^a몇 가지 펩티드의 특정 잔기는 확인되지 않았고, 이는 서열:57, 서열:62, 서열:63, 서열:64에서 "X"로 나타내었다.

고분자량 UspA 단백질성 물질이 하나이상의 별개 단백질 다량체 또는 두 개의 상이한 단백질의 다량체로 존재한다는 확신은 UspA 물질의 분자량이 약 59,500이라는 초기 전기분사 질량 스펙트럼 분석으로 알 수 있다. 이와 같은 60kDa 단백질은 MAbs 17C7, 45-2, 13-1, 29-31와 면역학적으로 반응하지만, 이와 대조적으로 UspA 1 단백질은 MAb 17C7하고만 교차 반응한다. MAb 17C7는 두 가지 분리된 단백질과 반응한다는 사실은 이 Mab는 이들 두 단백질에 공통된 에피토프를 인지한다는 것을 말한다.

돌연변이 uspA1 구조물 준비

클론된 uspA1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 동계 uspA1 돌연변이 구조를 만든다. 올리고뉴클레오티드 프라이머(BamHI-ended P1 P16 및 P16, 표4)를 이용하여, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 염색체 DNA로부터 uspA1 ORF의 절두된 형태를 증폭시키고; 이와 같은 PCR^TM 생성물은 플라스미드 벡터 pBluescript II SK+의 BamHI 부위로 클론시킨다. 이 클론된 단편의 중간 부분 0.6kb BglII 단편을 잘라내어, 카나마이신 저항성을 인코드하는 BamHI-말단을 가지는 카세트를 대체시킨다. 이와 같은 새로운 플라시미드는 대장균(E. coli) DH5α에서 생장시키고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하고, EcoRI으로 선형화시키고, 침전시키고, 물에 용해시킨다. 이와 같이 선형 DNA 분자를 이용하여, 기존에 설명한 기술에 따라 야생형 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E를 전기영동한다(Helminen et al., 1993b). 약 5,000개 카나마이신-저항성 형질변형체를 얻을 수 있고; 무작위로 몇 개를 선택하면 MAb 17C7와 반응성이 있는 것을 알 수 있다. 이들 카나마이신-저항성 클론중 하나를 무작위로 선택하여 추가 검사에 이용하고, 서든 블랏 분석을 통하여 이와 같은 돌연변이가 동계라는 것을 확인한다.

uspA1 돌연변이에 의해 발현되는 생성물 분석

야생형 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주와 이 돌연변이의 전체 세포 용해물을 SDS-PAGE하고, 이들 야생형 균주 및 돌연변이 균주는 모두 UspA로 지정한 매우 분자량이 큰 밴드를 발현하였다. 그러나, 약 120kDa의 단백질이 돌연변이 균주에서는 사라진 것을 알 수 있다(도 2a). 돌연변이 및 야생향 균주는 MAb 17C7와 반응성이 있는 매우 분자량이 큰 항원을 발현한다는 사실은(도 2B) MAb 17C7-반응성 항원을 인코드하는 제 2 유전자가 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E에 있다는 것을 말한다. 또한, 야생형 균주의 EDTA-추출한 외측 막 소포(도 2C, 라인 5, 7)와 돌연변이 균주의 EDTA-추출한 외측 막 소포(도2C, 라인 6, 8)에는 MAb 17C7와 반응성이 있는 약 70-80kDa 단백질을 가진다는 것을 알 수 있다. 이와 같은 70-80kDa 밴드는 MAb 17C7-반응성 에피토프를 인코드하는 제 2 유전자 생성물의 한 개 형태 아마도 단량체 형을 나타나는 것이다.

야생형 균주 및 돌연변이 균주에서의 염색체 DNA를 PvuII로 절단하고, uspA1 유전자에서 유도된 0.6kb BglII-PvuII와 함께 서든 블랏 분석에서 프로브시키면, 야생형은 이 프로브에 결합하는 2.6kb 밴드 및 2.8kb 밴드를 나타내는데(도 3) 대조적으로 돌연변이 균주는 이 프로브에 결합된 2.6kb 및 3.4kb 밴드를 가진다. 3.4kb 밴드가 존재한다는 것은 uspA1 유전자에 결손 부위로 kan 카트릿지가 삽입되었기 때문이다.

실시예 3 ; UspA2 및 uspA2 의 특징

융합 단백질 작제. MAb 17C7에 결합하는 에피토프를 uspA1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 국소화시켜, 융합 단백질을 작제한다. 우선, pGEX4T-2 단백질 융합 시스템(Pharmacia LKB)을 이용하여, 5개 펩티드 스패닝 UspA1 단백질을 가지는 융합 단백질을 만든다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 염색체 DNA에서 원하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위해 PCR^TM에서 이용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표 9에 나타내었다. 이들 각각은 5'단부에 BamHI- 및 XhoI-부위를 가지고 있어, BamHI- 및 XhoI-절단된 벡터로 증폭된 생성물의 인-프레임 클로닝을 할 수 있다. 이들 각 5개 융합 단백질을 발현시키는 재조합 대장균(E. coli) 균주를 콜리니 블랏 방사능면역검사에 이용할 경우에, 한 개 융합 단백질 MF-4만이 MAb 17C7에 결합한다. MF-4 융합 구조에서 uspA1-유도된 뉴클레오티드 서열을 분석하면, MF-4 융합 단백질에서 유도된 79개 아미노산 잔기(MF-4-1) 및 123개 아미노산 서열(MF-4-2)을 포함하는 융합 생성물을 만드는 것이다(표 9). 이들 두 개 융합 단백질은 MAb 17C7에 모두 결합한다(표 9). 도 4에서는 MAb 17C7이 MF-4-1 융합 단백질에 대한 웨스턴 블랏 활성을 설명한 것이다. 이와 같은 두 개 융합 단백질은 공통적으로 23개 잔기 부분 NNINNIYELAQQQDQHSSDIKTL(서열:65)을 가지는데, 이는 이와 같은 23개 잔기("3Q"로 지정)에는 MAb 17C7에 결합되는 에피토프를 포함한다는 것을 말한다.

발생된 단편	프라이머 쌍^a	MAb 17C7와 반응성
MF-3	P5-P8	-
MF-4	P6-P13	+
MF-4.1	P7-P12	+
MF-4.2	P11-P13	+

^a프라이머 서열은 다음과 같다;

P5 GGTGCAGGTCAGATCAGTGAC 서열:66

P6 GCCACCAACCAAGCTGAC 서열:67

P7 AGCGGTCGCCTGCTTGATCAG 서열:68

P8 CTGATCAAGCAGGCGACCGCT 서열:69

P11 CAAGATCTGGCCGCTTACAA 서열:70

P12 TTGTAAGCGGCCAGATCTTG 서열:71

P13 TGCATGAGCCGCAAACCC 서열:72

MAb 17C7 에피토프 설명

이와 같은 23개 잔기 폴리펩티드("3Q" 펩티드)를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 실시예 2에서 설명한 서든 블랏 분석에 이용된 0.6kb BglII-PvuII 단편에 존재한다. 이와 같은 발견으로 MAb 17C7에 결합되는 에피토프는 2.6 및 2.8kb PvuII 단편에 있는 DNA에 의해 인코드되는 것으로 보이고, 이때 2.8kb PvuII 단편은 클론된 uspA1 유전자에서 유도되고, 2.6kb PvuII 단편은 이와 같은 동일한 에피토프를 인코드하는 또 다른 유전자 전부 또는 일부를 나타낸다.

이와 같은 발견을 확인하기 위해 결찰-PCR^TM 시스템을 이용한다. 돌연변이 균주로부터 얻은 염색체 DNA는 PvuII로 완전히 절단하고, 아가로즈 겔 전기영동에 의해 해리한다. 2-3kb 크기의 단편을 아가로즈로부터 절단하여, 잘린 말단(blunt end)은 pBluescript II SK+의 EcoRV 부위에 결찰시킨다. 이와 같은 결찰 반응 혼합물을 침전시키고, 이를 PCR^TM 증폭 반응에 이용한다. 각 PCR^TM 반응에는 3Q 펩티드를 인코드하는 DNA로부터 유도된 T3 또는 T7 프라이머가 포함된다. 이 방법으로 T3 및 P10 프라이머의 1.7kb 생성물과 T7 및 P9 프라이머의 0.9kb 생성물을 얻는다(도 5). 이들 두 개 밴드의 합은 원하는 DNA 단편의 2.6kb와 동일하다.

이들 두 개 PCR^TM 생성물의 뉴클레오티드 서열 분석에서 두 개의 불완전한 ORFs가 나타났는데, 이들은 3Q 펩티드를 인코드하는 부분에 결합되었을 경우에, 분자량이 62,483달톤(계산치)인 단백질(서열:3)을 인코드하는 1,728-bp ORF를 만든다. 이들 단백질의 아미노산 서열은 UspA1 서열과 43% 상동성을 가진다. 더 검사하면, 제 2 단백질에서 아미노산 278-411로 이어지는 부분(UspA2라고 지칭함)은 UspA1의 아미노산 505-638(서열:1) 부분과 거의 동일한 것으로 나타났다. EH한, 이들 두 개 부분은 MAb 17C7가 결합하는 에피토프를 포함하는 23-mer("3Q" 펩티드)를 포함한다. 표 9에서 UspA1에서 발견되지 않은 4개 펩티드(펩티드 7-10)는 UspA2의 유추된 아미노산 서열의 펩티드와 유사하거나 거의 동일한 것으로 밝혀졌다. 또한, 표 9의 처음 6개 펩티드는 UspA1의 유추된 아미노산 서열에 있는 펩티드와 일치하거나 매우 유사한 것으로 이는 또한 UspA2의 유추 아미노산 서열에서 발견되는 펩티드와 짝을 이룬다.

올리고뉴클레오티드 프라이머 P1 및 P2(표 9)를 이용하여, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 염색체 DNA의 2.5-2.6kb 단편을 증폭시킨다. 이 PCR^TM 생성물의 뉴클레오티드 서열 분석을 이용하여, 결찰-PCR^TM 연구에서 결정된 uspA2 ORF의 뉴클레오티드 서열을 확인한다. 이 결과는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 ORFs가 MAb 17C7에 결합하는 동일한 펩티드(가령 "3Q" 펩티드)를 인코드하는 두 개 상이한 ORFs(가령, uspA1 및 uspA2)를 포함한다는 것을 증명하는 것이다. 이와 같은 3Q 펩티드는 UspA1에는 두 개 , UspA2에는 1개 있는 것으로 나타났다(서열:1 및 서열:3).

uspA1에서 이들 3Q 펩티드를 인코드하는 두 개 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열이 거의 동일하나 3개 뉴클레오티드가 상이하다. 이들 뉴클레오티드 차이로 인하여 아미노산 서열이 변화되는 것은 아니다. uspA2에서 3Q 펩티드를 인코드하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열은 UspA1에 있는 처음 3Q 펩티드를 인코드하는 DNA와 동일하다.

도 2C, 라인 7에서 볼 수 있는 것과 같이, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 외측 막 소포에 있는 3개 주요 MAb 17C7-반응성 밴드는 실제 분자량이 200kDa, 120kDa, 70-80kDa 이상이다. 200kDa, 120kDa, 70-80kDa 이상인 분자량을 가지는 몇 가지 MAb 17C7-반응성 밴드가 존재한다는 것이 미국 특허 5,552,146(도 1, 라인H)에 설명하고 있음을 알 수 있다. 따라서, MAb 17C7와 반응성이 있는 한 개 이상의 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 항원이 존재한다는 것은 1991년에 설명된 것이다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E에서 약 120kDa 밴드는 UspA1 항원의 단량체를 나타내는 것이고, 약 70-80kDa 밴드는 UspA2 항원의 단량체를 나타내는 것이다. 하나이상의 종이 응집하여 고분자량 단백질성 물질(200kDa 이상)의 UspA 항원을 형성한다.

새로운 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 게놈 라이브러리는 박테리오파아지 ZAP Express(Stratagene, La Jolla, CA)에서 만든다. 이 균주의 염색체 DNA를 Sau3A1을 이용하여 부분적으로 절단하고, 4-9kb DNA 단편은 제조업자의 지시에 따라 벡터에 결찰시킨다. 이 라이브러리는 대장균(E. coli) MRF'에서 증폭시킨다. 이 라이브러리를 희석하여, 플레이트하고, 생성된 플락은 MAb 17C7의 반응성에 대해 스크린한다. MAb에 결합하는 약 24개 플락을 감지하였다; 단일 블락 분리 방법을 이용하여 해당하는 재조합 박테이로파아지를 정제하고, 이들 박테리오파아지중 한 개로부터 DNA 삽입물을 뉴클레오티드 서열 분석을 하였다. 이와 같은 박테리오파아지에 존재하는 2.6kb DNA 뉴클레오티드 서열은 한 단부에 3Q 펩티드를 인코드하는 불완전한 ORF를 포함하는 것으로 나타났다. 벡터 클로닝 부부이에서 이를 절두부분까지, 이와 같은 불완전한 ORF의 서열은 바로 위에서 설명한 것과 같은 결찰 PCR^TM 연구에서 유도된 uspA2 ORF의 서열과 동일하거나 거의 동일하여, 이는 UspA 항원을 인코드하는 공통 에피토프를 두 유전자가 공유한다는 증가를 제공하는 것이다.

실시예 4: 단백질UspA1 및 UspA2의 정제 및 면역학적 성질

재료 및 방법

박테리아

실시예 1에서는 TTA24 및 O35E 분리체를 설명하였다. 추가 분리체는 University of Rochester and the American Type Culture Collection(ATCC)로부터 수득하였다. 박테리아는 35℃, 5% 이산화탄소에서 배양된 Mueller-Hinton agar(Difco, Detroit, MI)에서 계대한다. 단백질을 정제하기 위해 이용된 박테리아는 ℓ당 10g 카자미노산(Difco, Detroit, MI), 15g 이스트 추출물(BBL, Cockeysville, MD)을 포함하는 멸균 브로스에서 생장한다. 분리체는 40% 글리세롤을 포함하는 Mueller-Hinton 브로스에서 -70℃에 저장한다.

UspA2의 정제

박테리아 세포(모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) O35E ∼400wt)를 1.0% Triton^?? X-100(TX-100)(J.T. Baker Inc., Philipsburg, NJ)(pH 6.0)를 포함하는 pH6.0, 0.03M 인산나트륨(NaPO₄) 2ℓ로 실온에서 60분간 교반하여 2회 세척한다. UspA2 단백질을 포함하는 세포는 13,700 ×g에서 4℃, 30분간 원심분리하여 펠렛화한다. 원심분리후에, 펠렛은 1.0% TX-100을 포함하는 pH 8.0, 0.03M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-HCl(Tris-HCl) 2ℓ에 재현탁시키고, 4℃에서 하룻밤동안 교반하여 UspA2 단백질을 추출한다. 세포는 4℃에서 13,700 ×g로 30분간 원심분리한다. UspA2 단백질을 포함하는 상청액을 수득하고, 0.8㎛ 막(CN.8, Nalge, Rochester, NY)을 통하여 연속하여 마이크로필터를 하여 정화한후, 0.45㎛(셀룰로오즈 아세테이트, 단백질 결합이 낮음, Corning, Corning, NY)을 통하여 필터하여 정화한다.

전체 여과된 거친 추출물 준비물은 0.1% TX-100(THT)를 포함하는 pH 8.0, 0.03 M Tris-HCl 완충액으로 평형을 이룬 50 ×217㎜(∼200㎖) TMAE 컬럼[650(S), 0.025-0.4㎜, EM Separations, Gibbstown, NJ]에 적하한다. 컬럼은 400㎖ 평형 완충액으로 세척하고, 600㎖ 0.25M NaCl/0.03M THT로 세척한다. UspA2는 800㎖ 1.0M NaCl/0.03M THT로 용출시킨다. 분취물은 UspA2에 대해 SDS-PAGE로 스크린하고, 모은다. UspA2을 포함하는 분취물(∼750 ㎖)은 질소 압력하에, YM-100 막과 Amicon stirred cell(Amicon Corp., Beverly, MA)을 이용하여 약 2배 농축시킨다. TMAE 농축물은 175㎖ 두 개로 분리하고, 0.1% TX-100(10mM PT)을 포함하는 pH 7.0, 10mM NaPO₄으로 평형을 이룬 50 ×280㎜(∼550 ㎖) Sephadex G-25(Coarse) 컬럼(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)상에서 각 완충액을 교환하였다. 완충액 교환된 물질은 10mM PT로 평형을 이룬 50 ×217㎜(∼425 ㎖) 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼(Type I, 40 ㎛, Bio-Rad)에 얹는다. 컬럼은 450㎖ 평형 완충액으로 세척하고, 이어서 0.1% TX-100 포함하는 900㎖ pH 7.0, 0.1M NaPO₄ 농도차 용액으로 세척한다. UspA2는 pH 7.0 NaPO₄ 선형농도차(0.1M NaPO₄ 내지 0.2M NaPO₄)(0.1% TX-100 포함)로 용출한다. 0.1% TX-100을 포함하는 pH 7.0, 0.2M NaPO₄ 추가 용액을 컬럼에 얹고, 모아서, UspA2 회수량을 최대로 한다. UspA2에 대해 SDS-PAGE를 이용하여 분취물을 스크린한 다음 모은다. 컬럼은 0.1% TX-100을 포함하는 900㎖ pH 7.0, 0.5M NaPO₄로 세척한다. 그 다음 세척액의 분취물은 SDS-PAGE을 이용하여, UspA1에 대해 스크린한 다음, 4℃에 저장한다. 이 저장물은 UspA1을 정제하는데 이용한다.

UspA1의 정제

UspA2를 정제하는 4가지 별도 과정동안에 수득한 UspA1 부분이 많은 분취물을 모은다. 복합된 UspA1 푸울은 Amicon 교반된 셀, YM-100 막을 이용하여, 질소 압력하에서 한외여과를 이용하여 3배 농축시킨다. UspA1 농축물은 175㎖ 두 개로 분리하고, 10mM PT로 평형을 이룬 50 ×280㎜(∼550 ㎖) Sephadex G-25(Coarse) 컬럼 상에서 각 완충액을 교환하였다. 완충액 교환된 물질은 10mM PT로 평형을 이룬 50 ×217㎜(∼425 ㎖) 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼(Bio-Rad)에 얹는다. 컬럼은 450㎖ 평형 완충액으로 세척하고, 이어서 0.1% TX-100 포함하는 900㎖ pH 7.0, 0.25M NaPO₄ 농도차 용액으로 세척한다. UspA1는 pH 7.0 0.25M NaPO₄ 선형농도차(0.25M NaPO₄ 내지 0.5M NaPO₄)(0.1% TX-100 포함)로 용출한다. UspA1을 포함하는 분취물은 이용하여 정제한 다음 모은다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석

SDS-PAGE는 4 내지 20%(w/v) 농도차 아크릴아미드 겔(Integrated Separation Systems (ISS), Natick, MA)을 이용하여 Laemmli(1970) 방법으로 실행한다. 단백질은 Coomassie Brilliant Blue R250로 겔을 착색하면 볼 수 있고, 겔은 Personal Densitometer SI(Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA)로 스캔한 다음, ISS의 착색된 분자량 표식을 기준으로 이용하여, Fragment Analysis software(version 1.1)로 분자량을 측정한다. 폴리비닐리덴 이플로오르화물(PVDF) 막으로 단백질을 이동시키는 것은 반-건조 일렉트로블로터(electroblotter) 및 일렉트로블랏 완충액(ISS)을 이용한다. 막에는 단백질 특이적인 항혈청 또는 MAb's를 프로브시키고, 제 2 항체로 염소 항-쥐 알칼리 포스파타제 공액물(BioSource International, Camarillo, CA)을 프로브한다. 웨스턴 블랏은 BCIP/NBT Phosphatase Substrate System(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)으로 얻는다.

단백질 측정

BCA assay(Pierce, Rockford, IL)에 의해 소 혈청 알부민을 표준으로 하여 단백질 농도를 측정한다.

UspA2 및 UspA1의 효소적 화학적 절단

(i) CNBr 절단

약 0.3㎎ 정제 단백질을 90%(v/v) 에탄올로 침전시키고, 펠렛은 12M 요소를 포함하는 100㎕ 88%(v/v) 포름산에 재현탁시킨다. 재현탁시킨 후에, 2M CNBr(Sigma, St. Louis, MO)을 포함하는 100㎕ 88%(v/v) 포름산을 첨가하고, 혼합물은 어두운 상태에서 실온, 하룻밤동안 배양한다.

(ii) 트립신 및 키로트립신 절단

약 2㎎ 정제 단백질은 90%(v/v) 에탄올로 침전시키고, 펠렛은 0.1% TX-100을 포함하는 1㎖ 인산-완충된 염(PBS)에 현탁된다. 준비물은 바로 각 트립신 또는 키모트립신(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 25㎍을 포함하는 바이알에 첨가 한다. 반응 혼합물은 48h동안 37℃에서 배양하였다.

(iii) 엔도프로테나제 Lys-C 절단

약 2㎎ 정제 단백질은 90%(v/v) 에탄올로 침전시키고, 펠렛은 0.1% TX-100을 포함하는 1㎖ PBS에 현탁된다. 준비물은 바로 엔도프로테나제 Lys-C(Boehringer Mannheim) 15㎍을 포함하는 바이알에 첨가한다. 반응 혼합물은 48h동안 37℃에서 배양하였다.

(iv) 펩티드 분리

상기 절단 반응 혼합물은 Eppendorf 원심분리로 12,000rpm에서 5분간 원심븐리하고, 상청액은 Vydac Protein C4 HPLC column(The Separations Group, Hesperia, CA)에 바로 적하한다. 이용된 용매는 0.1%(v/v) 수용성 트리플로오르아세트산(TFA)[용매 A] 및 아세토니트릴:H₂O:TFA, 80:20:0.1(v/v/v)[용매 B]를 분당 1.0㎖ 속도로 이용한다. 용매 A로 초기에 세척한 후에, 펩티드는 용매 B 0% 내지 100% 선형 경사를 이용하여 용출한 다음, 220㎚에서 흡수도를 측정한다. 적절한 분취물을 수득하고, Speed-Vac 농축기(Jouan Inc., Winchester, VA)에서 건조시키고, 증류수에 재현탁시킨다. 분취물은 트리스-트리신 완충액 시스템(Schagger and von Jagow, 1987)에서 10 내지 18%(w/v, 아크릴아미드) 경사 겔(ISS)에서 분리한다. 단일 펩티드 밴드를 포함하는 분취물을 N-말단 서열 분석한다. SDS-PAGE에서 다중 펩티드 밴드를 나타내는 분취물은 전술한 것과 같이 PVDF 막에 전기영동에 의해 옮긴다. 막은 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 착색하고, 개별 밴드를 절 라내어, N-말단 서열 분석(Matsudaira, 1987)한다.

서브유닛 크기 결정

매트릭스로 3,5-디메톡시-4-하이드록시-시나민산으로 Lasermat 2000 Mass Analyzer(Finnigan Mat, Hemel Hempstead, UK)에서 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight(MALDI-TOF) 질량 스펙트로메터(Hillenkamp Karas, 1990)로 분자량을 측정한다. 계면활성제를 제거하기 위해, ≥0.1%(v/v) TX-100를 포함하는 샘플에서 차가운 에탄올 침전을 실시한다. 최종 에탄올 농도는 90%(v/v)이다. 침전된 단백질은 물에 재현탁한다.

겔 여과 크로마토그래피에 의한 응집물 크기 결정

약 1㎎의 정제된 단백질을 90%(v/v) 에탄올로 침전시키고, 펠렛은 0.1% TX-100을 포함하는 총 용적 1.0㎖ PBS에 재현탁시킨다. 200㎖ 준비물을 분당 0.5㎖ 속도로 PBS/0.1% TX-100에서 평형을 이룬 Superose-6 HR 10/30 겔 여과 컬럼(10 ×30 ㎜, Pharmacia)에 얹는다. 컬럼은 158,000 크기의 알도라제; 232,000 크기의 카탈라제; 440,000 크기의 페리틴; 669,000 크기의 티로글로블린; 2000 내지 2,000,000 크기의 블루 덱스트란을 포함하는 HMW Calibration Kit(Pharmacia)를 이용하여 눈금을 정한다.

아미노산 서열 분석

온라인 모델 120A PTH Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA)가 갖추어진 Applied Biosystems Model 477A Protein/Peptide Sequencer를 이용하여, N-말단 서열 분석을 한다. Brownlee PTH C-18 컬럼(임자 크기 5㎛, 2.1㎜ i.d. ×22 ㎝ 1.; Applied Biosystems)을 이용하여, 역상 HPLC에 의해 페닐티오하이드라토인(PTH)을 확인하였다

면역화반응

주령이 6-8주인 암컷 BALB/c 생쥐(Taconic Farms, Germantown, NY)에 4주 간격으로 2회 약량 UspA1 또는 UspA2을 피하로 면역주사한다. 백신을 준비하기 위해, 정제된 UspA1 또는 UspA2는 인삼 알루미늄염에 첨가하고, 혼합물은 4℃에서 하룻밤동안 회전시킨다. 3-O-데아실화된 모노포스포릴 리피드 A(MPL)(Ribi ImmunoChem Research, Inc.)를 투여하기 직전에 첨가한다. 각 백신 약량에는 5㎍ 정제된 단백질, 100㎍ 인산 알루미늄염, 200㎍ 용적에 재현탁시킨 50㎍ MPL을 포함한다. 기준 생쥐에는 동일한 어쥬번트를 사용하여 5㎍ CRM₁₉₇를 주사한다. 백신 주사하기 전과, 제 2 면역주사후 2주에 혈청 샘플을 수집한다. 생쥐는 특정-병인균이 없는 곳에서 가두고, 물과 음식을 임의로 제공한다.

단클론 항체

하이브리도마(ATCC HB11093)에서 17C7 MAb가 분비된다. MAbs 13-1, 29-31, 45-2, 6-3는 이전에 설명한 것과 같이(Chen et al., 1995) 준비한다.

모렉셀라 카타르할리스( M. catarrhalis ) 폐 정화 뮤린 모델

이 모델은 이전에 설명한 것과 같이(Chen et al., 1995), 실행한다.

효소 연결된 면역흡수 검사(ELISA) 과정

두 가지 상이한 ELISA 과정을 이용한다. 한 가지는 전체 박테리아 세포에 대한 혈청 반응성을 검사하는 것이고, 다른 하나는 정제된 단백질에 대한 반응성을 설명하는 것이다.

전체 세포 ELISA의 경우에, 박테리아는 Mueller-Hinton 한천에서 하룻밤동안 배양시키고, 플레이트에서 면봉으로 찍어 PBS에 넣는다. 세포의 탁도는 600㎚에서 0.10으로 조정하고, 96웰 Nunc F Immunoplate(Nunc, Roskilde, Denmark)의 웰에 100㎕를 웰에 첨가한다. 세포는 37℃에서 하룻밤동안 건조시키고, mylar 플레이트 밀봉제로 봉하고, 필요할 때까지 4℃에 저장한다. 검사하는 날에, 남아있는 단백질 결합 부위는 지방이 없는 5% 분유 및 0.1% Tween 20(Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer [BLOTTO])를 포함하는 PBS를 첨가하여, 차단하고, 한 시간동안 37℃에서 배양한다. 차단 용액은 제거하고, 100㎕ 혈청을 blotto 웰에서 연속적으로 희석한다. 혈청은 37℃에서 1 시간동안 배양한다. 플레이트 웰에는 0.1% Tween 20을 포함하는 300㎖ PBS로 30초간 적시고, Skatron 플레이트 세척기로 5초간 3회 세척한 다음 blotto에서 1:1000으로 희석된 알칼리 포스포타제(BioSource)에 공액된 염소 항-쥐 IgG로 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 세척 후에, 실온에서 플레이트는 디에탄올아민 완충액에 용해된 1㎎/㎖ p-니트로페닐 포스페이트를 웰당 100㎕으로 발생시킨다. 각 웰에 50㎕ 3N NaOH를 첨가하여 발생을 중단시킨다. 각 웰에서 흡수도는 405㎚에서 일고, 선형 회귀를 이용하여 역가를 계산한다. 역가는 희석의 역으로 나타내어, 1.0 단위 흡수치까지 추정한다.

정제된 단백질에 대해 ELISA의 경우에, 단백질은 0.02% 아지드나트륨(Sigma Chemical Co.)을 포함하는 50mM 탄산나트륨 완충액(pH 9.8)에 5㎍/㎖ 농도로 희석 한다. 96웰 E.I.A./R.I.A 배지 결합 ELISA 플레이트(Costar Corp., Cambridge, MA)의 각 웰에 100㎕를 첨가하고, 4℃에서 16시간동안 배양하였다. 플레이트는 세척하고, 천제 세포 ELISA 과정에서 설명한 것과 동일하게 처리한다.

컴플리먼트-의존성 살균 검사

이 검사를 위해서는, 0.1mM CaCl₂:, MgCl₂, 0.1% 젤라틴(PCMG)이 보충된 PBS에 약 1200cfu를 포함하는 박테리아 현탁액 20㎕를 PCMG에 희석한 20㎕ 혈청과 혼합하고, 4℃에서 30분간 배양하였다. 상기에서 설명한 것과 같이 준비된 컴플리먼트(Chen et al., 1996)를 약 20% 농도까지 첨가하고, 혼합하고, 35℃에서 30분간 배양하였다. 200㎕ 냉각(4℃) PCMG로 희석하여 검사를 중단한다. 이 현탁액 50㎕는 Mueller-Hinton 플레이트에 도말한다. 활성 컴플리먼트 대신에 열에 의해 비활성화된 컴플리먼트를 대체한 샘플과 비교하여 샘플에서 cfu의 감소 비율을 %로 나타내어 상대적인 치사율을 계산한다.

HEp-2 세포에 박테리아 흡착 방해

HEp-2 세포에 박테리아 흡착에 대해 특정 항체의 효과를 검사하였다. RPMI-10 300㎕에 총 5 ×10⁴ HEp-2 세포를 멸균된 8개 웰 8-well Lab-Tek 챔버 슬라이드(Nunc, Inc., Naperville, Ill)에 첨가하고, 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤동안 배양하여, 슬라이드상에 단층 세포를 얻는다. 슬라이드는 PBS로 세척하고, 300㎕ 박테리아 현탁액(A₅₅₀=0.5) 또는 1시간동안 37℃에서 항혈청(1:100)으로 배양한 박테리아 현탁액으로 배양한다. 그 다음 슬라이드는 PBS로 세척하고, Difco quick stain으로 착색한다. 슬라이드를 보고, 카메라가 장착된 광 현미경으로 사진을 찍는다(Nikon Microphot-SA, Nikon, Tokyo, Japan).

피브로넥틴 및 비트로넥틴과 단백질의 상호작용

도크 블랏에 의해 피브로넥틴과 정제된 UspA1 및 UspA2와의 상호작용을 검사하였다. 사람 혈장 피브로넥틴(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 니트로셀룰로오즈 막에 얹고, 막은 실온에서 1시간동안 blotto로 차단한다. 블랏은 PBS로 세척하고, 정제된 UspA1 또는 UspA2(2㎍/㎖ in blotto)로 4℃에서 하룻밤동안 배양한다. PBS로 3회 세척 후에, 막은 실온에서 2시간동안 blotto에서 희석한 MAb 17C7와 함께 배양하고 그 다음 알칼리 포스포타제(BIO-RAD Lab. Hercules, Calif.) (1:2,000 PBS(5% 분유), 2시간, 실온)에 공액된 염소 항-생쥐 이뮤노글로블린과 배양한다. 막은 니트로블루 및 5-브로모-클로로-3-인돌일 포스페이트/0.1M 트리스-HCl(pH 9.8)을 포함하는 기질 용액으로 최종 현상한다.

비트로넥틴과의 상호작용도 유사한 과정으로 검사한다. 정제된 UspA1 및 UspA2를 니트로셀룰로오즈 막에 스팟하고, 막은 blotto로 차단한다. 그 다음 사람 혈장 비트로넥틴(GIBCO BRL, Grand Island, N.Y., 1㎍/㎖ in blotto), 토끼 항-사람 비트로넥틴 혈청(GIBCO BRL), 염소 항-토끼 IgG-알칼리 포스포타제 공액체 및 기질에 막을 연속하여 배양한다.

정제된 단백질에 의한 HEp-2 세포와의 상호작용

96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰(Costar Corp., Cambridge, Mass.)에 10% 태아 송아지 혈청을 포함하는 5 ×10⁴ HEp-2 세포/0.2㎖ RPMI를 접종하고, 5% CO₂를 포함하는 37℃ 배양기에서 하룻밤동안 배양한다. blotto에 있는 정제된 UspA1 또는 UspA2(1 내지 1,000ng)을 첨가하고, 2시간동안 37℃에서 배양한다. 플레이트는 PBS로 세척하고, 생쥐 항혈청과 UspA1 또는 UspA2(1:1000 PBS로 희석/5% 분유를 포함하는 PBS에) 1:1 혼합물에 배양하고, 양고추냉이 과산화효소에 공액된 토끼 항-생쥐 IgG(1:5,000 PBS로 희석/PBS에는 5% 분유 포함)(Brookwood Biomedical, Birmingham, AL)로 1시간동안 실온에서 배양한다. 최종적으로, 플레이트를 세척하고, 0.03% 과산화수소(KPL, Gaithersburg, MD)를 포함하는 pH 4.0 구연산 완충액 ㎖당 0.3㎎의 2,2'-아지노-비스-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산)을 포함하는 기질 용액으로 현상한다. 전체 박테리아 균주 O35E를 양성 기준으로 포함된다. 테스트된 박테리아의 최대 농도는 A₅₅₀=1.0 이다. 도 7에 나타낸 박테리아 데이터의 영구 횡자표는 박테리아 현탁액의 3배 희석에 대한 값을 플롯한 것이다.

결과

UspA1 및 UspA2 정제

발명자들은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 세포 펠렛으로부터 UspA2를 대규모 다량으로 추출 및 정제하는 방법을 개발하였다. 이 방법은 세 가지 중요한 단계로 구성된다. 첫째, 박테리아로부터 pH 8.0, 0.03 M THT을 이용하여 UspA2 단백질을 추출한다. 둘째, 세포 추출물은 TMAE 컬럼에 얹고, UspA2 단백질은 NaCl로 용출한다. 마지막으로, TMAE 크로마토그래피로부터 풍부한 분취물은 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼에 얹고, UspA2는 선형 NaPO₄ 경사를 이용하여 용출한다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) O35E 균주 세포 -400G(습식중량)으로부터 일반적으로 약 정제된 UspA2 250㎎을 얻을 수 있다. Coomassie blue 착색에 의해 SDS-PAGE 겔에서 한 개 밴드의 UspA2를 볼 수 있다. 이는 ∼240,000정도의 분자량에 상응하고, 스캐닝 밀도계에 따르면 단백질의 95%이상을 포함한다(도. 6A). 약 125,000에서 17C7 MAb와 반응하는 제 2 밴드가 UspA2 준비물에서 발견되나(단, 웨스턴 블랏에 의해서 발견되고, Coomassie blue 착색에 의해서는 나타나지 않음(도 6C). 이와 같은 높은 수득율을 얻기 위해 세포를 용해할 필요는 없고 이는 박테리아의 표면에 다량의 단백질이 존재한다는 것을 의미한다.

UspA1 단백질을 정제하는 방법도 또한 개발되었다. 이 단백질은 초기 추출 및 TMAE 크로마토그래피 단계를 통하여 UspA2와 함께 정제된다. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피후에는 UspA1은 컬럼에 결합된 채로 남아있고, 이는 더 높은 동도의 500mM NaPO₄로 용출해야한다. 이 단계에서 수득된 정제 안된 UspA1 준비물을 다시 하이드록시아파타이트 컬럼에 얹고, 선형 농도 경가를 가지는 인산 나트륨염을 이용하여 다시 용출해야한다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) O35E 균주 세포 -1.6㎏(습중량)으로부터 총 80㎎ 정제된 UspA1 단백질을 얻는다. 이 방법을 이용하여 정제된 UspA1는 샘플 준비 방법에 따라 SDS-PAGE상에서 세 가지 다른 크기로 이동된다. 가열안한 샘플의 경우에는 ∼280,000에서 한 개 밴드로 나타나지만, 100℃에서 3분간 가열을 한 경우에, 분자량이 ∼350,000로 이동된다(도 6B). 100℃에서 장시간 가열을 한 경우에, 350,000밴드가 100,000밴드로 이동된다(도 6B). 100℃에서 7분간 가열 한 후에, 100,000상의 밴드에는 단백질의 95%이상이 포함된 것을 알 수 있다(Coomassie blue 착색된 겔을 스캔 말도측정계로 확인한 결과). 대조적으로, SDS-PAGE에 의해 검사한 결과, UspA2는 가열 시간에 관계없이 240,000으로 이동된다. 상이한 이동 경향을 나타내는 것은 두 개 별개 다른 단백질이 포함되었다는 것을 말한다.

분자량 측정

70%(v/v) 수용성 아세토니트릴 및 0.1% TFA 존재 하에, 3,5-디메톡시-4-하이드록시-시나민산 매트릭스를 이용하여, UspA2의 분자량을 측정하는 MALDI-TOF 질량 스펙르로메터 분석을 하면, 대부분 종이 평균 분자량이 59,518Da으로 나타났다. 예상되는 [M+H]⁺ 와 [M+2H]²⁺ 분자 이온에 추가하여, [2M+H]⁺ 및 [3M+H] ⁺ 이온도 관찰하였다. 후자 두 가지 이온은 이량체와 삼량체 종과 일치한다. 유사한 조건을 이용하면, 발명자는 UspA1의 질량을 결정할 수 없다.

용액에서 정제된 단백질의 분자크기를 결정하기 위해, UspA1 및 UspA2를 각각 Superose-6 HR 10/30 겔 여과 컬럼(분리 범위 5,000-5,000,000)에 얹는다. 정제된 UspA1는 고유 분자량이 1,150,000이고, UspA2는 고유 분자량이 830,000이다. 그러나 이 크기는 TX-100가 존재하는 경우에 영향을 받는다.

UspA1 및 UspA2 펩티드 내부의 N-말단 서열 분석

UspA 및 UspA1의 N-말단을 결정하려는 모든 시도는 실패하였다. 서열이 정 해진 것은 없다. 이는 두 가지를 말하는 것이다. 첫째, 두 단백질의 N-말단이 차단되었거나 둘째, 단백질 준비물에는 N-말단이 차단되지 않은 단백질 오염물질을 포함한다는 것이다.

따라서, 이들 각 유전자 서열에서 유추된 것에 상응하는 정제된 UspA1 및 UspA2의 1차 서열을 확인하기 위해서는 내부 펩티드 단편을 만들고, 이를 N-말단 서열 분석을 해야한다. 표 10 및 11에서는 각 UspA2 및 UspA1 단백질을 절단하여 생긴 단편에서 얻은 N- 말단을 보여주고 있다. 각 유전자 서열에서 유추된 1차 아미노산 서열과 일치하는 서열을 각 단편에 나타내었다. UspA2 단편 #3 및 #4는 UspA 1 유전자에서 유추한 아미노산 서열의 각 잔기 505-515 및 605-614와 유사한 서열을 나타내었다. 표 12에서는 UspA1 단편 #3이 UspA2 1차 서열의 잔기 #278-294에 유사한 서열을 가지는 것을 볼 수 있다. 이들 서열은 93% 서열 상동성을 공유하는 UspA2 및 UspA1내에 도메인에 상응한다.

그러나, 나머지 서열은 각 단백질에 독특한 것이다.

UspA2 Fragment Sequence^a	Match^b	Cleavage
1) LLAEQQLNG SEQ ID NO:73	92-100	Trypsin
2) ALESNVEEGL SEQ ID NO:74	216-225245-254274-283	Lys-C
3) ALESNVEEGLLDLS SEQ ID NO:75	274-288*505-515	Trypsin
4) AKASAANTDR SEQ ID NO:76	378-387*605-614	Chymotrypsin
5) AATAADAITKNGN SEQ ID NO:77	439-450	Chymotrypsin
6) SITDLGTKVDGFDGR SEQ ID NO:78	458-472	Lys-C
7) VDALXTKVNALDXKVN SEQ ID NO:79	473-488	Trypsin
8) AAQAALSGLFVPYSVGKFNATAALGGYGSK SEQ ID NO:80	506-535	CNBr

^a밑줄은 아미노산 서열에서 유도된 뉴클레오티드와 잘못 짝을 이루는 것을 나타낸다. 확인되지 않은 불확실한 잔기는 X로 표시하였다.

^b*는 UspA1과 짝을 이루는 것을 나타낸다. 별표가 없는 것은 UspA2의 뉴클레오티드 유도된 아미노산 서열과 짝을 이루는 것을 나타낸다.

UspA1 Fragment Sequence^a	Match^b	Cleavage
1) LENNVEEPXLNLS	456-468	Lys-C
2) DQKADI	473-478	Trypsin
3) NNVEEGLLDLSGRLIDQK	504-524*278-294	Lys-C
4) VAEGFEIF	690-697	Trypsin
5) AGIATNKQELILQNDRLNRI	701-720	Lys-C

^a표 1에서 본 것과 같이, X는 확인 안된 아미노산 잔기를 나타낸다.

^b*는 UspA2과 짝을 이루는 것을 나타낸다. 별표가 없는 것은 UspA1의 뉴클레오티드 유도된 아미노산 서열과 짝을 이루는 것을 나타낸다.

UspA1 및 UspA2와 MAb의 반응성

정제된 UspA1와 UspA2의 웨스턴 블랏 분석으로 두 가지 단백질 모두 Helminen et al.(1994)에서 설명하는 것과 같이, MAb 17C7와 강하게 반응하는 것으로 나타났다(도 7). 다른 MAbs와 단백질간의 반응성에 대해서도 조사하였다. 표 12에서 볼 수 있는 것과 같이, ELISA 또는 웨스턴 검사를 하건 간에, MAbs 13-1, 29-31, 45-2는 UspA2하고만 반응하고, MAbs 7D7, 29C6, 11A6, 12D5는 UspA1하고만 반응하고, 17C7은 UspA1 및 UspA2하고 반응한다. 표 13에 나타낸 모든 MAbs는 ELISA에 의해 검사하였을 경우에 전체 박테리아에 결합하는 것으로 나타났다. 이 결과는 UspA2가 박테리아의 표면에 있다는 것을 말하는 것이다.

mAb	Isotype	Reactivity
mAb	Isotype	Whole bacterium^a	Purified UspA1^b	Purified UspA2^b
13-1	IgG1κ	+	-	+
29-31	IgG1λ	+	-	+
45-2	IgG2a	+	-	+
17C7	IgG2a	+	+	+
6-3	IgM	+	+	+
7D7	IgG2b	+	+	-
29C6	IgG1	+	+	-
11A6	IgA	+	+	-
12D5	IgG1	+	+	-

^a는 전제 세포를 ELISA에 의해 검사한 것이고

^b는 ELISA 및 웨스턴 블랏에 의해 검사한 것이다.

Antiserum to	Geometric mean ELISA titer^b to
Antiserum to	UspA1	UspA2
UspA1^a	740,642^c	10,748^c
UspA2^a	19,120^d	37,615^d

^a텍스트에서 설명하는 것과 같이 혈청을 준비한다.

^bELISA 역가는 열 마리 생쥐에서 모은 혈청의 총 IgG 및 IgM에 대한 것이다.

^c항-UspA1의 역가와 두 가지 정제된 단백질에서 차이는 Wilcoxon 랭크 테스트(p=0.0002)에 의한 통계상의 차이이다.

^d항-UspA2의 역가와 두 가지 정제된 단백질에서 차이는 Wilcoxon 랭크 테스트(p=0.01)에 의한 통계상의 차이이다.

면역원성 및 항체 교차-반응성

생쥐에서 정제된 UspA1 및 UspA2 단백질에 대한 항혈청을 만든다. 이들 혈청에서 항원 특이적인 항체(IgG 및 IgM)의 역가 뿐만 아니라 교차 반응성 항체의 역가는 각 정제된 단백질을 이용하여 ELISA 검사로 결정한다. 이와 같은 두 가지 단백질은 이형단백질에 대한 것보다 이들 자체에 대해 더 큰 단백질 역가를 유도한다. 따라서, 두 가지 항체(표 12) 및 다클론 항체에 대한 반응성은 단백질이 교유 및 비공유 B-세포 에피토프를 가진다는 것을 나타낸다.

전체 박테리아 세포에 대한 항체 반응성 및 살균 활성

UspA1 및 UspA2에 대한 항혈청은 상동성 O35E 균주와 몇 가지 이형 분리체(표 14)에 대한 전체 세포 ELISA을 이용하여 검사하였다. 이형 분리체에 대한 혈청의 반응성으로 이들이 UspA1 및 UspA2에 의해 유도된 항체에 결합한다는 것을 나타 낸다.

Isolate	Whole cell ELISA^a		Bactericidal titer^b
Isolate	anti-UspA1^a	anti-UspA2^a	anti-UspA1	anti-UspA2
O35E	195,261	133,492	400	800
430-345	12,693	18,217	400	400
1230-359	7,873	13,772	400	400
TTA24	14,341	7,770	800	800

^a역가는 열마리 생쥐의 혈청에서 결정한다. 처음 면역주사하기전에 얻은 혈청의 역가는 모든 분리체에서 50이하이다.

^b살균 역가는 박테리아의 50%이상을 죽이는 최대 혈청 농도의 역으로 나타낸다. CRM₁₉₇으로 같이 면역주사를 맞은 쥐의 혈청의 역가는 100미만이 된다.

UspA1 및 UspA2에 대한 살균 활성은 O35E 및 다른 분리체에 대해 결정한다(표 14). 두 가지 혈청 모두 O35E 및 질병 병리물에 대해 살균 역가 범위가 400-800정도이다. 항-CRM₁₉₇ 혈청, 음성 기준, 면역화하기전의 혈청은 모든 균주에 대해 <100의 역가를 가진다. 이 결과는 이전에 관찰된 두 가지 단백질에 의해 공유되는 에피토프가 분리체 사이에서 매우 보존성이 크고, 이들 분리체에 대한 항체는 살균성이 있다는 것과 일치한다.

폐 공격

면역화된 생쥐에 상동성 O35E 균주 또는 이형 TTA24 균주를 이용하여 폐를 공격한다. CRM₁₉₇로 면역주사한 기준 쥐와 비교하여, UspA1 또는 UspA2로 생쥐에 면역주사를 하건간에, 이들 균주의 정화능력이 개선되었다(표 15). UspA1 및 UspA2로 면역주사된 쥐 집단간에 통계학적 유의성있는 차이(p>0.05)는 없는 것으로 보인다.

Study	Immunogen	Challenge strain	% clearance^a	p^a
1	UspA1UspA2CRM₁₉₇	O35E	49.031.80	0.0130.05-
2	UspA1UspA2CRM₁₉₇	TTA24	54.666.60	0.020.0003-

^a침투 방법은 문헌에 설명되어 있다. CRM₁₉₇로 면역주사한 기준 쥐와 비교하여 면역화된 쥐에서 박테리아가 제거되는 비율을 수로 나타낸 것이다.

HEp-2 세포와 정제된 단백질의 상호작용

ELISA를 이용하여 96-웰 플레이트에서 HEp-2 세포 단층과 정제된 UspA1 및 UspA2 단백질이 상호 작용하는 능력에 대해 시험하였다. UspA1 및 UspA2와 생쥐 할혈청 1:1 혼합물에서 HEp-2 세포에 결합하는 단백질이 감지되었다. 10ng 농도이 상에서 HEp-2에 정제된 UspA1이 결합되었다. 100ng이상의 농도에서 UspA2의 약한 결합이 감지된다(도 7). HEp-2 세포에 대해 O35E 박테리아를 부착한 것을 양성 기준으로 이용한다. 그 결과, 항-UspA1 항체가 HEp2 세포에 박테리아가 부착되는 것을 방해하는 것과 더불어, UspA1는 박테라아 흡착에 중요한 역할을 하여, UspA1 역시 박테리아 표면에 있다는 것을 말해준다.

피브로넥틴 및 비트로넥틴과 정제된 단백질의 상호작용

도트 블랏 검사를 통하여 정제된 단백질이 피브로넥틴 및 비트로넥틴과의 상호 작용하는 능력에 대해 테스트하였다. 사람 혈장 피브로넥틴은 정제된 UspA1이 결합된(UspA2는 결합안됨) 니트로셀룰로오즈 막에 고정시키고(도 8), 니트로셀룰로오즈 막에 결합된 UspA2는 비트로넥틴에 결합할 수 있다(도 8). UspA1에 의해 결합된 비트로넥틴을 감지하였으나, 그 반응성이 약하다. 콜라겐(타입 IV), 돼지 뮤신(타입 III), 페투인, 헤파린에 대해 정제된 UspA1 및 UspA2와의 상호작용에 대해 테스트하였으나, 감지 가능한 결합이 나타나지는 않는다.

토론

기존의 UspA 정제 과정으로 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏에 의해 분자량이 큰 단백질 밴드를 포함하는 준비물을 생산한다. 각 밴드는 "UspA 특이적인" MAb 17C7와 반응을 하기 때문에, 이들은 다양한 형태의 UspA 단백질이라고 보인다(Chen et al., 1996). 그러나, 발명자들은 17C7 MAb가 인지하는 에피토프를 공유하는 두가지 별개 단백질 UspA1 및 UspA2이 있다는 것을 발견하였다. 이들 두 단백질은 상이한 유전자에 의해 인코드된다. 이 연구에서 볼 수 있는 것은 UspA1 및 UspA2는 서로 분리되어 있다는 것이다. 분리된 단백질은 상이한 SDS-PAGE 이동성, 단클론 항체에 대한 상이한 반응성, 상이한 내부 펩티드 서열을 가진다. 그러나, MAb 17C7 에피토프를 포함하는 이들 펩티드 서열의 일부를 공유한다는 것은 일치한다. 서로 단백질을 분리하면 발명자들은 어떻게 이들 단백질이 상이한가 그리고, 이들의 생화학적, 기능적, 면역학적 특징의 차이를 설명할 수 있을 것이다.

용액에서, 정제된 단백질은 강력한 비-공유 힘에 의해 서로 유지되는 서브유닛으로 된 동종 중합체인 것으로 보인다. 이는 UspA2가 임의 시스테인이 부족하고, 환원제로 단백질을 처리하는 경우에, SDS-PAGE상에서도 이들의 이동성이 변경되지 않기 때문에 알 수 있는 사실이다. 이들 두 가지 유전자 서열에는 코일-코일 상호작용을 중개하는 루이신 지퍼 모티프를 보유한다(O'Shea et al., 1991). 이 경우에도, 두 가지 단백질의 비공유 결합은 SDS-PAGE를 위해 샘플을 준비하는 통상의 조건에 의해 해리되는 것에 저항성을 가질 뿐만 아니라, 요소(Klingman and Murphy, 1994) 및 구아니딘 HCl등과 같은 혼란 물질이 다량 사용되는 것에 대해 저항을 가지는 것에 놀랍다. 이들 두 단백질 중에, UspA2는 다소 응집정도가 약하다는 것을 알 수 있는데, 이는 이들 서브유닛의 크기가 59,500Da이라는 사실이다. 그러나, UspA1는 시도한 모든 방법에서 해리에 대해 저항하여, 이 크기는 질량 분석으로는 측정할 수 없었다. SDS-PAGE에서, 주요 UspA2는 240,000크기로 이동하고, 더 적은 부분은 약 125,000로 이동되고, 이는 웨스턴 블랏 분석으로만 감지된다. 그러나, UspA1의 이동성은 샘플을 얼마동안 가열하였느냐에 따라 달라진다. 최소 형태는 약 100,000이다. 이는 uspA1 돌연변이에서 손실한 유전자 생성물의 크기와 일치하나, 88,000Da 유전자 서열에서 예상된 크기는 아니다. 용액에서, 두 가지 단백질은 SDS-PAGE에서 볼 수 있는 것보다 더 큰 응집 형태를 만든다. 겔 여과 크로마토그래피에 의해 측정하였을 경우에 이들 크기는 UspA1 및 UspA2의 경우에 각 1,150,000 및 830,000이 된다. 단백질이 in vivo에서 이와 같은 방식으로 거동한다면, UspA1 및 UspA2는 박테리아의 표면에서 큰 분자 복합체를 형성한다.

UspA1 및 UspA2 유도된 펩티드의 N-말단 아미노산 서열 분석 결과를 보면(표 10, 11) 각 유전자 서열에서 유도된 단백질 서열과 일치한다. 이는 각 uspA1 및 uspA2 유전자 생성물이라는 것을 알 수 있다. 또한, UspA1 및 UspA2의 실험 및 이론 아미노산 서열이 일치한다. 그러나, 질량 스펙트럼에 의한 크기 59,518와 UspA2의 유전자 서열에서 유추한 크기 62,483로 차이가 있다. 이와 같은 차이는 이 단백질이 해독후 프로세싱 또는 단백질 분해성 절단을 한다는 것을 알 수 있다.

이들 단백질이 박테리아 표면에 노출되어있다는 것을 제시한다. 단백질의 적어도 한 부분이 노출된 것은 MAb 17C7 및 다클론성 혈청이 전체 세포와 반응한다는 것으로 알 수 있다. 전체 세포 ELISA에 있는 박테리아 세포와 UspA2 특이적인 단클론 항체 13-1, 29-31, 45-2의 반응성은 UspA2은 표면 단백질(표 12)이라는 증거를 제시한다. 전체 세포 ELISA에 있는 박테리아 세포와 UspA1 특이적인 단클론 항체 MAbs 7D7, 29C6, 11A6 12D5의 반응성은 UspA1은 표면 단백질(표 12)이라는 증거를 제시한다. 또한 UspA1의 표면 노출에 대한 정보는 HEp-2 세포에 박테리아 부착시에 항혈청의 저해 효과로 나타낸다. UspA2에 대한 혈청은 이와 같은 활성이 부족하다. 따라서, UspA1 및 UspA2은 박테리아에 노출된 표면에 있는 것으로 보인 다.

단백질의 표면 노출은 두 가지 단백질 기능에서 중요한 것으로 간주된다. UspA1의 한 가지 기능은 숙주조직에 흡착을 중개하는 것이다. 이에 대한 증거는 UspA1 항체가 HEp-2 세포에 박테리아가 결합하는 것을 방해하고, 정제된 단백질 자체가 세포에 결합한다는 것이다. HEp-2에 대한 결합 관련성은 이것이 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 콜로니 형성하는 공통 부위인 후두에서 유도한 상피라는 것이다(Schalen et al., 1992). 이는 발명자가 UspA1을 발현하지 않는 돌연변이는 상피세포에 결합하지 못한다는 것을 발견하여 확인하였다. 발명자는 또한 UspA1가 피브로넥틴에 결합한다는 것을 보여주었다. 피브로넥틴은 다른 병인균에 대한 숙주 수용체라고 보고된 바 있다(Ljungh and Wadstrom, 1995; Westerlund and Korhonen, 1993). 그러나, 유전자 서열을 검사하여, 그램 양성 유기체에서 보고된 피브로넥틴 결합 모티프와 유사한 것을 발견하지는 못하였다(Westerlund and Korhonen, 1993). 따라서, UspA1는 세포 중개된 피브로넥틴를 통하여 숙주 흡착에 중요한 역할을 한다는 것이 분명하다.

UspA2의 기능이 확실하지는 않다. 이에 대한 항체는 HEp-2 또는 Chang 세포주에 흡착하는 것을 차단하지 못하고, 정제된 단백질이 이들 세포에 결합하지도 못한다. 여전히, UspA2도 비트로넥틴에 강하게 결합한다. 비트로넥틴의 병인균은 숙주 세포 흡착에 연결된다(Gomez-Duarte et al., 1997; Limper et al., 1993); 그러나, van Dijk 및 그 동료는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 의해 비트로넥틴 결합을 이용하여 숙주 방어 기작을 잃게 한다(Verdium et al., 1994). 컴 플리먼트 인자 S로 공지된 비트로넥틴 가용성형이 막 공격 복합체 형성을 조절한다(Su, 1996). 이로써, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 비트로넥틴이 결합함으로써 막 공격 복합체가 형성되는 것을 방해하여, 혈청의 컴플리먼트 의존성 치사 활성에 박테리아 저항성을 제공한다. 이는 두 가지 형태의 사람 분리체로 설명되는데; 하나는 비트로넥틴에 결합하여 혈청의 용해 활성에 저항하는 것이고; 다른 하나는 비트로넥틴에 결합하지 않아 혈청 감응성이 되는 것이다(Hol et al., 1993). 그러나, 모든 다른 세포외 매트릭스 단백질과 유사하게, 비트로넥틴은 많은 형을 가지고, 숙주에서 여러 가지 기능을 한다(Preissner, 1991; Seiffert, 1997). 따라서, 세포외 매트릭스 단백질 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 UspA1 및 UspA2의 상호작용으로 박테리아가 숙주 방어기작을 상실하게 하거나 박테리아 흡착을 위한 수용체로 작용하게 한다.

비록 두 개 단백질이 에피토프 및 서열을 공유하지만, 다른 생화학적 활성을 가지고 다른 생물학적 기능을 한다. 이들 단백질에 대한 면역 반응으로 이의 기능을 간섭받는 경우에, 이는 백신 물질로 간주한다. 생쥐에서 면역학적 연구 결과를 보면 이들 두 단백질은 훌륭한 백신 추천물질이 된다. UspA1 또는 UspA2로 면역주사한 쥐에서는 상동 및 이형 생물학적 분리체에 대해 매우 높은 역가를 발생시킨다. 또한, 이들 생쥐의 혈청은 테스트한 모든 분리체에 대해 컴플리먼트 의존성 살균 활성을 가진다. 또한, 면역화된 생쥐는 동종 분리체 및 이종 분리체에 대한 폐 정화가 강화됨을 보여준다. 중요한 것은 단백질에 의해 유도되는 항체는 부분적으로 교차 반응성이 있다는 것이다. 이는 이들 모두 17C7 MAb와 반응하고, 아미 노산 서열을 공유하기 때문인 것으로 보인다.

실시예 5 : UspA1 및 UspA2단백질에 대한 어린이 및 성인 사람 항체의 수준 및 살균 능력

사람이 존재하는 이들 항체의 생물학적 활성 및 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 UspA1 및 UspA2에 대한 요구 항체를 원래 소유하는지를 결정하기 위해, 다양한 연령대의 건강한 사람의 혈청을 ELISA 및 살균 검사를 통하여 조사하였다. 건강한 사람은 이들 혈청에 UspA1 및 UspA2에 대한 필요 항체를 자연적으로 가지고, 이들 항체 수준 및 살균 능력은 나이에 관계한다는 것이다. 이들 결과에서 보면, 자연상태에서 요구되는 UspA1 및 UspA2는 생물학적 기능을 가지는 것으로, 이는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 질병을 예방하는 백신 추천물질로 이들을 이용할 수 있다는 것이다.

재료 및 방법

세균

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 및 TTA24는 실시예 1에서 설명하였다. ATCC 균주(ATCC 25238) 및 세 가지 다른 임상 분리체는 발명자가 모은 것을 이용하였다.

사람 혈청

일상적인 어린이 면역주사를 맞은 2, 4, 6, 7, 15, 18 개월의 열명 어린이에서 58개 혈청 샘플을 얻는다. 26명 성인 및 15명 추가 어린이(18-36월령)로부터 혈청을 또한 검사하였다. 모든 혈청은 임상적으로 건강한 개체로부터 얻는다. 개 체에서 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 콜로니화에 대한 정보 및 감염에 대한 정보는 수집하지 않는다. 혈청은 -70℃에 저장한다.

UspA1 및 UspA2 정제

여기에서 설명한 실시예 4의 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E로부터 정제된 UspA1 및 UspA2를 얻는다. 각 단백질 준비물에는 Coomassie Brilliant blue 착색된 SDS-PAGE의 밀도 착색에 기초하여 특정 단백질이 95% 함유되었음을 알 수 있다. 단클론 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 이용하여, 각 정제된 단백질에는 다른 감지 가능한 오염물질이 포함되어 있지 않다.

사람 혈장으로부터 UspA1 및 UspA2 특이 항체 정제

두 사람의 건강한 성인의 혈장은 미국 적십자[American Red Cross (Rochester, N.Y.)]에서 얻었다. 암모니움 설페이트를 50% 포화되도록 첨가하여 항체를 침전시킨다. 침전물은 원심분리로 얻고, PBS에 대해 투석한다. 실온에서 1시간동안, 니트로셀룰로오즈 막(2 ×3인치)에 UspA1 또는 UspA2(0.1%(vol/vol) Triton X-100를 포함하는 PBS에서 0.5㎎/㎖ 농도로)를 배양하고, PBS로 2회 세척하고, 막에 있는 잔류 결합 부위는 2시간동안 실온에서 PBS에 분유 5%(wt/vol)를 이용하여 차단한다. 그 다음 막을 연속하여 PBS 및 100mM 글리신(pH 2.5)으로 세척하고, 마지막으로 PBS로 세척하여 투석된 항체 준비물로 배양한다. 4℃에서 4시간 배양 후에, 막은 다시 PBS로 세척하고, 그 다음 1M 염화나트륨을 포함하는 10mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 세척하여, 비-특정 단백질을 제거한다. 결합된 항체는 교반하면서 2분간 5㎖ 100mM 글리신(pH 2.5)으로 배양하여 용출한다. 1㎖ Tris- HCl(1M, pH 8.0)을 바로 용출액에 첨가하여, pH를 중화시킨다. 용출된 항체는 PBS에 대해 투석하고 -20℃에서 저장한다.

효소-연결된 면역흡착 검사(ELISA)

O35E 및 다른 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 항체 역가는 바이오틴-라벨된 토끼 항-사람 IgG 또는 IgA 항체를 이용하여 전체 세포-ELISA로 결정한다(Brookwood Biomedical, Birmingham. Alabama) (Chen et al., 1996). UspA1 및 UspA2에 대한 항체 역가는 유사한 방법으로 결정하나, 단 플레이트는 실온에서 하룻밤동안 웰당 100㎍ PBS에서 정제된 단백질 1㎍으로 피복한다. 알칼리 포스포타제에 공액된 양 항-사람 IgG 서브클래스 항체를 이용하여 UspA1 또는 UspA2에 대한 IgG 서브클래스 항체를 결정한다(The Binding Site Ltd., San Diego, Califg.). 항체 끝점 역가는 기준의 것에 3배 이상인 A₄₁₅을 제공하는 최대 혈청 희석비로 정의한다. 기준 웰에는 사람 혈청을 제외하고는 모든 처리를 하고, 통상 흡수값이 0.03 내지 0.06를 가진다.

ELISA에 의해 정제된 사람 IgG, IgM, IgA(Pierce, Rockford, IL)에 대해 바이오틴-라벨된 토끼 항-사람 IgG 및 IgA 항체의 특이성을 결정한다. 교차-반응성은 감지되지 않았다. ELISA에 있는 적절한 이소타입의 정제된 사람 항체를 테스트함으로써 결정된 검사 감응성은 IgG 및 IgA 검사의 경우에 각 15ng/㎖ 및 60ng/㎖ 이었다. 유사하게, 사람 IgG 서브클래스 항체 검사의 특이성은 정제된 사람 골수 IgG 서브클레스 단백질에 대해 ELISA를 하여 확인하였다(ICN Biomedicals, Inc., Irvine, CA). IgG1, IgG3, IgG4 검사에서 검사 감응성은 15ng/㎖이고, IgG2 검사의 경우에 120ng/㎖이 된다. 두 개 기준 혈청이 포함되어 검사간의 변화를 조절하였다.

컴플리먼트 의존성 살균 검사

기존에 설명한 것과 같이 사람 혈청의 살균 활성을 검사하였다(Chen et al., 1996). 일부 경우에, 혈청은 검사하기 전에 정제된 UspA1 또는 UspA2를 흡수시킨다. 최종 농도를 20 내지 50㎍/㎖로 하여 정제된 단백질을 첨가하여 이들 혈청의 특정 항체를 흡수하도록 한다. 최종 혈청 희석비는 1:10이다. 혼합물은 4℃에서 2시간동안 배양하고 침전물은 마이크로-원심분리에 의해 제거한다. UspA1 및 UspA2에 특이적인 정제된 사람 항체는 유사한 방법으로 다섯 가지 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주에 대해 검사하였다.

통계학

JMP 소프트웨어(SAS institute, Cary, N.C.)를 이용하여 로그 변환된 역가로 통계학적으로 분석을 하였다. 변환을 위해, 최저 혈청 희석치에 절반 값은 감지가능한 역가를 포함하지 않는 것으로 한다. 나이 군간에 IgG 수준을 비교하는 것은 변수 분석, 항체 관계를 이용하여 실시하고, 살균 역가는 로그 회귀를 이용하여 겨렁한다. 0.05보다 적인 p 값은 유의성이 있는 것으로 간주한다.

결과

어린이 및 성인에서 UspA1 및 UspA2에 대한 혈청 IgG 및 IgA 역가 비교

O35E 균주 전체 박테리아 세포, 정제된 UspA1 및 UspA2(ELISA에 의해)에 대해 2-18월령의 10명 어린이에서 장기적으로 수집하고 뿐만 아니라 15명의 어린이(월령 18-36개월)에서 무작위로 취한 샘플에서 IgG 및 IgA 항체 역가를 검사하였다. 세 가지 항원 모두에 대한 IgG의 역가는 거의 모든 혈청에서 감지되었다(도 9). UspA1 및 UspA2에 대한 IgG 역가는 O35E 박테리아에 대한 IgG의 역가와 비교하였을 경우에 나이에 따른 변화가 큰 것으로 나타났다(도 9). 성인 혈청은 다양한 나이대의 어린이 혈청의 것보다는 정제된 단백질에 대해 IgG 역가가 상당히 큰 것으로 나타났다(p0.01). 월령이 6-7일 어린이 혈청은 UspA 단백질에 대해 최저의 IgG 역가를 가지고, 이는 이 나이가 2개월된 나이의 어린에서보다 역가가 상당히 낮다는 것을 의미한다(p0.05).

UspA1, UspA2, O35E 박테리아 세포에 대한 IgA 항체의 수준은 나이에 관계한다(도 9). UspA1 및 UspA2에 대한 혈청 IgA는 26명 성인 및 월령이 18-36인 모든 군에서 감지되었다. 19개월 이하의 어린이 경우에, 항원 특이적인 IgA 역가를 나타내는 비율은 나이가 증가함에 따라 증가된다. 이들 혈청에서 UspA1, UspA2, O35E에 대한 평균 IgA 역가는 처음 7개월에서는 낮지만, 그 이후로는 점차 증가된다(도 9).

UspA1 및 UspA2에 대한 IgG 항체의 나이에 따른 서브클래스 분포

UspA1 및 UspA2 항원에 대한 IgG 서브클레스 역가는 10명의 성인 및 35명의 어린이 혈청에서 결정한다. 서브클래스 분포는 나이에 따라 달라진다. UspA1 및 UspA2에서 가장 우세한 항체는 거의 모든 혈청에서 감지되는 IgG1 및 IgG3이다. IgG2 및 IgG4 역가는 감지할 수 없거나 매우 낮다. 따라서, IgG1 및 IgG3 서브클래스에 대한 정보만 있다(도 10). 성인 혈청에서 UspA1 또는 UspA2에 대한 IgG3 역가는 IgG1 역가보다는 상당히 높다(p0.05). 2개월된 어린이 혈청에서 동일한 서브클래스 프로파일을 볼 수 있는데, 단 IgG1 및 IgG3 역가의 차이가 통계학적으로 유의성이 있는 것이 아니고, 샘플 크기가 작기 때문이다. 4 내지 36월령 어린이 혈청에서는 성인 및 2개월된 어린이의 것과는 다른 프로파일을 가진다. 어린이 혈청에서 IgG1 역가는 IgG3 역가와 동등하거나 상당히 높다. UspA1 또는 UspA2에 대한 평균 IgG3의 역가는 이들 어린이 혈청에 동일 항원에 대한 IgG3 역가보다 상당히 높다(p0.05).

살균 활성

상이한 나이대의 17개 혈청의 살균 역가를 결정하였다(표 16). UspA에 대해 높은 IgG 역가를 가지는 2개월된 아이의 5개 혈청중 3개 및 모든 성인 혈청에는 강력한 살균 활성을 가지고 있었다. 6개월된 어린이 혈청에는 최저 살균 활성을 가진다. 이들 나이군의 5개 모든 혈청은 기준 살균 역가 50을 가진다. 월령이 18 내지 36개월인 살균 활성은 50 내지 500의 다양한 역가를 가진다. 살균 역가 및 UspA1 및 UspA2에 대한 IgG 항체 간에는 선형 관계가 있다(로그 회귀 분석 p0.01)(도 11).

개체	나이	ELISA IgG 역가^b		BC 역가^c
개체	나이	UspA1	UspA2	BC 역가^c
1	2개월6개월15개월	17,1274,273798	6,2681,363250	50050<50
2	2개월6개월18개월	12,0781,35714,041	12,24487814,488	50050200
3	2개월6개월18개월	30,2831,0772,478	20,3621,9471,475	50050<50
4	2개월6개월18개월	2,0865309,767	8698028,591	5050200
5	2개월6개월18개월	3,2332,24626,693	2,65536043,703	5050500
6	1.5-3년	4,036	2,686	50
7	1.5-3년	2,037	1,251	50
8	1.5-3년	341	251	50
9	1.5-3년	2,538	1,200	500
10	1.5-3년	1078	1,370	500
11	1.5-3년	1,265	953	50
12	adult	161,750	87,180	450
13	adult	873,680	248,290	>1350
14	adult	154,650	146,900	450
15	adult	10,330	7,860	50
16	adult	35,780	31,230	150
17	adult	19,130	132,200	450

^a개체 1 내지 5의 3개 연속 샘플을 명기한 나이 대에 수집하였다.

^bO35E로부터 정제된 UspA1 또는 UspA2에 대한 ELISA 엔드 포인트 역가는 배경의 3배이상으로 A₄₁₅인 최대 희석비를 제공하는 것으로 측정한다.

^cBC역가: O35E 균주에 대한 살균 역가. 혈청은 1:50, 100, 200, 500에서 검사하였다. 기준에 대해 박테리아의 50%이상을 죽이는 최대 혈청 희석으로 살균 역가를 결정한다. 기준 박테리아는 테스트 혈청 및 열로 비활성화된 컴플리먼트 혈 청으로 배양하였다.

정제된 UspA1 또는 UspA2를 흡수시킨 혈청의 살균 활성

웨스턴 블랏에서 지시한 것과 같이, 정상적인 사람 혈청은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 여러 항원에 대해 항체를 가지고 있기 때문에, 흡수 방법을 이용하여 살균 활성에 대해 UspA1 및 UspA2 특이적인 항체 분포를 결정한다. 6명의 성인 혈청에 정제된 UspA1 또는 UspA2를 흡수시켜, UspA 단백질에 대한 ELISA 반응성의 변화를 결정한다. 흡수 후에 모든 혈청에서 ELISA 반응성이 감소되었다는 것을 볼 수 있다(표 17). EH한, 한 가지 단백질의 흡수로 인하여 다른 단백질에 대한 IgG 역가가 감소되었다. 흡수물이 UspA1 또는 UspA2에 관계없이 동일한 정도로 UspA2 반응성이 감소되었다. 대조적으로 UspA1 보다는 UspA2로 흡수한 후에 UspA1 반응성의 감소가 적었다(표 17). 이는 UspA1 및 UspA2에 대한 항체는 부분적으로 교차-반응성이 있다는 것을 나타낸다.

흡수물	샘플에서 UspA1에 대한 IgG 역가^b
흡수물	#1	#2	#3	#4	#5	#6
염	161,750	873,680	154,650	10,330	35,780	19,130
UspA1	2,450	2,210	3,160	1,650	500	3,010
UspA2	42,620	90,150	33,570	6,420	3,490	4,130
	UspA2에 대한 IgG 역가^b
염	87,180	248,290	146,900	7,860	31,230	13,200
UspA1	2,800	2,120	2,700	2,220	500	500
UspA2	500	1,820	3,010	2,960	500	500

^a흡수: 몇 방울의 성인 혈청을 희석하고, O35E 균주의 정제된 UspA1 또는 UspA2를 최종 단백질 농도가 50㎍/㎖이 되도록 첨가한 다음 1:10 혈청 희석한다. 혼합물은 2시간동안 4℃에서 배양하고, 침전물은 마이크로원심분리에 의해 제거한다.

^bUspA1 또는 UspA2 단백질에 대한 IgG 역가는 혈청 희석을 1:500으로 하여 엔드포인트 역가로 결정한다.

흡수된 혈청의 살균 역가를 결정하고, 흡수전에 이들을 비교한다(표 18). UspA1 또는 UspA2로 흡수되면 O35E 균주에 대해 검사하였을 경우에, 6개 모든 혈청에서 살균 활성(<50)이 완전하게 상실된다(표 18). 흡수된 혈청의 살균 활성은 이형 균주 1230-359에 대해 검사하였을 경우에 적어도 3배 감소된다. UspA1를 이용하여 흡수하였을 경우에, UspA2을 이용하여 흡수한 것과 비교할 때 6개 샘플중 3개에서 이형 균주에 대한 살균 역가가 상당히 감소되었음을 볼 수 있다(표 18). 이 결과는 두 가지 단백질을 흡수한 후에, UspA1에 대한 ELISA 역가가 감소되는 것과 일치한다. UspA1 및 UspA2 복합 단백질을 이용한 흡수의 경우에는 UspA1 단독으로 이용하였을 경우보다 살균 활성이 감소되지 않았다. 웨스턴 블랏 분석으로 결정하였을 경우에 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)로부터 74kDa OMP에 대한 항체만을 포함하고, 정제된 74kDa 단백질을 이용한 흡수의 경우에는 O35E 균주 또는 1230-357 균주의 살균 활성에 영향을 주지 못하였다. UspA 단백질에 대한 항체가 성인 혈청에서 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 살균 활성의 주요 소스라는 것을 말하는 것이다.

흡수물자	샘플에서 O35E에 대한 살균 역가^b
흡수물자	#1	#2	#3	#4	#5	#6
염	450	>1350	450	50	150	450
UspA1	50	50	50	50	50	50
UspA2	50	150	50	50	50	50
	1230-359 균주에 대한 살균 역가^b
염	450	4050	>1350	150	150	450
UspA1	50	150	50	50	50	150
UspA2	150	1350	450	50	50	50

^a혈청은 표 17에서 설명한 것과 동일하다.

^b살균 역가; 살균 역가는 1:50으로 시작한 3배 희석된 혈청으로 O35E 또는 1230-359 균주에 대해 측정하였다. 50%이상을 죽이는 최대 혈청 희석비를 살균 역가로 결정한다. 흡수에 이용되는 정제된 UspA1 또는 2 단백질은 O35E 균주에서 만든다.

매우 소량의 어린이 혈청을 이용하기 때문에, UspA1 및 UspA2 단백질 혼합물을 이용하여 이들 혈청 흡수를 시킨다. 흡수로 인하여, 7개 혈청중 4개에서 살균 활성이 완전히 상실되거나 또는 상당히 감소된다(표 19). 2개월된 어린이 3명을 포함하는 4개 혈청에는 흡수전보다 더 큰 200 살균 역가를 가진다. 다른 세 개 혈청은 흡수시에 살균 역가에 변화가 없기 때문에 모두 흡수 전에 기본 50 역가를 가진다. 흡수후에 UspA 단백질에 대한 ELISA 반응성의 감소는 항체 농도가 감소되었다는 것을 확인시키는 것이다. 이는 어린이 혈청에 있는 UspA1 및 UspA2 단백질에 대한 특이적인 항체가 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 살균 활성의 주요 소스라는 것을 말한다.

샘플	나이(월령)	흡수안된 혈청		흡수된 혈청
샘플	나이(월령)	A₄₁₅ ^b	BC 역가^c	A₄₁₅ ^b	BC 역가^c
1	2	0.84	200	0.29	50
2	2	0.93	200	0.19	50
3	2	0.98	500	0.38	50
4	18	0.88	200	0.43	50
5	15	0.66	50	0.25	50
6	18	0.62	50	0.32	50
7	15	0.68	50	0.35	50

^a흡수도; 각 혈청은 최종 단백질 농도 200, 50, 20㎍/㎖에서 O35E 균주로부터 UspA1 및 UspA2 단백질 혼합물을 흡수한다. 각 샘플에서 이들 세 가지 흡수에 대해 동일한 결과를 볼 수 있다. 20㎍/㎖ 단백질을 이용하여, 검사로부터 얻은 데이터를 볼 수 있다.

^bA₄₁₅ : 감지 항원으로 UspA1 및 UspA2 혼합물을 이용하여 ELISA에서 415㎚에서 흡수도를 나타낸다. 혈청은 1:300 희석비로 테스트하였다.

^cBC 역가: 검사에서 O35E 균주를 50%이상 죽이는 최대 혈청 희석. 혈청은 1:50, 200, 500희석비에서 검사하였다.

UspA1 및 UspA2에 대한 친화력 정제된 항체

이들의 교차 활성 및 살균 활성을 확인하기 위해, 성인 혈장의 UspA1 또는 UspA2에 대한 항체를 친화력 정제 과정에 따라 분리하였다. 정제된 항체는 UspA1 및 UspA2와 특이적으로 반응하나 웨스턴 블랏 검사에서 O35E 용해물에 있는 비-UspA 단백질과는 특이적으로 반응하지 않는다. 한 단백질에 대한 정제된 항체는 ELISA에서 거의 등가의 역가로 다른 것과 반응한다(표 20). 항체 준비물은 전체-세포 ELISA 및 살균 검사에서 다섯 가지 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주와 반응성이 있는 것으로 나타났다(표 21). 모든 다섯 가지 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주에 대한 살균 역가의 범위는 400 내지 800이고, 이는 정제된 항체 준비물에 있는 0.25-0.50 ㎍/㎖와 등가이다(표 21).

정제된 항체^a	IgG 역가^b
정제된 항체^a	UspA1	UspA2
UspA1	50,468	20,088
UspA2	53,106	52,834

^a항체는 니트로셀룰로오즈 막에 고정된 O35E로부터 정제된 UspA1 또는 UspA2를 이용하여 면역 용출함으로써 두 명의 건강한 성인의 혈청으로부터 정제한다.

^bELISA 엔드 포인트 역가는 배경에 대해 3배인 A₄₁₅를 제공하는 최대 항체 희석을 제공한다.

검사 균주	전체 세포 ELISA 역가^b		BC 역가^c
검사 균주	Ab to UspA1	Ab to UspA2	Ab to UspA1	Ab to UspA2
O35E	12,553	9,939	400	800
ATCC25238	30,843	29,512	400	400
TTA24	51,511	57,045	800	800
216:96	31,140	23,109	400	400
1230-359	8,495	16,458	800	800

^a정제된 항체 준비물은 표 20의 것과 동일하다. 다른 외측 막 단백질이 아닌 UspA 단백질에 대한 정제된 항체에 대한 특정 반응성은 웨스턴 블랏으로 확인하였다.

^bELISA 엔드 포인트 역가는 전체 박테리아 세포에 대해 검사하였을 경우에 배경의 3배가 되는 A₄₁₅을 제공하는 최대 항체 희석배.

^cBC 역가: 검사에서 박테라아 접종물을 50%이상 죽이는 최대 항체 희석배, 항체(120㎍/㎖)는 1:100, 200, 400, 800 희석비에서 검사한다.

토론

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 전체 세포 또는 외측 막 단백질에 대한 사람 항체를 검사하는 기존 연구는 한 개 나이군에 집중된다. 또한, 항체의 생물학적 기능은 대개 측정하지 않은 채로 남겨두고(Chapman et al., 1985), 기능적인 항체를 유도하는 항원에 대해서는 확인하지 않았다. 따라서, 이와 같은 기존 연구는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 질병에 대해 보호를 위해 자연적으 로 요구되는 항체의 역할 및 백신 개발에 적합한 항원에 대한 정보도 제공하지 않았다. 이 연구에서 얻은 데이터에서는 UspA1 및 UspA2에 대한 IgG 항체는 정상 사람 혈청에 존재하고, 이 수준은 나이에 따라 달라진다는 것을 보여준다. 이와 같은 항체는 어린이 및 어른에서 혈청 살균 활성의 중요한 소스라는 것이다.

이들 데이터로부터 대부분 어린이는 개인별로 그 수준에 있어서 차이가 있기는 하지만, 2개월째에 UspA1 및 UspA2에 대한 혈청 IgG 항체를 가진다는 것을 보여주고, 이들 유아 혈청에서 IgG 서브클래스 프로파일은 성인 혈청의 것과 유사하다는 것이다. 유아 혈청은 살균 활성을 가진다. 흡수 연구에서 이들 혈청에 있는 큰 살균 항체는 UspA1 및 UspA2 단백질에 대한 것이다. 이 결과는 2개월된 어린이에게서 감지되는 IgG 항체는 모체에서 기인된 것이다. 이는 탯줄 혈청에서 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 전체 세포에 대한 높은 역가의 항체가 포함되었다는 것과 일치한다(Ejlertsen et al., 1994b).

이 연구에서 검사된 개체 및 소수 개체에서 임상 정보가 부족하기 때문에, UspA에 대한 모체 항체가 어린이에게서 보호성이 있는지는 결정되지 않았다. 그러나, 2개월된 어린이는 UspA 단백질에 대해 상당히 높은 혈청 IgG 역가를 가지고, 이들 어린이들중 몇몇은 15-18월령의 어린이와 비교하였을 때, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대해 낮은 수준의 IgA를 가진다. 혈청 IgA가 박테리아에 점막이 노출되는 경우에, 대부분 어린이는 처음 몇 개월간 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 감염되지 않는다. 이 이유 중에 하나는 어린이에 존재하는 모체 항체가 이 나이에 감염으로부터 보호를 해준다는 것이다. 이는 어 린이는 이러한 박테리아를 잘 가지고 있지 않으며, 출생후 처음 몇 개월간에는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 질병에 걸리지 않는다는 것과 일치한다(Ejlertsen et al., 1994a).

모체 항체가 약해지면 어린이는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염에 걸리기 쉬워진다. 이 연구에서, 6 내지 7개월된 어린이 혈청은 UspA 단백질에 대해 최저 수준의 IgG 항체를 가지고, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 전제 세포에 대해 살균 역가를 거의 감지할 수 없다. 15개월 경우는, 거의 모든 어린이는 UspA 단백질에 대해 혈청 IgA를 가지나, 6 내지 7개월된 어린이와 비교하였을 경우에, IgA 항체 수준은 IgG 항체의 수준과 함께 상당히 증가되고, 살균 활성도 증가된다. 이는 이들 어린이들이 박테리아에 노출되고, 항체 반응을 하는 것으로 보인다. 18-36월령의 어린이의 15개 혈청에는 모두 UspA 단백질에 대해 IgG 및 IgA를 가지고, 살균 역가는 매우 다양하다. 나이가 들면서 어린이의 혈청에는 UspA 특이적인 IgG 항체는 2개월된 어린이의 항체와는 다른 특징을 가진다. 우선, IgG1 항체 역가는 어린이 혈청에서 IgG3 역가보다 상당히 높고, 2개월된 어린이에서는 그 반대이다(도 10). 둘 째, 2개월된 어린이의 대부분 혈청에는 살균 활성을 가지지만, 6개월된 어린이에서는 이 활성을 거의 찾아볼 수 없다. 6-36월령의 어린이에서 볼 수 있는 낮은 항체 수준 및 낮은 살균 활성은 이 나이대의 어린이가 최대 콜로니 형성 속도 및 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 질병의 최대 발병율을 가진다는 것과 일치한다(Bluestone, 1986; Ejlertsen et al., 1994b; Leinonen et al., 1981; Roitt et al., 1985; Ruuskanen and Heikkinen, 1994; Sethi et al., 1995; Teele et al., 1989).

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염에 저항성인 집단인 성인 (Catlin, 1990; Ejlertsen et al., 1994a)은 UspA 단백질에 대한 IgG 항체 수준이 항상 어린이보다 더 높고 뿐만 아니라 더 높은 살균 활성을 가진다. 성인 혈청의 살균 활성은 이뮤노글로블린 결손된 혈청에서는 활성이 없기때문에(Chen et al., 1996), 분명하게 항체-중개된 활성이 되고, 성인 혈청에서 정제된 항체는 컴플리먼트 의존성 살균 활성을 나타낸다. 단일 분리체로부터 UspA1 또는 UspA2을 이용한 사람 혈청에서 정제된 항체는 다중 균주에 대해 치사 활성을 나타낸다. 이 결과는 사람은 자연적인 감염에 대해 UspA 단백질의 보존 에피토프에 대해 살균 항체를 발생한다.

모든 성인 샘플에서, IgG 항체는 주로 IgG1와 IgG3 서브클래스로 구성되는데, IgG3이 더 많다. 이는 기존의 보고서에서 IgG3 서브클래스가 성인 및 4세 이상의 어린이(더 어린 사람은 제외)에서 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 면역 반응의 주요 구성분이다(Carson et al., 1994; Goldblatt et al., 1990). 사람에서 4개 IgG 서브클래스중에, IgG3는 혈청에서 총 이뮤노글로블린에 소수 성분이다. 그러나, IgG3 항체는 Clq과 상호작용을 하는 최대 활성을 가지는 것으로 이는 전통적인 컴플리먼트 경로의 초기 단계에서 컴플리먼트-의존성 치사 및 opsono-식작용에 의해 박테리아를 제거하는 것이다(Roitt et al., 1985). IgG3 항체는 태반을 효과적으로 이동하기 때문에, 태아에게 보호성 면역을 제공한다. 이 연구 데이터에서 UspA 단백질에 대한 IgG3 항체는 자연 감염에 대한 면역 반응 의 주요 성분이고 in vitro 생물학적 활성을 가진다.

연구 개체에 대해 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염과 관련된 임상 정보가 수집되어 있지 않기 때문에, 어떻게 UspA1 또는 UspA2에 대해 항체가 유도되는지는 알 수 없다. 다른 종 가령, 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 나이제리아 메닝지티디스(Niesseria meningitidis), 나이제리아 고노리어(Neisseria gonorrhoeae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 대장균(Escherichia coli), 비-형태성 호모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)와 기니아 피그에서 UspA 단백질에 대해 만들어진 항체와의 반응성을 웨스턴 블랏으로 테스트하였는데, 반응성이 유도되지는 않았다. 이는 항체가 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 UspA 항원에 특이적으로 반응하여 유도된다는 것을 의미한다. 이는 높은 콜로니형성율, 사람 집단에서 이들 유기체의 특징과 일치한다. 두 가지 UspA 단백질에 대해 친화력 정제된 항체는 교차 반응성이 있기 때문에, 사람 항체가 한 개 또는 두 개 단백질에 의해 유도되는지를 결정할 수는 없다. 이들 두 개 단백질사이에 공유하는 서열은 살균성 항체의 주요 표적이 되는 것은 분명하다.

요약하면, 이 연구에서 이들 두 개 UspA1에 대한 항체는 주로 나이와는 무관하에 모든 사람에 존재한다는 것을 설명한다. 그러나, 이들 항체의 전체 수준 및 서브클래스 분포는 나이에 따라 달라진다. UspA1 및 UspA2에 대한 IgG 항체는 교차 반응성이고, 성인의 혈청 살균 항체의 주요 소스가 된다. 이들 항체의 수준 및 혈청 살균 활성은 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염에 대해 나이에 따 른 저항성과 연관이 있는 것으로 보인다. 사람은 저연적인 감염 후에, UspA1 및 UspA2에 추가하여 다른 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 항원에 대해 반응하는 항체를 만들기 때문에, 한 개 또는 두 개 UspA 단백질이 감염될 수 있는 집단에서 적절한 보호를 제공할 수 있을지를 조사해야 한다.

실시예 6 : 올리고사카라이드용 담체로써 UspA2

폐염구균 사카라이드 담체로써 UspA2

이 연구에서는 UspA2가 폐염구균 사카라이드용 담체로 작용할 수 있는지를 설명하는 것이다. 7가 폐염구균 폴리사카라이드를 환원성 아미네이션을 통하여 UspA2에 공액시킨다. Swiss Webster 쥐에 0주 및 4주에 면역주사를 하고, 6주에 최종적으로 출혈을 시킨다. 각 쥐에는 피하로 약량당 1㎍ 탄수화물을 복막으로 주사하는데, 어쥬번트로는 인산 알루미늄염을 사용한다. 생쥐 집단에 PP7F-CRM 공액체로 면역화시켜, 기준으로 사용한다. 6주 출혈후에 혈청에서 얻은 데이터를 표 22, 표23, 표24에 나타내었다. 공액체는 폴리사카라이드 및 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 대한 살균 항체에 대해 항체를 유도한다. 이들 결과에서는 UspA2가 폐염구균 사카라이드에 대해 항체를 유도하는 담체로 작용하고, UspA2에 대한 면역원성을 보유한다는 것을 설명한다.

항원	Pn Ps 7F^*에 대한 Ig ELISA
PP7F-UspA2 혼합물	100
PP7F-UspA2 공액체	9,514
PP7F-CRM 공액체	61,333

^* 다섯마리 쥐에서 얻은 혈청

이뮤노겐 집단¹	테스트한 균주`
이뮤노겐 집단¹	035E	430-345	1230-359
PP7F-UspA2² 혼합물	51,409	4,407	9,124
PP7F CRM 공액체	56	49	47
PP7F UspA2 공액체	31,111	3,529	8,310

¹백신 군은 5 Swiss-Webster mice로 구성된다. 각 집단은 0주 및 3주에 면역주사를 하고, 6주에 혈청을 수득한다.

¹백신은 1㎍ Pneumo Type 7F 및 인산알루미늄염으로 어쥬번트된 1㎍ UspA2로 구성된다.

이뮤노겐군¹	테스트된 균주
이뮤노겐군¹	035E	430-345	1230-359
PP7F-UspA2 혼합물	400	400	400
PP7F CRM 공액체	100	100	100
PP7F UspA2 공액체	400	400	200

¹BC₅₀ 역가는 0주에 혈청과 비교하여 박테리아의 50%이상이 죽었을 때 최대 혈청 희석물을 말한다. 테스트된 최대 농도 혈청은 1:100 희석물이다.

호모필리스 b( Haemophilus b) 올리고사카라이드 담체로써의 UspA2

이 연구에서는 UspA2가 호모필리스 인플루엔자 b(Haemophilus influenzae b) 올리고사카라이드(HbO)용 담체로 작용할 수 있다는 것을 설명한다. HbO 샘플(평균 DP=24)를 0.1% Triton X-100 존재 하에 수용성 환원 아미네이션으로 UspA2에 공액시킨다. HbO에 대한 UspA2의 비율은 2:1(중량비)이다. 공액하여 35℃에서 프로시드하고, 용액물은 Amicon 100K cutoff 막으로 통과여과를 시킨다. 공액물 비율(탄수화물㎎/UspA2㎎)은 0.43:1이다. orcinal 검사 및 Lowry 단백질 검사를 통하여 탄수화물을 결정한다. 아미노산 분석으로 이용하여 하이드록시-에틸 리신의 수가 12.6이라는 것을 알았다.

공액물의 면역원성은 Swiss-Webster 생쥐에 면역주사하여 검사한다. 생쥐에 1㎍ 탄수화물을 0주 및 4주에 면역주사한다. 공액물에는 어쥬번트를 이용하지 않으나, UspA2에서는 어쥬번트를 이용한다. 혈청을 모으고, 역가를 조사한다. 방사능항원 결합검사(RABA)에 의해 HbPS에 대한 반응성은 HbO가 CRM₁₉₇에 공액된 경우와 비슷하다는 것을 알았다(표 25). 상동 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 분리체(O35E)에 대한 전체 세포 역가는 공액안된 UspA2에 대한 역가와 유사한데(표 26), 이의 살균 역가도 같이 나타내었다(표 27). 따라서, 0.10이하의 RABA 역가를 일반적으로 유도하는 탄수화물 항원이 UspA2에 공액되는 경우에는 면역원성이 될 수 있다.

Week	HbO-CRM₁₉₇	Hbo-UspA2
0	0.10	0.10
3	2.51	2.87
4	4.46	3.56
6	58.66	18.92

Week	UspA2^a	Hbo-UspA2
0	50	50
4	54,284	17,424
6	345,057	561,513

^a5㎍ UspA2는 500㎍ 인산알루미늄으로 어쥬번트한다.

Isolate	UspA2^a	Hbo-UspA2
O35E	4,500	>4,500
345	n.d.	450

^a5㎍ UspA2는 500㎍ 인산알루미늄으로 어쥬번트한다.

n.d.는 결정되지 않음

실시예 7 : 돌연변이 형 UspA2의 발현과 생쥐 혈청 감응성과의 연합

박테리아에 대한 특이 항체가 부족한 혈청존재하에 박테리아가 죽을 경우에, 이를 혈청 감응성("serum sensitivity")이라고 한다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 경우에, 고유 UspA2 단백질이 부족한 돌연변이체는 혈청 감응성으로 판단된다. 이와 같은 돌연변이는 한 개는 UspA1를 발현하지 않고(O35E1: 실시예 4에서 분리체 O35E.1, O35E.2, O35E.12), 한 개는 UspA2를 발현하지 않고(O35E.2), 다른 한 개는 17C7 단클론 항체와 반응성이 부족한 단백질을 발현하지 않도록(O35E.12) 만든다. 그러나, O35E.2 및 O35E.12는 정제된 UspA2를 쥐에 면역주사하여 준비한 항체와는 반응을 하는 더 작은 절두형 UspA2(tUspA2)을 발현시킨다. tUspA2는 다클론항체 항-UspA2 또는 MAb 13-1을 이용하여 웨스턴 블랏 박테리아 용해물에서 감지될 수 있다. 더 작은 형태는 두 개 돌연변이체를 작제하는데 이용되는 유전자 절두형과 일치한다.

미량적정 플레이트의 웰에서 비-이뮨 생쥐 혈청과 사람 컴플리먼트 희석물 및 박테리아 현탁액(1:5)(Approx. 1000 cfu)를 혼합하여 이와 같은 살균 능력을 테스트한다. 생쥐 혈청은 1:50 및 1:100 희석물에서 테스트한다. 그 다음 살아있는 박테리아의 수는 한천 생장 배지에 이와 같은 살균 현탁액 희석물을 도말하여 결정한다. 생쥐 혈청없이 샘플에 대해 cfu를 회수하였을 경우에 50%이만의 생존율을 가질 때 치사가 유의성이 있는 것이다. "완전한" UspA2를 가지지 못하는 돌연변이에서만 비-이뮨 혈청에 의한 치사를 볼 수 있다(표 28).

돌연변이	발현된 단백질	정상 생쥐 혈청의 살균 활성
035E	UspA1 & UspA2	-
035E.1	UspA2	-
035E.2	UspA1 & tUspA2	+
035E.12	tUspA2	+

실시예 8: MAb 17C7에 결합하는 UspA1에 데카펩티드 에피토프의 확인

상이한 종의 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)로 작업을 하여 UspA1의 단백질 서열 분석하면, 특정 에피토프 부분이 동일하지는 않지만, 유사하고, 이들은 사람에서 기본적인 면역반응을 제공한다는 것이다. 이와 같은 면역원 에피토프를 확인하기 위해, MAb 17C7에 대한 결합 부위를 포함하는 것으로 알려진 UspA1 부분을 가지는 펩티드를 준비하고, 이들이 MAb 17C7에 결합하는 능력을 검사한다.

특히, 표 29 및 도 12에 나타낸 것과 같이, 유도된 셀룰로오즈로 구성된 막에 N말단부에 결합하는 겹쳐지는 합성 데카펩티드를 Research Genetics Inc.(Huntsville, AL)에서 구하였다. 탈지 건유 5%(w/v)를 포함하는 PBS-Tween으로 5회 세척한 후에, 막을 4℃에서 하룻밤동안 MAb 17C7(하이브리도마 배양 상청액의 형으로)에 배양한다. PBS-Tween으로 3회 세척한 후에 막은 부드럽게 교반하면서 방사능요오드화된 10⁶cpm(특이 활성 2 ×10⁷ cpm/㎍단백질) 및 친화력-정제된 염 소 항-생쥐 이뮤노글로블린으로 배양한다. 그 다음 막은 X-ray 필름에 노출하기전에 세척하고, 노출시킨다(Fuji RX safety film, Fuji Industries, Tokyo, Japan).

자가방사사진(도 13)에서 볼 수 있는 도트 블랏 결과에서 펩티드 13, YELAQQQDQH(서열:18)이 MAb 17C7에 최적의 결합을 나타내고, 펩티드 14(서열:85)는 다소 부족한 결합을 가진다. 이와 동일한 펩티드(서열:18)가 UspA2에 존재하는데, 이는 MAb 17C7에 결합하는 두 가지 단백질이 결합한다는 것을 설명한다.

흥미로운 것은, 펩티드 12는 결합을 하지 않고, 펩티드 15, 16, 19, 22, 23 에 의한 결합은 비-특이적인 것으로 보인다. 따라서, 펩티드 12, 13, 14 비교하면, 7-mer AQQQDQH(서열:17)는 MAb 17C7가 UspA1 및 UspA2에 결합하는데 필수적인 에피토프이라는 결론을 얻게 된다. 이와 같은 결론은 면역원 에피토프가 5, 6 또는 7개 잔기와 같은 적은 잔기로 구성된다는 것과 일치한다.

실시예 9: 모렉셀라 카타르할리스( M. catarrhalis ) 균주 O35E에서 동계 uspA1 및 uspA2 의 표현형 효과

재료 및 방법

박테리아 균주, 플라스미드 및 생장 조건

본 연구에서 이용된 박테리아 균주 및 플라스미드는 표 30에 나타내었다. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주는 95% air-5% CO₂에서, 필요한 경우 카나미이신(20㎍/㎖) (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) 또는 클로람페니콜(0.5 ㎍/㎖)(Sigma)을 보충한 Brain-Heart Infusion(BHI) 한천 플레이트(Difco Laboratories, Detroit, MI)에서 또는 BHI 브로스에서 생장시킨다. 흡착 검사용으로 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)을 생장시키는데 이용된 BHI 브로스는 여과에 의해 멸균한다. 대장균(Escherichia coli)은 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트(Maniatis et al., 1982)[필요에 따라 암피실린(100㎍/㎖), 카나마이신(30㎍/㎖), 클로람페니콜(30㎍/㎖)을 보충]에서 배양한다.

균주 또는 플라스미드	설명	소스 또는 참고문헌
M. catarrhalis
O35E	중이 유체에서 야생형분리체	Helminen et al., 1994
O35E.1	uspA1 구조유전자에 kan 카트리지가 있는 O35E 동계 돌연변이	Aebi et al., 1997
O35E.2	uspA2 구조유전자에 kan 카트리지가 있는 O35E 동계 돌연변이	Aebi et al., 1997
O35E.12	uspA2 구조 유전자에 있는 kan 카트릿지와 uspA1 구조 유전자에 있는 cat 카트릿지가 있는 O35E 동계 돌연변이	본 연구
P-44	신속한 헤마글루티닌을 나타내는 야생형 분리체	Soto-Hernandez et al., 1989
P-48	느린 헤마글루티닌을 나타내는 야생형 분리체	Soto-Hernandez et al., 1989
Escherichia coli
DH5α	클로닝 연구의 숙주	Stratagene
Plasmids
pBluescript II	클로닝 벡터; Amp^r	Stratagene
pUSPA1	M. catarrhalis 균주 O35E의 uspA1 유전자 대부분을 포함하는 2.7kb 삽입체를 가지는 pBluescript II SK+	Aebi et al., 1997
pUSPA1CAT	uspA1 유전자 단편 0.6kb BglII를 대체하는 cat 카트릿지를 가지는 pUSPA1	본 연구

외측 막 단백질의 특징

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주의 전체 세포 용해물질 및 외측 막 소포는 Murphy and Loeb, 1989; Patrick et al., 1987에서 설명하는 것과 같이 준비한다. 이들 준비물에 존재하는 단백질은 SDS-PAGE에 의해 용해시키고, Coomassie blue로 착색을 하거나 또는 Helminen et al., 1993a에서 설명하는 것과 같이 웨스턴 블랏 분석으로 감지한다.

단클론 항체(MAbs)

초기 실시예에서 설명하는 것과 같이, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E의 보존된 에피토프 UspA1 및 UspA2와 반응하는 뮤린 IgG 항체인 MAb 17C7를 이용하여 이들 단백질의 면역성을 감지한다. 웨스턴 블랏 분석에서 하이브리도마 배양물 상청액의 형으로 그리고 간접 항체-접근성 검사에서 MAb 17C7을 이용한다. 헤모필러스 듀크레이(Haemophilus ducreyi)(Klesney-Tait et al., 1997)의 주요 외측 막 단백질에 특이적인 IgG MAb인 MAb 3F12를 간접 항체-근접성 검사의 음성 기준으로 이용한다.

분자 클로닝 방법

폴리메라제 사슬 연쇄반응(PCR^TM) 시스템에 주형으로 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 염색체 DNA와 균주 O35E uspA1 오픈 리딩 프레임(도 14의 P1) 또는 오픈 리딩 프레임의 단부(도 14의 P2)에서 유도한 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 이용한다. 이들 프라이머는 5'말단부위에 BamHI 제한 위치를 포함하도록 만든 것이다. 이들 프라이머의 서열은 다음과 같다;

P1-5'-CGGGATCCGTGAAGAAAAATGCCGCAGGT-3' (서열:96);

P2-5'-CGGGATCCCGTCGCAAGCCGATTG-3' (서열:97)

DNA 단편은 PTC 100 Programmable Thermal Controller(MJ Research, Inc., Cambridge, MA) 및 GeneAmp PCR^TM kit(Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ)를 이용하여 증폭시킨다. PCR^TM 생성물은 Qiaex Gel Extraction Kit(Qiagen, Inc., Chadsworth, CA)를 이용하여 0.7% 아가로즈 겔 슬라이스로부터 추출하고, BamHI(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)으로 절단하여, pBluescript II SK+(Stratagene, La Jolla, CA)의 BamHI 부위에 연속하여 결찰시킨다. 결찰 반응 은 T4 DNA 결찰효소(Gibco BRL, Inc., Gaithersburg, MD)를 이용하여, 16℃에서 하룻밤동안 실행한다. 컴피턴스 대장균(E. coli) DH5α세포는 표준 열 쇼크 과정(Sambrook et al., 1989)에 따라 결찰 반응 혼합물으로 형질 전환되고, 적절한 항균 화합물 존재 하에 배양하여, 원하는 형질전환체를 선별한다. pUC△ECAT(Wyeth-Lederle, Rochester, NY)으로부터 절단하여(BamHI를 이용) 1.3 kb 클로람페니콜(cat) 저항 카트릿지를 준비한다. cat 카트릿지는 uspA1 유전자의 중간 부분 클론된 단편에 위치하는 BglII 제한 부위에 연속하여 결찰시키고, 컴피턴트 대장균(E. coli) DH5 세포로 형질변환 후에, 클로람페니콜을 포함하는 고형 배지상에서 선택하여 재조합 클론을 확인한다.

모렉셀라 카타르할리스( M. catarrhalis )의 형질변환

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E를 형질변환시키는데 이용되는 전기천공은 Helminen et al., 1993b에서 상세하게 설명한다. 간략하게 설명하면, 원심분리를 하여, 로그상 브로스 배양물 30-㎖(10⁹ 콜로니 형성 단위[cfu]/㎖)를 수득하고, 증류수에 10%(v/v) 글리세롤로 3회 세척하여 동일한 용액 100㎕에 재현탁시킨다. 이들 세포 20-㎕를 마이크로전기천공실(Cel-Porator Electroporation system; Bethesda Research Llaboratories, Gaithersburg, MD)에서, 16.2 kV 전장을 0.15㎝거리에서 제공하여, 5㎍ 선형 DNA(가령, cat 카트릿지를 포함하는 절두된 uspA1 유전자)/물 5㎕를 이용하여, 전기천공한다. 전기천공후에, 세포 현탁액을 1㎖ BHI 브로스에 옮기고, 90분간 37℃에서 교반하면서 배양한다. 10개 100-㎕ 부분을 적절한 항균 화합물을 포함하는 BHI 한천 플레이트에 도말한다.

서든 블랏 분석

야생형 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 및 돌연변이 균주에서 정제된 염색체 DNA는 PvuII 또는 HindIII(New England Biolabs)로 절단하고, Sambrook et al., 1989에서 설명하는 방법으로 서든 블랏 분석을 한다. 이줄 가닥 DNA 프로브는 무작위 프라임된 DNA 라벨링 키트(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN)를 이용하여 ³²P으로 라벨한다.

간접 항체-접근성 검사

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 및 이의 동계 돌연변이를 하룻밤동안 BHI브로스에서 배양한 배양물을 10%(v/v) 태아 송아지 혈청 및 0.025%(w/v) 아지드 나트륨(PBS-FBS-A)을 포함하는 PBS 완충액으로 희석하여 110 Klett units(ca. 10⁹ cfu/㎖)[Klett-Summerson colorimeter(Klett Manufacturing Co., New York, NY)로 측정하였을 경우]가 되도록 한다. 이 현탁액의 일부분(100㎕)을 1㎖ MAb 17C7 또는 MAb 3F12 배양 상청액에 첨가한다. 부드럽게 교반하면서 한 시간동안 4℃에서 배양한 후에, 세균 세포를 일단 세척하고, 1㎖ PBS-FBS-A에 현탁한다. 친화력-정제된 염소 항-생쥐 이뮤노글로블린은 ㎍당 10⁸ cpm의 특이 활성을 가지도록 ¹²⁵I로 방사능라벨하여, 첨가하고, 혼합물은 부드럽게 교반하면서 1시 간동안 4℃에 배양한다. 그 다음 세포는 1㎖ PBS-FBS-A로 4회 세척하고, 500㎕ 삼중 계면활성제에 현탁한다음(Helminen et al., 1993a) 유리 관에 옮긴다. 각 샘플에 존재하는 방사능활성은 감마 카운터를 이용하여 측정한다.

자가응집 및 혈액응집 검사

자가응집되는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 능력은 BHI 한천 플레이트에 하룻밤동안 생장된 박테리아 세포를 이용하여 평가한다. 이들 세포는 유리관에 400Klett 단위의 탁도를 가지도록 재현탁하고, 연속하여 10분간 실온에서 방치하여, 이때 현탁물의 탁도를 다시 측정한다. 탁도가 10분 후에, 200Klett이하가 되는 경우는 자가응집이 신속한 것을 말하고, 200Klett이상이 되는 경우는 자가응집이 느린 것을 말한다. 혈액응집 슬라이드 검사는 헤파린처리된 사람 집단 O Rh⁺ 적혈구를 이용하여 Soto-Hernandez et al., 1989에서 설명하는 것과 같이 실행한다.

혈청 살균 검사

표준 방법에 따라 컴플리먼트-충족된 정상 성인 사람 혈청을 준비한다. 56℃에서 30분간 혈청을 가열하여 컴플리먼트 비활성화된 것을 얻는다. 초기 로그상태의 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 브로스 배양물은 0.10%(w/v) 젤라틴(GVBS)을 포함하는 Veronal-완충된 염으로 희석하여, 1-2 ×10⁵ cfu/㎖ 농도로 하고, 20㎕ 부분을 20㎕ 고유 또는 열에 의해 비활성화된 정상 사람 혈청에 첨가하고, 5mM MgCl₂ 및 1.5mM CaCl₂를 포함하는 160㎕ Veronal-완충된 염을 함께 첨 가한다. 이 혼합물은 정제된 수조에 37℃에서 배양한다. 0시, 15분, 30분에 10㎕씩을 제거하여, 75㎕ BHI 브로스에 재현탁하고, 이를 예열된 BHI 한천 플레이트에 도말한다.

흡착 검사

in vitro 상에서 Chang 결막 세포에 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)흡착을 측정하는데 이용되는 방법(St. Geme III and Falkow, 1990)을 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)에 이용한다. 간략하면, 2-3 ×10⁵ HEp-2 세포(ATCC CCL 23) 또는 Chang 결막 세포(ATCC CCL 20.2)를 24-웰 조직 배양 플레이트(Corning-Costar)의 각 웰에 접종하고, 사용하기전에 24시간동안 배양한다. 항생제 없이 하룻밤동안 배양한 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 0.3㎖을 항생제가 없는 10㎖의 새로 만든 BHI 배지에 접종하고, 이 배양물은 연속하여 gyrotory 수조에서 교반하면서 약 5 ×10⁸ cfu/㎖(120 Klett units)의 농도로 배양한다. 배양물은 10분간 4-8℃, 6,000 ×g로 원심분리하여 수득한다. 상청액은 버리고, 파스테르 피펫을 이용하여 5㎖ pH 7.4 인산 완충염(PBS) 또는 0.15%(w/v) 젤라틴(PBS-G)을 포함하는 PBS에 박테리아 세포를 부드럽게 재현탁시킨다. 박테리아 세포는 다시 원심분리하고, 이와 같은 최종 생성물은 6-8㎖ PBS 또는 PBS-G에 부드럽게 재현탁시킨다.

단층의 HEp-2 또는 Chang 세포를 포함하는 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 이 현탁액(10⁷ CFU) 일부분(25㎕)을 접종한다. 이와 같은 조직 배양물 플레이트는 5분간 165 ×g에서 원심분리하고, 그 다음 37℃에서 30분간 배양한다. 비-흡착 박테리아는 세포를 PBS 또는 PBS-G으로 세척하여 제거하고, 상피 세포는 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA를 포함하는 200㎕ PBS를 첨가하여 플라스틱 서포트로부터 분리한다. 이와 같은 세포 현탁액은 연속하여 PBS 또는 PBS-G로 희석하고, BHI 플레이트에 도말하여 살아있는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 수를 결정한다. 흡착은 웰에 첨가된 고유 접종물에 대해 사람 세포에 부착된 박테리아 비율로 나타낸다.

결과

UspA1 및 UspA2의 발현이 부족한 동계 모렉셀라 카타르할리스( M. catarrhalis ) 돌연변이의 작제

UspA1(돌연변이 균주 O35E.1) 또는 UspA2(돌연변이 균주 O35E.2)를 발현하는 능력이 부족한 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 돌연변이를 작제하는 것은 이전의 실시예에서 설명하고 있다(Aebi et al., 1997). UspA1 및 UspA2 모두의 발현이 부족한 이중 돌연변이를 작제하기 위해서는, pUSPA1(도 14)의 0.6kb BglII 단편을 cat 카세트로 대체하여, 재조합 플라스미드 pUSPA1CAT를 만든다. 프라이머 P1 및 P2를 이용하여, pUSPA1CAT의 3.2kb 삽입물은 PCR^TM로 증폭시킨다. 이와 같은 PCR^TM 증폭물을 이용하여, 카나마이신-저항성 uspA2 균주 O35E.2를 전기천공하고, 클로람페니콜-카나마이신-저항성 형질전환체 O35E.12 가칭, uspA1 uspA2 이중 돌연변이를 만든다.

서든 블랏 분석을 이용하여 균주 O35E.1, O35E.2, O35E.12가 동계 돌연변이임을 확인하고, 대립유전자 교환이 적절히 일어나서, 야생형 uspA1 또는 uspA2 또는 이들 두 개 유전자를 돌연변이된 대립유전자로 대체한다. 야생형 모균주 O35E에서 준비한 염색체 DNA 준비물, uspA1 돌연변이 O35E.1, uspA2 돌연변이 O35E.2 및 가칭 uspA1 uspA2 돌연변이 균주 O35E.12를 PvuII로 완전하게 절단하고, 이들 두 개 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 유전자 또는 kan 카트릿지에서 유도된 DNA 단편에 프로브하여 서든 블랏 분석을 한다. cat 카트릿지로 프로브를 하기위해서, 균주 O35E.12의 염색체 DNA는 HindIII로 절단한다.

프라이머 P3, P4(도 14A)를 이용하여 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E 염색체 DNA의 PCR^TM 증폭으로 uspA1-특이적인 DNA 프로브를 얻는다 . 프라이머 P5, P6를 이용하여 PCR^TM하여, O35E 염색체 DNA으로부터 500-bp uspA2-특이적인 DNA 단편을 증폭시킨다. 이들 두 개 유전자-특이적인 프로브와 서든 블랏 분석에서 kan 및 cat 카트릿지를 이용하여 균주 O35E.12는 uspA1 uspA2 이중 돌연변이라는 것을 확인하였다.

야생형 및 돌연변이 모렉셀라 카타르할리스( M. catarrhalis ) 균주에 의해 발현되는 선택된 단백질의 특징

야생형 및 이들의 세 가지 돌연변이 균주에서 추출한 외측 막 소포에 있는 단백질을 SDS-PAGE로 해리시키고, 이들을 Coomassie blue(도 15A)로 착색시키거나 또는 웨스턴 블랏 분석(도 15B)에서 MAb 17C7로 프로브시킨다. 야생형 모균주 O35E는 Coomassie 블루 착색(도 15A, 라인 1, 화살표)으로 감지할 수 있는 매우 분자량이 큰 밴드를 가지는데 이는 uspA1 돌연변이 O35E.1에서도 유사하게 많은 것이다(도 15A, 라인 2). uspA2 돌연변이 O35E.2(도 15A, 라인 3)은 겔의 동일한 부분에서 밴드 발현이 상당히 감소되었고, 이 밴드는 uspA1 uspA2 이중 돌연변이 균주 O35E.12(도 2, 패널 A, 라인 4)에서는 전혀 볼 수 없다.

야생형 균주(도 15B, 라인 1)는 상당한 량의 MAb 17C7을 발현하고, 이들의 대부분은 분자량이 220,000을 초과하는 매우 분자량이 크다는 것을 웨스턴 블랏 분석으로 알 수 있다. 또한 야생형 균주는 MAb에 결합하는 약 120,000 및 85,000(도 15B, 라인 1, 개방 화살표, 닫힌 화살표 각각)의 분자량을 가지는 별도 항원을 나타낸다. uspA1 돌연변이 O35E.1(도 15B, 라인 2)는 120kDa 항원의 발현이 부족하고, 이는 UspA1 단량체 형으로 제시되나 이는 85kDa 항원으로 발현된다. uspA1 돌연변이에 의해 발현되는 매우 분자량이 큰 MAb 17C7-반응성 항원은 야생형 균주에서 발현되는 것과 등가인 것으로 나타났다. uspA2 돌연변이 O35E.2(도 15B, 라인 3)은 120kDa 항원을 발현하나 85kDa 항원 발현이 부족하고, 이는 UspA2 단백질의 단량체형으로 있다는 것을 말한다. uspA1 돌연변이와는 대조적으로, uspA2 돌연변이는 MAb 17C7와 반응성이 있는 매우 분자량이 큰 항원은 상대적으로 매우 적은 것으로 나타났다. 마지막으로, uspA1 uspA2 이중 돌연변이 O35E.12(도 15B, 라인 4)은 감지할정도의 MAb 17C7-반응성 항원을 발현하지 않았다.

야생형 및 돌연변이 균주의 전체 세포에 대한 MAb 17C7의 결합

간접 항체-접근성 검사를 이용하여 UspA1 및 UspA2 모두가 모렉셀라 카타르 할리스(M. catarrhalis)의 표면에 노출되었는지 그리고, 항체에 대한 접근성을 파악한다. 이들 야생형 균주 O35E 및 uspA1 돌연변이 O35E.1의 전체 세포가 유사한 양의 MAb 17C7(표 31)에 결합한다. 이 결과를 보면, UspA2는 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)의 표면에서 발현되거나 uspA1 돌연변이의 표면에서 발현된다는 것이다. uspA2 돌연변이 O35E.2는 야생형 균주보다는 MAb 17C7에 적게 결합되나, 그 결합 수준은 H. ducreyi 외측 막 단백질에 대한 무관한 IgG MAb에서 얻을 수 있는 것보다는 많다(표 31). 웨스턴 블랏 분석으로 예측할 수 있는 것과 같이, uspA1 uspA2 이중 돌연변이 O35E.12는 H. ducreyi-특이적인 MAb가 관련된 음성 기준에서 얻을 수 있는 수준으로는 MAb 17C7에 결합하지 못한다(표 31).

균주	MAb 17C7에 결합	MAb 3F12b에 결합^b
O35E(야생형)	145,583^c	4,924
O35E.1(uspA1 돌연변이)	154,119	4,208
O35E.2(uspA2 돌연변이)	96,721	4,455
O35E.12(uspA1 uspA2 이중 돌연변이)	6,081	3,997

^a세균 세포 표면에 부착된 항체에 결합된 ¹²⁵I-라벨된 염소 항-생쥐 이뮤노글로블린의 CPM(cpunt per min), 이는 간접 항체-근접성 검사로 측정한다.

^b H. ducreyi 외측 막 단백질(Klesney-Tait et al., 1997)에 특이적인 뮤린 IgG 항체인 MAb 3F12는 음성 기준으로 포함한다.

^c값은 두 개 별도 연구의 평균이다.

야생형 및 돌연변이 균주의 생장, 자가응집, 혈액응집의 특징

BHI 한천 플레이트에서 생장한 이들 세 가지 돌연변이 균주의 콜로니 모양은 야생형 모균주의 것과 다르지 않다. 유사하게, BHI 브로스에서 이들 네 가지 균주의 생장 속도 및 그 정도는 동일하지는 않지만 거의 유사하다(도 16). 본 실시예의 재료 및 방법에서 설명하는 것과 같이 실행한 자가응집 검사에서, 네가지 모든 균주는 동일한 속도의 자가응집을 나타낸다. 마지막으로, 사람 O 적혈구세포를 이용하여(Soto-Hernandez et al., 1989), 혈액응집 검사에서 야생형 모균주 및 돌연변이 균주간에 차이를 감지할 수 없다. 기준이 되는 혈액응집 연구(Soto-Hernandez et al., 1989)는 혈액응집이 각각 빠른 것과 느린 것으로 확인된 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 분리체(예를 들면, 균주 P-44, P48)쌍을 이용하여 실행한다.

사람 세포에 모렉셀라 카타르할리스( M. catarrhalis )가 흡착하는 능력에서 uspA1 및 uspA2 의 효과

예비연구에서 야생형 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주 O35E는 HeLa 세포, HEp-2 세포, Chang 공액된 세포에 in vitro에서 흡착한다는 것이 밝혀졌다. UspA1 또는 UspA2의 발현 부족이 이와 같은 흡착 능력에 영향을 주는지를 결정하기 위해, 야생형 및 세 가지 돌연변이 균주를 우선 Hep-2 세포와의 흡착 검사에 이용한다. 이와 같은 연구에서, HEp-2 세포 단층을 세척하고, 검사가 종료된 때에 트립신화된 HEp-2 세포 단층을 희석하는데 희석제로 PBS를 이용한다. 야생형 및 uspA2 돌연변이 균주 O35E.2는 HEp-2 단층에 흡착하는 수준이 비슷한 것으로 나타났다(표 31). 그러나, uspA1 돌연변이 O35E.1는 이와 같은 HEp-2세포에 잘 흡착하지 않았고, UspA1 발현 감소는 약 6배 정도 흡착 정도를 감소시켰다(표 32). uspA1 uspA2 이중 돌연변이 O35E.12에서도 흡착정도가 비슷하게 감소되었다(표 32).

균주	HEp-2 세포에 흡착^a	Chang 세포에 흡착^a
O35E(야생형)	14.7 ±4.9	51.4 ±30.8
O35E.1(uspA1 돌연변이)	2.4 ±0.9 (0.006^d)	0.8 ±0.5 (0.002^d)
O35E.2(uspA2 돌연변이)	19.1 ±7.0 (0.213^d)	55.9 ±16.7 (0.728^d)
O35E.12(uspA1 uspA2 이중 돌연변이)	2.3 ±1.8 (0.011^d)	0.6 ±0.2 (0.002^d)

^a 흡착은 30분 배양후에 사람 상피 세포에 흡착되는 고유 접종물의 비율로 나타낸다. 각 수는 두 개 별도 연구의 평균치(±S.D.)로 나타낸다.

^b 흡착된 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 단층을 세척하고 연속 희석하는데 PBS를 이용한다.

^c 흡착된 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 단층을 세척하고 연속 희석하는데 PBS-G를 이용한다.

^d 야생형 O35E 균주를 이용한 것과 비교하여 two-tailed Student t-test를 이용한 P값이다.

그러나 기준 연구에 따르면, 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)는 HEp-2 단층을 세척하는데, 그리고 흡착된 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 유기체를 연속 희석하는데 PBS를 이용한 경우에 잘 생존하지 못한다. 야생형 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 및 돌연변이 균주 10⁸ CFU를 PBS에 현탁하였을 경우에, 살아있는 세균 수는 10⁷ CFU로 감소된다. 대조적으로 0.15%(w/v) 젤라틴(PBS-G)을 포함하는 PBS를 동일한 실험에 이용하였을 경우에, 실험동안에 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 균주의 생존을 감소시키지 않았다. HEp-2 세포계 흡착 연구를 HEp-2 세포 단층을 세척하는데, 그리고 희석제로 PBS-G를 이용하는 경우에, 야생형 모균주로 수득할 수 있는 uspA1 돌연변이 흡착 시에 3배정도 감소된다. 이와 같은 발견에 기초하여, 야생형 및 uspA1 돌연변이 균주간에 관측되는 흡착 능력이 6배 정도 차이가 나는 것은 PBS 세척 및 희석제를 이용한 생존능의 문제인 것으로 보인다.

세포 흡착의 표적으로 Chang 공액된 세포와 PBS-G 세척 및 희석제를 이용한 연구에 따르면, 야생형 및 uspA1 돌연변이의 흡착 능력에 실제 차이가 있는 것으로 보인다(표 32). 야생형 및 uspA2 돌연변이는 Chang 세포에 유사한 수준으로 흡착하는 반면에, uspA1 돌연변이의 흡착정도는 야생형 모균주모다 100배 정도 적은 것으로 나타났다. uspA1uspA2 이중 돌연변이는 uspA1 돌연변이에서 얻는 것보다 휠씬 적은 것으로 나타났다(표 32).

모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 혈청 저항성에 uspA1 및 uspA2 돌연변이 효과. 모렉셀라 카타르할리스(M. catarrhalis) 대부분 질병 분리체에서 유사하게(Hol et al., 1993; 1995; 1994, Verduin et al., 1994), 야생형 균주 O35E는 in vitro에서 정상 사람 혈청에 의해 죽는 것에 저항을 한다(Helminen et al., 1993b). 혈청 저항성에서 UspA1 또는 UspA2 발현의 부족이 영향을 주는 지를 검사하기 위해, 야생형 및 세 가지 돌연변이 균주를 혈청 살균 검사로 테스트하였다. 야생형 균주(도 17, ◆) 및 uspA1 돌연변이(도 17,

)는 정상적인 사람 혈청 존재하에서도 생장할 수 있는데, 이는 UspA1 발현 부족으로 인하여, 균주 O35E.1가 정상적인 사람 혈청에 의해 죽는 것에 부정적으로 영향을 주지 않는다는 것을 말한다(도 17,

). 그러나, uspA2 돌연변이 균주 O35E.2(

) 및 uspA1 uspA2 이중 돌연변이 O35E.12(도 17,

)는 둘다 공통적으로 UspA2 발현이 부족한 것으로 이는 정상 사람 혈청에 의해 죽는다. 이와 같은 정상적인 사람 혈청에 존재하는 컴플리먼트 시스템의 열에 의한 비활성화로 이들 혈청이 두 가지 돌연변이(도 17, ○, □)를 죽이는 능력이 감쇠되었다.

여기에서 설명하는 모든 조성물 및 방법은 본 발명의 명세서를 이용하여 과도한 실험없이도 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 적절한 구체예를 통하여 설명하고 있지만, 당업자는 본 발명의 개념 및 범위를 벗어나지 않고, 여기에서 설명하는 조성물, 방법 및 방법의 후속 단계에 변화를 줄 수 있을 것이다. 좀더 구체적으로는, 동일한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다면, 여기에서 사용하는 물질 대신에 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 물질로 대체할 수 있다. 이와 같은 유사한 치환, 변형등은 당업자가 잘 인지할 것이다.

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서열표 리스트

(1)일반정보

(i)출원인;

(A) 이름; Board of Reagent, The University of Texas System

(B) 거리; 201 W. 7th Street

(C) 도시; Austin

(D) 주; 텍사스

(E) 나라; 미국

(F) 우편코드; 78701

(ii) 발명의 명칭; USPA1 and USPA2 antigens of Moraxella catarrhalis

(iii) 서열의 수; 98

(iv) 컴퓨터 판독 형태

(A)매체형태; 플로피 디스크

(B)컴퓨터;IBM PC 호환성

(C)작동시스템; PC-DOS/MS-DOS

(D)소프트웨어; PatentIn Release#1.0, Version #1.30(EPO)

(vi) 현재 출원 자료

(A) 출원번호; US60/033,598

(B) 출원일; 96.12.20

(2)서열 1에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 831개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 1

(2)서열 2에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3349bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 2

(2)서열 3에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 573개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 3

(2)서열 4에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 2596bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 4

(2)서열 5에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 892개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 5

(2)서열 6에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3381bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 6

(2)서열 7에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 624개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 7

(2)서열 8에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3295bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 8

(2)서열 9에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 941개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 9

(2)서열 10에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3538bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 10

(2)서열 11에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 610개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 11

(2)서열 12에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 2673bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 12

(2)서열 13에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 873개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 13

(2)서열 14에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3292bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 14

(2)서열 15에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 889개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 15

(2)서열 16에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 4228bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 16

(2)서열 17에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 7개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 17

(2)서열 18에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 18

(2)서열 19에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 19

(2)서열 20에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 22bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 20

(2)서열 21에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 19bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 21

(2)서열 22에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 18bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 22

(2)서열 23에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 21bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 23

(2)서열 24에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 14개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 2..13

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 24

(2)서열 25에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 4개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 25

(2)서열 26에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 30개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 26

(2)서열 27에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 13개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 27

(2)서열 28에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 9개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 28

(2)서열 29에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 4

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 29

(2)서열 30에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 14개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 11..12

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 30

(2)서열 31에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 7개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 31

(2)서열 32에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 9개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 7

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 32

(2)서열 33에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 13..15

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 33

(2)서열 34에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 34

(2)서열 35에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 5..19

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 35

(2)서열 36에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 36

(2)서열 37에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 14개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 37

(2)서열 38에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 38

(2)서열 39에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 12개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 39

(2)서열 40에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 9개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 40

(2)서열 41에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 8개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 41

(2)서열 42에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 8개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 42

(2)서열 43에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 12개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 43

(2)서열 44에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 4개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 44

(2)서열 45에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 14개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 45

(2)서열 46에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 46

(2)서열 47에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 12개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 47

(2)서열 48에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 6개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 48

(2)서열 49에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 12개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 12

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 49

(2)서열 50에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 4..8

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 50

(2)서열 51에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 22개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 51

(2)서열 52에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 21개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 52

(2)서열 53에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 13개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 53

(2)서열 54에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 13개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 54

(2)서열 55에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 55

(2)서열 56에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 21개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 56

(2)서열 57에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 22개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 11

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 57

(2)서열 58에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 22개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 58

(2)서열 59에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 12개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 59

(2)서열 60에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 12개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 60

(2)서열 61에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 23개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 61

(2)서열 62에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 14개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 12..13

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 62

(2)서열 63에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 8

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 63

(2)서열 64에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 6개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 5

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 64

(2)서열 65에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 23개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 65

(2)서열 66에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 21개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 66

(2)서열 67에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 18bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 67

(2)서열 68에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 21bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 68

(2)서열 69에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 21bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 69

(2)서열 70에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 70

(2)서열 71에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 71

(2)서열 72에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 18bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 72

(2)서열 73에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 9개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 73

(2)서열 74에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 74

(2)서열 75에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 14개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 75

(2)서열 76에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3788개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 76

(2)서열 77에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 13개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 77

(2)서열 78에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 78

(2)서열 79에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 16개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix)특징

(A)이름/키; 변형된 부위

(B)위치; 5..13

(D)다른 정보;/노트="X"="임의(any)"

(xi)서열 79

(2)서열 80에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 30개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 80

(2)서열 81에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 81

(2)서열 82에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 82

(2)서열 83에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 83

(2)서열 84에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 84

(2)서열 85에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 85

(2)서열 86에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 86

(2)서열 87에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 87

(2)서열 88에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 88

(2)서열 89에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi) 서열 89

(2)서열 90에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 90

(2)서열 91에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 91

(2)서열 92에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 92

(2)서열 93에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 93

(2)서열 94에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 94

(2)서열 95에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 95

(2)서열 96에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 29bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 96

(2)서열 97에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 24bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 이중가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 97

(2)서열 98에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 79개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 98

Claims

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)에 대한 항체의 표적이 되는 항원의 펩티드를 인코드하는 핵산에 있어서,

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 035E의 UspA1 항원(Seq ID No. 1):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 035E의 UspA2 항원(Seq ID No. 3):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 046E의 UspA1 항원(Seq ID No. 5):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 035E의 UspA2 항원(Seq ID No. 7):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 TTA24의 UspA1 항원(Seq ID No. 9):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 TTA24의 UspA2 항원(Seq ID No. 11):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 TTA37의 UspA1 항원(Seq ID No. 13):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 TTA37의 UspA2 항원(Seq ID No. 15)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제 1 항에 있어서, 핵산은

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 035E의 uspA1 DNA 서열(Seq ID No. 2):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 035E의 uspA2 DNA 서열(Seq ID No. 4):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 046E의 uspA1 DNA 서열(Seq ID No. 6):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 035E의 uspA2 DNA 서열(Seq ID No. 8):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 TTA24의 uspA1 DNA 서열(Seq ID No. 10):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 TTA24의 uspA2 DNA 서열(Seq ID No. 12):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 TTA37의 uspA1 DNA 서열(Seq ID No. 14):

모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 분리체 TTA37의 uspA2 DNA 서열(Seq ID No. 16)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산.
모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) UspA1 단백질의 잔기 582-604 부분(Seq ID No. 1) 또는 UspA2의 잔기 355-377 부분(Seq ID No. 3)으로 구성된 항원 단백질.
모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)에 대한 항체의 표적이 되는 항원 펩티드에 있어서, Seq ID No. 7의 아미노산 7개로 구성된 에피토프로 구성된 것을 특징으로 하는 항원 펩티드.
모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 감염 또는 예방을 치료하기 위한 항원 조성물에 있어서, 활성 성분으로 제1항, 제2항, 제3항, 제4항중 어느 한항에 따른 펩티드를 포함하고, 약학적으로 이용가능한 완충액 또는 희석액이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 항원 조성물.
제 5 항에 있어서, 활성 성분 펩티드에 결합된 약학 조성물에 사용되는 통상적인 캐리어가 추가 포함된 것을 특징으로 하는 항원 조성물.
제 6 항에 있어서, 캐리어는 KLH, 디프테리아 독소, 파상풍 독소, CRM197에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항원 조성물.
제 5 항에 있어서, 어쥬번트(adjuvant)가 추가 포함된 것을 특징으로 하는 항원 조성물.
제 8 항에 있어서, 어쥬번트는 지질(lipid) A`인 것을 특징으로 하는 항원 조성물.
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제1항, 제2항, 제3항, 제4항중 어느 한 항에 따른 항원 조성물로 구성된 것을 특징으로 하는 모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 백신.
제 5 항에 있어서, 항원 조성물은 포유류에서 면역 반응을 유도하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 항원 조성물.
제 1항, 제2항, 제3항 또는 제4항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)에 감염된 개체를 치료하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 항원 단백질.
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제3항 또는 제4항의 펩티드가 모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)에 대해 면역 반응을 유도하는 능력이 있는 지를 in vitro에서 스크리닝하는 방법에 있어서,

a) 제3항 또는 제4항의 펩티드를 준비하고;

b) 실험실 동물에 상기 펩티드를 투여하고;

c) 실험 동물에 모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)를 감염시키고;

d) 실험 동물에서 모렉셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 감염이 있는 지를 검사하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 in vitro에서 스크리닝하는 방법.
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