MXPA06011501A - Peptidos terapeuticos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un ligando aislado de la proteina de membrana exterior de Moraxella catarrhalis que liga a receptores CEACAM, el ligando comprende un dominio de enlace receptor que comprende una secuencia de amino acidos seleccionada del grupo descrito, o un fragmento, homologo, equivalente funcional, derivado, degenerado o producto de hidroxilacion, sulfonacion o glicosilacion u otro producto de procesamiento secundario de los mismos. La invencion tambien proporciona medicamentos y vacunas que comprenden al ligando, y su uso en el tratamiento o profilaxis de infeccion. Tambien proporciona ligando, y su uso en el tratamiento o profilaxis de infeccion. Tambien se proporciona un metodo de monitoreo o supervision para la identificacion de novedosos compuestos terapeuticos.

Description

PEPTIDOS TERAPÉUTICOS Esta invención se refiere a péptidos terapéuticos y en particular a péptidos terapéuticos que son útiles en la preparación de vacunas u otros tratamientos para infección, así como en el monitoreo o supervisión de compuestos para actividad farmacéutica potencial en el tratamiento de infecciones. Los presentes inventores previamente han identificado que moléculas de adhesión celular relacionadas a - antígeno Carcinoembriónico (CEACAMs = Carcinoembryonic antigen elated cell adhesión molecules) son receptores para patógenos de membranas de las mucosas, especialmente para patógenos respiratorios tales como Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis . CEACAMs pertenecen a la familia Antígeno Carcino Embriónico (CEA = Carcino Embryonic Antigen) , una miembro de la superfamilia Inmunoglobulina. La familia de genes CEA comprende las sub-fa ilias expresada de superficie (CEA) y secretada (glicoproteína específica de embarazo, PSG = pregnancy-specific glycoprotein) . La sub-familia asociada con membrana redefinida como molécula de adhesión celular relacionada a CEA (CEACAM = CEA related Cell Adhesión Molecule)20 comprende varias glicoproteínas relacionadas de las cuales CEACAMl es la más ampliamente expresada en tejidos humanos distintos12. Los estudios reportados por los inventores primordialmente utilizan células de ovario de Hámster chino (CHO = Chinese Hámster Ovary) transfectadas con CEACAM1 (previamente denominado CD66a y BGPc) que contiene cuatro dominios extracelulares, una región TM y una cola citoplásmica corta (S) o una larga (L) (fórmula de molécula: NAl BA2-TM-S o L) . Además, fueron empleadas construcciones truncadas solubles contienen uno o más de los dominios extracelulares. Estudios previos demostraron que tanto Neisseria meningitidis como Haemophilus influenzae hacen blanco primordialmente al dominio-N de varias CEACAMs7'9'10. Este blanco puede llevar a conexión de superficie celular así como invasión celular9. Además, bacterias pueden ligarse a CEACAMs en células fagocíticas y linfocitos T y B. Estas interacciones pueden llevar a muerte celular bacteriana8, muerte celular objetivo o inhibición de función inmune, por ejemplo de linfocitos T y B cuando N. gonorrhoeae (cercanamente relacionada a N. meningitidis) liga a CEACAMs de estos linfocitos21'22. La presencia de ligandos que enlazan CEACAM en Moraxella catarrhalis y Haemophilus influenzae ha sido un hallazgo sorprendente para los presentes inventores ya que por mucho tiempo se han asociado CEACAMs con proteínas Opa asociadas con opacidad de membrana exterior de Neisseriae y ni Haemophilus influenzae o Moraxella catarrhalis producen proteínas Opa. ' En la descripción que sigue, la presente invención se describirá con referencia particular a la infección de membranas de las mucosas, especialmente de las membranas respiratorias, o a infección del oído (especialmente otitis media) pero habrá de entenderse que la invención encuentra igual utilidad en otras áreas tales como la mucosa genital o la uretra en donde los receptores CEACAM están implicados en infección u otros procesos de enlace receptor o en algún otra parte en infección humana en donde las bacterias pueden diseminarse de las superficies de las mucosas. Los patógenos de las mucosas Neisseria meningitidis (Nm) , Haemophilus influenzae (Hi y Moraxella ca tarrhalis (Mx) son organismos específicos de humanos y residen en el tracto respiratorio superior de donde pueden diseminarse para provocar serias infecciones. Las cepas de Meningococos de distintos serogrupos pueden ser transportadas dentro de la nasofaringe de hasta 25% de individuos sanos1. Sin embargo, en una cantidad de sujetos, el organismo invade la barrera de las mucosas para provocar una de las enfermedades de más rápido avance y extremadamente seria. Los factores precisos que aumentan la susceptibilidad del huésped a la infección de meningococos, no se comprenden completamente. Aún más, la protección limitada que se logra por vacunas específicas de grupo y la no inmunogenicidad del polisacárido de grupo B, resaltan la necesidad por estudios fundamentales para comprender la susceptibilidad del huésped e identificar características sub-capsulares salientes que pudieran servir como blancos comunes para combatir meningococos. Estudios por los presentes inventores han proporcionado una comprensión de la base molecular de la colonización de meningococos, la naturaleza de sus interacciones con las células de barrera humana (epiteliales y endoteliales) así como células fagocíticas. En los últimos años, la base para colonización de las mucosas por Neisseriae comensal se ha investigado para comprender las características que diferencian entre colonizadores substancialmente inocuos y patógenos ocasionales aunque serios, tales como Nm. Además, los estudios han determinado si Neisseriae comensal pudieran utilizarse como portadores de antígenos de vacunas potenciales de Nm. Hasta 75% de individuos sanos pueden transportar cepas que pertenecen a la especie H. influenzae2. Aunque como resultado de la vacuna Hib, ha habido un decremento dramático en la incidencia de la enfermedad tipo b en el Oriente, enfermedades provocadas por cepas Hi no tipificables (NTHi) permanecen como un problema principal. NTHi provoca infecciones localizadas así como diseminadas incluyendo epiglotitis, otitis media, celulitis, neumonía, endocarditis, bactere ia y meningitis. Otitis media es uno de los problemas principales en medicina pediátrica y NTHi responsable por más de 20% de los episodios en niños durante el primer año de edad2,3. NTHi también se asocia con infecciones recurrentes y persistentes agudas en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD = chronic obstructive pulmonary dise'ase) y fibrosis cística. Qué determina infecciones recurrentes por NTHi en estos pacientes o múltiples episodios de otitis media en niños, no está claro2'3'4. Moraxella catarrhalis, otro residente del tracto respiratorio humano, a menudo se aisla eN casos de infecciones localizadas junto con Hi . Ambos organismos están asociados con sinusitis y exacerbaciones de condiciones asmáticas5,6. Mx es la tercera causa más común de otitis media en niños (que se estima responsable por 3-4 millones de casos anualmente) . También provoca infecciones del tracto respiratorio inferior en adultos, especialmente en pacientes con COPD5. En raras ocasiones, se ha asociado con infecciones diseminadas5. Tanto Hi como Mx provocan infecciones persistentes y se considera que escapan a los mecanismos inmunes del anfitrión y a los antibióticos por penetración del tejido4. Varias proteínas de membrana exterior Mx se han estudiado con respecto a sus propiedades adhesivas. Sin embargo, pocos receptores celulares para Mx se han identificado y muchos de los detalles de mecanismos patogénicos permanecen por investigar4'5'6. Un requerimiento primario para patógenos de las mucosas respiratorias es el establecimiento de contacto firme con células epiteliales respiratorias. Los objetivos de estos patógenos trópicos humanos son moléculas específicas de humanos y los estudios tienen que basarse en tejido humano in vi tro y cultivos de órganos. La conexión a menudo está mediada por estructuras variables antigénicas y de fase bacteriana. Además, cada vez es más claro que la conexión de patógenos es de múltiples facetas y la ' adaptación ambiental juega un papel significante en la forma de conexión. Aunque muchos estudios recientes han empezado a definir diversas etapas en los mecanismos de blanco u objetivo celular complejos, quedan por describirse los detalles de adaptación celular o transferencia indeseada de señales entre anfitrión-microbios. Recientes estudios por los presentes inventores han mostrado que Nm7-9 y Hi10'11 comparten algunos mecanismos distintos y otros comunes para hacer blanco en ciertos receptores en las superficies de células humanas CEACAMs12. Además, los presentes inventores recientemente han identificado que aislados clínicos de Moraxella catarrhalis también hacen blanco a las moléculas CEACAM humanas. Además, ahora se ha encontrado que la proteína de membrana exterior de Moraxella de alto peso molecular liga al receptor. Expresiones de CEACAMs en distintos tejidos12 incluyendo células epiteliales respiratorias se han demostrado24. Estas observaciones implican que hacer blanco específico de CEACAMs es de ventaja particular para bacterias respiratorias y puede haber surgido como resultado de evolución convergente. Entre los factores de adhesión elaborados por Neisseria meningitidis son pilina (fimbrias)13'14'16 y las proteínas de opacidad de membrana exterior, Opa' y Opc15'16. Pelos Nm son estructuras de proteína filamentarias largas compuestas por sub-unidades múltiples de pilina. En general se consideran como las adhesinas más importantes en las bacterias capsuladas13,14'16, debido al hecho de que la cápsula enmascara parcial o totalmente los ligandos de membrana exterior que resulta en su eficacia funcional reducida, mientras que los pelos recorren la cápsula y permanece funcional en bacterias totalmente capsuladas. Opa es una familia antigénicamente variable de proteínas y ocurre en N. meningitidis así como en N. gonorrhoeae. En meningococos, código de sitio de gen de 3-4 opa para proteínas de transmembrana relacionadas con cuatro bucles expuestos en superficie, tres de los cuales se someten a variación de secuencia16'17. Opc, otra proteína transmembrana, es substancialmente invariante15'16. En los últimos 12 años, los presentes inventores han investigado reacciones de estructura/función de pelos Nm, el potencial de virulencia de proteínas Opa y OPC e identificaron dos receptores humanos para las proteínas de opacidad de neisseria . Además, el papel de ácidos siálicos superficiales en interacciones bacterianas con células objetivo humano así como el papel de LPS y otros factores en toxicidad celular, se han estudiado por los presentes inventores. La presente invención resulta de la identificación por los inventores, de un ligando de alto peso molecular aislado de la proteína de membrana exterior de Moraxella que liga a los receptores CEACAM. El ligando puede caracterizarse por un patrón de migración SDS-PAGE que es indicativo de la familia de proteínas USP, ya que se descompone en monómeros que tienen un peso molecular de entre aproximadamente 60 y 150 kD, cuando se hierve por un periodo prolongado.

El ligando se ha caracterizado en la cepa Mx ATCC 25238 (MX2) como UspAl y su secuencia de amino ácidos determinada. El ligando además se ha caracterizado por determinar el dominio o región de enlace receptor, es decir características de péptido o péptido asociado que ligan al receptor. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un ligando aislado de la proteína de membrana exterior de Moraxella catarrhalis que liga a los receptores CEACAM, en donde el ligando es un polipéptido que consiste o comprende un dominio de enlace receptor que comprende o consiste de una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo que consiste de los residuos 463 a 863, 527 a 623, 527 a 668, 527 a 863, 427 a 623, 427 a 668 y 427 a 863 de la secuencia mostrada en la Figura 6, o un fragmento, homólogo, equivalente funcional, derivado, degenerado o producto de hidroxilación, sulfonación o glicosilación u otro producto de procesamiento secundario. En una modalidad preferida, el ligando es un polipéptido que comprende o consiste de una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo que consiste de los residuos 527 a 623, 527 a 668, y 427 a 623 de la secuencia mostrada en la Figura 6, o un fragmento homólogo, equivalente funcional, derivado, producto degenerado o de hidroxilación, sulfonación o glicosilación u otro producto de procesamiento secundario del mismo. El término ligando se emplea aquí para denotar tanto la molécula entera que liga al receptor como cualquier parte de la misma, que incluye el dominio de ligando receptor tal que retenga la propiedad de enlace de receptor. De esta manera "ligando" abarca moléculas que consisten solo del dominio ligando de receptor es decir la región o regiones de péptido requeridas para ligar el receptor. En otra modalidad preferida, el polipéptido comprende o consiste de al menos una de las secuencias conservadas dentro de las regiones 427 a 623 de la secuencia mostrada en la Figura 6, que se identifican en el alineamiento mostrado en la Figura 27. Por lo tanto, en esta modalidad, el polipéptido comprende o consiste de al menos uno de : QHSSDIKTLK, NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK, NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA, DIAQNQ , DIQDLAAYNELQD, QTEAI DALNKASS, TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK, NQADIQLHDKKITNLGILHSMV ARA VGNNTQGVA TNKADIAK, NQADIANNIKNIYELA, NQADIANNI, NIYELA. Se entenderá que los ligandos polipéptidos de la invención pueden comprender un dominio de enlace de receptor de la secuencia aquí descrita, que se modifica por la adición o eliminación de residuos amino ácido a o de las secuencias aquí descritas en cualquiera o ambos extremos N o C, estos péptidos modificados retienen la habilidad por ligar receptores CEACAM. De acuerdo con esto, la invención además proporciona un ligando que comprende o consiste de un polipéptido en donde 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ó 1 residuos amino ácido se han agregado a o eliminado de una secuencia de amino ácidos aquí descrita en cualquiera o ambos extremo N o C, en donde el polipéptido modificado retiene la capacidad por ligar receptores CEACAM y/o producir una respuesta inmune contra el péptido no modificado. De preferencia, el amino ácido en la posición 560 se retiene en el péptido modificado. Respecto a fragmentos de los polipéptidos de la invención, fragmentos de cualquier tamaño pueden emplearse en la invención, siempre que el fragmento retenga la capacidad por ligar receptores CEACAM. Puede ser conveniente el aislar un péptido mínimo que contiene solo aquellas regiones preferidas para enlace de receptor. Ligandos de polipéptido de acuerdo con la invención pueden derivarse de proteínas UspAl de Moraxella catarrhalis conocidas por truncado en cualquiera o ambos de los extremos N y C. De acuerdo con esto, la invención además proporciona una secuencia UspAl de tipo silvestre que carece de al menos (o exactamente) 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160 etc. a 520 amino ácidos del extremo N, y/o carece de al menos (o exactamente) 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160, 180 o 200 amino ácidos del extremo C. De preferencia, el truncado retiene la función de enlace CEACAM. Posibles truncados pueden seleccionarse de aquellos mostrados en la siguiente tabla, todos los cuales están dentro del alcance de la invención. Tabla I. Posibles combinaciones de truncados a los extremos N y C de proteína UspAl de tipo silvestre.

Secuencias UspAl • de tipo silvestre conocidas que pueden truncarse de esta manera, son aquellas de las cepas ATCC25238 (MX2; número de acceso GenBank AAD43465) , P44 (AAN84895), 035E (AAB96359) , TTA37 (AAF40122), 012E (AAF40118), 046E (AAF36416) , V1171 (AAD43469) , TTA24 (AAD43467) (ver Ejemplo 10, Tabla II) . Idealmente, el truncado UspAl de esta modalidad comprende o consiste de una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo que consiste de los residuos 463 a 863, 527 a 623, 527 a 668, 527 a 863, 427 a 623, 427 a 668, y 427 a 863 de la secuencia mostrada en la Figura 6, o un fragmento homólogo, equivalente funcional, derivado, producto degenerado o de hidroxilación, sulfonación o glicosilación u otro producto de procesamiento secundario del mismo; o comprende o consiste de al menos una de las secuencias conservadas dentro de la región 427 a 623 de la secuencia mostrada en la Figura 6, que se identifican en el alineamiento mostrado en la Figura 27, por ejemplo: QHSSDIKTLK, NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK, NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA, DIAQNQT, DIQDLAAYNELQD, QTEAI DALNKASS, TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK, NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK, NQADIAN IK IYELA, NQADIAN I, IYELA. Puede ser conveniente producir proteínas de fusión que contienen ligandos polipéptido como se describe aquí. De acuerdo con esto, en una modalidad adicional, la invención proporciona proteínas de fusión, que comprenden ligandos polipéptidos de acuerdo con la invención. De preferencia, una proteína de fusión de acuerdo con esta modalidad es menos que 50 por ciento idéntica a cualquier secuencia de longitud completa conocida sobre toda su longitud. Los péptidos homólogos pueden ser identificados por comparación de secuencia. Los péptidos homólogos de. preferencia son al menos 60 por ciento idénticos, más preferible al menos 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento o 99 por ciento idénticos en orden ascendente de preferencia a las secuencias péptido aquí descritas o sus fragmentos sobre toda la longitud. De preferencia, el péptido homólogo retiene la capacidad por ligar receptores CEACAM y/o producir una respuesta inmune contra las secuencias péptido aquí descritas o su fragmento. De preferencia, el amino ácido en la posición 560 o posición homologa, es lisina. La Figura 20 muestra un alineamiento de secuencias péptido de diferente origen que indica regiones de secuencia capaces de modificarse mientras que retienen la función (es decir capacidad de enlace CEACAM) . Los inventores han determinado que la habilidad de enlace CEACAM del ligando péptido se asocia con una conformación basada en alfa-helicoidal, como se determina por espectroscopia de dicroísmo circular (CD) en oposición estructura de bobina aleatoria. De acuerdo con esto, en una modalidad preferida, el ligando péptido o dominio de enlace de receptor de la invención o su fragmento u homólogo u otro derivado, ' adopta una estructura alfa-helicoidal. Opcionalmente, la estructura es una estructura helicoidal embobinada. De preferencia, la espectroscopia CD, se realiza como se describe en los ejemplos acompañantes. En una modalidad adicional, la invención proporciona péptidos que son estructuralmente homólogos a los péptidos aquí descritos o sus fragmentos. Un péptido estructuralmente homólogo es un péptido homólogo como se describió anteriormente que da un trazo de espectroscopia de dicroísmo circular (CD) indicativo de una conformación basada en alfa-helicoidal, como se muestra en la Figura 18. Mimotopes (del inglés acrónimo de mimic + epitope) de los péptidos aquí descritos o sus fragmentos también se preveen. Mimotopes pueden comprender D-amino ácidos o sustituciones de amino ácidos no naturales pero aún retienen las características funcionales de los péptidos aquí descritos, incluyendo un trazo CD indicativo de una conformación de base alfa-helicoidal. La conformación de base alfa-helicoidal revelada por los inventores indica que los péptidos aquí descritos poseen una estructura de sub-unidad globular que ho se basa en una membrana asociada para lograr la conformación apropiada para enlace CEACAM. De acuerdo con esto, en una modalidad aún adicional, la invención proporciona una molécula de sub-unidad globular que comprende el ligando péptido o dominio de enlace de receptor de la invención que no es una proteína UspAl de longitud íntegra y que es capaz de ligar receptores CEACAM sin necesidad porque esté presente una membrana exterior. De preferencia, la molécula de sub-unidad globular comprende menos de 200 amino ácidos, más preferiblemente menos de 100 amino ácidos.

Dominios de enlace de receptor estructural y/o funcionalmente equivalentes también pueden ocurrir en otras proteínas tipo UspA, ya que las proteínas híbridas ocurren en Mx que pueden contener epítopos mosaico derivados tanto de proteínas UspAl como UspA223. Ligandos que comprenden estos dominios de enlace de receptor equivalente también están dentro del alcance de la invención. La proteína de enlace CEACAM del ligando péptido significa que tiene utilidad tanto como un antígeno (es decir en una vacuna) como un "antibiótico" con lo que se administra para bloquear enlace CEACAM y de esta manera evitar el enlace y entrada del patógeno. Por lo tanto, el dominio de enlace de receptor o ligando, de preferencia es adecuado para utilizar en la prevención o tratamiento de infección. La presente invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de ligando de la presente invención junto con homólogos, fragmentos, polimorfismos, degenerados y variantes de combinación. El ligando de la invención, o sus combinaciones puede emplearse en una vacuna u otro tratamiento profiláctico de infección.

La vacuna u otro tratamiento profiláctico puede comprender cualquier adyuvante, vehículo, excipiente, aglutinante, portador, conservadores y semejantes conocidos, para proporcionar una preparación farmacéuticamente aceptable del ligando para utilizar en el tratamiento de un paciente. La invención también proporciona una preparación farmacéuticamente aceptable del ligando para utilizar en medicina. La preparación farmacéuticamente aceptable del ligando pueden emplearse en el tratamiento o prevención de cualquier enfermedad en donde receptores CEACAM se implican, por ejemplo en el tratamiento o prevención de infección, enfermedad respiratoria, enfermedades neoplásicas y condiciones asociadas de enfermedades neoplásicas y angiogénesis. De preferencia, cuando se trata de una infección, la infección es de, o ha ocurrido mediante la membrana ucosal, en especial una infección respiratoria. Más preferiblemente, el ligando se emplea como una vacuna para o en otra profilaxis o tratamiento de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis . Idealmente, el ligando se emplea para una vacuna para o en otra profilaxis o tratamiento de otitis media.

En un aspecto adicional, el ligando de la presente invención también puede emplearse para identificar reactivos de bloqueo novedosos, para utilizar como agentes terapéuticos para proteger grupos vulnerables y al público en general contra varios patógenos de mucosa. Por ejemplo, el ligando puede emplearse para identificar análogos receptores que son útiles para este propósito. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un ensayo de monitoreo o supervisión para la identificación de novedosos reactivos de bloqueo para utilizar como agentes terapéuticos, el ensayo comprende las etapas de supervisar agentes terapéuticos potenciales por su habilidad para imitar a o por su homología al ligando de la presente invención. La ' invención además proporciona agentes terapéuticos identificados por el ensayo de supervisión anteriormente mencionado. Componentes de vacuna efectivos pueden producirse al utilizar la información de los mecanismos de diana de receptor identificados por la presente invención tales como imitadores de péptidos biológicamente activos. Estos pueden evitar colonización/invasión bacteriana de mucosa así como producir anticuerpos que pueden ser de bloqueo, opsónicos y bactericidas.

Secuencias péptido biológicamente activas bacterialmente derivadas, identificadas por el ligando de la presente invención, pueden emplearse para estudiar los papeles de CEACAMs en cáncer y desarrollo como las moléculas se asocian con estos procesos. Estos también tienen potencial como agentes antí-cáncer y para controlar o de otra forma en el tratamiento de angiogénesis. La información generada por los inventores respecto a la conformación de ligando péptido de la invención, puede emplearse para diseñar una nano estructura sintética, por ejemplo a partir de plástico. Esta estructura tendrá las ventajas de ser resistente a degradación biológica y no-inmunogénica. Como tal, sería particularmente útil como un "antibiótico" que actúa para evitar, ligar y entrada de patógeno al bloquear receptores CEACAM. En una modalidad adicional, la invención proporciona el uso de ligando de enlace-receptor CEACAM en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad en donde están involucrados los receptores CEACAM en diana celular del patógeno que provoca la' enfermedad, en donde el ligando comprende o consiste de una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo que consiste de los residuos 463 a 863, 527 a 623, 527 a 668, 527 a 863, 427 a 623, 427 a 668, y 427 a 863 de la secuencia mostrada en la Figura 6, o un fragmento, homólogo, equivalente funcional, derivado, producto degenerado o de hidroxilación, sulfonación o glicosilación u otro producto de procesamiento secundario. Otros ligandos adecuados para utilizar en este aspecto de la invención son polipéptidos que comprenden o consisten de al menos una de las secuencias conservadas dentro de las regiones 427 a 623 de la secuencia mostrada en la Figura 6, que se identifican en el alineamiento mostrado en la Figura 27, por ejemplo: QHSSDIKTLK, NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK, NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA, DIAQNQT, DIQDLAAYNELQD, QTEAIDALNKASS, TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK, NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK, NQADIANNIKNIYELA, NQADIANNI, NIYELA. De preferencia, la enfermedad se elige del grupo que consiste de infección, enfermedad respiratoria, enfermedad neoplásica y condiciones asociadas de enfermedad neoplásica y angiogénesis. Medicamentos como se describió anteriormente son de utilidad particular en donde el patógeno infecta o entra en una membrana de mucosa. Se describen aquí medicamentos particularmente útiles en el tratamiento o prevención de infecciones (enfermedad) provocadas por Moraxella catarrhalis . Sin embargo, se describen aquí ligandos como útiles en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de cualquier enfermedad en donde están, implicados receptores CEACAM tales como enfermedades provocadas por Neisseria meningitidis y Haemophilus influenzae. En una modalidad particularmente preferida, la enfermedad es otitis media. Ligandos de la invención también pueden emplearse en el tratamiento de enfermedades provocadas por otras bacterias orales tales como caries dental. La bacteria oral Fusobacterium nucleatum está asociada con enfermedad de las encías pero también está enlazada con otitis media, partos de mortinatos en raros casos con bacteremia. Recientes trabajos por los inventores han mostrado que varios aislados de Fusobacterium nuclea tum ligan a CEACAMs y que el enlace de CEACAM 1 con F. nuclea tum puede ser inhibido por un ligando polipéptido como aquí se describe, sugiriendo que ligandos o dominios de enlace de receptor de la invención, tienen utilidad en el tratamiento o prevención de enfermedades provocadas por este patógeno. La habilidad de D-7, un ligando polipéptido preferido de acuerdo con la invención para bloquear interacciones de bacterias sin cápsula (no mostradas) o encapsuladas con HeLa-CCl H (Ejemplo 7), para bloquear el enlace a múltiples CEACAMs y su eficacia contra una cantidad de especies oportunistas de mucosa (Ejemplo 7), lo hace un agente anti-microbiano con potencial significante. Además, su habilidad para evocar respuesta de anticuerpo que bloquea adhesión Mx (Ejemplo 8) sugieren su potencial como un candidato de vacuna, solo o como parte de una vacuna de múltiples componentes (junto con otros antígenos Mx tales como: UspA2, Hag/MID, OMPCD, Mcap) para evitar otitis media o infecciones pulmonares en donde Mx, a menudo está implicado 5. Vacunas con base en adhesinas han sido empleadas exitosamente, por ejemplo contra Escherichia coli uropatogénica en un modelo de cistitis de ratón por vacunación sistémica 29. La inclusión de un ligando de acuerdo con la invención como una droga profiláctica, puede considerarse en una variedad de situaciones en donde el riesgo de adquirir cepas resistentes a antibióticos o particularmente virulentas, es elevado y puede suministrarse por aplicación tópica directa o mediante probióticos. En el caso de bacterias que se conectan a tejidos diana mediante interacciones carbohidrato-lectina, carbohidratos solubles han evitado exitosamente infecciones en modelos in vitro y de animales30' 31' 32. Aplicación tópica de un péptido sintético correspondiente a una región de proteína Streptococcus mutans SAI/II", se muestra que inhibe el enlace por S. mutans en sujetos humanos. El estudio empleó péptido a 1 µg.ml"1 en un lavado bucal, diariamente por dos semanas y éste fue suficiente para, evitar colonización 33. Probióticos en la forma de lactobacilos se han empleado para evitar numerosas infecciones 34' 35. Además, una cepa de E. coli recombinante, se ha empleado como un probiótico en donde se modificaron genes LPS para codificar un imitador estructural del receptor de toxina Shiga. Administración oral de esta cepa se muestra que evita muerte de ratones de ataque letal con E. coli que produce toxina shiga36. Péptidos de interferencia aplicados tópicamente tienen una ventaja adicional ya que pueden suministrarse cuando y donde se requiera por el uso de probióticos transitorios o por vectores de expresión que pueden ser controlados por la sincronización o los niveles de expresión. De esta manera la longitud de exposición al agente antimicrobiano puede ser controlada37' 38. La interferencia al hacer diana del dominio de enlace del receptor, imita la adherencia bacteriana y es poco, probable que tenga efectos nocivos sobre y por encima de enlazar ligandos bacterianos comensales 'nativos. También, esta estrategia específica asegura tolerancia hacia otras microfloras comensales, muy pocas de las cuales ligan a CEACAMs7' 10' 38. Aún más, la naturaleza monomérica y monovalente de la forma predominante del péptido es menos probable que dispare señalización indeseable que, para CEACAMs, parece ser inducida en enjambrado de receptor11, 39. Puede existir alcance para mejora de D-7 al identificar adicionalmente aminoácidos críticos involucrados en interacción de CEACAM y modificaciones para reducir su tamaño mientras que se asegura el enlace al igual que su longevidad in vivo . Estas modificaciones pueden incluir incorporación de D-aminoácídos o ácidos no naturales33. La resistencia a estos tratamientos anti- adhesiv /anti-invasivo es poco probable que ocurra, ya que cualesquiera cambios en el ligando bacteriano probablemente ellos mismos llevan a pérdida de función y en este caso colonización/infección. La emergencia de mutantes con especificidad de receptor completamente alterada debido a competencia de péptido, no se esperará que surja más frecuentemente que lo usual ya que la competencia por receptor es probable entre los patógenos en la situación natural. De esta manera, D-7 tiene el potencial por servir como un agente anti-adhesivo contra varios patógenos y como un candidato de vacuna. Modalidades de la presente invención ahora se describirán puramente a manera de ejemplos no limitantes, en donde se hace referencia a las figuras de las cuales :- La Figura 1 es una gráfica que muestra niveles de enlace relativos de CEACAMl-Fc (lµg. mi-1) construcción de receptor soluble sola (barras blancas, a mano izquierda) , o en la presencia de anticuerpo específico de dominio-N YTH71.3 CEACAM1 (barras grises, centro) a 3 cepas de Mx inmovilizadas en nitrocelulosa. Enlace de CD33-Fc en cada caso fue despreciable (barras a mano derecha, negras). Las cepas 1, 2, 3: MX2 (ATCC 25238), MX3, MX4 (aislados clínicos) respectivamente. El enlace se determina en una superposición de tinción por puntos y la intensidad de reacciones se cuantifica por análisis densitométrico utilizando el programa de Imagen NIH Scion. La Figura 2 muestra una tinción Western de las proteínas de cepa MX2 separadas bajo no-disociación (sin calentar, pista 1) o después de ebullición por 10 minutos (pista 2) . La tinción se superpuso con CEACAMl-Fc (lµg. mi-1) y el enlace receptor detecta con anticuerpo Fe antihumano conjugado a peroxidasa de rábano picante y su substrato. La Figura 3 muestra tinciones Western de Usados de células enteras desnaturalizados de cepas MX2, -3, -4 (pistas 1-3 respectivamente) en donde se superponen con CEACAMl-Fc (lµg. mi-1; a) , anticuerpo de péptido anti-UspAl (lOµg. mi-1; b) y anticuerpo péptido anti-UspA2 (lOµg. mol-1; c) . Hay que notar el perfil de migración similar de proteínas de enlace CEACAMl-Fc y proteínas de enlace y anti-UspAl en las tres cepas. Los restos de proteínas no disociadas en c. 250 kDa, (detectada en este caso debido a superior sensibilidad de detección en el ensayo de fosfatasa alcalina) , ligan a CEACAMl-Fc. Estos solo se reconocen débilmente por los anticuerpos anti-péptido, supuestamente ya que los epítopes contenidos dentro de péptidos sintéticos no están completamente expuestos en la proteína nativa, que se vuelve progresivamente expuesta conforme se desnaturaliza el complejo. Anticuerpos Anti-UspA2 ligan a proteínas de masas aparentes > 200 kDa, que permanecen sin disociar después de hervir, una propiedad indicativa de proteínas UspA2.

La Figura 4 muestra un espectro de masa de péptidos trípticos de la proteína de enlace CEACAM1 de MX2 después de electro-elución (4a) . El resumen de datos alimentados en la base de datos de identificación de proteína ProFound se ilustra en (4b) . Una tabla de las diez proteínas identificadas superiores y los valores de probabilidad se ilustran en (4c) . Detalle del número 1 tuvo un rango de candidato, en este caso UspÁl con una calificación de Z- de 2.34 se muestra en (4d) indicando el número de péptidos que corresponden, sus posiciones dentro de la proteína, el % de la proteína cubierta y una lista de péptidos que no corresponden en esta ocasión. La Figura 5 muestra análisis de técnica Western de fragmentos trípticos de UspAl de MX2. A: tinción de control utilizando anticuerpos secundarios (mezcla de Fe anti-humano-cabra e Ig anti-conejo cabra utilizadas en B y C) . B: tinción superpuesta con CEACAMl-Fc y anti-humano-cabra. C: tinción superpuesta con anticuerpos de conejo purificados por afinidad desarrollados contra péptido UspAl (ETNNHQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR SEQ ID NO:l)) (ver Figura 6) e Ig anti-conejo. * = pistas con marcadores de peso molecular-mostrados a la izquierda.

Los péptidos mostrados por las dobles flechas reaccionan fuertemente con CEACAMl-Fc (B) así como los anticuerpos de péptido anti-UspAl (C) . El enlace de los anticuerpos péptido anti-UspAl al péptido MW más bajo (flecha con cabeza) identifica este fragmento de enlace CEACAM como el fragmento C-terminal contenido dentro N-199 a K-863 de UspAl de MX2 (ver Figura 6) . La Figura 6 muestra la secuencia de amino ácidos de la proteína MX2 UspAl (SEQ ID N0:2). Péptido específico de UspAl utilizado para desarrollar anti-suero de conejos se ilustra con negritas. La región de enlace CEACAM está contenida en el fragmento C-terminal subrayado de UspAl de MX2. La Figura 7 muestra la separación de péptidos trípticos que reaccionan con CEACAMs . La cepa M. catarrhalis MX2 se trata con 1 mg/ml de tripsina a 37 grados C por 10 minutos. La muestra tripsinisada se somete a SDS-PAGE. Después de tinción, la región de 50 kDa se electroeluye durante la noche. La proteína electroeluida se secó por congelamiento y resuspendió en amortiguador y aplica a un segundo gel. Parte del gel se tiñó con nitrocelulosa y bandas de péptido que reaccionan con CEACAM se identificaron por superposición de técnica Western utilizando CEACAMl-Fc (Tinción) . '*': denota bandas de péptido enviadas para secuenciado N-terminal. La Figura 8 muestra la secuencia de amino ácidos de un péptido tríptico de proteína MX2 o UspAl (SEQ ID N0:3). El péptido tríptico 50 kDa mostrado (amino ácidos 463 a 863) liga CEACAM y antisuero contra péptido UspAl (amino ácidos 753-780 subrayados) . La secuencia N-terminal del péptido de enlace CEACAM de c. 50 kDa es "ALESNVEEGL" (SEQ ID NO: 4) que ocurre después del sitio de escisión de tripsina en el amino ácido 462. La Figura 9 muestra una representación diagramática de las posiciones de cebadores o iniciadores utilizados para generar fragmentos de gen uspAl para la expresión de péptidos recombinantes. El sitio de enlace CEACAM1 se codifica por ADN amplificado por los cebadores P4 y P7, cebadores adicionales a través de esta región (letras A-I) fueron designados y empleados. La Figura 10 muestra la secuencia del fragmento recombinante 4-7 (SEQ ID NO: 5). La región subrayada de la región N-terminal del péptido tríptico CEACAMl-reactivo. El peso molecular pronosticado del fragmento 4-7 es c. 26 kDa. El MW pronosticado del fragmento etiquetado His: c. 28kDa.. La posición del péptido truncado se ilustra por 'T' (ver Figura 13) . La Figura 11 es un diagrama que muestra la estrategia general de clonación, expresión y purificación para péptidos UspAl recombinantes, como se ejemplifica por el sistema pQE30. La Figura 12 es un mapa del vector pQE30.

La Figura 13 muestra enlace de CEACAMl-Fc en superposición de tinción a recombinantes polipéptidos 4-8 (pista 3), 4-T (pista 4) y 4-7 (pista 5). La pista 1 contiene un péptido recombinante de control de Treponema y la pista 2 contiene usados de M15 no inductores que contienen construcción 4-8. La Figura 14 muestra tinciones Western que ilustran reactividad de péptido recombinante con anticuerpo de etiqueta anti-His (superior) y CEACAMl-Fc (fondo) . Las pistas 2-4 contienen 6-8 péptidos, la pista 1 contiene 4-8 como control. Posiciones de migración pronosticadas de los péptidos se ilustran a la derecha. Ambos péptidos ligan anticuerpo anti-His. Sin embargo, mientras que 4-8 liga a CEACAMl-Fc, 6-8 no. La Figura 15 muestra que el polipéptido D-8 liga CEACAMl-Fc (pista 1) pero no CD33-FC utilizado como un control (pista 2) . El origen de este péptido se confirma por reactividad con el anticuerpo de etiqueta anti-His (pista 3) . La Figura 16 es un diagrama esquemático que ilustra los tamaños y posiciones relativas de fragmentos rUspAl. Recombinante 4-7 se ha empleado para bloqueo bacteriano ver Figura 17. La Figura 17 muestra transfectores CH0-CEACAM1 fueron incubados en la ausencia de péptidos (A) o con péptido de control recombinante (un péptido de treponema, B) o péptido UspAl r4-7 (secuencia, que corresponde a la cepa MX2, C y D) a las concentraciones mostradas y bacterias agregadas por un periodo de 2 horas. Al final de esta incubación, bacterias no ligadas se lavaron por arrastre y bacterias ligadas se detectaron con anti-suero policlonal anti- . catarrhalis y anticuerpo secundario conjugado TRITC. A 1 µg/ml inhibición significante de una cepa M. ca tarrhalis heterólogas (MX1) se obtuvo y a 10 µg por mi, enlace de H. influenzae se inhibió significativamente por el péptido recombinante M. catarrhalis UspAl. La Figura 18 es una gráfica que muestra los espectros de dicroísmo circular de péptido D-7 recombinante y D-7 con mutación K 560 I. Los espectros indican que D-7 tiene una estructura alfa-helicoidal mientras que D-7 (K 560 I) adopta una formación de bobina aleatoria. La Figura 19 muestra una serie de péptidos lineales que se extiende por la región D-7 que no ligan CEACAM1. El residuo K correspondiente a K560 de D-7 está subrayado. La Figura 20 es un alineamiento.de la región D-7 de las secuencias de aminoácidos de las proteínas UspAl de diez cepas de Mx: TTA24, TTA37, p44, 012E, 035E, 046E, MX2, V1171, MX3 y MX4. La línea superior muestra la secuencia de mayoría. La Figura 21 es un alineamiento manual de 035E D-7 contra MX2 D-7. La línea superior muestra la secuencia de mayoría. La Figura 22 es una tabla que muestra identidad de secuencia de regiones D-7 de aislados Mx como se determina por MegAlign® (DNASTAR Inc.). La Figura 23 muestra D-7 de péptido recombinante (pero no recombinante 6-8, es decir residuos E659-K863 de UspAl de MX2) inhibe el enlace de ambas cepas homologas y heterólogas a células CHO transfectadas que expresan CEACAMl. Después de preincubación de células ya sea sin péptido (columna 1) , péptido de control (2 µg.rnl"1; columna 2) , o D-7 (2 µg.ml-1; columna 3) se agregaron bacterias y bacterias no adherentes se retiraron al lavar después de una hora de incubación. Bacterias asociadas con células después se detectaron utilizando antisueros desarrollados contra distintas cepas y anticuerpos secundarios conjugados con rodamina. Mx: Moraxella catarrhalis, Nm. Neisseria meningitidis; Hi: Haemophilus influenzae. La Figura 24 es una serie de diagramas que muestra la inhibición de interacciones bacteriana-CCl-Fc por D-7. (a) Una inhibición dependiente de dosis del enlace receptor a la cepa Mx homologa MX2 (columnas grises) y a una cepa heteróloga MXl (columnas negras) se exhibe sobre el intervalo de concentración de péptido 0.001-0.1 µg.ml-1. C representa el péptido de control D-8delta. Valores promedio se muestran n=3, *P<0.015 respecto a CCl-Fc solo, (b) D-7 recombinante (columnas negras) pero sin D-8delta (columnas grises) inhibe el enlace de múltiples cepas tanto de especies homologas como heterólogas (como indicó anteriormente cada gráfica) a CCl-Fc. Lisados de células enteras de distintos aislados de diferentes géneros se aplicaron por puntos en nitrocelulosa y cubrieron con CCl-Fc solo o en la presencia de los péptidos (2 µg.ml-1 cada uno) . Valores de por ciento (%) de inhibición en la presencia del péptido respecto a su ausencia se obtuvieron por análisis densitométrico utilizando el programa NIH Scion Image. Datos son representativos de dos a tres experimentos independientes . La Figura 25 muestra que D-7 inhibe enlace bacteriano a un intervalo de líneas celulares que expresan CEACAM. (a) Análisis de inmunofluorescencia de interacciones bacterianas con células CHO transfectadas que expresan CEACAM1 después de preincubación de células sin o con péptidos (2 µg.ml-1) como se indica.

La inhibición de adherencia de bacterias visualizadas por etiquetado con rodamina se observa en la presencia de D-7. (b) Análisis cuantitativo de inhibición de enlace bacteriano a células CH0-CEACAM1 utilizando un ensayo de conteo viable. Mono-capas diana se pre-incubaron con péptido de control (2 µg.ml-1; C) o un intervalo de D-7 como se muestra. Valores promedio de % de inhibición con D-7 comparado con el péptido de control, se ilustran (n=3-6, *P<0.05). Cepas empleadas en a y b fueron: Mx(MXl), Nm (C751 D) , Hi (THi, Rd) y Hi-aeg (A3) , (c) inhibición de Nm (C751 D) que liga a distintos CEACAMs por D-7. Células HeLa que expresan CEACAM1 (CC1) , CEA o CEACAM6 (CC6) se pre-incubaron con cualquiera de sin péptido, péptido de control (2 µg. l-1; columnas grises) , o D-7 (2 µg.ml-1; columnas negras) . Números promedio de Nm adherentes por células se obtuvieron utilizando un ensayo de inmunofluorescencia y por conteo directo de 20 células en cada caso. (d) Una línea celular HeLa con altos niveles de expresión CEACAM1 (HeLa-CCIH) que soporta adhesión mediante vellos y proteína Opa, se infectó con hl8.18, un derivado en cápsula y con vellos de la cepa MC58 que expresa adhesinas Opa y Opc. La adhesión celular se reduce con previa (pre) o simultánea (sim) adición de D-7 pero no D-ddelta como se indica. (e) Inhibición de interacciones bacterianas con células epiteliales de pulmón A549 conocidas que expresan CEACAMs después de preincubación de células ya sean sin péptido, péptido de control (2 µg.ml"1), o D-7 (2 µg.ml-1) como se indica. Cepas empleadas fueron Mx(MXl), Nm (C751 D) y Hi (Hi-aeg, A3) . La Figura 26 es un diagrama que muestra que el anticuerpo de conejo purificado por afinidad que se desarrolla contra D-7, inhibe tanto enlace Mx homólogo como heterólogo a toCEACaMl-Fc (CCl-Fc) . En un experimento de revestimiento por puntos-transferencia el enlace respecto a sin control de anticuerpos se determina por análisis densitométrico, utilizando el programa o soporte lógico NIH Scion Image. Se observó buena inhibición para las cepas Mx probadas pero no para otras especies bacterianas probadas incluyendo Hi (THi Rd & Hi-aeg A3), Nm (C751A & C751 D) y Ng (P9-13) . Datos son representativos de tres experimentos independientes. La Figura 27 muestra adhesión de N. meningitidis a células HMEC1 sólo (A) o en la presencia de péptido de control (B) o el péptido de bloqueo D-7 (C) . Se debe notar la inhibición completa virtual en la presencia de D-7. La Figura 28 es un alineamiento múltiple de fragmentos de secuencias de proteína UspAl conocidas correspondientes al fragmento 4-T de la secuencia MX2.

Residuos que se conservan en todas las secuencias analizadas se sombrean de negro. Residuos que se conservan en todas las secuencias en donde están presentes, pero que hay una eliminación de la posición correspondiente en una o más secuencias, tienen sombreado gris oscuro. Cuando hay variación en el residuo presente en esa posición, los residuos consenso se sombrean de gris claro. Ejemplo 1. Cepas Moraxella ca.tarrha.lis ligan a CEACAM1-Fe de humano mediante las proteínas UspAl Las cepas de Moraxella catarrhalis (Mx) empleadas en este estudio incluyen aislados clínicos (MX3 y MX4) así como la cepa de referencia adquirida de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC 25238, un cultivo clonal dé este fue designado MX2) . Ensayos de superposición de receptor muestran que Mx liga a construcciones de receptor CEACAMl-Fc Para estimar la interacción de cepas de M. catarrhalis con CEACAMl, bacterias (c. 4-8 x 106) se aplicaron a nitrocelulosa, secaron al aire y sitios de enlace no específicos bloquearon en BSA-PBST al 3%. Tiras de nitrocelulosa se revistieron ya sea con CEACAM1-Fc (1-2 µg mi-1) solo o en la presencia del anticuerpo de N-dominio CEACAMl YTH71.3. CD33-FC (1-2 µg mi-1) se empleó como un control negativo. Construcciones de proteína quimérica se prepararon como se describió previamente11. Enlace de receptor quimérico se detecta por anticuerpos Fe anti-humano cabra conjugados ya sea a peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. Se revelaron tinciones o transferencias ya sea con diamino benceno y peróxido de hidrógeno o nitro azul tetrazolio y substratos de 5-bromo-4-cloro-3-indoilfosfato, respectivamente. Todas las cepas Mx ligaron a CEACAMl-Fc pero no a CD33-Fc (Figura 1) . El enlace de receptor se inhibió en la presencia de anticuerpo monoclonal YTH71.3 sugiriendo que las cepas ligaron al dominio N terminal del receptor. De acuerdo con esto, todas las cepas ligaron igualmente bien a la construcción N-Fc truncada de CEACAM1, que solo contiene el dominio N (no mostrado) . Identificación de proteína de enlace CEACAMl-Fc de M. catarrhalis Lisado de células enteras de Mx (c. 3 x 107) se aplicaron a pistas individuales de un gel de bis-trispoliacrilamida al 10% (invitrogen) ya sea sin tratamiento térmico previo o después de calentamiento a 100 grados C por 10 minutos y sometieron a electroforesis por 45 minutos a 180 V. Proteínas de los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando condiciones de transferencia o tinción estándar. Membranas de nitrocelulosa se revistieron con construcciones quiméricas solubles como se describió anteriormente. En cada caso, se observó una sola proteína que ligó específicamente a CEACAMl-Fc. La migración de la proteína en geles fue indicativa de la proteína UspAl de Mx, ya que cuando se aplicaron lisados bacterianos sin desnaturalización con calor, las proteínas de enlace CEACAM1 migraron con una masa aparente de > 200 kDa mientras que cuando los lisados primero se calentaron, las proteínas de enlace CEACAMl migraron con una masa reducida de aproximadamente 92 kDa (Figura 2) Anticuerpos desarrollados contra UspAl pero no aquellos contra una proteína similar UspA2 ligada a las proteínas de enlace CEACAMl-Fc de cepas Mx Se diseñaron péptidos de acuerdo con las secuencias publicadas para las proteínas UspA de las cepas M. ca tarrhalis . Es decir, ETNNRQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR (SEQ ID NO:l; UspAl-péptido) y KDEHDKLITANKTAIDANKAS (SEQ ID NO: 6; UspA2-péptido) . Se acoplaron péptidos con KLH mediante un residuo cisterna N-terminal que se incorporó y se utilizaron para inmunizar conejos (200 µg de péptido por conejo) a intervalos de 14 días, inicialmente con adyuvante completo de Freund y posteriormente con adyuvante Freund incompleto. Los conejos se desangraron a intervalos en el día O y el día 14 posteriores a inmunización. Anticuerpos policlonales se purificaron utilizando el péptido apropiado acoplado a columnas AminoLink Plus (Pierce) . Anticuerpos específicos de UspA se utilizaron a una concentración de 1-10 µg mi-1 para revestimiento de transferencia o tinción Western y detectaron con anticuerpo secundario anti-conejo cabra acoplado a fosfatasa alcalina. Se revelaron tinciones como se describió previamente. La migración de las proteínas de enlace CEACAMl-Fc en SDS-PAGE de las tres cepas Mx fue idéntica a la de las proteínas de enlace anticuerpo UspAl pero no a las proteínas de enlace anticuerpo UspA2 (Figura 3) . Ligando de M. catarrhalis que co-precipita con CEACAMl-Fc se identifica como UspAl Cultivos durante la noche de bacterias se suspendieron en octil ßD glucopiranósido 100 mM en PBSB que contiene un cóctel inhibidor en proteasa (pie; PMSF 1 mM, E-64 1 µM, pepstatina A lµM, bestatina 6 nM y EDTA lOOzM) . Las muestras se mezclaron extremo sobre extremo durante la noche a 4 grados C. Mientras tanto, 100 µl de proteína A acoplada a sepharose CL-4B (Sigma) se incubaron ya sea con 20 g de CEACAMl-Fc o CD33-FC (utilizado como control) durante la noche a 4 grados C y subsecuentemente lavó 3 veces con PBSB para retirar cualquier receptor no ligado. ' Material bacterial insoluble se retiró por centrifugación a 15,000 g por 30 minutos. Extractos solubles se incubaron ya "sea con complejo receptor-Proteína A sepharose por 2h a 4 grados C (en una proporción de 5xl08 bacterias por µg de construcción de receptor) . Siguiendo un lavado extenso con octil ßD glucopiranósido 50 mM y muestras PBSB se analizaron por electroforésis SDS-PAGE y técnica Western bajo condiciones de desnaturalización. En experimentos de co-precipitación con CEACAMl-Fc, MX4 produjo una proteína de fuerte tinción de apr. 97 kDa y MX3 produjo una proteína de tinción relativamente débil de apr. 92 kDa. Las masas de proteínas co-precipitadas correspondieron con aquellos observadas en los experimentos de revestimiento del receptor (mostrados en la Figura 3) . Ninguna proteína co-precipitó con CD33-Fc. Las proteínas co-precipitadas se identificaron adicionalmente como proteínas UspAl ya que se ligan a anticuerpo de péptido anti-UspAl. Además, después de escisión del gel, la proteína MX4 se sometió a espectrometría de masas MALDI-TOF (ver a continuación) . Identificación de ligando CEACAM1 por espectrometría de masas MALDI-TOF (a) Muestras de revestimiento Western. Lisados celulares enteros de MX2 y MX3 se sometieron a SDS-PAGE en geles zanja y la banda de proteína correspondiente a ligando de enlace CEACAMl-Fc se electroeluyó del gel. La muestra se concentró y volvió a aplicar en una sola pista de un segundo gel, sometido a electroforésis antes de digestión de tripsina en gel de la proteína apropiada. Los péptidos resultantes se analizaron por espectrometría de masas de desorción láser asistida con matriz/ionización-tiempo-de-vuelo (MALDI-TOF = Matrix-assisted Láser desorption/ionisation-time-of-flight) . Un ejemplo del espectro de masas resultante se ilustra para la proteína de enlace CEACAM de MX2 (Figura 4a) . Las masas de péptido obtenidas se alimentaron al sitio de identificación de proteínas ProFound y los resultados se obtuvieron como se ilustra para esta proteína (Figura 4b, c) . En este caso, masas -de 10 péptidos correspondieron con las masas pronosticadas para péptidos trípticos de UspAl de M. ca tarrhalis que cubren aproximadamente 18% de la proteína (Figura 4d) . La calificación de Z estimada de 2.34 sugiere fuertemente que la proteína sea UspAl (calificación Z > 1.65 sobre el percentil 95avo; http: /129.85.19.192/profound_bin/webProFound. exe) . Además, otra banda de alto peso molecular sin enlace de MX2 se identificó como UspA2 después de un análisis similar. De manera semejante para la cepa MX3, las proteínas de enlace y no enlace CEACAMl se identificaron como UspAl y UspA2, respectivamente. (b) Muestras co-precipitadas: Para MX4, la proteína co-precipitada de CEACAMl-Fc (como se describió anteriormente) también se identificó como UspAl por MALDI-TOF MS con una calificación Z de 2.27 en una búsqueda de todos los taxones. Se alinearon 12 péptidos cubriendo 21% de la proteína. Este estudio por lo tanto ha identificado que Moraxella catarrhalis hace blanco en CEACAM1 humano mediante la proteína de alto peso molecular UspAl en la referencia y las cepas clínicas indicadas. Escisión enzimática de UspAl y péptido recombinante (a) Péptidos trípticos, de UspA 1 ligan a CEACAMl-Fc Suspensiones bacterianas de MX2 (1010 mi-1) se trataron con Tripsina (Sigma) a 0.1-1 mg/ml concentraciones e incubaron por 1-4 horas a 37 grados C. Lisados digeridos se disociaron en amortiguador SDS-PAGE, hirvieron y sometieron a electroforésis. Después de transferencia a nitrocelulosa, las tinciones se cubrieron con la construcción de receptor CEACAMl-Fc o los anticuerpos de péptido anti-UspAl purificados por afinidad. Un pequeño fragmento que reaccione con el receptor también ligó a los anticuerpos específicos anti-UspAl (Figura 5) . (b) Localización de dominio de enlace CEACAM de UspA2 de la cepa M. catarrhalis MX2 Las suspensiones bacterianas MX2 se trataron con Tripsina a 1 mg/ml por 10 minutos a 37 grados C. La muestra tripsinizada se corrió en un gel SDS-PAGE. Después de tinción, la región de 50 kDa se electroeluyó durante la noche. La proteína electroeluida se secó por congelamiento y resuspendió en amortiguador y aplicó a un segundo gel. Parte del gel se tiñó en nitrocelulosa y bandas de péptido que reaccionan con CEACAM, se identificaron por superposición de técnica Western utilizando CEACAMl-Fc. (Figura 7) . Bandas de péptido correspondientes a los péptidos de aproximadamente 50 kDa y aproximadamente 150 kDa se sometieron a secuenciado N-terminal. Las secuencias N-terminales fueron ALESNVEEGL (péptido aprox. 50 kDa) y ALESNV (SEQ ID NO:7) (péptido aprox. 150 kDa). La proteína de 150 kDa es aparentemente un trímero de la proteína 50 kDa ya que tienen la misma secuencia N-terminal. La secuencia N-terminal de este péptido de MX2 UspAl se ilustra en la Figura 8. (c) Péptido Recombinante El péptido MX recombinante N-terminal que fue construido consiste de amino ácidos 1 a 449 de la secuencia mostrada en la Figura 6 no liga CEACAM. Esto además indica que el péptido tríptico de aprox. 50 kDa que consiste de los amino ácidos 463 a 863 de la secuencia mostrada en la Figura 8, que tiene ALESNVEEGL de secuencia N-terminal contiene el dominio de enlace CEACAM. Ejemplo 2. Identificación de Dominios de Enlace de Receptor en Determinantes de Virulencia Múltiples de Patógenos de las mucosas N. meningitidis y H. influenzae hacen blanco con moléculas CEACAM humanas por ligandos que se unen a sitios de superposición en CEACAM. Los ligandos Mx de la presente invención también hacen blanco al dominio N. Estas observaciones dirigen a una posibilidad emocionante que características similares en ligandos de varios factores patógenos de las mucosas pueden estar involucradas para hacer blanco en receptor. Ya que las interacciones Nm y Hi con CEACAMs se afectan por las características estructurales de los dominios variables expresados en superficie, esto sugiere que pueden contener similares amino ácidos cruciales en una configuración espacial, que son capaces de ligar al receptor y estos pueden conservarse en proteínas de otra forma variable. Sin duda, nuestros estudios y aquellos de otros sugieren que dos bucles hiper-variables de Opa (HV1 y HV2) pueden estar involucrados en hacer blanco en CEACAM9'18. Una técnica poderosa que puede identificar posible determinantes de interacciones entre ligandos y receptores es exhibición de fago, que puede utilizarse para identificar mimotopes (secuencias aleatorias que imitan los dominios de enlace)19 así como aptómeros (secuencias más cercanamente relacionadas a la estructura original que inhibe el enlace de ligando)20. La presente invención también hace altamente factible que el dominio de ligando Mx que liga CEACAMs actuará como un mímico para otros patógenos de las mucosas de enlace CEACAM y las características estructurales de este ligando ayudarán a identificar las características sobresalientes requeridas en ligandos Nm y Hi para hacer blanco en el dominio N de CEACAM. Anticuerpos del dominio Mx pueden tener el potencial de identificar otros ligandos que tienen la capacidad para hacer blanco a la región misma, similar o cercanamente ubicada del receptor. La identificación del dominio de enlace CEACAMl mínimo de MX2 UspAl se realiza utilizando métodos conocidos de la tecnología de ingeniería de proteínas y ADN recombinante. Péptidos recombinantes pueden ser supervisados in vitro por ensayos de revestimiento de receptor descritos anteriormente para detectar el dominio de MX2 que liga al receptor. Péptidos etiquetados His pueden separarse en una columna de níquel, escindirse con His-Tag como se requiera y utilizarse para inmunizar conejos y ratones para obtener anticuerpos para adicionales investigaciones. Un péptido de longitud conveniente para aplicaciones biológicas puede determinarse por examen de propiedades estimulatorias inmunológicas así como otras funciones tales como bloqueos de enlace receptor. Ejemplo 3. Características Sobresalientes del Receptor Requerido para Interacciones de Ligando Ya que el dominio N de CEACAM es suficiente para las interacciones de proteínas Opa, los presentes inventores están utilizando también técnicas de exhibición de fago para investigar epítopes adhesivos del dominio N de CEACAM. El conocimiento de la o las regiones de enlace-ligando en el receptor, que se han estudiado por los presentes inventores por mutagénesis de exploración de alanina del receptor9 ha facilitado este estudio. En este caso también, un ensayo de revestimiento de ligando está disponible para selección (concentración de afinidad) de fagos quiméricos que contienen secuencias de receptor.

Análogos de receptor tienen el potencial por bloquear múltiples cepas independientemente del tipo Opa producido ya que nuestros estudios ya han mostrado que a pesar de su variación antigénica, diferentes proteínas Opa requieren características comunes en el receptor para adhesión primaria9. También es de interés notar que los antígenos CEA se desprenden de la mucosa intestinal y pueden bloquear la adhesión de cepas de E. coli que también se conoce hacen blanco de CEACAMs . Esto también se ha propuesto como un mecanismo de inmunidad innata contra patógenos entéricos. 12De esta manera estos análogos de receptor actúan como agentes terapéuticos. Ejemplo 4. Producción de Péptidos UspAl de Moraxella catarrhalis que Ligan a CEACAM Recombinantes Compendio : La amplificación .PCR de varios fragmentos sobre la longitud de UspAl se llevó a cabo utilizando los cebadores mostrados en la Figura 9. Péptidos recombinantes se obtuvieron como se describe a continuación. En la primera vuelta, se encontró que el péptido recombinante que liga a CEACAM1 se codifica por ADN amplificado por los cebadores P4 y P8 pero no codificado por la región entre Pl y P5. Además, CEACAM1 liga con P4-P7 recombinante pero no P6-P8. Cebadores adicionales se emplearon utilizando dentro de la región P4 y P7. La región D-7 retiene el enlace CEACAM. La secuencia de fragmento 4-7 se ilustra en la Figura 10. Estrategia General de Clonación, Expresión y Purificación Para Péptidos UspAl Recombinantes El fragmento UspAl 1-5 se produce utilizando el sistema pBAD. Los productos PCR requeridos fueron TA clonados en el vector pBAD y la cepa TOP10 E. coli se utilizó para amplificación. El resto del procedimiento fue como se ilustra en la Figura 11, excepto porque pBAD se indujo utilizando arabinosa. El fragmento 4-7 se produjo utilizando ambos sistemas pBAD y pQE30 (Figura 11) con resultados de enlace CEACAM similares. El resto de los fragmentos se produce utilizando la estrategia en la Figura 11. Vector y el sistema de expresión pQE30 El vector pQE30 (Figura 12) se utiliza en conjunto con la cepa E. coli M15. M15 contiene el plásmido pREP4 que codifica un represor, que restringe la transcripción de ADN clonado en pQE30. La adición de IPTG a una concentración de 1 mM evita codificación de este represor y de esta manera la transcripción de los fragmentos clonados en pQE30. La estrategia de clonación Los amplímeros PCR primero se ligaron en pCR2.1. Esto proporciona un hospedero estable del cual el amplímero puede recuperarse por digestión de restricción (BamHl/Pstl) , asegurando que cada extremo del fragmento de gen se cortara. pQE30 se digirió similarmente y recuperó por purificación de gel, que también asegura que ambos sitios de restricción se han cortado. pQE30 digerido y el amplímero UspAl se ligaron durante la noche a 16 grados C con T4 ADN ligasa y transformaron en E. Coli M15 competente CaCl2. Los transformantes se seleccionaron en agar LB suplementado con ampicilina (100 µg/ml) y canamicina (25 µg/ml) . 4-8 colonias se recolectaron y desarrollaron en caldo LB con antibióticos. Bacterias de 3-4ml de cultivos se recolectaron por centrifugación y sometieron al método miniprep de lisis alcalina. El vector purificado se digirió como con anterioridad para verificar el inserto UspAl. Bacterias que contiene pQE30 con un inserto de tamaño correcto se desarrollaron en cultivos de 50 mi e indujeron con IPTG (ver a continuación) . Tinciones Western luego se emplearon para supervisar la producción de proteína recombinante. Además, se secuenciaron vectores para determinar que el inserto fue la región correcta de ADN y verificar cualesquiera errores de secuencia.

Expresión y purificación M15 que contiene construcciones pQE30/uspAl se desarrolla en caldo LB (suplementado con 100 pg/ml de Ampicilina y 25 µg/ml de Canamicina) con agitación a OD600 = 0.5 antes de la adición de IPTG a una concentración de 1 mM. Se incubaron cultivos por 3-4 horas más y las bacterias se recuperaron por centrifugación. Nodulos bacterianos se solubilizaron en amortiguador B (urea 8M, Tris 50mM, etanol 10%, Tween 2%, i idazol 5mM, pH 7) por 1-3 horas y el material de membrana retirado por centrifugación a 20,000 g por 20 minutos. Se incubaron los sobrenadantes con resina de níquel por 1-2 horas en un mezclador rotatorio y pasaron a través de una columna de polipropileno. La resina retenida se lavó con 5-10 mi de amortiguador B y la proteína ligada eluyó con eluciones de 0.5 mi de amortiguador B suplementado con imidazol 100 mM. Las proteínas eluidas se verificaron por SDS-PAGE antes de diálisis para retirar urea y otras sales. Fragmentos Recombinantes A: Fragmentos 1 -5 y 4-8 Estos fragmentos producidos por sistema pBAD mostraron que 1-5 no liga con CEACAMl pero 4-8 si. B : Fragmentos 4-8, 4-8T, 4-1 y 6-8 producidos utilizando el sistema pQE30.

Fragmento 4-8 fue el primer fragmento rUspAl producido y se encontró que liga CEACAM1 con alta afinidad en ensayos de tinción-revestimiento. Además del péptido rUspAl 4-8 de longitud íntegra, se observó una proteína más pequeña, truncada. Este péptido (designado 4-T) también ligó CEACAM1 y parece ser expresado a menores niveles que 4-8 (Figura 13) . Análisis de secuencia de pQE30/4-T encontró que un apareamiento incorrecto (CAÁ a TAA) llevó a un codón de terminación en el residuo Q624 (ver Figura 10) . Los péptidos 4-7 y 6-8 se produjeron a fin de descartar la . posibilidad de que un segundo sitio de enlace CEACAM ocurriera en 6-8. Como se pronostica del péptido 4-T, 4-7 demostró enlace CEACAM (Figura 13) pero 6-8 no (Figura 14) . C; Fragmentos D-8 y D-7 producidos por sistema pQE30 Se encontró que ambos fragmentos rUspAl D-8 (Figura 15) y D-7 (no mostrado) ligan CEACAM1. Actividad biológica de péptido recombinante 4-7 La cepa M. catarrhalis MX1 y la cepa de H. influenzae Rd ligan a Células de Ovario de Hámster Chino (CHO) transfectadas con CEACAM1. Su enlace puede bloquearse con el péptido recombinante 4-7 UspAl de M. catarrhalis pero no un péptido de control (Figura 17) .

En un experimento adicional se mostró que el péptido recombinante D-7 (pero sin recombinantes 6-8, es decir los residuos E659-K863 de UspAl de MX2) inhibe el enlace tanto de cepas homologas como heterólogas a células CHO transfectadas que expresan CEACAM1 (Figura 23) . Siguiendo preincubación de células ya sea sin péptido (columna 1) , péptido de control (2 µg.ml-1; columna 2) , o D-7 (2 µg.ml-1; columna 3) se agregaron bacterias y no se retiraron bacterias adherentes por lavado después de incubación por una hora. Bacterias asociadas con células después se detectaron utilizando antisuero desarrollado contra cepas distintas y anticuerpos secundarios conjugados con rodamina. Mx: Moraxella catarrhalis, Nm. Neisseria meningitidis; Hi: Haemophilus influenzae . E emplo 5. Caracterización de péptidos de enlace CEACAM1. El péptido D-7 se encuentra que es el péptido recombinante de enlace más fuerte. Por lo tanto, la región D-7 (142 amino ácidos; ver Fig. 16) de MX2 contiene la información de enlace CEACAMl . El péptido truncado 4-T (197 amino ácidos) retiene enlace débil (Fig. 13) . Por lo tanto la región D-T puede contener una región con habilidad de enlace CEACAM1.

Una sustitución de un sólo aminoácido, K 560 I, en D-7 se encuentra que casi elimina el enlace CEACAMl. Eliminación de la región 571-632 en el péptido D-8 (D-8delta) resultó en una pérdida de enlace CEACAM1. Péptidos de superposición lineal que se extienden la región D-T (Fig. 19) se elaboraron y probaron por su habilidad para ligar CEACAMl. No se observó enlace con CEACAM1. Espectroscopia de dicroísmo circular El péptido D-7 y el mutante (K 560 I) se analizaron por espectroscopia de dicroísmo circular (CD) . Espectros de dicroísmo circular se obtuvieron a temperatura ambiente utilizando un espectropolarímetro Jobin-Yvon CD6. Espectros D-7 recombinante y D-7 (K 560 I) a concentraciones de 0.1 mg/ml se midieron en cubas de cuarzo. Todos los espectros son promedio de ocho exploraciones con espectros de amortiguador libre de proteína relevante sustraídos y se trazaron utilizando Excel (Microsoft Inc.). Los espectros obtenidos muestran que D-7 tuvo una estructura alfa-helicoidal mientras que D-7 (K 560 I) adopta una formación helicoidal aleatoria o al azar (Fig. 18) . Sin desear estar ligados por ninguna teoría particular, se propone que el enlace CEACAM1 por Mx UspAl requiere una conformación de base alfa-helicoidal, probablemente una estructura de hélice embobinada. Compendio De los resultados descritos anteriormente, los inventores concluyeron que el enlace CEACAMl de Mx UspAl requiere una región dentro de D-7 además de una conformación de base alfa helicoidal, probablemente una estructura de hélice embobinada. El hallazgo de que el dominio de enlace CEACAM1 de Mx UspAl adopta una conformación de base alfa helicoidal que se requiere para enlace receptor, es particularmente interesante. Proteínas Opa requieren reconstitución cuidadosa para presentación de los dominios de enlace CEACAM que ocurren en diferentes bucles expuestos en superficie. Los presentes hallazgos sugieren que D-7 repliega espontáneamente para proporcionar la propiedad de enlace CEACAM. En D-7, la estructura embobinada proporciona una estructura de sub-unidad globular con conformación apropiada para enlace CEACAM1. Esta propiedad ventajosa del péptido D-7 significa que el péptido y derivados, homólogos o fragmentos del mismo, pueden tener utilidad particular como una vacuna sub-unitaria o terapéutica. Derivados del péptido D-7 que tienen la conformación de base alfa-helicoidal requerida pueden identificarse por el espectro de dicroísmo circular de "huella dactilar" único. E emplo 6. Análisis de Secuencia Un alineamiento de la región D-7 de las secuencias de amino ácido de las proteínas UspAl de diez cepas de Mx, se muestra en la Figura 20. Seis de diez cepas son idénticas sobre la región secuenciada. Las cepas MX3 y MX4 son 100% idénticas sobre la secuencia disponible de la región D-7 y tienen identidades totales de 90.85% y 88.03% respectivamente, tomando en cuenta a los 13 y 17 residuos amino ácido N-terminales para MX3 y MX4 respectivamente, que no se han determinado. Las dos cepas restantes TTA37 y 035E tienen eliminaciones como se muestra (Figura 20) que ocurren dentro de la región D-T. La identidad total incluyendo los espacios en D-7 es 70.4% y 50%, respectivamente.

TTA37 es idéntico en la región restante de 100 amino ácidos mientras que 035E es idéntico en 71 de 72 amino ácidos cuando se alinean manualmente (Figura 21) . Se conoce que 035E no liga a CEACAM1. TTA37 no está disponible para prueba. Ejemplo 7. Propiedades de bloqueo de adhesión de D-7 Resultados El potencial de D-7 como un agente antiadhesivo efectivo contra cepas homologas y heterólogas de Mx, Nm, Ng y Hi, se examinó primero utilizando el receptor soluble. CEACAMl-Fc (CCl-Fc) fue pre-incubado con D-7 antes de revestir lisados de células enteras de dos cepas Mx aplicados por puntos sobre nitrocelulosa. D-7 recombinante se muestra que inhibe enlace de CCl-Fc significativamente a una cepa heteróloga MX1 y a la cepa homologa MX2 en una forma dependiente de dosis (Figura 24 a) . La inhibición fue significante y parece alcanzar una meseta sobre 0.01 µg.ml-1. No se exhibió esta inhibición por el péptido de control (D-8delta) , previamente no muestra que liga CEACAM1 (Ejemplo 5) . Además, se determina la inhibición de múltiples cepas bacterianas. La mayoría de las - cepas empleadas representa aislados clínicos de orígenes de todo el mundo (ver Métodos) . Inhibición significante y específica se exhibió por D-7 pero no D-8delta (Figura 24 b) . El efecto de bloqueo de D-7 se examinó utilizando células de Ovario de Hámster chino (CHO = Chínese Hámster Ovary) transfectadas con CEACAM1 (CHO-CEACAM1) . Como con el receptor soluble, una inhibición de enlace de Mx, Nm y Hi a células CHO-CEACAM1 se observa siguiendo la pre-incubación con D-7 pero no con el péptido de control (Figuras 25 a y b) . La inhibición de enlace bacteriano a células CHO-CEACAM1 fue dependiente de dosis y significante en o sobre 0.1 µg.ml-1 para Mx y. Hi y 0.2 µg.ml-1 para Nm (Figura 25 b) . Abrogación casi completa de enlace bacteriano a CHO-CEACAM1 se obtuvo a concentraciones de c. 2 µg.ml-1 (Figuras 25 a y b) . Valores obtenidos para inhibición sugieren tentativamente un orden de afinidad para interacciones CEACAM de las bacterias empleadas en este estudio como Nm>Mx>Hi . Además CEACAM1, se ha mostrado que N. meningitidis hace diana a otros miembros de la familia CEACAM -humana, incluyendo CEA epitelial y CEACAM6 (NCA)9, esto es también el caso con algunas cepas Mx, las cepas Hi tienden a hacer diana en CEACAM1 como un receptor preferido (datos no mostrados) . Después de preincubación con D-7 (2 µg.ml"1) , inhibición de enlace Nm se observa a células HeLa transfectadas que expresan CEACAM 1, 6 y CEA (Figura 25 c) . La eficacia de D-7 se probó adicionalmente utilizando HeLa-CCIH, una línea celular generada para expresar altos niveles de CEACAMl para imitar, en parte un estado de inflamación posible in vivo de células epiteliales. Alta densidad de receptor permite que bacterias que expresan Opa, se conecten a células diana a pesar de la presencia de cápsula7. Por lo tanto, este modelo nos permite también utilizar un fenotipo de Nm (hl8.18) que puede encontrarse in vivo, es decir cápsula, con vellos y expresar la proteína de membrana exterior Opa al igual que Opc 15' 25. Primero, se prueba el enlace de un derivado deficiente en Opa de hld .18 con HeLa-CCl H y se encuentra que es relativamente bajo (10-20 bacterias por célula) y se debe a la expresión de vellos. Como se expresa, la adherencia de hl8.18 a HeLa-CCl H fue muy mejorada (100-150 bacterias por célula) y a pesar de la contribución de los vellos, la adhesión celular por hld.18 se redujo considerablemente por el tratamiento previo o simultáneo con D-7 (Figura 25 d) . Además de lo anterior, D-7- se prueba en la línea celular epitelial de pulmón humano a A549, que se conoce expresa CEACAMs 26. Esta línea celular se eligió ya que también expresa receptores para otros ligandos Mx 27, de esta manera la eficacia de D-7 para reducir la carga bacteriana puede probarse. En la presencia de D-7 (2 µg.ml-1) pero no D-ddelta, se observó una disminución dramática en interacción de Nm y Hi con células A549 (Figura 25 e) . La reducción en enlaces se observa para la cepa Mx también y aunque en comparación relativamente menor, sin embargo fue significante (Figura 25 e) . Métodos Aislados y cultivos bacterianos Mx y Nm se desarrollaron en agar BHI suplementado con sangre de caballo calentada, al 10% mientras que, Hi se desarrolló en agar de infusión de cerebro-corazón (BHI) suplementado con base Levinthal . Cepas Ng se cultivaron en agar GC. Todas las bacterias se cultivaron a 37 grados C por hasta 16 horas en un incubador de C02 al 5%. Las cepas Mx fueron aislados clínicos que se obtienen de casos de otitis media y COPD y representan aislados de varios países. Eagan, cl y fl son Hi tipificables con cápsulas de tipo b, c y f respectivamente, Rd es un derivado sin cápsula de una cepa tipo d. Las cepas A930065 y NT1 son NTHi. Las cepas A3, F2087, F3035 y F1947 son aislados de aegyptius biogrupo Hi. Aislados Nm C751A, C751 B y C751 D son tres distintos aislados que expresan Opa de una cepa de serogrupo A C751. Otros aislados fueron de los siguientes serogrupos: PMC17 (A) y MC58 (B) , y C114 (C) PMC2 (29E) , PMC4 (W135) y PMC10 (Y). Aislados Ng P9-13, 16 y 35 son variantes Opa intracepa de la cepa P9 y otros aislados clínicos fueron de origen mundial. La mayoría de las cepas empleadas en el estudio actual se han descrito más previamente 10' 26, 28. Anticuerpos Anticuerpo monoclonal de ratón anti-p?li histidina se adquirió de Qiagen y empleó a 0.2 µg.ml-1. Antisueros policlonales contra cepas Mx, Nm y Hi se desarrollan en conejos utilizando protocolos estándar y lisados de células enteras de múltiples cepas como antígenos. Anticuerpo anti-UspAl (R38) empleado en este estudio se ha descrito en el Ejemplo 1 y 26. Antisuero policlonal contra D-7 se genera en conejos por inmunización con péptido ligado a resina Ni-NTA (Qiagen; 100-200 µg de péptido por inmunización) . El complemento se inactiva al calentar el antisuero a 56 grados C por 30 minutos. Anticuerpos anti-D-7 fueron purificados por afinidad utilizando el péptido D-7 acoplado a columna AminoLink Plus, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Pierce) . Construcciones y líneas celulares de receptor soluble CEACAMl-Fc soluble y células CHO se transfectaron con CEACAM1 utilizado en este estudio, se han descrito previamente 11, 9 n Células HeLa que expresan un intervalo de moléculas CEACAM fueron un regalo del Profesor Wolfgang Zimmerman ' (Universidad de Munich, Alemania) y el Doctor Scott Gray-Owen (Universidad de Toronto, Canadá) y se desarrollaron en RPMI 1640 que contiene suero bovino fetal al 10% (FCS) . Células de carcinoma de pulmón humano A549 (Flow Laboratories) se cultivaron en medio Ham F12 que contiene FCS al 10%. Células HeLa que expresan altos niveles de CEACAM se generaron al utilizar el sistema de expresión de gen Tet-OnMR (Clontech) . El gen ceacaml se clonó en el plásmido de respuesta pTRE-2hyg (Clontech) y transformó en células HeLa que contienen el gen regulatorio (Clontech) utilizando Fugene-6 (Roche) . Transfectantes se eligieron utilizando 400 µg.ml-1 de higromicina. Estos transfectantes que fueron positivos para expresión de CEACAM se seleccionaron utilizando FACS y dilución limitante. El clon HeLa-CCIH en la presencia de 0.25 µg.ml-1 de doxiciclina produjo los más altos niveles del receptor. Ensayo de revestimiento de receptor Estos experimentos se basaron en un método previamente descrito9 con las siguientes excepciones.' Para estudios de inhibición CEACAMl-Fc (0.1 µg. mi-1) se preincubaron con D-7 o péptido de control (0.001-2 µg. mi-1) por 1 h a RT. Transferencias se aplicaron subsecuentemente ya sea con CEACAM I -Fe (0.1 µg. mi-1) solo o preincubaron con péptidos como se describió. Transferencias alternas se revistieron con anticuerpo anti-D-7 de conejo purificado (10 µg.ml"1) por 1 hora antes de revestimiento con el receptor (0.1 µg.ml"1) . En cualquier caso, niveles de enlace de receptor se determinaron por análisis densitométrico utilizando el programa NIH Scion Image. Inhibición de adherencia bacteriana a células que expresan CEACAM por péptido D-7.

Mono-capas confluentes de células se preincubaron con péptido D-7 o péptido de control (0.1-2 µg.ml-1) por 30-60 minutos a 37 grados C en medio 199 con la adición de suero bovino fetal al 2%. Se examinaron mono-capas siguiendo preincubación con péptido para asegurar que no hubiera ocurrido efecto nocivo en las células. Subsecuentemente, se incubaron mono-capas en una proporción de c. 100-200 bacterias por célula en medio 199 con la adición de suero bovino fetal al 2% por 1 hora a 37 grados C. Bacterias no adherentes se retiraron al lavar 4 veces con medio 199 y después se trataron mono-capas ya sea por detección de inmunofluorescencia o lisaron con saponina al 1% y diluciones de bacterias revestidas para determinación de unidades formadoras de colonia (cfu = colony forming units) como se describió previamente 25. Para detección de inmunofluorescencia, se fijaron células en metanol absoluto por 10 minutos, lavaron y bloquearon con albúmina de suero bovino al 1% en PBS que contiene Tween 0.05% por 1 hora. Las bacterias conectadas se detectaron utilizando antisuero anti-bacterial y anticuerpos secundarios conjugados con rodamina. Números de bacterias que se adhieren a células que expresan HeLa-CEACAM se obtuvieron por conteo directo utilizando un microscopio Olympus 1X70, con amplificación X400.

Valores promedio de bacterias ligadas se obtuvieron después de contar bacterias adherentes a 20 células seleccionadas al azar de experimentos duplicados. La adherencia bacteriana a HeLa-CCl H se determina por análisis de cfu como se describió previamente. Ejemplo 8. Anticuerpo anti-D-7 inhibe interacciones Mx- CEACAM1 Resultados Antisueros de conejo generados contra D-7 contienen anticuerpos que fueron de reacción cruzada con UspAl de varias cepas Mx en revestimiento de transferencia Western de lisado de células enteras (datos no mostrados) . No se observó enlace de anti-D-7 a Nm. Opa o Hi P5 por transferencia Western utilizando anticuerpos purificados por afinidad (datos no mostrados) . Incubación de lisados de células enteras de un intervalo de cepas Mx con anti D-7 (10 µg.ml"1) ante de revestimientos de CCl-Fc, resultó en una inhibición significante del enlace receptor con la mayoría de las cepas que muestran más de 80% de inhibición (Figura 26) . Sin embargo, solo bajos niveles de inhibición se observaron para las cepas de Hi, Nm y Ng en experimentos similares. De esta manera, anticuerpos contra D-7 pudieron ofrecer protección contra infección Mx, mientras que D-7 puede servir como un péptido anti-microbiano más general para un intervalo diverso de bacterias de diana CEACAM. Ejemplo 9. Inhibición de adherencia bacteriana a células endoteliales humanas que expresan CEACAM por el péptido D-7 A fin de estimar el efecto de D-7 en células endoteliales, se emplearon mono-capas confluentes de células HMEC-1. Las células endoteliales microvasculares humanas se pre-incubaron ya sea con D-7 o una molécula de control recombinante (ambas a 1 µg.ml"1) por 60 minutos. Después se agregaron bacterias (aislado que expresa OpaD de cepa C751 de N. meningitidis) en una proporción de infección de 100 bacterias por célula e incubaron por 1 hora a 37 grados C. Después de este tiempo, bacterias no adherentes se retiraron al lavar y la mono-capa fija en metanol por 10 minutos a temperatura ambiente. Bacterias adherentes se detectaron por revestimiento con antisuero policlonal de conejo contra N. meningitidis y subsecuentemente anticuerpo secundario conjugado TRITC de anticonejo. La mayoría de las células endoteliales tuvieron hasta 30 bacterias asociadas por célula en la ausencia de péptidos. En la presencia de péptido de control, no se observó inhibición evidente de enlace bacteriano. Sin embargo, en la presencia de D-7, el enlace fue abrogado virtualmente con células ocasionales que tienen 1-2 bacterias conectadas (Figura 27) . De esta manera D-7 es capaz de inhibir adhesión mediada por Opa-CEACAM de N. meningitidis a células endoteliales así como células epiteliales. Ejemplo 10. Conservación de la secuencia del fragmento "4-T" (amxno ácidos 427-623 de MX2 UspAl) entre secuencias de proteínas UspAl conocidas . Tabla II. Cepas y secuencias empleadas Un alineamiento múltiple con todas las secuencias de proteína de longitud íntegra se realizó para identificar el fragmento correspondiente en secuencias de otras cepas.

El alineamiento múltiple para estos fragmentos se muestra en la Figura 28. Los por cientos de identidad asociados se muestran a continuación. Tabla IV. Porcentaje de identidad de secuencia de fragmentos definidos en la Tabla III Como se muestra en el Ejemplo 6 para la región D-7, los resultados anteriores indican que la región 4-T está altamente conservada entre diferentes cepas, con identidad de secuencia de 95% o más para todas las cepas probadas excepto 035E (85% de identidad) . Como se anotó previamente, 035E no liga a CEACAM. De acuerdo con esto, péptidos que comprenden o consisten de regiones conservadas de la secuencia 4-T (427-623) , como se muestra en la Figura 28, son péptidos preferidos de acuerdo con la invención, con utilidad para el tratamiento o profilaxis de enfermedad, en particular enfermedades en donde están implicados receptores CEACAM. Referencias : 1. Cartwright, K. y colaboradores 1995. En Meningococcal disease (enfermedad de Meningococos) . John Wiley & Sons. 2. vanAlphen, L. & van Ham, S. M. 1994. Rev Med Microbiol 5 : 245. 3. Foxwell, A. R. y colaboradores 1996.

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Claims (24)

1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido aislado que comprende o consiste de una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo que consiste de: residuos 527 a 623 de la secuencia mostrada en la Figura 6, y secuencias conservadas que se identifican en el alineamiento de secuencia mostrado en la Figura 28.
2. 2. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia conservada se elige del grupo que consiste de: QHSSDIKTLK, NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK, NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA, DIAQNQT, DIQDLAAYNELQD, QTEAIDALNKASS, TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK, NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK, - NQADIANNIKNIYELA, NQADIANNI, y NIYELA.
3. 3. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, que es una proteína UspAl truncada.
4. 4. Un polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que liga receptores CEACAM.
5. 5. Un medicamento que comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y uno o más adyuvantes, vehículos, excipientes, aglutinantes, portadores o conservadores farmacéuticamente aceptables.
6. 6. Uso del medicamento de conformidad con la reivindicación 5, para el tratamiento o profilaxis de infección.
7. 7. Uso del medicamento de conformidad con la reivindicación 5, para el tratamiento o prevención de una enfermedad en donde están involucrados receptores CEACAM en el blanco celular del patógeno que provoca la enfermedad.
8. 8. Uso de conformidad con la reivindicación 7, para el tratamiento o prevención de infección, enfermedad respiratoria, enfermedades neoplásicas y condiciones asociadas de enfermedades neoplásicas, angiogénesis, caries dental y enfermedad de encías.
9. 9. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la infección es de, o ha ocurrido mediante una membrana de las mucosas.
10. 10. Uso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la infección se provoca por Neisseria meningitidis , Haemophilus influenzae o Moraxella catarrhalis.
11. 11. El uso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la infección se provoca por Fusobacterium nucleatum.
12. 12. Uso del medicamento de conformidad con la reivindicación 5, para la profilaxis o tratamiento de otitis media.
13. 13. Uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en un ensayo de supervisión ' o monitoreo para la identificación de reactivos de bloqueo novedosos, para utilizar como agentes terapéuticos, que comprende supervisar agentes terapéuticos potenciales por su habilidad para imitar, o por su homología con el polipéptido.
14. 14. Una vacuna que comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y uno o más adyuvantes, vehículos, excipientes, aglutinantes, portadores o conservadores, farmacéuticamente aceptables .
15. 15. Un método para tratar o evitar infección en un individuo que lo requiere, que comprende administrar una ' cantidad efectiva de un medicamento de conformidad con la reivindicación 5.
16. 16. Un polipéptido substancialmente como se describió con anterioridad con referencia a y como se ilustra por la Figura 6 de los dibujos acompañantes.
17. 17. Un medicamento substancialmente como se describió con anterioridad, que comprende el polipéptido de la reivindicación 16.
18. 18. El uso • de un ligando de enlace receptor CEACAM en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad en donde están involucrados receptores CEACAM en hacer blanco celular del patógeno que provoca la enfermedad, en donde el ligando comprende o consiste de una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo que consiste de los residuos 527 a 623 de la secuencia mostrada en la Figura 6 y secuencias conservadas identificadas en el alineamiento de secuencia mostrado en la Figura 28, o un fragmento o equivalente funcional del mismo que retiene habilidad de enlace CEACAM.
19. 19. Uso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la secuencia conservada se elige del grupo que consiste de: QHSSDIKTLK, NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK, NVEEGLLDLSG RLI DQKADIAKNQA, DIAQNQT, DIQDLAAYNELQD, QTEAI DALNKASS, TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK, NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK, NQADIANNIKNIYELA, NQADIANNI, y NIYELA.
20. 20. Uso de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque la enfermedad se elige del grupo que consiste de infección, enfermedad respiratoria, enfermedad neoplásica y condiciones asociadas de enfermedad neoplásica, angiogénesis, caries dental y enfermedad de las encías .
21. 21. Uso de conformidad con las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque el patógeno infecta, o entra por una membrana de las mucosas .
22. 22. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque el patógeno que provoca la enfermedad se elige del grupo que consiste de Neisseria meningitidis , Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.
23. 23. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque el patógeno que provoca la enfermedad es Fusobacterium nucleatum.
24. 24. Uso de conformidad con la reivindicación 22 o 23, caracterizado porque la enfermedad es otitis media.