KR101523108B1 - 면역원성 ｐｃｐａ 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 대한 면역 반응을 유도하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 특별하게는, 상기 조성물 및 방법은 PcpA의 단편 및 이의 변이체를 포함하는 면역원성 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 엔코딩하거나 발현하는 핵산, 벡터 및 형질감염된 세포에 관한 것이다. 상기 면역원성 폴리펩티드를 제조하는 방법 및 이를 이용하는 방법이 또한 개시된다.

Description

면역원성 ＰＣＰＡ 폴리펩티드 및 이의 용도{IMMUNOGENIC PCPA POLYPEPTIDES AND USES THEREOF}

관련 출원에 대한 상호-참조

본원은 2006년 8월 17일자로 출원된 미국 출원 제60/822,715호; 2006년 9월 28일자로 출원된 미국 출원 제60/827,348호; 및 2007년 5월 10일자로 출원된 미국 출원 제60/917,178호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 특허출원서의 내용 전체는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.

연방 정부 지원 연구에 관한 진술

본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 기금 ROl AI053749, ROl AI21548 및 T32 HL 07553에 따른 정부 지원하에 수행되었다. 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 가질 수 있다.

배경기술

스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 다소 편재된(ubiquitous) 인간 병원균으로, 폐, 중추신경계(central nervous system, CNS), 중이(middle ear) 및 비도(nasal tract)를 포함하는 몇몇 기관을 감염시킬 수 있다. 감염은 결과적으로 다양한 증상들, 예컨대 기관지염, 폐렴, 뇌수막염, 공동(sinus) 감염, 및 폐혈증을 일으킨다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애는 인간에서의 세균성 뇌수막염의 주된 요인이며, 항생제 치료에도 불구하고 심각한 사망률 및 이환율과 연관되어 있다(문헌[Quagliarello et al., (1992) N. Eng. J. Med. 327:864-872]).

현재 가용한 2가지 폐렴구균 백신이 존재한다. 하나는 성인용 백신으로, 23종의 상이한 캡슐 다당류로 이루어져 있으며, 상기 다당류는 폐렴구균 감염증(infection)을 일으키는 균주(strain)의 캡슐 타입 약 90%를 한꺼번에 제시한다. 그러나, 이 백신은 폐렴구균 감염증에 높은 민감도(susceptibility)를 지니는 연령 그룹에 속하는, 어린 아이들에게는 면역원성을 부여하지 못한다. 성인에서, 이 백신은 세균성(bacteremic) 폐렴에 대해 약 60%의 효험을 나타내었으나, 연령 또는 근원적인(underlying) 의학적 조건으로 인해 폐렴구균 감염증에 대한 더 높은 위험을 지니는 성인에서는 효험이 더 적은 것으로 나타났다(문헌[Fedson, and Musher. 2004. "Pneumococcal Polysaccharide Vaccine," pp. 529-588. In Vaccines, S. A. Plotkin and W. A. Orenstein (eds.), W. B. Saunders and Co., Philadelphia, PA; Shapiro et al., N. Engl. J. Med. 325: 1453-1460 (1991)]). 이 백신이, 감염의 가장 일반적인 형태인, 비-세균성 폐렴구균 폐렴에 대해 효과적인지 여부는 밝혀진 바 없다.

두 번째 가용한 백신은 7가(7-valent) 컨주게이트 백신으로, 2세 미만의 어린 아이들의 세균성 폐렴구균 감염증에 대해 효험이 있다. 이 백신은 또한 폐렴에 대한 효능(efficacy)이 입증되었다(문헌[Black et al, Pediatr. Infect. Dis. 21:810-5 (2002); Black et al., Arch. Pediatr. 11(7):843-53 (2004)]). 7가지 상이한 컨주게이트를 생산하여야 하는 요구로 인해 이 백신의 생산은 복잡하며, 이러한 요구는 백신이 비싸지게 만든다(아이당 약 $200). 더욱이, 이 백신은 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 비-백신 타입이 매우 흔한 개발도상국가에서 감염을 조절(covering)하는데 유효하지 아니하다(문헌[Di Fabio et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 20:959-967 (2001); Mulholland, Trap. Med. Int. Health. 10:497-500 (2005)]). 이 백신은 중이염 및 집락형성(colonization)에 잘 듣지 아니할 뿐만 아니라 침습성 질환에도 잘 듣지 않는다. 또한 7-가 컨주게이트 백신의 사용이 백신에 포함된 7가지 다당류에 의해 제시되지 않는 캡슐 타입을 지니는 균주에 의한 집락형성 및 질환의 증가를 초래하는 것으로 드러났다(문헌[Bogaert et al., Lancet Infect. Dis. 4:144-154 (2004); Eskola et al., N. Engl J. Med. 344:403-409 (2001); Mbelle et al., J. Infect Dis. 180: 1171-1176 (1999)]). 그러므로, 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 효과적인 치료제에 관한 요구는 여전히 존재한다.

발명의 요약

스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 면역 반응을 유도하는 조성물 및 그러한 방법이 기재된다. 더 특별하게는, 본 발명의 교시는 PcpA의 단편 및 이의 변이체(variant)를 포함하는 면역원성 PcpA 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산과 관련이 있다. 본 발명의 교시는 추가로 상기 면역원성 폴리펩티드를 제조하는 방법 및 이를 사용하는 방법과 관련이 있다. 이러한 조성물과 방법은 폐렴구균 감염증을 감소시키거나 예방하기 위해 디자인된 현재 가용한 조성물과 방법에 비하여 개선된 효능과 효율성(efficiency) 및 비용 감소를 제공한다.

도 1은 PCR로 확인된 pcpA를 도시한다. 다양한 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주의 게놈 DNA에 대한 PCR 분석. 프라이머 쌍[GP1(서열번호 50) 및 BGP2(서열번호 51)]를 사하여 PcpA의 말단 부분(LRR 영역을 포함함)을 엔코딩하는 핵산을 증폭시켰다. 레인 1, TIGR4; 레인 2, L82013; 레인 3, D1091B; 레인 4, BG12730; 레인 5, TJ0893; 레인 6, R6; 레인 7, BG10752; 레인 8, V175; 레인 9, EF3030; 레인 10, 음성 대조군(주형 DNA 없음).

도 2는 저 Mn²⁺ 조건하의 PcpA 존재에 대한 웨스턴 블랏 분석을 보여준다. 박테리아를 중간-대수기(mid-log phase)까지 저 Mn²⁺ 배지에서 배양하고 전체 세포 단백질 샘플을 준비하였다. 샘플을 SDS-PAGE로 분리시키고, 니트로셀룰로오스에 옮기고 rPcpA 폴리클로날 항혈청으로 탐침(probing)하였다. 레인 1, JEN11(pcpA-돌연변이체); 레인 2, JEN7(pcpA 항시성(constitutive) 돌연변이체); 레인 3, D1091B; 레인 4, EF5668; 레인 5, BG10752; 레인 6, V175; 레인 7, L82013; 레인 8, BG12730; 레인 9, TJ0893.

도 3은 애주번트 단독과 비교하여 rPcpA 면역접종(immunization)에 의해 부여된 보호가 폐렴 뮤린 모델에서 통계학적으로 유의미함을 보여준다. CBA/N 마우스에게 수산화알루미늄에 흡착된 rPcpA 또는 수산화알루미늄만을 피하로 투여하여 면역접종하였다. 가벼운 마취하에서, 5xlO⁶ CFU의 EF3O3O를 비강내로 투여하여 마우스를 공격하였다. 마우스를 감염 후 7일째에 절명시키고 폐 균질액(homogenate)(도 3A) 및 비강 세척물(wash)(도 3B)로부터의 박테리아 수치(count)를 측정하였다. 수평선은 중앙값 Log1O CFU를 나타낸다. (**: p=0.0019, 만-휘트니법).

도 4는 단독의 애주번트와 대비하여 rPcpA 면역접종에 의해 부여된 다른 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 혈청형에 대한 보호가 폐렴 뮤린 모델에서 통계학적으로 유의미함을 보여준다. 마우스를 균주 TJ0893, 혈청형 14(도 4A)(**: p=0.0209); L82016, 혈청형 6B(도 4B)(**: p=0.0193); 또는 EF9303, 혈청형 23F(도 4C)(**: p=0.0388, 만-휘트니법)로 공격하였다. 수평선은 중앙값 Log1O CFU를 나타낸다.

도 5는 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 비강내 집락형성에 대한 pcpA 불활성화의 효과를 보여준다. 비강내로 10⁶ CFU의 EF3O3O 또는 이의 유도체 JEN18을 투여하여 마우스를 공격하였다. 마우스를 감염 후 7일째에 절명시키고 비강 세척물으로부터의 박테리아 수치를 측정하였다. 수평선은 중앙값 Log1O CFU/코(Nose)를 나타낸다.

도 6은 단독의 애주번트와 대비하여 rPcpA 면역접종에 의해 부여된 보호가 치사성(fetal) 패혈증의 뮤린 모델에서 통계학적으로 유의미함을 보여준다. CBA/N 마우스에게 수산화알루미늄에 흡착된 rPcpA 또는 수산화알루미늄만을 피하로 투여하여 면역접종하였다. 마우스를 정맥내로 300 CFU의 TIGR4로 공격하고 21일 동안 생존 시간을 모니터링하였다. 수평선은 생존 시간 중앙값을 나타낸다. (**: p=0.0067, 만-휘트니법). 생존한 마우스를 안락사시켰으며, 시험시, 모든 마우스의 혈액 내에는 검출가능한 스트렙토코쿠스 뉴모니애가 존재하지 아니하였다.

도 7은 패혈증의 뮤린 모델에서 TIGR4 및 이의 pcpA 불활성화 유도체 JEN11의 병원성(virulence)을 보여준다. 정맥내로 300 CFU의 TIGR4 또는 JEN11을 투여하여 마우스를 공격하고 21일간 생존 시간을 모니터링하였다. 수평선은 생존 시간의 중앙값을 나타낸다. (**:p=0.0299, 만-휘트니법).

도 8은 폐렴의 뮤린 모델에서 단독의 애주번트와 비교할 때 rPcpA 점막 면역접종에 의해 보호가 부여되었음을 보여준다. CBA/N 마우스에게 비강내로 rPcpA 및 콜레라 독소 B 소단위체(CTB) 또는 단독의 CTB를 투여하여 면역접종하였다. 가벼운 마취하에서 비강내로 5x10⁶ CFU의 EF3030을 투여하여 마우스를 공격하였다. 마우스를 감염 후 7일째에 절명시키고 균질화된 폐내의 박테리아 수치를 측정하였다. 수평선은 중앙값 Log1O CFU를 나타낸다. (*:p=0.0001, 만-휘트니법).

도 9는 인간 폐 상피 세포에 대한 pcpA ⁺ 및 pcpA ^-TIGR4 균주(각각, T1GR4 및 JEN11)의 부착(adherence)을 도시한다. A549 인간 폐 상피 세포 단일층을 고 망간(고 Mn²⁺) 또는 저 망간(저 Mn²⁺) 성장 조건하에서 성장시킨 10⁶ CFU의 pcpA ⁺ 및 pcpA ^- TIGR4 균주와 함께 150분 동안 인큐베이션시켰다. 상기 상피 세포를 세척하고 용해시켰다. 각 용해물내 부착 폐렴구균의 수를 혈액 아가 플레이트 상에 정량 플레이팅(quantitative plating)함으로써 측정하였다. Log10 회수된(recovered) CFU는 실험 말기에 폐 상피 세포에 결합된 폐렴구균의 수를 의미한다. (**: p=0.0022, 만-휘트니법).

도 10은 pcpA ⁺ 및 pcpA ^- TIGR4 균주가 인간 비강 상피 세포에 부착되지 않았다는 것을 도시한다. 디트로이트562(Detroit562) 인간 비강 상피 세포 단일층을 고 망간(고 Mn²⁺) 또는 저 망간(저 Mn²⁺) 성장 조건하에서 성장시킨 10⁶ CFU의 pcpA ⁺ 및 pcpA ^- TIGR4 균주와 함께 150분 동안 인큐베이션시켰다. 이후 상기 세포를 세척하고 용해시켰다. 각 용해물내 부착 폐렴구균의 수를 혈액 아가 플레이트 상에 정량 플레이팅함으로써 측정하였다. Log10 회수된 CFU는 실험 말기의 폐렴구균 수를 의미한다.

도 11은 PcpA에 대한 항체에 의한 A549 세포에 대한 폐렴구균의 부착의 억제를 보여준다. 항체 없이, 또는 1/100, 또는 1/50으로 희석된 PcpA 항체와 함께, 고 망간(고 Mn²⁺) 또는 저 망간(저 Mn²⁺) 하에서 성장시킨 10⁶ CFU의 pcpA ⁺ 및 pcpA ^- TIGR4 균주와 A549 인간 폐 상피 세포 단일층을 같이 인큐베이션시켰다. 상기 세포를 세척하고 용해시켰다. 용해물내 폐렴구균의 수를 혈액 아가 플레이트 상에 정량 플레이팅함으로써 측정하였다.

도 12는 PcpA에 대한 래빗 혈청을 이용한 패혈증에 대한 보호를 보여준다. 래빗에게 완전한 프레운트(Freund) 애주번트 중의 100㎍ rPcpA를 면역접종하고 후속하여 2주와 4주 경과 후 완전한 프레운트 애주번트 중의 100㎍ rPcpA로 면역접종시킴으로써 래빗 혈청을 제조하였다. 혈청을 최종 부스팅 2주 후에 수집하였고 도트 블랏 검정으로 상기 혈청이 PcpA에 대한 항체를 함유하고 있음을 확인하였다. 전-항혈청을 또한 면역접종 개시 이전에 수집하였다. 마우스를 2개의 그룹으로 나누어 치사성 폐렴구균 감염증에 대해 보호하는 래빗 항-혈청의 희석액의 활성에 대해 시험하였다. 마우스 3개 그룹에게 1/10, 1/100 또는 1/1000 항혈청 희석액 0.1 mL를 복강내로 투여하고 1시간 경과 후 정맥내로 TIGR4를 투여하여 공격하였다. 마우스 2마리에는 1/10 전-면역(비-면역) 래빗 혈청을 투여하고 마우스 2마리에는 희석액(PBS)만을 투여하였다. 마우스를 500 시간 또는 절명시까지 관찰하였다. 1/10 항혈청을 투여받은 마우스 2마리는 실험기간 내내 생존하였다. 다른 모든 마우스는 공격 후 40 및 60시간 사이에 절명하였다.

도 13은 PcpA 및 뉴모리신(Ply)을 이용한 폐 감염에 대한 보호를 보여준다. 마우스에게 5㎍의 rPcpA, 5㎍의 뉴모리신(Ply), 또는 5㎍의 rPcpA + 5㎍ Ply를 3회 면역접종하였다. 처음 2회의 주사는 명반(alum)을 지녔고 3회째 주사는 단백질만을 지녔다. 사용된 Ply는 야생형 Ply였다. 마우스를 이소플루란(MinRAD, Buffalo, NY)으로 마취시키고 40㎕ 부피 중의 5x1O⁶ CFU의 캡슐 타입 19F 균주 EF3O3O으로 공격하였다(i.n.). 상기 절차로 폐 감염 및 비강 집락형성이 야기되었 다. 7일 경과 후 마우스를 절명시키고 균질화된 폐를 플레이팅하였다. 관찰된 CFU는 PcpA 또는 Ply로의 면역접종이 유사한 수준의 보호를 가져왔음을 보여주었다. PcpA 및 Ply로 면역접종된 마우스는 결과적으로 대조군 마우스 보다 100배 이상 그리고 Ply 또는 PcpA만으로 면역접종된 마우스 보다 10배 더 보호되었다.

도 14는 플라스미드 pET30a와 PcpA의 단편[스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 B6으로부터의 ΔSPΔCBDPcpA]을 엔코딩하는 핵산의 라이게이션(ligation)으로 형성되는 플라스미드 pJMS87의 구성을 보여주는 도면이다.

도 15A 및 15B는 뮤린 패혈증 모델에서 마우스에게 실시예 8의 재조합 PcpA(rPcpA)(10 내지 0.625㎍/용량)를 면역접종함으로써 부여된 보호에 관한 그래프이다. 복강내로 300 CFU의 균주 WLJBM3을 투여하여 마우스를 공격하였다. 도 15A는 각각의 투여량의 rPcpA로 면역접종된 마우스가 애주번트 대조군 그룹(PBS)(Fisher Exact Test)에 비해 소정 기간에 걸쳐 현저하게 보호되었음을 보여준다. 도 15B는 공격 후 7일째에 각각의 그룹에서의 보호 수준을 보여준다.

도 16은 마우스 폐렴 모델에서 실시예 8의 rPcpA로 면역접종함으로써 부여된 보호에 관한 그래프이다. 그룹 1 내지 6을 위약(그룹 1), PspA(그룹 2) 또는 rPcpA(그룹 3 내지 6)로 면역접종하였다. 0일째에 그룹 당 대략 14마리의 CBA/N 마우스에게 1차(primary) 투여량의 면역원을 피하로(s.c.) 투여하여 면역접종하였다. 21일째에 2차 면역접종을 실시하고 43일째에 3차 면역접종을 실시하였다. 63일째에 비강내로 5.6x10⁶ CFU의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 EF3O3O을 투여하여 마우스를 공격하였다. 감염 5일째에 CFU를 균질화된 폐 조직에서 측정하였다.

PcpA의 면역원성 단편 및 변이체가 상기 단편 및 변이체의 제조 방법 및 이의 사용 방법과 함께 본 명세서에 기재된다. PcpA는 처음에 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 콜린 결합 단백질(choline-binding protein, CBP)로서 확인되었는데, CBP 단백질 PspA 및 PspC와는 상이하며(문헌[Sanchez-Beato et al., FEMS Microbiol. Lett. 164:207-214 (1998)]), pcpA에서 돌연변이가 (1) 돌연변이체 균주와 야생형 균주가 경쟁하도록 만들어진 경쟁 모델에서 마우스의 폐, 균혈증, 및 코인두(nasopharynx)에서 병원성의 감소를 초래하며(문헌[Hava and Camilli, MoL Microbiol. 45:1389-1406 (2002)]); (2) 폐 집락형성의 비-경쟁 비교에서 병원성 및 박테리아 부하의 감소를 초래하고(문헌[Johnston et al., Infect. Immun. 74: 1171-1180 (2006)]); (3) CBA/CaHN-Btkxid/J 마우스에서 패혈증을 유발하는 침습성 균주 TIGR4(캡슐 타입 4) 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 활성 감소를 초래하며; (4) 야생형 균주와의 경쟁으로 폐 집락형성의 감소를 초래한다는 것이 밝혀졌다. 본 명세서의 교시는 PcpA가 면역원성이며, 특히, PcpA의 단편 및 변이체가 면역원성이라는 증거를 최초로 제공한다.

면역원성 폴리펩티드는 전장-길이 PcpA 아미노산 서열(신호 서열은 존재하거나 비존재함), 이의 단편, 및 이의 변이체를 포함한다. 전장-길이 PcpA는 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 CAB04758(스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 B6에서 유래), 진뱅크 수탁 번호 NP_346554(스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 TIGR4에서 유래) 진뱅크 수탁 번호 NP_359536(스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 R6에서 유래)를 포함한다.

선택적으로, PcpA의 면역원성 폴리펩티드는 하나 이상의 류신 풍부 영역(LRR)을 포함한다. 이러한 LLR은 천연적으로 생성된 PcpA내에 존재하거나 상기 천연적으로 생성된 LRR에 대해 약 60 내지 약 99%의 서열 동일성(예를 들어, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 포함함)을 지닌다. 성숙한 PcpA 단백질(즉, 신호 펩티드가 결여된 단백질)내의 LRR은 서열번호 1, 2, 41 또는 45의 서열 내부에서 확인될 수 있다.

PcpA의 면역원성 폴리펩티드는 선택적으로 천연적으로 생성된 성숙한 PcpA 단백질내에 전형적으로 존재하는 콜린 결합 앵커 서열이 결여되어 있다. 천연적으로 생성된 콜린 결합 앵커의 서열은 서열번호 52의 성숙한 PcpA 단백질이다. 더 특별하게는, 면역원성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환과 천연적으로 생성된 PcpA에 대하여 약 60 내지 약 99%의 서열 동일성 또는 상기 수치 사이의 임의의 서열 동일성(예를 들어, 80, 85, 90 및 95%)을 지닌다. N-말단 영역은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환의 존재 또는 부재하에 그리고 신호서열의 존재 또는 부재하에, 서열번호 1, 2, 3, 4, 41 또는 45의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. N-말단 영역은 서열번호 1, 2, 3, 4, 41 또는 45의 서열에 대하여 약 60 내지 약 99% 서열 동일성(또는 80 내지 99% 사이의 임의의 동일성)을 지니는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

서열번호 1, 2, 3, 4, 41 또는 45의 면역원성 단편은 서열번호 1, 2, 3, 4, 41 또는 45의 아미노산 잔기 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 및 191개를 포함하거나 5와 191 사이의 임의의 수의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시의 일환으로, 이와 같은 단편의 예는 LEKIEDRAFD(서열번호 5), FSELEEIELP(서열번호 6), ASLEYIGTSA(서열번호 7), FSFSQKLKKL(서열번호 8), TFSSSSKLEL(서열번호 9), ISHEAFANLS(서열번호 10), NLEKLTLPKS(서열번호 11), VKTLGSNLFR(서열번호 12), LTTSLNMLML(서열번호 13), LTTSLKHVDV(서열번호 14), RGMIVASVDG(서열번호 15), EEGNESFASVDG(서열번호 16), VSFQSKTQLI(서열번호 17), VLFSKDKTQLI(서열번호 18), YYPSQKNDES(서열번호 19), YKTPKETKEL(서열번호 20), ASYSFNKNSY(서열번호 21), LKKLELNEGL(서열번호 22), QKIGTFAFAD(서열번호 23), EKIGTFAFAD(서열번호 24), ATKLEEISLP(서열번호 25), AIKLEEISLP(서열번호 26), NSLETIERLA (서열번호 27), FYGNLELKELIL(서열번호 28)를 포함하는 아미노산를 포함한다.

선택적으로, PcpA의 면역원성 폴리펩티드는 LRR이 결여되어 있다, LRR이 결여된 면역원성 폴리펩티드의 일례는 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 31 또는 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 29, 30 또는 31의 임의의 면역원성 단편을 포함한다. 서열번호 30 및 31은 PcpA의 C-말단 잔기 내지 류신-풍부 영역을 포함한다.

본 명세서에 기재된 면역원성 폴리펩티드의 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 면역원성 폴리펩티드의 변이체는 서열번호 1 내지 31, 41 및 45 또는 이의 임의의 단편에 대해 약 60 내지 약 99% 서열 동일성(또는 60와 99% 사이의 임의의 동일성)을 지니는 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 본 명세서에 교시된 방법을 이용하여 이들의 면역원성 능력(capacity)에 관해 선별된다.

본 명세서에 기재된 PcpA의 면역원성 폴리펩티드는 PcpA의 단편 및 이와 같은 단편의 변이체를 포함한다. PcpA 단편의 변이체는 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 변형은 치환형, 삽입형 또는 결실형 변화를 포함한다. 변이체가 면역원성 폴리펩티드이기만 하다면, 치환, 결실, 삽입 또는 이의 임의의 조합은 단일 변이체에서 조합될 수 있다. 삽입은 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합을 비롯한 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 삽입은 보통 아미노 또는 카르복실 말단 융합물(예를 들어, 약 1 내지 4개의 잔기)의 삽입 보다 더 적은 수의 삽입일 것이다. 결실은 단백질 서열로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 전형적으로, 약 2 내지 6개 이하의 잔기가 단백질 분자 내부의 임의의 한 부위에서 결실된다. 이러한 변이체는 보통 단백질을 엔코딩하는 DNA의 뉴클레오티드에 대한 위치 특이적 돌연변이유발을 실행하고, 그에 따라 변이체를 엔코딩하는 DNA를 생산하고, 이후 재조합 세포 배양물에서 DNA를 발현시킴으로써 제조된다. 공지된 서열을 지니는 DNA의 미리 결정된 위치에 치환 돌연변이를 생성하기 위한 기술은 잘 알려져 있고, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 상기 기술에는 M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발이 포함된다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기에서 일어나지만 다수의 상이한 위치에서 한번에 일어날 수 있다. 치환 변이체는 하나 이상의 잔기가 제거되고 상기 잔기의 위치에 다른 잔기가 삽입되는 그러한 변이체이다. 이와 같은 치환은 일반적으로 하기 표 1에 따라서 이루어지고 보존적 치환으로 지칭된다. 그러나, 다른 치환이 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 변이체는 또한 상동성 pcpA 유전자 내부의 하나 이상의 위치에서 다형성(polymorphism)을 나타내는 다른 균주로부터의 천연적으로 생성된 pcpA 대립유전자를 포함한다. 변이체는 관용적인 분자 생물학 기술에 의해 생산될 수 있다. 변이체는 본 명세서에서 천연적으로 생성된 pcpA와 비교한 상대적인 서열 동일성으로 기재된다. 당업계의 통상의 기술자는 어떻게 2개의 폴리펩티드 또는 핵산의 서열 동일성을 결정하는지를 쉽게 이해한다. 예를 들어, 서열 동일성은 이 동일성이 가장 높은 수준으로 나타나도록 2개의 서열을 정렬시킨 후 계산될 수 있다. 정렬은 정렬 프로그램에서 사용되는 특정 알고리즘에 어느 정도 의존적이다. 상기 알고리즘은, 예를 들어, 스미스 및 워터만의 국소 상동성 알고리즘(문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]), 니들만 및 분쉬의 상동성 정렬 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]), 피어슨 및 리프만의 유사성 방법을 위한 검색(문헌[Pearson and Lipman, PNAS USA 85:2444 (1988)]), 상기 알고리즘의 컴퓨터화된 실행[위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)(제네틱 컴퓨터 그룹(Genetic Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재)에 있는 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA], BLAST와 BLAST 2.0 및 문헌[Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25:3389-3402, 1977; Altschul, et al, J. Mol Biol. 215:403-410, 1990; Zuker, M. Science. 244:48-52, 1989; Jaeger et al. PNAS USA 86:7706-7710, 1989; 및 Jaeger et al. Method Enzymol. 183:281-306, 1989]에 기재된 알고리즘을 포함한다. 이러한 참고 문헌 각각은 적어도 정렬 및 동일성의 계산과 관련된 문제에 대한 참고 문헌으로 포함된다. 상기 방법들 중 임의의 방법이 전형적으로 사용될 수 있으며, 특별한 경우에 이러한 다양한 방법의 결과는 다를 수 있다는 것은 이해된다. 서열 동일성이 예를 들어, 95%로 제공되는 경우, 이후 이와 같은 동일성은 허용된 계산 방법 중 적어도 한 방법으로 검출가능하여야 한다.

본 명세서에 기재된 면역원성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 유사체(analog) 또는 비-천연적으로 생성된 입체이성질체를 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 유사체와 입체이성질체는 tRNA 분자를 선택된 아미노산으로 채우고(charging), 위치 특이적 방식으로 유사체 아미노산을 펩티드 쇄(chain)내로 삽입시키기 위해, 예를 들어, 앰버(amber) 코돈을 이용하는 유전자 작제물을 조작함으로써 용이하게 폴리펩티드 쇄내로 통합될 수 있다(문헌[Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12: 158-163 (1994); Ibba and Hermecke, Biol technology, 12:678-682 (1994)])(상기 모든 문헌은 적어도 아미노산 유사체와 관련된 문제에 관한 참고 문헌으로 본 명세서에 포함된다). 펩티드와 유사하지만 천연 펩티드 결합(linkage)을 통해 연결되지 않은 면역원성 단편이 생산될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 또는 아미노산 유사체를 위한 결합은 CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH₂-, - CH(OH)CH₂-, 및 -CHH₂SO-를 포함할 수 있으며, 상기 결합과 기타 결합은 하기 문헌들에서 찾아볼 수 있다(문헌[Spatola, A. F. "Peptide backbone modifications: A structure-activity analysis of peptides containing amide bond surrogates, conformational constraints, and related backbone modification." In Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, pp. 267-357. Weinstein, B. editor, Marcel Dekker, New York, N.Y. (1983); Morley, Trends in Pharm. Sci. 1(2):463-468 (1980); Hudson, et al, Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (-CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H₂-S); Hann, Journal of the Chemical Society; Perkin Transactions. pp.307-314 (1982) (-CH-CH-, cis and trans); Almquist et al., J. Med. Chem. 23: 1392-1398 (1980) (-COCH₂-); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (-COCH₂-); 유럽 특허 공개 공보 EP0045665호[Szelke, et al. (1982)](-CH(OH)CH₂-); Holladay et al., Tetrahedron. Lett. 24:4401-4404 (1983)(-C(OH)CH₂-); 및 Hruby Life Sci 31: 189-199 (1982) (-CH₂-S-)])(상기 문헌 각각은 적어도 결합과 관련된 문제에 관한 참고 문헌으로 본 명세서에 포함된다).

아미노산 유사체와 입체이성질체는 종종 향상되거나 바람직한 특성, 예컨대, 더 경제적인 생산성, 탁월한 화학적 안정성, 증강된 약학 특성(반감기, 흡수, 잠재효능(potency), 효능 등), 변형된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성), 및 기타 특성을 지닐 수 있다. 예를 들어, D-아미노산은 더 안정한 펩티드를 생성시키는데 사용될 수 있는데, 이는 D 아미노산이 천연적으로 생성되는 펩티다아제에 의해 인지되지 않기 때문이다. 콘센서스(Consensus) 서열의 하나 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D-아미노산으로 전체적으로 치환하는 방법(예를 들어, L-리신 대신 D-리신으로 치환)이 더 안정한 펩티드를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 2개 이상의 펩티드를 고리화시키거나 이들을 함께 연결시키는데 사용될 수 있다. 이것은 펩티드를 특정한 형태로 구속시키는데(constraining) 이로울 수 있다(문헌[Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)])(상기 문헌은 참고 문헌으로 본 명세서에 포함된다).

PcpA의 면역원성 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 본 명세서에 기재된다. 선택적으로, 조성물은 추가로 애주번트를 포함한다. 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 다른 면역원성 폴리펩티드의 조합물을 함유할 수 있는데, 예를 들어, 면역원성 스태필로코쿠스(Staphylococcus) 폴리펩티드 또는 PspA의 면역원성 단편, 뉴모리신, 또는 이의 조합물을 함유할 수 있다.

선택적으로, 본 명세서에 기재된 조성물은 점막 표면(musosal surface) 투여용으로 적합하다. 조성물은, 예를 들어, 비강 스프레이, 분무기(nebulizer) 용액, 또는 에어로졸 흡입제(inhalant)일 수 있다. 따라서, 조성물은 용기내에 존재할 수 있으며 용기는 비강 스프레이, 분무기, 또는 흡입기일 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체는 생물학적으로 또는 달리 요망되는 물질을 의미하는데, 즉 상기 물질은, 임의의 요망되지 않는 생물학적 효과를 초래하거나 이것이 함유된 약학 조성물의 다른 성분들 중 임의의 성분과 해로운 방식으로 상호작용함이 없이, pcpA의 면역원성 단편과 함께, 피검체에 투여될 수 있는 물질이다. 담체는, 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 천연적으로 활성 성분의 임의의 분해를 최소화시키고 피검체내에서 임의의 해로운 부작용을 최소화시키기 위해 선택될 것이다.

적당한 담체 및 이들의 제형은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)]에 기재되어 있다. 전형적으로, 적절한 양의 약학적으로 허용되는 염이 제형에 사용되어 상기 제형이 등장성이 되도록 한다. 약학적으로 허용되는 담체의 예는 멸균수, 염수, 링거액과 같은 완충용액, 및 덱스트로스 용액을 포함하나, 이로만 국한되는 것은 아니다. 용액의 pH는 일반적으로 약 5 내지 약 8 또는 약 7 내지 약 7.5이다. 기타 담체는 면역원성 PcpA 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스와 같은 서방형 제조물(preparation)을 포함한다. 매트릭스는 성형물(shaped article), 예를 들어, 박막(film), 리포좀 또는 미세입자의 형태를 취한다. 특정 담체가, 예를 들어, 투여되는 조성물의 투여 경로 및 농도에 따라 더 선호될 수 있다는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 담체는 인간 또는 다른 피검체에게 PcpA 면역원성 단편을 투여하기 위한 목적으로 적합한 것들이다.

약학 조성물은 면역원성 폴리펩티드 이외에, 담체, 증점제(thickener), 희석제, 완충제, 보존제(preservative), 표면 활성제, 애주번트, 면역자극제를 포함할 수 있다. 또한, 약학 조성물은 항생제, 항염증제 및 마취제와 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.

애주번트는 금속성 염, 예컨대, 알루미늄 염을 포함하며, 애주번트 활성을 지니는 안전한 부형제를 제공하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 애주번트의 작용에 관한 메커니즘은 항원 투여 후 최대 3주 동안 주입 부위에 머무를 수 있도록 항원 데포(depot) 형성, 및 또한 항원 제시 세포에 의해 더 용이하게 받아들여 지는 항원/금속성 염 복합체의 형성을 포함하는 것으로 생각된다. 알루미늄 이외에, 아연, 칼슘, 세륨, 크롬, 철, 및 베릴륨의 염을 포함하는, 다른 금속성 염이 항원을 흡착시키는데 사용되어 왔다. 알루미늄의 수산화염 및 인산염이 가장 일반적이다. 알루미늄 염, 항원, 및 추가의 면역자극제를 함유하는 제형 또는 조성물이 당업계에 알려져 있다. 면역자극제의 일예는 3-데-O-아세틸화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)이다.

애주번트 및/또는 면역자극제는 폴리펩티드 조성물과 동시에(concomitantly), 상기 조성물의 투여 바로 직전에, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 선택적으로, 조성물은 추가로 애주번트를 포함할 수 있다. 애주번트 제형은, 예를 들어, 점막 유도성(inductive) 부위를 표적으로 삼는 제제를 포함한다. 애주번트는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 혈관신생 인자, 아폽토시스 억제자(inhibitor), 및 이들의 조합물을 포함하는 그룹에서 선택적으로 선택될 수 있다. 사이토카인이 애주번트로 선택되는 경우, 사이토카인은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, IL-1, IL-3, IL-2, IL-5, IL-6, IL-12, IL-15 및 IL-18을 포함하는 인터루킨; 변형 성장 인자-베타(TGF-β); 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF); 인터페론-감마(IFN-γ); 또는 애주번트 활성을 지니는 임의의 다른 사이토카인을 포함하는 그룹에서 선택될 수 있다. 또한 애주번트 활성 또는 기타 생물학적 활성을 지니는, 사이토카인의 일부분, 또는 사이토카인의 돌연변이체 또는 모방체(mimic)(또는 이들의 조합물)가 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다.

케모카인이 애주번트로 선택되는 경우, 케모카인은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 림포탁틴(Lymphotactin), RANTES, LARC, PARC, MDC, TARC, SLC 및 FKN을 포함하는 그룹에서 선택적으로 선택될 수 있다. 아폽토시스 억제자가 애주번트로 선택되는 경우, 아폽토시스 억제자는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 카스파제-8의 억제자, 및 이들의 조합물을 포함하는 그룹에서 선택적으로 선택될 수 있다. 혈관신생 인자가 애주번트로 선택되는 경우, 혈관신생 인자는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 히아루로난(hyaluronan, HA) 단편, 및 이들의 조합물을 포함하는 그룹에서 선택적으로 선택될 수 있다.

실질적으로 무독성이고, 생물학적으로 활성있는 애주번트의 다른 일예는, 호르몬, 효소, 성장 인자, 또는 생물학적으로 활성있는 이의 일부분을 포함한다. 이와 같은, 호르몬, 효소, 성장 인자, 또는 생물학적으로 활성있는 이의 일부분은, 예를 들어, 인간, 소, 돼지, 양, 개, 고양이, 말, 또는 조류에서 기원한 것일 수 있으며, 종양 괴사 인자(TNF), 프롤락틴(prolactin), 상피 성장 인자(EGF), 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1), 소마토트로핀(somatotropin)(성장 호르몬) 또는 인슐린, 또는 수용체(receptor)가 면역 시스템의 세포에서 발현되는 임의의 다른 호르몬 또는 성장 인자일 수 있다.

애주번트는 또한 세균 독소, 예를 들면, 콜레라 독소(CT), 대장균 열-민감성(heat-labile) 독소(LT), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile) 독소 A 및 백일해 독소(PT), 또는 이들의 조합물, 소단위체, 톡소이드(toxoid), 이들의 키메라(chimera), 또는 돌연변이체를 포함한다. 예를 들어, 정제된 천연 콜레라 독소 소단위체 B(CTB)가 사용될 수 있다. 또한, 애주번트 활성을 유지하고 있는 한, 상기 독소들의 임의의 절편, 상동체, 유도체, 및 융합물도 적합하다. 애주번트의 적합한 돌연변이체는, 예를 들어, WO95/17211(Arg-7-Lys CT 돌연변이체), WO 96/6627(Arg-192-Gly LT 돌연변이체), 및 WO 95/34323(Arg-9-Lys 및 Glu-129-Gly PT 돌연변이체)에 개시되어 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 추가적인 LT 돌연변이체는, 예를 들어, Ser-63-Lys, Ala-69-Gly, Glu-110-Asp, 및 Glu-112-Asp 돌연변이체를 포함한다. RH-3-리간드(ligand); CpG-모티프 올리고뉴클레오티드; 예를 들어, 대장균, 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 또는 시겔라 엑스네리(Shigella exneri)의 세균성 모노포스포릴 지질 A(MPLA); 사포닌(예를 들어, QS21), 또는 폴리락티드 글리콜라이드(polylactide glycolide, PLGA) 마이크로스피어와 같은, 다른 애주번트도 또한 사용될 수 있다. 가능한 다른 애주번트는 디펜신(defensin) 및 CpG 모티프이다.

본 명세서에 기재된 면역원성 폴리펩티드를 제조하는 방법과 이를 사용하는 방법 및 이와 같은 방법에 유용한 조성물이 제공된다. 폴리펩티드는 표준 분자 생물학 기술 및 발현 시스템을 이용하여 생성될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition by Sambrook et al, Cold Spring Harbor Press, 2001] 참조). 예를 들어, 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 pcpA 유전자의 단편은 단리될 수 있고 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 시중에서 입수할 수 있는 임의의 발현 벡터[예컨대, pBR322 및 pUC 벡터(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc., 미국 매사추세츠주 입스위크 소재)] 또는 발현/정제 벡터[예컨대, GST 융합 벡터(화이자 인코포레이티드(Pfizer, Inc., 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)]내로 클로닝되고 이후 적합한 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 숙주내에서 발현될 수 있다. 이후 정제는 관용적인 수단에 의해, 또는 상업적 발현/정제 시스템의 경우, 제조업자의 사용설명서에 따라서 이루어질 수 있다.

본 명세서에서 서열번호 1 내지 31, 41 및 45 중의 임의의 서열을 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 본 명세서에서 서열번호 32, 33 및 47의 서열을 포함하는 핵산이 제공되는데, 이 핵산은 전장 길이 PcpA 단백질 또는 이의 단편을 엔코딩한다. 또한 서열번호 32, 33 및 47의 축퇴된(degenerate) 변이체 및 이러한 축퇴된 변이체의 단편이 제공된다.

서열번호 1 및 2 또는 이의 단편을 엔코딩하는 핵산이 기재되어 있는데, 상기 핵산은, 각각, 서열번호 34 및 서열번호 35, 또는 이의 축퇴된 변이체 또는 단편을 포함한다.

서열번호 3 및 4 또는 이의 단편을 엔코딩하는 핵산은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 각각 서열번호 36 및 37, 또는 이의 축퇴된 변이체 또는 단편을 포함한다.

서열번호 41 또는 이의 단편을 엔코딩하는 핵산이 기재되어 있는데, 상기 핵산은 서열번호 42 또는 이의 축퇴된 변이체 또는 단편을 포함한다.

서열번호 45 또는 이의 단편을 엔코딩하는 핵산이 기재되어 있는데, 상기 핵산은 서열번호 46 또는 이의 축퇴된 변이체 또는 단편을 포함한다.

서열번호 29 또는 이의 단편을 엔코딩하는 대표적인 핵산은 서열번호 38 또는 이의 축퇴된 변이체 또는 단편을 포함한다.

더 구체적으로, 본 명세서에서 서열번호 32 내지 38, 42, 46 및 47로 지정된 서열 중 임의의 서열 또는 이의 축퇴된 변이체를 포함하는 핵산이 제공된다.

또한 매우 엄격한 조건하에서, 서열번호 32 내지 38, 42, 46 및 47 또는 상기 서열번호 32 내지 38, 42, 46 및 47의 보완체(complement) 또는 상기 서열의 임의의 단편 또는 이의 보완체를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지니는 혼성화 프로브의 전부 또는 임의의 일부분에 혼성화되는 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 혼성화되는 핵산의 혼성화되는 일부분은 전형적으로 15개 이상의(예를 들어, 15, 20, 25, 30, 40개 또는 그 이상) 뉴클레오티드 길이이다. 혼성화되는 일부분은 이것이 혼성화되는 서열의 일부분에 대해 80% 이상(예를 들어, 85%, 90% 또는 95%) 동일하다. 혼성화되는 핵산은, 예를 들어, 클로닝 프로브, 프라이머(예를 들어, PCR 프라이머), 또는 진단 프로브로서 유용하다. 핵산 듀플렉스(duplex) 또는 하이브리드 안정성은 용융 온도(melting temperature) 또는 Tm으로 표현되는데, 이 온도는 표적 DNA로부터 프로브가 용융되는 온도이다. 이 용융 온도는 요구되는 엄격도(stringency) 조건을 정의하기 위해 사용된다. 서열이 동일하다기 보다 프로브와 관련되어 있고 실질적으로 동일한 것으로 확인되는 경우, 용융 온도는 특정 염(예를 들어, SSC 또는 SSPE) 농도에서 상동성 혼성화만이 일어나는 가장 낮은 온도를 제일 먼저 확립시키는데 유용하다. 1% 미스매칭(mismatching)은 Tm에서 1℃ 감소를 초래하는 것으로 추정되며, 따라서 혼성화 반응에서 최종 세척 온도가 감소된다(예를 들어, 95% 이상의 동일성 서열을 지니는 서열을 추구하는 경우, 최종 세척 온도는 5℃까지 감소된다). 실제적으로, Tm에서의 변화는 1% 미스매치당 0.5와 1.5℃ 사이일 수 있다. 매우 엄격한 조건은 68℃에서 5X SSC/5X 덴하르트(Denhardt) 용액/1.0% SDS 중의 혼성화단계, 및 실온에서 0.2X SSC/0.1% SDS 중의 세척단계를 포함한다. 적절하게 엄격한 조건은 42℃에서 3X SSC 중의 세척단계를 포함한다. 염 농도 및 온도는 프로브와 표적 핵산 사이의 동일성의 최적 수준을 달성시키기 위해 달라질 수 있다. 이와 같은 조건에 관한 추가 지침은, 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 2001]에 기재된 종래 기술로부터 용이하게 이용할 수 있다.

따라서, 앞서 언급한 펩티드 서열, 변이체 및 이의 단편을 엔코딩할 수 있는 핵산이 개시되어 있다는 것은 이해된다. 핵산은 특정 단백질 서열과 관련된 모든 축퇴된 서열, 즉 하나의 특정 단백질 서열을 지니는 모든 핵산뿐만 아니라, 상기 단백질 서열의 개시된 변이체 및 유도체를 엔코딩하는, 축퇴된 핵산을 포함하는 모든 핵산을 포함할 것이다. 따라서, 각각의 특정 핵산 서열이 본 명세서에 기재되어 있지 않다하더라도, 본 명세서에는 각각의 서열 및 모든 서열이 사실상 개시된 것이며 상기 개시된 단백질 서열을 통해 본 명세서에 기재되어 있다는 것이 이해된다.

본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 벡터가 또한 개시된다. 따라서, 면역원성 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 1 내지 31, 41 또는 45 또는 이의 단편 또는 변이체)를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 벡터는 핵산 서열 서열번호 32 내지 38, 42 및 47 또는 이의 축퇴된 변이체 또는 단편 중의 임의의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 벡터의 핵산은 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 또는 상기 둘 모두)에 작동적으로 연결된다. 적당한 발현 벡터는 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고 다양한 공급원, 예컨대, 노바젠 인코포레이티드(Novagen, Inc., 미국 위스콘신주 매디슨 소재); 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재); 및 프로메가 코포레이션(Promega Corporation, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)으로부터 구입할 수 있다.

벡터를 포함하는 배양된 세포가 또한 제공된다. 배양된 세포는 벡터로 형질감염된 배양된 세포 또는 이 세포의 자손일 수 있는데, 여기서 상기 세포는 면역원성 폴리펩티드를 발현시킨다. 적당한 세포주는 당업계의 통상의 기술자에게 알려져 있고 예를 들어, 미국 미생물 보존센터[American Type Culture Collection (ATCC)]를 통해 구입할 수 있다.

형질감염된 세포는 면역원성 폴리펩티드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 이 방법은 면역원성 폴리펩티드의 발현을 가능케 하는 조건하에서(선택적으로, 발현 서열의 조절하에서), 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 면역원성 폴리펩티드는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 세포 또는 배양 배지로부터 단리될 수 있다.

면역원성 폴리펩티드는 더 거대한 폴리펩티드 또는 단백질의 표준 효소성 절단을 이용하여 제조될 수 있거나 단백질 화학 기술에 의해 2개 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 함께 연결함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 Fmoc(9-플루오레닐메틸카르보닐) 또는 Boc(tert-부틸옥시카르보닐) 화학반응을 사용하여 현재 가용한 실험실 장비를 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. (어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드(Applied Biosystems, Inc., 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재). 펩티드 축합 반응, 천연 화학 라이게이션, 고체상 화학, 또는 효소적 라이게이션에 의해, 2개의 단편이 카르보닐 및 아미노 말단에서 펩티드 결합을 통해 공유적으로 결합되어 면역원성 PcpA 폴리펩티드를 형성할 수 있다. (문헌[Synthetic Peptides: A User Guide., Grant, ed., W.H. Freeman and Co., New York, N. Y. (1992); Principles of Peptide Synthesis., Bodansky and Trost, eds. Springer-Verlag Inc., New York, N.Y. (1993); Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991); Dawson et al. Science, 266:776-779 (1994); Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nd Edition, Stewart, ed., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, (1984)])(상기 문헌들 모두는 본 명세서에 기재된 방법에 대한 참고 문헌으로써 여기에 포함된다).

하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 폴리펩티드 및 조성물은 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 피검체에서 PcpA에 특이적인 항체를 생성시키는 방법은 본 명세서에 기재된 면역원성 PcpA 단편을 상기 피검체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한 본 명세서에서 PcpA 폴리펩티드에 결합하는 항체를 비롯한 PcpA 폴리펩티드에 결합하는 항체 단편이 제공된다.

항체는 폴리클로날 항체이거나 모노클로날 항체일 수 있으며, 완전한 인간 항체이거나 인간화된 항체일 수 있으며, 천연적으로 생성된 항체와 단일-쇄 항체를 포함한다. 항체는 면역원성 PcpA 폴리펩티드를 피검체에게 투여함으로써 생체내에서 제조될 수 있다. 항체 생산은 하이브리도마(hybridoma) 방법을 이용하여 모노클로날 항체를 제조하는 단계를 포함한다. 하이브리도마 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며 콜러와 밀스테인의 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)] 및 하로우와 레인의 문헌[Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)]에 기재되어 있다(상기 문헌들의 전체 내용은 본 명세서에 기재된 방법에 대한 참고 문헌으로써 포함된다).

단일-쇄 항체의 생산을 위한 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,359,046호를 참조한다(상기 문헌의 전체 내용은 이와 같은 방법에 관한 참고 문헌으로써 여기에 포함된다). 단일 쇄 항체는 짧은 펩티드 링커를 이용하여 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 함께 융합시키고, 그에 따라 단일 분자 상에 항원 결합 부위를 재구성함으로써 생성된다. 한 가변 도메인의 C-말단이 15개 또는 25개의 아미노산 펩티드 또는 링커를 통해 다른 가변 도메인의 N-말단에 구속된(tethered) 단일-쇄 항체 가변 단편(scFv)이 항원 결합 또는 결합의 특이성을 유의적으로 파괴시키지 아니한 채 개발되었다. 링커는 중쇄와 경쇄가 이들의 적당한 형태적 배향으로 서로 결합될 수 있게 선택된다. 예를 들어, 허스톤 제이. 에스. 등의 문헌[Huston, J. S., et al., Methods in Enzym. 203:46-121 (1991)]을 참고한다(상기 문헌은 링커에 관한 문제를 위한 참고 문헌으로 포함된다).

PcpA 폴리펩티드에 대한 완전한 인간 항체 및 인간화된 항체가 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수령체(recipient) 항체)를 포함하는데, 상기 수령체의 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR)에서 유래된 잔기는 요망되는 특이성, 친화력 및 능력을 지니는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트 또는 래빗의 CDR에서 유래된 잔기로 대체된다. 일부 경우에 있어서, 인간 면역글로불린의 Fv 골격부(framework) 잔기는 대응되는 비인간 잔기로 대체된다. 면역접종시, 인간 항체의 완전한 레퍼토리(즉, 완전한 인간 항체)를 생산할 수 있는 유전자이식 동물이 이용될 수 있다.

키메라 및 생식선(germ-line) 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(J(H)) 유전자의 동형접합성(homozygous) 결실은 내생성(endogenous) 항체 생산의 완전한 억제를 초래한다. 이와 같은 생식선 돌연변이 마우스에서 인간 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 운반은 결과적으로 항원 공격시 인간 항체의 생산을 초래한다(예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemarm et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)] 참고). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생산될 수 있다(문헌[Hoogenboom et al., J. MoL, Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J, Mol. Biol, 222:581 (1991)]). 또한 코트 등[Cote et al.]의 문헌 및 보너 등[Boerner et al.]의 문헌에 소개된 기술이 인간 모노클로날 항체 제조를 위한 방법을 개시한다(문헌[Cole, et al., "The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer." In, Monoclonal Antibody and Cancer Therapy, Volume 27, Reisfeld and Sell, eds., pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., New York, N.Y., (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(l):86-95 (1991)]). 이러한 문헌들의 전체 내용은 본 명세서에 기재된 방법을 위한 참고 문헌으로써 포함된다.

본 명세서에서 사용된 항체 단편은 하이브리드 단편을 포함하면서, F(ab')2, Fab', 및 Fab 단편을 포함한다. 이와 같은 항체의 단편은 특이적인 PcpA 폴리펩티드에 결합하는 활성을 보유한다. 방법은 (ab) 발현 라이브러리(예를 들어, 문헌[Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281] 참조)를 구축하는데 사용되어 PcpA 폴리펩티드에 대한 요망되는 특이성을 지니는 모노클로날 F(ab) 단편의 신속하고 효과적인 식별(identification)을 가능케 할 수 있다. 폴리펩티드에 대한 이디오타입(idiotype)을 포함하는 항체 단편이, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 하기를 포함하는 당업계의 공지된 기술에 의해 생산될 수 있다: (i) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생산된 F(ab')2 단편; (ii) F(ab')2 단편의 이황화 가교를 환원시킴으로써 생성된 Fab 단편; (iii) 파파인 및 환원제로 항체 분자를 처리함으로써 생성된 F(ab) 단편; 및 (iv) F(v) 단편.

PcpA의 면역원성 단편 또는 이의 조성물을 피검체에게 투여하는 단계를 포함하는 피검체에서 폐렴구균 감염증의 위험을 감소시키는 방법이 본 명세서에 기재된다. 폐렴구균 감염증은, 예를 들어, 뇌수막염, 중이염, 폐렴, 패혈증, 또는 용혈성 요독증을 포함한다. 따라서, 이러한 감염증 중 하나 이상의 임의의 감염증의 위험은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 감소된다. 본 발명의 방법은 제 2 면역원성 단편을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 제 2 면역원성 단편은 PspA, 뉴모리신 또는 이의 조합물에서 유래될 수 있다. 제 2 면역원성 단편은 PcpA의 면역원성 단편의 투여와 동시에, 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다.

PcpA 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 조성물은 경구로, 비경구로(예를 들어, 정맥내로), 근육내로, 복강내로, 경피로 또는 국소로(비내 투여 또는 호흡계의 임의의 부분에 대한 투여를 포함) 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 호흡계에 대한 투여는 에어로졸분무(aerosolization) 또는 삽관(intubation)을 통한, 스프레이 메커니즘 또는 점적(droplet) 메카니즘에 의한 전달을 포함하는, 한쪽 또는 양쪽 콧구멍 또는 입을 통한 코 및 코 통로내로의 조성물의 전달을 의미한다.

요구되는 조성물 및 PcpA 폴리펩티드 또는 단편의 정확한 양은 종(species), 연령, 체중 및 피검체의 전반적인 상태, 사용된 폴리펩티드, 및 이의 투여 양상에 따라서, 피검체마다 달라질 것이다. 따라서, 모든 조성물을 위한 정확한 양을 특정하는 것은 가능하지 않다. 그러나, 적절한 양은 본 명세서의 상세한 설명에 따라 당업계의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 더욱이, 예를 들어, 프라임(prime) 섭생 및 부스트 섭생을 포함하는, PcpA 폴리펩티드 또는 단편의 복수 용량이 사용될 수 있다.

PspA와 뉴모리신의 조합물이 폐렴 및 패혈증에 대한 보호적 면역력을 유도하는데 있어서 단백질을 단독으로 사용한 경우보다 더 효과적이다(문헌[Briles et al., J. Infect. Immun. 188:339-48 (2003); Ogunniyi et al., Infect. Immiin. 68:3028-33 (2000)]). 따라서, PcpA 또는 면역원성 단편을 포함하는 조성물은 임의의 제 2의 PcpA의 면역원성 단편, PspA, 또는 뉴모리신, 또는 이의 조합물을 포함한다. 상기 참고 문헌들의 전체 내용은 본 명세서에 교시된 단백질들의 조합 방법 및 이들의 투여 방법에 관한 참고 문헌으로써 여기에 포함된다.

앞서 언급된 치료제(treatment) 중 임의의 치료제가 본 명세서에 기재된 조성물과 선택적으로 조합되어 사용될 수 있다. 조합물은 동시에(예를 들어, 혼합물로서), 별개로 그러나 일제히(simultaneously)(예를 들어, 별개의 정맥 혈관(intravenous line)을 통해 동일한 피검체내로), 또는 순차적으로(예를 들어, 화합물 또는 제제 중 하나가 먼저 투여되고 후속하여 다른 것이 투여됨) 투여될 수 있다. 따라서, 용어 "조합"은 2개 이상의 제제의 동시 투여, 일제 투여, 또는 순차 투여를 의미하기 위해 사용된다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 것과 같은, 단수형은 문맥에서 명백히 다르게 기술하지 않는 한 복수의 지칭대상(referent)을 포함한다. 따라서, 항원 단편에 대한 설명은 항원 단편들의 혼합물을 포함하며, 약학 담체 또는 애주번트에 대한 설명은 2개 이상의 그러한 담체들 또는 애주번트들의 혼합물을 포함한다.

본 명세서에서 사용된, 피검체는 개인을 의미한다. 따라서, 피검체는 길들여진 동물, 예컨대, 고양이와 개, 가축(예를 들어, 소, 말, 돼지, 양 및 염소), 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 래빗, 래트, 기니 피그) 및 새를 포함할 수 있다. 한 양상에서, 피검체는 포유동물, 예컨대, 영장류 또는 인간이다.

용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 이의 바로 뒤에 기재된 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는다는 것을 의미하며, 기재(description)는 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 어구 "조성물이 선택적으로 조합물을 포함할 수 있다"는 기재는 조합(즉, 개별 구성성분들의 조합물)의 존재 및 부재 둘 모두를 포함하도록 상기 조성물이 상이한 분자들의 조합물을 포함하거나 조합물을 포함하지 않을 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 범위는 한 특정 값의 근사치로부터, 및/또는 또 다른 특정 값의 근사치까지로 표현될 수 있다. 이와 같은 범위가 표기될 때, 또 다른 양상은 한 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지 포함한다. 유사하게, 선행사 "약"의 사용에 의해, 해당 값이 근사치(approximation)로 표기되는 경우, 특정 값이 또 다른 양상을 이룬다는 것이 이해될 것이다. 상기 범위 각각의 종결점은 다른 종결점과 관련되거나, 다른 종결점과 독립적으로, 또는 상기 둘 모두의 측면에서 유의미하다는 것이 추가로 이해될 것이다.

용어 "예방하다(prevent)", "예방하는(preventing)", 및 "예방(prevention)"은 본 명세서에서 해당 조건(예를 들어, 폐렴구균 감염증의 예방)을 위한 주어진 치료제와 연계되어 사용될 때, 이러한 용어들은 치료된 환자가 해당 조건을 임상적으로 관찰가능한 수준으로 전혀 발달시키지 않거나, 그/그녀가 치료를 받지 아니할 경우에 비해 해당 조건을 서서히 발달시키고/시키거나 더 적은 정도로 발달시킨다는 것을 의미한다. 이러한 용어들은 그것이 어떠한 양상일지라도 환자가 해당 조건의 양상을 경험하지 못한 임의의 상황에만 국한되지 아니한다. 예를 들어, 치료제가 주어진 병태의 발현(manifestation)을 일으킬 것으로 기대되는 자극에 환자가 노출되는 동안 주어지고, 그 결과 환자가 예상한 것과는 달리 더 적고/적거나 유순한 조건의 증상을 경험하게 된다면, 해당 치료제는 상기 조건을 예방하는 것으로 칭해질 것이다. 치료제는 환자가 오직 감염증의 유순한 현시 증상만을 나타내도록 함으로써 감염을 예방할 수 있고; 이것이 감염 미생물에 의한 임의의 세포에 대한 침투가 존재하지 아니하여야 한다는 것을 의미하지는 않는다.

유사하게, (예를 들어, 폐렴구균 감염증의 위험도를 감소시키는) 주어진 치료제를 이용한 감염의 위험도와 연계되어 본 명세서에서 사용된 용어 "감소시키다", "감소시키는", 및 "감소"는 대조군 또는 치료제(예를 들어, 면역원성 폴리펩티드의 투여)의 부재시 발달되는 감염증의 기저 수준과 비교하여 피검체가 감염증을 더 서서히 또는 더 적은 수준으로 발달시킨다는 것을 의미한다. 감염증의 위험도의 감소는 결과적으로 환자가 오직 감염증의 유순한 현시 증상을 나타내거나 감염증의 증상 지연을 나타내도록 할 수 있고; 이것이 감염 미생물에 의한 임의의 세포에 대한 침투가 존재하지 아니하여야 한다는 것을 의미하지는 않는다.

개시된 방법 및 조성물은 달리 명시하지 않는 한 특정 합성 방법, 특정 분석 기술, 또는 특정 시약으로만 국한되지 아니하며, 그 자체로 달라질 수 있다는 것이 이해된다. 또한 본 명세서에 사용된 용어(terminology)는 단지 특성 구체예를 설명하기 위한 목적으로 사용된 것이며 국한시키려는 의도로 사용된 것이 아니다.

본 발명의 다수의 구체예들이 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 더욱이, 한 특징 또는 단계가 기재된 경우, 상기 조합이 명확하게 언급되지 아니한 경우라 할지라도 본 명세서의 임의의 다른 특징 또는 단계와 조합될 수 있다. 따라서, 다른 구체예들이 특허청구범위의 영역내에 포함된다.

실시예 1: PcpA 가 폐 감염 및 치사성 패혈증에 대한 보호를 개시시킨다.

실험재료 및 실험방법.

박테리아 균주, 배지, 및 성장 조건. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 TIGR4 및 EF3O3O, 이들의 유도체를 본 연구에 사용하였다. 폐렴구균을 37℃에서 0.5% 효모 추출물(THY)과 함께 토드-헤위트 브로쓰(Todd-Hewitt broth) 중에서 또는 달리 언급하지 않는한 혈액 아가 플레이트 상에서 성장시켰다. 적절한 시기에, 에리쓰로마이신을 0.3 ㎍/㎖의 농도로 상기 배지에 첨가하였다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 임상 단리주(clinical isolate)(표 2) 및 주요 클론 그룹의 단리주(표 3)를 사용하였다.

(*) 환자의 본래 단리주로부터 10회 이상 계대배양에 의해 분리되지 아니한 임상적 균주. R6는 1920년대의 환자 단리주였던, 균주 D39에서 유래되었다.

이러한 연구들에서 사용된 임상 균주들은 지난 25년 동안 단리되었다. PcpA의 가능한 다양성을 시험하기 위해 단리주가 스트렙토코쿠스 뉴모니애 게놈 다양성 프로젝트(http://genome.microbio.uab.edu/strep/info)에서 활용된 균주의 그룹에서 선택되었다.

균주 제작과정이 진행되는 동안, 플라스미드를 루리아-베르타니(Luria-Bertani, LB) 브로쓰 또는 1.5% 아가를 지니는 LB 플레이트에서 성장된 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) TOP1O 세포(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에서 유지시켰다. pCR2.1, pCR4 및 pET-20b-기초 플라스미드의 경우 암피실린(50㎍/㎖) 또는 pJY4164-기반 플라스미드의 경우 에리쓰로마이신(400㎍/㎖)을 성장 배지에 첨가하였다.

고 망간 배지에서 박테리아를 성장시키기 위해 THY 배지를 사용하였다. 저 망간 조건에서 성장시키는 경우, 망간 결핍된 형태의 THY를 제조하였다. THY 배지를 제조업자의 지침에 따라 제조하였는데, 오토클레이빙(autoclaving)에 앞서 켈렉스(Chelex)-100(2% w/v)(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스 소재)을 첨가하였다. 오토클레이빙 후, THY/켈렉스 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고 난 후, 뒤이어 멸균 여과하였다. ZnCl₂, MgCl₂, CaCl₂ 및 FeSO₄를 각각 1mM의 농도로 첨가하고, MnSO₄를 사용 직전에 0.1μM의 농도로 첨가하였다. 성장을 600nm에서의 광학 밀도로 모니터링하였다.

균주 제작. 본 연구에 사용된 E. coli 균주, 플라스미드, 및 프라이머가 나열되어 있다(표 4). 돌연변이유발을 이용하여 모 균주 TIGR4 및 EF3030에서 pcpA를 불활성화시켰다. 돌연변이체 균주 제작은 이전에 수행되었고 문헌[Johnston, et al, Infect. Immun. 74: 1171-80 (2006)]에 기재되어 있다.

^a 프라이머는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 TIGR4(2)의 완전한 게놈 서열에 기초하였다. 소문자(Lowercase)는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 생성시키는데 사용된 미스캐치를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'으로 기재된다.

재조합 PcpA 발현 및 정제. 본 연구에 사용된 균주, 플라스미드, 및 프라이머는 표 2에 나열되어 있다. 균주 TIGR4에서 1126 bp의 pcpA 단편을 증폭시키기 위해 프라이머 DTG-16(5'-CGCGGATCCATATGTCCCTAATGAACC-3'(서열번호 39)) 및 DTG-12(5'-GCGCTCGAGTTCCTTTAATGAATCTAAGACGCCACTTAGGAAGAAGGAC-3'(서열번호 40))을 디자인하였다. 프라이머는 조작된 제한효소 엔도뉴클레아제 부위인, BamHI 및 XhoI을 각각 함유한다. 3.0mM MgCl₂, 125μM dNTP, 각각의 프라이머 50 피코몰, 및 Taq DNA 폴리머라아제 2.5 단위를 포함하는 총 50㎕ 부피의 칵테일 중에서 30 사이클 동안 반응을 진행시켰다. 사이클은 94℃에서, 1분간; 55℃에서, 1분간; 72℃에서, 5분간 진행되었다. 플라스미드 pLMG를 형성하는 T-테일드(tailed) 방법으로 이 증폭된 유전자 단편을 처음에 pTOPO4(인비트로겐 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)로 클로닝시켰다.

이 단편을 TOPO TA 클로닝 키트(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)로 pCR4에 클로닝시켰다. 정제된 플라스미드를 BamHI와 XhoI(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 엔도뉴클레아제 절단으로 스크리닝하였다. 아가로스 겔 전기영동, PCR 분석, 및 DNA 시퀀싱을 모두 이용하여 결과적으로 생성된 플라스미드, pDG-1에서 pcpA 단편의 삽입을 확인하였다. pDG-1로부터의 삽입물을 pET-20b 발현 벡터(노바젠, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 서브클로닝시켰다. 그 결과 얻어진 플라스미드, pJM-1을 단백질 생산을 위한 E. coli 균주 로세타블루(RosettaBlue)(DE3) pLysS(노바젠, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 형질전환시켰다. 이 균주는 유도성 UV5 프로모터의 조절하의 T7 프로모터의 염색체 복사본을 함유한다. IPTG 유도시, 아미노산 19-391을 함유하는, 절단된(truncated) 단백질이 발현되었다. 과-발현된 절단된 단백질을 노바젠 HIS-BIND(등록상표) 정제 키트(노바젠, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 이용하여 정제하였는데, 상기 키트는 정제를 용이하게 하기 위해 C-카르복시 말단 히스티딘 태그를 이용한다. 코마시 블루(Comassie Blue)를 이용한 후속 SDS-PAGE 분석은 대략 41-kDa의 단일 밴드를 산출시켰다.

클로닝되고 발현된 rPcpA 단백질의 완전한 서열이 하기에 제시된다. 밑줄 그은 부분은 클로닝 벡터에서 유래한 것이다.

항-PcpA 폴리클로날 항체 생산. 항-PcpA 폴리클로날 혈청을 획득하기 위해 정제된 rPcpA를 사용하여 뉴질랜드 흰색 래빗(미르틀 래비티(Myrtle's Rabbity), 미국 테네시주 톰슨 스테이션 소재)을 피하 투여로 면역접종시켰다. 래빗에게 1㎖의 프레운트(Freund) 컴플리트 애주번트 중의 100㎍의 rPcpA를 총 부피 2㎖로 피하 투여로 주입하였다. 2차 부스트로 프레운트 컴플리트 애주번트 중의 100㎍의 rPcpA를 2주 후에 주입하고 3차 부스트로 프레운트 컴플리트 애주번트 중의 100㎍의 PcpA를 상기 2차 부스트 주입 2주 후에 주입하였다. 최종 부스트 투여 2주 경과 후, 마취하에서, 심장 천자로 래빗에서 채혈하였다. 혈액을 응고시키고, 원심분리로 혈청을 획득하고 -80℃에 저장하였다.

스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주내 pcpA의 PCR 확증. 다양한 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주에서 pcpA의 존재 또는 부재를 PCR 프라이머 쌍 BGP-1과 BGP-2를 이용하여 검사하였다. 프라이머 쌍은 균주 TIGR4에서 pcpA의 1416bp 길이의 N -말단 단편을 증폭시키기 위해 디자인되었다. 그런 다음 PCR 생성물을 T.A.E. 아가로즈 겔에서 분리시키고, 에티듐 브로마이드로 염색하고, 증폭된 밴드의 정확한 크기를 시험하였다.

스트렙토코쿠스 뉴모니애 세포 분획화. 요터와 화이트의 문헌[Yother and White, J. Bacteriol 176:2976-85 (1994)]에 기재된 방법을 약간 변형하여 원형질체(protoplast)를 생산하였다. MTHY에서 성장시킨, 대수기(Log-phase) 세포를 펠렛화하고 PBS에서 세척하였다. 세포를 이후 0.5㎖의 2% 콜린 클로라이드에 재현탁시키고 튜브를 수회 인버팅시켰다. 이후 세포를 펠렛화시키고 상청액을 따라 버리고 -2O℃에서 보관하였다(콜린 용리 분획). 세포를 펠렛화시키고 300㎕의 원형질체 완충액(20% 수크로오스, 5 mM Tris [pH 7.4], 2.5 mM MgSO₄)으로 1회 세척하였다. 펠렛을 이후 1㎖의 원형질체 완충액에 재현탁시키고, 이후 무타노리신(Mutanolysin)(시그마 알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)을 펠렛화된 배양물 ㎖ 당 5U로 첨가하였다. 현탁액을 실온에서 밤새 인큐베이션시켰다. 세포를 6000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화시키고, 상청액을 -20℃에 보관하였다(세포 벽 분획). 원형질체를 이후 1㎖의 원형질체 완충액으로 세척하였다. 원형질체의 형성을 현미경 검사로 확증하였다. 원형질체를 펠렛화시키고 0.3 - 1㎖의 dH₂O에서 분해시키고, 이것을 -2O℃에 보관하였다(막/세포질 분획). 각 분획 샘플을 웨스턴 블랏 분석으로 PcpA의 존재에 대해 시험하였다.

스트렙토코쿠스 뉴모니애의 항체 염색. 고 또는 저 망간 배지에서 성장시킨, 중간 대수기 세포(OD₆₀₀ O.6)를 펠렛화시키고, PBS로 세척하고, 1% 소 혈청 알부민을 지니는 PBS(PBSB)에 재현탁시키고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 펠렛화시키고 PBSB 또는 PBSB에서 1:100으로 희석된 항-PcpA 혈청에 재현탁시키고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션에 후속하여 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 이후 PBSB에서 희석된 염소 항-래빗 면역글로불린 G(중쇄 및 경쇄)-플루오레신 이소티오시아네이트(서던 바이오테크놀로지 어쏘시에이트스 인코포레이티드(Southern Biotechnology Associates, Inc., 미국 알라바마주 버밍행 소재)와 같이 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 이후 PBS로 2회 세척하고 0.01 mM의 친지성 막 염료 TMA-DPH(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 포함한 PBS 중의 4% 포름알데히드에 현탁시켰다. 박테리아 세포를 이후 올림푸스(Olympus) IX 70 현미경을 이용하여 동시형광법(epifluorescence)으로 검사하였다.

웨스턴 블랏. 박테리아 배양물을 THY와 MTHY에서 중간-대수기(OD₆₀₀ 0.6)까지 성장시켰다. 각 균주의 등가량을 인산으로 완충된 염수(PBS)로 2회 세척하고, 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 샘플 완충액과 함께 PBS 중에서 재현탁시키고, 5분 동안 끓였다. 샘플 및 전-염색된(pre-stained) 단백질 표준(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 NuPAGE 10% Bis-Tris 겔(Invitorgen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 상에 로딩시키고 제조업자의 사용설명서에 따라 포르폴린에탄설폰산(MES)-SDS 전개 완충액(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 중에서 전기영동시켜 분리하였다. 단백질을 이후 트랜스-블랏(Trans-Blot) SD 반건조 전이 세포(바이오-래드(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 허큘리스 소재))를 지니는 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. 블랏을 PBSB 중에서 1:1000으로 희석된 항-PcpA 폴리클로날 항체로 탐침하였다. 염소 항-래빗 면역글로불린 G(중쇄 및 경쇄)-알카라인 프로스타아제 및 스트렙토아비딘-알카라인 포스파타아제(서던 바이오테크놀로지 어쏘시에이트스 인코포레이티드, 미국 알라바마주 버밍행 소재)를 2차 항체로 사용하였다. 시그마 패스트(Sigma Fast) 니트로블루테트라졸리움-5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페티트(NBT-BCIP) 정제(시그마 알드리치, 스위스 소재)로 비색(colorimetric) 검출을 수행하였다.

마우스의 전신 면역접종. 6-8주령의 CBA/CaHNBtkxid/J(CBATN) 마우스(잭슨랩스(JacksonLabs, 미국 메인주 바 하버 소재))에게 처음에 애주번트로서 2㎍의 수산화알루미늄과 10㎍의 rPcpA(총 부피 200㎕)를 피하로 주입하였다. 2차 부스트로 수산화알루미늄과 10㎍의 rPcpA를 2주 후에 주입하였다. 수산화알루미늄 없이 10㎍의 rPcpA를 포함한 3차 부스트를 2주 후에 주입하였다. 마우스를 이후 2주 동안 휴식시키고 난 후 스트렙토코쿠스 뉴모니애로 공격하였다. 감염 24시간 전에 마우스로부터 채혈하였다.

패혈증의 뮤린 모델. 폐렴구균의 병원성을 종래 기술된 감염에 대한 전신 모델로 시험하였다(문헌[Coats, et al, Vaccine 23:4257-62 (2005); Ren et al., Infect. Immun. 71:75-85 (2003)]). 6-8 주령 CBA/N 마우스에 락테이트화된 링거에 희석시킨 300 CFU의 박테리아를 정맥내 투여로 주입하였다. 마우스를 21일 동안 모니터링하였다. 마우스들이 접촉에 민감하게 반응하지 않게 되고 이들의 체온이 정상 온도 보다 저하되었을 때, 마우스들을 빈사 상태에 따라 스코어링하고 날짜와 시간을 기록하였다. 빈사 상태의 모든 마우스를 CO₂ 마취로 마취시켰다.

폐렴의 뮤린 모델. 폐 감염을 종래 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌[Balachandran et al., Infect. Immun. 70:2526-34 (2002); Briles et al., J. Infect. Dis. 188:339-48 (2003); Takashima et al., Infect. Immun. 65:257-260 (1997)]). 6-8 주령 CBA/N 마우스를 이소플루란(민라드(MinRAD, 미국 뉴욕주 버팔로 소재))으로 마취시키고, 5 x 10⁶마리의 박테리아를 함유한 40㎕의 락테이트화된 링거 용액의 현탁액을 마우스의 콧구멍으로 도입시켜 호흡 폐렴을 유도하였다. 7일 후, 마우스를 희생시켰다. 희생시킨 마우스의 코 공동을 종래 기재된 바와 같이 50㎕의 락테이트화된 링거액으로 세척하였다(문헌[Wu et al., J. Infect. Dis. 175:839-46 (1997)]). 코 세척물을 연속하여 희석시키고 젠타마이신(4 ㎍/㎖)과 함께 혈액 아가 상에 플레이팅하였다. 폐를 회수하고 스토마커 백(stomacher bag)에 담긴 2㎖의 락테이트화된 링거액에 넣고, 균질화시키고, 연속하여 희석시키고, 연속 3배 희석액 중의 젠타마이신을 지니는 혈액 아가 상에 플레이팅하였다.

비인강 집락형성의 뮤린 모델: 비내 접종을 종래 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌[Balachandran et al., Infect. Immun. 70:2526-34 (2002); Wu et al., J. Infect. Dis. 175:839-46 (1997)]). 마취없이 6-8 주령 CBA/N 마우스에 10㎕의 락테이트화된 링거 용액 중의 10⁶마리의 박테리아를 비내 투여로 감염시켰다. 감염된 마우스를 이후 희생시키고, 이들의 코 공동을 50㎕의 링거 용액으로 세척하였다. 코 세척물을 연속적으로 희석하고 젠타마이신을 지니는 혈액 아가 상에 플레이팅하였다. 밤새 37℃로 캔들 항아리에서 인큐베이션한 후 혈액 아가 플레이트에서 육안으로 확인할 수 있는 수치를 측정하였다.

통계 분석. 인스타트(Instat)(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software Inc., 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재))를 이용하여 통계학적으로 분석을 실시하였다. 대조군 및 실험군 간의 빈사 상태에 이르는 시간 또는 회수된 CFU의 수치에 대한 비교를 만-휘트니 2종 샘플 랭크 시험을 이용하여 수행하였다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.

결과

pcpA는 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 임상적으로 적절한 균주에 존재한다. pcpA의 존재를 pcpA의 LRR 영역에 걸쳐있는(spanning) 프라이머(BGP1 및 BGP2)를 이용하여, PCR로 검사하였다. 시험된 23종의 균주 각각은(표 2 및 3) 대략 1500-bp 길이의 단편을 생산하였다. 이러한 균주들 중 8개 균주는 지난 25년간 동정된 임상 균주로서 7-가 컨주게이트 백신에 의해 조절되는(covered) 7가지 공통 캡슐 타입의 대표 균주이다(도 1). 나머지 12가지 균주는 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 다양성의 폭을 확실히 파악하기 위해 선택된 균주의 세트를 포함하는, 게놈 다양성 프로젝트(http://genome.microbio.uab,edu/strep/info/)의 일부분으로서 모아진 균주 세트에서 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 세트이다. 이러한 12가지 균주는 MLST 데이터에 기초하여 고도로 분기된 균주로서 선택되었다. 4가지 균주는 심각한 침습성 질병을 지닌 환자에서 유래되었고, 5가지 균주는 무증상 보균체(carriage)에서 유래되었으며(2가지 균주의 경우 질병/집락형성이 미지였음), 1가지 균주는 전세계적인 항생제 내성 클론에서 유래되었다. 이러한 균주는 세계의 상이한 지역으로부터의 12가지 상이한 캡슐 타입을 나타낸다.

모든 균주에서 PcpA의 발현에 대해 시험하기 위해, 균주를 저(≤ 0.1 μM) 망간 중에서 성장시켰다. 전체 세포 단백질 샘플을 저 망간 배지에서 배양된 중간 대수기 세포로부터 제조하였다. (표 2 및 3에) 제시된 모든 균주를 시험하였으나, 단지 7가 백신에 포함된 캡슐 타입을 나타내는 균주들만 도시되어 있다(도 2). 전체 세포 단백질 샘플을 SDS-PAGE로 분리시키고 니트로셀룰로오스에 옮겼다. 블랏을 항-PcpA 폴리클로날 항혈청으로 탐침하여, 캡슐 혈청형 4, 6, 9, 14, 18, 19, 23의 이러한 야생형 균주 각각에서 대략 62-kDa의 밴드를 확인하였다(도 2). 이 62-kDa 밴드는 pcpA-불활성화된 돌연변이체 JEN11에 존재하지 않았으나, 대표적인 7종의 균주에 존재하였다. 전체 세포 단백질 샘플을 또한 동일한 균주를 위한 고 망간 배지에서 성장시킨 균주로부터 제조하였으며, 그러나 밴드가 항-PcpA 항혈청으로 확인되지 아니하였다. 웨스턴 블랏 데이터와 조합된 PCR 분석은 pcpA가 표 2와 3에 나열된 모든 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주에 존재한다는 것을 입증하였다.

PcpA는 저 망간 조건하에서 스트렙토코쿠스 뉴모니애가 표면 상에 노출되어 있다. 연구 결과 조절자 PsaR의 작용을 통해, 망간이 pcpA 유전자의 전사를 조절한다는 것이 밝혀졌다(문헌[Johnston et al, Infect. Immun. 74:1171-80 (2006)]). 본 명세서에 기재된 바와 같이, 망간 의존성 조절은 직접적으로 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 표면 상의 PcpA 존재에 영향을 미치며 표면 PcpA는 심지어 캡슐화된 폐렴구균에 대한 항체에 접근가능하다.

세포 분획화를 실행하여 PcpA가 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 세포벽 또는 세포막/세포질과 연관되어 있는지 여부를 결정하였다. 이러한 세포 분획에 대한 웨스턴 블랏 분석은 PcpA가 저 망간 배지에서 성장한 박테리아인, 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 세포벽에 현저하게 존재한다는 것을 보여주었다. PcpA의 적은 분획은 세포막/세포질과 연관되어 있었으며, 아마도 박테리아의 표면으로 아직 이출(export)되지 아니한 PcpA를 나타낸다.

세포 분획화 이외에, 야생형 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 TIGR4로부터의 대수기 세포를 고 또는 저 망간 배지에서 성장시키고, 항-PcpA 폴리클로날 항혈청으로 염색하고 후속하여 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)-컨주게이션된 항-래빗 면역글로불린으로 염색하였다. 구체적으로, TIGR4를 중간-대수기까지 고 또는 저 Mn2+ 배지에서 배양하였다. 박테리아를 항-PcpA 래빗 혈청과 함께 인큐베이션시키고, 후속하여 FITC-컨주게이션된 항-래빗 Ig 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 이후 막 안료 TMA-DPH를 함유한 4% 포름알데히드에서 고정시켰다. 표지된 박테리아를 이후 면역형광 현미경으로 검사하였다. PcpA에 대한 항체는 저 망간에서 성장된 박테리아의 염색을 매개할 수 있었으나, 고 망간에서 성장된 박테리아에 대해서는 그렇지 못하였다.

이러한 결과들은 PcpA가 시험관내 저 망간 조건하에서 배양된 야생형 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 노출된 표면에 존재한다는 것을 시사한다. 이것은 PcpA가 숙주 내부, 예컨대, 폐 및 혈액의 박테리아 감염 저 망간 부위에 발현되며 상기 부위에 노출되어 나타난다는 것을 시사한다. PcpA의 이러한 노출은 감염이 진행되는 동안 박테리아와 숙주 상피 사이의 PcpA-리간드 상호작용을 용이하게 한다. 이러한 결과는 또한 망간 농도에 의한 PcpA 생산 조절이 대부분의 폐렴구균에 대해 일반화될 수 있다는 것을 시사한다.

rPcpA로의 면역접종은 항체를 유도시키며 폐 및 전신성 감염에 대한 보호를 제공하나, 비인강 집락형성에 현저하게 영향을 미치지 아니한다. 감염 연구에 이용하기에 앞서, 마우스에 수산화알루미늄과 함께 rPcpA를 면역접종하거나 수산화알루미늄만을 면역접종하였다. 두 그룹의 마우스를 대상으로 ELISA로 총 Ig(H+L)에 대해 정량하였다. 면역접종된 마우스 혈청내의 PcpA 특이적 항체의 기하 평균 수준은 0.465(±0.119) ㎍/㎖이었으며, 반편 애주번트만을 주입받은 마우스의 경우 평균은 0.002(±0.002) ㎍/㎖이었다(±SEM). 이것은 면역접종 경로가 rPcpA에 대한 면역 반응을 유도시키는데 있어서 성공적이었다는 것을 시사한다.

면역접종이 폐렴으로부터 마우스를 보호하였는지 여부를 알아 보기 위해, 면역접종된 마우스 및 명반만 주입한 마우스를 약하게 마취시키고 콧구멍내로 5 x 10⁶ CFU의 균주 EF3030을 접종하였다. 이 절차는 결과적으로 균혈증 없이 국소(focal) 폐렴을 초래하였다. 따라서 이 모델에서 보호는 그 자체로 폐렴과 연관이 있을 수 있으며 일반적으로 패혈증과는 연관이 없을 수 있다. 감염 7일 후 모든 마우스를 희생시켰다. 박테리아 수치를 균질화된 폐 조직과 비강 세척물로부터 계수하였다. 회수된 CFU 중앙값에 기초할 때, rPcpA로 면역접종된 마우스의 폐 균질액으로부터 회수된 폐렴구균 수치는 애주번트만을 주입받은 마우스의 폐 균질액으로부터 회수된 폐렴구균 수치의 1/100 미만이었다(도 3A)(P=0.002). 이러한 결과는 rPcpA로의 면역접종이 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 폐 감염에 대한 보호를 유도시킬 수 있다는 것을 제시한다. rPcpA로 면역접종된 마우스와 애주번트만을 주입받은 마우스의 비강 세척물로부터 회수된 박테리아 수치에 있어서 유의한 차이는 없었다(도 3B). 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 혈청형 6으로부터의, 재조합 PcpAΔSPΔCBD(rPcpAΔSPΔCBD)(아래에 상세하게 기재됨)가 또한 폐렴의 마우스 모델에서 폐 감염에 대해 보호하였으나 집락형성에 대해서는 그러하지 못했다.

다음으로, 피하 면역접종이 다른 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주(TJ0893, 혈청형 14; EF9303, 혈청형 23F; 및 L82016, 혈청형 6B)의 국소 폐 감염에 대하여 보호를 부여할 수 있는지 여부를 결정하였다. rPcpA로의 피하 면역접종은 단지 애주번트만을 면역접종한 마우스와 비교할 때 각 균주에 대한 현저한 보호를 유도하였다(도 5).

PcpA의 발현은 최적의 비강 집락형성에 필요하지 않다. 면역접종은 폐렴 모델에서 사용된 마우스의 비강 세척물로부터 회수된 박테리아의 수에 영향을 미치지 않았기 때문에, pcpA 재활성화의 영향이 비강인두 보균체 모델에서 시험되었다. 폐렴 모델에서 마우스의 비강 세척물로부터 수집된 간접적인 관찰과는 상반되게, 이 모델은 비강 보균체에 대한 PcpA의 임의의 효과에 대한 직접적인 검증이 가능케 하였다. 마우스에 10⁶ CFU의 균주 EF3030 또는 이의 pcpA-불활성화 돌연변이체 JEN18을 마취 이전에 또는 마취 없이 접종시켰다. 감염 7일 경과 후, 마우스를 희생시키고 비강 세척물을 수집하고 폐렴구균을 검출하기 위해 플레이팅하였다. EF3030 또는 JEN18을 접종시킨 마우스의 비강 세척물로부터 회수된 박테리아의 수에서 유의한 차이는 없었다(도 5).

마우스의 비강 세척물에서 회수된 폐렴구균의 수에 영향을 미치기 위한 온전한 pcpA 유전자의 부재 또는 rPcpA를 이용한 피하 면역접종의 실패는 코인두내 망간 농도(≥ 36μM)가 pcpA 전사를 억제시키는데 충분히 높다는 사실과 일치한다. 이러한 조건하에서 pcpA 전사는 코인두내, psaR에 의해, 억제될 것이다. 따라서, PcpA에 대한 면역원성은 이의 숙주 부위내의 박테리아에 거의 영향을 주지 못할 것으로 예상된다.

PcpA 및 PcpA에 대한 면역원성은 전신성 감염의 뮤린 모델에서 병원성에 영향을 미친다. 패혈증에 대한 보호를 제공할 수 있는 PcpA에 대한 면역원성의 활성을 평가하기 위해, CBA/N 마우스를 수산화알루미늄 중의 PcpA 또는 대조군으로서 수산화알루미늄만으로 피하 투여로 면역접종시키고 정맥내 투여로 TIGR4 스트렙토코쿠스 뉴모니애, 캡슐 타입 4로 공격하였다. 이 균주는 마우스에서 균혈증과 패혈증을 용이하게 유발할 수 있기 때문에 EF3O3O 보다 이 균주를 사용하였다. 면역접종된 동물에게 300 CFU의 T1GR4 균주 스트렙토코쿠스 뉴모니애를 IV로 주입하였다. 21일 동안 생존을 모니터링하였다. rPcpA 면역접종을 주입받은 마우스는 애주번트만을 주입받은 마우스와 비교하여 43.5 시간까지 연장된 시간에 빈사 상태가 되는 중앙값 시간을 보여주었다(도 6). rPcpA로 면역접종시킨 마우스의 26%가 생존한 반면, 수산화알루미늄만으로 면역접종시킨 마우스는 모두 생존하지 못했다; 생존도에서 이러한 차이는 통계학적으로 유의미하였다(P=O.007).

정맥내 접종 후 마우스가 빈사 상태가 되도록 유발하는 폐렴구균 활성에 대한 pcpA의 불활성화 효과. pcpA 불활성화는 결과적으로 폐렴의 뮤린 모델 및 폐-패혈증 모델에서 병원성을 감소시켰다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 정맥내 공격 후 전신성 감염에 대한 pcpA 불활성화의 효과를 비투약된(naive) 마우스에 300 CFU의 TIGR4 또는 이의 pcpA 불활성화된 돌연변이체 JEN11을 감염시켜 시험하였다. pcpA ^- 돌연변이체로 감염시킨 마우스의 경우 빈사 상태에 이르는 중앙값 시간은 야생형 박테리아로 감염시킨 마우스와 비교할 때 31.5 시간까지(P = 0.0299) 연장되었다(도 7). 이것은 전신성 질병을 유발시키는 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 활성에 PcpA가 소정의 역할을 담당한다는 것을 입증한다.

실시예 2: PcpA 를 이용한 점막 면역접종은 폐 감염을 예방한다.

도 8에 도시된 바와 같이, PcpA를 이용한 점막 면역접종은 균주 EF3030을 이용한 폐 감염을 예방한다. CBA/N 마우스를 비내 투여로 5㎍의 PcpA + 애주번트로서 콜레라 독소 B 소단위체(CTB)로 면역접종시켰다. 면역접종 후 마우스로부터 채혈하고 이후 비내로 5x10⁶ CFU의 균주 EF3O3O을 투여하여 공격하였다. 도 8은 감염 후 7일째의 폐 균질액내의 박테리아 CFU에 대한 Log 값이다.

점막 면역접종 보호가 SC 면역접종에 비해 조금 더 나은 것으로 관찰되었다. 이러한 데이터 및 실시예 1은 폐렴 및 패혈증에 대한 예방이 적어도 점막 또는 피하 경로 투여를 이용하여 부여될 수 있다는 것을 시사한다. PcpA를 이용한 점막 면역접종은 이 균주를 이용한 비강 집락형성에 대해 보호하지 못한다. 이것은 PcpA가 집락형성 동안 발현되지 아니하므로 예상된다.

실시예 3: PcpA를 이용한 피하 또는 비강내 면역접종에 의해 유도된 항체.

PcpA로 면역접종된 마우스로부터 획득된 혈청을 PcpA에 대한 항체 수준에 대해 시험하였다. 0일째 및 14일째에 CBA/N 마우스에게 피하 투여로(SC) 애주번트로서 수산화알루미늄 또는 콜레라 독소 B 소단위체(CTB)를 면역접종하고, 21일째에 PcpA만을 면역접종하였다. 35일째에 마우스로부터 채혈하고 혈청내 항체 수준을 PspA-코팅된 미세적정(microtitration) 플레이트와 반응하는 공지 농도의 PspA 항체를 이용하여 관찰된 OD를 표준으로 사용하여 결정하였다. 대조군으로서, 추가 그룹의 마우스에게 희석액 및 애주번트만을 면역접종하였다. 비강내(IN) 면역접종에 비해 1.3-배 더 높은 IgG 항체 반응이 SC 면역접종에서 관찰되었다(표 5).

이 유형의 검정에서 공통되는 바와 같이, 하위클래스의 분량은 합계하여 총 Ig의 분량이 되지 못하였다. 이것은 항-IgG 혈청이 모든 IgG 하위클래스를 동등하게 인지하지 못한다는 지표이다.

실시예 4: PcpA 는 폐 세포에 대한 부착을 위해 필요하다.

PcpA는 형질전환된 폐 상피 세포의 A549 세포주에 대한 부착을 위해 필요하지만(도 9), 형질전환된 인간 비강 상피 세포의 디트로이트562 세포주에 대한 부착을 위해서는 필요하지 않다(도 10). A549 폐 상피 세포에 대한 부착은 또한 폐렴구균이 저 Mn²⁺에서 성장하는데 요구되며 그래서 이들은 PcpA를 생산할 것임이 관찰되었다. 이러한 연구들에서 폐렴구균은 토드-헤위트(Todd-Hewitt) 및 효모(Yeast) 배지(고 Mn²⁺) 또는 켈렉스-100(시그마) 위를 거치고 0.1㎛ MnSO₄ 및 1mM ZnCl₂, MgCl₂, CaCl₂, 및 FeSO₄로 재구성된 토드-헤위트 및 효모 배지(저 Mn²⁺)에서 성장되었다(문헌[Briles et al., J. Infect. Dis. 188:339-48 (2003)]). 디트로이트562 또는 A549 세포 단일층을 150분 동안 10⁶ CFU의 TIGR4(pcpA ⁺) 또는 JEN11(pcpA ^- TIGR4 균주)과 함께 인큐베이션하였다. 부착된 박테리아를 지니는 상피 세포를 세척하고 0.5% Tween 20으로 용해시켰다. 용해물 중의 폐렴구균 수를 혈액 아가 플레이트 상에서의 정량적 플레이팅으로 측정하였다.

A549 세포에 대한 폐렴구균의 부착은 PcpA에 대한 항체로 억제되었다(도 11). 이러한 데이터는 폐 상피 세포에 대한 폐렴구균의 PcpA-의존성 부착을 입증한다.

실시예 5: 수동 보호 모델.

폐 감염에 대한 보호를 유도시키는 PcpA를 이용한 적극 면역접종의 활성에 기초하여, PcpA에 대한 항체가 수동적으로 폐 감염으로부터 마우스를 보호할 수 있을 것인지 여부를 확인하였다. 그러나, 수동 보호는 폐렴 모델에서 관찰되지 않았다. 제 2 수동 면역접종 연구에서, TIGR4 균주를 이용한 IV 패혈증에 대한 수동 보호를 PcpA에 대한 면역 래빗 혈청을 이용하여 결정하였다. 시험된 가장 높은 농도의 혈청(1/10)이 2마리의 마우스를 죽음으로부터 보호할 수 있었음을 관찰하였다(도 12). 비-면역 혈청은 동일 농도에서 보호할 수 없었다. 이러한 데이터는 수동 면역접종이 TIGR4 균주에 대하여 보호할 수 있다는 것을 시사하는데, 상기 균주는 보호하기가 어려운 균주일 수 있다(문헌[Roche et al, Infect. Immun. 71:4498-505 (2003)]).

실시예 6: PcpA 및 뉴모리신에 의한 보호.

뉴모리신(Ply)은 폐 감염에 대한 약간의 보호를 유도시킬 수 있는 또 다른 단백질이다(문헌[Briles et al., J. Infect. Dis. 188:339-48 (2003)]). 뉴모리신 및 PcpA는 둘 모두 단백질-기반 폐렴구균 백신으로 사용하기 위한 후보물질이기 때문에, 상기 두 단백질 중 어느 하나를 단독으로 사용할 때 보다 면역원으로서 두 단백질 모두를 사용할 때, 폐 감염에 대해 더 나은 보호를 제공하는지 여부를 확인하였다. 마우스에게 5㎍의 PcpA, 5㎍의 뉴모리신, 또는 5㎍의 PcpA + 5㎍의 뉴모리신을 3회 면역접종하였다. 처음 2회는 명반과 함께 주입하였고 세번째는 단백질만을 주입하였다. 여기서 사용된 뉴모리신은 야생형 뉴모리신이었다. 도 13은 뉴모리신이 PcpA에 의해 유도된 보호에 비해 폐 감염에 대해 더 적은 보호를 유도시킨다는 것을 보여준다. PcpA 및 뉴모리신의 조합은 뉴모리신 단독에 비해 상당히 더 보호적이었다. 이러한 데이터는 보호가 PcpA와 뉴모리신 둘 모두를 사용하여 부여될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 7: 다른 폐렴구균에 대한 교차-보호.

PcpA가 교차 보호를 유도시키는지 여부를 확인하기 위해, 실시예 1 및 2에 기재된 균주 이외의 균주를 상기한 방법을 이용하여 시험할 수 있다. 폐혈증 연구의 경우, 균주, 예컨대, WU2, A66, BG7322, EF6796, D39와 더불어 TIGR4가 시험된다. 이러한 균주는 캡슐 타입 3, 3, 6B, 6A, 및 2이다. 폐 감염을 시험하기 위해, 병소 폐 감염의 마우스 모델에서 잘 작동하는 균주를 사용하였다. 이러한 균주는 EF9309, TG0893, L82016, BG7322 및 EF6796을 포함한다. 이들은 캡슐 타입 23F, 14, 6B, 6B, 및 6A이다.

실시예 8: 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 6으로부터의 재조합 PcpA의 클로닝 및 발현.

스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 6 균주(14453, ATCC 수탁번호 55987)로부터의 pcpA 유전자의 단편을 하기와 같이 클로닝하였다. PcpA C-말단 콜린-결합 도메인(CBD) 반복부를 엔코딩하는 부분 및 천연 신호 펩티드(SP) 서열을 엔코딩하는 부분이 결여된 pcpA 유전자를 도 14에 도시된 바와 같이 pET-30a(노바젠 인코포레이티드, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 NdeI 및 XhoI 클로닝 부위 사이에 클로닝하였다. pcpA 유전자의 내부 유전자 단편(ΔSPΔCBD1335bp)을 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 6 균주 염색체 DNA로부터 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭시켰다: 5'-TAGCCTCGAGTTAACCTTTGTCTTTAACCCAACCAACTACTCCCTGATTAG-3'(서열번호 43) 및 5'-CTAATGAACCACATATGGCAGATACTCCTAGTTCGGAAGTAATC-3'(서열번호 44). PCR 반응을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. PCR 프라이머를 제한효소 엔도뉴클레아제 부위 NdeI과 XhoI에 통합시켰다. 그 결과 얻어진 PcpAΔSPΔCBD를 엔코딩하는 1335 염기쌍 길이의 단편은 한쪽 말단에 NdeI과 XhoI 부위를 내포하였다. 증폭된 단편을 겔 정제하고 NdeI과 XhoI로 절단하고, pcpA 유전자 단편을 이후 강한 T7 프로모터와 번역 신호를 지니는 pET-30벡터(노바젠 인코포레이티드, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 NdeI와 XhoI 사이에 라이게이션시켰다(도 14). DNA 서열분석으로 재조합 플라스미드 pJMS87이 pcpA 유전자 단편 ΔSPΔCBD(1335bp)를 함유하고 있음을 확인하였다. 단백질 생산을 위해 플라스미드 pJMS87로 E. coli 균주 BL21(DE3)을 형질전환시켰다. 이 E. coli 균주는 IPTG로 유도시, 천연 신호 펩티드(ΔSP) 및 C-말단 콜린-결합 도메인(ΔCBD)이 결여된 PcpA 단백질을 발현하였다. 발현된 단백질을 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다.

rPcpA 단백질 서열(PcpAΔSPΔCBD로도 공지됨)은 하기와 같다. 밑줄 그은 잔기(M)는 클로닝 벡터에서 유래된다.

실시예 9: PcpAΔSPΔCBD를 이용한 면역접종은 패혈증 모델에서 폐렴에 대한 보호를 유도한다.

PcpAΔSPΔCBD가 뮤린 패혈증 모델에서 감염에 대해 보호하는지 여부를 결정하기 위해, 마우스를 정제된 재조합 PcpAΔSPΔCBD(rPcpAΔSPΔCBD)의 투여량 당10, 5, 2.5, 1.25, 및 0.625㎍으로 면역접종시키고 마우스 당 약 300 CFU의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 WUBM3으로 공격하였다. rPcpAΔSPΔCBD를 인산알루미늄 애주번트와 함께 제형화하였다.

간략히 요약하면, 마우스에게 PBS 애주번트(대조군), 30㎍의 3가 재조합 PspA 단백질을 함유하는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 PspA 단백질, 또는 투여량 당 10, 5, 2.5, 1.25, 또는 0.625㎍의 rPcpAΔSPΔCBD를 면역접종하였다. 0일째에 건강한 암컷 BALB/c K-72 마우스(찰스 리버 래보러토리스(Charles River Laboratories, 미국 매사추세츠주 윌밍톤 소재))(그룹 당 대략 14마리)에게 피하로(s.c) 면역접종하였다. 두 번째 면역접종을 21일째에 실행하고 세번재 면역접종을 43일째에 실행하였다. 63일째에, 복강내로(IP) 약 300 CFU의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 WU2BM3 박테리아를 0.4㎖ 투여량으로 투여하여 마우스를 공격하였다. 시간(일)에 대하여 도시된 생존율은 도 15A에 제시되어 있다. 공격 후 7일째에 생존율은 도 15B에 제시되어 있다.

이러한 결과는 rPcpA가 투여량 당 약 0.625㎍ 이상에서 투여량 당 약 10㎍ 이상까지 보호적임을 보여준다. 통계학적으로 유의미한 보호는 애주번트 대조군과 비교하여 rPcpA에 의해 부여되었다(피셔 정확도 데스트(Fisher Exact Test) 1측(sided) 또는 2측).

실시예 10: PcpAΔSPΔCBD를 이용한 면역접종은 폐렴에 대한 보호를 유도한다.

또한 마우스 폐렴 모델에서 실시예 5의 rPcpA 단백질을 이용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 EF3O3O 공격에 대한 이 단백질의 보호 효능을 시험하였다. 10마리의 CBA/N 마우스로 구성된 그룹에게 피하로 표 7에 제시된 것과 같은 200㎕의 면역원 제형을 3주 간격으로 3회 면역접종하였다(0일, 21일 및 42일). 3차 면역접종 후 3주째에(63일), 마취하에서, 비내로 5.6x10⁶ CFU의 균주 EF3030을 투여하여 마우스를 공격하였다. 공격 5일 후(68일), 마우스를 희생시키고 폐 조직 및 혈액을 수확하고 CFU 회수를 위해 플레이팅하였다. 면역접종 그룹은 인산알루미늄 중에서 3mg/㎖로 제형화되었다.

3가 PspA 면역원은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 Rx1-M1, EF3296 및 EF5668로부터의 PspA로 이루어졌다.

결과는 도 16에 제시되어 있다. rPcpA 단백질은 대조군(애주번트 단독, 그룹 1)과 비교할 때 유의미한 보호를 제공하였으며(그룹 3-6), 양성 대조군(그룹 2 PspA)과 유사한 보호 수준을 제공하였다. 만-휘트니 시험으로부터의 p 값이 표 8에 제시되어 있다.

본 명세서에 인용된 간행물 및 이 간행물에 인용된 문헌들은 이들의 전체 내용이 참고 문헌으로써 여기에 특별히 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> The UAB Research Foundation Sanofi Pasteur Ltd. <120> Immunogenic PcpA Polypeptides and Uses Thereof <130> 20674-078WO1 <150> US 60/822,715 <151> 2006-08-17 <150> US 60/827,348 <151> 2006-09-28 <150> US 60/917,178 <151> 2007-05-10 <160> 52 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 192 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 Leu Glu Lys Ile Glu Asp Arg Ala Phe Asp Phe Ser Glu Leu Glu Glu 1 5 10 15 Ile Glu Leu Pro Ala Ser Leu Glu Tyr Ile Gly Thr Ser Ala Phe Ser 20 25 30 Phe Ser Gln Lys Leu Lys Lys Leu Thr Phe Ser Ser Ser Ser Lys Leu 35 40 45 Glu Leu Ile Ser His Glu Ala Phe Ala Asn Leu Ser Asn Leu Glu Lys 50 55 60 Leu Thr Leu Pro Lys Ser Val Lys Thr Leu Gly Ser Asn Leu Phe Arg 65 70 75 80 Leu Thr Thr Ser Leu Asn Met Leu Met Leu Arg Gly Met Ile Val Ala 85 90 95 Ser Val Asp Gly Val Ser Phe Gln Ser Lys Thr Gln Leu Ile Tyr Tyr 100 105 110 Pro Ser Gln Lys Asn Asp Glu Ser Tyr Lys Thr Pro Lys Glu Thr Lys 115 120 125 Glu Leu Ala Ser Tyr Ser Phe Asn Lys Asn Ser Tyr Leu Lys Lys Leu 130 135 140 Glu Leu Asn Glu Gly Leu Gln Lys Ile Gly Thr Phe Ala Phe Ala Asp 145 150 155 160 Ala Thr Lys Leu Glu Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ser Leu Glu Thr Ile 165 170 175 Glu Arg Leu Ala Phe Tyr Gly Asn Leu Glu Leu Lys Glu Leu Ile Leu 180 185 190 <210> 2 <211> 195 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 2 Leu Glu Lys Ile Glu Asp Arg Ala Phe Asp Phe Ser Glu Leu Glu Glu 1 5 10 15 Ile Glu Leu Pro Ala Ser Leu Glu Tyr Ile Gly Thr Ser Ala Phe Ser 20 25 30 Phe Ser Gln Lys Leu Lys Lys Leu Thr Phe Ser Ser Ser Ser Lys Leu 35 40 45 Glu Leu Ile Ser His Glu Ala Phe Ala Asn Leu Ser Asn Leu Glu Lys 50 55 60 Leu Thr Leu Pro Lys Ser Val Lys Thr Leu Gly Ser Asn Leu Phe Arg 65 70 75 80 Leu Thr Thr Ser Leu Lys His Val Asp Val Glu Glu Gly Asn Glu Ser 85 90 95 Phe Ala Ser Val Asp Gly Val Leu Phe Ser Lys Asp Lys Thr Gln Leu 100 105 110 Ile Tyr Tyr Pro Ser Gln Lys Asn Asp Glu Ser Tyr Lys Thr Pro Lys 115 120 125 Glu Thr Lys Glu Leu Ala Ser Tyr Ser Phe Asn Lys Asn Ser Tyr Leu 130 135 140 Lys Lys Leu Glu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Lys Ile Gly Thr Phe Ala 145 150 155 160 Phe Ala Asp Ala Ile Lys Leu Glu Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ser Leu 165 170 175 Glu Thr Ile Glu Arg Leu Ala Phe Tyr Gly Asn Leu Glu Leu Lys Glu 180 185 190 Leu Ile Leu 195 <210> 3 <211> 379 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 3 Tyr Val Pro Asn Glu Pro Ile Leu Ala Ala Tyr Val Pro Asn Glu Pro 1 5 10 15 Ile Leu Ala Asp Thr Pro Ser Ser Glu Val Ile Lys Glu Thr Lys Val 20 25 30 Gly Ser Ile Ile Gln Gln Asn Asn Ile Lys Tyr Lys Val Leu Thr Val 35 40 45 Glu Gly Asn Ile Gly Thr Val Gln Val Gly Asn Gly Val Thr Pro Val 50 55 60 Glu Phe Glu Ala Gly Gln Asp Gly Lys Pro Phe Thr Ile Pro Thr Lys 65 70 75 80 Ile Thr Val Gly Asp Lys Val Phe Thr Val Thr Glu Val Ala Ser Gln 85 90 95 Ala Phe Ser Tyr Tyr Pro Asp Glu Thr Gly Arg Ile Val Tyr Tyr Pro 100 105 110 Ser Ser Ile Thr Ile Pro Ser Ser Ile Lys Lys Ile Gln Lys Lys Gly 115 120 125 Phe His Gly Ser Lys Ala Lys Thr Ile Ile Phe Asp Lys Gly Ser Gln 130 135 140 Leu Glu Lys Ile Glu Asp Arg Ala Phe Asp Phe Ser Glu Leu Glu Glu 145 150 155 160 Ile Glu Leu Pro Ala Ser Leu Glu Tyr Ile Gly Thr Ser Ala Phe Ser 165 170 175 Phe Ser Gln Lys Leu Lys Lys Leu Thr Phe Ser Ser Ser Ser Lys Leu 180 185 190 Glu Leu Ile Ser His Glu Ala Phe Ala Asn Leu Ser Asn Leu Glu Lys 195 200 205 Leu Thr Leu Pro Lys Ser Val Lys Thr Leu Gly Ser Asn Leu Phe Arg 210 215 220 Leu Thr Thr Ser Leu Asn Met Leu Met Leu Arg Gly Met Ile Val Ala 225 230 235 240 Ser Val Asp Gly Val Ser Phe Gln Ser Lys Thr Gln Leu Ile Tyr Tyr 245 250 255 Pro Ser Gln Lys Asn Asp Glu Ser Tyr Lys Thr Pro Lys Glu Thr Lys 260 265 270 Glu Leu Ala Ser Tyr Ser Phe Asn Lys Asn Ser Tyr Leu Lys Lys Leu 275 280 285 Glu Leu Asn Glu Gly Leu Gln Lys Ile Gly Thr Phe Ala Phe Ala Asp 290 295 300 Ala Thr Lys Leu Glu Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ser Leu Glu Thr Ile 305 310 315 320 Glu Arg Leu Ala Phe Tyr Gly Asn Leu Glu Leu Lys Glu Leu Ile Leu 325 330 335 Pro Asp Asn Val Lys Asn Phe Gly Lys His Val Met Asn Gly Leu Pro 340 345 350 Lys Phe Leu Thr Leu Ser Gly Asn Asn Ile Asn Ser Leu Pro Ser Phe 355 360 365 Phe Leu Ser Gly Val Leu Asp Ser Leu Lys Glu 370 375 <210> 4 <211> 373 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 4 Tyr Val Pro Asn Glu Pro Ile Leu Ala Asp Thr Pro Ser Ser Glu Val 1 5 10 15 Ile Lys Glu Thr Lys Val Gly Ser Ile Ile Gln Gln Asn Asn Ile Lys 20 25 30 Tyr Lys Val Leu Thr Val Glu Gly Asn Ile Gly Thr Val Gln Val Gly 35 40 45 Asn Gly Val Thr Pro Val Glu Phe Glu Ala Gly Gln Asp Gly Lys Pro 50 55 60 Phe Thr Ile Pro Thr Lys Ile Thr Val Gly Asp Lys Val Phe Thr Val 65 70 75 80 Thr Glu Val Ala Ser Gln Ala Phe Ser Tyr Tyr Pro Asp Glu Thr Gly 85 90 95 Arg Ile Val Tyr Tyr Pro Ser Ser Ile Thr Ile Pro Ser Ser Ile Lys 100 105 110 Lys Ile Gln Lys Lys Gly Phe His Gly Ser Lys Ala Lys Thr Ile Ile 115 120 125 Phe Asp Lys Gly Ser Gln Leu Glu Lys Ile Glu Asp Arg Ala Phe Asp 130 135 140 Phe Ser Glu Leu Glu Glu Ile Glu Leu Pro Ala Ser Leu Glu Tyr Ile 145 150 155 160 Gly Thr Ser Ala Phe Ser Phe Ser Gln Lys Leu Lys Lys Leu Thr Phe 165 170 175 Ser Ser Ser Ser Lys Leu Glu Leu Ile Ser His Glu Ala Phe Ala Asn 180 185 190 Leu Ser Asn Leu Glu Lys Leu Thr Leu Pro Lys Ser Val Lys Thr Leu 195 200 205 Gly Ser Asn Leu Phe Arg Leu Thr Thr Ser Leu Lys His Val Asp Val 210 215 220 Glu Glu Gly Asn Glu Ser Phe Ala Ser Val Asp Gly Val Leu Phe Ser 225 230 235 240 Lys Asp Lys Thr Gln Leu Ile Tyr Tyr Pro Ser Gln Lys Asn Asp Glu 245 250 255 Ser Tyr Lys Thr Pro Lys Glu Thr Lys Glu Leu Ala Ser Tyr Ser Phe 260 265 270 Asn Lys Asn Ser Tyr Leu Lys Lys Leu Glu Leu Asn Glu Gly Leu Glu 275 280 285 Lys Ile Gly Thr Phe Ala Phe Ala Asp Ala Ile Lys Leu Glu Glu Ile 290 295 300 Ser Leu Pro Asn Ser Leu Glu Thr Ile Glu Arg Leu Ala Phe Tyr Gly 305 310 315 320 Asn Leu Glu Leu Lys Glu Leu Ile Leu Pro Asn Asn Val Lys Asn Phe 325 330 335 Gly Lys His Val Met Asn Gly Leu Pro Lys Leu Lys Ser Leu Thr Ile 340 345 350 Gly Asn Asn Ile Asn Ser Leu Pro Ser Phe Phe Leu Ser Gly Val Leu 355 360 365 Asp Ser Leu Lys Glu 370 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 5 Leu Glu Lys Ile Glu Asp Arg Ala Phe Asp 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 6 Phe Ser Glu Leu Glu Glu Ile Glu Leu Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 7 Ala Ser Leu Glu Tyr Ile Gly Thr Ser Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 8 Phe Ser Phe Ser Gln Lys Leu Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 9 Thr Phe Ser Ser Ser Ser Lys Leu Glu Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 10 Ile Ser His Glu Ala Phe Ala Asn Leu Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 11 Asn Leu Glu Lys Leu Thr Leu Pro Lys Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 12 Val Lys Thr Leu Gly Ser Asn Leu Phe Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 13 Leu Thr Thr Ser Leu Asn Met Leu Met Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 14 Leu Thr Thr Ser Leu Lys His Val Asp Val 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 15 Arg Gly Met Ile Val Ala Ser Val Asp Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 16 Glu Glu Gly Asn Glu Ser Phe Ala Ser Val Asp Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 17 Val Ser Phe Gln Ser Lys Thr Gln Leu Ile 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 18 Val Leu Phe Ser Lys Asp Lys Thr Gln Leu Ile 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 19 Tyr Tyr Pro Ser Gln Lys Asn Asp Glu Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 20 Tyr Lys Thr Pro Lys Glu Thr Lys Glu Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 21 Ala Ser Tyr Ser Phe Asn Lys Asn Ser Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 22 Leu Lys 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Glu Ala Gly Gln 35 40 45 Asp Gly Lys Pro Phe Thr Ile Pro Thr Lys Ile Thr Val Gly Asp Lys 50 55 60 Val Phe Thr Val Thr Glu Val Ala Ser Gln Ala Phe Ser Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Glu Thr Gly Arg Ile Val Tyr Tyr Pro Ser Ser Ile Thr Ile Pro 85 90 95 Ser Ser Ile Lys Lys Ile Gln Lys Lys Gly Phe His Gly Ser Lys Ala 100 105 110 Lys Thr Ile Ile Phe Asp Lys Gly Ser Gln 115 120 <210> 30 <211> 43 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 30 Pro Asp Asn Val Lys Asn Phe Gly Lys His Val Met Asn Gly Leu Pro 1 5 10 15 Lys Phe Leu Thr Leu Ser Gly Asn Asn Ile Asn Ser Leu Pro Ser Phe 20 25 30 Phe Leu Ser Gly Val Leu Asp Ser Leu Lys Glu 35 40 <210> 31 <211> 44 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 31 Pro Asp Asn Val Lys Asn Phe Gly Lys His Val Met Asn Gly Leu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Lys Ser Leu Thr Ile Gly Asn Asn Ile Asn Ser Leu Pro Ser 20 25 30 Phe Phe Leu Ser Gly Val Leu Asp Ser Leu Lys Glu 35 40 <210> 32 <211> 2127 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 32 atgaaaaaaa ctacaatatt 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cataaaaaaa atacaaaaaa aaggcttcca tggaagtaaa 420 gctaaaacta ttatttttga caaaggcagt cagctggaga aaattgaaga tagagctttt 480 gatttttctg aattagaaga gattgaattg cctgcatctc tagaatatat tggaacaagt 540 gcattttctt ttagtcaaaa attgaaaaag ctaacctttt cctcaagttc aaaattagaa 600 ttaatatcac atgaggcttt tgctaattta tcaaatttag agaaactaac attaccaaaa 660 tcggttaaaa cattaggaag taatctattt agactcacta ctagcttaaa acatgttgat 720 gttgaagaag gaaatgaatc gtttgcctca gttgatggtg ttttgttttc aaaagataaa 780 acccaattaa tttattatcc aagtcaaaaa aatgacgaaa gttataaaac gcctaaggag 840 acaaaagaac ttgcatcata ttcgtttaat aaaaattctt acttgaaaaa actcgaattg 900 aatgaaggtt tagaaaaaat cggtactttt gcatttgcag atgcgattaa acttgaagaa 960 attagcttac caaatagttt agaaactatt gaacgtttag ccttttacgg taatttagaa 1020 ttaaaagaac ttatattacc aaataatgtt aaaaattttg gtaaacacgt tatgaacggt 1080 ttaccaaaat taaaaagttt aacaattggt aataatatca actcattgcc gtccttcttc 1140 ctaagtggcg tcttagattc attaaaggaa attcatatta agaataaaag tacagagttt 1200 tctgtgaaaa aagatacatt tgcaattcct 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ttactcctgt agagtttgaa gctggtcaag atggaaaacc attcacgatt 180 cctacaaaaa tcacagtagg tgataaagta tttaccgtta ctgaagtagc tagtcaagct 240 tttagttatt atccagatga aacaggtaga attgtctact atcctagctc tattactatc 300 ccatcaagca taaaaaaaat acaaaaaaaa ggcttccatg gaagtaaagc taaaactatt 360 atttttgaca aaggcagtca gctggagaaa attgaagata gagcttttga tttttctgaa 420 ttagaagaga ttgaattgcc tgcatctcta gaatatattg gaacaagtgc attttctttt 480 agtcaaaaat tgaaaaagct aaccttttcc tcaagttcaa aattagaatt aatatcacat 540 gaggcttttg ctaatttatc aaatttagag aaactaacat taccaaaatc ggttaaaaca 600 ttaggaagta atctatttag actcactact agcttaaaac atgttgatgt tgaagaagga 660 aatgaatcgt ttgcctcagt tgatggtgtt ttgttttcaa aagataaaac tcaattaatt 720 tattatccaa gtcaaaaaaa tgacgaaagt tataaaacgc ctaaggagac aaaagaactt 780 gcatcatatt cgtttaataa aaattcttac ttgaaaaaac tcgaattgaa tgaaggttta 840 gaaaaaatcg gtacttttgc atttgcggat gcgattaaac ttgaagaaat tagcttacca 900 aatagtttag aaactattga acgtttagcc ttttacggta atttagaatt aaaagaactt 960 atattaccag ataatgttaa aaattttggt aaacacgtta tgaacggttt accaaaatta 1020 aaaagtttaa caattggtaa taatatcaac tcattgccgt ccttcttcct aagtggcgtc 1080 ttagattcat taaaggaaat tcatattaag aataaaagta cagagttttc tgtgaaaaaa 1140 gatacatttg caattcctga aactgttaag ttctatgtaa catcagaaca tataaaagat 1200 gttcttaaat caaatttatc tactagtaat gatatcattg ttgaaaaagt agataatata 1260 aaacaagaaa ctgatgtagc taaacctaaa aagaattcta atcagggagt agttggttgg 1320 gttaaagaca aaggttaa 1338 <210> 47 <211> 1926 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 47 atgaaaaaaa ctacaatatt atcattaact acagctgcgg ttattttagc agcatatgtc 60 cctaatgaac caatcctagc agatactcct agttcggaag taatcaaaga gactaaagtt 120 ggaagtatta ttcaacaaaa taatatcaaa tataaggttc taactgtaga aggtaacata 180 ggaactgttc aagtgggtaa tggagttact cctgtagagt ttgaagctgg tcaagatgga 240 aaaccattca cgattcctac aaaaatcaca gtaggtgata aagtatttac cgttactgaa 300 gtagctagtc aagcttttag ttattatcca gatgaaacag gtagaattgt ctactatcct 360 agctctatta ctatcccatc aagcataaaa aaaatacaaa aaaaaggctt ccatggaagt 420 aaagctaaaa 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taaatcaaat ttatctacta gtaatgatat cattgttgaa 1320 aaagtagata atataaaaca agaaactgat gtagctaaac ctaaaaagaa ttctaatcag 1380 ggagtagttg gttgggttaa agacaaaggt ttatggtatt acttaaacga atcaggttca 1440 atggctactg gttgggttaa agacaaaggt ttatggtatt acttaaacga atcaggttca 1500 atggctactg gttgggttaa agacaaaggc ttatggtatt acttaaacga atcaggttca 1560 atggctactg gttgggttaa agacaaaggc ttatggtatt acttaaatga atcaggttca 1620 atggctactg gttgggttaa agacaaaggc ttatggtatt acttaaacga atcaggttca 1680 atggctactg gttgggttaa agacaaaggc ttatggtatt acttaaacga atcaggttca 1740 atggctactg gttgggttaa agacaaaggc ttatggtatt acttaaatga atcaggttca 1800 atggctactg gttggtttac agtttctggt aaatggtact atacctataa ttcaggagat 1860 ttattagtaa acacgactac acccgatggc tatcgagtca atgctaacgg tgagtgggta 1920 ggataa 1926 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 aactgttcaa gtgggtaatg g 21 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 tgaacttgag gaaaaggtta gc 22 <210> 50 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 atgaaaaaac tacaatatta tcattaacta cagctgcg 38 <210> 51 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 ccataaacct ttgtctttaa cccaaccaac tac 33 <210> 52 <211> 311 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 52 Ile His Ile Lys Asn Lys Ser Thr Glu Phe Ser Val Lys Lys Asp Thr 1 5 10 15 Phe Ala Ile Pro Glu Thr Val Lys Phe Tyr Val Thr Ser Glu His Ile 20 25 30 Lys Asp Val Leu Lys Ser Asn Leu Ser Thr Ser Asn Asp Ile Ile Val 35 40 45 Glu Lys Val Asp Asn Ile Lys Gln Glu Thr Asp Val Ala Lys Pro Lys 50 55 60 Lys Asn Ser Asn Gln Gly Val Val Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu 65 70 75 80 Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys 85 90 95 Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr 100 105 110 Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly 115 120 125 Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu 130 135 140 Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu 145 150 155 160 Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys 165 170 175 Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr 180 185 190 Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly 195 200 205 Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu 210 215 220 Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu 225 230 235 240 Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys 245 250 255 Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr 260 265 270 Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly 275 280 285 Ser Met Ala Thr Gly Trp Phe Lys Val Ser Gly Lys Trp Tyr Tyr Thr 290 295 300 Tyr Asn Ser Gly Asp Phe Ile 305 310

Claims (29)

1. 천연적으로 생성된 PcpA의 N-말단 영역을 포함하되, 천연적으로 생성된 PcpA의 콜린 결합 도메인 반복부가 결여된 면역원성 PcpA 폴리펩티드로서,

   상기 N-말단 영역이 하나 이상의 보존적 아미노산 치환과 함께 서열번호 41 또는 서열번호 45를 포함하는, 면역원성 PcpA 폴리펩티드.
2. 삭제
3. 삭제
4. 천연적으로 생성된 PcpA의 N-말단 영역을 포함하되, 천연적으로 생성된 PcpA의 콜린 결합 도메인 반복부가 결여된 면역원성 PcpA 폴리펩티드로서,

   상기 N-말단 영역이 서열번호 41 또는 서열번호 45를 포함하는, 면역원성 PcpA 폴리펩티드.
5. 제 1 항에 있어서,

   N-말단 영역이 서열번호 45를 포함하는, 면역원성 PcpA 폴리펩티드.
6. 제 1 항, 제 4 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 PcpA 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 폐렴구균의 비내 보균체(nasal carriage)를 예방 또는 감소시키거나, 폐렴구균 감염증의 위험을 감소시키기 위한 조성물.
7. 제 6 항에 있어서,

   애주번트(adjuvant)를 추가로 포함하는, 조성물.
8. 제 6 항에 있어서,

   면역원성 스태필로코쿠스(Staphylococcus) 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 조성물.
9. 제 6 항에 있어서,

   면역원성 PspA 폴리펩티드, 면역원성 뉴모리신 폴리펩티드 또는 이들의 조합물을 추가로 포함하는, 조성물.
10. 제 6 항에 있어서,

    면역원성 뉴모리신 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 조성물.
11. 제 6 항에 있어서,

    점막 표면에 투여하기에 적합한, 조성물.
12. 제 11 항에 있어서,

    비강 스프레이인, 조성물.
13. 제 11 항에 있어서,

    분무기(nebulizer) 용액인, 조성물.
14. 제 11 항에 있어서,

    에어로졸 흡입제(inhalant)인, 조성물.
15. 제 6 항에 따른 조성물을 포함하는 용기.
16. 제 15 항에 있어서,

    비강 스프레이인, 용기.
17. 제 15 항에 있어서,

    분무기인, 용기.
18. 제 15 항에 있어서,

    흡입기인, 용기.
19. 삭제
20. 제 6 항에 있어서,

    폐렴구균의 비내 보균체를 예방 또는 감소시키기 위한, 조성물.
21. 제 6 항에 있어서,

    폐렴구균 감염증의 위험을 감소시키기 위한, 조성물.
22. 제 21 항에 있어서,

    폐렴구균 감염증이 뇌수막염인, 조성물.
23. 제 21 항에 있어서,

    폐렴구균 감염증이 중이염인, 조성물.
24. 제 21 항에 있어서,

    폐렴구균 감염증이 폐렴인, 조성물.
25. 제 21 항에 있어서,

    폐렴구균 감염증이 용혈성 요독증(hemolytic uremia)인, 조성물.
26. 제 21 항에 있어서,

    폐렴구균의 비내 보균체를 제거하지 않는, 조성물.
27. 삭제
28. 삭제
29. 서열번호 41 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.

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