JP2002531055A - 肺炎連鎖球菌のタンパク質及び核酸分子 - Google Patents
肺炎連鎖球菌のタンパク質及び核酸分子Info
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Abstract
Description
パク質、該タンパク質をコードする核酸分子、該核酸分子及び/又はタンパク質
の抗原及び/又は免疫原としての使用及び検出/診断における使用、並びに潜在
的な抗微生物標的としての該タンパク質/核酸配列をスクリーニングする方法に
関する。
国及び先進国におけるヒトの疾患に関する肺炎連鎖球菌の感染の更なる重要性は
権威ある概説にまとめられている(ファイバー,ジー.アール.、Scienc
e,265:1385−1387(1994))。これは、世界的な規模で、こ
の生物が急性の呼吸系感染の最も一般的な原因細菌であると考えられており、且
つ主に発展途上国で毎年百万人の子供が死に至ると見積られていることを示して
いる(スタンスフィールド,エス.ケイ.、Pediatr.Infect.D
is.,6:622(1987))。アメリカ合衆国では、肺炎球菌が現在でも
細菌性肺炎の最も一般的な原因であり、且つ罹患率が幼児、年配者、並びに無脾
症、心臓、肺及び腎臓の疾患、糖尿病、アルコール中毒などに罹りやすい状態の
患者又は免疫抑制障害、特にAIDSの患者にとりわけ高いことが示唆されてき
た(ブライマンら、Arch.Intern.Med.,150:1401(1
990))。これらの群は、肺炎球菌敗血症、従って髄膜炎の危険性がより高く
、従って、肺炎球菌の感染により死亡する危険性がより大きい。肺炎球菌は中耳
炎及び副鼻腔炎の主要原因でもある。これは、先進国の子供に流行る感染であり
且つ相当な費用を費やしている。
予防戦略の必要性が強調されている。12の州における13の米国の病院におい
て肺炎球菌の単離体の6.6%がペニシリンに対して耐性であることが見出され
、且つ単離体の中には第三世代(?)のシクロスポリンを含む他の抗生物質にも
耐性があったと報告されている(シャペルト,エス.エム.、Vital an
d Health Statistics of the Centres f
or Disease Control/National Centre f
or Health Statistics、214:1(1992))。幾つ
かの病院ではペニシリン耐性の割合がより高い(20%まで)ことがある(ブラ
イマンら、J.Am.Med.Assoc.、271:1831(1994))
。肺炎球菌のペニシリン耐性は、ペニシリンが有効な治療であった数十年の後、
最近且つ突然に発達しているため、これらの発見は警鐘と考えられる。
を検討する抗し難い理由がある。
が採られてきた。困難は、例えば、該生物を取り囲む多糖類莢膜の構造に基づく
血清型の種類(少なくとも90)から生じる。個々の血清型に対するワクチンは
他の血清型に対して有効でなく、これは大部分の症例に有効であるためにワクチ
ンが全範囲の血清型から得られる多糖類抗原を含まなければならないことを意味
する。精製されワクチンとして使用される場合、莢膜多糖類(その各々が血清型
を決定し主要な防御抗原である)は、侵襲性の肺炎球菌の感染及び髄膜炎の最も
高い発生を被る年齢群である二歳以下の子供に防御抗体応答を確実に誘発するも
のではないことが見出されたため、更なる問題が生じている。
を付与することにより強化された該応答を誘導するために、該多糖類をタンパク
質に結合させることによる。このアプローチはヘモフィラス・インフルエンザエ
に対するワクチンの開発に用いられてきた。多重多糖類ワクチンに関する費用及
び結合体に基づく費用の両方に問題がある。
原性の構成要素を探すことである。本出願において、本発明者らは分泌/放出さ
れた(exported) タンパク質であるタンパク質抗原の群を提供する。
ら選択される1配列を有する肺炎連鎖球菌のタンパク質又はポリペプチドを提供
する。
えば、他のタンパク質を実質的に含まない形で提供されうる。
質又はポリペプチドが提供される。
パク質を包含する。
物質として有用である。このような物質は「抗原性」及び/又は「免疫原性」で
あり得る。一般的に、「抗原性」は、該タンパク質又はポリペプチドが抗体を生
産するために用いることができること又は実際に患者に抗体応答を誘導できるこ
とを意味すると解される。「免疫原性」は、該タンパク質又はポリペプチドが被
験者に防御免疫応答を誘発できることを意味すると解される。従って、後者の場
合、該タンパク質又はポリペプチドは、抗体応答だけでなく更に抗体に基づかな
い免疫応答を引き起こすことができうる。
の文脈における使用、即ち抗原性/免疫原性の物質としての使用を見出しうるこ
とを理解するであろう。従って、例えば、一つ以上の付加、欠失、置換等を含む
タンパク質又はポリペプチドが本発明に包含される。さらに、一アミノ酸を他の
同類の「型」で置換できうる。例えば、一つの疎水性アミノ酸を他のもので置換
する。アミノ酸配列を比較するためにCLUSTALプログラムなどのプログラ
ムを使用できる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、どちらかの配列に
適切にスペースを挿入することにより最適な整列を見出す。最適な整列について
のアミノ酸の同一性又は類似性(アミノ酸型の同一性プラス保存性)を計算でき
る。BLASTxなどのプログラムは最長の類似配列を整列させ、その適合性に
数値を割り当てる。従って、各々が異なる点数を有する幾つかの類似領域が見出
される場合には、比較を得ることができる。本発明において、両タイプの分析が
意図される。
との同一性の程度は、この同族体又は誘導体が肺炎連鎖球菌に対する抗原性又は
免疫原性を保持することほどには重要でない。しかしながら、本明細書に記載さ
れるタンパク質又はポリペプチドと少なくとも60%の(上述の)類似性を有す
る同族体又は誘導体が提供されることが相応しい。好ましくは少なくとも70%
の類似性、より好ましくは少なくとも80%の類似性を有する同族体又は誘導体
が提供される。少なくとも90%又は更に95%の類似性を有する同族体又は誘
導体が提供されることが最も好ましい。
ク質又はポリペプチドを効果的にタグ化することにより精製を容易にする部分を
組み入れた融合タンパク質でありうる。「タグ」を除去することが必要であって
も良く、又はこの融合タンパク質自体が有用である程に十分な抗原性を保持する
場合もあろう。
はそれらの同族体若しくは誘導体の抗原性断片が提供される。
しくは誘導体の断片について、状況は若干異なる。エピトープ領域、即ちタンパ
ク質又はポリペプチドの抗原性又は免疫原性の原因となる領域を同定するために
該抗原性のタンパク質又はポリペプチドをスクリーニングできることは周知であ
る。このようなスクリーニングの実施方法は当分野では周知である。従って、本
発明の断片は、これらの抗原性/免疫原性の性質を保持するために、一つ以上の
該エピトープ領域を含むか又は該領域に十分に類似しているべきである。従って
、本発明の断片についての同一性の程度はおそらく見当違いであり、なぜなら本
明細書に記載されるタンパク質若しくはポリペプチド、同族体又は誘導体の特定
部分に100%同一でありうるためである。再度であるが、重要な点は該断片が
抗原性/免疫原性の性質を保持することである。
ンパク質又はポリペプチドの抗原性/免疫原性の少なくともある程度を保有する
ことである。
グ手法が用いられてもよい。これらの手法は、例えば、ジェイ.サムブルックら
、分子クローニング、第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス(1989)に開示されている。従って、第四の側面において、本発明
は、下記の1配列を含む又は下記の1配列からなる核酸分子を提供する。 (i) 表1に示されるDNA配列群又はそれらのRNA等価物のいずれか、 (ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、 (iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配
列、 (iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的な同一性を有する配列
、 (v) 表1で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列
。
る核酸分子を提供する。 (i) 表4に示されるDNA配列群又はそれらのRNA等価物のいずれか、 (ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、 (iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配
列、 (iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的な同一性を有する配列
、 (v) 表4で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列
。
本発明が本明細書で例示される特定の新規な核酸分子の新たな変異型を含み得る
ことを理解するであろう。このような変異型は本発明に包含される。これらは例
えば株の変異により自然界で生じうる。例えば、付加、置換及び/又は欠失が含
まれる。さらに、とりわけ微生物の発現系を利用する場合、発現に用いられる特
定の生物において既知の好ましいコドン用語を活用することにより該核酸配列の
設計を企ててもよい。従って、合成又は非天然産の変異型も本発明の範囲に含ま
れる。
RNAの「U」が遺伝コードでは「T」に置き換わるという事実を考慮して)所
与のDNA分子の配列に相補的な配列を有することを示している。
FIT及びGAP(双方ともウィスコンシン・ジェネティックス・コンピュータ
ー・グループ(GCG)ソフトウェア・パッケージから得られる)等のプログラ
ムを使用できる。BESTFITは、例えば二つの配列を比較し最も類似したセ
グメントの最適な整列を作成する。GAPは配列をその全長に沿って整列させる
ことができ、どちらかの配列に適切にスペースを挿入することにより最適な整列
を見出す。核酸配列の同一性を論じる際には本発明の文脈において、該比較は配
列の全長に沿ったそれらの整列によりなされることが好ましい。
同一性、望ましくは少なくとも75%の配列同一性、並びにより望ましくは少な
くとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有する。この配列同一性が9
9%以上でありうる場合もある。
に記載される任意の配列とより高い程度の同一性を有することを示すことが望ま
しい。
場合、本発明はその範囲内において該遺伝子産物又はその新規な部分をコードす
るあらゆる可能な配列を含むことに注意すべきである。
よく、ベクターは宿主に組込まれてもよい。このようなベクター及び適切な宿主
は本発明のさらなる側面を形成する。
とにより、肺炎連鎖球菌の遺伝子が同定できる。次いで、該遺伝子は制限酵素を
用いて切出しベクターにクローニングできる。該ベクターは発現用の適切な宿主
に導入できる。
いることにより肺炎連鎖球菌から得られうる。プローブ用に相応しい長さの断片
を得るために制限酵素又は超音波処理の手法が使用できる。
って、本明細書に記載される配列データはPCRで用いる二つのプライマーを設
計するために用いることができるため、遺伝子全体又はその断片を含む所望の配
列が標的化でき、次いで高度に増幅できる。一方のプライマーは通常一つのDN
A分子鎖上に位置する第一配列に対して高度の特異性を示し、他方のプライマー
は通常該DNA配列の相補鎖に位置する第二配列に対して高度の特異性を示し該
第一配列の相補的配列から一定の間隔が置かれている。
。
てもよい。比較的短い配列は化学合成し互いに連結しより長い配列を提供しても
よい。
体若しくは誘導体、及び/又はこれらの任意の断片から選択されるタンパク質又
はポリペプチドの一つ以上を含む免疫原性/抗原性の組成物を提供する。好まし
い実施態様において、この免疫原性/抗原性の組成物はワクチンであり又は診断
検定に用いられる。
よい。これらの多数の例が当分野ではよく知られている。
ともできる。従って、本発明は本明細書で定義される一つ以上の核酸配列を含む
ワクチン組成物も提供する。このようなDNAワクチンの使用は当分野に記され
ている。例えば、ドネリーら、Ann.Rev.Immunol.、15:61
7−648(1997)を参照。
プチド、それらの同族体又は誘導体、及び/又はこれらの任意の断片は肺炎連鎖
球菌の検出方法/診断方法に用いることができる。このような方法は、被験者に
存在しうる該タンパク質に対する抗体の検出に基づく。従って、本発明は、本明
細書に記載されるタンパク質、又はその同族体、誘導体若しくは断片の少なくと
も一つと検査試料を接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法/診断方法を
提供する。該試料は、検査される被験者から得られる組織試料又は血液若しくは
唾液の試料などの生物試料が適切である。
同族体、誘導体、及び/又は断片は抗体を生産するために用いることができ、次
いで該抗体は該抗原、従って肺炎連鎖球菌を検出するために使用できる。このよ
うな抗体は本発明の他の側面を形成する。本発明の範囲内の抗体はモノクローナ
ル又はポリクローナルでありうる。
誘導体若しくは断片が適切な動物宿主(例えば、マウス、ラット、モルモット、
ウサギ、ヒツジ、ヤギ又はサル)に注射されると、該動物中で該抗体の生産を刺
激することにより生じ得る。必要なときは、アジュバントが該タンパク質ととも
に投与されても良い。周知のアジュバントはフロイントのアジュバント(完全及
び不完全)及び水酸化アルミニウムを含む。次いで、該抗体は本明細書に記載さ
れるタンパク質に結合することで精製できる。
系を形成させるために骨髄腫細胞と所望の抗体を生産する脾臓細胞を融合するこ
とにより形成できる。従って、周知のコーラー&ミルスタイン手法(Natur
e、256(1975))又はこの手法に基づく一連の変法が使用できる。
ポリクローナル抗体の生産法は当分野でよく開発されている。これらは、例えば
ロイットら、免疫学第二版(1989)、チャーチル リビングストーン、ロン
ドンなどの標準的な免疫学の教科書で論じられている。
るそれらの誘導体を含む。従って、本発明は抗体断片及び合成構築物を含む。抗
体断片及び合成構築物の例は、ドガールら、Tibtech、12、372−3
79(1994年9月)に記載されている。
b断片(これらはロイットら(前出)で論じられている)。Fv断片は単鎖のF
v(scFv)分子として知られる合成構築物を生産するために改変できる。こ
れは該分子の安定性に寄与するVh領域とVl領域よ共有結合するペプチドリンカ
ーを含む。使用できる他の合成構築物にはCDRペプチドが含まれる。これらは
抗原結合決定基を含む合成ペプチドである。ペプチド擬似体も使用されうる。通
常、これらの分子はCDRループの構造を模倣し且つ抗原と相互作用する側鎖を
含むコンフォメーションが限定された有機環である。
その誘導体は本発明の範囲内にある。ヒト化抗体の例はヒトのフレームワーク領
域を有するが、げっ歯類の超可変領域を有する抗体である。キメラ抗体の生産方
法は、例えばモリソンら、PNAS、81、6851−6855(1984)及
びタケダら、Nature、314、452−454(1985)により論じら
れている。
る付加的部分を含む分子も含まれる。例えば、該部分は標識(例えば蛍光標識又
は放射性標識)であってもよい。または薬学的に活性な薬剤であってもよい。
側面において、本発明は、本明細書に記載される一つ以上のタンパク質、又はそ
の同族体、誘導体及び/又は断片に結合できる抗体と検査試料を接触させる工程
を含む肺炎連鎖球菌の検出方法/診断方法を提供する。
細菌のアルファ−らせんの受容体ドメイン(ノードら)のコンビナトリアルライ
ブラリーから選択される結合タンパク質である。従って、異なる標的タンパク質
に特異的に結合できる小タンパク質ドメインがコンビナトリアルアプローチを用
いて選択できる。
に使用されうることも明白である。従って、さらなる側面において、本発明は本
明細書に記載される少なくとも一つの核酸配列と検査試料を接触させる工程を含
む肺炎連鎖球菌の検出方法/診断方法を提供する。この試料は、検査される被験
者から得られる組織試料又は血液若しくは唾液の試料などの生物試料が適切であ
る。このような試料は本発明の方法に使用する前に前処理してもよい。従って、
例えば試料はDNAを抽出するため処理してもよい。次いで、本明細書に記載さ
れる核酸配列に基づくDNAプローブ(即ち、通常該配列の断片)は肺炎連鎖球
菌の核酸を検出するために用いてもよい。
くは断片、又は本発明の免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む被験者に
肺炎連鎖球菌に対するワクチンを注射する方法、 (b)本明細書で定義される核酸分子を被験者に投与する工程を含む被験者に肺
炎連鎖球菌に対するワクチンを注射する方法、 (c)本発明のタンパク質若しくはポリペプチド、又はその誘導体、同族体若し
くは断片、又は本発明の免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む肺炎連鎖
球菌の感染の予防方法又は治療方法、 (d)本明細書で定義される核酸分子を被験者に投与する工程を含む肺炎連鎖球
菌の感染の予防方法又は治療方法、 (e)本発明の一つ以上タンパク質若しくはポリペプチド、又はその同族体、誘
導体若しくは断片、又は本発明の免疫原性組成物を含む肺炎連鎖球菌の感染を検
出/診断する際に使用するキット、並びに (f)本明細書で定義される一つ以上の核酸分子を含む肺炎連鎖球菌の感染を検
出/診断する際に使用するキット、 を提供する。
なタンパク質は抗微生物治療の潜在的な標的である。しかしながら、個々の各タ
ンパク質が該生物の生存能力に必須であるか否かを決定することが必要である。
従って、本発明は、本明細書に記載されるタンパク質又はポリペプチドが潜在的
な抗微生物標的に相当するか否かを決定する方法であって、該タンパク質を不活
性化する工程及び肺炎連鎖球菌がインビトロ又はインビボでまだ生存しているか
否かを決定する工程を含む方法も提供する。
成し遂げることであり、即ち該タンパク質の発現を妨げ、これが致死的な変化を
もたらすか否かを決定することである。このような遺伝子ノックアウトの適当な
実施方法は、リーら、P.N.A.S.、94:13251−13256(19
97)に記載されている。
れる医薬の製造における、本発明のタンパク質又はポリペプチドの機能又は発現
と拮抗し、これを阻害又は他の方法で妨害できる作用物質の使用を提供する。
何なる意味でも限定するものと解釈されるべきでない。
ク・リサーチ(TIGR、ロックビル、メリーランド州、米国)で進行中である
。現在のところ、全配列は完了又は発表されていない。1997年11月21日
に、TIGRセンターは終了した配列を正確に反映していないコンティグ(cont
igs)としての幾つかのDNA配列を公開した。これらのコンティグはウェブスタ
ー(www@tigr.org)からダウンロードできる。本発明者らはこれら
のコンティグをダウンロードし、GCGToBLAST(ウィスコンシンパッケ
ージ9.1版、ジェネティックス・コンピュータ・グループ(GCG)、マディ
ソン、米国)アプリケーションを用いてローカルデータベースを作成した。この
データベースは(ピアソンとリップマンの方法(PNAS USA、85:24
44−2448(1988))を用いる)FastA及びTfastAの手法で
検索できる。
ー配列の性質についてこの肺炎球菌のローカルデータベースを検索した。相対的
に新規な配列について応答信号を送らせるために関連のある配列を使用した。こ
れらは、 (i) 既に記載されている肺炎連鎖球菌のリーダー配列群(タンパク質NanA
、NanB、LytA、PapA、pcpA、PsaA、及びPspAに由来す
る)、 (ii) ラクトコッカス・ラクティスから得られる分泌タンパク質であるUsp
45のリーダー配列、 (iii) (i)及び(ii)の検索から演繹される新規な仮定的リーダー配列、 (iv) ソルターゼ(Sortase)複合タンパク質に関わる機構により固定される多
数のグラム陽性細菌表面タンパク質に共通する性質であるアンカーモチーフLP
xTG、である。
以下に示す。
球菌のローカルデータベースを検索する開始点として用いた。この検索で見出さ
れた仮定的タンパク質は次いでEMBL、スイスプロット等の一般的なデータベ
ースでBlast検索にかけた。肺炎球菌で未だ知られていないタンパク質は残
し注釈を施す。次に、新規な潜在的タンパク質リーダー配列をプローブとして用
いて、TfastA手法により、この検索を再度実施する。
3.1(インビトロゲン社)(実際はpcDNA3.1+、全場合でこの正方向
を用いたが本明細書ではpcDNA3.1と呼ぶ)であった。このベクターは、
この文献(ザングら、クラ−ルとスプリッター、アンダーソンら)の病原体から
防御するワクチン候補遺伝子を試験するための宿主ベクターとして広く並びに首
尾よく使用されてきた。このベクターは哺乳類細胞における高レベルに安定で複
製しない一過性の発現用に設計された。pcDNA3.1は大腸菌で簡便に高い
コピー数の複製と増殖ができるColE1複製起点を含む。次に、これは多数の
遺伝子の迅速で効率のよいクローニングと試験ができる。このpcDNA3.1
ベクターは、多数のクローニング部位を有し、クローニング選別を手助けするア
ンピシリン耐性をコードする遺伝子並びに該組換えタンパク質を効率よく高レベ
ルに発現させるヒトのサイトメガロウイルス(CMV)の直初期プロモーター/
エンハンサーも含む。このCMVプロモーターは、筋細胞及び免疫(抗原提示)
細胞の両方を含む広範囲の細胞タイプにおける強力なウイルスプロモーターであ
る。インビボで防御応答を生じる際にどの細胞タイプが最も重要であるかに関し
てまだ分かっていないため、これは最適な免疫応答に重要である。この多クロー
ニング部位の上流にあるT7プロモーターは目的の修飾挿入物を効率よく発現さ
せ、インビトロでクローニング遺伝子をセンス方向で転写できる。
マックラルティー,ジー.、及びブランハム, アール.シー.(1997)、「
主要な外膜タンパク質遺伝子によるDNAワクチン注射はクラミジア・トラコマ
ティス(マウスの肺炎)の感染に対する後天的免疫を誘導する」、Infect
ion and Immunity、176、1035−40。
ボルタスのリボソームL7/L12遺伝子の核酸ワクチン接種は免疫応答を誘発
する」、Vaccine、15、1851−57。
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素の断片CをコードするDNAによる免疫後のマウスにおける免疫応答」、In
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子について設計した。各遺伝子は徹底的に調べ、可能ならば、プライマーは該遺
伝子タンパク質の成熟部分のみコードすると考えられる遺伝子部分を標的とする
ように設計された。哺乳類細胞で発現させた場合、標的遺伝子タンパク質の成熟
部分のみをコードする配列の発現がその正しい折りたたみを容易にすると記載さ
れた。例えば、プライマーは、通例、推定的N末端シグナルペプチド配列がpc
DNA3.1発現ベクターにクローニングされる最終の増幅産物に含まれないよ
う設計した。このシグナルペプチドはタンパク質放出経路を介して該ポリペプチ
ド前駆体を細胞膜に向かわせる。この経路では該ペプチドは通常シグナルペプチ
ダーゼI(又はリポタンパク質の場合シグナルペプチダーゼII)により切断さ
れる。従って、成熟タンパク質が細菌表面上に提示されるか分泌されるかに関わ
らず、このシグナルペプチドは該成熟タンパク質のどの部分も構成しない。N末
端リーダーペプチド配列は直ちに明白ではなかった場合、プライマーはクローニ
ング用及び最終的にはpcDNA3.1の発現用に該遺伝子配列の全体を標的と
するよう設計した。
ンパク質の発現及び提示に影響を及ぼしうる。目的のタンパク質をコードする遺
伝子における該特性をコードするDNA配列はオリゴヌクレオチドの設計中に排
除した。これらの特性には以下のものが含まれた。 1 LPXTG細胞壁固定モチーフ。 2 LXXCリポタンパク質付着部位。 3 疎水性のC末端ドメイン。 4 N末端シグナルペプチド又はLXXCがなかった場合、開始コドンは排除し
た。 5 疎水性のC末端ドメイン又はLPXTGモチーフがなかった場合、終止コド
ンは除去した。
ーを設計する際に上記の特性をコードする任意領域及び全領域は該遺伝子から除
去した。プライマーは、適切な酵素制限部位及びその後に、保存されたコザック
のヌクレオチド配列((全例で)GCCACCを用いた。このコザック配列は、
真核性リボソームによるイニシエーター配列の認識を容易にする。)及び目的の
遺伝子挿入物の上流にあるATG開始コドンを持つものを設計した。例えば、B
amHI部位を用いる前向きプライマーの場合、このプライマーはGCGGGA
TCCGCCACCATGで始まり目的遺伝子の5’末端の小セクションに続く
。この逆向きプライマーは該前方向プライマーと適合するように、そして全例で
5’末端にNotI制限部位を備えるように(この部位はTTGCGGCCGC
)設計した。
用いた。
GATG3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCCTGTTTAGATTGGATATCTGTAAA
GACTT3’ 4172.5 前向きプライマー 5’CGCGGATCCGCCACCATGGATTTTCCTTCAAATT
TGGAGG3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCACCGTACTGGCTGCTGACT3’ ID211 前向きプライマー 5’CGGATCCGCCACCATGAGTGAGATCAAAATTATT
AACGC3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCCGTTCCATGGTTGACTCCT3’ 4197.4 前向きプライマー 5’CGCGGATCCGCCACCATGTGGGACATATTGGTGG
AAAC3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCTTCACTTGAGCAAACTGAATCC3’ 4122.1 前向きプライマー 5’CGCGGATCCGCCACCATGTCACAAGAAAAAACAA
AAAATGAA3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCATCGACGTAGTCTCCGCC3’ 4126.7 前向きプライマー 5’CGCGGATCCGCCACCATGCTGGTTGGAACTTTCT
ACTATCAAT3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCAACTTTCGTCCCTTTTTGG3’
3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCTTGTTTCATAGCTTTTTTGATTGT
T3’ ID209 前向きプライマー 5’CGCGGATCCGCCACCATGCTATTGATACGAAATG
CAGGG3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCAACATAATCTAGTAAATAAGCGTA
GCC3’ ID215 前向きプライマー 5’CGCGGATCCGCCACCATGACGGCGACGAATTTTC
3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCTTAATTCGTTTTTGAACTAGTTGC
T3’ 4170.4 前向きプライマー 5’CGCGGATCCGCCACCATGGCTGTTTTTCTTCGCT
ATCATG3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCTTTCTTCAACAAACCTTGTTCTTG
3’ 4193.1 前向きプライマー 5’CGCGGATCCGCCACCATGGGTAACCGCTCTTCTC
GTAAC3’ 逆向きプライマー 5’TTGCGGCCGCGCTTCCATCAAGGATTTTAGC3’
タイプ カルチャーから入手した4型肺炎連鎖球菌株11886の単離されたゲ
ノムDNAを鋳型にしてPCRにより増幅した。このPCR産物は適切な制限酵
素で切断し常套な分子生物学的技法を用いてpcDNA3.1の多クローニング
部位にクローニングした。適切に位置付けられた目的遺伝子のクローンを培養し
、このプラスミドはプラスミドメガキット(キアーゲン社)を用いて大量に(>
1.5mg)単離した。遺伝子のクローニング及び維持の成功は、各構築物の各
大量調製物の制限地図の作成並びに5’クローニング連結による約700塩基対
の配列決定により確認した。
撃法で使用した。4型肺炎連鎖球菌株NCTC11886の均一な実験株の凍結
乾燥されたアンプルを、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・ストレイン
ズから入手した。このアンプルを開封し、培養菌を0.5mLのトリプティック
・ソイ・ブロス(0.5%グルコース、5%血液)に再懸濁した。この懸濁液は
10mLのトリプシンダイズ培地(0.5%グルコース、5%血液)で継代培養
し37℃で一晩静置してインキュベートした。この培養菌は5%血液寒天プレー
ト上に塗布し、汚染を調べ、生存を確認し、血液寒天斜面上へ移した。残りの該
培養菌は20%グリセロールストックを作製するために使用した。この斜面は、
4型の血清型を確認するためパブリック・ヘルス・ラボラトリー・サービスに送
った。
し、37℃で一晩CO2ガス槽中でインキュベートした。新鮮な塗布菌が生成し
、オプトヒン感受性を確認した。
とにより、4型肺炎連鎖球菌の標準接種原を調製し凍結した。該接種原は培地中
約109cfu/mLの所定の生菌数まで凍結前に増殖させた。この調製はフロ
ーチャートにより以下に示す。 肺炎球菌の培養を塗布し同一性を確認する ↓ 上記プレート上で4〜5コロニーからの一晩培養菌を増殖させる ↓ 肺炎球菌培養菌を動物継代培養する (採取された心臓採血の腹膜腔内注射) ↓ 動物継代培養した肺炎球菌から一晩培養を増殖させる ↓ 動物継代培養の一晩培養を(所定の光学密度まで)一日増殖させ −70℃で凍結する−これは標準的な最低値である ↓ 標準接種原の1本の部分標本を解凍し生菌数を計数する ↓ 標準接種原を用いて有効用量を測定する (ビルレンス試験と呼ばれる) ↓ その後の全ての攻撃(標準接種原を有効用量まで用いる)
に用いた。
球菌を各マウスの鼻に適用した。この摂取はマウスの通常の呼吸により促進され
た。マウスは放置して元に回復させた。
NAを投与することにより実施した。ワクチン注射されるマウスは6つの群に分
け、各群は目的の特定の標的遺伝子配列を含む組換えpcDNA3.1+プラス
ミドDNAを用いて免疫した。ダルベッコのPBS(シグマ社)中総量100μ
gのDNAを両足の前脛骨筋中に筋内注射した(各足に50μL)。4週間後に
同じ手法でブーストを行った。比較のため、対照群を全ワクチン試行に含めた。
これらの対照群は、非ワクチン接種動物であるか、上述した同じ時間経過で非組
換えpcDNA3.1+DNA(偽ワクチン接種)のみを投与された動物であっ
た。二回目の免疫の3週間後、全てのマウス群は致死量の血清型4肺炎連鎖球菌
(NCTC11886株)を鼻腔内に攻撃した。投与された細菌数は、連続希釈
の接種原を5%血液寒天プレート上に塗布することにより測定した。鼻腔内免疫
の問題は、該接種原が泡立ち鼻孔外にあふれてしまうマウスがいることであり、
これは結果表に記録し計算時に考慮した。不明な問題は各マウスが一定量の該接
種原を嚥下しうることである。この量は各マウスで同じであり菌接種の間中で平
均化されると推定される。しかしながら、使用した試料サイズは小さく、この課
題は幾つかの実験で有意な結果を有しうる。攻撃後に生存している全てのマウス
は感染の3又は4日後に屠殺した。感染過程の間、攻撃されたマウスは、肺炎連
鎖球菌に誘発される疾患の発症に伴う症状の進展について調べられた。典型的な
徴候には、適当な順序で、立毛、猫背の増大、眼からの分泌、嗜眠の増加及び動
きへの抵抗が含まれる。この後者の症状は通常さらなる苦痛を回避するためにマ
ウスを淘汰する段階である瀕死状態の形成と一致した。これらのマウスは死の瀬
戸際にあると考えられ、この淘汰の時間を統計学的分析用に生存期間を測定する
ために用いた。マウスの死が発見された場合、この生存期間はマウスの存命が観
察された最後の時点とされた。
該攻撃に対する防御を付与したものと解した。防御は、該DNA配列が統計学的
に有意な防御(95%の信頼レベル(p<0.05))を付与するもの、マン−
ウィットニーを用いてぎりぎり有意であるか若しくは有意に近いもの、又は、一
匹以上の範囲外のマウスが存在するとか、例えば最初の死に至る時間が延びたた
めなどという幾つかの防御特性を示すもの、と解した。これらの結果の中には鼻
腔内感染の投与に伴う問題により明瞭性があいまいであると考えられる場合、限
界に近い結果又は有意性のない結果を潜在的な陽性とみなすことが許容される。
平均生存期間が長かったが、本結果は統計学的に有意でない。 試行7−4172.5でワクチン注射した群はワクチン注射していない対照よ
り非常に長い生存期間を示したが、差異は統計学的に有意でなかった。 試行8−ID211でワクチン注射した群はワクチン注射していない対照より
有意に長く生存した。4197.4、4122.1及び4126.7のワクチン
注射した群はワクチン注射していない群より長い平均生存期間を示したが、本結
果は統計学的に有意でなかった。4197.4及び4126.7の群は最初の死
に至る時間の延びも示し、4122.1群は一つの範囲外の結果を示した。
。
射した群はワクチン注射していない対照より平均生存期間が顕著に長かった。 試行10−ワクチン注射していない対照群はpcDNA3.1+でワクチン注
射した群より有意に長い期間生存した。ID215と4170.4でワクチン注
射した群は偽ワクチン注射群と比較して統計学的に有意に長い生存期間を示した
(p=0.0168と0.0316)が、ワクチン注射していない群と比較した
場合はそうではなかった。 試験11−4193.1でワクチン注射した群は最も有望であり、pcDNA
3.1+でワクチン注射した群より平均6.5時間長く、ワクチン注射していな
い群より6時間長く生存したが、本結果は統計学的に有意でなかった。
Claims (20)
- 【請求項1】 表2に示される配列群から選択される1配列を有する肺炎連
鎖球菌のタンパク質又はポリペプチド。 - 【請求項2】 表4に示される配列群から選択される1配列を有する肺炎連
鎖球菌のタンパク質又はポリペプチド。 - 【請求項3】 実質的に純粋な形態で提供される請求項1又は請求項2記載
のタンパク質又はポリペプチド。 - 【請求項4】 請求項1から請求項3のいずれか一項に記載のタンパク質又
はポリペプチドと実質的に同一なタンパク質又はポリペプチド。 - 【請求項5】 請求項1から請求項4のいずれか一項に記載のタンパク質又
はポリペプチドの同族体又は誘導体。 - 【請求項6】 表2〜表4で定義されるタンパク質又はポリペプチドの抗原
性及び/又は免疫原性の断片。 - 【請求項7】 下記の1配列、すなわち (i) 表1に示されるDNA配列群又はそれらのRNA等価物のいずれか、 (ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、 (iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配
列、 (iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的に同一な配列、 (v) 表1で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列
、 を含む核酸分子又は該配列からなる核酸分子。 - 【請求項8】 下記の1配列、すなわち (i) 表4に示されるDNA配列群又はそれらのRNA等価物のいずれか、 (ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、 (iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配
列、 (iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的に同一な配列、 (v) 表4で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列
、 を含む核酸分子又は該配列からなる核酸分子。 - 【請求項9】 表2〜表4に示される配列、又はそれらの同族体、誘導体及
び/又は断片から選択される配列を有するタンパク質又はポリペプチドの免疫原
及び/又は抗原としての使用。 - 【請求項10】 一つ以上のタンパク質又はポリペプチドを含む免疫原性及
び/又は抗原性の組成物であって、該タンパク質又は該ポリペプチドの配列が表
2〜表4に示される配列、又はそれらの同族体若しくは誘導体、及び/又はこれ
らのいずれかの断片から選択されるものである組成物。 - 【請求項11】 ワクチンであるか又は診断検定に用いられる請求項10記
載の免疫原性及び/又は抗原性の組成物。 - 【請求項12】 賦形剤、希釈剤、アジュバント等から選択される一つ以上
の補足的構成要素を含む請求項11記載のワクチン。 - 【請求項13】 表1、表3又は表4に定義される核酸配列の一つ以上を含
むワクチン組成物。 - 【請求項14】 表2〜表4に定義される少なくとも一つのタンパク質若し
くはポリペプチド、又はその同族体、誘導体若しくは断片と検査試料を接触させ
る工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法/診断方法。 - 【請求項15】 表2〜表4に定義されるタンパク質若しくはポリペプチド
、又はその同族体、誘導体若しくは断片に結合できる抗体。 - 【請求項16】 モノクローナル抗体である請求項15記載の抗体。
- 【請求項17】 検査試料と請求項15又は請求項16に記載の少なくとも
一つの抗体とを接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法/診断方法。 - 【請求項18】 検査試料と請求項7又は請求項8に記載の少なくとも一つ
の核酸配列とを接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法/診断方法。 - 【請求項19】 表2〜表4に定義されるタンパク質又はポリペプチドが潜
在的な抗微生物標的であるか否かを決定する方法であって、該タンパク質又は該
ポリペプチドを不活性化する工程及び肺炎連鎖球菌がインビトロ又はインビボで
まだ生存しているか否かを決定する工程を含む方法。 - 【請求項20】 肺炎連鎖球菌感染の治療又は予防に使用される医薬の製造
における、表2〜表4に定義されるタンパク質又はポリペプチドの機能又は発現
と拮抗、阻害又は他の方法で妨害できる作用物質の使用。
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