ES2307564T3

ES2307564T3 - Antigenos de streptococcus pyrogenes y fragmentos de adn correspondientes.

Info

Publication number: ES2307564T3
Application number: ES01271387T
Authority: ES
Inventors: Denis Martin; Bernard R. Brodeur; Josee Hamel; Stephane Rioux; Patrick Rheault
Original assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Current assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2021-12-21
Also published as: ATE398677T1; US20160326221A1; US20040097706A1; EP1343895B1; ES2307564T9; BE2021C506I2; AU2002216863B8; WO2002050107A3; US20100119507A1; AU1686302A; US8821895B2; US8298551B2; DE60134494D1; WO2002050107A2; CA2432525A1; US9340586B2; EP1343895A2; FR21C1005I2; JP2004524014A; BR0116704A

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia que comprende: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos; (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia que comprende: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos; (c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia elegida de: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos; (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia que comprende: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos; (e) un polinucleótido que codifica una porción que alberga epítopos de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos; o (f) un polinucleótido que es complementario a un polinucleótido de (a), (b), (c), (d) o (e), y en el que dicho polipéptido o su fragmento puede provocar una respuesta inmunitaria hacia Streptococcus pyogenes.

Description

Antígenos de Streptococcus pyrogenes y fragmentos de ADN correspondientes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a antígenos, más en particular a los antígenos BVH-P2, BVH-P3, BVH-P4, BVH-P5 y BVH-P6 del patógeno bacteriano Streptococcus (S. pyogenes) del grupo A, que se pueden usar para prevenir, diagnosticar y/o tratar las infecciones estreptocócicas.

Antecedentes de la invención

Los estreptococos son bacterias gram (+) que se diferencian mediante los antígenos de carbohidratos específicos A a O que se hallan en la superficie celular. Los aislamientos de S. pyogenes se distinguen adicionalmente mediante los antígenos de proteína M específicos de tipo. Las proteínas M son factores de virulencia importantes que son sumamente variables tanto en pesos moleculares como en secuencias. De hecho, se han identificado más de 80 tipos de proteínas M basándose en las diferencias antigénicas.

S. pyogenes es responsable de muchos tipos de infección diversos, que incluyen faringitis, erisipelas e impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales como bacteriemia y fascitis necrosante. Se ha documentado una reaparición de la enfermedad invasiva en los últimos años en muchos países, que incluyen los de Norteamérica y Europa. Aunque el organismo es sensible a los antibióticos, la elevada tasa de morbilidad y el inicio rápido de la sepsis da como resultado una morbilidad y mortalidad elevadas.

Para el desarrollo de una vacuna que proteja a los hospedadores de la infección por S. pyogenes, los esfuerzos se han centrado en los factores de virulencia, tales como las proteínas M específicas de tipo. Sin embargo, se descubrió que la porción aminoterminal de las proteínas M inducía anticuerpos con reactividad cruzada que reaccionaban con el miocardio humano, la tropomiosina, miosina, y vimentina, lo que podría estar implicado en enfermedades autoinmunitarias. Otros autores han utilizado técnicas recombinantes para producir proteínas híbridas complejas que contienen péptidos aminoterminales de las proteínas M de diferentes serotipos. Sin embargo, una vacuna segura que contenga todos los serotipos de S. pyogenes será sumamente compleja de producir y normalizar.

Además de los antígenos específicos de serotipo, otras proteínas de S. pyogenes han generado interés como candidatos para vacunas potenciales. Se demostró que la peptidasa C5a, que se expresa en al menos 40 serotipos de S. pyogenes, es inmunógena en ratones, pero su capacidad de reducir el nivel de colonización nasofaríngea fue limitada. Otros investigadores se han centrado también en las exotoxinas pirógenas estreptocócicas que parecen desempeñar un papel importante en la patogénesis de la infección. La inmunización con estas proteínas previno los síntomas mortales de choque tóxico, pero no previno la colonización.

El documento WO 00/40729 identifica un polipéptido adecuado para el uso en la vacunación contra infecciones estreptocócicas derivadas de Streptococcus pyogenes, que comprende la lipoproteína de un transportador ABC. La proteína también se denomina proteína SmtA o MtsA.

El documento WO 99/52939 describe un polipéptido adecuado para el uso de una vacuna contra las infecciones estreptocócicas derivadas de la proteína H de Streptococcus pyogenes.

La Universidad de Oklahoma ha desarrollado un proyecto de secuenciación genómica para la cepa MI GAS de S. pyogenes (http://dnal.chem.ou.edu/strep.html).

Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad sin satisfacer de antígenos de S. pyogenes que se puedan usar como componentes de una vacuna para la profilaxis y/o la terapia de la infección por S. pyogenes.

Resumen de la invención

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia que comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos, y en el que dicho polipéptido o su fragmento puede provocar una respuesta inmunitaria hacia Streptococcus pyogenes.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a los polipéptidos definidos en las reivindicaciones 9 a 10.

En otros aspectos, se proporcionan polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención, composiciones farmacéuticas, vectores que comprenden los polinucleótidos de la invención unidos de manera operable a una región de control de la expresión, así como células hospedadoras transfectadas con dichos vectores y métodos para producir polipéptidos que comprenden cultivar dichas células hospedadoras en condiciones adecuadas para la expresión.

Breve descripción de los dibujos

En las Figuras 1, 3, 5, 7, 9, la porción subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder. En las Figuras 2, 4, 6, 8, 10, la porción subrayada de la secuencia representa el péptido líder.

La Figura 1 representa la secuencia de ADN del gen BVH-P2 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes
ATCC12384; ID SEC Nº: 1.

La Figura 2 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido BVH-P2 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes ATCC12384; ID SEC Nº: 2.

La Figura 3 representa la secuencia de ADN del gen BVH-P3 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes
ATCC700294; ID SEC Nº: 3.

La Figura 4 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido BVH-P3 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294; ID SEC Nº: 4.

La Figura 5 representa la secuencia de ADN del gen BVH-P4 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes
ATCC700294; ID SEC Nº: 5.

La Figura 6 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido BVH-P4 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294; ID SEC Nº: 6.

La Figura 7 representa la secuencia de ADN del gen BVH-P5 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes
ATCC700294; ID SEC Nº: 7.

La Figura 8 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido de BVH-P5 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294; ID SEC Nº: 8.

La Figura 9 representa la secuencia de ADN del gen BVH-P6 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes
ATCC700294; ID SEC Nº: 9.

La Figura 10 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido BVH-P6 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294; ID SEC Nº: 10.

La Figura 11 representa la secuencia de ADN del gen BVH-P4 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes ATCC123834; ID SEC Nº: 11.

La Figura 12 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido BVH-P4 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes ATCC12384; ID SEC Nº: 12.

La Figura 13 representa la secuencia de ADN del gen BVH-P4 del serotipo M6 de la cepa de S. pyogenes SPY67; ID SEC Nº:13.

La Figura 14 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido BVH-P4 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes SPY67; ID SEC Nº: 14.

La Figura 15 representa la secuencia de ADN del gen BVH-P4 del serotipo de la cepa de S. pyogenes B514; ID EC Nº: 15.

La Figura 16 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido BVH-P4 del serotipo de la cepa de S. pyogenes B514; ID SEC Nº: 16.

La Figura 17 representa la comparación de las secuencias de nucleótidos de los genes BVH-P4 del serotipo M1 de S. pyogenes ATCC700294, el serotipo M3 de ATCC12384, el serotipo M6 de la cepa SPY77 y el aislamiento de ratón B514 mediante el uso del programa Clustal W del soporte informático de análisis de secuencias de MacVector (versión 6.5). Los nucleótidos idénticos se representan como *, y las diferencias se indican mediante espacios en blanco.

La Figura 18 representa la comparación de las secuencias de aminoácidos predichas de los marcos de lectura abiertos parciales de BVH-P4 del serotipo M1 de S. pyogenes ATCC700294, el serotipo M3 de ATCC12384, el serotipo M6 de la cepa SPY77 y el aislamiento de ratón B514 mediante el uso del programa Clustal W del soporte informático de análisis de secuencias de MacVector (versión 6.5). Debajo de la alineación hay una línea de consenso. Los aminoácidos idénticos se ilustran con un *, mientras las diferencias se indican mediante puntos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona moléculas de ADN purificadas y aisladas que codifican polipéptidos estreptocócicos que se pueden usar para prevenir, tratar y/o diagnosticar la infección estreptocócica.

Los expertos en la técnica apreciarán que la invención incluye moléculas de ADN que codifican análogos tales como mutantes, variantes, homólogos y derivados de tales polipéptidos, como se describe en la presente solicitud de patente. La invención también incluye moléculas de ARN que corresponden a las moléculas de ADN de la invención. Además de las moléculas de ADN y ARN, la invención incluye los polipéptidos correspondientes y los anticuerpos monoespecíficos que se unen de forma específica a tales polipéptidos.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia que comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos, y en el que dicho polipéptido o su fragmento puede provocar una respuesta inmunitaria hacia Streptococcus pyogenes.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 90% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia que comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos, y en el que dicho polipéptido o su fragmento puede provocar una respuesta inmunitaria hacia Streptococcus pyogenes.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia que comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos, y en el que dicho polipéptido o su fragmento puede provocar una respuesta inmunitaria hacia Streptococcus pyogenes.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido de la secuencia representada en la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión hacia un polipéptido que tiene una secuencia que comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica una porción que alberga epítopos de un polipéptido que tiene una secuencia que comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a porciones que albergan epítopos de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad respecto de un segundo polipéptido que comprende la secuencia ID SEC Nº:
10.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad respecto de un segundo polipéptido que comprende la secuencia ID SEC Nº:
10.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 90% de identidad respecto de un segundo polipéptido que comprende la secuencia ID SEC Nº:
10.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad respecto de un segundo polipéptido que comprende la secuencia ID SEC Nº:
10.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión hacia un polipéptido que comprende la ID SEC Nº: 10.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica una porción que alberga epítopos de un polipéptido que tiene la secuencia ID SEC Nº: 10.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a porciones que albergan epítopos de un polipéptido que tiene la secuencia ID SEC Nº: 10.

\newpage

De acuerdo con la presente invención, todos los polinucleótidos que codifican polipéptidos están dentro del alcance de la presente invención.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen al menos un 70% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen al menos un 95% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos que comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos capaces de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión hacia un polipéptido que tiene una secuencia elegida de ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen al menos un 70% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la ID SEC Nº: 10.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen al menos un 95% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la ID SEC Nº: 10.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que se caracterizan por la secuencia de aminoácidos que comprende la ID SEC Nº: 10.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos capaces de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión hacia un polipéptido que tiene una secuencia elegida de ID SEC Nº: 10.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a porciones que albergan epítopos de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de ID SEC Nº: 10.

En una realización adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención son antigénicos.

En una realización adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención son inmunógenos.

En una realización adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden provocar una respuesta inmunitaria en un hospedador.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polipéptidos que son capaces de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión hacia los polipéptidos de la presente invención como se definieron anteriormente.

Un anticuerpo que "tiene especificidad de unión" es un anticuerpo que reconoce y se une al polipéptido seleccionado, pero que no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas de una muestra, p. ej., una muestra biológica, que incluye de manera natural el péptido seleccionado. La unión específica se puede medir mediante el uso de un análisis de ELISA en el que el polipéptido seleccionado se usa como antígeno.

De acuerdo con la presente invención, "protección" en los estudios biológicos se define mediante un incremento significativo de la curva, tasa o periodo de supervivencia. Los análisis estadísticos que usan la prueba del orden logarítmico para comparar las curvas de supervivencia, y la prueba exacta de Fisher para comparar las tasas de supervivencia y el número de días hasta la muerte, respectivamente, podrían ser útiles para calcular los valores de P y para determinar si la diferencia entre los dos grupos es estadísticamente significativa. Los valores de P de 0,05 se consideran no significativos.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una secuencia nucleotídica consenso para BVH-P4 representada en la Figura 17. Como se puede observar mediante la alineación, el polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención está muy conservado. Sin limitar el alcance de la invención, la siguiente tabla A muestra las modificaciones posibles:

1

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una secuencia de aminoácidos consenso para BVH-P4 descrita en la Figura 18. Como se puede observar mediante la alineación, el polipéptido de la invención está muy conservado. Sin restringir el alcance de la invención, la siguiente tabla B muestra las modificaciones posibles:

2

En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan fragmentos antigénicos/inmunógenos de los polipéptidos de la invención, o de sus análogos.

Los fragmentos de la presente invención deberían incluir una o más regiones epitópicas, o ser lo suficientemente similares a tales regiones para mantener sus propiedades antigénicas/inmunógenas. Así, para los fragmentos según la presente invención, el grado de identidad es quizás irrelevante, ya que pueden ser un 100% idénticos a una parte particular de un polipéptido o de un análogo suyo como se describe en esta memoria. La presente invención proporciona además fragmentos que tienen al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de las secuencias polipeptídicas de la presente invención. En una realización, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos. En una realización, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos.

La persona experta apreciará que los análogos de los polipéptidos de la invención también tendrán utilidad en el contexto de la presente invención, es decir, como material antigénico/inmunógeno. Así, por ejemplo, la presente invención abarca las proteínas o polipéptidos que incluyen una o más adiciones, deleciones, sustituciones o similares.

Estas sustituciones son aquellas que tienen una influencia mínima sobre la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Las sustituciones preferidas son aquellas conocidas en la técnica como conservativas, es decir, los residuos sustituidos comparten propiedades físicas o químicas tales como hidrofobicidad, tamaño, carga o grupos funcionales. Estas incluyen las sustituciones tales como las descritas por Dayhoff, M. en Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978 y por Argos, P. en EMBO J. 8, 779-785, 1989. Por ejemplo, los aminoácidos, ya sean naturales o no, que pertenecen a uno de los siguientes grupos representan cambios conservativos:

ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr, val;

cys, ser, tyr, thr;

val, ile, leu, met, ala, phe;

lys, arg, orn, his;

y phe, tyr, trp, his.

Las sustituciones preferidas también incluyen las sustituciones de los enantiómeros D por los L-aminoácidos correspondientes.

El porcentaje de homología se define como la suma del porcentaje de identidad más el porcentaje de similitud o conservación del tipo de aminoácido.

En una aproximación alternativa, los análogos podrían ser proteínas de fusión, que incorporan restos que hacen que la purificación sea más fácil, por ejemplo marcando de manera eficaz el polipéptido deseado. Puede ser necesario eliminar el "marcador", o puede ser posible que el propio polipéptido de fusión mantenga una antigenicidad suficiente para que sea útil.

Así, lo importante es que los análogos, derivados y fragmentos posean al menos cierto grado de la antigenicidad/inmunogenicidad de la proteína o polipéptido del que derivan.

Como se usa aquí, los "fragmentos", "análogos" o "derivados" de los polipéptidos de la invención incluyen aquellos polipéptidos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente conservado), y que puede ser natural o no.

En una realización, los análogos de los polipéptidos de la invención tendrán alrededor de un 70% de identidad con las secuencias ilustradas en las figuras o sus fragmentos. Es decir, el 70% de los residuos son iguales. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 75% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 80% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 85% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 90% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 95% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 99% de homología. En una realización adicional, los análogos de los polipéptidos de la invención tendrán menos de alrede-
dor de 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos de aminoácidos, y más preferiblemente menos de 10.

En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 70% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 75% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 80% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 85% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 90% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 95% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 99% de homología. En una realización adicional, los derivados y análogos de los polipéptidos de la invención tendrán menos de alrededor de 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos de aminoácidos, y más preferiblemente menos de 10. Las sustituciones preferidas son aquellas conocidas en la técnica como conservativas, es decir, los residuos sustituidos comparten propiedades físicas o químicas tales como hidrofobicidad, tamaño, carga o grupos funcionales.

Se puede usar un programa tal como el programa CLUSTAL para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa compara secuencias de aminoácidos y halla la alineación óptima insertando espacios en cada secuencia según sea apropiado. Es posible calcular la identidad o similitud (identidad más la conservación del tipo de aminoácido) de aminoácidos para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. Así es posible obtener una comparación en la que se hallan varias regiones de similitud, y cada una tiene una puntuación diferente. Se contemplan ambos tipos de análisis de la identidad en la presente invención.

Para los fragmentos de los polipéptidos descritos aquí, o de sus análogos, la situación es ligeramente diferente de la proteína nativa. Se sabe que es posible cribar un polipéptido antigénico para identificar regiones epitópicas, es decir, aquellas regiones que son responsables de la antigenicidad o inmunogenicidad del polipéptido. Los métodos para llevar a cabo tal cribado se conocen bien en la técnica. Así, los fragmentos de la presente invención deberían incluir una o más de tales regiones epitópicas, o ser lo suficientemente similares a tales regiones para mantener sus propiedades antigénicas/inmunógenas. Así, para los fragmentos según la presente invención, el grado de identidad es quizás irrelevante, ya que pueden ser un 100% idénticos a una parte particular de un polipéptido, o análogo como se describe en esta memoria.

También están incluidos los polipéptidos que tienen fusionados en ellos otros compuestos que alteran las propiedades biológicas o farmacológicas de los polipéptidos, es decir, polietilenglicol (PEG) para incrementar la semivida; secuencias de aminoácidos líderes o secretoras para facilitar la purificación; prepro- y pro-secuencias; y (poli)sacáridos.

Además, en aquellas situaciones en las que se descubre que las regiones de aminoácidos son polimórficas, puede ser deseable variar uno o más aminoácidos particulares para imitar de manera más eficaz los diferentes epítopos de las diferentes cepas de estreptococo.

Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden modificar mediante acilación NH_{2}-terminal (p. ej. mediante acetilación, o mediante amidación con ácido tioglicólico, amidación carboxiterminal, p. ej. con amoníaco o metilamina) para proporcionar estabilidad, hidrofobicidad incrementada para la conexión o la unión a un soporte u otra molécula.

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También están contemplados los hetero- y homo-multímeros polipeptídicos de los fragmentos y análogos de polipéptido. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más polipéptidos que se han entrecruzado con agentes de entrecruzamiento tales como avidina/biotina, gliceraldehído o suberimidato de dimetilo. Tales formas poliméricas incluyen también polipéptidos que contienen dos o más secuencias contiguas en tándem o invertidas, producidas a partir de ARNms multicistrónicos generados mediante técnicas de ADN recombinante. En una realización adicional, la presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden uno o más polipéptidos o sus fragmentos o análogos, como se definen en las figuras de la presente solicitud.

En una realización adicional, la presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que tienen una secuencia elegida de las ID SEC Nºs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 o sus fragmentos o análogos; con tal de que los polipéptidos estén unidos para formar un polipéptido quimérico.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que tienen una secuencia elegida de las ID SEC Nºs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16 con tal de que los polipéptidos estén unidos para formar un polipéptido quimérico.

Para llevar a cabo la formación de polímeros antigénicos (es decir, multímeros sintéticos) se pueden utilizar polipéptidos que tengan grupos bis-haloacetilo, haluros de nitroarilo, o similares, en los que los reactivos son específicos para los grupos tiol. Por lo tanto, la unión entre dos grupos mercapto de los diferentes polipéptidos puede ser un enlace simple o puede estar compuesta de un grupo de unión de al menos dos, el general al menos cuatro, y no más de 16, pero habitualmente no más de alrededor de 14 átomos de carbono.

En una realización particular, los fragmentos y análogos de los polipéptidos de la invención no contienen un residuo de inicio, tal como metionina (Met) o valina (Val).

Preferiblemente, los polipéptidos no incorporarán una secuencia líder o secretora (secuencia señal). La porción de señal de un polipéptido de la invención se puede determinar según las técnicas de biología molecular establecidas. El polipéptido de interés se puede aislar a partir de un cultivo estreptocócico y secuenciarlo posteriormente para determinar el residuo inicial de la proteína madura y por lo tanto la secuencia del polipéptido maduro.

Se entiende que los polipéptidos se pueden producir y/o usar sin su codón de inicio (metionina o valina) y/o sin su péptido líder para favorecer la producción y la purificación de polipéptidos recombinantes. Se sabe que el clonado de genes sin las secuencias que codifican los péptidos líder restringirá la presencia de los polipéptidos al citoplasma de E. coli y facilitará su recuperación (Glick, B.R. y Pasternak, J.J. (1998) Manipulation of gene expression in prokaryotes. En "Molecular biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA", 2ª edición, ASM Press, Washington DC, págs. 109-143).

Los polipéptidos se pueden expresar con o sin una secuencia líder o secretora. En el primer caso, la secuencia líder se puede eliminar mediante el uso de procesamiento postraduccional (véanse los documentos US 4.431.739, US 4.425.437 y US 4.338.397), o se puede eliminar químicamente tras la purificación del polipéptido expresado.

Según otro aspecto de la invención, también se proporciona (i) una composición de materia que contiene un polipéptido de la invención, junto con un vehículo, diluyente o adyuvante; (ii) una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la invención y un vehículo, diluyente o adyuvante; (iii) una vacuna que comprende un polipéptido de la invención y un vehículo, diluyente o adyuvante; (iv) el uso de una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido de la invención para provocar una respuesta inmunitaria, p. ej., una respuesta inmunitaria protectora hacia estreptococo para la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria contra estreptococo, en un hospedador; y en particular (v) el uso de una cantidad profiláctica o terapéutica de un polipéptido de la invención para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar una infección por estreptococo en un hospedador que lo necesite.

Antes de la inmunización, los polipéptidos de la invención se pueden acoplar o conjugar también a proteínas portadoras tales como la toxina del tétanos, la toxina de la difteria, el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, el antígeno VP1 del virus de la poliomelitis, o cualquier otra toxina o antígeno viral o bacteriano o cualquier proteína adecuada para estimular el desarrollo de una respuesta inmunitaria más intensa. Esta unión o conjugación se puede llevar a cabo químicamente o genéticamente. Una descripción más detallada de la conjugación péptido-portador está disponible en Van Regenmortel, M.H.V., Briand J.P., Muller S., Plaué S., "Synthetic Polypeptides as antigens" en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 19 (ed.) Burdou, R.H. y Van Knippenberg P.H. (1988), Elsevier, Nueva York.

Según otro aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más polipéptidos estreptocócicos de la invención en una mezcla con un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes adecuados incluyen (1) formulaciones de emulsiones aceite en agua tales como MF59^{TM}, SAF^{TM}, Ribi^{TM}; (2) adyuvante completo o incompleto de Freund; (3) sales, es decir, AlK(SO_{4})_{2}, AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4}(SO_{4})_{2}, Al(OH)_{3}, AlPO_{4}, sílice, caolín; (4) derivados de saponina tales como Stimulon^{TM} o partículas generadas a partir suyo tales como ISCOMs (complejos inmunoestimulantes); (5) citocinas tales como interleucinas, interferones, factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF); (6) otras sustancias tales como polinucleótidos de carbono, es decir, poli IC y poli AU, toxina del cólera destoxificada (CTB) y la toxina termolábil de E. coli para la inducción de inmunidad de mucosas. Hay disponible una descripción más detallada del adyuvante en una revisión de M.Z.I Khan et al. en Pharmaceutical Research, vol. 11, nº 1 (1994) págs. 2-11, y también en otra revisión de Gupta et al., en Vaccine, vol. 13, nº 14, págs. 1263-1276 (1995) y en el documento WO 99/24578, que se incorporan en esta memoria como referencia. Los adyuvantes preferidos incluyen QuilA^{TM}, QS21^{TM}, Alhydrogel^{TM} y Adjuphos^{TM}.

En una realización adicional, se proporciona un método para fabricar una composición farmacéutica que comprende mezclar un polipéptido de la invención con un diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de una cantidad terapéutica o profiláctica de una composición de la invención para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección bacteriana estreptocócica en un hospedador susceptible a la infección estreptocócica.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar de forma parenteral mediante inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción, bucal u oral. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen también el toxoide tetánico.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento o la profilaxis de la infección estreptocócica, y/o para las enfermedades y síntomas mediados por la infección estreptocócica como se describe en P.R. Murray (ed. en jefe), E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover y R.H. Yolken. Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, Washington, D.C. sexta edición, 1995, 1482 p., que se incorpora en esta memoria como referencia. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se usan para el tratamiento o la profilaxis de faringitis, erisipelas e impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales como bacteriemia y fascitis necrosante, y también choque tóxico. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento o la profilaxis de la infección por estreptococo y/o las enfermedades y síntomas mediados por la infección por estreptococo, en particular estreptococo del grupo A (S. pyogenes), estreptococo del grupo B (GBS o S. agalactiae), S. pneumoniae, S. dysgalactiae, S. uberis, S. nocardia así como Staphylococcus aureus. En una realización adicional, la infección por estreptococo es por Streptococcus pyogenes.

En una realización particular, las composiciones farmacéuticas son adecuadas para los hospedadores con riesgo de infección por estreptococo, tales como niños, ancianos y hospedadores inmunodeprimidos.

Según un aspecto adicional, los polipéptidos estreptocócicos de la invención se pueden usar en un equipo que comprende los polipéptidos de la invención para la detección o el diagnóstico de la infección estreptocócica. Como se usa en la presente solicitud, el término "hospedador" incluye a los mamíferos. En una realización adicional, el mamífero es un humano.

Las composiciones farmacéuticas están preferiblemente en una forma farmacéutica unitaria de alrededor de 0,001 a 100 \mug/kg (antígeno/peso corporal), y más preferiblemente 0,01 a 10 \mug/kg, y lo más preferiblemente 0,1 a 1 \mug/kg, 1 a 3 veces con un intervalo de alrededor de 1 a 6 semanas entre las inmunizaciones.

Las composiciones farmacéuticas están preferiblemente en una forma farmacéutica unitaria de alrededor de 0,1 \mug a 10 mg, y más preferiblemente 1 \mug a 10 mg, y lo más preferiblemente 10 a 100 \mug, 1 a 3 veces con un intervalo de alrededor de 1 a 6 semanas entre las inmunizaciones.

En una realización, los polinucleótidos son los ilustrados en las ID SEC Nºs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, que pueden incluir los marcos de lectura abiertos (ORF), que codifican los polipéptidos de la invención.

Se apreciará que las secuencias polinucleotídicas ilustradas en las figuras se pueden alterar con codones degenerados, y pueden codificar todavía los polipéptidos de la invención. Por lo tanto, la presente invención proporciona además polinucleótidos que hibridan con las secuencias polinucleotídicas descritas anteriormente en esta memoria (o sus secuencias complementarias) que tienen un 50% de identidad entre las secuencias. En una realización, al menos un 70% de identidad entre las secuencias. En una realización, al menos un 75% de identidad entre las secuencias. En una realización, al menos un 80% de identidad entre las secuencias. En una realización, al menos un 85% de identidad entre las secuencias. En una realización, al menos un 90% de identidad entre las secuencias. En una realización adicional, los polinucleótidos son hibridables en condiciones rigurosas, es decir, tienen al menos un 95% de identidad. En una realización adicional, más de un 97% de identidad.

Las condiciones rigurosas adecuadas para la hibridación pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) editado por Ausubel F.M. et al., John Wiley & Sons, Inc., N.Y.).

En una realización adicional, la presente invención proporciona polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con

(a): una secuencia de ADN que codifica un polipéptido, o

(b): el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;

en el que dicho polipéptido comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

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(a): una secuencia de ADN que codifica un polipéptido, o

(b): el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;

en el que dicho polipéptido comprende la ID SEC Nº: 10.

(a): una secuencia de ADN que codifica un polipéptido, o

(b): el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;

en el que dicho polipéptido comprende al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la ID SEC Nº: 10 o sus fragmentos o análogos.

(a): una secuencia de ADN que codifica un polipéptido, o

(b): el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;

en el que dicho polipéptido comprende al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la ID SEC Nº: 10.

En una realización adicional, los polinucleótidos son los ilustrados en las ID SEC Nºs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, que codifican los polipéptidos de la invención.

Como apreciará fácilmente un experto en la técnica, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.

La presente invención también incluye polinucleótidos complementarios a los polinucleótidos descritos en la presente solicitud.

En un aspecto adicional, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención, o sus fragmentos, análogos o derivados, se pueden usar en un método de inmunización con ADN. Es decir, se pueden incorporar en un vector que es replicable y expresable tras la inyección, por lo que se produce un polipéptido antigénico in vivo. Por ejemplo, se pueden incorporar polinucleótidos en un vector plasmídico bajo control del promotor de CMV que es funcional en las células eucarióticas. Preferiblemente el vector se inyecta de forma intramuscular.

Según otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes expresando un polinucleótido que codifica dicho polipéptido en una célula hospedadora y recuperando el producto polipeptídico expresado. De forma alternativa, los polipéptidos se pueden producir según técnicas químicas sintéticas establecidas, es decir, síntesis en fase de disolución o en fase sólida de oligopéptidos que se ligan para producir el polipéptido completo (ligadura de bloques).

Los métodos generales para la obtención y el análisis de polinucleótidos y polipéptidos se describen en las siguientes referencias: Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, editado por Ausubel F.M. et al., John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; PCR Cloning Protocols, from Molecular Cloning to Genetic Engineering, editado por White B.A., Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 1997, 490 páginas; Protein Purification, Principles and Practices, Scopes R.K., Springer-Verlag, Nueva York, 3ª edición, 1993, 380 páginas; Current Protocols in Immunology, editado por Coligan J.E. et al., John Wiley & Sons Inc., Nueva York.

Para la producción recombinante, las células hospedadoras se transfectan con vectores que codifican el polipéptido, y después se cultivan en medios nutritivos modificados según sea apropiado para activar los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los genes. Los vectores adecuados son aquellos que son viables y replicables en el hospedador elegido, e incluyen las secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, p. ej., plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos. La secuencia polipeptídica se puede incorporar en el vector en el lugar apropiado mediante el uso de enzimas de restricción, de forma que está unida de manera operable a una región de control de la expresión que comprende un promotor, un sitio de unión al ribosoma (región consenso o secuencia de Shine-Dalgarno), y opcionalmente un operador (elemento de control). Se pueden seleccionar los componentes individuales de la región de control de la expresión que sean apropiados para un hospedador y vector dados según los principios establecidos de biología molecular (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, editado por Ausubel F.M. et al., John Wiley and Sons, Inc., Nueva York). Los promotores adecuados incluyen, pero sin limitación, LTR o promotor de SV40, promotores lac, tac o trp de E. coli y el promotor P_{L} de fago \lambda. Los vectores incorporarán preferiblemente un origen de replicación, así como marcadores seleccionables, es decir, el gen de resistencia a ampicilina. Los vectores bacterianos adecuados incluyen pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pD10, phagescript, psi174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 y los vectores eucarióticos pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células hospedadoras pueden ser bacterianas, es decir, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; fúngicas, es decir, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans; levaduras, es decir, Saccharomyces, o eucarióticas, es decir, CHO, COS.

Tras la expresión del polipéptido en cultivo, las células se recogen generalmente mediante centrifugación y después se lisan mediante medios físicos o químicos (si el polipéptido expresado no se secreta en los medios), y el extracto bruto resultante se conserva para aislar el polipéptido de interés. La purificación del polipéptido a partir de los medios de cultivo o del lisado se puede llevar a cabo mediante técnicas establecidas, dependiendo de las propiedades del polipéptido, es decir, mediante el uso de precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía con hidroxiapatito y cromatografía con lectina. La purificación final se puede llevar a cabo mediante el uso de HPLC.

Según un aspecto adicional, los polipéptidos estreptocócicos de la invención se pueden usar en una prueba diagnóstica para la infección por estreptococo, en particular la infección por Streptococcus pyogenes. Son posibles varios métodos diagnósticos, por ejemplo para la detección del organismo estreptococo en una muestra biológica se puede seguir el siguiente procedimiento:

a): obtener una muestra biológica de un hospedador;

b): incubar un anticuerpo, o su fragmento, reactivo con un polipéptido de estreptococo de la invención con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c): detectar el anticuerpo unido o el fragmento unido de forma específica en la mezcla, lo que indica la presencia del estreptococo.

De forma alternativa, se puede llevar a cabo un método para la detección de un anticuerpo específico para un antígeno de estreptococo en una muestra biológica que contiene, o que se sospecha que contiene, dicho anticuerpo como sigue:

a): obtener una muestra biológica de un hospedador;

b): incubar uno o más polipéptidos de estreptococo de la invención, o sus fragmentos, con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c): detectar el antígeno unido o el fragmento unido de forma específica en la mezcla, lo que indica la presencia del anticuerpo específico para estreptococo.

Un experto en la técnica reconocerá que esta prueba diagnóstica puede presentarse en varias formas, que incluyen una prueba inmunológica tal como un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo o un ensayo de aglutinación de látex, básicamente para determinar si los anticuerpos específicos para la proteína están presentes en un organismo.

Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos de la invención se pueden usar también para diseñar sondas de ADN para el uso en la detección de la presencia de estreptococo en una muestra biológica que se sospecha que contiene tal bacteria. El método de detección de esta invención comprende:

a): obtener una muestra biológica de un hospedador;

b): incubar una o más sondas de ADN que tienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención, o sus fragmentos, con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c): detectar la sonda de ADN unida de forma específica en la mezcla, lo que indica la presencia de la bacteria estreptococo.

Las sondas de ADN de esta invención se pueden usar también para detectar estreptococos circulantes, es decir, ácidos nucleicos de Streptococcus pyogenes en una muestra, por ejemplo mediante el uso de una reacción en cadena de la polimerasa, como método para diagnosticar las infecciones por estreptococo. La sonda se puede sintetizar mediante el uso de técnicas convencionales, y se puede inmovilizar en una fase sólida, o se puede marcar con una molécula marcadora detectable. Una sonda de ADN preferida para esta aplicación es un oligómero que tiene una secuencia complementaria respecto de al menos alrededor de 6 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de Streptococcus pyogenes de la invención.

Otro método diagnóstico para la detección de estreptococo en un hospedador comprende:

a): marcar un anticuerpo reactivo con un polipéptido de la invención, o su fragmento, con una molécula marcadora detectable;

b): administrar el anticuerpo marcado o el fragmento marcado al hospedador; y

c): detectar el anticuerpo marcado o el fragmento marcado unido de forma específica en el hospedador, lo que indica la presencia del estreptococo.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de los polipéptidos de estreptococo de la invención como inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para el diagnóstico, y en particular para el tratamiento, de la infección por estreptococo. Los anticuerpos adecuados se pueden determinar mediante el uso de métodos de cribado apropiados, por ejemplo midiendo la capacidad de un anticuerpo particular para proteger de manera pasiva contra la infección por estreptococo en un modelo experimental. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo en ratón descrito en los ejemplos de esta memoria. El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo, o un fragmento suyo de unión al antígeno, y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulinas. El anticuerpo o el fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen mamífero y más específicamente de origen murino, de rata o humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento suyo, o si se desea un anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante. La expresión anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante significa un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se produjo mediante el uso de técnicas de biología molecular. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede ser policlonal, o preferiblemente monoclonal. Puede ser específico para varios epítopos asociados a los polipéptidos de Streptococcus pyogenes, pero preferiblemente es específico para uno.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de los anticuerpos dirigidos hacia los polipéptidos de la invención para la inmunización pasiva. Se podrían usar los anticuerpos descritos en la presente solicitud. Tales anticuerpos se pueden determinar mediante el uso de métodos de cribado apropiados, por ejemplo midiendo la capacidad de un anticuerpo particular para proteger de manera pasiva contra la infección estreptocócica en un modelo experimental. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo en ratón descrito en los ejemplos de esta memoria. El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo, o un fragmento suyo de unión al antígeno, y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulinas. El anticuerpo o el fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen mamífero y más específicamente de origen murino, de rata o humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento suyo, o, si se desea, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante. La expresión anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante significa un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se produjo mediante el uso de técnicas de biología molecular. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede ser policlonal, o preferiblemente monoclonal. Puede ser específico para varios epítopos asociados a los polipéptidos estreptocócicos, pero preferiblemente es específico para uno.

Según un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo para el tratamiento y/o la profilaxis de las infecciones estreptocócicas.

A menos que se defina de otra manera, todas las expresiones técnicas y científicas usadas en esta memoria tienen el mismo significado que entiende normalmente alguien de experiencia habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes, y otras referencias mencionadas en esta memoria se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, predominará la presente memoria descriptiva, lo que incluye las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos, y no pretenden ser limitantes.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra el clonado y las características moleculares del gen BVH-P2 y del polipéptido correspondiente.

La región codificante del gen BVH-P2 de S. pyogenes (ID SEC Nº: 1) se amplificó mediante PCR (Robocycler Gradient 96 Temperature Cycler, Stratagene, LaJolla, Ca) a partir de ADN genómico del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes ATCC12384 mediante el uso de los siguientes cebadores oligonucleotídicos que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG): DMAR124 y DMAR125, que se presentan en la Tabla 1. Los productos de la PCR se purificaron a partir de un gel de agarosa mediante el uso de un equipo de extracción de geles QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA), y se digirieron con NdeI y XhoI (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pET-21b(+) (Novagen, Madison, WI) se digirió con NdeI y XhoI y se purificó a partir de un gel de agarosa mediante el uso de un equipo de extracción de geles QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de PCR NdeI-XhoI se ligaron al vector de expresión NdeI-XhoI pET-21b(+). Los productos ligados se transformaron en la cepa de E. coli DH5 [\Phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 hsdR17 (r_{K}-m_{K}+) deoR thi-1 supE44 \lambda^{-}gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) según el método de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), págs. 109-135). Se purificó el plásmido recombinante pET-21b(+) (rpET21b(+)) que contenía el gen BVH-P2 mediante el uso de un equipo de plásmidos de QIAgen (Chatsworth, CA), y el inserto de ADN se secuenció (equipo Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA).

TABLA 1 Cebadores oligonucleotídicos usados para las amplificaciones mediante PCR de los genes de S. pyogenes

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Se determinó que el marco de lectura abierto (ORF) que codifica BVH-P2 contiene 633 pb y codifica un polipéptido de 210 residuos de aminoácidos con un pI predicho de 6,40 y una masa molecular predicha de 24.611,78 Da. El análisis de la secuencia predicha de residuos de aminoácidos (ID SEC Nº: 2) mediante el uso del programa informático Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) pareció indicar la existencia de un péptido señal de 22 residuos de aminoácidos (MKKTLTLLLALFAIGVTSSVRA), que termina con un sitio de escisión situado entre un residuo de alanina y un residuo de ácido glutámico.

Para confirmar la presencia mediante amplificación con PCR del gen BVH-P2 (ID SEC Nº: 1), se usaron las siguientes 4 cepas de S. pyogenes serológicamente diferentes: el serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC 700294 y el serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes ATCC12384 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.); el serotipo M6 del aislamiento clínico de S. pyogenes SPY67 fue proporcionado por el Centre de recherche en infectiologie du Centre hospitalier de l'université Laval, Sainte-Foy; y la cepa de S. pyogenes B514 que se aisló inicialmente en un ratón fue proporcionada por Susan Hollingshead, de la Universidad de Alabama, Birmingham. La cepa de E. coli XL1-Blue MRF' se usó en estos experimentos como control negativo. El ADN cromosómico se aisló de cada cepa de S. pyogenes como se describió previamente (Jayarao BM et al. 1991. J. Clin. Microbiol. 29:2774-2778). El gen BVH-P2 (ID SEC Nº: 1) se amplificó mediante PCR (Robocycler Gradient 96 Temperature Cycler, Stratagene, LaJolla, Ca) del ADN genómico purificado de las 4 cepas de S. pyogenes, y la cepa de E. coli de control mediante el uso de los cebadores oligonucleotídicos DMAR124 y DMAR125 (Tabla 1). La PCR se llevó a cabo con 30 ciclos de 45 seg a 95ºC, 45 seg a 50ºC y 1 min a 72ºC, y un periodo de elongación final de 7 min a 72ºC. Los productos de PCR se fraccionaron por tamaños en geles de agarosa del 1% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los resultados de estas amplificaciones mediante PCR se presentan en la Tabla 2. El análisis de los productos de amplificación reveló que el gen BVH-P2 (ID SEC Nº: 1) estaba presente en el genoma de las 4 cepas de S. pyogenes analizadas. No se detectó tal producto cuando el ADN de E. coli de control se sometió a amplificaciones mediante PCR idénticas con estos cebadores oligonucleotídicos.

TABLA 2 Identificación de genes de S. pyogenes mediante amplificación con PCR

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Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra el clonado y las características moleculares del gen BVH-P3 y del polipéptido correspondiente.

La región codificante del gen BVH-P3 de S. pyogenes (ID SEC Nº: 3) se amplificó mediante PCR (Robocycler Gradient 96 Temperature Cycler, Stratagene, LaJolla, Ca) a partir de ADN genómico del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294 mediante el uso de los siguientes oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG): DMAR188 y DMAR189, que se presentan en la Tabla 1. Los métodos usados para el clonado de BVH-P3 en un vector de expresión y la secuenciación son similares a los métodos descritos en el Ejemplo 1.

Se determinó que el marco de lectura abierto (ORF) que codifica BVH-P3 contiene 921 pb y codifica un polipéptido de 306 residuos de aminoácidos con un pI predicho de 5,73 y una masa molecular predicha de 33.882,36 Da. El análisis de la secuencia predicha de residuos de aminoácidos (ID SEC Nº: 4) mediante el uso del programa informático Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) pareció indicar la existencia de un péptido señal de 27 residuos de aminoácidos (MSLILGAFLSVFLLVACSSTGTKTAKS), que finaliza con un sitio de escisión situado entre un residuo de serina y un residuo de ácido aspártico. Se demostró que el gen BVH-P3 estaba presente tras la amplificación con PCR mediante el uso de los cebadores oligonucleotídicos DMAR188 y DMAR189 en las 4 cepas serológicamente diferentes de S. pyogenes analizadas (Tabla 2). Los métodos usados para la amplificación con PCR del gen BVH-P3 fueron similares a los métodos presentados en el Ejemplo 1. No se detectó tal producto cuando el ADN de E. coli de control se sometió a amplificaciones mediante PCR idénticas con estos cebadores oligonucleotídicos.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra el clonado y las características moleculares del gen BVH-P4 y del polipéptido correspondiente. La región codificante del gen BVH-P4 de S. pyogenes (ID SEC Nº: 5) se amplificó mediante PCR (Robocycler Gradient 96 Temperature Cycler, Stratagene, LaJolla, Ca) a partir de ADN genómico del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294 mediante el uso de los siguientes oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG): DMAR192 y DMAR193, que se presentan en la Tabla 1. Los métodos usados para el clonado de BVH-P4 en un vector de expresión y la secuenciación son similares a los métodos descritos en el Ejemplo 1.

Se determinó que el marco de lectura abierto (ORF) que codifica BVH-P4 contiene 1053 pb y codifica un polipéptido de 350 residuos de aminoácidos con un pI predicho de 7,90 y una masa molecular predicha de 36.392,50 Da. El análisis de la secuencia predicha de residuos de aminoácidos (ID SEC Nº: 6) mediante el uso del programa informático Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) pareció indicar la existencia de un péptido señal de 19 residuos de aminoácidos (MNKKFIGLGLASVAVLSLA), que finaliza con un sitio de escisión situado entre dos residuos de alanina.

Se demostró que el gen BVH-P4 estaba presente tras la amplificación con PCR mediante el uso de los cebadores oligonucleotídicos DMAR192 y DMAR193 en las 4 cepas serológicamente diferentes de S. pyogenes analizadas (Tabla 2). Los métodos usados para la amplificación con PCR del gen BVH-P4 fueron similares a los métodos presentados en el Ejemplo 1. No se detectó tal producto cuando el ADN de E. coli de control se sometió a amplificaciones mediante PCR idénticas con estos cebadores oligonucleotídicos.

La secuenciación de genes BVH-P4 adicionales de otras cepas confirmó el nivel elevado de conservación molecular de este gen entre aislamientos de S. pyogenes. La región codificante respectiva del gen BVH-P4 de S. pyogenes de las cepas ATCC 12384 (ID SEC Nº: 11), SPY67 (ID SEC Nº: 13), y B514 (ID SEC Nº: 15) se amplificó mediante PCR (Robocycler Gradient 96 Temperature Cycler, Stratagene, LaJolla, Ca) a partir de ADN genómico mediante el uso de los cebadores oligonucleotídicos DMAR192 y DMAR193 que se describen en la Tabla 1. Los productos de PCR se purificaron a partir de un gel de agarosa mediante el uso de un equipo de extracción de geles QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA), y los insertos de ADN se secuenciaron (equipo Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA). Las secuencias predichas de aminoácidos de las cepas ATCC12384 (ID SEC Nº: 12), SPY67 (ID SEC Nº: 14), y B514 (ID SEC Nº: 16) se presentaron respectivamente en las figuras 12, 14 y 16 siguientes. La figura 18 representa las secuencias consenso de aminoácidos predichas establecidas para BVH-P4 de S. pyogenes. La comparación mediante emparejamientos de estas secuencias de aminoácidos de BVH-P4 indicó que el nivel de identidad fue mayor del 99%, lo que demuestra claramente el nivel elevado de conservación de BVH-P4 entre los aislamientos de S. pyogenes.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra el clonado y las características moleculares del gen BVH-P5 y del polipéptido correspondiente.

La región codificante del gen BVH-P5 de S. pyogenes (ID SEC Nº: 7) se amplificó mediante PCR (Robocycler Gradient 96 Temperature Cycler, Stratagene, LaJolla, Ca) a partir de ADN genómico del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294 mediante el uso de los siguientes oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG): DMAR200 y DMAR201, que se presentan en la Tabla 1. Los métodos usados para el clonado de BVH-P5 en un vector de expresión y la secuenciación son similares a los métodos descritos en el Ejemplo 1.

Se determinó que el marco de lectura abierto (ORF) que codifica BVH-P5 contiene 1044 pb y codifica un polipéptido de 347 residuos de aminoácidos con un pI predicho de 5,65 y una masa molecular predicha de 36.808,91 Da. El análisis de la secuencia predicha de residuos de aminoácidos (ID SEC Nº: 8) mediante el uso del programa informático Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) pareció indicar la existencia de un péptido señal de 17 residuos de aminoácidos (MNKKVMSLGLVSTALFT), que finaliza con un sitio de escisión situado entre un residuo de treonina y un residuo de leucina.

Se demostró que el gen BVH-P5 estaba presente tras la amplificación con PCR mediante el uso de los cebadores oligonucleotídicos DMAR200 y DMAR201 en las 4 cepas serológicamente diferentes de S. pyogenes analizadas (Tabla 2). Los métodos usados para la amplificación con PCR del gen BVH-P5 fueron similares a los métodos presentados en el Ejemplo 1. No se detectó tal producto cuando el ADN de E. coli de control se sometió a amplificaciones mediante PCR idénticas con estos cebadores oligonucleotídicos.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra el clonado y las características moleculares del gen BVH-P6 y del polipéptido correspondiente.

La región codificante del gen BVH-P6 de S. pyogenes (ID SEC Nº: 9) se amplificó mediante PCR (Robocycler Gradient 96 Temperature Cycler, Stratagene, LaJolla, Ca) a partir de ADN genómico del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294 mediante el uso de los siguientes cebadores oligonucleotídicos que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG): DMAR235 y DMAR236, que se presentan en la Tabla 1. Los métodos usados para el clonado de BVH-P6 en un vector de expresión y la secuenciación son similares a los métodos descritos en el Ejemplo 1.

Se determinó que el marco de lectura abierto (ORF) que codifica BVH-P6 contiene 1020 pb y codifica un polipéptido de 339 residuos de aminoácidos con un pI predicho de 6,66 y una masa molecular predicha de 38.017,78 Da. El análisis de la secuencia predicha de residuos de aminoácidos (ID SEC Nº: 10) mediante el uso del programa informático Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) pareció indicar la existencia de un péptido señal de 33 residuos de aminoácidos (MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFS), que finaliza con un sitio de escisión situado entre un residuo de serina y un residuo de alanina. Se demostró que el gen BVH-P6 estaba presente tras la amplificación con PCR mediante el uso de los cebadores oligonucleotídicos DMAR235 y DMAR236 en las 4 cepas serológicamente diferentes de S. pyogenes analizadas (Tabla 2). Los métodos usados para la amplificación con PCR del gen BVH-P6 fueron similares a los métodos presentados en el Ejemplo 1. No se detectó tal producto cuando el ADN de E. coli de control se sometió a amplificaciones mediante PCR idénticas con estos cebadores oligonucleotídicos.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra el clonado de genes de S. pyogenes en el plásmido de CMV pCMV-GH.

Las regiones de ADN codificante de proteínas de S. pyogenes se insertaron en fase en posición 3' respecto de un gen de hormona del crecimiento humana (hGH) que estaba bajo control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMV) en el vector plasmídico pCMV-GH (Tang et al., Nature, 1992, 356: 152). El promotor de CMV es un plásmido no funcional en células de E. coli, pero es activo tras la administración del plásmido en células eucarióticas. El vector también incorporó el gen de resistencia a ampicilina.

Las regiones codificantes de los genes BVH-P2 (ID SEC Nº: 1), BVH-P4 (ID SEC Nº: 5), BVH-P5 (ID SEC Nº: 7), y BVH-P6 (ID SEC Nº: 9) sin sus regiones de péptidos líder se amplificaron mediante PCR (Robocycler Gradient 96 Temperature Cycler, Stratagene, LaJolla, Ca) a partir del ADN genómico del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294 mediante el uso de cebadores oligonucleotídicos que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción BamHI (GGATCC) y SalI (GTCGAC), que se describen en la Tabla 1. Los productos de PCR se purificaron a partir de un gel de agarosa mediante el uso de un equipo de extracción de geles QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA), se digirieron con enzimas de restricción (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfe, Canadá). El vector pCMV-GH (laboratorio del Dr. Stephen A. Johnston, Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas, Dallas, Texas) se digirió con BamHI y SalI y se purificó a partir de un gel de agarosa mediante el uso del equipo de extracción de geles QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN de BamHI-SalI se ligaron en el vector BamHI-SalI pCMV-GH para crear las proteínas de fusión hGH-BVH-P2, hGH-BVH-P4, hGH-BVH-P5, y hGH-BVH-P6 bajo el control del promotor de CMV. Los productos ligados se transformaron en la cepa de E. coli DH5\alpha[\Phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 hsdR17 (r_{K}-m_{K}+) deoR thi-1 supE44 \lambda^{-}gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) según el método de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed.), págs. 109-135). Los plásmidos pCMV recombinantes se purificaron mediante el uso de un equipo de plásmidos de QIAgen (Chatsworth, CA), y las secuencias nucleotídicas de los insertos de ADN se verificaron mediante secuenciación del ADN.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra el uso de ADN para provocar una respuesta inmunitaria hacia antígenos proteicos de S. pyogenes.

Se inmunizaron grupos de 8 ratones hembra BALB/c (Charles River, St-Constant, Quebec, Canadá) mediante inyección intramuscular de 100 \mul tres veces a intervalos de dos o tres semanas con 50 \mug de pCMV-GH recombinante que codificaba los genes BVH-P2 (ID SEC Nº: 1), BVH-P4 (ID SEC Nº: 5), BVH-P5 (ID SEC Nº: 7), y BVH-P6 (ID SEC Nº: 9) en presencia de 50 \mug de plásmido pCMV-GH-GM-CSF que expresa factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (laboratorio del Dr. Stephen A. Johnston, Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas, Dallas, Texas). Como control se inyectó a grupos de ratones 50 \mug de pCMV-GH en presencia de 50 \mug de pCMV-GH-GM-CSF. Las muestras de sangre se recogieron del seno orbital antes de cada inmunización y siete días después de la tercera inyección, y se determinaron las respuestas de anticuerpos séricos mediante ELISA con el uso de las proteínas recombinantes de S. pyogenes marcadas con His como antígenos de revestimiento. La producción y la purificación de estas proteínas recombinantes de S. pyogenes marcadas con His se presentan en el Ejemplo 8.

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Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra la producción y la purificación de proteínas recombinantes de S. pyogenes.

Se usaron los plásmidos pET-21b(+) recombinantes con BVH-P2 (ID SEC Nº: 1), BVH-P3 (ID SEC Nº: 3), BVH-P4 (ID SEC Nº: 5), BVH-P5 (ID SEC Nº: 7), y BVH-P6 (ID SEC Nº: 9) para transformar mediante electroporación (aparato Gene Pulser II, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canadá) la cepa de E. coli BL21 (DE3) (F^{-}ompT hsdS_{B}(r_{B}m^{-}B) gal dcm (DE3)) (Novagen, Madison, WI). En esta cepa de E. coli, el promotor de T7 que controla la expresión de la proteína recombinante es reconocido específicamente por la ARN polimerasa de T7 (presente en el profago \lambdaDE3), cuyo gen está bajo control del promotor lac que es inducible mediante isopropil-\beta-d-tiogalactopiranósido (IPTG). Los transformantes BL21 (DE3)/rpET se cultivaron a 37ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB (10 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl) que contenía 100 \mug de carbenicilina (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canadá) por ml hasta que la A_{600} alcanzó un valor de 0,6. Para inducir la producción de las proteínas recombinantes de S. pyogenes marcadas con His, las células se incubaron durante 3 horas adicionales en presencia de IPTG a una concentración final de 1 mM. Las células inducidas de un cultivo de 500 ml se centrifugaron y se congelaron a -70ºC.

La purificación de las proteínas recombinantes a partir de la fracción citoplasmática soluble de BL21(DE3)/
rpET21b(+) inducido por IPTG se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad basándose en las propiedades de la secuencia His\cdotTag (6 residuos consecutivos de histidina) para unirse a cationes divalentes (Ni^{2+}) inmovilizados en la resina quelante de metales His\cdotBind. Brevemente, las células centrifugadas obtenidas de un cultivo de 500 mL inducido con IPTG se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH 7,9) que contenía PMSF 1 mM, se sonicaron y se centrifugaron a 12.000 X g durante 20 min para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se depositó en una columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá). Las proteínas recombinantes de S. pyogenes marcadas con His se eluyeron con imidazol 250 mM-NaCl 500 mM-Tris 20 mM, pH 7,9. La eliminación de la sal y del imidazol de las muestras se llevó a cabo mediante diálisis con PBS a 4ºC. Las cantidades de las proteínas recombinantes obtenidas de la fracción soluble de E. coli se estimaron mediante MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).

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Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra la reactividad de las proteínas recombinantes de S. pyogenes marcadas con His con sueros humanos y sueros recogidos de ratones tras inmunización con preparaciones antigénicas de S. pyogenes.

Como se muestra en la Tabla 3, todas las proteínas recombinantes purificadas fueron reconocidas en inmunotransferencias por los anticuerpos presentes en la mezcla de sueros normales. Esto indica que los humanos que están normalmente en contacto con S. pyogenes desarrollan anticuerpos que son específicos para estas proteínas. Estos anticuerpos humanos particulares podrían estar implicados en la protección contra la infección por S. pyogenes. Además, las inmunotransferencias también revelaron que los sueros recogidos de ratones inmunizados con preparaciones antigénicas de S. pyogenes enriquecidas en proteínas de membrana que protegieron a los ratones contra la exposición letal también desarrollaron anticuerpos que reconocieron las proteínas recombinantes marcadas con His BVH-P3, BVH-P4 y BVH-P5. Este resultado indica que estas proteínas estaban presentes en la preparación antigénica de S. pyogenes que protegió a los ratones contra la infección, y que indujeron anticuerpos que reaccionaron con la proteína recombinante correspondiente marcada con His.

TABLA 3 Reactividad en inmunotransferencias de sueros humanos y sueros recogidos de ratones tras inmunización con preparaciones antigénicas de S. pyogenes con proteínas recombinantes de fusión marcadas con His de S. pyogenes

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Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra la accesibilidad a anticuerpos del polipéptido BVH-P4 de S. pyogenes en la superficie de células estreptocócicas intactas.

Las bacterias se cultivaron en caldo de Tood Hewitt (TH) (Difco Laboratories, Detroit, MI) con un 0,5% de extracto de levadura (Difco Laboratories) y un 0,5% de extracto de peptonas (Merck, Darmstadt, Alemania) a 37ºC en una atmósfera de un 8% de CO_{2} para proporcionar una DO_{490 nm} de 0,600 (\sim10^{8} UFC/ml). Después se añadieron diluciones de sueros anti-BVH-P4 o de control y se dejaron unir a las células, que se incubaron después durante 2 h a 4ºC. Las muestras se lavaron 4 veces en tampón de bloqueo [solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía un 2% de albúmina de suero bovino (BSA)], y después se añadió 1 ml de IgG + IgM anti-ratón de cabra conjugada a fluoresceína (FITC). Después de una incubación adicional de 60 min a temperatura ambiente, las muestras se lavaron 4 veces con tampón de bloqueo y se fijaron con formaldehído al 0,25% en tampón PBS durante 18-24 h a 4ºC. Las células se lavaron 2 veces en tampón PBS y se suspendieron en 500 \mul de tampón PBS. Las células se mantuvieron en la oscuridad a 4ºC hasta que se analizaron mediante citometría de flujo (Epics® XL; Beckman Coulter, Inc.). El análisis de citometría de flujo reveló que los anticuerpos específicos para BVH-P4 reconocieron de manera eficaz sus epítopos correspondientes expuestos en la superficie en la cepa de S. pyogenes heteróloga (ATCC12384; serotipo M3) analizada. Se determinó que más del 90% de las 10.000 células de S. pyogenes analizadas se marcaron con los anticuerpos presentes en los antisueros específicos de BVH-P4. Parece que el polipéptido BVH-P4 es accesible en la superficie, en donde puede ser reconocido por los anticuerpos.

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Ejemplo 11

Este ejemplo ilustra la protección contra la infección fatal por S. pyogenes inducida mediante la inmunización pasiva de ratones con sueros hiper-inmunes de conejo.

Se inyectan de forma subcutánea a conejos New Zealand (Charles River Laboratories, St-Constant, Canadá) en múltiples sitios 50 \mug y 100 \mug de las diferentes proteínas recombinantes de S. pyogenes marcadas con His, que se produjeron y se purificaron como se describió en el Ejemplo 8 y se adsorbieron en adyuvante Alhydrogel (Superfos Biosector a/s). Los conejos se inmunizan tres veces a intervalos de tres semanas con las diferentes proteínas recombinantes de S. pyogenes marcadas con His. Se recogen muestras de sangre tres semanas después de la tercera inyección. Los anticuerpos presentes en el suero se purifican mediante precipitación con el uso de sulfato amónico saturado al 40%. Se inyectan de forma intravenosa a grupos de 10 ratones CD-1 hembra (Charles River) 500 \mul de suero purificado recogido de conejos inmunizados con las proteínas recombinantes de S. pyogenes marcadas con His, o de conejos inmunizados con una proteína recombinante de control no relacionada. Dieciocho horas más tarde los ratones se exponen a aproximadamente 2x10^{7} UFC del tipo 3 de la cepa de S. pyogenes ATCC12384. Las muestras del inóculo de exposición a S. pyogenes se colocan en placas de agar-sangre para determinar las UFC y para verificar la dosis de exposición. Las muertes se registran durante un periodo de 5 días.

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Ejemplo 12

Este ejemplo ilustra la protección de los ratones contra la infección fatal por S. pyogenes inducida mediante inmunización.

Se inmunizan de forma subcutánea grupos de 8 ratones CD-1 hembra (Charles River) tres veces a intervalos de tres semanas con 20 \mug de proteínas recombinantes de S. pyogenes marcadas con His purificadas mediante afinidad en presencia de 10 \mug de adyuvante QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) o, como control, adyuvante QuilA solo en PBS. Se recogen muestras de sangre del seno orbital en los días 1, 22 y 43 antes de cada inmunización y siete días (día 50) después de la tercera inyección. Dos semanas más tarde los ratones se exponen a aproximadamente 2x10^{7} UFC del tipo 3 de la cepa S. pyogenes ATCC12384. Las muestras del inóculo de exposición a S. pyogenes se colocan en placas de agar-sangre para determinar las UFC y para verificar la dosis de exposición. Las muertes se registran durante un periodo de 14 días.

Claims

1. Un polinucleótido aislado que comprende:

(a): un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia que comprende: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos;

(b): un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia que comprende: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos;

(c): un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia elegida de: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos;

(d): un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia que comprende: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos;

(e): un polinucleótido que codifica una porción que alberga epítopos de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos; o

(f): un polinucleótido que es complementario a un polinucleótido de (a), (b), (c), (d) o (e),

y en el que dicho polipéptido o su fragmento puede provocar una respuesta inmunitaria hacia Streptococcus pyogenes.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido es ADN.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido es ARN.

4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que hibrida en condiciones rigurosas con

(a): una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o

(b): el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;

en el que dicho polipéptido comprende la ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos.

5. El polinucleótido de la reivindicación 4, caracterizado porque dicho polipéptido comprende al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos.

6. Un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polinucleótido está unido de manera operable a una región de control de la expresión.

7. Una célula hospedadora transfectada con el vector de la reivindicación 6.

8. Un procedimiento para producir un polipéptido codificado por un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende cultivar una célula hospedadora según la reivindicación 7 en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido.

9. Un polipéptido aislado que comprende un polipéptido elegido de:

(a): un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos;

(b): un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad respecto de un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos;

(c): un polipéptido que comprende una secuencia elegida de: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos;

(d): un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de: ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos;

(e): una porción que alberga epítopos de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de ID SEC Nº 10 o sus fragmentos o análogos;

(f): el polipéptido de (a), (b), (c), (d) o (e) en el que está eliminado el residuo de Met N-terminal; y

(g): el polipéptido de (a), (b), (c), (d) o (e) en el que está eliminada la secuencia de aminoácidos secretora,

10. Un polipéptido según la reivindicación 9, que comprende además uno o más polipéptidos que tienen una secuencia elegida de: ID SEC Nºs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 o sus fragmentos o análogos; con tal de que los polipéptidos estén unidos para formar un polipéptido quimérico.

11. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según las reivindicaciones 9 ó 10 y un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

12. El uso de un polipéptido según la reivindicación 9 ó 10 para la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de faringitis, erisipelas, impétigo, escarlatina, enfermedades invasivas, tales como bacteriemia, fascitis necrosante y choque tóxico.

13. El uso de un polipéptido según la reivindicación 9 ó 10 para la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de la infección bacteriana por Streptococcus pyogenes.

14. Un método in vitro para el diagnóstico de la infección estreptocócica en un hospedador susceptible a la infección estreptocócica que comprende

(a): incubar un anticuerpo o su fragmento reactivo con un polipéptido estreptocócico de la reivindicación 9 ó 10 con una muestra biológica para formar una mezcla; y

(b): detectar el anticuerpo unido o el fragmento unido de forma específica en la mezcla, lo que indica la presencia del estreptococo.

15. Un método in vitro para el diagnóstico de la infección estreptocócica en un hospedador susceptible a la infección estreptocócica que comprende

(a): incubar uno o más polipéptidos estreptocócicos de la reivindicación 9 ó 10 o sus fragmentos con una muestra biológica para formar una mezcla; y

(b): detectar el anticuerpo unido o el fragmento unido de forma específica en la mezcla, lo que indica la presencia del anticuerpo específico hacia estreptococo.

16. Un equipo que comprende un polipéptido según la reivindicación 9 ó 10 para la detección o el diagnóstico de la infección estreptocócica.