ES2435923T3 - Antígenos de Haemophilus influenzae y los correspondientes fragmentos de ADN - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado seleccionado de: (a) un polipéptido que tiene más de un 99% de identidad con la secuencia aminoacídica expuesta en laSEQ ID NO: 10; (b) un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO: 10; (c) el polipéptido de (a) o (b), en el que se elimina el residuo Met N-terminal; y (d) el polipéptido de (a) o (b), en el que se elimina la secuencia aminoacídica secretora; en el que el polipéptido aislado puede desencadenar una respuesta inmunitaria ante Haemophilus influenzae.

Description

Antígenos de Haemophilus influenzae y los correspondientes fragmentos de ADN

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos de Haemophilus influenzae y a los correspondientes fragmentos de ADN, que pueden ser útiles para prevenir, diagnosticar y/o tratar infecciones por Haemophilus influenzae en individuos tales como seres humanos.

Antecedentes de la invención

Haemophilus influenzae es un bacilo gramnegativo que se encuentra en la naturaleza solo como patógeno humano. Los aislamientos de H. influenzae pueden subdividirse en formas encapsuladas y no encapsuladas. Las cepas encapsuladas expresan 1 de 6 polisacáridos capsulares estructural y antigénicamente distintos que se designan tipos “a” a “f”. Las cepas no encapsuladas se definen por su incapacidad de aglutinarse con antisueros contra polisacáridos capsulares reconocidos de H. influenzae y se hacen referencia como no tipables.

Las cepas de H. influenzae no tipables colonizan comúnmente el tracto respiratorio superior, incluyendo la nasofaringe y la orofaringe posterior. Una serie de exámenes de individuos sanos indican índices de colonización de entre 40 y 80% tanto entre niños como adultos (Spinola S.M., Peacock J., Denny F.W., Smith D.L. y Cannon J.G. (1986) “Epidemiology of colonisation by nontypeable Haemophilus influenzae in children : a longitudinal study”. J. Infect. Dis. 154: 100-109; Trottier S., Stenberg K. y Svanborg-Eden C. (1989) “Turn over of nontypeable Haemophilus influenzae in the nasopharynges of healthy children”. J. Clin. Microbiol. 27: 2175-2179). La colonización con una cepa particular puede persistir durante semanas o meses, permaneciendo asintomáticos la mayoría de individuos a lo largo de este periodo. La patogénesis de la enfermedad debida a H. influenzae no tipable implica la difusión contigua en el tracto respiratorio. La difusión a zonas adyacentes es habitualmente una consecuencia de anormalidades en las defensas del hospedador no específicas o específicas. Así, la H. influenzae no tipable causa una variedad de infecciones del tracto respiratorio en niños y adultos incluyendo otitis, sinusitis, bronquitis y neumonía. Estas infecciones pueden volverse crónicas o recurrentes en pacientes con bronquitis u otitis. De hecho, en lactantes y niños, la H. influenzae no tipable es una causa frecuente de otitis media aguda y está comúnmente implicada en otitis media recurrente (Harabuchi Y., Fadden H., Yamanaka N., Duffy L., Wolf J., Krystofik D. y Tonawanda/Williamsville Pediatrics. (1994) “Nasopharyngeal colonisation with nontypeable Haemophilus influenzae and recurrent otitis media”. J. Infect. Dis. 170: 862-866). En lactantes, la H. influenzae no tipable es responsable de entre un 27% y un 37% de los primeros episodios de otitis media a la edad de 1 año (Smith-Vaughan H.C., Sriprakash K.S., Mathews J.D. y Kemp D.J. (1997) “Nonencapsulated Haemophilus influenzae in aboriginal infants with otitis media: prolonged carriage of P2 porin variants and evidence for horizontal P2 gene transfer”. Infect. Immun. 65: 1468-1474; Teele D.W., Klein J.O., Rosner B. y Greater Boston Otitis Media study Group. (1989) “Epidemiology of otitis media during the first seven years of life in children in Greater Boston : a prospective, cohort study”. J. Infect. Dis. 160: 83-94). La meningitis está causada a veces por H. influenzae no tipable y da cuenta de 13% de todos los casos. Pero la H. influenzae no tipable es particularmente prevalente en hospedadores con una enfermedad subyacente que afecta al sistema inmunitario mucoso innato, tal como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y fibrosis quística (Murphy T.F. y Sethi S. (1992) “Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease”. Am. Rev. Respir. Dis. 146:1067-1083; St. Geme J.W. III. (1993) “Nontypeable Haemophilus influenzae disease: epidemiology, pathogenesis and prospects for prevention”. Inflect. Agents Dis. 2: 1-16). Las cepas de H. influenzae no tipables se encuentran predominantemente durante agravamientos cuando el esputo se vuelve mucopurulento. Los agravamientos infecciosos agudos de la bronquitis crónica desempeñan un papel importante en la morbilidad y mortalidad de pacientes con enfermedades pulmonares crónicas.

Las etiologías de la neumonía intrahospitalaria parecen haber cambiado en la última década. Aunque Streptococcus pneumoniae sigue siendo el patógeno predominante, ha aumentado la proporción de casos que implican otros organismos. H. influenzae se reseña ahora a menudo por ser la segunda causa más común de neumonía. Un 10% de los casos de neumonía por H. influenzae evolucionan a bacteremia. En los países desarrollados, la neumonía causada por H. influenzae no tipable es aparentemente una causa importante de morbilidad y mortalidad en niños.

El documento WO 96/33276 da a conocer el genoma completo de Haemophilus influenzae Rd y los posibles usos clínicos del mismo y de los polipéptidos codificados por el mismo.

Aunque se han desarrollado varias vacunas conjugadas polisacáridas de tipo H. influenzae, estas vacunas son ineficaces contra la enfermedad causada por otras cepas de H. influenzae (Scheifele D.W., Jadavji T.P., Law B.J., Gold R., Macdonald N.E., Lebel M.H., Mills E.L., Dery P., Halperin S.A., Morris R.F., Marchessault V. y Duclos P.J. (1996) “Recent trends in pediatric Haemophilus influenzae type b infections in Canada”. Can. Med. Assoc. J. 154: 1041-1047; Schulte E.E., Birkhead G.S., Kondracki S.F. y Morse D.L. (1994) “Patterns of Haemophilus influenzae type b invasive disease in New York State, 1987-1991 : the role of vaccination requirements for day-care attendance”. Pediatrics 94: 1014-1016). La identificación de los antígenos protectores cruzados conservados es crítica para el desarrollo de una vacuna universal contra la infección y enfermedad por H. influenzae. Se han identificado proteínas de la membrana externa tales como P1, P2, P4, P6, PCP, OMP26 y D-15 o se están explorando actualmente como antígenos de vacuna potenciales (Foxwell A.R., Kyd J.M. y Cripps A.W. (1998) “Nontypeable Haemophilus influenzae: Pathogenesis and Prevention”. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 294-308). La proteína D-15 es el único inmunógeno conservado que se ha descrito en la bibliografía científica por ser capaz de conferir protección contra múltiples serotipos y cepas no tipables.

Por lo tanto, continúa habiendo una necesidad insatisfecha de polipéptidos de H. influenzae que puedan ser útiles para prevenir, diagnosticar y/o tratar infecciones por Haemophilus influenzae en individuos tales como seres humanos.

Sumario de la invención

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia aminoacídica seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

En otros aspectos, se proporcionan polipéptidos codificados por polinucleótidos de la invención, composiciones farmacéuticas y vectores que comprenden polinucleótidos de la invención ligados operativamente con una región de control de la expresión, así como células hospedadoras transfectadas con dichos vectores y procesos de producción de polipéptidos que comprenden cultivar dichas células hospedadoras en condiciones adecuadas para la expresión.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI1 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 1.

La Figura 2 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI1 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 2.

La Figura 3 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI2 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 3.

La Figura 4 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI2 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 4.

La Figura 5 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI3 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 5.

La Figura 6 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI3 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 6.

La Figura 7 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI4 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 7.

La Figura 8 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI4 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 8.

La Figura 9 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI5 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 9.

La Figura 10 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI5 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 10.

La Figura 11 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI6 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 11.

La Figura 12 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI6 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 12.

La Figura 13 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI7 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 13.

La Figura 14 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI7 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 14.

La Figura 15 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI8 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 15.

La Figura 16 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI8 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 16.

La Figura 17 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI9 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 17.

La Figura 18 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI9 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 18.

La Figura 19 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI10 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 19.

La Figura 20 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI10 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 20.

La Figura 21 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI11 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 21.

La Figura 22 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI11 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 22.

La Figura 23 representa la secuencia de ADN del gen BVH-NTHI12 de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 23.

La Figura 24 representa la secuencia aminoacídica deducida de BVH-NTHI12 completo de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable; SEQ ID NO: 24.

La Figura 25 reproduce la comparación de las secuencias aminoacídicas predichas de marcos de lectura abiertos de BVH-NTHI1 de 12085, 10095, A18 y A108 de H. influenzae usando el programa Clustal W del software de análisis de secuencia MacVector (versión 6.5). Bajo el alineamiento, hay una línea de consenso en que los caracteres (*) representan residuos aminoacídicos idénticos y (.) representan residuos aminoacídicos conservados.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona polinucleótidos purificados y aislados que codifican polipéptidos de H. influenzae que pueden usarse para prevenir, tratar y/o diagnosticar infección por H. influenzae. La presente invención proporciona 12 polinucleótidos preferidos separados, definido cada uno individual y separadamente por una de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23. Se proporcionan adicionalmente en la presente invención 12 polipéptidos separados, definido cada uno individual y separadamente por una de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24. Los especialistas en la materia apreciarán que la invención incluye polinucleótidos que codifican análogos tales como mutantes, variantes, homólogos y derivados de dichos polipéptidos, como se describe en la presente memoria en la presente solicitud de patente. La invención incluye también moléculas de ARN correspondientes a las moléculas de ADN de la invención. Además de moléculas de ADN y ARN, la invención incluye los correspondientes polipéptidos y anticuerpos monoespecíficos que se unen específicamente a dichos polipéptidos.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 85% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 90% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos del mismo.

Según un aspecto, la presente se refiere a polinucleótidos que codifican un epítopo portador de una porción de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según un aspecto, la presente se refiere a polinucleótidos que codifican un epítopo portador de una porción de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24

Según un aspecto, la presente invención se refiere a porciones portadoras de epítopo de un polipéptido que tienen una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de las mismas.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a porciones portadoras de epítopo de un polipéptido que tienen una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 85% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 90% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto, la presente se refiere a polinucleótidos que codifican una porción portadora de epítopo de un polipéptido que tiene una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polinucleótidos que codifican un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polinucleótidos que codifican un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

El porcentaje de homología se define como la suma del porcentaje de identidad más el porcentaje de similitud o conservación del tipo de aminoácido.

Puede usarse un programa tal como el programa CLUSTAL para comparar secuencias aminoacídicas. Este programa compara secuencias aminoacídicas y encuentra el alineamiento óptimo insertando espacios en cualquier secuencia como sea apropiado. Es posible calcular la identidad o similitud aminoacídica (identidad más conservación del tipo de aminoácido) para un alineamiento óptimo. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. Es por tanto posible obtener una comparación en que se encuentran varias regiones de similitud, teniendo cada una una puntuación diferente. Ambos tipos de análisis de identidad están contemplados en la presente invención.

En una realización adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención son antigénicos.

En una realización adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención son inmunogénicos.

En una realización adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden desencadenar una respuesta inmunitaria en un individuo.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polipéptidos que son capaces de crear anticuerpos que tienen especificidad de unión por polipéptidos de la presente invención como se definen anteriormente.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polipéptidos capaces de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polipéptidos capaces de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que tiene una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Un anticuerpo que “tiene especificidad de unión” es un anticuerpo que reconoce y se une al polipéptido seleccionado, pero que no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas de la muestra, por ejemplo, una muestra biológica. La unión específica puede medirse usando un ensayo ELISA en que el polipéptido seleccionado se usa como antígeno.

De acuerdo con la presente invención, “protección” en los estudios biológicos se define como un aumento significativo de la curva, índice o periodo de supervivencia. El análisis estadístico que usa la prueba de rangos logarítmicos para comparar curvas de supervivencia y la prueba exacta de Fisher para comparar índices de supervivencia y números de días hasta la muerte, respectivamente, podría ser útil para calcular los valores de P y determinar si la diferencia entre los dos grupos es estadísticamente significativa. Los valores de P de 0,05 se consideran no significativos.

En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan fragmentos antigénicos/inmunogénicos de los polipéptidos de la invención, o de análogos de los mismos.

Los fragmentos de la presente invención deberían incluir una o más de dichas regiones epitópicas o ser suficientemente similares a dichas regiones para retener sus propiedades antigénicas/inmunogénicas. Por tanto, para los fragmentos según la presente invención, el grado de identidad es quizás irrelevante, puesto que pueden ser 100% idénticos a una parte particular de un polipéptido o análogo del mismo como se describe en la presente memoria. La presente invención proporciona adicionalmente fragmentos que tienen al menos 10 residuos aminoacídicos contiguos de las secuencias polipeptídicas de la presente invención. En una realización, al menos 15 residuos aminoacídicos contiguos. En una realización, al menos 20 residuos aminoacídicos contiguos.

La cuestión clave, de nuevo, es que el fragmento retenga las propiedades antigénicas/inmunogénicas.

El especialista en la materia apreciará que los fragmentos, análogos o derivados de los polipéptidos de la invención encontrarán también uso en el contexto de la presente invención, concretamente como material antigénico/inmunogénico. Por tanto, por ejemplo, los polipéptidos que incluyen una o más adiciones, deleciones, sustituciones o similares están englobados por la presente invención.

Como se usa en la presente memoria, los “fragmentos”, “análogos” o “derivados” de los polipéptidos de la invención incluyen aquellos polipéptidos en que uno o más de los residuos aminoacídicos están sustituidos con un residuo aminoácido conservado (preferiblemente conservado) y que pueden ser naturales o no naturales. En una realización, los derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán aproximadamente un 70% de identidad con aquellas secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de los mismos. Ese decir, un 70% de los residuos son iguales. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 80% de identidad. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 90% de identidad. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 95% de identidad. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 99% de identidad. En una realización adicional, los análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos aminoacídicos y más preferiblemente menos de 10.

En una realización, los derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán aproximadamente un 70% de homología con aquellas secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de los mismos. En una realización adicional, los derivados y análogos de polipéptidos tendrán más de un 80% de homología. En una realización adicional, los derivados y análogos de polipéptidos tendrán más de un 90% de homología. En una realización adicional, los derivados y análogos de polipéptidos tendrán más de un 95% de homología. En una realización adicional, los derivados y análogos de polipéptidos tendrán más de un 99% de homología. En una realización adicional, los derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos aminoacídicos y más preferiblemente menos de 10.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos un 70% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos un 80% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos un 85% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos un 90% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos caracterizados por una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos un 70% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos un 80% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos un 85% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos un 90% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que tienen al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptidos caracterizados por una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.

Estas sustituciones son aquellas que tienen una influencia mínima sobre la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Las sustituciones preferidas son aquellas conocidas en la materia como conservadas, concretamente, los residuos sustituidos comparten propiedades físicas o químicas tales como hidrofobicidad, tamaño, carga o grupos funcionales. Estos incluyen sustituciones tales como aquellas descritas por Dayhoff, M. en “Atlas of Protein Sequence and Structure” 5, 1978 y por Argos, P. en EMBO J. 8, 779-785, 1989. Por ejemplo, los aminoácidos, tanto naturales como no naturales, pertenecientes a uno de los siguientes grupos representan cambios conservativos:

ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr, val;

cys, ser, tyr, thr;

val, ile, leu, met, ala, phe;

lys, arg, orn, his;

y phe, tyr, trp, his.

Las sustituciones preferidas incluyen también sustituciones de enantiómeros D por los correspondientes Laminoácidos.

Preferiblemente un fragmento, análogo o derivado de un polipéptido de la invención comprenderá al menos una región antigénica, concretamente al menos un epítopo.

En un enfoque alternativo, los análogos podrían ser polipéptidos de fusión que incorporen restos que facilitan la purificación, por ejemplo, marcando eficazmente el polipéptido deseado. Puede ser necesario retirar el “marcaje” o puede ser el caso de que el polipéptido de fusión mismo retenga suficiente antigenicidad para ser útil.

Por tanto, lo importante para análogos, derivados y fragmentos es que posean al menos un grado de antigenicidad/inmunogenicidad de la proteína o péptido del que derivan.

Se incluyen también polipéptidos que tienen fusionados con los mismos otros compuestos que alteran las propiedades biológicas o farmacológicas del polipéptido, concretamente, polietilenglicol (PEG) para aumentar la semivida, secuencias aminoacídicas líder o secretoras para facilitar la purificación, preprosecuencias y prosecuencias y (poli)sacáridos.

Además, en aquellas situaciones en que las regiones aminoacídicas se encuentra que son polimórficas, puede ser deseable variar uno o más aminoácidos particulares para imitar más eficazmente los diferentes epítopos de las diferentes cepas de H. influenzae.

Además, los polipéptidos de la presente invención pueden modificarse mediante acilación del NH2 terminal (por ejemplo, mediante acetilación o amidación de ácido tioglicólico, amidación del carboxilo terminal, por ejemplo con amoniaco o metilamina), proporcionando estabilidad, hidrofobicidad aumentada para ligamiento o unión con un soporte u otra molécula.

Se contemplan también multímeros heteropeptídicos y homopolipeptídicos de los fragmentos y análogos polipeptídicos. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más polipéptidos que se han reticulado con reticulantes tales como avidina/biotina, glutaraldehído o dimetilsuperimidato. Dichas formas poliméricas incluyen también polipéptidos que contienen dos o más secuencias contiguas en serie o invertidas, producidas a partir de ARNm multicistrónico generado por tecnología de ADN recombinante.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polipéptidos quiméricos que comprenden uno o más polipéptidos o fragmentos o análogos o derivados de los mismos como se definen en las figuras de la presente solicitud.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que tienen una secuencia elegida de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 o fragmentos o análogos de los mismos; a condición de que los polipéptidos estén ligados formando un polipéptido quimérico.

En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que tienen una secuencia elegida de las SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24; a condición de que los polipéptidos estén ligados formando un polipéptido quimérico.

Para conseguir la formación de polímeros antigénicos (concretamente, multímeros sintéticos), pueden utilizarse polipéptidos que tienen grupos bishalogenoacetilo, haluros de nitroarilo o similares, en que los reactivos son específicos de grupos tio. Por lo tanto, la conexión entre dos grupos mercapto de los diferentes péptidos puede ser un enlace sencillo o un puede estar compuesta por un grupo ligante de al menos 2, típicamente al menos 4 y no más de 16, pero habitualmente no más de aproximadamente 14 átomos de carbono.

En una realización particular, los fragmentos o análogos polipeptídicos de la invención no contienen un residuo de inicio de metionina (Met). Preferiblemente, los polipéptidos no incorporarán una secuencia líder ni secretora (secuencia señal). La porción de señal de un polipéptido de la invención puede determinarse según técnicas de biología molecular establecidas. En general, el polipéptido de interés puede aislarse de cultivo de Haemophilus y secuenciarse posteriormente para determinar el residuo inicial de la proteína madura y por lo tanto la secuencia del polipéptido maduro.

La siguiente tabla A describe las secuencias señal de los polipéptidos de la invención como se describen en las figuras.

Polipéptido

SEQ ID NO Señal de secreción

BVH-NTHI1

2 MPVIRQVVFYDSLTGEQTKMKKFAGLITASFVA

BVH-NTHI2

4 MKKLLKISAVSAALLSAPMMA

BVH-NTHI3

6 MLMKLKATLTLAAATLVLAA

BVH-NTHI4

8 MMNRRHFIQIGATSILALSANRFAMA

BVH-NTHI5

10 MKKIILTLSLGLLTAWSAQI

BVH-NTHI6

12 Sin señal de secreción

BVH-NTHI7

14 MKKFLIAILLLILILAGAA

BVH-NTHI8

16 MKMKKFILKSFLLATLGCVAFASMAQA

BVH-NTHI9

18 MTMFKKISVLFFTLILAGCSSWS

BVH-NTHI10

20 MSILLQGERFKKRLMPILLSMALAGCSNLLG

BVH-NTHI11

22 MIRKLMKTPPFFTALFASAIFTLSVSQGVLG

BVH-NTHI12

24 MKLKQLFAITAIA

Según otro aspecto de la invención, se proporciona también (i) una composición de material que contiene un polipéptido de la invención, junto con un portador, diluyente o coadyuvante; (ii) una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la invención y un portador, diluyente o coadyuvante; (iii) una vacuna que comprende un polipéptido de la invención y un portador, diluyente o coadyuvante; (iv) un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra Haemophilus, en un individuo, mediante la administración al individuo de una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido de la invención para desencadenar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora contra Haemophilus; y particularmente (v) un procedimiento para prevenir y/o tratar una infección por Haemophilus mediante la administración de una cantidad profiláctica o terapéutica de un polipéptido de la invención a un individuo necesitado.

Antes de la inmunización, los polipéptidos de la invención pueden acoplarse o conjugarse también con proteínas portadoras tales como toxina del tétanos, toxina de la difteria, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, antígeno VP1 del virus de poliomielitis o cualquier otra toxina o antígeno vírico o bacteriano o cualquier proteína adecuada para estimular el desarrollo de una respuesta inmunitaria más fuerte. Este acoplamiento o conjugación puede realizarse química o genéticamente. Está disponible una descripción más detallada de la conjugación de péptido-portador en Van Regenmortel, M.H.V., Briand J.P., Muller S., Plaué S., “Synthetic Polypeptides as antigens” en “Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, vol. 19 (ed.) Burdou, R.H. & Van Knippenberg

P.H. (1988), Elsevier Nueva York.

Según otro aspecto, se proporcionan también composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más polipéptidos de Haemophilus de la invención en una mezcla con un portador, diluyente o coadyuvante farmacéuticamente aceptable. Los coadyuvantes adecuados incluyen (1) formulaciones de aceite en agua tales como MF59™, SAF™, Ribi™ ; (2) coadyuvante de Freund completo o incompleto; (3) sales, concretamente, AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)2, Al(OH)3, AlPO4, sílice, caolín; (4) derivados de saponina tales como Stimulon™

o partículas generadas a partir de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (5) citocinas tales como interleucinas, interferones, factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF); (6) otras sustancias tales como polinucleótidos carbonados, concretamente, poli IC y poli AU, toxina del cólera destoxificada (CTB) y toxina termolábil de E.coli para inducción de inmunidad mucosa. Está disponible una descripción más detallada de los coadyuvantes en una revisión de M.Z.I Khan et al. en “Pharmaceutical Research”, vol. 11, nº 1 (1994) pág. 2-11, y también en otra revisión de Gupta et al., en “Vaccine”, vol. 13, nº 14, pág. 1263-1276 (1995) y en el documento WO 99/24578. Los coadyuvantes preferidos incluyen QuilA™, QS21™, Alhydrogel™ y Adjuphos™.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por vía parenteral mediante inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción o por vía bucal u oral.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento o la profilaxis de infección y/o enfermedades por Haemophilus y síntomas mediados por infección por Haemophilus como se describen en P.R. Murray (redactor jefe), E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover y R.H. Yolken. “Manual of Clinical Microbiology”, ASM Press, Washington, D.C. 7ª edición, 1999, pág. 1481-1482, que se incorpora a la presente memoria como referencia. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se usan para el tratamiento o la profilaxis de otitis media (aguda o recurrente), sinusitis, bronquitis, neumonía, meningitis y bacteremia. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento o la profilaxis de infección y/o enfermedades por Haemophilus y síntomas mediados por infección por Haemophilus. En una realización adicional, la infección por Haemophilus es por Haemophilus influenzae. En una realización adicional, la infección por Haemophilus es por Haemophilus influenzae no tipable. En una realización adicional, la infección por Haemophilus es por Haemophilus influenzae tipable.

Como se usa en la presente solicitud, el término “individuo” incluye mamíferos. En una realización adicional, el mamífero es humano.

En una realización particular, las composiciones farmacéuticas se administran a aquellos individuos con riesgo de infección por H. influenzae tales como lactantes, ancianos e individuos inmunodeficientes.

Las composiciones farmacéuticas están preferiblemente en forma de dosificación unitaria de aproximadamente 0,001 a 100 μg/kg (antígeno/peso corporal) y más preferiblemente de 0,01 a 10 μg/kg y lo más preferiblemente de 0,1 a 1 μg/kg de 1 a 3 veces, con un intervalo de aproximadamente 1 a 6 semanas entre inmunizaciones.

Las composiciones farmacéuticas están preferiblemente en forma de dosificación unitaria de aproximadamente 0,1 μg a 10 mg, y más preferiblemente de 1 μg a 1 mg y lo más preferiblemente de 10 a 100 μg de 1 a 3 veces con un intervalo de aproximadamente 1 a 6 semanas entre inmunizaciones.

En una realización, los polinucleótidos son aquellos ilustrados en las SEQ ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23, que pueden incluir los marcos abiertos de lectura (ORF) que codifican los polipéptidos de la invención.

En una realización adicional, los polinucleótidos son aquellos ilustrados en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 que codifican polipéptidos de la invención.

Se apreciará que las secuencias polinucleotídicas ilustradas en las figuras pueden alterarse con codones degenerados pero seguir codificando el polipéptido de la invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona adicionalmente polinucleótidos descritos anteriormente en la presente memoria (o la secuencia complementaria de los mismos) que tienen un 50% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos un 70% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos un 75% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos un 80% de identidad entre secuencias. En un realización, al menos un 85% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos un 90% de identidad entre secuencias. En una realización adicional, los polinucleótidos son hibridables en condiciones rigurosas, concretamente que tienen al menos un 95% de identidad. En una realización adicional, más de un 97% de identidad.

Las condiciones rigurosas adecuadas para hibridación pueden determinarse fácilmente por un especialista en la materia (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) “Molecular cloning : A Laboratory Manual”, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; “Current Protocols in Molecular Biology”, (1999) editado por Ausubel F.M. et al., John Wiley & Sons, Inc., N.Y.).

En una realización adicional, la presente invención proporciona polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con

(a)

una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o

(b)

el complemento de la secuencia de ADN que codifica un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o fragmentos o análogos del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con

(a)

una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o

(b)

el complemento de la secuencia de ADN que codifica un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende al menos 10 residuos aminoacídicos contiguos de un polipéptido que comprende las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o fragmentos o análogos de los mismos.

En una realización adicional, la presente invención proporciona polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con

(a)

una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o

(b)

el complemento de la secuencia de ADN que codifica un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24.

En una realización adicional, la presente invención proporciona polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con

(a)

una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o

(b)

el complemento de la secuencia de ADN que codifica un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende al menos 10 residuos aminoacídicos contiguos de un polipéptido que comprende las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24.

Como se apreciará fácilmente por el especialista en la materia, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.

La presente invención incluye también polinucleótidos complementarios del polinucleótido descrito en la presente solicitud.

En un aspecto adicional, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de la invención, o fragmentos o análogos de los mismos, pueden usarse en un procedimiento de inmunización de ADN. Es decir, pueden incorporarse a un vector que es replicable y expresable tras inyección, produciendo así el polipéptido antigénico in vivo. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden incorporarse a un vector de plásmido bajo el control del promotor de CMV, que es funcional en células eucarióticas. Preferiblemente, el vector se inyecta por vía intramuscular.

Según otro aspecto, se proporciona un proceso o procedimiento de fabricación para la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes expresando un polinucleótido que codifica dicho polipéptido en una célula hospedadora y recuperando el producto polipeptídico expresado. Como alternativa, los polipéptidos pueden producirse según técnicas químicas sintéticas establecidas, concretamente, síntesis en fase de solución o fase sólida de oligopéptidos, que se ligan produciendo el polipéptido completo (ligamiento de bloques).

Se describen procedimientos generales para la obtención y evaluación de polinucleótidos y polipéptidos en las siguientes referencias: Sambrook et al., (1989) “Molecular cloning : A Laboratory Manual”, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) editado por Ausubel F.M. et al., John Wiley & Sons, Inc., N.Y.; “PCR Cloning Protocols, from Molecular Cloning to Genetic Engineering”, (1997) editado por White B.A., Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 490 páginas; “Protein Purification, Principles and Practices”, (1993) Scopes R.K., Springer-Verlag, N.Y., 3ª edición, 380 páginas; “Current Protocols in Immunology”, (1999) editado por Coligan J.E. et al., John Wiley & Sons Inc., N.Y., que se incorporan a la presente memoria como referencia.

Para producción recombinante, se transfectan células hospedadoras con vectores que codifican los polipéptidos de la invención, y se cultivan entonces en medios nutrientes modificados como sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Los vectores adecuados son aquellos que son viables y replicables en el hospedador elegido, e incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago. La secuencia polipeptídica puede incorporarse al vector en el sitio apropiado usando enzimas de restricción de tal modo que se ligue operativamente con una región de control de la expresión que comprenda un promotor, un sitio de unión a ribosoma (región de consenso o secuencia de Shine-Dalgarno) y, opcionalmente, un operador (elemento de control). Pueden seleccionarse componentes individuales de la región de control de la expresión que sean apropiados para un hospedador y vector dados según los principios de biología molecular establecidos (Sambrook et al., (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory manual”, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; “Current Protocols in Molecular Biology”, (1999) editado por Ausubel F.M. et al., John Wikey & Sons, Inc., N.Y., incorporados a la presente memoria como referencia). Los promotores adecuados incluyen, pero sin limitación, el promotor LTR o SV40, los promotores, lac, tac o trp de E. coli y el promotor PL del fago lambda. Los vectores incorporarán preferiblemente un origen de replicación así como marcadores de selección, concretamente gen de resistencia a ampicilina. Los vectores bacterianos adecuados incluyen pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pD10 phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 y los vectores eucarióticos pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células hospedadoras pueden ser bacterianas, concretamente, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; fúngicas, concretamente Aspergillus niger, Aspergillus nidulins; de levadura, concretamente Saccharomyces o eucarióticas, concretamente CHO, COS.

Tras la expresión del polipéptido en cultivo, se recogen típicamente las células por centrifugación y después se desestabilizan por medios físicos o químicos (si el polipéptido expresado no se secreta a los medios) y se retiene el extracto bruto resultante para aislar el polipéptido de interés. La purificación del polipéptido de los medios de cultivo

o lisado puede conseguirse mediante técnicas establecidas dependiendo de las propiedades de los polipéptidos, concretamente usando precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrófoba, cromatografía con hidroxiapatito y cromatografía con lectina. La purificación final puede conseguirse usando HPLC.

El polipéptido puede expresarse con o sin una secuencia líder o de secreción. En el primer caso, la líder puede retirarse usando procesamiento postraduccional (véanse los documentos US. 4.431.739, US 4.425.437 y US

4.338.397 incorporados a la presente como referencia) o retirarse químicamente después de purificar el polipéptido expresado.

Según un aspecto adicional, los polipéptidos de Haemophilus de la invención pueden usarse en un ensayo de diagnóstico para infección por H. influenzae, en particular para infección por H. influenzae. Son posibles varios procedimientos de diagnóstico, por ejemplo, para detectar el organismo Haemophilus en una muestra biológica, puede seguirse el siguiente procedimiento:

a.

obtener una muestra biológica de un individuo;

b.

incubar un anticuerpo o fragmento del mismo reactivo con un polipéptido de Haemophilus de la invención con la muestra biológica, formando una mezcla, y

c.

detectar el anticuerpo o fragmento unido específicamente en la mezcla, que indica la presencia de Haemophilus.

Como alternativa, puede efectuarse un procedimiento para la detección de un anticuerpo específico de un antígeno de H. influenzae en una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene dicho anticuerpo, como sigue:

a.

obteniendo una muestra biológica de un individuo;

b.

incubando uno o más polipéptidos de H. influenzae de la invención o fragmentos de los mismos con la muestra biológica, formando una mezcla y

c.

detectando el antígeno o fragmento unidos específicamente en la mezcla, que indica la presencia de anticuerpo específico de H. influenzae.

Un especialista en la materia reconocerá que este ensayo de diagnóstico puede tomar varias formas, incluyendo un ensayo inmunológico tal como un ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo o un ensayo de aglutinación con látex, esencialmente para determinar si están presentes en un organismo anticuerpos específicos de los polipéptidos.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de otitis media, sinusitis, bronquitis, neumonía y meningitis y bacteremia, que comprende administrar a un individuo una cantidad terapéutica o profiláctica de una composición de la invención.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección bacteriana por Haemophilus influenzae en un individuo susceptible de infección por Haemophilus influenzae, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéutica o profiláctica de una composición de la invención. En una realización adicional, Haemophilus influenzae es Haemophilus influenzae no tipable. En una realización adicional, Haemophilus influenzae es Haemophilus influenzae tipable.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de otitis media, sinusitis, bronquitis, neumonía y meningitis y bacteremia, que comprende administrar a un individuo una cantidad terapéutica

o profiláctica de una composición de la invención.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de una infección bacteriana por Haemophilus influenzae en un individuo susceptible de infección por Haemophilus influenzae, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéutica o profiláctica de una composición de la invención. En una realización adicional, Haemophilus influenzae es Haemophilus influenzae no tipable. En una realización adicional, Haemophilus influenzae es Haemophilus influenzae tipable.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica de la invención para el tratamiento profiláctico o terapéutico de infección por Haemophilus, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad profiláctica o terapéutica de la composición.

Según un aspecto adicional, los polipéptidos de Haemophilus de la invención pueden usarse en un kit que comprende los polipéptidos de la invención para la detección del diagnóstico de infección por Hameophilus.

Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos de la invención pueden usarse también para diseñar sondas de ADN para uso en la detección de la presencia de H. influenzae en una muestra biológica sospechosa de contener dichas bacterias. El procedimiento de detección de esta invención comprende:

a.

obtener la muestra biológica de un individuo;

b.

incubar una o más sondas de ADN que tienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o fragmentos de los mismos con la muestra biológica, formando una mezcla; y

c.

detectar una sonda de ADN unida específicamente en la mezcla, que indica la presencia de bacterias H. influenzae.

Las sondas de ADN de esta invención pueden usarse también para detectar la H. influenzae en circulación (concretamente, ácidos nucleicos de H. influenzae) en una muestra, por ejemplo usando una reacción en cadena de la polimerasa, como procedimiento de diagnóstico de infecciones por H. influenzae. La sonda puede sintetizarse usando técnicas convencionales y puede inmovilizarse sobre una fase sólida o puede marcarse con un marcaje detectable. Es una sonda de ADN preferida para esta aplicación un oligómero que tenga una secuencia complementaria de al menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de H. influenzae de la invención.

Otro procedimiento de diagnóstico para la detección de H. influenzae en un individuo comprende:

a.

marcar un anticuerpo reactivo con un polipéptido de la invención o fragmento del mismo con un marcaje detectable;

b.

administrar el anticuerpo marcado o fragmento marcado al individuo; y

c.

detectar el anticuerpo marcado unido específicamente o fragmento marcado en el individuo, que indica la presencia de H. influenzae.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de polipéptidos de Haemophilus de la invención como inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para el diagnóstico, y en particular, el tratamiento de infección por H. influenzae. Los anticuerpos adecuados pueden determinarse usando procedimientos de cribado apropiados, por ejemplo midiendo la capacidad de un anticuerpo particular de proteger pasivamente frente a infección por H. influenzae en un modelo de ensayo. Es un ejemplo de modelo animal el modelo de ratón descrito en el ejemplo de la presente memoria. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen mamífero, y más específicamente de origen de murina, rata o humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento del mismo, o si se desea, un anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo. El término anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante significa anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha producido usando técnicas de biología molecular. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser policlonal o preferiblemente monoclonal. Puede ser específico de una serie de epítopos asociados a polipéptidos de H. influenzae, pero es preferiblemente específico de uno.

Es un aspecto adicional de la invención el uso de una composición farmacéutica de la invención para el tratamiento profiláctico o terapéutico de infección por Haemophilus, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad profiláctica o terapéutica de la composición.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista en la materia a la que pertenece esta invención.

AISLAMIENTO DE POLIPÉPTIDOS DE H. INFLUENZAE NO TIPABLE (NTHI) E IDENTIFICACIÓN DE GENES QUE CODIFICAN ESTOS POLIPÉPTIDOS

AISLAMIENTO DE POLIPÉPTIDOS DE NTHI EXPUESTOS EN SUPERFICIE

Cepas bacterianas

Se proporcionaron los aislamientos clínicos de H. influenzae no tipable 12085 y 10095 por D.M. Granoff (St-Louis, Missouri) y B-20, A18, A108, C-98, C-26 y B-31 por el Centre de Recherche en Infectiologie du Centre Hospitalier de l’Université Laval. Se aisló H. influenzae no tipable 12085 de la sangre de un niño con infección del tracto respiratorio inferior en Pakistán.

Se usó DH5a de Escherichia coli (GIBCO BRL, Burlington, Ontario) como cepa hospedadora para el ADN recombinante. Se usó XL1-Blue MRF’ de E. coli (Stratagene, LaJolla, California) como cepa hospedadora para infección con el vector de fago lambda ZAP Express. Se usó XLOLR de E. coli (Stratagene) como cepa hospedadora para infección con fago lambda filamentoso Zap Express escindido in vivo.

Antisueros

Se produjeron antisueros de ratón después de periodos de tres semanas de inmunización subcutánea con proteínas de membrana externa en presencia de coadyuvante de Freund completo o incompleto (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá). Se recogieron los sueros 21 días después de la inmunización terciaria.

Se seleccionaron 4 antisueros humanos basándose en su reactividad por ELISA y transferencia Western sobre 12085 de H. influenzae no tipable termoinactivada.

Construcción y cribado de una colección de H. influenzae

Se extrajo ADN de 12085 de H. influenzae no tipable usando un kit de extracción genómica (QIAgen). Se digirió parcialmente el ADN con Tsp509I y se ligó con brazos del fago lambda ZAP-Express digeridos con EcoRI (Stratagene). Se empaquetó el ligamiento in vitro con extractos Gigapack según las recomendaciones del fabricante (Stratagene). Se sembró el fago recombinante en XL1-Blue MRF’ de E. coli a una densidad de 2,5 x 104 UFP/placa de 150 mm (de diámetro). Después de 8 horas de incubación, se recubrieron las placas con discos de nitrocelulosa y se procesaron las transferencias resultantes para inmunotransferencia con sueros humano y de ratón. Se escogieron los clones positivos y se purificaron en placa. Se recuperaron plásmidos pBK-CMV recombinantes que codifican genes de interés de Haemophilus del bacteriófago purificado usando el facto filamentoso auxiliar ExAssist y la cepa de E. coli resistente a lambda XLOLR mediante escisión in vivo.

Identificación de antígenos

La PAGE-SDS y el análisis de inmunotransferencia de lisados de estas E. coli recombinantes mostraron que cada clon expresaba uno o más polipéptidos que reaccionaban con antisueros humanos o de ratón.

Secuenciación de ADN y análisis de secuencia

Se secuenciaron los clones genómicos con el kit Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystem, Foster City, California). Se diseñaron varios cebadores internos para secuenciar adicionalmente en los insertos clonados. Se efectuó el ensamblado de secuencia usando software Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann

5 Arbor, Michigan) y se efectuó el análisis de secuencia con software McVector (Oxford Molecular Ltd., Campbell, California).

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la clonación de genes de H. influenzae no tipables en un vector de expresión.

Se amplificaron las regiones de codificación de los genes de H. influenzae no tipable BVH-NTHI1 a BVH- NTHI12

10 (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23) mediante PCR (sistema de PCR DNA Thermal Cycler GeneAmp 2400, Perkin Elmer, San José, CA) a partir de ADN genómico de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable usando los siguientes cebadores oligonucleotídicos que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción NcoI (CCATGG), NdeI (CATATG), SalI (GTCGAC) o XhoI (CTCGAG) (Tabla 1). Se purificaron los productos de PCR con geles de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen

15 siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA), y se digirieron con endonucleasas de restricción apropiadas (Pharmacia Canada Inc, Baie d’Urfé, Canadá). Se digirieron igualmente los vectores pET (Novagen, Madison, Wisconsin) y se purificaron con geles de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, California). Se ligaron los productos de PCR digeridos con el vector de expresión pET restringido con enzimas. Se transformaron los productos ligados en la cepa DH5a de E. colii [<80dlacZLM15 L (lacZYA-argF) U169

20 endA1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) deoR thi- 1 supE44 A-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) según el procedimiento de Simanis (Hanahan D. (1985) en: “DNA Cloning”. D.M. Glover, ed., IRL Press, Washington D.C. vol. 1, pág. 109-135). Se purificaron los plásmidos que contenían genes recombinantes (rpET) usando un kit QIAgen (Chatsworth, California) y se secuenciaron los insertos de ADN (kit Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, California).

25 Tabla 1. Lista de cebadores oligonucleotídicos para la clonación de ADN

Conjunto de cebadores de PCR

SEQ. ID Secuencia 5’-3’ Posición nucleotídica* Sitios de restricción Cepa del vector de clonación

HAMJ342-HAMJ343

25 26 CAAGGCGTTTTCATATG CCTGTCATTCGGCAGG CTAATTGACCTCGAGTT TTGCTGCTTTTAATTCT TGATAATATTG 1-1137 NdeIXhoI pET21-b+ Tuner (DE3)

HAMJ345-HAMJ344

27 28 GTAAGGAAACATACATA TGAAAAAACTTTTAAAA ATTAGTG TTAGAGACTCGAGTTTA GCTAAACATTCTATGTA GCTATC 1-1005 NdeI XhoI pET21-b+ BL21 (DE3)

HAMJ348-HAMJ349

29 30 CCTAACATTGACATATG CTTATGAAACTAAAAGC AACA TCAATATCTCGAGTTTA CCATCAACACTCACACC 1-1647 NdeI XhoI pET21-b+ AD494 (DE3)

HAMJ346

31 CTAATAAGGAAAACCAT ATGATGAACAGACGTCA TTTTATTC 1-1971 NdeI pET21-b+

HAMJ399

32 GACCTAGCTCGAGTTTA GATAAATCAATTTGATA CACTG XhoI Tuner(DE3)

HAMJ376-HAMJ377

33 34 CATAAGGAGTAACATAT GAAAAAAATTATTTTAA CATTATC GTGCAGATTCTCGAGTT TTTTATCAACTGAA 1-480 NdeI XhoI pET21-b+ Tuner (DE3)

HAMJ460-HAMJ461

35 36 CTGGACAGACCATATGC CTTCTGATTTAGTCGC CTAAATTGAGCTCGAGA TTAGTTTTTAATTTACT CC 2-936 NdeI XhoI pET21-b+ Tuner (DE3)

HAMJ458

37 CTTTCTTATAGCATATG AAGAAATTTTTAATTGC 1-1041 NdeI pET21-b+

GATT

HAMJ459

38 CTTCCGCACTCGAGTTT GGCATTTTTC XhoI Tuner (DE3) pLysS

HAMJ477-

39 GGAAGGAGCTAGCATGA 1-939 NheI pET21-b+

AAATGAAAAAATTTATT C

HAMJ478

40 TTGATACTCTCGAGTTT XhoI Tuner (DE3)

ATTAAAATACTG

HAMJ481

41 CTTTAATCACATATGAC TATGTTTAAAAAAATCT 1-534 NdeI pET21-b+

CTG

HAMJ482

42 CACCAATCTCGAGTTTA XhoI

GATGTACAGGCTT

HAMJ78

43 ACCCGCATGGCTGTTCA 75-1728 NcoI pET32-c+

AATCTACTTGGTAG

HAMJ79

44 ACTCGTCGACTTAGTTT SalI AD494 (DE3)

GCAACTGGTACAAT

HAMJ414

45 GATTAGGGAAAACATAT 1-3336 NdeI pET21-b+

GATTAGGAAACTTATGA

A

HAMJ415

46 CCATAATTTGCTCGAGT TTTTTTACATCAAC XhoI

HAMJ450-HAMJ411

47 48 GGAAGGAGCTAGCATGA AATTAAAACAACTTTTT G GTGCGGTAGCTCGAGCC AACCTTTTAC 1-816 NheI XhoI pET21-b+ Tuner (DE3)

* Posición nucleotídica indica el resultado de la clonación, concretamente la longitud y posición en la Figura 1 de los productos de PCR.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la amplificación y secuenciación por PCR del gen BVH-NTHI1 a partir de otras cepas de H. influenzae no tipables y la evaluación del nivel de conservación molecular de este gen.

Se amplificaron las regiones de codificación respectivas del gen BVH-NTHI1 de H. influenzae no tipable mediante PCR (sistema de PCR DNA Thermal Cycler GeneAmp 2400, Perkin Elmer, San José, CA) a partir de ADN genómico usando los siguientes oligonucleótidos: HAMJ342 (5’-CAAGGCGTTTTCATATGCCTGTCATTCGGCAGG-3’); HAMJ343 (5’-CTAATTGACCTCGAGTTTTGCTGCTTTTAATTCTTGATAATATTG-3’). Se purificaron los productos de PCR con geles de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA) y se secuenciaron los insertos de ADN (kit Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA). La longitud de los fragmentos de PCR generados por estas ocho cepas era idéntica. Las comparaciones pareadas de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas predichas de cuatro de estas cepas (12085, 10095, A18 y A108) revelaron un 99% de identidad como se muestra en la Figura 25.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la producción y purificación de polipéptido recombinante BVH-NTHI1 de H. influenzae no tipable.

Se usó el plásmido pET21-b+ recombinante con el gen BVH-NTHI1 correspondiente a la SEQ ID NO: 1 para electrotransformación (aparato Gene Pulser II, BIO- RAD Labs, Mississauga, Canadá), cepa E. coli Tuner (DE3) [F ompT, hsdS (rb, mb), gal, dcn, lacYI (DE3)] (Novagen, Madison, Wisconsin). En esta cepa de E. coli, el promotor T7 que controla la expresión del polipéptido recombinante se reconoce específicamente por la ARN polimerasa T7 (presente en el profago ADE3) cuyo gen está bajo el control del promotor lac, que es inducible por isopropil-ß-dtiogalactopiranósido (IPTG). Se cultivó Tuner (DE3)/rpET21 transformante a 37ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB (peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l) que contenía carbenicilina 100 μg/ml (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canadá), hasta que la A600 alcanzó un valor de 0,5. Para inducir la producción de polipéptido recombinante BVHNTHI1-His•Tag de H. influenzae no tipable, se incubaron las células durante 3 horas adicionales a 30ºC en presencia de IPTG a una concentración final 1 mM. Se sedimentaron mediante centrifugación las células inducidas en un cultivo de 500 ml y se congelaron a -70ºC.

Se realizó la purificación de los polipéptidos recombinantes de la fracción citoplasmática de Tuner (DE3)/rpET21 inducidos por IPTG mediante cromatografía de afinidad basándose en las propiedades de la secuencia His·Tag (6 residuos de histidina consecutivos) de unirse a cationes divalentes (Ni2+) inmovilizados sobre resina de quelación metálica His•Bind. Brevemente, se resuspendieron células sedimentadas obtenidas a partir de un cultivo de 500 ml inducido por IPTG en tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 5 mM, pH 7,9) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF; Sigma), se sometieron a sonicación y se centrifugaron a 16.000 x g durante 30 minutos para eliminar desechos. Se depositó el sobrenadante sobre una columna de agarosa Ni-NTA (QIAgen, Mississauga, Ontario, Canadá). Se eluyó el polipéptido recombinante BVH-NTHI1-His•Tag de H. influenzae no tipable con imidazol 250 mM-NaCl 500 mM-Tris 20 mM, pH 7,9. Se efectuó la retirada de la sal e imidazol de la muestra mediante diálisis frente a PBS a 4ºC. Se estimó la cantidad de polipéptido recombinante obtenida de la fracción soluble de E. coli mediante MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra el análisis de la inmunogenicidad y capacidad protectora de ratones frente a infección por H. influenzae no tipable después de inmunización con BVH-NTHI1.

Se inmunizaron por vía intranasal grupos de 5 ratones BALB/c hembra (Charles River, Ontario, Canadá) tres veces a intervalos de 2 semanas con 25 μg de polipéptido recombinante BVH-NTHI1-His•Tag purificado por afinidad en presencia del coadyuvante toxina termolábil de E. coli (LT; 1 μg; Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) o, como control, con coadyuvante solo en PBS. Se recogieron muestras de sangre del seno orbital el día antes de cada

inmunización y 14 días después de la tercera inyección (día 42). Se determinaron los títulos de anticuerpo por ELISA en vesículas de membrana externa y termoinactivadas de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable. El anticuerpo secundario usado fue un IgG+IgM (H+L) (específico de Fc) de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson Immunoresearch Labs, Mississauga, Ontario). Se definió el título reactivo de un anticuerpo como la inversa de la dilución que muestra un aumento de absorbancia doble con respecto al obtenido con la muestra de suero preinmunitario. Para investigar si las respuestas inmunitarias desencadenadas por BVHNTHI1 eran funcionalmente significativas, se evaluó la eficacia protectora in vivo 14 días después en ratones con infección aplicada por vía intrapulmonar con aproximadamente 2 x 105 UFC de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable. Se sembraron muestras del inóculo de aplicación de infección por H. influenzae no tipable en placas de agar achocolatado para verificar la dosis de infección. Para medida la eficacia de la vacunación para limitar el crecimiento in vivo de H. influenzae no tipable, se sacrificaron los ratones mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio (Euthanyl™) 5 h después de la inyección. Se valoró en los lavados broncoalveolares el aclaramiento bacteriano sembrando diluciones en serie para la determinación del recuento bacteriano. Se usaron ratones inyectados solo con coadyuvante como controles negativos.

Los resultados del estudio de inmunogenicidad (Tabla 2) mostraron que el nivel de anticuerpos específicos en el suero de animales inmunizados crecía aproximadamente 1000 veces respecto al suero de control. El título medido medido en OMP y muestras termoinactivadas divergía en solo una dilución, confirmando que el polipéptido BVH-NTHI1 representa verdaderamente un antígeno expuesto a superficie.

Tabla 2. Efecto de la inmunización sistémica sobre los niveles de anticuerpo dirigido a NTHI en sueroa

NTHI 12085

Título de ELISA

Control

Inmune

Polipéptidos de membrana externa

200 184 320

Termoinactivados

360 368 640

a) Se recogieron muestras de suero de ratones inmunes y de control el día 42 del régimen de inmunización

Los resultados del estudio de protección (Tabla 3) mostraron que la cepa 12085 se multiplicaba fácilmente en los pulmones de animales de control, de tal modo que a las 5 horas después de la aplicación de la infección, el número de células de H. influenzae no tipable viables había aumentado un 200%. En contraposición, era claramente evidente un aclaramiento pulmonar sustancial de la cepa 12085 por los ratones inmunizados con BVH-NTHI1, mientras que solo se recuperaba un 35% del número original de organismos depositados en los pulmones de los animales inmunes a las 5 h después de la aplicación de la infección.

Tabla 3. Efecto de la inmunización sistémica sobre el aclaramiento pulmonar de 12085 de H. influenzae no tipablea

Ratones Balb/c

UFC de 12085 de H. influenzae no tipable (x 104)

0 h

5 h

Control

4,6 9,2

Inmunizados

Nd 3,2b

a) Cada valor representa una media de 5 animales cada vez. b) **P < 0,0098 calculado según la prueba de t no pareada con corrección de Welch y comparado con el control.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra el reconocimiento de polipéptidos recombinantes de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable por sueros humanos y por antisueros de ratones protegidos.

Se usó una técnica de transferencia Western estándar para investigar si los polipéptidos recombinantes purificados se reconocían por sueros humanos. Además, se ensayaron antisueros de ratones inmunizados con preparaciones de proteínas de membrana externa frente a polipéptidos recombinantes purificados. Los ratones inmunizados con estas preparaciones demostraron un aclaramiento pulmonar aumentado después de la aplicación de la infección con cepa 12085 de H. influenzae no tipable. Par ala preparación de antígenos, se trataron polipéptidos recombinantes purificados con tampón de muestra que contenía SDS y 2-mercaptoetanol durante 5 min a 100ºC. Se resolvieron los péptidos por PAGE-SDS según el procedimiento de Laemmli, U.K. (1970) “Cleavage of structural proteins during the

assembly of the head of the bacteriophage T4”. Nature, 227: 680-685. Después de la PAGE-SDS, se transfirieron los polipéptidos electroforéticamente del gel al papel de nitrocelulosa por el procedimiento (Towbin, H., Staehelin, T. y Gordon, J. (1979) “Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354) y se sondearon con antisueros humanos o de 5 ratón. La detección de antígenos reactivos con los anticuerpos se efectuó mediante inmunoensayo enzimático indirecto usando inmunoglobulinas conjugadas anti-ratón o anti-humanas y un sustrato coloreado. Los resultados de la Tabla 4 muestran que la mayoría de polipéptidos se han observado ya por el sistema inmunitario humano. Como candidatos a vacuna, estos polipéptidos tienen por tanto el potencial de inducir una fuerte respuesta inmunitaria en seres humanos. Además, la mayoría de polipéptidos se reconocieron por sueros de ratones protegidos. Las

10 reactividades séricas se correlacionan con el aclaramiento pulmonar aumentado en el modelo de infección en ratón.

Tabla 4. Reactividades de sueros y antisueros humanos normales de ratones protegidos con polipéptidos recombinantes de 12085 de H. influenzae no tipable

SEQ. ID

Polipéptidos Reactividad séricaa Humano Ratón Aclaramiento pulmonar (%)b

2

BVH-NTHI1 ++ +++ 65

4

BVH-NTHI2 + +++ 36

6

BVH-NTHI3 + +++ 56

8

BVH-NTHI4 ++ +++ 98

10

BVH-NTHI5 - ++ nr c

16

BVH-NTHI8 - + nr

18

BVH-NTHI9 ++ ++ nr

20

BVH-NTHI10 +++ +++ 44

24

BVH-NTHI12 ++++ - 20

a) El número de “+” indica la intensidad de la reacción. El signo “-“ indica sin reacción b) Los ratones se inmunizaron con los polipéptidos recombinantes respectivos y el aclaramiento pulmonar se midió como en el ejemplo 4 c) nr, no realizado

LISTA DE SECUENCIAS

<110> SHIRE BIOCHEM INC.

15 HAMEL, Josee COUTURE, France BRODEUR, Bernard R. MARTIN, Denis

<120> ANTÍGENOS DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE Y FRAGMENTOS DE ADN CORRESPONDIENTES 20 <130> 484112.440EP1

<150> PCT/CA01/01402

<151>

<150> 60/236.712

<151> 25 <160> 51

<170> PatentIn version 3.1

<210>

1

<211>

1140

<212>

ADN

<213>

Haemophilus influenzae

5

<400> 1

<210>

2

<211>

379

<212>

PRT

10

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221>

SEÑAL

<222>

(1)..(33)

<400>

2

<210>

3

<211>

1008

<212>

ADN

5

<213> Haemophilus influenzae

<400>

3

<210>

4

<211>

335

10

<212> PRT

<213>

Haemophilus influenzae

<220>

<221>

SEÑAL

<222>

(1)..(21)

<400>

4

<400>

7

<210>

5

5

<211> 1650

<212>

ADN

<213>

Haemophilus influenzae

<400>

5

<210>

6

<211>

549

<212>

PRT

5

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221>

SEÑAL

<222>

(1) .. (20)

<400>

6

5

<210> <211> <212> <213> 7 1974 ADN Haemophilus influenzae

23

<210>

8

5

<211> 657

<212>

PRT

<213>

Haemophilus influenzae

<220>

<221>

SEÑAL

10

<222> (1)..(26)

<400>

8

<210>

9

<211>

483

<212>

ADN

5

<213> Haemophilus influenzae

<400>

9

<210>

10

<211>

160

10

<212> PRT

<213>

Haemophilus influenzae

<220>

<221>

SEÑAL

<222>

(1)..(20)

5

<400> 10

<210>

11

<211>

939

<212>

ADN

10

<213> Haemophilus influenzae

<400>

11

<210>

12

<211>

312

15

<212> PRT

<213>

Haemophilus influenzae

<400>

12

<210>

13

<211>

1041

5

<212> ADN

<213>

Haemophilus influenzae

<400>

13

<210>

14

<211>

347

<212>

PRT

<213>

Haemophilus influenzae

5

<220>

<221>

SEÑAL

<222>

(1)..(19)

<400>

14

<210>

15

<211>

942

<212>

ADN

<213>

Haemophilus influenzae

15

<400>

15

<210>

16

<211>

313

<212>

PRT

5

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221>

SEÑAL

<222>

(1)..(27)

<400>

16

<210>

17

<211>

487

<212>

ADN

5

<213> Haemophilus influenzae

<400>

17

<210>

18

<211>

178

10

<212> PRT

<213>

Haemophilus influenzae

<220>

<221>

SEÑAL

<222>

(1)..(23)

15

<400> 18

<210> 19

<211>

1728

<212>

ADN

<213>

Haemophilus influenzae

<400>

19

<210>

20

<211>

575

<212>

PRT

10

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221>

SEÑAL

<222>

(1)..(31)

<400>

20

<210>

21

<211>

3336

<212>

ADN

<213>

Haemophilus influenzae

5

<400> 21

<210>

22

<211>

1112

<212>

PRT

5

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221>

SEÑAL

<222>

(1)..(31)

<400>

22

<210>

23

<211>

816

<212>

ADN

5

<213> Haemophilus influenzae

<400>

23

<210>

24

<211>

272

10

<212> PRT

<213>

Haemophilus influenzae

<220>

<221>

SEÑAL

<222>

(1)..(13)

15

<400> 24

<210>

25

<211>

33

<212>

ADN

5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador AMJ342

<210>

26

10

<211> 45

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ343

<210>

27

<211>

41

<212>

ADN

20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HAMJ345

<210>

28

<211>

40

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ344

<210>

29

<211>

38

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAM3348

<210>

30

<211>

34

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ349

<210>

31

<211>

42

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ346

<210>

32

<211>

39

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ399

<210>

33

<211>

41

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ376

<210>

34

<211>

31

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ377

<210>

35

<211>

33

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ460

<210>

36

<211>

36

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ461

<210>

37

<211>

38

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ458

<210>

38

<211>

27

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ459

<210>

39

<211>

35

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ477

<210>

40

<211>

29

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ478

<210>

41

<211>

37

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ481

<210>

42

<211>

30

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ482

<210>

43

<211>

31

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ78

<210>

44

<211>

31

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ79

<210>

45

<211>

35

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ414

<210>

46

<211>

31

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ415

<210>

47

<211>

35

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Cebador HAMJ450

5

<210> 48

<211>

27

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

10

<223> Cebador HAMJ411

<210>

49

<211>

379

<212>

PRT

15

<213> Haemophilus influenzae

<400>

49

<210>

50

<211>

379

5

<212> PRT

<213>

Haemophilus influenzae

<400>

50

<210>

51

<211>

379

<212>

PRT

5

<213> Haemophilus influenzae

<400>

51

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido aislado seleccionado de:

   (a) un polipéptido que tiene más de un 99% de identidad con la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO: 10;

   5 (b) un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO: 10;

   (c) el polipéptido de (a) o (b), en el que se elimina el residuo Met N-terminal; y

   (d) el polipéptido de (a) o (b), en el que se elimina la secuencia aminoacídica secretora; en el que el polipéptido aislado puede desencadenar una respuesta inmunitaria ante Haemophilus influenzae.
2. 2. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende un polipéptido aislado seleccionado de:

   10 (a) un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:10;

   (b) un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:10;

   (c) un polipéptido que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia aminoacídica expuesta en la 15 SEQ ID NO:10;

   (d)

   un polipéptido que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:10;

   (e)

   un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:10;

   20 (f) un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO: 10;

   (g)

   un polipéptido que comprende un fragmento inmunogénico consistente en al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO: 10, en el que el fragmento inmunogénico puede desencadenar una respuesta inmunitaria ante Haemophilus influenzae;

   (h)

   el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f) o (g), en el que se elimina el residuo Met N-terminal; y

   25 (i) el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f) o (g), en el que se elimina la secuencia aminoacídica secretora; en la que el polipéptido aislado puede desencadenar una respuesta inmunitaria ante Haemophilus influenzae; y un portador, diluyente o coadyuvante farmacéuticamente aceptable.
3. 3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que el polipéptido es como se define en la reivindicación 1.

   30 4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2 o 3 para uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de otitis media, sinusitis, bronquitis, neumonía y meningitis o bacteremia mediada por infección bacteriana por Haemophilus influenzae.
4. 5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2 o 3 para su uso en el tratamiento profiláctico o

   terapéutico de infección bacteriana por Haemophilus influenzae en un individuo susceptible de infección por 35 Haemophilus influenzae.

5. 6.

   Una composición farmacéutica según la reivindicación 2 o 3 para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de infección por Haemophilus influenzae.

6. 7.

   Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la que (a)

   Haemophilus influenzae es Haemophilus influenzae no tipable o (b) Haemophilus influenzae es Haemophilus 40 influenzae tipable.

   Figura 1

   Figura 2 Figura 3

   Figura 4 Figura 5

   Figura 6 Figura 7 Figura 8

   Figura 9

   Figura 10

   Figura 11 Figura 12

   Figura 13 Figura 14

   Figura 15

   Figura 16

   Figura 17 Figura 18

   Figura 19 Figura 20 Figura 21

   Figura 22

   Figura 23 Figura 24

   Figura 25