ES2310062B1 - Particulas pseudovirales vacias quimericas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), procedimiento de obtencion y aplicaciones. - Google Patents

Abstract

Partículas pseudovirales vacías quiméricas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), procedimiento de obtención y aplicaciones.

Las partículas pseudovirales vacías quiméricas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV) están constituidas por ensamblaje de proteínas de fusión que comprenden una región A constituida por la proteína pVP2 de IBDV o un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés, tal como un polipéptido útil en vacunación, terapia o diagnóstico.

Description

Partículas pseudovirales vacías quiméricas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), procedimiento de obtención y aplicaciones.

Campo de la invención

La invención se relaciona con la producción de partículas pseudovirales vacías quiméricas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV) y sus aplicaciones.

Antecedentes de la invención

Las partículas pseudovirales son estructuras especializadas en el empaquetamiento y la vehiculización de ácidos nucleicos y proteínas. Una característica general de las partículas pseudovirales es su excelente capacidad para la estimulación de la respuesta inmune del hospedador. Estas propiedades convierten a las partículas pseudovirales en agentes de extraordinario interés para el desarrollo tanto de sistemas de transporte intracelular (delivery systems) como para la generación de vacunas sub-unidad. La utilización de diferentes sistemas de expresión genética ha facilitado la producción de cápsidas virales vacías o partículas pseudovirales (VLPs) de diferentes virus, por ejemplo, rotavirus (US 2003/0175301), retrovirus (US 6.602.705), parvovirus (US 6.458.362), etc. La manipulación genética de estos sistemas de expresión permite, a su vez, la producción de VLPs que contienen secuencias aminoacídicas heterólogas, procedentes de proteínas distintas de aquéllas que conforman la cápsida viral nativa. Estas VLPs se denominan genéricamente VLPs heterotípicas, recombinantes o quiméricas (QVLPs) y han sido utilizadas fundamentalmente con dos finalidades: (i) generación de vacunas multivalentes, mediante péptidos heterólogos inmunogénicamente relevantes y (ii) modificación del tropismo, mediante inserción de secuencias aminoacídicas involucradas en interacciones receptor-ligando.

El virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), perteneciente a la familia Birnaviridae, infecta diferentes especies aviares y es el responsable directo de la bursitis infecciosa, una grave enfermedad inmunosupresora causante de importantes pérdidas económicas en la industria avícola mundial.

Las partículas de IBDV son icosaédricas, con una simetría T=13, carecen de envuelta y están formadas por una única capa proteica. Hasta el momento, las aproximaciones encaminadas a la obtención un modelo atómico para las partículas de IBDV han fracasado. Por ello, la información estructural disponible está basada en modelos tridimensionales generados a partir de imágenes obtenidas por criomicroscopía electrónica del virus purificado y de VLPs. En base a esos estudios, se ha comprobado que la superficie externa de la partícula está formada por un entramado continuo de 260 trímeros de la proteína VP2 (37 kDa) ordenados en cinco conformaciones diferentes. La cara interna de las partículas contiene 200 trímeros de la proteína VP3 (29 kDa), estos últimos, independientes entre sí, se encuentran unidos a la zona basal de los trímeros de VP2. Se ha sugerido que un tercer polipéptido, VP4 (28 kDa), también podría formar parte
de las partículas, estando situado en la base de los pentámeros que forman los vértices de la estructura icosaédrica.

Los polipéptidos VP2, VP3 y VP4 se producen a partir del procesamiento proteolítico de un polipéptido precursor de un tamaño de 109 kDa. Este precursor se procesa auto-catalíticamente liberando los polipéptidos pVP2 (48 kDa), VP3 y VP4. El dominio VP4, que se localiza en la región central de la poliproteína, pertenece a la familia de las proteasas Ion y es el responsable del corte proteolítico. Los polipéptidos pVP2 y VP3 son los responsables directos del ensamblaje de las cápsidas. El producto pVP2 sufre un último corte en su extremo C-terminal antes de dar lugar a la forma madura de la proteína, VP2, que es la que se encuentra en las partículas purificadas. Este procesamiento de pVP2 es necesario para la correcta formación de las cápsidas y requiere de la presencia de VP3, aunque la proteasa responsable aún no ha sido identificada.

La morfogénesis es un proceso vital para el ciclo vírico que requiere de pasos sucesivos asociados a modificaciones en los polipéptidos precursores. Por ello, los virus han desarrollado estrategias que permiten la secuencial y correcta interacción entre cada uno de sus componentes. Una de estas estrategias, utilizada con frecuencia por virus icosaédricos, consiste en la utilización de polipéptidos provenientes de una única poliproteína como base de sus componentes estructurales. En estos casos, el adecuado procesamiento proteolítico de dicha poliproteína juega un papel crucial en el proceso de ensamblaje.

En trabajos previos se ha demostrado este principio para el ensamblaje de las cápsidas de IBDV (Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of ORF Al of infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79:1047-1054). La expresión en células eucarióticas del gen que codifica la poliproteína de IBDV da lugar a la formación de VLPs totalmente indistinguibles morfológica y bioquímicamente de los viriones de IBDV. Asimismo, se ha comprobado que el ensamblaje de las cápsidas necesita únicamente de la síntesis y del correcto procesamiento de la poliproteína viral y es independiente de la presencia del genoma vírico o de otras proteínas codificadas por el genoma viral tales como las proteínas VP5 y VP1.

Los resultados obtenidos hasta la fecha a partir de la expresión de los genes de IBDV en distintos sistemas recombinantes han permitido concluir que: i) el proceso de ensamblaje es independiente de la presencia del material genético del virus, ii) para el ensamblaje sólo son necesarios los polipéptidos codificados por el gen de la poliproteína, y iii) el ensamblaje requiere de una interacción coordinada entre los polipéptidos VP2 y VP3.

Sin embargo, no se conoce si la interacción pVP2/VP3 se establece entre dominios de VP2 y VP3 de la poliproteína precursora cuando aún no ha sufrido modificaciones, o si por el contrario, esta interacción ocurre tras el procesamiento del precursor. Además, la información actual no excluye la posibilidad de que VP4 pudiera jugar un papel relevante en la morfogénesis de la cápsida. De hecho, se han descrito VLPs de IBDV formadas por ensamblaje de las proteínas VP2, VP3 y VP4 de IBDV (US 6.528.063; US 5.788.970 y JP 5194597).

El trabajo desarrollado por estos mismos inventores ha permitido establecer sistemas para la obtención de VLPs de IBDV empleando diferentes vectores de expresión eucariótica. Estos vectores han sido utilizados para la expresión de la poliproteína de IBDV en ausencia o presencia de la RNA polimerasa viral VP1. La caracterización bioquímica de las VLPs purificadas demuestra que contienen las proteínas pVP2, VP2 y VP3, cuando se expresa únicamente la poliproteína viral, y las proteínas pVP2, VP2, VP3 y VP1 cuando se realiza la expresión simultánea de la poliproteína y la RNA polimerasa viral (Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79:1047-1054; Martínez-Torrecuadrada JL et al. 2000. Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells. Virology 278:322-331; Maraver A et al. 2003. The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology 77:6438-49; Lombardo E et al. 1999. VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73:6973-6983).

Por otra parte, la solicitud de patente WO 02/088339 describe unas partículas pseudovirales de IBDV formadas por ensamblaje de proteínas quiméricas que comprenden la poliproteína de IBDV unida en su extremo carboxilo terminal a un polipéptido.

No se han descrito previamente QVLPs basadas únicamente en la proteína pVP2 de IBDV, o en fragmentos de la misma, fusionada a un polipéptido de interés, ni su potencial uso como vacunas o como vehiculizadoras de productos de interés.

Compendio de la invención

La invención se enfrenta con el problema de proporcionar nuevas herramientas para vectorizar o vehiculizar productos de interés, tales como moléculas con actividad biológica, por ejemplo, fármacos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.

La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han observado que es posible obtener partículas pseudovirales vacías quiméricas derivadas de IBDV como consecuencia de la expresión de la proteína pVP2 de IBDV, o de un fragmento de dicha proteína que es capaz autoensamblarse y formar dichas partículas pseudovirales, modificada genéticamente para incluir una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés, denominadas genéricamente QVLPs-pVP2* de IBDV en esta descripción. De hecho, los inventores han observado que la proteína pVP2 de IBDV de longitud completa, o un fragmento de dicha proteína de hasta 501, típicamente de 441-466, restos de aminoácidos contiguos contados a partir del aminoácido número 1 de la proteína pVP2 de IBDV, puede fusionarse con un polipéptido heterólogo y las proteínas de fusión (quiméricas) así obtenidas pueden ensamblarse entre sí y formar QVLPs, en concreto, dichas QVLPs-pVP2*, las cuales poseen propiedades similares a las de las cápsidas virales nativas en cuanto a especificidad e interacciones con las células y que, además, pueden ser manipuladas para ser dirigidas a otras células diana.

Dichas QVLPs-pVP2* de IBDV están formadas por ensamblaje de proteínas de fusión que comprenden una región A constituida por una proteína pVP2 de IBDV o por un fragmento de dicha proteína pVP2 de IBDV que comprende al menos una secuencia homóloga a la del fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés, en donde dicha región B está unida al extremo amino- o carboxilo-terminal de dicha proteína pVP2* de IBDV. Estas QVLPs-pVP2* pueden ser utilizadas con fines sanitarios, por ejemplo, terapéuticos, profilácticos o preventivos, de diagnóstico, etc., por ejemplo, en la elaboración de vacunas, vectores para terapia génica, etc.

Estudios realizados por los inventores han puesto de manifiesto, sorprendentemente, que es posible obtener QVLPs formadas por ensamblaje de proteínas de fusión que comprenden (i) fragmentos de la proteína pVP2 de IBDV (e.g., fragmentos de pVP2 de 441 a 501, preferentemente de 441 a 466, restos de aminoácidos contiguos contados desde el aminoácido 1 de la proteína pVP2 de IBDV) y (ii) una secuencia aminoacídica heteróloga, y que dichas secuencias aminoacídicas heterólogas no constituyen ningún obstáculo para la formación de dichas QVLPs. Asimismo, los inventores han observado que dichas QVLPs pueden ser utilizadas para inmunizar eficazmente aves frente a la infección causada por IBDV o bien para proteger eficazmente animales frente a la infección causada por otros agentes causales (dependiendo de la secuencia aminoacídica heteróloga presente en dichas QVLPs y del antígeno/inmunógeno contenido en dicha secuencia).

En una realización particular, los inventores han obtenido QVLPs formadas por ensamblaje de proteínas de fusión que comprenden fragmentos de la proteína pVP2 de IBDV (e.g., fragmentos de pVP2 de 441 a 466 restos de aminoácidos contiguos contados desde el aminoácido 1 de la proteína pVP2 de IBDV) y una secuencia aminoacídica heteróloga, tal como una cola de histidinas (Ejemplo 1). Asimismo, en otra realización particular, los inventores han comprobado la formación de QVLPs mediante la expresión de fragmentos de la proteína pVP2 de IBDV, en particular, el fragmento identificado en esta descripción como proteína pVP2-456, fusionados al péptido quimérico del virus de la fiebre aftosa [foot-and-mouth disease virus (FMDV)] denominado BT, que comprende los epítopos de las células B y T de FMDV (Ejemplo 3) (Zhang, Q. et al., 2002, Acta Virologica 46(1):1-9).

La producción de QVLPs basadas en una única proteína (pVP2*) presenta numerosas ventajas, tanto a nivel de manipulación de los vectores expresión empleados como a nivel de rendimiento en la producción, frente a la producción de otras QVLPs constituidas por ensamblaje de dos proteínas (e.g., la proteína pVP2 de IBDV y una proteína de fusión basada en la proteína VP3 de IBDV).

Por tanto, un aspecto de la presente invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende una región A constituida por una proteína pVP2 de IBDV o por un fragmento de dicha proteína pVP2 de IBDV que comprende al menos una secuencia homóloga a la del fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés. El procedimiento para la obtención de dicha proteína de fusión constituye un aspecto adicional de esta invención.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una partícula pseudoviral vacía quimérica, denominada genéricamente QVLP-pVP2* (singular) o QVLPs-pVP2* (plural) de IBDV en esta descripción, caracterizada porque está constituida por ensamblaje de dicha proteína de fusión previamente definida.

Un aspecto adicional de esta invención se relaciona con un procedimiento para la producción de dichas QVLPs-pVP2* de IBDV proporcionadas por esta invención, basado en la expresión génica de dicha proteína de fusión previamente definida.

Los ácidos nucleicos, cassettes de expresión, vectores recombinantes y células hospedadoras desarrollados para la puesta en práctica de dicho procedimiento de producción de dichas proteínas de fusión o de dichas QVLPs-pVP2* de IBDV, así como su empleo para la producción de dichas proteínas de fusión QVLPs-pVP2* de IBDV, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.

Dichas QVLPs-pVP2* de IBDV tienen la capacidad de vectorizar o vehiculizar productos de interés, tales como moléculas con actividad biológica, por ejemplo, fármacos, polipéptidos, proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.

Por tanto, en otro aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el empleo de dichas QVLPs-pVP2* de IBDV, en la elaboración de composiciones farmacéuticas, tales como vacunas, vectores para terapia génica y sistemas de suministro de sustancias activas. Dichas vacunas, vectores y sistemas de suministro constituyen aspectos adicionales de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la expresión de los mutantes de deleción del extremo C-terminal de pVP2 con y sin un His-tag en el extremo N-terminal. La colección de mutantes de expresión pVP2/VP2 sin (Figura 1A) y con (Figura 1B, 9C) His-tag se analizó por SDS-PAGE y western-blot mediante el empleo de un anticuerpo policlonal anti-VP2 (Figura 1A, 1B) y anti-His (Figura 1C). Se cargó el mismo volumen de extracto celular para cada mutante para así poder comparar los niveles relativos de expresión de los mutantes pVP2/VP2. Como control positivo, se usaron las cápsidas de IBDV, se indican las posiciones correspondientes a pVP2 y VP2. A la izquierda se indican los marcadores de peso molecular en kDa. Para simplificar, los mutantes pVP2/VPs están referidos de acuerdo a la posición del último aminoácido. Para asegurar que la proteína VP3 no está presente y así descartar posibles contaminaciones, el Western-blot se controló usando anticuerpos anti-VP3 (no mostrado).

La Figura 2 muestra un análisis de la \alpha-hélice del extremo C-terminal de pVP2. La Figura 2A muestra el espectro de dicroísmo circular (DC) del péptido FGFKDIIRAIRRI (Seq. ID. No. 11) en tampón PES, en ausencia (línea discontinua) o presencia del 30% de trifluoroetanol (TFE) (línea continua). En la figura se puede observar el mínimo a 208 y 220 nm y el incremento en la elipticidad a 195 nm. En la Figura 2B se observa la estructura secundaria de los residuos 241-250 de LmTIM. Nótese el carácter anfipático de la hélice alfa.

La Figura 3 muestra un análisis de las proteínas pVP2 y del mutante HT-pVP2 en geles SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie. La Figura 3A es un esquema de la región C-terminal de la pVP2, se indican las posiciones y secuencias que han sido seleccionadas para las deleciones en los mutantes. También se generaron las versiones His-tag de los mutantes. Tanto los mutantes con tag (Figura 3C) como sin tag (Figura 3B) se expresaron a niveles altos, se centrifugaron en dos pasos; se recogieron 12 fracciones, se concentraron 20 veces, y se cargó 1-10 \mul de cada fracción (0,1 \mul por mutante HT-pVP2), se analizaron por SDS-PAGE y se revelaron por tinción de Coomassie. La estrella indica que el gel se analizó por Western blot usando un anticuerpo anti-VP2 (VP2-512). Los mutantes VP2-487 y VP2-494 no formaron estructuras suficientemente estables como para resistir las condiciones de purificación, ya que no dieron precipitado a partir del primer gradiente de sacarosa (resultado no mostrado). En la Figura 3D se muestra el perfil típico de las proteínas de IBDV de células infectadas con IBDV. La dirección de la sedimentación fue de derecha a izquierda, la fracción 12 representa la parte superior de cada gradiente.

La Figura 4 representa las fotografías por microscopía electrónica del ensamblaje de pVP2 de los mutantes de deleción de la región C-terminal. Las Figuras 4A y 4B muestran que los mutantes VP2-441 y VP2-456 forman partículas con cápsidas de simetría T=1, a pesar de que algunas permanecieron asociadas en estructuras inestables de mayor tamaño formadas por 12 partículas dodecaédricas (flechas en la Figura 4A). Las Figuras 4C, 4D y 4E muestran fotografías de distintos ensamblajes de la VP2-466: en la Figura 4C se muestran estructuras tubulares con ordenamiento hexagonal deducido a partir de sus transformaciones de Fourier (inserto) en las fracciones más bajas, la Figura 4D muestra partículas con cápsidas T=1, tubos delgados rotos y material disociado como estructuras predominantes, asimismo se obtuvieron partículas con cápsidas T=13 en las fracciones del medio, y la Figura 4E muestra partículas con T=1 en las fracciones superiores.

La Figura 5 consta de fotografías obtenidas por microscopía electrónica de los ensamblajes correspondientes a las proteínas mutantes His-pVP2 con deleciones en la región C-terminal. Las fracciones concentradas se diluyeron (1/50) para una observación óptima de los ensamblajes obtenidos. La Figura 5A muestra los ensamblajes HT-VP2-441: estructuras de cápsidas T=1 y ensamblajes dodecaédricos mayores (indicados con flechas). En la Figura 5B se muestran los ensamblajes de HT-VP2-466: partículas con cápsidas T=13 y T=7 en las fracciones intermedias. En la Figura 5C se muestran los ensamblajes de HT-VP2-466 partículas con cápsidas T=13 y T=7 en las fracciones intermedias. En las Figuras 5D, 5E y 5F se muestran los ensamblajes HT-VP2-476: estructuras tubulares tipo I en las fracciones inferiores (Figura 5D), partículas con cápsidas T=13 y T=7 y piezas con ensamblaje tubular en las fracciones intermedias (Figura 5E), y ensamblajes irregulares en las fracciones superiores (Figura 5F). La barra corresponde a una longitud de 100 nm.

La Figura 6 muestra la estructura tridimensional de la cápsida de IBDV. La figura 6A muestra una micrografia crioelectrónica de las cápsidas de IBDV. La longitud de la barra es de 50 nm. La Figura 6B muestra una representación de la superficie externa (izquierda) y de la interna (derecha) de la cápsida de IBDV vista a lo largo de un eje bidimensional de la simetría icosaédrica. El mapa de superficie se ha representado asumiendo la presencia de 780 moléculas de VP2-441 y un valor de 0,73 cm^{3}/g como volumen parcial específico de la proteína. Para observar con claridad los poros de la envuelta, se muestra solamente el hemisferio frontal del mapa. Los cinco tipos de capsómeros triméricos se indican con letras de la a a la e. La longitud de la barra es de 200 \ring{A}.

La Figura 7 muestra la estructura tridimensional de las cápsidas de HT-VP2-466. La Figura 7A muestra una fotografía de criomicroscopía electrónica de los ensamblajes de HT-VP2-466 (fracción 7). La longitud de la barra es de 50 nm. Los círculos encierran los tres ensamblajes icosaédricos claramente discernibles con una simetría T=13, T=7 y probablemente, T=1. La longitud de la barra es de 50 nm. La Figura 7B muestra la estructura tridimensional de las cápsidas de la HT-VP2-466 T=13 (izquierda y centro) y T=7 (derecha). Estos mapas de densidad se perfilaron para englobar un volumen de 780 (T=13) o 420 moléculas (T=7) de HT-VP2-466. Las clases de trímeros de HT-VP2-466 están indicados. La longitud de la barra es de 200 \ring{A}.

La Figura 8 muestra una comparación estructural de las cápsidas de IBDV y HT-VP2-466. La Figura 8A muestra los perfiles de densidades de las cápsidas de 3DR de IBDV (línea continua) y HT-VP2-466 (línea a puntos) analizadas ambas a una resolución de 15 \ring{A}. Las envueltas proteicas (r = 253-350 \ring{A}) son prácticamente superponibles excepto por pequeñas diferencias (flechas). La Figura 8B muestra la fotografía de un gel de SDS-PAGE con tinción azul de Coomassie de proteínas de las cápsidas de IBVD y HT-VP2-466 utilizadas para los datos de criomicroscopía electrónica. pVP2/VP2 y VP3 se cuantificaron a partir de geles iguales. Las Figuras 8C y 8D muestran unas secciones transversales de las cápsidas tomadas a partir de 3DR de IBDV y HT-VP2-466, respectivamente. Proteína y ARN están oscuros. La Figura 8E representa un mapa calculando la diferencia entre HT-VP2-466 con respecto a la cápsida de IBDV. El mapa resultante se representa sobre la superficie externa de la cápsida de IBDV vista a lo largo de un eje icosaédrico bidimensional. La Figura 8F representa un mapa de diferencia calculado a partir de la diferencia de IBDV con respecto a la cápsida de HT-VP2-466. El mapa resultante al restar estas diferencias, mostrado como 132 lóbulos mayores, se muestra en la superficie interna de la cápsida de HT-VP2-466 vista a lo largo de un eje icosaédrico bidimensional. Cada una de estas islas de densidad, usando 0,73 cm^{3}/g como volumen parcial de la proteína, corresponde a 26 kDa aproximadamente. Por otro lado, la masa de 5-6 copias de los segmentos de 442-466 (2,6 kDa) y el His-Tag (3,4 kDa) varían de 31 a 37 kDa cada uno. La longitud de la barra es de 200 \ring{A}.

La Figura 9 muestra la organización estructural de las cápsidas de IBDV y HT-VP2-466. Se muestran secciones icosaédricas de 3DR de las cápsidas de IBDV (mitad izquierda) y de HT-VP2.466 (mitad derecha), a una resolución de 15 \ring{A}, y vistas bajo un eje bidimensional. Las distancias perpendiculares de las secciones icosaédricas que se muestran desde el centro de las cápsidas T=13 son 328 \ring{A} (A), 319 \ring{A} (B), 311 \ring{A} (C), 302 \ring{A} (D), 294 \ring{A} (E), 286 \ring{A} (F), 277 \ring{A} (G) y 269 \ring{A} (H). Las facetas han sido generadas a partir del programa Facets (proporcionado por R.A. Crowther, MRC, Cambrige). La longitud de la barra es de 200 \ring{A}.

La Figura 10 muestra los ensamblajes proteicos de pVP2 y de los mutantes HT-pVP2. La Figura 10A muestra un esquema que ilustra los ensamblajes adoptados por VP2 con diferentes extensiones del extremo C-terminal, dependiendo de la extensión de la secuencia C-terminal, solo (VP2) o con His-tag (HT-VP2). Se muestra la hélice \alpha del péptido 443-GFKDIIRAIR-453 (Seq. ID. No. 16). Nótese que a medida que se aumenta la longitud de la secuencia C-terminal unida a VP2 (o su versión His-tag) hay un equilibrio en el desplazamiento entre estructuras con cápsidas T=1 y tubos, favoreciendo la formación de estructuras tubulares hexagonales. Se muestra además la secuencia completa de la región C-terminal de pVP2 y de los sitios usados en esta invención. La Figura 10B muestra una representación de la hélice \alpha predicha para el péptido GFKDIIRAIR (Seq. ID. No. 16) a la izquierda. En la derecha de la figura, se muestra la carga complementaria propuesta entre la hélice \alpha amfipática y los últimos cinco aminoácidos de la región C-terminal de VP3 (o el alineamiento de la región similar del His-Tag (H-tag) de VP3) usada en la presente invención. Las secuencias de VP3 y H-tag se muestran en direcciones opuestas, de la región C-terminal a la N-terminal.

La Figura 11 muestra el resultado de un análisis por Western blot de distintas fracciones (F6-F11) conteniendo cápsidas quiméricas de IBDV formadas por ensamblaje de la proteína pVP2-456 de IBDV y el péptido quimérico BT que contiene los epítopos B y T del virus de la fiebre aftosa (Foot-and-Mouth Disease Virus o FMDV) expresadas en levaduras. El blot superior muestra los resultados obtenidos utilizando un anticuerpo específico anti-VP2 de IBDV mientras que el blot inferior muestra los resultados obtenidos utilizando un anticuerpo específico anti-FMDV. En el blot superior pueden observarse distintas bandas inmunoreactivas (polipéptidos) debido a la existencia de los agregados que producen las proteínas al formar las cápsidas; esos mismos polipéptidos son reconocidos por anticuerpos específicos anti-FMDV (panel inferior). El control (pESCURA/pVP2) muestra una banda inmunoreactiva frente anticuerpos específicos anti-VP2 de menor peso molecular que no es reconocida por anticuerpos específicos anti-FMDV.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión, en adelante proteína de fusión de la invención, que comprende una región A constituida por la proteína pVP2 de IBDV (Seq. ID. No. 15) o por un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés. La región B puede estar localizada en posición N- o C-terminal con respecto a la región A.

El término "IBDV", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al virus causante de la bursitis infecciosa e incluye a las diferentes cepas de IBDV pertenecientes a cualquiera de los serotipos (1 ó 2) conocidos [a título ilustrativo véase la revisión realizada por van den Berg TP et al. 2000. Rev Sci Tech. 19:509-43].

El término "proteína pVP2 de IBDV" se refiere, en general, a una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos de la proteína pVP2 de IBDV (Seq. ID. No. 14) e incluye a cualquiera de las diferentes formas de las proteínas pVP2 representativas de cualquiera de las mencionadas cepas de IBDV [NCBI protein databank], de acuerdo con la definición realizada por Sánchez y Rodríguez (1999) (Sánchez AB & Rodríguez JF. Proteolytic processing in infectious bursal disease virus: identification of the polyprotein cleavage sites by site-directed mutagenesis. Virology. 1999 Sep 15; 262(1):190-199) así como a proteínas sustancialmente homólogas a dichas proteínas pVP2 de IBDV, es decir, proteínas que presentan un buen alineamiento con la secuencia de una proteína pVP2 de IBDV determinada, por ejemplo, proteínas cuyas secuencias de aminoácidos tienen un grado de identidad, respecto a dichas proteínas pVP2 de IBDV, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 80%, más preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más preferentemente de, al menos, un 95%. Secuencias homólogas a una secuencia de la proteína pVP2 de IBDV pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la materia con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias, por ejemplo, el programa BLAST (Altschul et al. 1997. Nucleic Acids Res. 25:3389). En una realización particular, la proteína pVP2 de IBDV es la proteína pVP2 de IBDV cepa Soroa cuya secuencia, longitud completa, de aminoácidos está depositada en la NCBI con el número de acceso AAD30136.

El término "fragmento 1-n de la/dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde ``n'' es un número entero comprendido entre 441 y 501", se refiere, en general, a un péptido o proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501. Por tanto, dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV presente, en su caso, en las QVLPs-pVP2* proporcionadas por esta invención, tiene una secuencia de aminoácidos constituida por, o que comprende, entre 441 y 501 restos de aminoácidos contiguos, contados a partir del resto del aminoácido número 1, de cualquier proteína pVP2 representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, de la proteína pVP2 de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de acceso AAD30136].

Los fragmentos 1-n de la proteína pVP2 de IBDV particulares se denominan siguiendo el formato "pVP2-n", donde "n" es el definido previamente. En una realización particular, dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV es una proteína seleccionada del grupo formado por:

(i)

la proteína pVP2-441, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 441 de la proteína pVP2 de IBDV;

(ii)

la proteína pVP2-452, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 452 de la proteína pVP2 de IBDV;

(iii)

la proteína pVP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína pVP2 de IBDV;

(iv)

la proteína pVP2-466, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 466 de la proteína pVP2 de IBDV;

(v)

la proteína pVP2-476, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 476 de la proteína pVP2 de IBDV;

(vi)

la proteína pVP2-487, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 487 de la proteína pVP2 de IBDV;

(vii)

la proteína pVP2-494, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 494 de la proteína pVP2 de IBDV; y

(viii)

la proteína pVP2-501, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 501 de la proteína pVP2 de IBDV.

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La proteína de fusión de la invención comprende una región A constituida por la proteína pVP2 de IBDV o por un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés. En una realización particular, dicha región B está unida a la región amino-terminal de dicha proteína pVP2 de IBDV, mientras que en otra realización particular, dicha región B está unida a la región carboxilo-terminal de dicha proteína pVP2 de IBDV.

En una realización particular, dicha región A está constituida por la proteína pVP2 de IBDV. En este caso, la proteína pVP2 de IBDV que constituye la región A de la proteína de fusión de la invención puede ser cualquier proteína pVP2 representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, la proteína pVP2, longitud completa, de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de acceso AAD30136].

En otra realización particular, dicha región A está constituida por un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV. En este caso, dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV que constituye la región A de la proteína de fusión de la invención puede ser cualquier fragmento 1-n de una proteína pVP2 representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, de la cepa Soroa. En una realización particular, dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV que constituye dicha región A es una proteína seleccionada del grupo formado por la proteína pVP2-441, la proteína pVP2-452, la proteína pVP2-456, la proteína pVP2-466, la proteína pVP2-476, la proteína pVP2-487, la proteína pVP2-494, y la proteína pVP2-501, preferentemente, seleccionada entre proteína pVP2-441, la proteína pVP2-452, la proteína pVP2-456 y la proteína pVP2-466.

La región B presente en la proteína de fusión de la invención está constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés. Tal como se utiliza en la presente invención el término "polipéptido heterólogo" se refiere a un polipéptido no propio de la cápsida de IBDV nativo.

El tamaño del polipéptido de interés puede variar dentro de un amplio intervalo, desde unos pocos aminoácidos hasta cientos de aminoácidos. Dicho polipéptido de interés puede ser prácticamente cualquier polipéptido, independientemente de su origen (eucarótico, procariótico, viral, etc.), susceptible de ser expresado de forma recombinante, por ejemplo, un antígeno, tal como un antígeno viral, bacteriano, microbiano, etc., frente al que se desea inducir una respuesta inmune en un animal (incluido el ser humano); una enzima, tal como una enzima destinada a suplementar una función en la que un organismo sea deficiente; o un polipéptido que comprende un dominio peptídico de unión a un ácido nucleico capaz de reconocer específicamente una secuencia diana de ADN o de ARN permitiendo la unión de la proteína de fusión de la invención a una secuencia de ácido nucleico que comprenda dicha secuencia diana y su encapsidación en una partícula pseudoviral que comprende dicha proteína de fusión de la invención (QVLPs-pVP2* de IBDV). En una realización particular, dicho polipéptido de interés es un polipéptido útil en vacunación, terapia o diagnóstico, tal como un epítopo o determinante antigénico capaz de inducir una respuesta inmune en animales y humanos frente a enfermedades causadas por virus, bacterias, parásitos o cualquier otro tipo de microorganismos o frente a enfermedades tumorales. En una realización concreta, dicho polipéptido de interés es el péptido quimérico del virus de la fiebre aftosa (FMDV) denominado BT, que comprende los epítopos de las células B (epítopo B) y de las células T (epítopo T) de FMDV (Zhang, Q. et al., 2002, Acta Virologica 46(1):1-9). En una realización particular, el epítopo B está localizado en la proteína VP1 de FMDV, por ejemplo, entre las posiciones 133-159 de dicha proteína VP1 del aislado español del serotipo C, o en posiciones equivalentes de otros aislados, mientras que el epítopo T está localizado en la proteína VP4 de FMDV, por ejemplo, entre las posiciones 20-34 de dicha proteína VP4 de FMDV del serotipo Asia.

En una realización particular, dicha región B comprende un único polipéptido de interés. Sin embargo, en otra realización particular, dicha región B comprende dos o más polipéptidos de interés, iguales o diferentes, los cuales pueden estar formando tándems.

En una realización particular, la proteína de fusión de la invención comprende una región A unida a una única región B. En este caso, dicha región B puede estar unida a la región amino-terminal de dicha proteína pVP2 de IBDV o de dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV; o bien, alternativamente, dicha región B puede estar unida a la región carboxilo-terminal de dicha proteína pVP2 de IBDV o de dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV.

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La región B, tal como se ha mencionado previamente, puede contener uno o más polipéptidos de interés. En una realización particular, dicha región B contiene un único polipéptido de interés mientras que en otra realización particular, dicha región B comprende dos o más polipéptidos de interés diferentes.

En otra realización particular, la proteína de fusión de la invención comprende una región A unida a dos regiones B, una de ellas unida a la región amino-terminal de la proteína pVP2 de IBDV o de dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV presente en la región A y la otra a la región carboxilo-terminal de la proteína pVP2 de IBDV o de dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV presente en la región A. Dichas regiones B pueden ser iguales o diferentes y cada una de ellas puede contener uno o más polipéptidos de interés, los cuales pueden ser iguales o diferentes entre sí. En una realización concreta, la proteína de fusión de la invención comprende una región A unida a una primera región B que contiene un primer polipéptido de interés (B1) y una segunda región B que contiene un segundo polipéptido de interés (B2). Dichos polipéptidos de interés (B1) y (B2) pueden ser iguales o diferentes. En una realización concreta, dichos polipéptidos de interés (B1) y (B2) son distintos entre sí.

La región A de la proteína de fusión de la invención puede estar unida directamente a dicha región B. Alternativamente, dicha región A no está unida directamente a dicha región B sino que está unida a través de un polipéptido espaciador (linker) entre dichas regiones A y B. Por tanto, si se desea, la proteína de fusión de la invención puede contener, además, un polipéptido espaciador situado entre dichas regiones A y B. Ventajosamente, dicho polipéptido espaciador es un péptido con flexibilidad estructural, preferentemente, un polipéptido que dé lugar a un dominio no estructurado capaz o no de inducir una respuesta inmune. A modo ilustrativo, dicho péptido flexible puede contener repeticiones de restos de aminoácidos, en particular de restos de Gly y Ser o cualquier otra repetición de restos de aminoácidos adecuada.

La proteína de fusión de la invención puede obtenerse mediante la expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión en células hospedadoras apropiadas. Dichas células hospedadoras apropiadas son células que contienen la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención, por ejemplo, células que contienen una secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención o que han sido transformadas por dicho ácido nucleico, o células transformadas, transfectadas o infectadas con un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión de la invención. Las secuencias de ácido nucleico, los cassettes de expresión, los vectores recombinantes y las células hospedadoras apropiadas para la obtención de la proteína de fusión de la invención se describirán más adelante de forma detallada en combinación con el procedimiento para la producción de QVLPs-pVP2* de IBDV.

La proteína de fusión de la invención expresada en una célula hospedadora apropiada puede autoensamblarse y formar partículas pseudovirales vacías quiméricas derivadas de IBDV denominadas genéricamente QVLP-pVP2* (singular) o QVLPs-pVP2* (plural) de IBDV en esta descripción.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con dichas QVLPs-pVP2* de IBDV. Dichas QVLPs-pVP2* de IBDV están fomadas por ensamblaje de la proteína de fusión de la invención, tienen simetría T=1 y se caracterizan porque están constituidas únicamente por ensamblaje de proteínas de fusión de la invención que comprenden una región A constituida por la proteína pVP2 de IBDV o por un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés.

Las QVLPs-pVP2* de IBDV de la invención pueden obtenerse mediante la expresión de la proteína de fusión de la invención en células hospedadoras apropiadas bajo condiciones que permiten la formación de dichas partículas pseudovirales de IBDV.

Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención.

En una realización particular, la secuencia de ácido nucleico de la invención comprende (i) una secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV o a un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, y (ii) una secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de interés.

En otra realización particular, la secuencia del ácido nucleico proporcionado por esta invención comprende (i) una secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV o a un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, (ii) una primera secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de interés, y (ii') una segunda secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de interés, en donde dicha segunda secuencia de nucleótidos puede ser igual o diferente a dicha primera secuencia de nucleótidos. En este caso, una de dichas primera o segunda secuencia de nucleótidos está operativamente unida al extremo 5' de la secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a dicha proteína pVP2 de IBDV o a dicho fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV y la otra está operativamente unida al extremo 3' de la secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a dicha proteína pVP2 de IBDV o a dicho fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV.

Tal como se utiliza en esta descripción, el término "fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV" o "fase de lectura abierta correspondiente a un fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV" incluye, además de las secuencias de nucleótidos de dichas fases de lectura abierta, otras fases de lectura abiertas análogas a las mismas codificantes de las proteínas pVP2 y fragmentos 1-n, donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, de dicha proteína pVP2 de IBDV.

Asimismo, el término "fase de lectura abierta de uno o más polipéptidos heterólogos que comprenden uno o más polipéptidos de interés" incluye cualquier secuencia de nucleótidos codificante de dicho(s) polipéptido(s) heterólogo(s)
que comprende(n) uno o más polipéptidos de interés. El término "análoga", tal como aquí se utiliza, pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos que puede ser aislada o construida sobre la base de la secuencia de nucleótidos codificantes de la proteína pVP2 de IBDV o del fragmento 1-n, donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, de dicha proteína pVP2 de IBDV, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. En general, una secuencia de nucleótidos análoga a otra secuencia de nucleótidos es sustancialmente homóloga a dicha secuencia de nucleótidos.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos, un 80%, más preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más preferentemente de, al menos, un 95%.

En otro aspecto, la invención proporciona un cassette de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico proporcionado por esta invención, es decir, un ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción.

En una realización particular, el cassette de expresión proporcionado por esta invención comprende, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, una secuencia de nucléotidos que comprende (i) una secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV o a un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, y (ii) una secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de interés.

En otra realización particular, el cassette de expresión proporcionado por esta invención comprende, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, una secuencia de nucleótidos que comprende (i) una secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV o a un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, (ii) una primera secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de interés, y (ii') una segunda secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de interés, en donde dicha segunda secuencia de nucleótidos puede ser igual o diferente a dicha primera secuencia de nucleótidos. En este caso, una de dichas primera o segunda secuencia de nucleótidos está operativamente unida al extremo 5' de la secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a dicha proteína pVP2 de IBDV o a dicho fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV y la otra está operativamente unida al extremo 3' de la secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a dicha proteína pVP2 de IBDV o a dicho fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV.

Los elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, presentes en el cassette de expresión proporcionado por esta invención incluyen promotores, que dirigen la transcripción de las secuencias de nucleótidos (pVP2 de IBDV o fragmento de la misma y polipéptido heterólogo) al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc. En general, dichos elementos, así como los vectores utilizados para construir los cassettes de expresión y los vectores recombinantes según la invención, se eligen en función de las células hospedadoras que se pretenden utilizar.

En otro aspecto, la invención proporciona un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico proporcionado por esta invención o un cassette de expresión proporcionado por esta invención. Prácticamente cualquier vector puede ser utilizado en la generación del vector recombinante proporcionado por esta invención. A modo ilustrativo, dichos sistemas o vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos, bácmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACS), cromosomas artificiales de bacteria (BACs), cromosomas artificiales basados en el bacteriófago P1 (PACs), cósmidos, o virus, que pueden contener, además, un origen de replicación heterólogo, por ejemplo, bacteriano o de levadura para que pueda ser amplificado en bacterias o levaduras, así como un marcador utilizable para seleccionar las células transfectadas diferente al gen o genes de interés. Estos vectores recombinantes pueden ser obtenidos por los técnicos en la materia mediante el empleo de técnicas convencionales de ingeniería genética (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) y forman parte de la presente invención.

En una realización particular, dicho vector recombinante es un plásmido, tal como un plásmido adecuado para transformar levaduras, o un virus, tal como un baculovirus recombinante (rBV) que expresa durante su ciclo de replicación la proteína de fusión de la invención y que, tras su ensamblaje, forman QVLPs-pVP2* de IBDV. En una realización particular se han obtenido QVLPs en levaduras, en concreto, QVLPs-pVP2* de IBDV que contienen el péptido quimérico BT de FMDV en posición C-terminal con respecto a la proteína pVP2-456. Para ello, se generó el plásmido de expresión pESCURA/pVP2-456-BT, el cual fue utilizado para transformar cultivos de Saccharomyces cerevisiae (Ejemplo 3). En otra realización particular se han obtenido QVLPs mediante el empleo de un sistema de expresión basado en rBV (Ejemplo 1).

En otro aspecto, la invención proporciona una célula hospedadora que contiene una secuencia de ácido nucleico proporcionada por esta invención, es decir, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención. En una realización particular, dicha célula hospedadora es una célula transformada por una secuencia de ácido nucleico proporcionada por esta invención que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención. En otra realización particular, dicha célula hospedadora es una célula transformada, transfectada o infectada con un vector recombinante proporcionado por esta invención que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención.

Prácticamente cualquier célula hospedadora susceptible de ser transformada por una secuencia de ácido nucleico proporcionada por esta invención, o cualquier célula hospedadora susceptible de ser transformada, transfectada o infectada por un vector recombinante proporcionado por esta invención puede ser utilizada, por ejemplo, células de mamífero, células aviares, células de insecto, levaduras, etc.; no obstante, en una realización particular, dicha célula huésped se selecciona entre levaduras y células de insecto. Las levaduras son adecuadas por razones de simplicidad y coste de producción. Las células de insecto son adecuadas cuando el sistema de expresión comprende un rBV. El empleo de rBV es ventajoso por cuestiones de bioseguridad relacionadas con el rango de huésped de los baculovirus, incapaces de replicar en otros tipos celulares que no sean de insecto.

En una realización particular, la invención proporciona una célula hospedadora, tal como una levadura, por ejemplo, una levadura del género Saccharomyces, tal como S. cerevisae, S. pombe, etc., o del género Pichia, tal como P. pastoris, etc., transformada con un vector recombinante proporcionado por esta invención, tal como un plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención o un cassette de expresión proporcionado por esta invención que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención.

En otra realización particular, la invención proporciona una célula hospedadora, tal como una célula de insecto, infectada con un vector recombinante proporcionado por esta invención, tal como un rBV que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención o un cassette de expresión proporcionado por esta invención que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de QVLPs-pVP2* de IBDV que comprende cultivar una célula hospedadora proporcionada por esta invención que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención y que expresa dicha proteína, y, si se desea, recuperar dichas QVLPs-pVP2* de IBDV. En una realización particular, dicho procedimiento se realiza mediante el empleo de una célula hospedadora proporcionada por esta invención consistente en una célula transformada por una secuencia de ácido nucleico de la invención que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención. En otra realización particular, dicho procedimiento se lleva a cabo utilizando una célula hospedadora proporcionada por esta invención consistente en una célula transformada, transfectada o infectada con un vector recombinante proporcionado por esta invención que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención.

Tras la expresión de la proteína de fusión de la invención en dichas células, las proteínas expresadas se ensamblan y forman las QVLPs-pVP2* de IBDV, las cuales pueden ser aisladas o retiradas del medio, y, si se desea, purificadas. El aislamiento y purificación de dichas QVLPs-pVP2* de IBDV puede realizarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante fraccionamiento en gradientes de sacarosa.

En una realización particular, la expresión génica de la proteína de fusión de la invención se realiza mediante el empleo de un rBV que permite la expresión de la proteína de fusión de la invención a partir de la secuencia de ácido nucleico proporcionado por esta invención en células de insecto. Por tanto, en una realización particular, la invención proporciona un procedimiento para la producción de QVLPs-pVP2* de IBDV que comprende (i) cultivar células de insecto infectadas con un rBV que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención, bajo condiciones que permiten la expresión de las proteínas recombinantes y su ensamblaje para formar QVLPs-pVP2* de IBDV, y (ii) si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dichas QVLPs-pVP2* de IBDV. Dicho procedimiento comprende, por tanto, en primer lugar, la obtención de un vector recombinante constituido por un rBV que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención o un cassette de expresión proporcionado por esta invención que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención, seguido de la infección de células de insecto con dicho rBV, expresión de las proteínas recombinantes y, si se desea, aislamiento de las QVLPs-PVP2* de IBDV formadas por ensamblaje de la proteína de fusión de la invención, y, opcionalmente, purificación posterior de dichas QVLPs-pVP2* de IBDV.

La construcción de un baculovirus recombinante que permite la expresión de la proteína de fusión de la invención puede ser realizada por un experto en la materia en base a lo aquí descrito y al estado de la técnica sobre esta tecnología (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Leusch MS et al. 1995. A novel host-vector system for direct selection of recombinant baculoviruses (bacmids) in Escherichia coli. Gene 160:91-4; Luckow VA et al. 1993. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol 67:4566-79).

En otra realización particular, la expresión génica de la proteínas de fusión de la invención se realiza mediante el empleo de un vector recombinante que permite la expresión de la proteína de fusión de la invención en células de levadura. Por tanto, en una realización particular, la invención proporciona un procedimiento para la producción de QVLPs-pVP2* de IBDV que comprende (i) cultivar levaduras transformadas con un vector recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención, bajo condiciones que permiten la expresión de las proteínas recombinantes y su ensamblaje para formar QVLPs-pVP2* de IBDV, y (ii) si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dichas QVLPs-pVP2* de IBDV. Dicho procedimiento comprende, por tanto, en primer lugar, la obtención de un vector recombinante constituido por un plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención o un cassette de expresión proporcionado por esta invención que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención, seguido de transformación de levaduras con dicho vector recombinante, expresión de las proteínas recombinantes y, si se desea, aislamiento de las QVLPs-pVP2* de IBDV formadas por ensamblaje de la proteína de fusión de la invención, y, opcionalmente, purificación posterior de dichas QVLPs-pVP2* de IBDV. En una realización concreta, el sistema de expresión adecuado para transformar levaduras está basado en un sistema de expresión pESC Yeast (Stratagene). La obtención de levaduras transformadas con un vector recombinante apropiado que permite la expresión de la proteína de fusión de la invención, puede ser realizada por un experto en la materia en base a lo aquí descrito y al estado de la técnica sobre esta tecnología (pESC epitope tagging vectors Instructions manual. Stratagene www.stratagene.com; Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). En general, las QVLPs-pVP2* de IBDV obtenidas en levaduras son cápsidas T=1; a modo ilustrativo, cuando se produjeron en levaduras QVLPs-pVP2* de IBDV en las que la región A está constituida por la proteína pVP2-441, la proteína pVP2-456 o la proteína pVP2-466, las QVLPs-pVP2* de IBDV así obtenidas únicamente eran cápsidas T=1.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo del vector recombinante proporcionado por esta invención para la producción y obtención de la proteína de fusión de la invención y/o de las QVLPs-pVP2* de IBDV de la invención.

Las QVLPs-pVP2* de IBDV pueden ser utilizadas como vectores o vehiculizadores de productos de interés, tales como moléculas con actividad biológica, por ejemplo, fármacos, polipéptidos, proteínas, anticuerpos, hormonas, enzimas con potencial terapéutico para tratar enfermedades, ácidos nucleicos, etc., por lo que pueden ser utilizadas con fines terapéuticos, de diagnóstico o de investigación. En una realización particular, dichas moléculas de interés biológico incluyen polipéptidos de interés, tales como antígenos o inductores de respuestas inmunes en animales o humanos a los que se suministre, por lo que pueden ser utilizadas en la elaboración de vacunas frente a enfermedades humanas y animales causadas por virus, bacterias, parásitos o cualquier otro tipo de microorganismos o frente enfermedades tumorales, o bien incluyen secuencias de ácido nucleico, útiles en terapia génica, destinadas a ser introducidas en el interior de las células apropiadas, por lo que pueden ser utilizadas en la elaboración de vectores para terapia génica, o bien incluyen compuestos de interés sanitario (anticuerpos, hormonas, enzimas con potencial terapéutico para tratar enfermedades, etc.) para su administración al cuerpo humano o animal, por lo que pueden ser utilizadas como sistemas de suministro de sustancias activas (delivery systems).

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de las QVLPs-pVP2* de IBDV en la elaboración de una composición farmacéutica, por ejemplo, vacunas, vectores para terapia génica, sistemas de suministro de sustancias activas, etc. En una realización particular, dicha composición farmacéutica es una vacuna destinada a conferir protección frente a enfermedades humanas o animales causadas por virus, bacterias, parásitos o cualquier otro tipo de microorganismos, o frente a enfermedades tumorales. En otra realización particular, dicha composición farmacéutica es un vector para terapia génica. En otra realización particular, dicha composición farmacéutica es un sistema de suministro de sustancias activas; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas sustancias activas incluyen fármacos, anticuerpos, hormonas, enzimas potencialmente implicados en el tratamiento de enfermedades, etc.

En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de QVLPs-pVP2* de IBDV, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dicha vacuna es útil para proteger animales y humanos frente a enfermedades causadas por microorganismos (virus, bacterias, parásitos, etc.), o frente a enfermedades tumorales. En una realización particular, dicha vacuna resulta especialmente útil para proteger animales y humanos simultáneamente frente a la infección causada por dos o más agentes infecciosos causantes de enfermedades. A modo ilustrativo, la vacuna proporcionada por esta invención puede ser utilizada para proteger aves, por ejemplo, pollos, pavos, ocas, gansos, faisanes, codornices, avestruces, etc., frente a IBDV y frente a uno o más agentes infecciosos responsables de enfermedades aviares (patógenos aviares).

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de QVLPs-pVP2* de IBDV calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de las QVLPs-pVP2* de IBDV y el efecto de inmunización a conseguir.

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas vacunas son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de vacunas.

En una realización particular, dicha vacuna se prepara en forma de una solución o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otro diluyente farmacéuticamente aceptable.

La vacuna proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada que dé como resultado una respuesta inmune protectora frente a la secuencia heteróloga o epítopo utilizado, para lo cual dicha vacuna se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la vacuna proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por ejemplo, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un sistema de suministro de sustancias activas que comprende, al menos, una QVLP-pVP2* de IBDV y una sustancia activa. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de sustancias activas incluyen fármacos, anticuerpos, hormonas, enzimas con potencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades, etc.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.

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Ejemplo 1 Obtención de QVLPs-pVP2* de IBDV en células de insecto y análisis del polimorfismo estructural I. Materiales y métodos Preparación de virus

IBDV cepa Soroa, una cepa de IBDV de serotipo I se purificó por un protocolo estándar a partir de células de músculo de codorniz QM7 (Lombardo et al. 1999. VP 1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. J Virol 73, 6973-6983) y se almacenó en tampón PES (piperacina-N-N'-bis (2-ácido etanosulfónica) [PIPES] 25 mM pH=6,2, NaCl 150 mM y CaCl_{2} 20 mM).

Construcción de baculovirus recombinantes

El baculovirus recombinante (rBV) FB/VP2-456 ya ha sido descrito previamente (Castón et al., 2001. C terminus of infectious bursal disease virus major capsid protein VP2 is involved in definition of the T number for capsid assembly. J Virol 75, 10815-10828).

El plásmido pVOTE.2/POLY (Oña et al., 2004. The C-terminal domain of the pVP2 precursor is essential for the interaction between VP2 and VP3, the capsid polypeptides of infectious bursal disease virus. Virology 322, 135-142.) se ha usado como DNA molde para la síntesis por PCR de los fragmentos de DNA de los derivados de pVP2 para generar los rBV identificados como FB/VP2-441, FB/VP2-466, FB/VP2-476, FB/VP2-487, FB/VP2-494, FB/VP2-501 y FB/VP2-512. La PCR se llevó a cabo con la DNA polimerasa Vent (Biolabs) usando un cebador común para el extremo 5' (5'-pVP2) y un cebador específico para el extremo 3' de cada mutante (Tabla 1).

TABLA 1 Secuencias de los cebadores de oligonucleótidos empleados para generar las deleciones de los mutantes de los extremos C-terminales

1

Los fragmentos de la digestión de la PCR con BglII-HindIII se donaron en los sitios de donación múltiple (polylinker) BamHI-HindIII de los plásmidos FastBac y pHisFastBac-C (Invitrogen) de expresión de proteínas. El plásmido pHisFastBac-C se usó para expresar las variantes His-pVP2. La secuencia extra tag que se empleó es MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMGS (SEQ ID No. 10). Las secuencias de los plásmidos resultantes se comprobaron mediante el método de secuenciación de Sanger (Sanger et al., 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463-5467).

La selección de los bácmidos derivados de la cepa DH10Bac de E. coli y la preparación de la misma para su transfección con lipofectamina se llevó a cabo según los protocolos de los fabricantes (Invitrogen).

Las construcciones se expresaron en células de insecto H5 (Maraver et al., 2003. Identification and molecular characterization of the RNA polymerase-binding motif of infectious bursal disease virus inner capsid protein VP3. J Virol 77, 2459-2468) (Figura 1).

Caracterización y purificación de las estructuras del mutante de deleción de pVP2

Se infectaron células 1-15 (2-5 x 10^{8} células) con el rBV apropiado a una multiplicidad de infección (m.d.i.) de 1-5 unidades formadoras de placa (UFP)/célula. Las células se recogieron a las 48 horas post-infección (h.p.i.) y se lisaron en tampón de lisis PES conteniendo un 1% de IGEPAL CA-630 (Sigma) en hielo. El material particulado se purificó a través de un colchón de sacarosa al 20% y un gradiente lineal de sacarosa de un 25-50%. El material particulado que contenía la proteína mutada de deleción pVP2 se concentró 20 veces por ultracentrifugación y se identificó mediante SDS-PAGE y Western blotting. Las fracciones ricas en VP2 se seleccionaron para estudios estructurales y se usaron dentro de los 1-2 días posteriores a la purificación.

SDS-PAGE y Western blotting

Los extractos celulares de las células infectadas (10-15 \mul) o las fracciones del gradiente de concentración de sacarosa (2-5 \mul) se añadieron al tampón de Laemmli hasta alcanzar una concentración final de 1x, se calentó (100°C, 2 minutos). La electroforesis se llevó a cabo en geles de poliacrilamida al 11% (38,96% (w/v) acrilamida y 1,04 (w/v) bis-acrilamida metileno). El Western blotting se llevó a cabo con un suero anti-VP2 (Lombardo et al., 1999. VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. J Virol 73, 6973-6983). Como control negativo interno se usó suero anti-VP3 de conejo. El anticuerpo anti-His tag se obtuvo de Sigma.

Microscopía electrónica convencional

Se dispusieron muestras de 2-5 \mul de cada fracción del gradiente de sacarosa y se tiñeron negativamente con 2% (w/v) de acetato de uranilo acuoso. Las micrografías se registraron con un microscopio electrónico JEOL 1200 EXII que operaba a 100 kV a una ampliación nominal de x40.000.

Criomicroscopía electrónica

Se dispusieron las muestras (gotas de 5 \mul), o las fracciones que contenían los viriones o las cápsidas HT-VP2-466 sobre rejillas recubiertas de carbón, se lavaron dos veces con gotas de agua, se secaron por absorción (blot) y el conjunto se sumergió en un baño de etano líquido siguiendo los procedimientos establecidos, esencialmente tal como describen Castón et al. (Castón et al. 2001. C terminus of infectious bursal disease virus major capsid protein VP2 is involved in definition of the T number for capsid assembly. J Virol 75, 10815-10828). Las micrografías se registraron bajo unas condiciones de exposición mínimas de modo que los especímenes captados recibieron exposiciones de 6-10 e^{-}/nm^{2}, a ampliaciones nominales de x50.000 en un microscopio electrónico Tecnai G2 que operó a 200 kV y estaba equipado con un dispositivo de emisión de campo. Se vitrificó el bacteriófago T4 y el espaciado axial de 40,5 \ring{A} de su vaina de cola se usó como patrón interno de magnificación.

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Espectroscopía de dicroísmo circular (DC)

El péptido FGFKDIIRAIRRI (Seq. ID. No. 11) se sintetizó químicamente, y su espectro de DC en UV lejano se almacenó in un dicrógrafo Jasco, usando células de tamaño 0,1 a 1 mm a 25°C. Cada espectro es la acumulación de 3 escáneres. Las concentraciones de péptidos usadas son de 10 a 200 \muM. El espectro de DC se analizó según se ha descrito previamente por Jiménez, 1999 (Jiménez et al., 1999. Helicity of alpha (404-451) and beta (394-445) tubulin C-terminal recombinant peptides. Protein Sci 8, 788-799) (Figura 4A).

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Análisis de imagen

Las operaciones de procesado de imagen generales se llevaron a cabo utilizando un sistema de software PIC (Trus et al. 1996. Digital image processing of electron micrographs: the PIC system-III. J Struct Biol 116, 61-67). Las micrografías se valoraron en cuanto a su resolución y astigmatismo por un análisis de Fourier. El valor de sub-foco de las micrografías electrónicas seleccionadas permitió las reconstrucciones de las estructuras a una resolución dentro del primer cero de la función de transferencia de contraste (CTF) del microscopio electrónico. Para las micrografías seleccionadas analizadas (81 de las IBDV, 82 para las cápsidas HT-VP2-466), los valores de sub-foco, determinados con el paquete Bsoft (Heymann, 2001), oscilaron de 0,6 a 3,7 \muM (CTF a espacios de 12-30 \ring{A}, respectivamente). Las micrografías se adquirieron con un escáner Zeiss PhotoScan TD a 7 \mum/pixel y binned para producir 21 \mum pixels (4,2 \ring{A} en la muestra. Las partículas proteicas se extrajeron y se pre-procesaron usando el procedimiento automatizado de Conway et al. (Conway et al., 1993. The effects of radiation damage on the structure of frozen hydrated HSV-1 capsids. J Struct Biol 111, 222-233). Las primeras estimaciones de las orientaciones angulares de las partículas se determinaron por los procedimientos de "líneas comunes" en las transformadas de Fourier (PTF) (Baker and Cheng, 1996. A model-based approach for determining orientations of biological macromolecules imaged by cryoelectron microscopy. J Struct Biol 116, 120-130), tomando como modelo de partida el 3DR del IBDV, a escala aproximada, a 28 \ring{A} de resolución. Se calculó un nuevo mapa de densidad y éste se usó para todos los refinamientos de orientación y de origen de fase subsiguientes, usando una versión modificada del algoritmo PTF de forma que se pueden usar ambas, información de fase y amplitud.

Para la reconstrucción de la cápsida pequeña de VP2 se utilizaron sólo procedimientos basados en modelo, y como modelo de partida se usó otra cápsida pequeña de VP2 extraída de la cápsida grande de VP2. Como control interno, se calculó su estructura tridimensional sin imponer la simetría icosaédrica usando un método de retroproyección ponderada y distribuyendo las orientaciones a lo largo de todo el espacio de orientación seleccionando al azar vistas equivalentes que se relacionaron con los originales por simetría. El mapa de densidad resultante fue similar al obtenido con el método basado en la simetría icosaédrica pero a una resolución más baja (datos no mostrados). Las fases de corrigieron para la función de transferencia de contraste (CTF) mediante simple transposición de las fases de los lóbulos requeridos de la CTF. Las reconstrucciones se calcularon utilizando las técnicas de Fourier-Bessel (Crowther, 1971. Procedures for three-dimensional reconstruction of spherical viruses by Fourier synthesis from electron micrographs. Phil Trans R Soc Ser B 261, 221-230). Las reconstrucciones finales combinaban 10.849 y 1.557 imágenes para IBDV y cápsidas HT-VP2-466, y las resoluciones obtenidas mediante el criterio de correlación de Fourier de la envuelta (0,5 de umbral) de 12 y 15 \ring{A}, respectivamente. Otra reconstrucción para cápsidas más pequeñas de HT-VP2-466 se calculó a partir del mismo set de micrografias. La resolución de la reconstrucción final, que contenía 108 partículas, se estimó en 23 \ring{A} aproximadamente, según la estimación obtenida por el análisis FSC (Convay et al., 1993. The effects of radiation damage on the structure of frozen hydrated HSV-1 capsids. J Struct Biol 111, 222-233).

Los perfiles de densidad radial cuantificadas esféricamente se calcularon para ambos mapas de T=13, y fueron normalizados y llevados a escala para solapar ambos perfiles. Los mapas se obtuvieron entonces por la diferencia de ambos y cambiando el orden de los dos mapas. Para traducir los resultados de ambos mapas (ver Figuras 8E y 8F), se filtraron pequeñas islas de densidades, solamente considerando las mayores diferencias en radios correspondientes a la envuelta proteica.

II. Resultados Mutantes de deleción del extremo C-terminal de la proteína pVP2 que presentan un His-tag en su extremo N-terminal

Dado que el procesamiento del extremo C-terminal la proteína pVP2 (512 aminoácidos) que da lugar a la proteína VP2 (441 aminoácidos) no se produce al expresarse en baculovirus recombinantes, se han expresado diferentes construcciones de pVP2 en dicho sistema que varían en la longitud del extremo C-terminal. Para cubrir uniformemente dicha región, se han seleccionado las posiciones 456, 466, 476, 487, 494 y 501 (Figura 3A). El análisis por Western blot de estas variantes de pVP2/VP2 muestra que todos los mutantes de pVP2 con las deleciones del C-terminal se expresan correctamente, dando lugar a una banda mayoritaria (Figura 1). Se han generado también las mismas series de mutantes de pVP2/VP2, fusionados en su extremo N-terminal a un His-tag (HT-VP2). Los pesos moleculares de dichas variantes de PVP2/VP2 se presentan en la Tabla 2.

TABLA 2 Peso molecular (kDa) de las variantes de pVP2/VP2

3

Las variantes pVP2/VP2 se expresaron a niveles elevados y se purificaron mediante un colchón de sacarosa seguido de un gradiente de sacarosa. Las fracciones obtenidas del gradiente se caracterizaron por electroforesis SDS-PAGE. Los geles teñidos con azul de Coomassie mostraron que las fracciones que contenían las variantes de pVP2 presentaban un rango de bandas muy amplio (Figuras 3B, 3C). Con el objetivo de comparar dichos resultados, se purificaron las proteínas de fusión obtenidas a partir de células infectadas con IBDV siguiendo la estrategia descrita anteriormente (Figura 3D). Mientras que los mutantes de pVP2 que no contenían el His-tag mostraron una organización heterogénea (Figura 3B), las proteínas de fusión de pVP2/VP2 que conteían el His-tag se organizan de forma que incrementan su tamaño a medida que aumenta la longitud del dominio C-terminal (Fig 3C).

Análisis por microscopía electrónica de los ensamblajes pVP2/VP2

Los análisis de las diferentes fracciones proteicas obtenidas a partir del gradiente de sacarosa, que se tiñen negativamente por microscopía electrónica, mostraron una morfología distinta dependiendo de la longitud del extremo C-terminal de la pVP2 y de la presencia o ausencia del His-tag.

VP2-441 (Figura 4A) y VP2-456 (Figura 4B) dieron lugar a unas estructuras de ensamblaje a modo de donut, de aproximadamente 23 nm de diámetro, que corresponde al de cápsidas dodecaédricas con una simetría T=1. Dependiendo del tipo de ensamblaje VP2-466 que se forme, así se sitúa la variante a través del gradiente de sacarosa. Las fracciones inferiores contenían tubos delgados con un diámetro de aproximadamente 25 nm (Figura 4C), ordenados de forma regular con una morfología helicoidal (Figura 4C, recuadro). Las fracciones del medio mostraron unos tubos delgados más cortos con cápsidas de simetría similar a T=1 rodeadas de material irrumpiendo las mismas, indicando que probablemente esta simetría es muy inestable (Figura 4D). Ocasionalmente también se observaron simetrías similares a T=13 (Figura 4D, recuadro). Las estructuras predominantes en la parte superior del gradiente eran pequeñas partículas isométricas (Figura 4E). VP2-476 se comporta de forma similar a VP2-466. La mayoría de las VP2-501 migraban hacia fracciones en la mitad-fondo del gradiente y se ensamblan en tubos de aproximadamente 35 nm de diámetro parcialmente ordenados (Figura 4F). En la parte mitad-superior del gradiente, VP2-501 se ensambla en una estructura de túbulos girados y algunas partículas de forma isométrica con un tamaño irregular. Finalmente, VP2-512 se vio como túbulos cortos curvados y como partículas irregulares.

En las células infectadas por IBDV, la mayoría de las estructuras purificadas se localizaban en la mitad del gradiente y se corresponden con una partícula icosaédrica de un diámetro de 65-70 nm (Figura 4H). Sin embargo, cerca del fondo del gradiente, se encontraron estructuras de forma tubular con una organización hexagonal, llamados tubos de tipo I (Figura 4G).

Todos estos resultados en conjunto muestran que VP2-466 contiene información suficiente para la formación de cápsidas tipo hexámero (tubo delgado) y pentámero (cápsida T=1), de forma esporádica se encontraron cápsidas con ensamblaje de T=13.

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Análisis por microscopía electrónica de los ensamblajes (His-) pVP2/VP2

De forma similar, se analizaron los ensamblajes de las proteínas de fusión HT-pVP2/VP2. En las fracciones de enriquecimiento de HT-VP2-441, se observó la aparición de partículas de 23 nm de diámetro (Figura 5A). El mutante HT-VP2-456 produjo ensamblaje de estructuras de morfología similar a verdaderas cápsidas infecciosas T=13 (comparar Figuras 5B y 4H), que migraban a la mitad del gradiente. La mayoría de las HT-VP2-456, cápsidas T=1, se localizaron en la parte superior del gradiente. La tendencia a formar cápsidas correctas se mejoró con la proteína HT-VP2-466 (Figura 5C). Partículas con cápsidas similares a T=13 se presentaban con mayor abundancia, y, a medida que se obtenían con alta eficiencia, se fueron seleccionando para estudios estructurales de alta resolución. Las cápsidas con un tamaño medio de aproximadamente 53 nm se pudieron distinguir fácilmente de las cápsidas T=13 (Figura 5C, flechas).

Las proteínas de fusión HT-VP2-476 (Figuras 5D-F) y HT-VP2-487 mantuvieron la capacidad de ensamblar como cápsidas con estructura similar a los virus, aunque con una menor eficiencia. Las estructuras predominantes eran los tubos hexagonales de longitudes variables (Figura 5D). Finalmente, las proteínas HT-VP2-494, HT-VP2-501 y HT-VP2-512, formaron solamente estructuras tubulares con un ordenamiento aparentemente hexagonal.

El extremo N-terminal His-tag de las diferentes proteínas pVP2/VP2 no afectó al ensamblaje de las subunidades en partículas regulares. En ausencia de la proteína VP3, el otro componente mayoritario de las cápsidas, HT-VP2-456 permitió el ensamblaje correcto de estructuras con simetría similar a cápsidas T=13.

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Análisis del dicroísmo circular de los aminoácidos 443-452 del dominio C-terminal de pVP2

La estructura secundaria del péptido GFKDIIRAIR (Seq. ID. No 16), que corresponde a los aminoácidos 443-452 del extremo C-terminal de la proteína pVP2, se predijo mediante el programa informático Agadir (Muñoz y Serrano, 1994. Elucidating the folding problem of helical peptides using empirical parameters. Nat Struct Biol 1, 399-409). Dicho programa detectó una marcada tendencia helicoidal en el péptido, que daba lugar a una \alpha-hélice anfipática (Figura 10B, izquierda). Para contrastar esta predicción, se sintetizó un péptido sintético, aminoácidos 442-454, y se analizó la media de la estructura secundaria por dicroísmo circular. En un tampón acuoso, el péptido presentaba una estructura helicoidal insignificante, de forma que adoptaba una conformación de enrollamiento aleatoria. Cuando se añade trifluoroetanol (TFE) que es un solvente inductor de hélices resultaba en la formación de un componente claramente helicoidal (Figura 2). Para comprobar si se pueden encontrar péptidos similares en estructuras conocidas, se realizó una búsqueda en la base de datos PDB (Protein Data Base) con WHATIF (http://www.cmbi.kun.nl/gv/wahtif) y se encontró dicho péptido en los aminoácidos 241-250 de la isomerasa triosa-fosfato de Leishmania mexicana (Lm TIM) (Williams et al., 1999. Structural and mutagenesis studies of leishmania triosephosphate isomerase: a point mutation can convert a mesophilic enzyme into a superstable enzyme without losing catalytic power. Protein Eng 12, 243-250). Cuando se compara dicha secuencia, EFRDIIDATR (Seq. ID. No 17), con los diez aminoácidos de pVP2, se observa que el carácter anfipático es casi idéntico: hay un cambio conservacional (R por K), una sustitución de D por R, que cambia la polaridad manteniendo un lado de la cadena cargado, y un cambio de T por I.

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Estructura de la cápsida de IBDV

Una criomicrografia de las partículas de IBDV muestra claras zonas dentadas periféricas (Figura 6A). El mapa de densidad final de la cápsida T=13 se calculó con una resolución de 12 \ring{A}. La arquitectura molecular de la cápsida es esencialmente como la descrita por Böttcher et al. (Böttcher et al., 1997. Three-dimensional structure of infectious bursal disease virus determined by electron cryomicroscopy. J Virol 71, 325-330) en la que la característica principal es la presencia de 260 trímeros de VP2 que sobresalen de una envoltura continua y que están organizados en cinco tipos de conformaciones diferentes (Figura 6B a-e). En la cara interna hay 200 protuberancias triméricas internas con forma de Y. La mejora en la resolución permitió identificar un número de detalles estructurales de forma más fina y precisa, particularmente, en los cinco ejes de la cápsida interna. De esta manera, los 60 trímeros internos ausentes, cinco por pentámero, se reemplazan por dos bordes anulares. Mientras que el borde más exterior está formado por diez densidades globulares íntimamente conectadas, el borde interno está formado por cinco glóbulos, tal como se había predicho (Figura 9). Otro aspecto relevante concierne al la apariencia porosa de la envoltura capsular. Estos poros (616 en total) tienen un diámetro de aproximadamente 15 \ring{A}, y se sitúan exactamente bajo conexiones de densidad, llamados brazos conectores, entre trímeros adyacentes en la cara externa.

Estructura de la cápsida His-VP2-466

El análisis por criomicroscopía electrónica de las fracciones ricas en partículas pseudovirales muestra que las cápsidas de VP2-466 están formadas por una mezcla compleja de diferentes cápsidas, pero de ensamblaje similar (Figura 7A). Estas cápsidas tienen un tamaño aproximado que varía de 65 nm (similares a las cápsidas de IBDV T=13) a 53 nm, con una variación también de ensamblajes isométricos menores. Todas estas estructuras mostraron las mismas zonas dentadas periféricas. La 3DR de las cápsidas HT-VP2-466 se determinó con una resolución de 15 \ring{A} (Figura 7B, izquierda y centro). Las caras externas de las cápsidas de IBDV y de HT-VP2-466 son casi superponibles, mientras que las caras internas mostraron diferencias aparentes. La mayor diferencia estructural está relacionada con los ejes de simetría de orden cinco y seis, donde se observa una densidad extra que conecta la estructura del trímero con forma de Y en la cápsida HT-VP2-466, y no en la de IBDV.

El mapa de densidad de las cápsidas de tamaño intermedio HT-VP2-466 mostraban una simetría T=7 (Figura 7B, derecha), la cual se basó en una equivalencia con los capsómeros triméricos como los de las T=13, excepto por el requerimiento de sólo tres clases diferentes de capsómeros triangulares (llamados a', b' y c'). Las cápsidas T=13 y T=7 comparten el mismo bloque trimérico fundamental del HT-VP2-466 en el entramado icosaédrico.

Comparación estructural y bioquímica de las cápsidas de IBDV y HT-VP2-466

Tanto en los perfiles de densidad radial (Figura 8A) como en las secciones transversales centrales (Figuras 8C y 8D) de las cápsidas de IBDV y de HT-VP2-466 se encontraron similitudes estructurales, las cuales son prácticamente superponibles. Se han encontrado dos diferencias menores en la cubierta proteica (radio aproximado 253 \ring{A} - 350 \ring{A}) (Figura 8A, flechas). Se ha observado un pico de densidad extra en la cara interior de la cápsida de IBDV, situada principalmente en un radio de 325 \ring{A} - 345 \ring{A}, y otra en la cápsida del HT-VP2-466 en su cara interior (en un radio de 268 \ring{A} -
285 \ring{A}). Para localizar de forma más precisa dichas diferencias, se han calculado mapas de diferencias mediante sustracción arimética de los valores de densidad de la cubierta proteica en ambas estructuras. Alternando el orden de sustracción en los dos mapas, los mapas resultantes mostraron sólo aquellas diferencias estructurales que podían atribuirse a cada estructura (Figuras 8E y 8F). La localización de las diferencias estructurales en la cara externa de la cápsida de IBDV muestra que las regiones con mayores diferencias se encuentran en los brazos conectores entre los trímeros VP2 adyacentes. Las diferencias estructurales a lo largo de la cara interna se encuentran principalmente en los ejes
de simetría de orden cinco y seis, donde precisamente se localizan las densidades internas de la cápsida HT-VP2-466.

La tinción de los geles de SDS-PAGE con azul de Coomassie mostró que las fracciones enriquecidas de partículas virales contienen como componentes mayoritarios pVP2/VP2 y VP3 (Figura 8B), comprendiendo casi un 90% de la proteína total. Un análisis equivalente de las fracciones usadas para obtener los datos de criomicroscopía electrónica de las cápsidas HT-VP2-466 mostró que dichas cápsidas están constituidas por un único polipéptido de aproximadamente 54 kDa. Como las diferencias mínimas a nivel de la cubierta proteica no se pueden tener en cuenta para ver las diferencias con la VP3, los resultados obtenidos implican que ambas cápsidas son construidas a partir de una única proteína, VP2, o su variante His-tag, para las cápsidas de IBDV e HT-VP2-466, respectivamente, así como que la VP3 no se incorpora como un componente integral de la cápsida de IBDV.

Análisis de cuasi-equivalencia en una cápsida T=13

Se debe considerar un nuevo escenario para la cápsida de IBDV, ya que ésta debe considerarse como una cápsida cuasi-equivalente. Para confirmar esta hipótesis y valorar convenientemente las características equivalentes de las cápsidas de IBDV y de HT-VP2-466, se compararon mapas de alineamiento de secciones icosaédricas de dichas cápsidas (Figura 9). Las secciones más exteriores (de 328 a 311 \ring{A}) mostraron que las unidades triméricas eran básicamente idénticas (Figuras 9A, 9B y 9C). Además, en (302 a 294 \ring{A}), es evidente la cápsida continua y se aprecian diferencias mínimas (Figuras 9D y 9E). En un radio de 286 \ring{A}, las secciones correspondientes al comienzo de la capa interna de ambas cápsidas de T=13 mostraron que las 260 unidades triméricas internas presentan una clara continuidad con otras 260 unidades triméricas internas, incluidas aquellas alrededor del eje de simetría de orden 5 (Figura 9F). Los trímeros pentaméricos se empaquetan más estrechamente entre ellos que los hexaméricos, y aparecen fusionados en un radio a 277 \ring{A}, donde son visibles densidades extra en ejes de simetría del orden 6 de la cápsida del HT-VP2-466 (Figura 9G). A 269 \ring{A} de radio, son evidentes densidades extra en ejes de simetría del orden 6 (Figura 9H).

Discusión

En la presente invención se ha analizado el poliforfismo conformacional de la proteína de mayor abundancia en IBDV, la proteína VP2. VP2 se sintetiza inicialmente como un precursor de 512 aminoácidos, pVP2 (Seq. ID. No. 15), el cual sufre varios procesamientos en su extremo C-terminal para dar lugar a la proteína madura VP2 (441 aminoácidos). La mayoría de los mutantes expresados en el sistema de baculovirus desarrollado en esta invención podrían corresponder por lo tanto a intermediarios ocurridos naturalmente durante el proceso de ensamblaje del virus. El mecanismo molecular responsable del control de los polimorfismos reside en una secuencia de 71 aminoácidos temporalmente unida al extremo C-terminal y que es eliminada cuando completa su función. En ausencia de VP3, se requiere de la presencia de un His-tag en el extremo N-terminal de la proteína VP2 para su correcto ensamblaje, indicando que este His-tag reproduce la función de la proteína VP3 durante el ensamblaje. El control del ensamblaje del complejo de la cápsida de IBDV T=13 requiere por lo tanto de la interacción de dos elementos polipeptídicos por separado y que pueden ser desconectados en el sistema de la presente invención.

Los resultados de la presente invención indican que el controlador molecular del cambio de la proteína VP2 (Seq. ID. No. 15) se localiza en el segmento 443-GFKDIIRAIR-453 (Seq. ID. No 16), el cual está organizado en forma de hélice \alpha. El mutante HT-VP2-456 de la invención representa la frontera entre la formación en la VP2 de una única conformación o múltiples conformaciones. Si las unidades de ensamblaje son más cortas, como en el caso de HT-VP2-441, sólo se producen estructuras pentaméricas (cápsidas T=1), mientras que si se incluyen los aminoácidos 443-452, se forman tanto cápsidas T=13 como cápsidas T=1.

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Ejemplo 2 Caracterización de la inmunogenicidad de las QVLPs-pVP2* de IBDV

Para evaluar la inmunogenicidad de las QVLPs-pVP2-456 obtenidas en el Ejemplo 1 se realizó un ensayo de inmunización en pollos de 1 día. Brevemente, un grupo de 7 animales SPF (libre de patógenos específicos) fue inmunizado por vía intramuscular con una única dosis de 200 \mul conteniendo 10 \mug de QVLPs-pVP2-456/animal diluidas en PBS. Un grupo similar fue inyectado con PBS. Se realizaron extracciones semanales de suero de cada uno de los animales de ambos grupos. Los sueros de cada grupo y fecha fueron mezclados para obtener un suero homogéneo (pool) representado por volúmenes equivalentes de cada individuo del grupo. Los sueros fueron analizados mediante ELISA. Para ello, los pocillos fueron tapizados con 10 ng de QVLPs-pVP2-456. Los ensayos fueron realizados según un protocolo previamente descrito (Current Protocols in Immunology. Edited by: Bierer, Coligan, Margulies, Shevach, Strober, John Wiley & Sons \underbar{http://www.interscience.wiley.com/c\_p/index.htm}). Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que una única inmunización en ausencia de adyuvante produce una potente respuesta frente a la proteína pVP2-456. Resultados similares se obtuvieron cuando se ensayaron otras QVLPs-pVP2* obtenidas en el Ejemplo 1. Asimismo, se obtuvieron resultados similares cuando se ensayaron otras VLPs, tanto quiméricas (QVLPs) como no quiméricas, conteniendo VP2 de IBDV descritas en las solicitudes de patentes españolas P200300751, P200400120 y P200400121.

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Ejemplo 3 Obtención de QVLPs-pVP2* (pVP2*-BT) en levaduras

Con el fin de estudiar la posibilidad de obtener QVLPs-pVP2* de IBDV en cultivos de levadura (S. cerevisiae) se generó el plásmido de expresión pESCURA/pVP2-456-BT con el gen heterólogo que codifica para el péptido quimérico de FMVD denominado BT (Zhang, Q. et al., 2002, Acta Virologica 46(1):1-9) unido al extremo N-terminal de pVP2-456. Dicho péptido quimérico BT comprende el epítopo de las células B (localizado entre las posiciones 133-159 de la proteína VP1 del aislado español, serotipo C, de FMDV) y el epítopo de células T (localizado entre las posiciones 20-34 de la proteína VP4 de FMDV, serotipo Asia). La secuencia de aminoácidos del epítopo de las células B es SIINNYYMQQYQNSM (SEQ ID No 12), mientras que la secuencia de aminoácidos del epítopo de las células T es MTTTYTASARGDLAHLTTTHARHLP (SEQ ID No 13).

El primer paso en la construcción del plásmido de expresión se realizó mediante el clonaje de la región codificante de la proteína pVP2-456 en el vector pESCURAinv. El plásmido pESCURAinv se generó mediante digestión del vector pRS426 (Stratagene) con el enzima PvuII y religación de la mezcla de digestión. El vector resultante, pESCURAinv, contiene la región de clonaje múltiple en posición invertida con respecto a la del vector parental pRS426. El fragmento de DNA correspondiente a la proteína pVP2-456 se obtuvo mediante PCR con los oligonucleótidos correspondientes (Tabla 1) empleando como molde el plásmido pVOTE.2/Poly (Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF Al of infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054). El fragmento fue purificado, sometido a digestión con los enzimas BglII y HindIII y clonado en el vector pESCURA.inv previamente digerido con los enzimas BamHI y HindIII. El plásmido resultante se denominó pESCURA/pVP2-456.

Un fragmento de DNA que contenía la fase de lectura abierta correspondiente a dicho péptido quimérico BT de FMDV fue clonado en el plásmido pESCURA/pVP2-456 previamente digerido con los enzimas de restricción apropiados. El plásmido resultante se denominó pESCURA/pVP2-456-BT y contiene las ORFs de la proteína pVP2-456 de IBDV y del péptido quimérico BT de FMDV.

Posteriormente, dicho plásmido pESCURA/pVP2-456-BT fue utilizado para transformar un cultivo de la levadura S. cerevisiae haploide cepa 499 según un protocolo previamente descrito (Gietz, R.D. and R.A. Woods. (2002) Transformation of yeast by the Liac/SS carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96). Las levaduras transformadas con el plásmido fueron seleccionadas mediante crecimiento en placas de medio SC (CSM + YNB, glucosa 2% y bacto agar) suplementadas con los aminoácidos triptófano, leucina e histidina y carentes de uracilo (-Ura). Tras una incubación de 48 h a 30°C, se seleccionó una colonia que fue empleada para la realización de los subsiguientes análisis de expresión de proteínas y formación de QVLPs-pVP2-456-BT.

El análisis de la expresión de las proteínas pVP2-456 y BT y formación de QVLPs se realizó siguiendo un protocolo descrito previamente para la caracterización de VLPs de IBDV en otros sistemas de expresión (Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054; Lombardo, E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73, 6973-698). La colonia seleccionada fue cultivada en medio liquido CSM (-Ura) + YNB suplementado con rafinosa al 2%. El cultivo se incubó a 30°C durante 24 h. Este cultivo fue empleado para inocular, a una densidad óptica (D.O.) de 0,2, un matraz de 200 ml de medio CSM (-Ura) + YNB suplementado con el inductor galactosa al 2%. El cultivo fue mantenido a 30°C durante 18 horas (hasta una D.O. entre 1,0 y 2,0). Las levaduras fueron centrifugadas a 3.000 rpm, 5 min a 4°C, se lavaron con agua destilada 1 vez, y el pellet fue resuspendido en tampón de lisis (TEN: Tris 10 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM) + inhibidores de proteasas 2X (Compl Roche). Para la lisis se añadió 1 volumen de "glass beads" (cuentas o perlas de vidrio) de un tamaño aproximado de 425-600 micrones (Sigma). Esta mezcla fue sometida al vortex vigoroso durante 30 segundos 4 veces, con intervalos de 30 segundos, y todo ello a 4°C. Tras ello se recuperó la fracción soluble por centrifugación de la mezcla de lisis a 13.000 rpm durante 15 min a 4°C. Esta muestra fue sometida a fraccionamiento en un gradiente de sacarosa de acuerdo al protocolo previamente descrito (Lombardo, E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73, 6973-6983). Las muestras obtenidas tras el fraccionamiento así como una muestra del material de partida fueron analizadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) [Current Protocols in Molecular Biology] e inmunodetección por Western blot empleando sueros anti-pVP2-456 y anti-BT [Current Protocols in Molecular Biology]. El Western blot reveló la presencia de bandas, con la masa molecular predicha correspondiente a las proteínas pVP2 (48 kDa) y BT (Figura 11). Estos resultados ponen de manifiesto la correcta expresión de ambos péptidos en el cultivo de S. cerevisiae transformado con el plásmido pESCURA/pVP2-456-BT. A continuación, las distintas fracciones del gradiente fueron analizadas mediante TEM como se ha descrito previamente (Lombardo, E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73:, 6973-6983). El análisis mediante TEM de las fracciones del gradiente reveló la existencia de QVLPs-VP2-456-BT (datos no mostrados).

<110> BIONOSTRA S.L., CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

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<120> PARTÍCULAS PSEUDOVIRALES VACÍAS QUIMÉRICAS DERIVADAS DEL VIRUS CAUSANTE DE LA ENFERMEDAD DE LA BURSITIS INFECCIOSA (IBDV), PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y APLICACIONES

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<130> P200501733

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<140> P200501733

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<141> 2005-07-15

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<160> 17

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 35

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador 5'-VP2

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<400> 1

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4

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<210> 2

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador NotI-441

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<400> 2

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5

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<210> 3

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador HindIII-456

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<400> 3

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6

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<210> 4

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador HindIII-466

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<400> 4

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7

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<210> 5

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador HindIII-476

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<400> 5

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8

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<210> 6

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador HindIII-487

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<400> 6

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9

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<210> 7

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador HindIII-494

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<400> 7

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10

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<210> 8

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador HindIII-501

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<400> 8

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11

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<210> 9

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador HindIII-512

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<400> 9

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12

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<210> 10

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<211> 28

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia extra tag

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<400> 10

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\hskip0.5cm13

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<210> 11

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Péptido sintético

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<400> 11

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\hskip0.5cm14

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<210> 12

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> secuencia de aminoácidos del epítopo de las células B

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<400> 12

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\hskip0.5cm15

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<210> 13

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> secuencia de aminoácidos del epítopo de las células T

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<400> 13

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\hskip0.5cm16

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<210> 14

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<211> 1536

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> secuencia de nucleotidos de IBDV Soroa pVP2

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<400> 14

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17

18

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<210> 15

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<211> 512

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> secuencia de aminoácidos de IBDV Soroa pVP2

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<400> 15

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19

20

21

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<210> 16

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido sintético

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<400> 16

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\hskip0.5cm22

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<210> 17

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Péptido Sintético

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<400> 17

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\hskip0.5cm23

Claims (37)

1. Una proteína de fusión que comprende una región A constituida por la proteína pVP2 del virus de la bursitis infecciosa (IBDV) o un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, unida al menos a una región B constituida por un polipéptido heterólogo.

2. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha región A está constituida por la proteína pVP2 de IBDV.

3. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha región A está constituida por un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV seleccionado del grupo formado por:

(i)

pVP2-441, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 441 de la proteína pVP2 de IBDV;

(ii)

pVP2-452, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 452 de la proteína pVP2 de IBDV;

(iii)

pVP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína pVP2 de IBDV;

(iv)

pVP2-466, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 466 de la proteína pVP2 de IBDV;

(v)

pVP2-476, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 476 de la proteína pVP2 de IBDV;

(vi)

pVP2-487, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 487 de la proteína pVP2 de IBDV;

(vii)

pVP2-494, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 494 de la proteína pVP2 de IBDV; y

(viii)

pVP2-501, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 501 de la proteína pVP2 de IBDV.

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4. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha región B está unida a la región amino-terminal de dicha proteína pVP2 de IBDV o de dicho fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV.

5. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha región B está unida a la región carboxilo-terminal de dicha proteína pVP2 de IBDV o de dicho fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV.

6. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido heterólogo comprende al menos un polipéptido de interés útil en vacunación, terapia o diagnóstico.

7. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha región B comprende un único polipéptido de interés.

8. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha región B comprende dos o más polipéptidos de interés.

9. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión comprende una región A unida a una única región B.

10. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión comprende una región A unida a dos regiones B, iguales o diferentes, estando una de dichas regiones B unida a la región amino-terminal de la proteína pVP2 de IBDV o de dicho fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV presente en la región A y estando la otra región B unida a la región carboxilo-terminal de la proteína pVP2 de la proteína pVP2 de IBDV o de dicho fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV presente en la región A.

11. Proteína según la reivindicación 10, en la que dichas regiones B contienen unos polipéptidos de interés iguales o diferentes entre sí.

12. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión comprende, además, un polipéptido espaciador situado entre dichas regiones A y B.

13. Una partícula pseudoviral vacía quimérica que comprende al menos una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Un ácido nucleico caracterizado porque su secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucléotidos que codifica para la proteína de fusión definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. Un cassette de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción.

16. Cassette de expresión según reivindicación 15 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico se encuentra operativamente unida a elementos de control de traducción.

17. Un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14.

18. Vector según la reivindicación 17, caracterizado porque dicho vector se selecciona entre plásmidos, bácmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACS), cromosomas artificiales de bacteria (BACs), cromosomas artificiales basados en el bacteriófago P1 (PACs), cósmidos, o virus.

19. Vector según reivindicación 18 caracterizado porque contiene un origen de replicación heterólogo.

20. Una célula hospedadora que contiene una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14, o un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, o un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 17-19.

21. Una célula hospedadora transformada por una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14.

22. Una célula hospedadora transformada, transfectada o infectada con un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 17-19.

23. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 20-22, caracterizada porque se selecciona entre una célula de mamífero, una célula aviar, una célula de insecto y una levadura.

24. Un procedimiento para la producción de partículas pseudovirales vacías quiméricas según la reivindicación 13, que comprende cultivar una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 20-23.

25. Procedimiento según reivindicación 24 caracterizado porque adicionalmente comprende recuperar dichas partículas pseudovirales vacías quiméricas.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24-25, en el que dicha célula hospedadora es una célula de insecto, que comprende (i) cultivar células de insecto infectadas con un baculovirus recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteína de fusión y su ensamblaje para formar partículas pseudovirales vacías quiméricas, QVLPs-pVP2* de IBDV, según la reivindicación 13.

27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24-25, en el que dicha célula hospedadora es una levadura, que comprende las etapas (i) cultivar levaduras transformadas con un vector recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteína de fusión y su ensamblaje para formar partículas pseudovirales vacías quiméricas, QVLPs-pVP2* de IBDV, según la reivindicación 13.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 26-27 que adicionalmente implica aislar dichas QVLPs-pVP2* de IBDV.

29. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 26-28 que adicionalmente comprende purificar dichas QVLPs-pVP2* de IBDV.

30. Empleo de un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, para la producción y obtención de partículas pseudovirales vacías quiméricas según la reivindicación 13.

31. Empleo de partículas pseudovirales vacías quiméricas según la reivindicación 13, en la elaboración de una composición farmacéutica.

32. Empleo según la reivindicación 31, en el que dicha composición farmacéutica es una vacuna, un vector para terapia génica o un sistema para el suministro de sustancias activas.

33. Una vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de partículas pseudovirales vacías quiméricas según la reivindicación 13.

34. Vacuna según reivindicación 33 que adicionalmente comprende uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

35. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33-34, útil para proteger animales y humanos simultáneamente frente a la infección causada por dos o más agentes infecciosos causantes de enfermedades.

36. Un vector para terapia génica que comprende una partícula pseudoviral vacía quimérica según la reivindicación 13.

37. Empleo de una partícula pseudoviral vacía quimérica según reivindicación 13 en la elaboración de un sistema de suministro de sustancias activas que comprende dicha partícula pseudoviral y una sustancia activa.