ES2294679T3 - Capsidas vacias (vlps(vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. - Google Patents
Capsidas vacias (vlps(vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2294679T3 ES2294679T3 ES05706999T ES05706999T ES2294679T3 ES 2294679 T3 ES2294679 T3 ES 2294679T3 ES 05706999 T ES05706999 T ES 05706999T ES 05706999 T ES05706999 T ES 05706999T ES 2294679 T3 ES2294679 T3 ES 2294679T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- ibdv
- pvp2
- vlps
- baselineskip
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 title claims abstract description 185
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 40
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 238000012545 processing Methods 0.000 title description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 163
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 94
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 82
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 64
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 64
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 35
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 33
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 31
- 101500001538 Avian infectious bursal disease virus Capsid protein VP3 Proteins 0.000 claims description 26
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 26
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 18
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 9
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 9
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 claims description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 241000271567 Struthioniformes Species 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 claims description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 101100114742 Homo sapiens CPVL gene Proteins 0.000 claims 20
- 101100484716 Homo sapiens VHLL gene Proteins 0.000 claims 20
- 102100032078 von Hippel-Lindau-like protein Human genes 0.000 claims 20
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 80
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 28
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 26
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 26
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 7
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 6
- 101800001319 Capsid protein VP3 Proteins 0.000 description 5
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 4
- 101710184528 Scaffolding protein Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 4
- -1 pVP2 Proteins 0.000 description 4
- 101500001532 Avian infectious bursal disease virus Capsid protein VP2 Proteins 0.000 description 3
- 101500001537 Avian infectious bursal disease virus Protease VP4 Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108700010756 Viral Polyproteins Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 3
- CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-benzamido-3-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- QHNORJFCVHUPNH-UHFFFAOYSA-L To-Pro-3 Chemical compound [I-].[I-].S1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=CC=C1C2=CC=CC=C2N(CCC[N+](C)(C)C)C=C1 QHNORJFCVHUPNH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015930 Lon proteases Human genes 0.000 description 1
- 101710091437 Major capsid protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010023294 Protease La Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010042602 Supraventricular extrasystoles Diseases 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 101710121537 mRNA (guanine-N(7))-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007261 sc medium Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
- C12N7/045—Pseudoviral particles; Non infectious pseudovirions, e.g. genetically engineered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10023—Virus like particles [VLP]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Una cápsida vacía del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), VLP(-VP4), caracterizada porque está constituida, únicamente, por ensamblaje de proteínas pVP2 de IBDV y proteínas VP3 de IBDV.
Description
Cápsidas vacías (VLPs(-VP4)) del virus causante
de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), su procedimiento
de obtención y aplicaciones.
La invención se refiere a cápsidas virales
vacías del virus causante de la bursitis infecciosa (IBDV), con
actividad inmunogénica frente a IBDV, constituidas por las proteínas
pVP2 y VP3 de IBDV, a su producción mediante ingeniería genética y
a sus aplicaciones, en particular, en la elaboración de vacunas
frente a la enfermedad aviar denominada bursitis infecciosa causada
por IBDV y en la elaboración de vectores para terapia génica.
El virus causante de la enfermedad de la
bursitis infecciosa (IBDV), también conocida como enfermedad de
Gumboro, pertenece a la familia Birnaviridae, infecta
distintas especies aviares y es el responsable directo de una grave
enfermedad inmunosupresora causante de importantes pérdidas
económicas en la industria avícola mundial.
Las partículas de IBDV son icosaédricas, con una
simetría T=13, carecen de envuelta y están formadas por una única
capa proteica. Hasta el momento, las aproximaciones encaminadas a la
obtención un modelo atómico para las partículas de IBDV han
fracasado. Por ello, la información estructural disponible está
basada en modelos tridimensionales generados a partir de imágenes
obtenidas por criomicroscopía electrónica del virus purificado y de
VLPs. En base a esos estudios, se ha comprobado que la superficie
externa de la partícula está formada por un entramado continuo de
260 trímeros de la proteína VP2 (37 kDa) ordenados en cinco
conformaciones diferentes. La cara interna de las partículas
contiene 200 trímeros de la proteína VP3 (29 kDa), estos últimos,
independientes entre sí, se encuentran unidos a la zona basal de
los trímeros de VP2. Se ha sugerido que un tercer polipéptido, VP4
(28 kDa), también podría formar parte de las partículas, estando
situado en la base de los pentámeros que forman los vértices de la
estructura icosaédrica.
Los polipéptidos VP2, VP3 y VP4 se producen a
partir del procesamiento proteolítico de un polipéptido precursor
de un tamaño de 109 kDa. Este precursor se procesa
auto-catalíticamente liberando los polipéptidos pVP2
(48 kDa), VP3 y VP4. El dominio VP4, que se localiza en la región
central de la poliproteína, pertenece a la familia de las proteasas
Lon y es el responsable del corte proteolítico. Los polipéptidos
pVP2 y VP3 son los responsables directos del ensamblaje de las
cápsidas. El producto pVP2 sufre un último corte en su extremo
C-terminal antes de dar lugar a la forma madura de
la proteína, VP2, que es la que se encuentra en las partículas
purificadas (Da Costa, B., Chevalier, C., Henry, C., Huet, J. C.,
Petit, S., Lepault, J., Boot, H. & Delmas, B. (2002). The
capsid of infectious bursal disease virus contains several small
peptides arising from the maturation process of pVP2. Journal of
Virology 76:2393-2402). Este procesamiento de
pVP2 es necesario para la correcta formación de las cápsidas y
requiere de la presencia de VP3, aunque la proteasa responsable aún
no ha sido identificada (Maraver, A., Oña, A., Abaitua, F.,
González, D., Clemente, R., Diaz-Ruiz, A., Caston,
J. R., Pazos, F. & Rodríguez, J. F. (2003). The oligomerization
domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease
virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of
Virology 77:6438-49).
Las vacunas convecionales empleadas para el
control de la bursitis infecciosa se basan en el empleo de cepas,
con diferentes grados de virulencia, del propio IBDV crecidas en
cultivo celular o en huevos embrionados. Los extractos que
contienen el material infeccioso son sometidos a procesos de
inactivación química para producir vacunas inactivadas o bien son
empleados de forma directa para producir vacunas vivas atenuadas
(Sharma, J. M., Kim, I. J., Rautenschlein, S. & Yeh, H. Y.
(2000). Infectious bursal disease virus of chickens: pathogenesis
and immunosuppression. Developmental and Comparative
Immunology 24:223-235; van den Berg TP,
Eterradossi N, Toquin D, Meulemans G. 2000. Rev Sci Tech 2000,
19:509-543). Este último tipo de vacunas presenta
los inconvenientes clásicos asociados con el empleo de vacunas
vivas atenuadas, concretamente, el riesgo de mutaciones que
reviertan la virulencia del virus o le hagan perder su
inmunogenicidad.
Se han descrito vacunas
sub-unidad recombinantes que contienen la proteína
VP2 de IBDV expresada en diversos sistemas de expresión, por
ejemplo, bacterias, levaduras o baculovirus, normalmente en forma de
proteína de fusión. Los resultados obtenidos en ensayos de
inmunización de pollos con dichas vacunas no han sido completamente
satisfactorios.
Las cápsidas virales vacías o partículas
pseudovirales (VLPs, del inglés "virus-like
particles"), constituyen una alternativa al empleo de vacunas
vivas atenuadas y de vacunas sub-unidad
recombinantes. Las VLPs se obtienen por autoensamblaje de las
sub-unidades constituyentes de la cápsida viral y
mimetizan la estructura y propiedades antigénicas del virión nativo
aunque carecen de material genético por lo que son incapaces de
replicarse. Además de su aplicación con fines vacunales las VLPs
pueden ser utilizadas como vectores de moléculas de interés
biológico, por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos o proteínas. A
modo ilustrativo pueden citarse VLPs de parvovirus (US 6.458.362) o
del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (US 6.602.705).
La morfogénesis es un proceso vital para el
ciclo vírico que requiere de pasos sucesivos asociados a
modificaciones en los polipéptidos precursores. Por ello, los virus
han desarrollado estrategias que permiten la secuencial y correcta
interacción entre cada uno de sus componentes. Una de estas
estrategias, utilizada con frecuencia por virus icosaédricos, es la
utilización de polipéptidos provenientes de una única poliproteína
como base de sus componentes estructurales. En estos casos, el
adecuado procesamiento proteolítico de dicha poliproteína juega un
papel crucial en el proceso de ensamblaje.
En trabajos previos se ha demostrado este
principio para el ensamblaje de las cápsidas de IBDV
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79, 1047-1054).
La expresión en células eucarióticas del gen codificador para la
poliproteína de IBDV da lugar a la formación de VLPs totalmente
indistinguibles morfológica y bioquímicamente de los viriones de
IBDV. Asimismo, se ha comprobado que el ensamblaje de las cápsidas
necesita únicamente de la síntesis y del correcto procesamiento de
la poliproteína viral y es independiente de la presencia del genoma
vírico o de otras proteínas codificadas por el genoma viral tales
como VP5 y VP1.
Paralelamente a la formación de cápsidas, el
producto VP4 de IBDV es capaz de autoensamblarse en estructuras
tubulares de 20 nm de diámetro. Estos túbulos, conocidos como
túbulos de tipo II, se co-purifican parcialmente
con las partículas virales. Otros experimentos han demostrado que la
obtención de VLPs de IBDV, utilizando para la expresión de la
poliproteína baculovirus recombinantes (rBVs), es extremadamente
ineficiente obteniéndose como resultado la acumulación de grandes
cantidades de túbulos de tipo I en el citosol de las células
infectadas (Martínez-Torrecuadrada, J. L., Castón,
J. R., Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodríguez, J. F. & Casal,
J. I. (2000). Different architectures in the assembly of infectious
bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells.
Virology 278:322-331; Chevalier, C., Lepault,
J., Erk, I., Da Costa, B. & Delmas, B. (2002). The maturation
process of pVP2 requires assembly of infectious bursal disease virus
capsids. Journal of Virology 76:2384-2392).
Recientemente se ha demostrado que esto es debido al corte
proteolítico a que es sometida la proteína VP3 cuando es
sintetizada en células de insecto. Dicha proteolisis se previene
casi totalmente por la formación de complejos VP3/VP1 (Maraver, A.,
Oña, A., Abaitua, F., González, D., Clemente, R.,
Diaz-Ruiz, A., Caston, J. R., Pazos, F. &
Rodríguez, J. F. (2003). The oligomerization domain of VP3, the
scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a
critical role for capsid formation. Journal of Virology
77:6438-6449).
Por tanto, los resultados obtenidos hasta la
fecha a partir de la expresión de los genes de IBDV en distintos
sistemas recombinantes ha permitido concluir que: (i) el proceso de
ensamblaje es independiente de la presencia del material genético
del virus, (ii) para el ensamblaje sólo son necesarios los
polipéptidos codificados por el gen de la poliproteína, y (iii) el
ensamblaje requiere de una interacción coordinada entre los péptidos
pVP2 y VP3.
Sin embargo, no se conoce si la interacción
pVP2/VP3 se establece entre dominios de VP2 y VP3 de la poliproteína
precursora cuando aún no ha sufrido modificaciones, o si por el
contrario, esta interacción ocurre tras el procesamiento del
precursor. Además, la información actual no excluye la posibilidad
de que VP4 pudiera jugar un papel relevante en la morfogénesis de
la cápsida viral. De hecho, se han descrito VLPs de IBDV formadas
por ensamblaje de las proteínas VP2, VP3 y VP4 de IBDV (US
6.528.063, US 5.788.970 y JP 5194597).
Por otro lado, la información acerca de la
expresión de proteínas de IBDV mediante ingeniería genética en
distintos modelos celulares es escasa. Se ha descrito la expresión
de proteínas de IBDV en células de insecto, bacterias y levaduras.
Jagadish et al. (Jagadish MN, Vaughan PR, Irving RA, Azad AA,
Macreadie IG. (1990). Expression and characterization of infectious
bursal disease virus polyprotein in yeast. Gene
9:179-186; Macreadie IG, Vaughan PR, Chapman AJ,
McKern NM, Jagadish MN, Heine HG, Ward CW, Fahey KJ, Azad AA.
(1990). Passive protection against infectious bursal disease virus
by viral VP2 expressed in yeast. Vaccine 8:549-552)
describen la expresión de VP2 de IBDV en levaduras. Los resultados
descritos indican que la expresión de la poliproteína viral en 2
especies de levadura, Saccharomyces cerevisiae y
Saccharomyces pombe, es muy ineficiente, acumulándose una
gran variedad de productos proteicos de diferente masa molecular. El
fracaso en la obtención de productos proteicos del tamaño esperado
y la imposibilidad de detectar estructuras producidas por el
ensamblaje de éstas fue atribuido a dos posibles causas: (i) una
posible toxicidad de la proteasa de IBDV (VP4) en este sistema; y/o
(ii) la ineficiencia del sistema de expresión para llevar a cabo una
transcripción y/o traducción correcta de la poliproteína de IBDV.
Recientemente, Pitcovski et al. (Pitcovski J., Gutter B,
Gallili G, Goldway M, Perelman B, Gross G, Krispel S, Barbakov M,
Michael A. (2003). Vaccine 21:4736-4743) han
descrito la expresión de VP2 de IBDV en Pichia pastoris y la
inmunización de pollos con un material que comprende la proteína
recombinante (rVP2) en forma parcialmente purificada. En ningún caso
se ha descrito la obtención en levaduras de VLPs de IBDV.
Un trabajo previo desarrollado por los
inventores ha permitido establecer sistemas para la obtención de
VLPs de IBDV empleando diferentes vectores de expresión
eucariótica. Estos vectores han sido utilizados para la expresión
de la poliproteína de IBDV en ausencia o presencia de la RNA
polimerasa viral VP1. La caracterización bioquímica de las VLPs
purificadas demuestra que contienen las proteínas pVP2, VP2 y VP3,
cuando se expresa únicamente la poliproteína viral y las proteínas
pVP2, VP2, VP3 y VP1 cuando se realiza la expresión simultánea de
la poliproteína y la RNA polimerasa viral
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79: 1047-1054;
Martínez-Torrecuadrada, J. L., Castón, J. R.,
Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodríguez, J. F. & Casal, J. I.
(2000). Different architectures in the assembly of infectious
bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells.
Virology 278: 322-331; Maraver, A., et
al., (2003) citado supra; Lombardo, E., Maraver, A.,
Castón, J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A.,
Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1,
the putative RNA-dependent RNA polymerase of
infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid
protein VP3, leading to efficient encapsidation into
virus-like particles. Journal of Virology 73:
6973-6983). Sin embargo, no se han descrito
previamente VLPs basadas únicamente en pVP2 y VP3 de IBDV, ni su
potencial uso con fines vacunales o como vehiculizadoras de
productos biológicos de interés.
La invención se enfrenta con el problema de
proporcionar nuevas vacunas eficaces y seguras frente al virus
causante de la bursitis infecciosa (IBDV).
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que es posible obtener VLPs de IBDV correctamente
ensambladas mediante la expresión simultánea de los polipéptidos
pVP2 y VP3 de IBDV como genes independientes y como única
representación de las proteínas de IBDV en un sistema de expresión
génica. Dichas VLPs están formadas por autoensamblaje de,
únicamente, pVP2 y VP3 de IBDV, por lo que carecen de VP4 de IBDV,
y, por ese motivo, se denominan VLP(-VP4) (singular) o VLPs(-VP4)
(plural) en esta descripción. Dichas VLPs(-VP4) pueden ser
utilizadas, por ejemplo, con fines terapéuticos o de diagnóstico,
por ejemplo, en la elaboración de vacunas para proteger aves de la
infección causada por IBDV o en la elaboración de vectores para
terapia génica.
Los resultados obtenidos permiten concebir dos
nuevas conclusiones al entendimiento del patrón de ensamblaje del
IBDV: (i) las interacciones entre los polipéptidos pVP2/VP3 dan como
resultado un ensamblaje eficiente de las partículas de IBDV sin
necesidad de la expresión de la poliproteína completa, y (ii) el
polipéptido VP4 no es necesario para la formación de la
cápsida.
Estos resultados han permitido diseñar una nueva
estrategia o procedimiento para la producción eficiente de VLPs de
IBDV que contienen los elementos proteicos antigénicamente
relevantes para inducir una respuesta inmune. Esta estrategia se
basa en la utilización de un sistema o vector de expresión génica
que permite la coexpresión de los polipéptidos pVP2 y VP3 como
genes independientes y que evita la síntesis de la poliproteína
precursora de dichos polipéptidos así como la presencia del
polipéptido VP4 durante el proceso de ensamblaje de las cápsidas
virales vacías.
En una realización particular, se describe la
expresión y obtención de VLPs de IBDV, en particular, VLPs(-VP4),
en células de insecto mientras que en otra realización particular
dichas VLPs(-VP4) se obtienen en levaduras, con un rendimiento muy
elevado y con un coste económico muy bajo.
Las vacunas obtenidas utilizando dichas
VLPs(-VP4) presentan numerosas ventajas ya que, por una parte, se
evita la manipulación de material altamente infeccioso, se previene
el riesgo potencial de aparición de nuevos mutantes de IBDV y se
elimina el uso de virus vivo en las explotaciones avícolas,
previniéndose de este modo el riesgo de diseminación de cepas
vacunales de IBDV al Medio Ambiente, y, por otra parte, permite el
desarrollo de sistemas de diagnóstico diferencial para discriminar
entre animales vacunados e infectados. Estos sistemas de
diagnóstico se basan en la detección de anticuerpos frente a las
proteínas VP2 y VP4. Los animales con IBDV desarrollan una fuerte
respuesta humoral frente a ambas proteínas. Mientras que los
animales inmunizados con VLPs(-VP4) solo presentan anticuerpos
frente a la proteína VP2.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención lo constituye una cápsida viral vacía de IBDV, VLP(-VP4),
con actividad inmunogénica frente a la infección en IBDV,
caracterizada porque está constituida por autoensamblaje de,
únicamente, las proteínas pVP2 y VP3 de IBDV.
Un aspecto adicional de esta invención se
relaciona con un procedimiento para la producción de dichas
VLPs
(-VP4) de IBDV proporcionadas por esta invención, basado en la co-expresión génica de dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV como dos genes independientes.
(-VP4) de IBDV proporcionadas por esta invención, basado en la co-expresión génica de dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV como dos genes independientes.
Los ácidos nucleicos, construcciones génicas,
sistemas de expresión y células huésped desarrollados para la
puesta en práctica de dicho procedimiento de producción de dichas
VLPs(-VP4) de IBDV, así como su empleo para la producción de dichas
VLPs(-VP4) de IBDV, constituyen aspectos adicionales de la presente
invención.
Dichas VLPs(-VP4) de IBDV tienen la capacidad de
inmunizar animales, en particular, aves, frente a la enfermedad
aviar causada por el IBDV así como la capacidad de vectorizar o
vehiculizar moléculas de interés biológico, por ejemplo,
polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc. En una realización
particular, dichas VLPs(-VP4) de IBDV pueden ser utilizadas en la
elaboración de una vacuna para proteger aves frente al virus
causante de la enfermedad aviar conocida como bursitis infecciosa
(IBDV). Prácticamente cualquier ave, preferentemente aquellas
especies aviares de interés económico, por ejemplo, pollos, pavos,
ocas, gansos, faisanes, codornices, avestruces, etc., pueden ser
inmunizadas frente a la infección causada por IBDV con las vacunas
proporcionadas por esta invención. En otra realización particular,
dichas VLPs(-VP4) de IBDV pueden vehiculizar, en su interior,
productos con actividad biológica, por ejemplo, ácidos nucleicos,
péptidos, proteínas, fármacos, etc., por lo que pueden ser
utilizadas en la elaboración de vectores para terapia génica.
Por tanto, en otro aspecto adicional, la
presente invención se relaciona con el empleo de dichas VLPs(-VP4)
de IBDV, en la elaboración de medicamentos, tales como vacunas y
vectores para terapia génica. Dichas vacunas y vectores constituyen
aspectos adicionales de la presente invención. En una realización
particular, dicha vacuna es una vacuna útil para proteger aves de
la infección causada por IBDV. En una realización concreta, dichas
aves seleccionan del grupo formado por pollos, pavos, ocas, gansos,
faisanes, codornices y avestruces, preferentemente, pollos.
Figura 1. (a) El diagrama esquematiza los pasos
de procesamiento proteolítico necesarios para la formación de las
proteínas maduras de la cápsida VP2 y VP3 a partir de la
poliproteína precursora. (b) El diagrama refleja las diferentes
construcciones genéticas derivadas de la poliproteína de IBDV
descritas hasta el momento, así como las estructuras producidas
mediante su expresión en diferentes sistemas heterólogos. Los
números indican la posición correspondiente al primer y último
residuo aminoacídico de la poliproteína presente en cada una de las
construcciones. La parte inferior de la figura muestra imágenes
obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión de las
estructuras obtenidas mediante expresión de las diferentes
construcciones. La barra corresponde a 50 nm. Los datos han sido
tomados de las siguientes referencias:
Fernández-Arias et al., (1998), citado
supra; Maraver et al., (2003), citado supra;
Martínez-Torrecuadrada et al., (2000),
citado supra; Castón et al., 2001. C terminus of
infectious bursal disease virus major capsid protein VP2 is
involved in definition of the t number for capsid assembly.
Journal of Virology 75, 10815-10828.
Figura 2. Análisis microscópico de células de
insecto H5 que coexpresan pVP2 y VP3. La distribución subcelular
de las proteínas pVP2 y VP3 fue analizada mediante
inmunomicroscopía confocal. Células infectadas con los rBVs FB/pVP2
(a), FB/VP3 (b), o FBD/pVP2-VP3
(c-e) fueron incubadas con suero de conejo
anti-pVP2 y suero de rata anti-VP3.
A continuación, las células fueron incubadas con suero de cabra
anti-Ig de conejo acoplada a Alexa 488 (rojo) y con
suero de cabra anti-Ig de rata acoplada a Alexa 594
(verde). Los núcleos se tiñeron con To-Pro 3
(azul). (e) Superposición de las imágenes mostradas en los paneles
(c) y (d). Imágenes de microscopía electrónica correspondientes a
secciones de células H5 infectadas con diferentes construcciones
genéticas derivadas de la poliproteína de IBDV. (f) Imagen a baja
magnificación de una célula H5 infectada con virus FB parental. El
inserto corresponde a un detalle ampliado del área indicada por el
recuadro. (g) Imagen a baja magnificación de una célula H5
infectada con el virus FBD/pVP2-VP3. El inserto
corresponde a un detalle ampliado del área indicada por el
recuadro. (h) Imagen de alta magnificación de una célula H5
infectada con el virus FBD/pVP2-VP3 que muestra en
detalle la formación de estructuras de IBDV. (i) Imagen de alta
magnificación de una célula BSC1 infectada con el virus vacunal
recombinante VTLacOI/POLY mostrando estructuras similares a las
detectadas en el panel (h). Las barras indican 600 nm (paneles f y
g) y 200 nm (paneles h é i).
Figura 3. Caracterización estructural y
bioquímica de las estructuras derivadas de IBDV producidas en
células de insecto co-infectadas con los
baculovirus recombinantes (rBV) FB/pVP2 +
FB/his-VP3. Células
co-infectadas con los rBV FB/pVP2 y
FB/his-VP3, o infectadas con el virus
FBD/Poly-VP1 o FB/pVP2 fueron empleadas para
purificar estructuras derivadas de IBDV mediante centrifugación en
gradientes de sacarosa. Los paneles (a), (b), y (c) muestran
imágenes de microscopía electrónica de transmisión correspondientes
a la fracción 4 de los gradientes obtenidos a partir de las
infecciones con FBD/Poly-VP1,
FB/pVP2+FB/his-VP3, y FB/pVP2, respectivamente. El
panel (d) muestra los resultados de un análisis mediante Western
blot de los gradientes de sacarosa correspondientes a cultivos
infectados con FBD/Poly-VP1 y
FB/pVP2+FB/his-VP3, respectivamente. Los extractos
totales (input) y las diferentes fracciones de los gradientes de
sacarosa (la fracción F1 corresponde al fondo del gradiente) fueron
analizadas mediante Westen blot empleando sueros específicos frente
a las proteínas VP1, pVP2, VP3, y VP4 de IBDV, respectivamente. Se
indica la masa molecular en kDa de los polipéptidos
inmunoreactivos.
Figura 4. Caracterización bioquímica y
estructural de VLPs de IBDV producidas en S. cerevisiae
transformadas con el plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP. Un cultivo
de S. cerevisiae transformada con el plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP fue crecido a
30ºC en medio suplementado con el inductor galactosa. A las 18 h el
cultivo fue recogido y centrifugado. El sedimento resultante fue
procesado mediante fraccionamiento en un gradiente lineal
25-50% de sacarosa. A) Análisis bioquímico de
muestras correspondientes al sedimento antes de fraccionar (T) así
como de las diferentes fracciones del gradiente de sacarosa. Las
muestras fueron analizadas mediante SDS-PAGE y
western blot empleando anticuerpos específicos frente a las
proteínas VP3 (anti-VP3) y pVP2
(anti-pVP2). Las flechas indican las posiciones de
las bandas inmunoreactivas correspondientes a las proteínas
VP3-GFP (61 kDa) y pVP2 (48 kDa), respectivamente.
B) El análisis estructural de las muestras obtenidas fue realizado
mediante TEM. La imagen corresponde a una micrografía obtenida a
partir de una alícuota correspondiente a la mezcla de las fracciones
7, 8 y 9 del gradiente de sacarosa. La muestra fue teñida con
acetato de uranilo y observada mediante TEM. La barra corresponde a
65 nm. C) Muestra de VLPs obtenidas mediante la expresión de la
poliproteína de IBDV en células de mamífero mediante infección con
el virus vacunal recombinante VT7/Poly
(Fernández-Arias et al., (1998), citado
supra). La barra corresponde a 65 nm.
En un primer aspecto, la invención proporciona
una cápsida vacía del virus causante de la enfermedad de la
bursitis infecciosa (IBDV), en adelante VLP(-VP4) de la
invención, caracterizada porque está constituida por ensamblaje de,
únicamente, proteínas pVP2 de IBDV y proteínas VP3 de IBDV.
El término "IBDV", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a las diferentes cepas de IBDV
pertenecientes a cualquiera de los serotipos (1 ó 2) conocidos [a
título ilustrativo véase la revisión realizada por van den Berg TP,
Eterradossi N, Toquin D, Meulemans G., en Rev Sci Tech 2000
19: 509-43] y los términos "proteína pVP2 de
IBDV" y "proteína VP3 de IBDV" se refieren a las diferentes
formas de las proteínas pVP2 y VP3 representativas de cualquiera de
las mencionadas cepas de IBDV [NCBI protein databank], de acuerdo
con la definición realizada por Sánchez y Rodríguez (1999) (Sánchez
AB, Rodríguez JF. Proteolytic processing in infectious bursal
disease virus: identification of the polyprotein cleavage sites by
site-directed mutagenesis. Virology. 1999 Sep 15;
262(1):190-199) así como proteínas
sustancialmente homólogas a dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, es
decir, proteínas cuyas secuencias de aminoácidos tienen un grado de
identidad, respecto a dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, de, al
menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 80%, más
preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más preferentemente de,
al menos, un 95%.
La proteína pVP2 de IBDV presente en la
VLP(-VP4) de la invención puede ser cualquier proteína pVP2
representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, la proteína
pVP2, longitud completa, de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de acceso
AAD30136]
La proteína de VP3 de IBDV presente en la
VLP(-VP4) de la invención puede ser cualquier proteína VP3
representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, la proteína
VP3, longitud completa, de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de acceso
AAD30136].
En una realización particular, las VLPs(-VP4) de
la invención presentan un diámetro de 65-70 nm y un
contorno poligonal indistinguible de las VLPs de IBDV obtenidas en
otros sistemas de expresión (Figura 4C).
Las VLPs(-VP4) de la invención pueden obtenerse
mediante la expresión simultánea de dichas proteínas pVP2 y VP3 de
IBDV, en células huésped apropiadas. Dichas células huésped
apropiadas son células que contienen la secuencia de nucleótidos
codificante de la proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de
nucleótidos codificante de la proteína VP3 de IBDV, bien en una
única construcción génica o bien en dos construcciones génicas. En
una realización particular, dichas células huésped apropiadas son
células transformadas, transfectadas o infectadas con un sistema de
expresión adecuado, tal como un sistema de expresión que comprende
una construcción génica, en donde dicha construcción génica
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
pVP2 de IBDV y la secuencia de nucleótidos codificante de la
proteína VP3 de IBDV, o bien, alternativamente, con un sistema de
expresión que comprende una primera construcción génica que
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
pVP2 de IBDV, y una segunda construcción génica que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP3 de
IBDV.
Por tanto, en otro aspecto, la invención
proporciona un ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha
proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de nucleótidos que codifica
para dicha proteína VP3 de IBDV, en forma de 2 genes independientes.
De forma más concreta, el ácido nucleico proporcionado por esta
invención se caracteriza porque su secuencia de nucleótidos está
constituida por (i) una secuencia de nucléotidos que comprende la
fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV
y (ii) una secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura
abierta correspondiente a la proteína VP3 de IBDV. Una
característica del ácido nucleico proporcionado por esta invención
es que carece de la secuencia de nucléotidos que comprende la fase
de lectura abierta correspondiente a la proteína VP4 de IBDV. Tal
como se utiliza en esta descripción, el término "fase de lectura
abierta correspondiente a la proteína pVP2" o "fase de lectura
abierta correspondiente a la proteínas VP3 de IBDV" incluye,
además de las secuencias de nucleótidos de dichas fases de lectura
abierta, otras fases de lectura abiertas análogas a las mismas
codificantes de las proteínas pVP2 y VP3 de IBDV. El término
"análogo/a", tal como aquí se utiliza, pretende incluir
cualquier secuencia de nucleótidos que puede ser aislada o
construida sobre la base de la secuencia de nucleótidos
codificantes de pVP2 y VP3 de IBDV, por ejemplo, mediante la
introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no
conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la
adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de
la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier
extremo o en el interior de la secuencia. En general, una secuencia
de nucleótidos análoga a otra secuencia de nucleótidos es
sustancialmente homóloga a dicha secuencia de nucleótidos. En el
sentido utilizado en esta descripción, la expresión
"sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de
nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de
nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos, un
80%, más preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más
preferentemente de, al menos,
un 95%.
un 95%.
En otro aspecto, la invención proporciona una
construcción génica que comprende un ácido nucleico
proporcionado por esta invención, es decir, un ácido nucleico cuya
secuencia de nucleótidos está constituida por (i) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta correspondiente
a la proteína pVP2 de IBDV y (ii) una secuencia de nucléotidos que
comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína
VP3 de IBDV. Dicha construcción génica carece de la secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta
correspondiente a la proteína VP4 de IBDV.
En otro aspecto, la invención proporciona un
sistema o vector de expresión seleccionado entre:
- a)
- un sistema de expresión que comprende una construcción génica proporcionada por esta invención, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, en donde dicha construcción génica comprende la secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína VP3 de IBDV; y
- b)
- un sistema de expresión que comprende dos construcciones génicas, una primera construcción génica que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, y una segunda construcción génica que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción.
En una realización particular, el sistema de
expresión proporcionado por esta invención comprende una
construcción génica que comprende (i) una secuencia de nucléotidos
que comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV y (ii) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, en donde
dicha construcción génica está operativamente unida a unos
elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de
traducción.
En otra realización particular, el sistema de
expresión proporcionado por esta invención comprende (i) una
primera construcción génica, operativamente unida a unos elementos
de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción,
comprendiendo dicha primera construcción génica una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, y (ii) una
segunda construcción génica, operativamente unida a unos elementos
de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción,
comprendiendo dicha segunda construcción génica una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV.
Los elementos de control de transcripción y,
opcionalmente, de traducción, presentes en el sistema de expresión
proporcionado por esta invención incluyen promotores, que dirigen la
transcripción de las secuencias de nucleótidos de interés a las que
están operativamente enlazados, y otras secuencias necesarias o
apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo
y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de
corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores
transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales
(silencers), etc.
Prácticamente cualquier sistema o vector de
expresión apropiado puede ser utilizado en la generación del sistema
de expresión proporcionado por esta invención. A modo ilustrativo,
dichos sistemas o vectores de expresión apropiados pueden
seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada
caso concreto entre plásmidos, bácmidos, cromosomas artificiales de
levadura (YACs), cromosomas artificiales de bacteria (BACs),
cromosomas artificiales basados en el bacteriófago P1 (PACs),
cósmidos, o virus, que pueden contener, además, un origen de
replicación heterólogo, por ejemplo, bacteriano o de levadura para
que pueda ser amplificado en bacterias o levaduras, así como un
marcador utilizable para seleccionar las células transfectadas
diferente al gen o genes de interés. Estos sistemas o vectores de
expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos
por los técnicos en la materia [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and
Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd
ed. Cold Spring Harbor Laboratory] y forman parte de la presente
invención. En una realización particular, dicho sistema o vector de
expresión es un plásmido, tal como un plásmido adecuado para
transformar levaduras, por ejemplo, el plásmido denominado
pESCURA/pVP2-VP3-GFP (Ejemplo 2), o
un virus, tal como un baculovirus recombinante (rBV), por ejemplo,
el rBV denominado FBD/pVP2-his-VP3
(Ejemplo 1.2), que expresa durante su ciclo de replicación ambas
proteínas (pVP2 de IBDV e his-VP3) simultáneamente
en células de insecto, o los rBVs denominados FB/pVP2 y
FB/his-VP3 (Ejemplo 1.1) que expresan las proteínas
pVP2 de IBDV e his-VP3, respectivamente, cuando
co-infectan células de insecto, obteniéndose
VLPs(-VP4) de IBDV.
En otro aspecto, la invención proporciona una
célula huésped que contiene la secuencia de nucleótidos
codificante de la proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de
nucleótidos codificante de la proteína VP3 de IBDV, bien en una
única construcción génica o bien en dos construcciones génicas
diferentes. En una realización particular, dicha célula huésped es
una célula huésped transformada, transfectada o infectada con (i) un
sistema de expresión proporcionado por esta invención que comprende
bien una construcción génica, en donde dicha construcción génica
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha
proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de nucleótidos que codifica
para dicha proteína VP3 de IBDV, o bien, alternativamente, con (ii)
un sistema de expresión que comprende una construcción génica que
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha
proteína pVP2 de IBDV y otra construcción génica que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína VP3 de
IBDV.
En una realización particular, la célula huésped
proporcionada por esta invención es una célula huésped transformada,
transfectada o infectada con un sistema de expresión que comprende
una construcción génica que comprende (i) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV y (ii) una
secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o
región codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, en
donde dicha construcción génica está operativamente unida a unos
elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de
traducción.
En otra realización particular, la célula
huésped proporcionada por esta invención es una célula huésped
transformada, transfectada o infectada con una primera construcción
génica, operativamente unida a unos elementos de control de
transcripción y, opcionalmente, de traducción, comprendiendo dicha
primera construcción génica una secuencia de nucléotidos que
comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, y con una segunda
construcción génica, operativamente unida a unos elementos de
control de transcripción y, opcionalmente, de traducción,
comprendiendo dicha segunda construcción génica una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV.
Prácticamente cualquier célula huésped
susceptible de ser transformada, transfectada o infectada por un
sistema de expresión proporcionado por esta invención puede ser
utilizada, por ejemplo, células de mamífero, células aviares,
células de insecto, levaduras, etc.; no obstante, en una realización
particular, dicha célula huésped se selecciona entre levaduras y
células de insecto. Las levaduras son adecuadas por razones de
simplicidad y coste de producción. Las células de insecto son
adecuadas cuando el sistema de expresión comprende uno o dos
baculovirus recombinantes (rBV). El empleo de rBV es ventajoso por
cuestiones de bioseguridad relacionadas con el rango de huésped de
los baculovirus, incapaces de replicar en otros tipos celulares que
no sean de insecto.
En una realización particular, la invención
proporciona una célula huésped, tal como una levadura, por ejemplo,
Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces pombe, etc.,
transformada con un sistema de expresión, tal como un plásmido o un
vector de expresión, que comprende una construcción génica
proporcionada por esta invención que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2 de IBDV y la
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP3 de
IBDV.
En otra realización particular, la invención
proporciona una célula huésped, tal como una célula de insecto,
infectada con un sistema de expresión, tal como un baculovirus
recombinante, que comprende una construcción génica proporcionada
por esta invención que comprende la secuencia de nucleótidos que
codifica para dicha proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de
nucleótidos que codifica para la proteína VP3 de IBDV.
En otra realización particular, la invención
proporciona una célula huésped, tal como una célula de insecto,
co-infectada con un sistema de expresión que
comprende un primer baculovirus recombinante que comprende una
construcción génica proporcionada por esta invención que comprende
la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2
de IBDV y con un segundo baculovirus recombinante que comprende una
construcción génica proporcionada por esta invención que comprende
la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP3 de
IBDV.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para la producción de VLPs(-VP4) de la
invención que comprende cultivar una célula huésped
proporcionada por esta invención que contiene la secuencia de
nucleótidos codificantes de dicha proteína pVP2 de IBDV y la
secuencia de nucleótidos codificante de dicha proteína VP3 de IBDV,
bien en una única construcción génica o bien en dos construcciones
génicas diferentes, y que expresa simultáneamente dichas proteínas
pVP2 y VP3 de IBDV, y, si se desea, recuperar dichas VLPs(-VP4) de
la invención. En una realización particular, dicha célula huésped
proporcionada por esta invención es una célula transformada,
transfectada o infectada con un sistema de expresión adecuado, tal
como un sistema de expresión que comprende una construcción génica,
en donde dicha construcción génica comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2 de IBDV y la
secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína VP3 de
IBDV, o bien, alternativamente, con un sistema de expresión que
comprende una primera construcción génica que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2 de
IBDV y una segunda construcción génica que comprende la secuencia
de nucleótidos que codifica para dicha proteína VP3 de IBDV.
Dicho procedimiento comprende, por tanto, la
co-expresión génica de dichas proteínas pVP2 y VP3
de IBDV como dos genes independientes. Tras la expresión simultánea
de dichas proteínas (pVP2 y VP3 de IBDV) en dichas células, las
proteínas expresadas se ensamblan y forman las VLPs(-VP4) de la
invención, las cuales pueden ser aisladas o retiradas del medio, y,
si se desea, purificadas. El aislamiento y purificación de dichas
VLPs(-VP4) de la invención puede realizarse por métodos
convencionales, por ejemplo, mediante fraccionamiento en gradientes
de sacarosa.
En una realización particular, la
co-expresión génica de las proteínas pVP2 y VP3 de
IBDV se realiza mediante el empleo de un rBV que permite la
expresión simultánea de dichas proteínas a partir de dos genes
quiméricos independientes en células de insecto. En este caso, la
producción de VLPs(-VP4) de la invención puede realizarse mediante
un procedimiento que comprende, en primer lugar, la obtención de un
sistema de expresión génica constituido por un rBV que contiene una
construcción génica que codifica simultáneamente para dichas
proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, tal como el rBV denominado
FBD/pVP2-his-VP3 (Ejemplo 1.2) o
bien, alternativamente, la obtención de un rBV que contiene una
construcción génica que codifica para la proteína pVP2 de IBDV y la
obtención de otro rBV que contiene una construcción génica que
codifica para dicha proteína VP3 de IBDV, tales como los rBVs
denominados FB/pPV2 y FB/his-VP3 (Ejemplo 1.1),
seguido de la infección de células de insecto con dicho sistema de
expresión basado en dicho(s) baculovirus
recombinante(s), expresión de las proteínas recombinantes y,
si se desea, aislamiento de las VLPs(-VP4) de la invención formadas
por ensamblaje de dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, y,
opcionalmente, purificación posterior de dichas VLPs(-VP4) de la
invención.
La construcción de un baculovirus recombinante
que permite la expresión de forma independiente de las proteínas
pVP2 y VP3 de IBDV se puede realizar por cualquier experto en la
materia en base a lo aquí descrito y al estado de la técnica sobre
esta tecnología (Cold Spring Harbor, N.Y.; Leusch MS, Lee SC, Olins
PO. 1995. A novel host-vector system for direct
selection of recombinant baculoviruses (bacmids) in Escherichia
coli. Gene 160: 191-4; Luckow VA, Lee SC, Barry
GF, Olins PO. 1993. Efficient generation of infectious recombinant
baculoviruses by site-specific
transposon-mediated insertion of foreign genes into
a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol
67: 4566-79).
En otra realización particular, la
co-expresión génica de las proteínas pVP2 y VP3 de
IBDV se realiza mediante el empleo de un vector que permite la
expresión de dichas proteínas en células de levadura. En este caso,
la producción de VLPs(-VP4) de la invención puede llevarse a cabo
mediante un procedimiento que comprende, en primer lugar, la
obtención de un sistema de expresión génica constituido por un
plásmido que contiene una construcción génica que codifica
simultáneamente para las proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, seguido de la
transformación de levaduras con dicho sistema de expresión,
expresión de las proteínas recombinantes y, si se desea, aislamiento
de las VLPs(-VP4) de la invención formadas por ensamblaje de dichas
proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, y, opcionalmente, purificación
posterior de dichas VLPs(-VP4) de la invención. En una realización
concreta, el sistema de expresión adecuado para transformar
levaduras está basado en un sistema de expresión pESC Yeast
(Stratagene) tal como, por ejemplo, el plásmido
pESCURA/pVP2/VP3-GFP (Ejemplo 2) que contiene una
construcción génica que codifica para las proteínas pVP2 de IBDV y
VP3-GFP.
La obtención de levaduras transformadas con una
construcción génica o con un sistema o vector de expresión
apropiado que permite la expresión simultánea de las proteínas pVP2
y VP3 de IBDV se puede realizar por cualquier experto en la materia
en base a lo aquí descrito y al estado de la técnica sobre esta
tecnología (pESC epitope tagging vectors Instructions manual.
Stratagene www.stratagene.com; Sambrook, J., Fritsch, E.F.,
and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual,
2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory).
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo del sistema de expresión génica proporcionado por
esta invención para la producción y obtención de VLPs(-VP4) de la
invención.
Las VLPs(-VP4) de la invención pueden ser
utilizadas paras inmunizar animales, en particular, aves, per
se o como vectores o vehiculizadores de moléculas con actividad
biológica, por ejemplo, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos,
fármacos, etc., por lo que pueden ser utilizadas con fines
terapéuticos o de diagnóstico. En una realización particular,
dichas moléculas con actividad biológica incluyen antígenos o
inductores de respuestas inmune en animales o humanos a los que se
suministre, o bien fármacos que se liberan en su sitio de acción
específico, o bien secuencias de ácido nucleico, todas ellas útiles
en terapia génica y destinadas a ser introducidas en el interior de
las células apropiadas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de las VLPs(-VP4) de la invención en la
elaboración de medicamentos tales como, vacunas, vectores para
terapia génica (delivery systems), etc. En una realización
particular, dicho medicamento es una vacuna destinada a conferir
protección a animales, en particular, aves, frente al virus
causante de la bursitis infecciosa (IBDV). En otra realización
particular, dicho medicamento es un vector para terapia génica.
En otro aspecto, la invención proporciona una
vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
VLPs(-VP4) de la invención, junto con, opcionalmente, uno o más
adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dicha vacuna
es útil para proteger animales, en particular, aves, frente al virus
causante de la bursitis infecciosa (IBDV). En una realización
particular, dichas aves se seleccionan del grupo formado por
pollos, pavos, ocas, gansos, faisanes, codornices y avestruces. En
una realización preferida, la vacuna proporcionada por esta
invención es una vacuna útil para proteger pollos de la infección
causada por IBDV.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad de VLPs(-VP4) de la invención calculada para producir el
efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras
causas, por las características propias de las VLPs(-VP4) y el
efecto de inmunización a conseguir.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas vacunas son los
adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y
utilizados habitualmente en la elaboración de vacunas.
En una realización particular, dicha vacuna se
prepara en forma de una solución o suspensión acuosa, en un
diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina,
solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otro
diluyente farmacéuticamente aceptable.
La vacuna proporcionada por esta invención puede
ser administrada por cualquier vía de administración apropiada que
dé como resultado una respuesta inmune protectora frente a la
secuencia heteróloga o epítopo utilizado, para lo cual dicha vacuna
se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de
administración elegida. En una realización particular, la
administración de la vacuna proporcionada por esta invención se
efectúa por vía parenteral, por ejemplo, por vía intraperitoneal,
subcutánea, etc.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
Ejemplo
1
En este ejemplo se describen los resultados de
una serie de experimentos diseñados para analizar la posibilidad de
obtener VLPs de IBDV a partir de una estrategia que evita la
síntesis de la poliproteína de IBDV y, por tanto, la presencia de
la proteasa VP4 durante el proceso de ensamblaje. El diseño
experimental se basa en la coexpresión de las proteínas pVP2 y VP3
de IBDV a partir de dos genes quiméricos independientes. Para ello,
se han utilizado dos baculovirus recombinantes (rBVs) descritos
previamente, FB/his-VP3 (Kochan, G., González, D.
& Rodríguez, J. F. (2003). Characterization of the RNA binding
activity of VP3, a major structural protein of IBDV. Archives of
Virology 148, 723-744) y FB/VPX [también
identificado como FB/pVP2 en esta descripción]
(Martínez-Torrecuadrada, J. L., Castón, J. R.,
Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodríguez, J. F. & Casal, J. I.
(2000). Different architectures in the assembly of infectious bursal
disease virus capsid proteins expressed in insect cells.
Virology 278, 322-331). Estos rBVs fueron
generados mediante el clonaje en vectores apropiados de los DNA
complementarios (cDNAs) codificadores de las proteínas pVP2 y pVP3
de IBDV. Dichos cDNAs fueron obtenidos por RT-PCR a
partir del segmento A del genoma de IBDV serotipo I cepa Soroa
(número de acceso al NCBI, AAD30136). El rBV
FB/his-VP3 expresa una proteína VP3 quimérica que en
su extremo N-terminal contiene un tandem de 6
histidinas fusionadas a la secuencia de VP3
(Met754-Glu1012 de la poliproteína) denominada
his-VP3. El rBV FB/pVP2 expresa la región
codificadora de la proteína pVP2 (Met1-Ala512).
El análisis de la expresión de estas proteínas
pVP2 y his-pVP3, bien de forma independiente o
conjunta, se realizó en cultivos celulares. Para la realización de
estos experimentos, se utilizaron cultivos en monocapa de células
procedentes del insecto Trichloplusia ni (H5, Invitrogen) que
fueron crecidos sobre cubreobjetos de cristal. Dichos cultivos
fueron infectados independientemente con FB/pVP2,
FB/his-VP3, o co-infectados con
ambos rBVs. La multiplicidad de infección fue de 5 unidades
formadoras de placa (ufp)/célula. A las 48 horas después de la
infección (hpi) las células fueron fijadas, e incubadas con sueros
policlonales de conejo anti-VP2 y con sueros
policlonales de rata anti-VP3
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79, 1047-1054).
Después de sucesivos lavados, los cubreobjetos fueron incubados con
sueros de cabra anti-rata conjugado con Alexa 594 y
con sueros de cabra anti-conejo conjugado a Alexa
488 (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.). Los núcleos
celulares fueron teñidos con el marcador especifico
To-Pro-3 (Molecular Probes, Inc.).
Finalmente, las muestras se visualizaron por epifluorescencia con
un microscopio Zeiss Axiovert 200 equipado con el sistema confocal
Bio Rad Radiance 2100. Las imágenes obtenidas se almacenaron
utilizando el equipo de software Laser Sharp Package (Bio Rad).
Como se muestra en la Figura 2a, en los cultivos infectados con
FB/pVP2 el suero anti-VP2 mostró una señal granular
fina mezclada con estructuras tubulares ambas distribuidas en todo
el citoplasma. La señal anti-VP3, detectada en las
células infectadas con el rBV FB/his-VP3, se
caracterizó por la presencia de acumulaciones de forma esférica
alrededor del núcleo y, aparentemente, huecas. En los cultivos
coinfectados con ambos rBV se detectó una notable modificación en
el patrón de distribución de ambas proteínas. En estas células, las
señales específicas de pVP2 y VP3 se colocalizaron en acumulaciones
esféricas y densas, sugiriendo que su coexpresión permitía la
formación de complejos pVP2/his-VP3 (Figura 2c a la
2e).
Con la intención de caracterizar estas
estructuras en mayor detalle, extractos similares, correspondientes
a células infectadas con FB/pVP2+FB/hisVP3 fueron analizados por
microscopía electrónica de transmisión (TEM). Como control, y en
paralelo, se analizaron por la misma técnica cultivos de células H5
infectadas con la cepa silvestre del virus FBD (FastBacDual,
Invitrogen). Después de la infección, las células fueron recogidas a
las 48 h, y procesadas como se ha descrito previamente
(Fernández-Arias A, Risco C, Martínez S, Albar JP
& Rodríguez JF. (1998). Expression of ORF A1 of infectious
bursal disease virus infectious bursal disease virus results in the
formation of virus-like particles. Journal of
General Virology 79:1047-1054) para su análisis
en cortes ultrafinos por TEM. Como se muestra en la Figura 2, el
citoplasma de las células coinfectadas contiene agregados formados
por una mezcla de túbulos y estructuras similares a cápsidas (Figura
2g, 2h y 2i). Estos agregados no fueron observados en ningún caso
en las muestras correspondientes a células infectadas con el virus
silvestre FBD (Figura 2f). El aspecto y el tamaño de los túbulos,
así como de las estructuras similares a cápsidas fue semejante a
los descritos previamente en cultivos celulares infectados con
VT7/Poly, un recombinante del virus vaccinia que expresa el gen de
la poliproteína de IBDV (Fernández-Arias A, Risco C,
Martínez S, Albar JP & Rodríguez JF. (1998). Expression of ORF
A1 of infectious bursal disease virus infectious bursal disease
virus results in the formation of virus-like
particles. Journal of General Virology
79:1047-1054).
Para establecer de forma inequívoca que la
coexpresión de pVP2 e his-VP3 permitía el ensamblaje
y, por tanto, la obtención de VLPs-(VP4), se decidió purificar las
partículas formadas. Para ello, se infectaron con
FB/pVP2+FB/his-VP3 cultivos de células H5. 60 hpi,
las células se homogeneizaron y los extractos se separaron en
gradientes de sacarosa tal y como se ha descrito previamente
(Lombardo E, Maraver A, Castón JR, Rivera J,
Fernández-Arias A, Serrano A, Carrascosa JL &
Rodríguez JF. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73:6973-6983).
Después de su centrifugación, los gradientes fueron fraccionados, y
las distintas fracciones fueron analizadas por TEM tal como se ha
descrito previamente (Lombardo E et al., citado
supra). Como control, y sujetos al mismo procedimiento, se
fraccionaron gradientes correspondientes a extractos de células
infectadas con el rBV FB/VPX o con el rBV
FBD/Poly-VP1. El virus recombinante
FBD/Poly-VP1 expresa simultáneamente la poliproteína
y el polipéptido VP1. Como era predecible, la infección con
FBD/Poly-VP1 tenía como resultado una eficiente
producción de VLPs (Maraver A, Oña A, Abaitua F, González D,
Clemente R, Diaz-Ruiz A, Castón JR, Pazos F &
Rodríguez JF. (2003). The oligomerization domain of VP3, the
scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a
critical role for capsid formation. Journal of Virology
77:6438-49). Por otra parte, las fracciones
correspondientes a las células infectadas con FB/VPX solamente
contenían túbulos de aspecto retorcido. Los gradientes
correspondientes a células coinfectadas con los rBVs
FB/pVP2+FB/his-VP3 contenían túbulos rígidos de tipo
I en las fracciones cercanas al fondo del gradiente, y VLPs-(VP4)
en las centrales y en las fracciones superiores (Figura 3b). Las
VLPs-(VP4) aisladas de las células co-infectadas con
rBV FB/pVP2+FB/his-VP3 tenían un diámetro de
65-70 nm, así como un contorno poligonal
característico, absolutamente indistinguible de las VLPs purificadas
de cultivos infectados con FBD/Poly-VP1 (Maraver,
A., Oña, A., Abaitua, F., González, D., Clemente, R.,
Diaz-Ruiz, A., Caston, J. R., Pazos, F. &
Rodríguez, J. F. (2003). The oligomerization domain of VP3, the
scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a
critical role for capsid formation. Journal of Virology
77:6438-49) o de los cultivos infectados con
VT7/Poly (Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez,
S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF
A1 of infectious bursal disease virus infectious bursal disease
virus results in the formation of virus-like
particles. Journal of General Virology 79,
1047-1054).
Con la intención de conseguir una
caracterización bioquímica del material obtenido, se realizaron
experimentos de western-blot en los que las
distintas fracciones se enfrentaron a sueros específicos contra las
proteínas VP1, pVP2, VP3 y VP4 (Fernández-Arias
et al. 1998, Lombardo et al., 2000). Como control se
utilizaron extractos de células infectadas con IBDV. Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 3d. Como se esperaba, las bandas
correspondientes a los polipéptidos VP1 y VP4 sólo fueron detectadas
en muestras correspondientes a células infectadas con
FBD/Poly-VP1. Los patrones correspondientes a
pVP2/VP3 en muestras correspondientes a células infectadas con
FBD/Poly-VP1 o coinfectadas con FB/VPX+
FB/his-VP3 fueron similares, detectándose dos
bandas correspondientes a pVP2 y VP3, respectivamente.
Además, se procedió a la construcción del
plásmido pFBD/pVP2-his-VP3. El
primer paso de la construcción se realizó mediante el clonaje de la
región codificante de la proteína pVP2 en el vector pFBDual
(Invitrogen). El fragmento de DNA correspondiente a pVP2 se obtuvo
mediante PCR con los oligonucleótidos identificados como Oligo I
(SEQ ID NO: 1) y Oligo II (SEQ ID NO: 2) empleando como molde el
plásmido pVOTE.2/Poly (Fernández-Arias, A., Risco,
C., Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998).
Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus infectious
bursal disease virus results in the formation of
virus-like particles. Journal of General
Virology 79, 1047-1054). El fragmento fue
purificado, sometido a digestión con los enzimas BglII y HindIII y
clonado en el vector pFBDual (Invitrogen) previamente digerido con
los enzimas BamHI y HindIII. El plásmido resultante se denominó
pFBD/pVP2. A continuación, se obtuvo un fragmento de DNA conteniendo
la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína VP3
mediante digestión del plásmido pFB/his-VP3 (Kochan
et al., 2003, citado supra) con el enzima RsrII,
tratamiento con Klenow, y posterior restricción con KpnI. Este
fragmento de DNA fue purificado y clonado en el plásmido pFBD/pVP2
previamente digerido con los enzimas SmaI y KpnI. El plásmido
resultante se denominó
pFBD/pVP2-his-VP3 (SEQ ID NO: 3) y
contiene la secuencia de nucleótidos codificante de las proteínas
pVP2 e his-pVP3 (esta última está codificada por la
cadena complementaria a los nucleótidos 6734-7585
de la SEQ ID NO: 3). La secuencia de aminoácidos de la proteína pVP2
y de la proteína de fusión his-VP3
(pVP2-his-VP3) codificada por la
secuencia de nucleótidos contenida en dicho plásmido
pFBD/pVP2-his-VP3 se muestra en la
SEQ ID NO: 4.
El plásmido
pFBD/pVP2-his-VP3 permite la
obtención de un rBV, denominado
FBD/pVP2-his-VP3, que expresa
durante su ciclo de replicación ambas proteínas simultáneamente
[http://invitrogen.com/content/sfs/manuals/bevtest.
pdf].
pdf].
Los resultados obtenidos con
FBD/pVP2-his-VP3 son idénticos a los
obtenidos mediante la coinfección con los rBVs FB/pVP2 y
FD/his-VP3, obteniéndose VLPs(-VP4) de IBDV.
Ejemplo
2
Con el fin de estudiar la posibilidad de obtener
VLPs(-VP4) de IBDV en cultivos de levadura (Saccharomyces
cerevisiae) se generó el vector
pESCURA/pVP2-VP3-GFP con el gen
heterólogo GFP unido al extremo N-terminal de VP3.
El primer paso en la construcción del vector se realizó mediante el
clonaje de la región codificante de la proteína pVP2 de IBDV en el
vector pESCURAinv. El plásmido pESCURAinv se generó mediante
digestión del vector pRS426 (Stratagene) con el enzima PvuII y
religación de la mezcla de digestión. El vector resultante,
pESCURAinv, contiene la región de clonaje múltiple en posición
invertida con respecto a la del vector parental pRS426. El
fragmento de DNA correspondiente a la proteína pVP2 se obtuvo
mediante PCR con los oligonucleótidos denominados Oligo III (SEQ ID
NO: 5) y Oligo IV (SEQ ID NO: 6) empleando como molde el plásmido
pVOTE.2/Poly (Fernández-Arias, A., Risco, C.,
Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression
of ORF A1 of infectious bursal disease virus infectious bursal
disease virus results in the formation of virus-like
particles. Journal of General Virology 79,
1047-1054). El fragmento fue purificado, sometido a
digestión con los enzimas BglII y HindIII y clonado en el vector
pESCURA.inv previamente digerido con los enzimas BamHI y HindIII.
El plásmido resultante se denominó pESCURA/pVP2.
El plásmido pFB/VP3-GFP fue
construido en dos etapas. La primera consistió en el clonaje de una
fragmento de DNA, generado mediante PCR, que contiene la ORF de la
proteína VP3 de IBDV carente del codón de terminación. Esta PCR se
realizó utilizando los oligonucleótidos denominados Oligo V (SEQ ID
NO: 7) y Oligo VI (SEQ ID NO: 8) y empleando como molde el plásmido
pVOTE.2/Poly (Fernández-Arias, A., Risco, C.,
Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998).
Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in
the formation of virus-like particles. Journal
of General Virology 79, 1047-1054). El DNA
resultante fue digerido con los enzimas EcoRI y BamHI y clonado en
el vector pEGFP-N3 (Clontech) también digerido con
los mismos enzimas. El plásmido resultante se denominó
pVP3-GFP. A continuación, el plásmido
pEGFP-GFP fue digerido con los enzimas EcoRI y
NotI y clonado en le vector pFastBac1 (Invitrogen). El plásmido
resultante se denominó pFB/VP3-GFP.
A continuación, se obtuvo un fragmento de DNA
que contenía la fase de lectura abierta correspondiente a la
proteína VP3 de IBDV fusionada a la región codificante de la
proteína EGFP mediante digestión del plásmido
pFB/VP3-GFP con los enzimas EcoRI y NotI. Este
fragmento de DNA fue purificado y clonado en el plásmido
pESCURA/pVP2 previamente digerido con los enzimas EcoRI y NotI. El
plásmido resultante se denominó
pESCURA/pVP2-VP3-GFP (SEQ ID NO: 9)
y contiene las ORFs de las proteínas pVP2 y VP3-GFP
bajo el control transcripcional de dos promotores independientes,
GAL 1 y GAL 10, ambos inducibles por galactosa (la proteína pVP2
está codificada por la cadena de nucleótidos complementaria a los
nucleótidos 5862-7343 de la SEQ ID NO: 9). La
secuencia de aminoácidos de la proteína pVP2 y de la proteína de
fusión VP3-GFP
(pVP2-VP3-GFP) codificada por la
secuencia de nucleótidos contenida en dicho plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP se muestra en
la SEQ ID NO: 10.
Posteriormente,
pESCURA/pVP2-VP3-GFP se empleó para
transformar un cultivo de la levadura S. cerevisiae haploide
cepa 499 de acuerdo con un protocolo previamente descrito (Gietz,
R.D. and R.A. Woods. (2002), Transformation of yeast by the Liac/SS
carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology
350:87-96). Las levaduras transformadas con el
plásmido fueron seleccionadas mediante crecimiento en placas de
medio SC (CSM + YNB, glucosa 2% y bacto agar) suplementadas con los
aminoácidos triptófano, leucina e histidina y carentes de uracilo
(-Ura). Tras una incubación de 48 h a 30ºC, se seleccionó una
colonia que fue empleada para la realización de los subsiguientes
análisis de expresión de proteínas y formación de VLPs-(VP4).
El análisis de la expresión de las proteínas
pVP2 y VP3 y formación de VLPs-(VP4) se realizó siguiendo un
protocolo descrito previamente para la caracterización de VLPs de
IBDV en otros sistemas de expresión
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus results in the formation of
virus-like particles. Journal of General
Virology 79, 1047-1054; Lombardo, E., Maraver,
A., Castón, J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A.,
Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1,
the putative RNA-dependent RNA polymerase of
infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid
protein VP3, leading to efficient encapsidation into
virus-like particles. Journal of Virology
73, 6973-698). La colonia seleccionada fue cultivada
en medio liquido CSM (-Ura) + YNB suplementado con rafinosa al 2%.
El cultivo se incubó a 30ºC durante 24 h. Este cultivo fue empleado
para inocular, a una densidad óptica (D.O.) de 0,2, un matraz de
200 ml de medio CSM (-Ura) + YNB suplementado con el inductor
galactosa al 2%. El cultivo fue mantenido a 30ºC durante 18 horas
(hasta una D.O. entre 1,0 y 2,0). Las levaduras fueron
centrifugadas a 3.000 rpm, 5 minutos a 4ºC, se lavaron con agua
destilada una vez, y el pellet fue resuspendido en tampón de lisis
(TEN: Tris 10 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM) + inhibidores de
proteasas 2X (Compl Roche). Para la lisis se añadió un volumen de
"glass beads" (cuentas o perlas de vidrio) de un tamaño
aproximado de 425-600 micrones (Sigma). Esta mezcla
fue sometida al vortex vigoroso durante 30 segundos 4 veces, con
intervalos de 30 segundos, y todo ello a 4ºC. Tras ello se recuperó
la fracción soluble por centrifugación de la mezcla de lisis a
13.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. Esta muestra fue sometida a
fraccionamiento en un gradiente de sacarosa de acuerdo con un
protocolo previamente descrito (Lombardo, E., Maraver, A., Castón,
J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A., Serrano, A.,
Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73,
6973-6983). Las muestras obtenidas tras el
fraccionamiento así como una muestra del material de partida fueron
analizadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) [Current Protocols
in Molecular Biology] e inmunodetección por Western blot (Figura 4A)
empleando sueros anti-pVP2 y
anti-VP3 [Current Protocols in Molecular Biology].
Como se muestra en la Figura 4A, el Western blot reveló la
presencia de bandas, con la masa molecular predicha correspondiente
a las proteínas pVP2 (48 kDa) y VP3-GFP (61 kDa),
así como otras bandas inmunoreactivas de menor tamaño producidas
probablemente por degradación proteolítica tanto en la muestra
inicial como en las diferentes fracciones del gradiente. Estos
resultados demostraron de forma fehaciente la correcta expresión de
ambos polipéptidos en el cultivo de S. cerevisiae
transformado con el plásmido pESCURA/pVP2-VP3. A
continuación, las distintas fracciones del gradiente fueron
analizadas mediante TEM tal como se ha descrito previamente
(Lombardo, E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J.,
Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L.
& Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73,
6973-6983). Como se muestra en la Figura 4B, el
análisis mediante TEM de las fracciones del gradiente reveló la
existencia de VLPs de IBDV en la fracciones superiores del
gradiente. Estas VLPs, VLPs(-VP4), presentan un diámetro de
65-70 nm y un contorno poligonal indistinguible de
las VLPs de IBDV obtenidas en otros sistemas de expresión (Figura
4C).
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTIFICAS
\vskip0.400000\baselineskip
<110> BIONOSTRA, S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CÁPSIDAS VACÍAS (VLPs(-VP4)) DEL
VIRUS CAUSANTE DE LA ENFERMEDAD DE LA BURSITIS INFECCIOSA (IBDV), SU
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P1392PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> ES P200400121
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-01-21 (21 enero, 2004)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> DNA Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Oligo I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcagatct atgacaaacc tgtcagatca aaccc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> DNA sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Oligo II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aggcgagagt cagctgcctt atgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7595
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pFBD/pVP2-his-VP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (157)..(285)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor ppolh
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (291)..(1289)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVP2 ORF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7443) . . (7503)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor p10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína
pVP2-his-VP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> DNA sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Oligo III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcagatct atgacaaacc tgtcagatca aaccc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> DNA sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Oligo IV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aggcgagagt cagctgcctt atgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> DNA sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Oligo V
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgaattc gatggcatca gagttcaaag aga
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> DNA sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Oligo VI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccc tcaaggtcct catcagagac gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5649)-(5859)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor GAL 1 (pVP2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7402)..(8080)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor GAL 2
(VP3-GFP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8086)..(9597)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF VP3-GFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 503
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína
pVP2-VP3-GFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (19)
1. Una cápsida vacía del virus causante de la
enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), VLP(-VP4),
caracterizada porque está constituida, únicamente, por
ensamblaje de proteínas pVP2 de IBDV y proteínas VP3 de IBDV.
2. Un ácido nucleico caracterizado porque
su secuencia de nucleótidos está constituida por (i) una secuencia
de nucléotidos que consiste en la fase de lectura abierta
correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV y (ii) una secuencia de
nucléotidos que consiste en la fase de lectura abierta
correspondiente a la proteína VP3 de IBDV.
3. Una construcción génica que comprende un
ácido nucleico según la reivindicación 2.
4. Un sistema de expresión seleccionado
entre:
- a)
- un sistema de expresión que consiste en (i) una construcción génica que consiste en la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, y (ii) una construcción génica que consiste en la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción; y
- b)
- un sistema de expresión que consiste en una construcción génica según la reivindicación 3, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción.
5. Sistema de expresión según la reivindicación
4, caracterizado porque se selecciona entre plásmidos,
bácmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACs), cromosomas
artificiales de bacteria (BACs), cromosomas artificiales basados en
el bacteriófago P1 (PAC), cósmidos, y virus, que pueden contener,
opcionalmente, un origen de replicación heterólogo.
6. Una célula huésped que contiene un ácido
nucleico según la reivindicación 2, o una construcción génica según
la reivindicación 3, o un sistema de expresión según cualquiera de
las reivindicaciones 4 ó 5.
7. Una célula huésped transformada, transfectada
o infectada con un sistema de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 4 ó 5.
8. Célula huésped según la reivindicación 6 ó 7,
caracterizada porque es una célula de insecto o una
levadura.
9. Un procedimiento para la producción de
cápsidas vacías del virus causante de la enfermedad de la bursitis
infecciosa (IBDV), VLPs(-VP4), según la reivindicación 1, que
comprende cultivar una célula huésped según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, y, si se desea, recuperar dichas cápsidas
vacías de IBDV.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que dicha célula huésped es una célula de insecto, que comprende
las etapas de:
- a)
- preparar un sistema de expresión seleccionado entre:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- b)
- infectar células de insecto con dicho sistema de expresión preparado en la etapa a);
- c)
- cultivar las células de insecto infectadas obtenidas en la etapa b) bajo condiciones que permiten la expresión de las proteínas recombinantes y su ensamblaje para formar cápsidas vacías, VLPs(-VP4), de IBDV; y
- d)
- si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dichas cápsidas vacías, VLPs(-VP4), de IBDV.
11. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que dicha célula huésped es una levadura, que comprende las
etapas de:
- a)
- preparar un sistema de expresión constituido por un plásmido que contiene una construcción génica según la reivindicación 3;
- b)
- transformar células de levadura con dicho sistema de expresión preparado en la etapa a);
- c)
- cultivar las levaduras transformadas obtenidas en la etapa b) bajo condiciones que permiten la expresión de las proteínas recombinantes y su ensamblaje para formar cápsidas vacías, VLPs(-VP4), de IBDV; y
- d)
- si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, las cápsidas vacías, VLPs(-VP4), de IBDV.
12. Empleo de un sistema de expresión génica
según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, para la producción
y obtención de cápsidas vacías, VLPs(-VP4), de IBDV según la
reivindicación 1.
13. Empleo de cápsidas vacías del virus causante
de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), VLPs(-VP4),
según la reivindicación 1, en la elaboración de un medicamento.
14. Empleo según la reivindicación 13, en el que
dicho medicamento es una vacuna frente a la enfermedad aviar
denominada bursitis infecciosa.
15. Empleo según la reivindicación 13, en el que
dicho medicamento es un vector para terapia génica.
16. Una vacuna que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva de cápsidas vacías de IBDV, VLPs(-VP4),
según la reivindicación 1, junto con, opcionalmente, uno o más
adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
17. Vacuna según la reivindicación 16, para
proteger aves de la infección causada por el virus causante de la
bursitis infecciosa (IBDV).
18. Vacuna según la reivindicación 17, en la que
dichas aves se seleccionan del grupo formado por pollos, pavos,
ocas, gansos, faisanes, codornices y avestruces.
19. Una vacuna para proteger pollos de la
infección causada por el virus causante de la bursitis infecciosa
(IBDV) que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
cápsidas vacías de IBDV, VLPs(-VP4), según la reivindicación 1,
junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200400121 | 2004-01-21 | ||
| ES200400121A ES2307346B1 (es) | 2004-01-21 | 2004-01-21 | Capsidas vacias (vlps(-vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2294679T3 true ES2294679T3 (es) | 2008-04-01 |
Family
ID=34802832
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200400121A Withdrawn - After Issue ES2307346B1 (es) | 2004-01-21 | 2004-01-21 | Capsidas vacias (vlps(-vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. |
| ES05706999T Active ES2294679T3 (es) | 2004-01-21 | 2005-01-21 | Capsidas vacias (vlps(vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200400121A Withdrawn - After Issue ES2307346B1 (es) | 2004-01-21 | 2004-01-21 | Capsidas vacias (vlps(-vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090208528A1 (es) |
| EP (1) | EP1706485B1 (es) |
| AT (1) | ATE374245T1 (es) |
| DE (1) | DE602005002621T2 (es) |
| ES (2) | ES2307346B1 (es) |
| WO (1) | WO2005071068A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2310062B1 (es) | 2005-07-15 | 2009-11-13 | Bionostra, S.L. | Particulas pseudovirales vacias quimericas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), procedimiento de obtencion y aplicaciones. |
| EP2407534A1 (en) | 2010-07-14 | 2012-01-18 | Neo Virnatech, S.L. | Methods and reagents for obtaining transcriptionally active virus-like particles and recombinant virions |
| EP2505640A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-03 | Neo Virnatech, S.L. | Vaccine compositions for birnavirus-borne diseases |
| US10086062B2 (en) | 2012-07-05 | 2018-10-02 | Ohio State Innovation Foundation | Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) vaccine compositions |
| EP3608401A1 (en) | 2012-07-05 | 2020-02-12 | Ohio State Innovation Foundation | Compositions and methods related to viral vaccines |
| CN109134668A (zh) * | 2018-09-19 | 2019-01-04 | 天康生物股份有限公司 | 鸡传染性法氏囊病病毒的融合蛋白及其制备方法、应用、表达系统和疫苗 |
Family Cites Families (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5614409A (en) * | 1989-05-30 | 1997-03-25 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Production of IBDV VP2 in highly immunogenic form |
| US5641490A (en) * | 1991-03-07 | 1997-06-24 | Virogenetics Corporation | Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine |
| WO1992022575A1 (en) * | 1991-06-19 | 1992-12-23 | Sri International | M-protein peptides of influenza virus as antiviral agents |
| US5658572A (en) * | 1991-07-26 | 1997-08-19 | Virogenetics Corporation | Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine |
| US5290686A (en) * | 1991-07-31 | 1994-03-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Expression of influenza a M2 protein in baculovirus |
| US5605792A (en) * | 1993-11-04 | 1997-02-25 | The Ohio State University Research Foundation | Infectious bursal disease virus VP2 fusion protein expressed by baculovirus, use as diagnostic |
| US5788970A (en) * | 1994-03-29 | 1998-08-04 | The University Of Maryland College Park | Chimeric infectious bursal disease virus CDNA clones, expression products and vaccines based thereon |
| AT402898B (de) * | 1994-08-08 | 1997-09-25 | Int Centre Genetic Eng & Bio | Molekulares präsentiersystem |
| ES2282998T3 (es) * | 1996-01-02 | 2007-10-16 | Institut Pasteur | Pseudo-particularmente viricas recombinadas y aplicaciomnes vacunales y antitumorales. |
| US5871744A (en) * | 1996-09-05 | 1999-02-16 | University Of Maryland-Biotechnology Inst. | Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts |
| US5916879A (en) * | 1996-11-12 | 1999-06-29 | St. Jude Children's Research Hospital | DNA transcription unit vaccines that protect against avian influenza viruses and methods of use thereof |
| CA2238659C (en) * | 1997-05-26 | 2010-12-14 | Akzo Nobel N.V. | Recombinant birnavirus vaccine |
| US6596280B1 (en) * | 1997-07-31 | 2003-07-22 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts |
| US6169175B1 (en) * | 1997-08-06 | 2001-01-02 | Centers For Disease Control And Prevention | Preparation and use of recombinant influenza A virus M2 construct vaccines |
| US6231868B1 (en) * | 1997-09-30 | 2001-05-15 | University Of Maryland-Biotechnology Institute | Method for generating nonpathogenic infections birnavirus from synthetic RNA transcripts |
| US6406843B1 (en) * | 1998-02-27 | 2002-06-18 | University Of Arkansas | Poultry virus isolates and method |
| AU3353599A (en) * | 1998-03-31 | 1999-10-18 | University Of Maryland Biotechnology Institute | A method for generating nonpathogenic, infectious pancreatic necrosis virus (ipnv) from synthetic rna transcripts |
| US6114112A (en) * | 1998-05-21 | 2000-09-05 | The Ohio State University | Method of making immunogenic compositions for infectious bursal disease virus |
| WO2000039302A2 (en) * | 1998-12-31 | 2000-07-06 | Chiron Corporation | Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles |
| US6528063B2 (en) * | 1999-01-04 | 2003-03-04 | Rahan Meristem | Recombinant vaccines against IBDV |
| EP1069187A1 (en) * | 1999-07-14 | 2001-01-17 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Mosaic Infectious Bursal Disease Virus vaccines |
| FR2806087B1 (fr) * | 2000-03-07 | 2002-10-18 | Agronomique Inst Nat Rech | Particules pseudovirales de rotavirus et leur utilisation pour vectoriser des proteines ou des acides nucleiques |
| WO2001079273A2 (en) * | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Viruses comprising mutated ion channel protein |
| US20020165176A1 (en) * | 2000-05-01 | 2002-11-07 | Haynes Joel R. | Nucleic acid immunization |
| EP1278542A2 (en) * | 2000-05-05 | 2003-01-29 | Cytos Biotechnology AG | Molecular antigen arrays and vaccines |
| AU2000252449A1 (en) * | 2000-06-19 | 2002-01-02 | Rahan Meristem | Recombinant vaccines against infectious bursal disease virus |
| CA2410297C (en) * | 2000-06-23 | 2011-03-15 | American Cyanamid Company | Assembly of wild-type and chimeric influenza virus-like particles (vlps) |
| CA2435000C (en) * | 2001-01-18 | 2014-03-25 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Oligomeric complexes of chimeric proteins with enhanced immunogenic potential |
| FR2824327B1 (fr) * | 2001-05-02 | 2003-07-11 | Agronomique Inst Nat Rech | Particules pseudovirales de birnavirus |
| EP1420819B1 (en) * | 2001-08-10 | 2008-05-28 | University of Maryland Biotechnology Institute | Sub-unit vaccine for infectious pancreatic necrosis virus |
| US6764684B2 (en) * | 2001-09-28 | 2004-07-20 | Zeon Corporation | Avian herpesvirus-based recombinant infectious bursal disease vaccine |
| AU2003242742B2 (en) * | 2002-06-20 | 2009-04-30 | Cytos Biotechnology Ag | Packaged virus-like particles for use as adjuvants: method of preparation and use |
| US20060121468A1 (en) * | 2002-06-26 | 2006-06-08 | Allnutt F C T | Viruses and virus-like particles for multiple antigen and target display |
| EP1603590A4 (en) * | 2003-03-07 | 2008-08-27 | Merck & Co Inc | INFLUENZA VIRUS VACCINE |
| WO2004112831A2 (en) * | 2003-05-28 | 2004-12-29 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy |
| WO2005004907A1 (en) * | 2003-07-10 | 2005-01-20 | Cytos Biotechnology Ag | Packaged virus-like particles |
| US8592197B2 (en) * | 2003-07-11 | 2013-11-26 | Novavax, Inc. | Functional influenza virus-like particles (VLPs) |
| AU2005248361B2 (en) * | 2004-05-18 | 2010-03-11 | Vical Incorporated | Influenza virus vaccine composition and methods of use |
| US7244432B2 (en) * | 2004-12-08 | 2007-07-17 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Infectious bursal disease virus (IBDV) variant from Georgia |
-
2004
- 2004-01-21 ES ES200400121A patent/ES2307346B1/es not_active Withdrawn - After Issue
-
2005
- 2005-01-21 EP EP05706999A patent/EP1706485B1/en not_active Not-in-force
- 2005-01-21 AT AT05706999T patent/ATE374245T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-01-21 WO PCT/EP2005/000694 patent/WO2005071068A1/en active Application Filing
- 2005-01-21 US US10/576,988 patent/US20090208528A1/en not_active Abandoned
- 2005-01-21 ES ES05706999T patent/ES2294679T3/es active Active
- 2005-01-21 DE DE602005002621T patent/DE602005002621T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090208528A1 (en) | 2009-08-20 |
| EP1706485A1 (en) | 2006-10-04 |
| DE602005002621D1 (de) | 2007-11-08 |
| ES2307346B1 (es) | 2009-11-13 |
| WO2005071068A1 (en) | 2005-08-04 |
| ES2307346A1 (es) | 2008-11-16 |
| DE602005002621T2 (de) | 2008-07-24 |
| EP1706485B1 (en) | 2007-09-26 |
| ATE374245T1 (de) | 2007-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1706486B1 (en) | Chimeric empty capsids of the infectious bursal disease virus (ibdv), obtainment process and applications | |
| ES2310062B1 (es) | Particulas pseudovirales vacias quimericas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), procedimiento de obtencion y aplicaciones. | |
| Fodor et al. | Induction of protective immunity in chickens immunised with plasmid DNA encoding infectious bursal disease virus antigens | |
| Martinez-Torrecuadrada et al. | Structure-dependent efficacy of infectious bursal disease virus (IBDV) recombinant vaccines | |
| WO2005105834A1 (es) | Procedimiento para la producción en levaduras de cápsidas virales vacías compuestas por proteínas derivadas de pvp2 del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv) | |
| ES2294679T3 (es) | Capsidas vacias (vlps(vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. | |
| Jackwood | Multivalent virus-like–particle vaccine protects against classic and variant infectious bursal disease viruses | |
| CA2673355A1 (en) | Antigenicity of infectious pancreatic necrosis virus vp2 sub-viral particles expressed in yeast | |
| CA2324478C (en) | A method for generating nonpathogenic, infectious pancreatic necrosis virus (ipnv) from synthetic rna transcripts | |
| ES2217967B1 (es) | Procedimiento de produccion de particulas virales vacias (vlps) del virus inductor de la bursitis infecciosa (ibdv), composiciones necesarias para su puesta a punto y su uso en la elaboracion de vacunas frente al ibdv. | |
| WO2011054995A2 (es) | VACUNAS PROFILACTICAS DE GRIPE A PARTIR DE CAPSIDAS VIRALES DE BIRNAVIRUS CONTENIENDO EL ANTIGENO M2e DEL VIRUS DE LA GRIPE | |
| Rey et al. | II, 2. The three-dimensional structure of rotavirus VP6 |