AT402898B - Molekulares präsentiersystem - Google Patents

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Description

AT 402 898 B
Die Erfindung bezieht sich auf ein molekulares Präsentiersystem, wobei virale Proteine als Träger für heterologe Aminosäuresequenzen vorgesehen sind.
Unter dem Begriff molekulares Präsentierssystem versteht man ein Molekül, das zur Präsentation kurzer von heterologen Quellen stammender Aminosäuresequenzen in einem conformationsspezifischen Monomer in der Lage ist.
Die Möglichkeiten, virale Proteine, die in der Lage sind, eine schützende Immunantwort in Tieren hervorzurufen, zu identifizieren und synthetisieren, hat die Entwicklung von synthetischen Vaccinen stimuliert. Obwohl bereits gezeigt wurde, daß synthetische Peptide in einigen Fällen gute Immunantwort induzieren können, zeigte es sich, daß es schwache Immunogene waren, es sei denn, daß sie auf sehr immunogene Trägermoleküle angebracht wurden. Ebenso waren sie kaum in der Lage, in geimpften Tieren Schutzimmunität hervorzurufen. Die Versuche, die Immunogenität dieser Antigene für die Verwendung als Vaccine zu erhöhen, hat zur Entwicklung einer Reihe von Antigenpräsentationssystemen geführt. Viele davon sind so konstruiert, daß sie das Antigen als polyvalente teilchenförmige Struktur präsentieren. Die Entwicklung eines teilchenförmigen Vektorsystems für immunogene Epitope ergab einen starken Fortschritt für die Präsentierung von Antigenen. Verschiedene Arten von Teilchen wurden verwendet, um Fremdepito-pe zu präsentieren. Es handelt sich dabei um die Fremdepitope des Kernantigens des Hepatitis B Virus (HBV) (HBcAg) [1] und des Oberflächenantigens des Hepatitis B Virus (HBsAg) [2], des Capsidproteins des Poliovirus [3], des Hefe Ty Proteins [4], die Teilchen, die nach Einfügung von HIV 1-gag in Baculovirus [5] erhalten wurden, des Rotavirus VP-6 Proteins [6], der Kernteilchen des Bluetonge Virus (BTV)[7] sowie filamentöser oder icosahedraler Bakteriophagen [8,9].
Es konnte dabei nachgewiesen werden, daß die Immunogenität eines Peptids sowohl von seiner Sequenz als auch von der Art seiner Präsentierung an das Immunsystem abhängig ist. Es wurde anhand von menschlichen Rhinovirus-Capsidsequenzen als Gastpeptide und den Teilchen von HBcAg als Träger gezeigt, daß die interne Lokalisierung der Fremdsequenzen die Immunogenität des Epitopes auf das 10- bis 50-fache erhöht, wenn sie mit der Aminoterminus Anordnung [10] verglichen wird. Auch die Antigenität (gemessen als Reaktivität zu einem mAb) wurde stark erhöht, wenn die Peptide in diese Position am Träger gebracht wurden. Weiters präsentierten beide Konstrukte die Epitope wesentlich effizienter an die mAbs als die Äquivalente mit freien Peptiden. Das war auch der Fall, wenn spezifische HIV-1 Epitope (die V3 Schleife) in unterschiedliche Domänen von HBcAg [10] eingefügt wurden. Da die Eigenschaften eines vorliegenden Epitops durch seine Konformation beeinflußt werden können, war es daher von großem Interesse, ein Trägersystem zu haben, das verschiedene Insertionsstellen trägt und viele mögliche Konfor-mationen in sich trug. Dies würde die Möglichkeit des Auffindens einer Konformation, die der natürlichen Konformation der vorliegenden Sequenz weitaus ähnlicher ist, erhöhen. Trotz der Tatsache, daß, wie oben erwähnt, verschiedene teilchenförmige Systeme für die Präsentationen von Epitopen entwickelt wurden, basierten alle darauf, daß die Fremdepitope hauptsächlich in einer einzigen Position angeordnet wurden. Dies beruhte vor allem auf dem Fehlen der Kenntnis der räumlichen Struktur der eingesetzten Trägerteilchen.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Hinblick auf das Vorherstehende wurde ein neues Präsentiersystem entwickelt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das virale Protein von kleinen Insektviren, vorzugsweise vom Flock House Virus (FHV) mit bekannter räumlicher Struktur und Aminosäuresequenz abgeleitet ist, wobei heterologe Aminosäuresequenzen, z.B Epitope, in den nach außen gerichteten Schleifen des viralen Capsidproteins eingesetzt sind. Dieser Träger zeigt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um Epitope räumlich günstig einzusetzen. Insbesondere ist das teilchenförmige Trägersystem dadurch gekennzeichnet, daß als virales Protein rekombinantes Protein oder virusartige Partikel eingesetzt sind, wobei dieses rekombinante Protein oder die virusartigen Partikel durch Expression des durch das gegebenenfalls modifizierte RNA-2 Gen des FHV Capsidproteins, wie es in Fig. 3 wiedergegeben ist, codierenden Proteins in prokaryotischen oder eukaryoti-schen Zellen erhalten ist.
Charakteristika der Trägerpartikel
Flock House Virus (FHV) FHV ist ein hüllenloser icosahedraler Insektvirus, welcher ein zweiteiliges RNA-Genom aufweist und zu den Nodaviridae Familien gehören. Diese Viren sind unter den Bekannten die kleinsten und am einfachsten aufgebauten. Das FHV Genom besteht aus zwei einsträngigen mRNA Molekülen (RNA-1 aus 3,1 kb und 2
AT 402 898 B RNA-2 aus 1,4 kb), wobei beide in denselben Teilchen eingekapselt sind. RNA-1 trägt die Information für die virale RNA-Polymerase. RNA-2 codiert den Hüllprecurser alpha. Nach Synthese wird dieses Protein (Hüllprecursor alpha) rasch mit beiden RNAs zusammengefügt, wobei unreife virionenähnliche (Provirionen) Partikel entstehen. Diese Partikel werden langsam durch autokatalytische Schnitte [12] zu reifen Partikel. Röntgendiffraktionsstudien haben die Struktur der Partikel bei etwa 3,0 Ä Auflösung [13] gezeigt. Diese Aufnahme ist in Fig. 1 wiedergegeben. Das Virion hat 60 icosahedrale asymmetrische Einheiten, von welchen jede aus drei quasiäquivalenten Protomeren bestehen, die eine Proteinhülle um das innere RNA Genom bilden [14]. Die Protomeren bestehen aus 1) einem basischen, kristallographisch ungeordnetem Aminoterminus, 2) einer Beta-Tonnen-Struktur, 3) einer nach außen gerichteten Ausbuchtung, die vorwiegend aus Beta-Faltblättern zusammengesetzt und durch drei große Insertionen zwischen den Strängen der Beta-Tonnen gebildet ist, und 4) eine carboxiterminale Domäne, die aus zwei verdrehten innerhalb der Schale liegenden Helices zusammengesetzt ist. Die äußere Virionenzone, die am wenigsten konserviert wird, hat viele verschiedene Sequenzunterschiede, die im wesentlichen alle Auslassungen und Insertionen zwischen den einzelnen Stämmen beinhalten [12]. Die Variationen in den Schleifen, die sich nach außen von den Segmenten der Beta-Tonnen Struktur erstrecken, definieren serologisch bestimmte virale Stämme.
Gerade diese Schleifen wurden als jene Regionen ausgewählt, die für den Einsatz der Fremdepitope behandelt werden.
Fig. 2 zeigt als Raumstruktur das Band des durch FHV RNA2 codierten Proteins, wobei die Positionen, in welchen die Fremdepitope eingesetzt sind, angegeben sind. Die Stellen, an welchen diese Fremdepitope eingesetzt sind, sind durch folgende Aminosäureregionen gegeben:
Schleife L1 Aminosäuren 195-219
Schleife L2 Aminosäuren 263 - 277
Schleife L3 Aminosäuren 129 - 138
Schleife 11 Aminosäuren 107 - 110
Schleife I2 Aminosäuren 152 - 165, und
Schleife I3 Aminosäuren 304 - 310.
In Fig. 3, welche die DNA-Sequenz von FHV-RNA 2 sowie die zugehörige Aminosäuresequenz wiedergibt, sind die einzelnen Schleifenregionen hervorgehoben.
Fig. 4 gibt die gesamte Restriktionskarte anhand der DNA-Sequenz von FHV-RNA 2 wieder.
Fig. 5 veranschaulicht die Anzahl der Schnittstellen der Endonucleasen.
Fig. 6 gibt alle Stellen, an welchen die Endonucleasen an FHV-RNA-2 angreifen, wieder.
Fig. 7 veranschaulicht als graphische Darstellung die Einzelschnittstellen der Endonucleasen. FHV wächst stark in kultivierten Zellen und ergibt Ausbeuten von 20 % des gesamten Zellproteins [14], Es wächst zusätzlich auch noch wirksam in einzelnen Lepidopteranlarven. Die Viren dieser Familie haben eine erhebliche Resistenz gegen Inaktivierung durch Hitze, Detergentien oder andere Denaturantien [14]. Vor kurzem vurde gezeigt [15], daß die Expression des Capsidproteins (RNA-2) des FHV in Insektenzellen über einen rekombinanten Baculovirus virusartige Partikel (VLP) bilden, die mit dem tatsächlichen Virion verwechselbar sind. Durch die vorliegenden Erfinder wurde gezeigt, daß dies auch durch die Expression eines modifizierten Gens erreicht werden kann, welches Insertionen zur Expression fremder Aminosäuren innerhalb der Capsomerstruktur enthält. Die VLP, die durch dieses Verfahren in Insektenzellen gebildet werden, sind reife Partikel, da das Vorläuferprotein, das in Provirionen auftritt, abgeschnitten ist. Dieses System ermöglicht die Produktion von 1 - 2 mg von gereinigten synthetischen Virionen (VLPs) in 50 ml kultivierter Zelle [16].
Ein anderes Verfahren zur Erzeugung von Partikel, welche Fremdepitope tragen, liegt darin, daß infektive Virionen nach Cotransfektion der genomischen RNA-2 (die durch in vitro Transcription von modifizierten cDNAs erhalten werden) mit purifizierter RNA-1 wiedergewonnen werden [17], Dies gilt nur für Genome, die solche Veränderungen tragen, die den replikativen Zyklus oder die Assemblierung des Virus nicht verändern. Die RNA-1 kann durch mehrfaches Durchlaufen von autonomen Replikationen in DM-1 Zellen (Drosophila melanogaster) gereinigt werden, wobei vorteilhaft ancewendet wird, daß die RNA-1 sich wie ein autonomes Replikon in transferierten Zellen verhält [18].
Genaue Beschreibung der Konstruktion von rekombinantem Baculovirus, welcher das Wildtyp- oder modif-zierte Capsomergen trägt
Produktion von cDNA von viralem RNA-2: FHV wurde in DM-1 Zellen gezüchtet und durch Sucrose und CsCI Gradienten wie in [19] beschrieben gereinigt. Die genomische RNA wurde aus den gereinigten Virionen extrahiert, u.zw. durch Behandlung mit 3
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Proteinase K und Phenolchloroform-Extraktion. Eine einzelsträngige cDNA wurde mit Reverstranscriptase unter Verwendung von 20 Basen langen Oligonukleotiden hergestellt, welche zu der 3' Endsequenz [12] komplementär waren (siehe dazu Fig. 3). Eine doppelsträngige cDNA wurde durch Amplifizierung der einsträngigen, durch Standard PCR Techniken [20] hergestellt, wobei ein 20 Basen langes Oligonukleotid verwendet wurde, das komplementär zu dem 5'-Ende der RNA-2 zusammen mit dem ersten Primer war. Beide Primer trugen Extrabasen, welche für ausgewählte Restriktionsenzymstellen kodierten (Bam-Hl Stelle für das 5' Ende und Xba-I Stelle für das 3'-Ende). Nach der PCR Amplifikation wurde die doppelsträngige DNA gelgereinigt und an pUC18 (Sma I Stelle) ligiert. Für die in vitro Transcription von RNA-2 wurde die korrespondierende cDNA unter der Kontrolle der T7 Phagen Polymerase in das Plasmid pBluescript SKII (Stratagene) eingebaut. Beispiele der genannten Modifikationen von FHV RNA2 sind aus nachstehender Tabelle 1 entnehmbar. 4
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Tabelle 1
Beispiele für die Modifikation von FHV RNA2 Genen um neue einzige Schnittstellen zu schaffen
Positionen Restriktions stellen Kommentare L1 Κρη I (Nach Mutagenese) a) Aminosäuren 205 bis 209 (ATDPA) aus der ursprünglichen Sequenz weggelasse b) Vai 204 in Gly (GTT zu GGT) mutagenisiert, um eine Kün I Stelle zu schaffen: G204 T205 GGT ACC CCA TGG c) Nach Oligoinsertion, GT dupliziert L2 Pst I (Nach Mutagenese) a) Aminosäuren 270 bis 273 (GSTG) aus der ursprünglichen Sequenz weggelassen. b) Mutagenese der Codonverwendung von L269 (CAG zu CTG) und Q274 (CAA Zu CAG) um eine Pst I Stelle zu schaffen: L269 Q274 CTG CAG GAC GTC c) Nach Oligoinsertion, LQ dupliziert L 3 Nhe I Spe I (original) a) Aminosäuren 128 bis 134 (VPAGTFP) nach doppelter Digestion mit Nhe I - Spe I entfernt: A126 S127 T135 S136 Nhe I GCT AGC Spei ACT AGT CGA TCG TGA TCA b) S127 und T135 wurden nach Oligoinsertion regeneriert. Es fand keine Duplizierung von Aminosäuren statt. 13 Bsu36 I (original) a) Hier sind keine Aminosäuren der ursprünglichen Sequenz weggelassen b) Oligoinsertion dupliziert die Aminosäuren P304 und E305 P304 E305 G CCT GAG G GGA CTC C 12 BamH I (nach Mutagenese) a) Aminosäuren 154 und 155 (TT) nach Mutagenese weggelassen b) Änderung der Codonverwendung in S156 (TCA zu TCC) um eine BamH I Stelle zu schaffen: G270 S 271 GGA TCC CCT AGG c) GS-Duplikation nach Oligoinsertion 1 1 - Bsu36 I (nach Mutagenese) a) Mutagenese von G108 um eine Bsu36 I stelle zu schaffen G108 Q109 GGA CAG zu: P108 0109 CCT CAG G(von D110) b) Oligoinsertion dupliziert die Aminosäuren P und Q
Die cDNA von RA-2 wurde ebenfalls in den Vektor pVL-1393 (Invitrogene) an Bam-Hl/Xba-I Stellen eingefügt. In diesem Vektor ist das Gen unter der Kontrolle des Polyhedrinpromotors plaziert, wobei es durch Sequenzen von Autographa caiifornica Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV) flankiert war, welche die Produktion von rekombinantem Virus in vivo nach Cotransfektion mit AcNPV Genom DNA ermöglicht. 5
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Einführung von Fremdsequenzen in die cDNA von RNA-2
Kleine Insertionen/Weglassungen in der Sequenz von RNA-2 wurden mittels der PCR Technik vorgenommen [20]. Diese Methode wurde hauptsächlich zur Konstruktion von sehr genau charakterisierten Epitopen benutzt, bei welchen die Kernstruktur ebenso gut definiert ist, wie dies bei HIV-1 Epitopen der Fall ist (siehe dazu Fig. 8). Zur Insertion von größeren Sequenzen (etwa 20 Aminosäuren), wie es für nicht so genau definierte Epitope der Fall sein kann, wurde die gesamte Sequenz an einer oder mehreren der ausgewählten Stellen unter Verwendung von Restriktionsenzymstellen (wenn vorhanden) eingesetzt oder die Insertion wurde durch PCR Technik vorgenommen. Bei dem in Fig. 8 dargestellten räumlichen Diagramm von FHV Promotor sind die Stellen angezeichnet, wo die speziellen HIV-1 Sequenzen "IGPGRAF" inseriert wurden. In den Positionen L1, L2, L3 und 12 wurden jeweils die genannten Aminosäuren eingefügt, bei der Position 13 wurde die Insertion "IGPGRAFE" eingefügt. Außer bei der Position 13 wurde überall eine Weglassung vorgenommen, u.zw. in Position L1 wurden die Aminosäuren 205 - 209, in Position L2 die Aminosäuren 268 - 272, in Position L3 die Aminosäuren 131 - 134 und in Position 12 die Aminosäuren 154 -158 weggelassen.
Beispiele für die Einfügung fremder Sequenzen in das Rekombinante FHV Capsomer sind in der folgenden Tabelle 2 angeführt.
Tabelle 2
Beispiele für Fremdsequenzen, die in den rekombinanten FHV-Capsomer enthalten sind Sequenzen Lage Aminosäuresequenzen und deren Charakteristika exprimiert in HBV-PreSl I3 MGTNLSVPNPPAFGANST-NPDWDFNPGGMQWNSTAL T Zellepitop Rezeptorbindungsstelle E.coli HBV-PreS2 13 MQWNSTALDPRVRGL B Zellepitop E.coli HBV-S L1,L2,L3 I2.I3 CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC B Zellepitop E.coli Baculovirus HCV-core L1,L2,L3 I2.I3 1. TNPKPQRKTKRNTNRRPQD 2. VKFPGGGQIVGGVYLLPRR B Zellepitope E.coli Baculovirus HIV-1 gp120 L1.L2.L3 12,13 IQRGPGRAF (IIIB) IGPGRAF (MN) FGPGQAL (Mal) IGPGRTL (NY5) KGPGRVI (RF) IGLGQAL (Z2) V3 Schlaufe. B Zellepitop Neutralisierendes Epitop E.coli Baculovirus HIV-1 gp120 L1.L2.L3 I2.I3 1. GKAMYAPPI 2. NMWQE(K)VGKA (C4) B Zellepitop Neutralisierendes Epitop E.coli Baculovirus HIV-1 gp41 L1 ,L2,L3 12,13 ELDKWAS B Zellepitop Neutralisierendes Epitop E.coli Baculovirus HIV-1 gp41 L1 ,L2,L3 I2.I3 IEEEGGERDRDR B Zellepitop Neutralisierendes Epitop E.coli Baculovirus
Produktion von recombinanten Baculoviren, welche das RNA-2 Gen tragen
Die cDNA von RNA-2 (Wildtyp oder nach der genetischen Manipulation) wurde in den Transfervektor pVL-1393 unter einem Polyhedrinpromotor an den Stellen Barn Hl und Xbal des Polylinkers inseriert. Dies ist ein Vektor, der auf pUC9 basiert und in der Sequenz neben seinem Polylinker ein Segment Ac NPV trägt, und der den Transfer des Fremgens auf ein Baculovirus Genom nach in vivo Rekombination (siehe Fig. 9) erlaubt. Insektenzellen (Spodoptera frugiperda SF-21 Zellen) werden mit linearen Genomen DNA (nicht lebensfähig) von AcNPV (BaculoGold von PharMingen) und mit dem Transfervektor, welcher das FHV Gen trägt, kotransfektiert (Lipofectin). Nach 4 Tagen wurde die Virusnachkommenschaft geerntet und getitert. Danach wurden verschiedene rekombinanten Viren plaquepurifiziert (3 - 4 mal aus gut isolierten Plaques). Diese Rekombinanten wurden AcNPV-FHV genannt. In einigen Fällen können die VLPs bis zu 20 Aminosäureinsertionen vertragen, ohne den Prozeß des Zusammenbaues zu alterieren. In anderen Fällen 6
AT 402 898 B kann, obwohl die Insertionen die Formation von VLPs verhinderten, dies durch Koinfektion sowohl mit dem Wildtyp als auch mit modifizierten Baculoviren überwunden werden, wodurch mosaikförmige VLPs entstanden, die beide Typen der Capsomerstrukturen trugen.
Produktion und Reinigung von VLP aus Insektenzellen, die mit AcNPV FHV infiziert sind
Um gereinigte Antigene für immunologische Antigenstudien zu erhalten, wurden Sf-21 Zellen (entweder in Suspension oder als Monolayer) mit rekombinanten Baculoviren mit einer Infektionsmultiplizität von 10 infiziert. Zwei bis drei Tage nach der Infektion wurde das Medium mit 0,5 % Nonidet P-40 und 0,1 % ß-Mercaptoethanol (2-ME) versetzt. Nach 15 min auf Eis wurden die Zelldebris durch 10minütiges Zentrifugieren bei 12000 g separiert. Die VLPs in dem Überstand wurden durch einen 30 Gew.-/Gew.-%igen Sucrosepuffer in 50 mM HEPES pelletiert; 0,1 %ige 2-ME zugesetzt und 3 Stunden bei 4*C in einem SW41 Rotor bei 40000 U/min zentrifugiert. Die Pellets wurden in einem 50mMol HEPES, 0,1 % 2-ME resuspendiert und auf 10 ml 5 - 20 Gew.-/Gew.- % kontinuierlichem Sucrosegradient im gleichen Puffer aufgegegeben. Die Partikel wurden durch einstündiges Zentrifugieren bei 11 · C in einem SW41 Rotor bei 40000 U/min sedimentiert. Die Fraktionen des Gradienten wurden vom Boden abgenommen und die Aliquoten jeder Fraktion auf einem 10%igen SDS Polyacrylamidgel laufen gelassen, um die Teilchenpeaks zu lokalisieren. Die Fraktionen, die die VLPs enthielten, wurden gepoolt, pelletisiert durch Zentrifugation und im gleichen Puffer resuspendiert. Der Proteingehalt dieser Präparationen wurde durch durch ein Micro BCA Protein Assay Reagens (Pierce) bestimmt.
Wiedergewinnung von modifiziertem FHV, welches exogene Sequenzen enthielt
Lebende rekombinante FHV Viren können wiedergewonnen werden, wenn die heterologen Aminosäuresequenzen, die in das Capsomer eingeführt sind, die Virionen-Assemblierung nicht beeinträchtigen. Die Wiedergewinnung wurde durch Kotransfektion von DM-1 Zellen mit in vitro hergestellten Transcripten der modifizierten RNA-2 und authentischen RNA-1 erreicht, wobei letztere durch mehrfaches Durchlaufen von Transfektioinen bei limitierender Verdünnung zur RNA-2 Freiheit gereinigt wurden, wie dies bei Ball [18] beschrieben ist.
Beispiel 1:
Produktion von VLP, welches die spezifische Sequenz IGPGRAF des HIV-1 (Human Immunschwächevirus Typ 1) trägt
Eine Reihe von Domänen des HIV-1 gp-120 sind in der Lage, neutralisierende Antikörper zu induzieren. Eine davon ist die hypervariable Region 3 (V-3 Schleife). Dies ist ein lineares immundominantes Epitop, das als die "Hauptneutralisierungsdeterminante" (PND) bekannt ist [21,22]. Obwohl die gesamte Domäne innerhalb der einzelnen Isolate weit variiert, wurde kürzlich gefunden, daß möglicherweise aufgrund von Konformationszwängen, die Aminosäuresequenz an der Spitze der Schleife gut konserviert ist. Sequenzdaten von 245 Isolaten aus der USA zeigten, daß die V3 Schleifensequenz "GPGRAF” in mehr als 60 % vorhanden wäre [23]. Darüberhinaus wurde gefunden, daß Tiere, die mit Peptiden, die diese Sequenz enthielten, immunisiert wurden, Sera produzierten, die, zwar mit niedrigem Titer, in der Lage waren, mehrere divergierende Isolate zu neutralisieren [24], Diese Sequenz wurde in fünf verschiedenen Positionen auf der Oberfläche der FHV Struktur angeordnet und in einigen Fällen an zwei Stellen desselben Moleküls. Die ausgewählten Positionen waren die nach außen ragenden Schleifen, wie vorstehend erwähnt wurde (siehe FHV Struktur Fig. 2). In einem Fall (Position 13) wurde die fremde Sequenz direkt eingesetzt als ein Insert in der Originalsequenz von RNA-2. Um dies zu erreichen, wurde die cDNA, die für das FHV Capsidprotein codiert, mit Bsu 361 verdaut (welches die DNA beim Nucleotid 934 spaltet) und ein synthetisches Oligonuclectid, das für die HIV-1 spezifische Sequenz codierte, wurde inseriert. Als Konsequenz dieser Maßnahme war eine zusätzliche Glutaminsäure am Carboxiterminus der HIV-1 Sequenz eingeführt. Die Struktur all dieser rekombinanten Proteine ist in Fig. 8 wiedergegeben.
Fig. 9 zeigt die Proteine, die in Sf-21 Zellen nach der Infektion mit dem rekombinanten Baculovirus, das die HIV-1 Epitope an den in Fig. 8 wiedergegebenen Stellen enthielt, induziert wurden. Zellen, die mit diesen Rekombinanten infiziert waren, mockinfizierte Zellen und Zellen, die mit Baculoviren, die keine Inserts trugen, wurden lysiert und die Lysate in einem 10%igen Polyacrylamidgel analysiert. Eine Färbung der Gele mit Coomassie Blau zeigt bei Lysaten, die aus mit den rekombinanten Viren infizierten Zellen stammen , Bande mit einem Molekulargewicht, welches ähnlich dem war, wie es für die FHV Capsomerpre- 7
AT 402 898 B curserprotein (Alpha Protein) oder dem geschnittenen Produkt erwartet wurde. Diese Banden waren bei Zellen, die mit Baculoviren, die kein Insert trugen (AcNPV-RP6) infiziert waren, nicht vorhanden. Western Blots von ähnlichen Gelen, die mit kaninchenhyperimmun Anti FHV Serum analysiert wurden, bestätigten die Identität des präsumptiven Chimären Proteins. In allen Fällen wurde neben dem Alpha Precurser auch das geschnittene Produkt (das reife Beta Protein) gesehen. Dies zeigt möglicherweise, daß die modifizierten Capsomeren nach wie vor in der Lage sind zu assemblieren oder selbst abzuspalten. Allerdings schien in einigen Fällen, daß der Anteil am reifen Protein sehr gering war (z.B. L3, I3, I2), was darauf hindeutet, daß die Gegenwart der Inserts die Möglichkeit der Selbstspaltung unterschiedlich beeinträchtigt. Wenn ein ähnlicher Blot analysiert wurde, u.zw. entweder unter Verwendung menschlicher Seren von HIV-1 positiver Patienten oder HIV-1 spezifischer menschlicher monoklonaler Antikörper, entwickelte sich ein deutlich unterschiedliches Erkennungsmuster. Das Patientenserum erkannte hauptsächlich das Epitop in der L2-Position oder in jenen Kombinationen, wo diese Position vorhanden war. Hingegen erkannte der monoklonale Antikörper sehr stark die Position L1 oder Kombinationen, die von dieser abgeleitet wurden. Position L3 wurde bei allen Seren zwar erkannt, jedoch in wesentlich geringerem Ausmaß. Die anderen Positionen wurden durch diese Seren kaum erkannt. Anderseits entdeckten einige menschliche Seren bevorzugt die Proteine, die die Inserts in den Positionen L3 oder I3 trugen, was eine unterschiedliche Spezifität der individuellen Immunantwort auf dieselbe Sequenz andeutet. Allerdings bis heute wurden die stärksten Signale immer dann erhalten, wenn die Proteine die Inserts bei den Positionen L1 oder L2 trugen. Die Coomassie Färbung des Gels zeigte, daß die Unterschiede nicht von der Menge des induzierten Proteins in den Insektenzellen abhängt. Das bestätigte die Annahme, daß die Antigenität der Epitope durch die Lokalisierung beeinflußt ist. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt konnte der Grund des unterschiedlichen Erkennungsmusters bei unterschiedlichen Patienten noch nicht erklärt werden. Es werden nun weitere Nachforschungen über die Erklärung dieser Daten anzustellen sein, wie z.B. die Herkunft des infizierenden Stammes, der Neutralisierungstiter der Seren, die unterschiedlichen idiotypischen Antworten, die Differenz in den Prognosen der Patienten u.dgl.
Reinigung von VLP-V3 aus rekombinanten baculovireninfizierten Sf-21 Zellen
Fig. 11 veranschaulicht die Reinigung und die Antigenzusammensetzung von VLPs, die durch drei verschiedene Baculoviren erhalten werden, nämlich AcNPV-FHV, welches das unmodifizierte FHV Capsid-protein exprimiert; AcNPV-FHV-V3/L1, welches dasselbe Protein exprimiert, allerdings das HIV-1 Epitop in Position L1 trägt, und AcNPV-FHV-V3/L2, welches das Insert in Position L2 trägt. Die Lage dieser Inserts ist im Detail in Fig. 8 wiedergegeben. In allen Fällen wurde aufgefunden, daß das so erhaltene teilchenförmige Material auf dieselbe Position im Gradienten wandert, in der sich auch die FHV teilchen befinden. Die teilchenförmige Natur dieser Komponenten wurde weiters durch Elektronenmikroskopie bestätigt. Proben, die von jedem Peak genommen wurden, wurden auf Polyacrylamidgel laufen gelassen und mit HIV-1 positivem Serum nach Transfer auf Nitrozellulosepapier sondiert. In allen Fällen wurde gefunden, daß die aufgefundenen Proteine an dieselbe Position des FHV Capsidproteins oder seines Precursers gewandert sind. Im Falle des Wildtyps oder der L1 abgeleiteten Partikel entsprach die Hauptbande dem reifen Protein, hingegen bei den von L2 abgeleiteten Partikeln war ein hoher Anteil von unreifem Precurser (a-Protein) zusätzlich vorhanden. Allerdings schien es eine Anreicherung von reifem Protein in VLPs zu sein, wenn diese mit dem Ausgangsmaterial vor der Reinigung verglichen wurden. Ähnliche Resultate wurden auch erhalten, wenn die Produkte der anderen rekombinanten Baculoviren analysiert wurden, welche die FHV Capsidproteine exprimieren, die die Inserts wie vorher beschrieben in andere Positionen trugen. Die einzigen Unterschiede, die gefunden wurden, waren die Ausbeute an teilchenförmigem Material und der Anteil von VLPs, die unreifes Protein in diesem Material in sich trugen.
Die Versuche wurden dabei folgendermaßen vorgenommen: Vier Tage nach der Infektion wurden die Zellen und das Medium wie beschrieben behandelt und das Vorhandensein der partikelförmigen Teilchen wurde durch sucrosedichte Sedimentation (SW50.1 Rotor bei 45000 U/min für 30 min bei 20 ’C) analysiert. Die Fraktionen wurden von den Böden der Röhrchen gesammelt. Um die Verteilung von FHV entlang des Gradienten zu ermitteln, wurden aliquote Anteile jeder Fraktion auf ihre FHV Aktivität mittels eines ELISA-Tests gemessen. Die Verteilung von HIV-1 spezifischer Reaktivität entlang des Gradienten wurde durch Western Blot gemessen, u.zw. von Proben von den jedem Peak entsprechenden Fraktionen. Die Western Blots wurden mit HIV-1 positiven Seren sondiert, wobei am Boden jeder graphischen Darstellung die Banden eingezeichnet sind. In Fig. 11 veranschaulicht die Kurve A die Reaktivität von AcNPV-FHV abgeleiteten Partikeln, die Kurve B die von AcNPV-FHV-V3-L1 abgeleiteten Partikeln, und die Kurve C jene von AcNPV-FHV-V3-L2 abgeleiteten Partikel.Die Pfeile in der Figur zeigen die Migration von FHV, welcher in einem Parallelgradienten laufen gelassen wurde. 8
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Immunogenität von Chimären VLP-V3 Partikeln
Um zu bestimmen, ob die in die VLP Struktur eingesetzten sieben HIV-Aminosäuren adäquat genug waren, um eine Antwort zu induzieren, wurden Meerschweinchen mit gereinigten VLPs, die HIV-1 Inserts trugen, immunisiert. In zwei Fällen waren die Inserts in jeweils einer Position (I3 oder L3) vorhanden, im dritten Fall trugen die Teilchen beide Insertionen dieser Sequenzen, u.zw. sowohl in L3 als auch in der I3-Position. Eine Gruppe von drei Meerschweinchen wurden mit einer 500 ul PBS Dosis, die 50 ug von jeder der VLP Präparationen enthielt, subkutan immunisiert. Für die erste Immunisierung am Tag Null wurden die Antigene mit dem kompletten Freund'schen Adjuvans (CFA) formuliert. Die Tiere wurden am 14. und 28. Tag mit der gleichen Menge Antigen nachgeimpft, welche im unvollständigen Freund'schen Adjuvans (IFA) formuliert waren. Das Blut wurde von jedem Tier 35 Tage nach der ersten Impfung abgenommen. Die Seren von geimpften Tieren wurden hinsichtlich der spezifischen Anti V3 Antikörper durch ELISA getestet, u.zw. unter Verwendung von gp160 als Einfangantigen. Die ermittelten Daten sind aus Fig. 12 ersichtlich, aus welcher hervorgeht, daß diese Präparate eine gute Antikörperantwort, die auf die V3 Sequenz spezifisch ist, ausgelöst haben. Wie aus diesem Test hervorgeht, zeigten sich keine größeren Unterschiede zwischen den verschiedenen Konstrukten. Allerdings wäre nun der Rest der Positionen zu analysieren und auszuwerten, welche Differenzen in der Affinität auftreten, die diese hinsichtlich des nativen gp-120 zeigen, welches ein Parameter ist, der für die Assoziierung mit ihrer neutralisierenden Kapazität bekannt ist.
In Fig. 12 sind die Serumantikörpertiter angeführt, die durch ELISA Tests aus Meerschweinchen gemessen wurden, die mit rekombinantem VLP immunisiert werden, welche die Sequenz IGPGRAF in unterschiedlichen Positionen tragen. Die Meerschweinchen (drei jeder Gruppe) wurden dreimal (am Tag Null, 14 und 28 Tage) mit jeweils 50 ug von gereinigtem VPL immunisiert. Für die erste Immunisation am Tage Null wurden die Antigene in komplettem Freund'schen Adjuvans formuliert, für die Auffrischungsimmunisierungen wurde das unvollständige Freund'sche Adjuvans verwendet. Das Blut wurde durch Kardial-punktur am 35. Tag entnommen. Die Daten geben reziproke Verdünnungswerte bei A*92 = 0,2 wieder. Für die Anti-FHV-Titer wurden die ELISA-Platten mit CsCL gereinigten Viren (200 ng pro Vertiefung) beschichtet. Die Titer gegen HIV-I Inserts wurden mit Platten analysiert, die mit rekombinanten gp 120 (ABT-Baculovirus) hergestellt, analysiert, u.zw. mit 100 ng pro Vertiefung.
Beispiel 2:
Hepatitis C Virus (HCV)
Die durch Transfusion hervorgerufene Hepatitis, welche weder dem Hepatitis A Virus noch dem Hepatitis B Virus zugerechnet werden kann (NANBH), zählt zu der Hauptgruppe der durch Transfusionen hervorgerufenen Erkrankungen [25]. Das Klonieren und die Expression von HCV hat die Entwicklung von Antikörper screening Immunoassay erlaubt, welche für die Auffindung von HCV Infektionen geeignet waren, wobei als Festphasenantigen ein Fusionspolypeptid verwendet wurde, das durch rekombinante Hefe exprimiert wurde. Erste Studien unter Verwendung dieses Proteins bestätigten, daß HCV das dominante Agens von NANBH ist. Allerdings zeigten diese und die folgenden Studien eine Reihe von Nachteilen mit diesen serologischen Tests, die auf Sensitivität und Spezifität beruhen. Dieser Test beruht auf dem Nachweis von Antikörpern gegen die nicht strukturellen Proteine NS3-NS4, welche allerdings so lange nicht in infizierten Patienten auftreten, bis die Krankheit in einem weit vorgeschrittenen Stadium vorliegt (4 - 6 Monate nach dem Einsetzen der Hepatitis). Daher ist der Nachweis der Antikörper eher für die Auffindung im chronischen Stadium geeignet. Es konnte später nachgewiesen werden, daß die meisten immunodomin-anten Epitope innerhalb der aminoterminalten Teile des Kernproteins angeordnet sind [25,26,27] und daß diese Antikörper zu diesen Epitopen frühzeitig nach der Infektion auftreten. Dies wurde unter Verwendung von rekombinanten HCV-Kernproteinen gezeigt, welche in Bakterien oder Baculoviren produziert wurden oder auch durch Verwendung synthetischer Peptide, die mit diesen Sequenzen korrespondieren. Darüber-hinaus wird das Kernprotein von HCV als das wesentlichste Einzelantigen zur Antikörperermittlung in infizierten Patienten gehalten. In allen positiven Proben wurden 80 - 85 % corepositive Werte gefunden, und bei den meisten darunter wurde nur dieses als einziges Antigen gefunden,
Produktion von FHV-VLPs, welche ein HCV Kernepitop tragen
Aufgrund dieser Überlegungen wurden die Epitope des HCV Kernproteins in dem erfindungsgemäßen Präsentiersystem getestet. Es wurde eine 20 Aminosäure lange Sequenz ausgewählt, welche den Aminosäuren 20 - 40 der Originalsequenz entsprachen, von welcher nachgewiesen wurde, daß diese für 9
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Diagnosezwecke sehr wirkungsvoll sind [26]. Das 20 Aminosäuren lange Epitop wurde in die I3 Position an der Bsu-361 Stelle des RNA-2 Gens eingesetzt, welches in pVL-1393 enthalten war. Das rekombinante Baculovirus wurde wie beschrieben hergestellt und gereinigt. Das resultierende Rekombinat wurde AcNPV-HCVc genannt. Fig. 13 veranschaulicht die Expression von Hybriden FHV-HCV Proteinen durch den rekombinanten Baculovirus AcNPV-HCVc. Es wird so durch den rekombinanten Baculovirus das Chimäre Capsomer hergestellt. Es wurden Sf-21 Zellen mit rekombinanten Baculovirus AcNPV-HCVc (Reihen 3, 6 und 7), mit einem Baculovirus, der ein unmodifiziertes FHV Capsidprotein trägt, nämlich AcNPV-FHV (Reihen 2 und 4) und mit einem polyhydrin-minus Baculovirus, der kein Insert trägt, AcNPV-RP6 (Reihe 1) infiziert. Der Extrakt der gesamten Zellen wurden in einem 10%igen SDS-PAGE laufen gelassen. Gereinigtes FHV wurde als Marker (Reihe 5) inkludiert. Die Reihen 1 - 3 wurden mit Coomassie Blau gefärbt. Gemäß Reihen 4 - 7 wurden die Proteine auf Nitrocellulosepapier nach dem Laufenlassen geblottet. Nach Sichtbarmachen der Bande durch Poinceaurotfärbung wurden Streifen von Papier entsprechend jeder Vertiefung geschnitten und mit einem spezifischen Serum sondiert. Die Reihen 4 und 6 wurden mit Serum eines corepositiven Patienten durch den RIBA-II Test sondiert. Die Reihen 5 und 7 wurden mit Kaninchen-Anti-FHV-Serum sondiert.
Die Insektenzellen wurden mit dem rekombinanten Virus infiziert und 4 Tage nach der Infektion wurden die Zellen lysiert und auf einem I0%igen SDS-PAGE-Gel analysiert. Nach dem Laufenlassen wurde das Gel mit Coomassie Brillantblau gefärbt. Die Einführung von HCV-Sequenzen hatte offensichtlich keinen Einfluß auf die Proteinproduktion. Allerdings sind alle aufgefundenen Proteine mit dem Molekulargewicht des Precursers (α-Protein) migriert. Das deutet darauf hin, daß der Reifeprozeß durch die Sequenzveränderung irgendwie beeinträchtigt war. Um die Identität dieses Proteins zu konfirmieren, wurden die Lysate der infizierten Zellen auf einem ähnlichen Gel laufen gelassen, auf Nitrozellulosepapier transferiert und mit spezifischen Antiseren sondiert. Wie erwartet reagierte das Protein stark mit einem spezifischen Kaninchen anti FHV Antiserum (Verdünnung 1 : 2000) bzw. zusätzlich auch mit HCV positiven Menschenseren (Verdünnung 1 : 200).
Fig. 14 zeigt die FHV-Reaktivität (gemessen durch einen ELISA-Test) nach der Sedimentation in einem Sucrosegradienten von VLP, welches durch Infektion von SF-21 Zellen mit dem rekombinanten Baculovirus AcNPV-HCVc gebildet wurden. Die Laufbedingungen sind die gleichen wie in Verbindung mit Fig. 11 beschrieben. Die Aliquots einer jeden Peakfraktion wurden durch Western Blot verarbeitet und mit HCF positiven Humanseren sondiert. Ein Foto der entwickelten Western Banden ist am Boden der Graphik eingezeichnet. Die Pfeile deuten die Position von FHV in einem parallelen Gradienten an.
Wie im Falle der die HIV-1 spezifischen Sequenzen tragenden Teilchen, migierten die Teilchen etwas langsamer als die Wildtyp-FHV-Teilchen. Western Blot von Aliquoten der Peaks reagierten mit HCV positiven Seren. Dies ist eine Indikation dafür, daß trotz der Tatsache, daß das Protein keiner Spaltung unterlag, dies nicht die Fähigkeit zur Autoassemblierung zu einer partikulären Struktur behinderte.
Zur Einschätzung der Möglichkeit des Antigens, spezifische Antikörper aufzufinden, wurden für den ELISA Test purifizierte VLPs verwendet. Die Vertiefungen von ELISA-Platten (Nunc) wurden mit 100 ul gereinigtem VLP, welches in PBS Puffer (100 ng pro Vertiefung verdünnt war) beschichtet. Nach der Blockierung mit PBS, welches 5 % BSA enthielt, wurden 100 ul von Serumverdünnung jeder Vertiefung zugesetzt und die Platte 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die gebundenen Antikörper wurden durch eine zweite Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase-Konjugat der IgG Fraktion von Ziegen Anti-Menschen-Immunglobulin 1 Stunde bei Raumtemperatur ermittelt. Die Enzymaktivität wurde durch Verwendung von o-Phenylendiamin als Substrat gemessen. Die Absorption jeder Vertiefung wurde bei A = 490 nm gemessen. Der Titer jeder Probe wurde als höchste Verdünnung gerechnet, welche bei A 490 < 0,2 gegeben ist. Um die Sensibilität dieses Antigens zu testen, wurden 100 Sera ausgewählt, von denen bekannt war, daß sie corepositiv bei einem kommerziellen Testset waren (RIBA ll-Chiron Corp.). Beinahe 85 % der Proben gaben einen Titer höher als 1 : 1000, was eine sehr gute Sensitivität bedeutet, wenn Anticoreantikörper detektiert werden. Diese Resultate zeigten, daß diese 20 Aminosäuren der HCV Coresequenz, wenn sie in das erfindungsgemäße Trägersystem eingesetzt waren, ein sehr verläßliches Antigen zur Ermittlung von HCV Infektion darstellen.
Die Ergebnisse sind als Blockdiagramm in Fig. 15 wiedergegeben.
Vergleich eines ELISA-Tests, der auf VLP basiert, mit herkömmlichen kommerziell erhältlichen Tests
Um die Sensitivität des ELISA Tests zu ermitteln, wurde eine Kollektion von serienmäßig entnommenen Blutproben von infizierten Patienten für spezifische HCV-KernantikÖrper analysiert, u.zw. unter Einbeziehung der Periode der Serokonversion. In diesem Stadium haben alle Patienten bereits ein hohes Niveau an spezifischem Leberenzymen Alanin-Aminotransferase (ALT). In vier von 50 Patienten, welche analysiert 10

Claims (3)

  1. AT 402 898 B wurde (siehe Fig. 16), zeigte der Test mit den erfindungsgemäßen Trägern eine Serokonversion früher als bei den herkömmlich erhältlichen Testkits (RIBA II). Diese Resultate zeigen, daß das Antigen extrem gut für die Ermittlung von kontaminierten Proben in Blutbanken ist. Die serienmäßig entnommenen Blutproben von ausgewählten Patienten, welche vor der Serokonversion für den RIBA-II Test entnommen waren, wurden durch den von den vorliegenden Erfindern zusammengestellten ELISA-Test analysiert, u.zw. mit Platten, die mit VLPs, die ein HCV corespezifisches Epitop tragen, beschichtet waren. Die Seraverdünnung war 1 : 100 für RIBA-II als auch für den erfindungsgemäßen ELISA-Test. Die RIBA-II Werte sind in der oberen Reihe wiedergegeben. Die ELISA-VLP Werte sind in den Diagrammen durch Kreise gekennzeichnet, die ALT-Werte durch einen senkrechten Strich. VLPs, welche HCV Kernsequenzen tragen, im Vergleich zu freien HCV Peptiden hinsichtlich der Antikörperauffindung Es hat sich gezeigt, daß kurze Peptide sehr effizient waren, wenn sie als Fangantigene für das Auffinden von spezifischen Antikörper sowohl in menschlichen als auch tierischen Seren waren, insbesondere in Form von verzweigten Peptiden [29]. Es ist auch schon berichtet worden, daß sie besser reagieren als die entsprechenden rekombinanten Antigene [30]. Bei durch Transfusionen hervorgerufenen Hepatitis-C Fällen wurde ermittelt, daß bei Verwendung von Peptiden als Fangantigenen positive Seren schon nach einem Monat nach der ersten Transfusion ermittelt werden konnten und mit dem ersten Anstieg der speziellen Leberenzyme verbunden ist, welche sie als wirkungsvolle Marker für die Ermittlung von akuten HCV spezifischen Infektionen machen [27], Aus diesem Grunde wurde entschieden, die HCF spezifischen Antigene entsprechend der vorliegenden Erfindung in einem Dot-Blot Assay mit den entsprechenden freien Peptiden (HCc-2p) mit einem Peptid, welches die ersten 20 Aminosäuren des Kernes enthält (HCc-lp) zu vergleichen und auch mit Peptiden, die anderen HCV Proteinen entsprechen (NS Peptide). Fig. 17 zeigt ein Photo dieser Dot-Blots. Zur Erstellung dieser Auswertungen wurden Aliquots von 10 ul von gereinigten VLPs (5 ug pro ml), welche eine Insertion von 20 Aminosäuren vom Kern des HCV enthalten, und Lösungen, die 100 ug/ml Peptide enthalten, die verschiedene Bereiche des HCV Genoms repräsentieren, wurden auf einem Nitrocellulosepapier geblottet. Nach der Blockierung mit 5%iger fettfreier und trockener Milch wurde jeder Streifen mit einer 1 : 100 Lösung von menschlichen Seren inkubiert. Nach dem Waschen wurde jeder Filter mit Antihuman-Antikörpern, die an Meerretich-Peroxidase (Dako) Verdünnung 1 : 5000 konjugiert waren, und schließlich mit Diaminobenzidin (DAB) inkubiert. Die Linien 1 - 6 zeigen Patientenseren, die Linie NC war das negative Kontrollserum. Wie ersehen werden kann, sind schon sehr geringe Werte von Antigenen (50 ng), die 2,5 ng des spezifischen HCV-Peptids entsprechen , in Form von VLPs stark genug, um ein gutes Signal mit positiver Probe zu ergeben. Das entsprechende freie Peptid (HCc-2) gab nur ein sehr schwaches Signal, obwohl es dieselbe Anzahl von positiven Proben erfaßte. In diesem Fall war die Menge an Antigenen, die auf das Nitrocellulosepapier aufgetragen waren, 400mal höher als im Falle von VLPs, bezogen auf das molare Verhältnis. Das Peptid, das den ersten 20 Aminosäuren entspricht (HCc-1p), gab stärkere Signale, versagte aber beim Nachweis einer positiven Probe und gab unbestimmte Resultate mit einer anderen Prober. Die Peptide, die anderen HCV-Proteinen entsprechen (die entsprechend publizierter Resultate konstruiert sind), sind weit weniger effizient für die Detektierung HCV positiver Sera. Patentansprüche 1. Molekulares Präsentiersystem, wobei virale Proteine als Träger für heterologe Aminosäuresequenzen vorgesehen sind, dadurch gekennzeichnet, daß das virale Protein von kleinen Insektviren, vorzugsweise vom Flock House Virus (FHV), mit bekannter räumlicher Struktur und Aminosäuresequenz abgeleitet ist, wobei heterologe Aminosäuresequenzen, z.B. Epitope, in den nach außen gerichteten Schleifen des viralen Capsidproteins eingesetzt sind.
  2. 2. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als virales Protein rekombinantes Protein oder virusartige Partikel eingesetzt ist, wobei dieses rekombinante Protein oder die virusartigen Partikel durch Expression des durch das, gegebenenfalls modifizierte, RNA-2 Gen des FHV Capsidproteins, wie es in Fig. 3 wiedergegeben ist, codierten Proteins in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen erhalten ist.
  3. 3. System nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologen Aminosäuresequenzen in ein oder mehrere Regionen der nach außen gerichteten Schleifen des durch das RNA-2 Gen codierten 11 AT 402 898 B FHV Capsidproteins eingesetzt sind, wobei die Schleifen mit der Bezeichnung Li, L2, L3, 11, I2, I3 ausgewählt sind. System nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Einsetzung der heterologen Aminosäuresequenzen ausgewählten Bereiche der Schleifen durch folgende Aminosäurensequenzregionen des durch das RNA-2 Gen codierten FHV Capsidproteins definiert sind: Schleife L1 Aminosäuresequenzregion 195-219 Schleife L2 Aminosäuresequenzregion 263-277 Schleife L3 Aminosäuresequenzregion 129-138 Schleife 11 Aminosäuresequenzregion 107-110 Schleife I2 Aminosäuresequenzregion 152-165 Schleife I3 Aminosäuresequenzregion 304-310. Verfahren zur Herstellung eines molekularen Präsentiersystems nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das RNA-2 Gen des FHV Capsidproteins in den den Schleifen L1,12, L3,11,12, I3 entsprechenden Regionen durch Weglassungen und/oder Mutagenese und/oder Einfügungen abgeändert wird, um in den genannten Schleifenbereichen Schnittstellen für Restriktionsenzyme für die Insertion der für die Aminosäuresequenzen codierenden Inserte zu schaffen. Verwendung eines molekularen Präsentiersystems nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem Verfahren zur Herstellung eines Heilmittels, eines Diagnosemittels oder eines Impfstoffes. Hiezu 22 Blatt Zeichnungen 12
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