DE60126349T2

DE60126349T2 - Rekombinantes nukleoprotein von newcastle-krankheitsvirus als markierungsimpfstoff

Info

Publication number: DE60126349T2
Application number: DE60126349T
Authority: DE
Inventors: Teshome Mebatsion; Marcus Josephus Marie Koolen
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2000-11-02
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2021-10-31
Also published as: US7070789B2; US20040043035A1; AU2481502A; MXPA03003700A; AU2002224815B2; CA2427578C; WO2002036617A3; WO2002036617A2; CY1106493T1; HU226256B1; JP2004517612A; HUP0302265A2; PT1383795E; PL207132B1; DK1383795T3; ATE352557T1; EP1383795A2; EP1383795B1; JP4476543B2; ES2278810T3

Description

Das Newcastle-Krankheitsvirus (NDV) ist verantwortlich für eine der die drastischsten Verluste hervorrufenden Krankheiten beim Geflügel und hat einen wesentlichen ökonomischen Einfluss auf die Geflügel-Industrie. Impfungen von Hühnern, insbesondere denjenigen, die für den kommerziellen Verbrauch vorgesehen sind, werden überall auf der Welt ausgeführt. Obwohl wirksame lebende oder inaktivierte ND-Impfstoffe (Impfstoffe gegen die Newcastle-Krankheit) derzeit verfügbar sind, verbleibt das Virus eine weitergehende Herausforderung für kommerzielle Schwärme.
Das negativ-strängige RNS Virus-Genom des NDV, welches ungefähr 15 kb lang ist, enthält sechs Gene, die sechs hauptsächliche strukturelle Proteine kodieren: Nukleoprotein (NP), Phosphorprotein (P), Matrixprotein (M), Fusionsprotein (F), Hämagglutininneuraminidase (HN) und RNS-abhängige RNS-Polymerase (L). Die RNS zusammen mit NP, P und L-Proteinen bilden den Ribonukleoprotein-Komplex (RNP), der als ein Template für die RNS-Synthese dient. Ein gemeinsames Merkmal von allen negativ-strängigen Viren (NSV) ist die Anwesenheit ihrer genetischen Information ausschliesslich in Gestalt eines RNP. Das RNP, aber nicht die nackte RNS, dient als Template für die Transkription und Replizierung.
Das NP zusammen mit den Polymerase-Proteinen P und L, spielt eine wesentliche Rolle beim Einkapseln und Schutz der RNS vor enzymatischer Zerstörung. Darüber hinaus reguliert NP die Transkription und Replikation des viralen Genoms durch Wechselwirkung mit P alleine, mit P und L (RNS-Polymerase) oder mit sich selbst (NP-NP Wechselwirkung). Für den Sendai Paramyxovirus ist gezeigt worden, dass ein konservierter N-Endbereich des NP in der NP-RNS und NP-NP Wechselwirkung involviert gewesen ist (Buchholz et al., J. Virol. 67, 5803–5812, 1993), wobei für den Carboxy-Endbereich gezeigt worden ist, dass er für die Template-Funktion notwendig ist (Curan et al., J. Virol. 67, 4358–64). Die meisten Teile des NP sind damit absolut wesentlich für die Virus-Replikation aufgrund der mannigfaltigen Wirkung von NP bei dem Zusammensetzen und der biologischen Aktivität von RNP.
In vielen Ländern besteht eine Gesetzgebung, um NDV-Ausbrüche zu kontrollieren. In einigen Ländern werden Ausrottungs-Strategien mit zwangsweiser Eliminierung von infizierten Vögeln praktiziert. Für eine Weiterverfolgung von erfolgreichem internationalem Geflügel-Handel ist die Einführung von systematischen ND-Kontrollmassnamen wünschenswert. Doch haben alle derzeit benutzten auf ganzen Viren basierende lebende und inaktivierte ND-Impfstoffe einen wesentlichen Nachteil, der darin liegt, dass geimpfte Tiere nicht von infizierten Tieren unterschieden werden können, wenn standardisierte serologische Tests wie die Hämagglutination-Inhibition (HI) oder Virus-Neutralisierung (VN) eingesetzt werden. Daher besteht das Bedürfnis für NDV-immunogenes Material, umfassend ein NDV-Protein, welchem mindestens eine immuno-dominante Epitope fehlt. Eine Epitope ist ein kleiner struktureller Bereich auf einem Antigen, der mit einem Antikörper wechselwirkt. Eine Epitope kann aus so wenig wie drei Aminosäuren eines Polypeptids bestehen, aber üblicherweise umfasst es fünf bis zehn oder in manchen Fällen mehr Aminosäuren.
Erst kürzlich sind Impfstoffe daraus, die als „Marker-Impfstoffe" bezeichnet worden sind, an Popularität in der Veterinär-Medizin zu gewinnen, wo die Auslöschung von bestimmten Krankheiten von nationalem oder internationalem Interesse ist.
Ein Marker-Impfstoff ist als ein Impfstoff definiert, der in Zusammenhang mit einem Diagnose-Test eine serologische Unterscheidung von geimpften Tieren von infizierten Tieren ermöglicht.
Versuche, Marker-Impfstoffe zu entwickeln, umfassen die Löschung von einem oder mehreren nicht wesentlichen aber immunogenen Genen. Dieser Ansatz ist hauptsächlich verfügbar für DNS-Viren, die verschiedene nicht notwendige Gene enthalten (beispielsweise Herpes-Viren). Für RNS-Viren sind die meisten der Gene entweder wesentlich oder die nicht-wesentlichen sind nicht immunogen. NDV, ein negativ-strängiges RNS-Virus, umfasst sechs hauptsächliche strukturelle Gene, die alle wesentlich für die Ausbreitung des Virus sind. Durch die Löschung von einem oder mehreren dieser Gene würde man erwarten, dass ein Verlust an biologischen Aktivitäten folgen würde. Tatsächlich, wo solche Kontroll-Programme für andere virale Infektionskrankheiten in Tieren in Entwicklung sind, ist bis jetzt und dem Vorliegen der in Rede stehenden Erfindung ein Impfstoff, der auf einem NDV-Impfstrang basiert, welcher in ND-Kontrollprogramme einpassen würde, noch nicht beschrieben worden.
Ein alternativer Ansatz für die Entwicklung eines Marker-Impfstoffs ist der Einsatz von sogenannten „sub-unit" Impfstoffen. Dieser Ansatz ist für NDV implementiert worden durch Identifizierung von zwei Glyko-Proteinen, dem Fusions-Protein (F) und der Hämagglutinin-Neuraminidase (HN), welche bei der Induktion von Schutz-Immunität involviert sind. Rekombinante Vektoren wie das Herpes-Virus des Truthahns (HVT) und das Geflügelpocken-Virus (FPV) die NDV F und/oder HN exprimieren, sind in erfolgreicher Weise hergestellt worden und ihre Sicherheit und Wirksamkeit sind in intensiver Weise studiert worden.
Nukleoproteine (NP) der negativ-strängigen RNS-Viren (NSV) sind in der Natur hoch immunogen und werden als ein Antikörper in Diagnose-ELISA's eingesetzt. Dies umfasst die Tollwut, die Masern, die Rinderpest, das vesikuläre Stomatitis-Virus und NDV. Diese Tests werden hauptsächlich eingesetzt, um Impfprogramme zu überwachen. Im Zusammenhang mit einem NDV HN-Subunit Impfstoff ist auch ein NP-basierter Immunoassay beschrieben und ein Diagnose-Test zur Unterscheidung zwischen geimpften und infizierten Tieren (Makkay et al., Vet. Microbiol. 66, 209–222, 199). Dennoch bestehen keine NP-Immuno-Assays in Zusammenhang mit einem ganzen NSV-basierten Marker-Impfstoff, insbesondere einem NDV-Impfstoff, hauptsächlich aufgrund der Tatsache, dass genetische Modifizierungen des sehr vitalen NP-Gens nachteilige Konsequenzen auf die Virus-Replikation und die Infektiösität haben würde.
Ein Nachteil der NDV-Subunit-Impfstoffe ist jedoch, dass die Wirksamkeit der rekombinanten Viren, die das NDV F oder HN Protein exprimieren, in signifikanter Weise in Gegenwart von mütterlich abgeleiteten Antikörpern (MDA) in kommerziell verwerteten Hühnern vermindert ist. Im Gegensatz dazu liefern konventionelle ND-Impfstoffe, die auf einer Präparation des ganzen Virus basieren, vollen Schutz, selbst in Gegenwart von MDA.
Ein weiterer allgemeiner Nachteil von mehreren der rekombinanten Vektoren ist der verzögerte Einsatz der Schutz-Immunität. Konventionelle lebende ND-Impfstoffe geben im allgemeinen den vollen Schutz 6–7 Tage nach der Impfung, wohingegen das Einsetzen der Immunität, welches durch einen Impfstoff induziert wird, welcher auf einem rekombinanten HVT exprimierenden NDV F Protein basiert, nur zwischen 14 und 21 Tagen nach der Impfung dargestellt werden konnte (Morgan et al., Avian Dis. 37, 1032–1040, 1993).
Angesichts dieser Nachteile von ND-Subunit-Impfstoffen besteht eine Notwendigkeit für einen ND Marker-Impfstoff, der auf einem ganzen Virus basiert, welches sein F- und HN-Protein in seiner natürlichen Form behält und welches in serologischer Weise von Wildtypen- wie auch von traditionellen Impf-Viren unterschieden werden kann.
Die internationale Patentanmeldung WO 99/66045 beschreibt einen NDV Marker-Impfstoff, der auf einer genetisch modifizierten NDV-Mutante basiert, welcher eine immuno-dominante Epitope auf einem NDV-Protein fehlt. Dennoch enthält dieses Impfstoff-Virus ein hybrides HN-Protein, welches nur aus einem Viertel-Teil des HN-Proteins auf NDV besteht, während die verbleibenden Teile des HN-Proteins von einem nicht in Beziehung stehenden aviären Paramyxovirus des Typs 2 oder 4 abgeleitet worden sind. Die Entfernung des Hauptteils der NDV HN Region würde in vorstellbarer Weise die Rolle vermindern, die von HN bei der Induktion von einem NDV schützenden Antikörper gespielt wird.
Derzeit verfügbare lebende NDV-Impfstoffe können nur geschlüpften Hühnern durch das Trinkwasser, Aerosol, Augentropfen oder parenterale Wege verabreicht werden. Diese Verabreichungs-Wege haben einige Nachteile. Insbesondere sind diese Verfahren teuer, weil sie eine Arbeitskraft für die Anwendung benötigen. Kürzlich ist der Impfstoff von Embryo-Impfstoffen als effiziente und ökonomische Weise dargelegt worden (Sharma und Burmester, Avian Diseases 26, 134–149, 1982 und Sharma, Avian Diseases 29, 1155–1169, 1985). Darüber hinaus ist die Embryo-Impfung als vorteilhaft befunden worden aufgrund der wegen des jungen Alters bestehenden Widerstandskraft auf bestimmte Krankheiten und die Verabreichung einer gleichförmigen Dosis des Impfstoffs in jedes Ei mit halbautomatischen Maschinen mit Vielfach-Injektions- Köpfen.
Es sollte festgehalten werden, dass viele Impfstoffe, die in konventioneller Weise für die Impfung von Vögeln nach dem Schlüpfen eingesetzt werden, nicht für die in ovo Impfung eingesetzt werden können. Embryos von späteren Stufen sind in hoher Weise für eine Infektion für die meisten betrachteten Impf-Viren empfänglich, umfassend diejenigen Impf-Viren, die in sicherer Weise einen Tag alten geschlüpften Hühner injiziert werden können. Daher können konventionelle Impfstoffe nicht für die in ovo Verabreichung eingesetzt werden.
Derzeit besteht kein geeigneter kommerziell verfügbarer ND-Impfstoff, der in ovo angewandt werden kann, hauptsächlich aufgrund der hochgradigen Embryo-Sterblichkeit, die selbst mit den zwei leichtesten, kommerziell verfügbaren NDV Impf-Stämmen verbunden sind: NDW (US Patent US 5,149,530 ) und C2 (US Patent US 5,750,111 ).
Das US Patent US 5,427,791 (Regents of the University of Minnesota) beschreibt den Einsatz von chemischen mutagenen Agenzien, um NDV Mutanten des Hitchner B1 Stammes zu erzeugen, die für Embryos der späten Stufe nicht pathogen sind. Die chemische Behandlung des B1 Stammes mit Ethyl-Methanin-Sulfonat (EMS) resultierte in dem mutanten Virus NDV-B1-EMS, welches in sicherer Weise Hühnereiern am Tag 18 der Embryo-Entwicklung verabreicht werden konnte. Dennoch musste in nachteiliger Weise jeder Ei-Übergangsschritt dieses Stammes in Gegenwart des mutagenen Agents EMS ausgeführt werden, aufgrund der Eigenschaft der Mutante, in den B1 Elternstamm zurückzukehren, der für die Embryos nicht sicher gewesen ist.
Es ist ein Ziel dieser vorliegenden Erfindung, eine NDV-Mutante anzugeben, die als aktive Komponente in einem mit einem ganzen Virus basierten ND Marker-Impfstoff eingesetzt werden kann, um die serologische Unterscheidung zwischen Tieren zu ermöglichen, die mit dem Wildtypus NDV infiziert worden sind gegenüber denen, die mit konventionellen NDV-Impfstämmen geimpft worden sind gegenüber den Tieren, die mit einem Impfstoff immunisiert worden sind, der auf dieser NDV-Mutante basiert.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine NDV-Mutante anzugeben, die als aktive Komponente in einem Impfstoff eingesetzt werden kann, der nicht nur jungen Vögeln nach dem Schlüpfen verabreicht werden kann, sondern auch sicher in ovo verabreicht werden kann.
Die hier beschriebene Erfindung erfüllt diese Ziele durch das Liefern einer genetisch veränderten NDV-Mutante, die sich von den bekannten NDV-Stämmen (Impfstämmen) unterscheidet aufgrund der Entfernung einer neuen immuno-dominanten Epitope aus dem NP, welches in serologischer Weise bei der NDV-Infektion sehr relevant ist, aber wobei die Löschung von dieser nicht in negativer Weise die Schutzeigenschaften der neuen NDV-Mutanten beeinflusst.
Die vorliegende Erfindung liefert eine NDV-Mutante, der eine immuno-dominante Epitope auf einem NDV-Protein fehlt, als Ergebnis einer Mutation in einem Gen, welches das Protein kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass der NDV-Mutante eine Epitope fehlt, die innerhalb eines Bereichs des Nukleo-Proteins (NP) angeordnet ist, wobei der Bereich die Aminosäure-Sequenz (447–455) aufweist, die in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist.
Es ist auch gefunden worden, dass die Aminosäure-Sequenz (447–455) Phe Leu Asp Leu Met Arg Ala Val Ala des NP, welche durch die Nukleotide 1460–1486 des NDV-Genoms kodiert worden sind, eine immuno-dominante Epitope des NDV-NP umfassen. Dies sagt aus, dass Antiseren, die aus virtuell allen Hühnern erhalten werden, die mit NDV infiziert worden sind, mit einer Epitope wechselwirken, die in diesem Bereich angeordnet ist. Die Antiseren wechselwirken mit den oben erwähnten Aminosäuren, aber wechselwirken im Wesentlichen nicht mit Aminosäure, die diesen Bereich flankieren.
Weiterhin ist in 2 dargestellt, dass Hühner-Antiserum, welches sowohl durch lebende und inaktivierte, konventionelle NDV-Stämme induziert worden ist, mit dem NP 18-mer Peptid reagiert, überspannend die Aminosäuren (443–460) Gly Glu Thr Gin Phe Leu Asp Leu Met Arg Ala Val Ala Asn Ser Met Arg Glu (SEQ ID Nr. 2), welche den (447–455) Bereich umfassen. Ein Vergleich der Aminosäure-Sequenzen, die diesen Bereich umfassen, zeigen 100%-ige Aminosäuren-Identität unter den velogenen Texas GB Stämmen, dem mesogenen Beaudette C Stamm und dem lentogenen Clone-30 Stamm. Daher ist es eines der wesentlichsten Kriterien zur Entwicklung eines Marker-Impfstoffs, d.h. der Identifizierung einer Epitope, die durch ein Protein des konventionellen NDV-Stammes exprimiert wird, dass es von dem Hühner-Immunsystem erkannt wird, erfüllt wird.
Die in Klammern eingesetzten Zahlen, die hier benutzt werden, dienen zur Identifizierung von Nukleotid-Positionen auf dem NDV-Genom und Aminosäure-Residuen in den NDV-Proteinen, wie dies in (Römer-Oberdörfer et al., J. Gen. Virol. 80, 2987–2995, 1999, EMBL Zugangs-Nr. Y18898) beschrieben worden ist.
In unerwarteter Weise ist weiter gefunden worden, dass trotz der Tatsache, dass das NP ein wesentliches Protein für die NDV-Replikation ist, die Aminosäuren (447–455) für die Virus- Replikation nicht erforderlich sind. Eine infektiöse rekombinante NDV-Mutante, die keine NP-Epitope exprimiert, die in diesem Bereich angeordnet ist, ist in erfolgreicher Weise aus Zellen nach Transfektion dieser Zellen mit geeigneten Plasmiden wiedergewonnen worden, unter Einsatz einer „reversen genetischen" Technologie, und konnten in effizienter Weise in Hühnereiern ausgebreitet werden.
Eine NDV NP Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung ist erzeugt worden unter Einführung einer Mutation in das NP-Gen, so dass die Fähigkeit der immuno-dominanten Epitope, Antikörper in Hühner zu induzieren, die mit einer Epitope reagieren, die innerhalb des 18-mer Peptids angeordnet ist, welches die Aminosäure-Sequenz (443–460) hat, ist verloren gegangen. Beispiele 2 und 3 demonstrieren (i), dass die NDV NP Mutante gemäss der Erfindung fähig ist, HI Antikörper und polyklonale Hühner-Anti-NDV-Seren zu induzieren, die mit dem ganzen Virus Anti-Gen reagieren, aber dass (ii) diese Anti-Seren keine Reaktivität mit einer Epitope zeigen, die innerhalb des 18-mer Peptids angeordnet gewesen ist.
Die Beobachtung, dass Hühner-Anti-NDV-Seren, die gegen die NDV NP Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung gezogen worden sind, von Hühner-Seren unterschieden werden können, die gegen natürlich auftretende NDV-Stämme und konventionelle NDV-Impfstämme aufgezogen worden sind, durch Beobachtung der Wechselwirkung dieser Antiseren mit einer Epitope, die innerhalb des (447–455) Bereichs liegt, macht diese NDV NP Mutante zu einem geeigneten Kandidaten für einen Marker-Impfstoff. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung eine NDV NP Mutante, der eine immuno-dominante Epitope fehlt, die innerhalb des (447–455) Bereichs angeordnet ist, welche Anti-Serum in Hühnern induziert, welches von Anti-Serum unterschieden werden kann, welches durch konventionelle NDV-Stämme induziert worden ist, indem die Wechselwirkung des mutanten Anti-Serums mit einem Peptid beobachtet wird, welches den (447–455) Bereich umfasst, in Gegenwart eines monoklonalen Antikörpers, der in spezifischer Weise mit einer immuno-dominanten Epitope bindet, die in diesem Bereich angeordnet ist. Im letzt genannten Fall ist die Beobachtung üblicherweise ein immunologischer Wettbewerbs- oder Blockier-Assay.
Daher ist eine bestimmte NDV NP Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante Antiserum in Hühner induziert, welchen Antikörper fehlen, welche mit einer immuno-dominanten Epitope reagieren, welche innerhalb des Aminosäuren-Bereichs (447–455) des NP angeordnet ist.
In einem bevorzugteren Ausführungsbeispiel ist eine NDV NP Mutante vorgegeben, die ein Antiserum in Hühner induziert, welchen Antikörper fehlen, welche mit einem 18-mer Peptid reagieren, welches die NP Aminosäure-Sequenz (443–460) hat, die in der SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist.
Unter dem Begriff „induziert Anti-Serum in Hühnern, welchem Antikörper fehlen, die mit ... reagieren" ist zu verstehen, dass eine Serum-Probe, die aus einem infizierten/geimpften Huhn erhalten worden ist in einem direkten oder blockierenden NP Enzym-verbundenen immunosorbanten Assay (ELISA) ein negatives Ergebnis zeigt.
Typischerweise ist der Absorbanz (OD) Abschnitts-Wert für den NP ELISA, um zwischen positiven und negativen Proben zu differenzieren, auf drei Standard-Abweichungen oberhalb des mittleren P/N Verhältnisses der negativen Kontrollproben aus SPF-Hühnern gesetzt (wobei P = der OD der Proben aus Plattenpunkten ist, die mit einem relevanten Peptid, welches mit einem Träger-Molekül gekoppelt ist, beschichtet sind, wobei N = der OD der Proben aus Plattenpunkten ist, die mit dem Träger-Molekül beschichtet sind). Ein Träger-Molekül kann ein Träger-Protein wie BSA, Ovalbumin, KLH, eine Kohlenhydrat-Kette oder eine synthetische Aminosäuren-Kette sein.
Das NP-Gen ist auf dem NDV-Genom an den Nukleotid-Positionen 56 bis 1801 angeordnet (NDV-Stamm Clone 30^®). Das NP des NDV ist 489 Aminosäuren lang und hochkonserviert mit lentogenen, mesogenen und velogenen Stämmen. Die Nukleotid-Sequenz und die Aminosäure-Sequenz des NP-Gens dieses NDV-Stammes sind in den SEQ ID Nrn. 3 und 4 dargestellt. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuren-Sequenzen des NP des Clone-30 mit den entsprechenden Sequenzen des velogenen Texas GB- und des mesogenen Beaudette C Stammes von NDV zeigen eine 100%-ige und 99.3%-ige Identität. Im Falle, dass ein Polypeptid-Bereich hier durch Referenz auf eine bestimmte Aminosäuren-Sequenz definiert ist, abgeleitet von dem spezifischen NDV-Stamm Clone 30, ist dieser Bereich so zu betrachten, dass er den entsprechenden Bereich mit einer abweichenden Aminosäuren-Sequenz eines anderen NDV-Stammes umfasst.
Eine Mutation wird verstanden als ein Wechsel der genetischen Information in einem "Wild-Typus" oder unmodifizierten NP-Gen eines Eltern-NDV-Stammes, der fähig ist, ein natives NP zu exprimieren, so dass dem von der NDV-Mutanten exprimierten NP eine immunodominante Epitope fehlt, welche innerhalb des (447–455) Bereichs des NP angeordnet ist.
Eine weitere Anforderung der in das NP-Gen eingeführten Mutation liegt darin, dass das veränderte NP die Wiedergewinnung der infektiösen NDV aus einer Zellkultur nach Transfektion dieser Zellen mit den geeigneten Plasmiden, unter Einsatz der "reversen genetischen" Technologie für NDV gestattet. Die Beispiele 1 und 2 beschreiben Experimente, die geeignet sind, um die Fähigkeit des geänderten NP zu bestimmen, NDV-Antikörper zu induzieren und die Zulässigkeit der Mutation, infektiöse Viren zu erzeugen, die aus Zellkulturen wieder gewinnbar sind, welche mit den geeigneten Plasmiden transfektiert sind.
Die Mutation ist beispielsweise eine Nukleinsäure-Substitution, Löschung, Einfügung oder eine Kombination davon.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung umfasst die NDV NP Mutante eine Löschung oder einen Ersatz von einer oder mehreren Aminosäuren im Bereich des NP mit der Aminosäuren-Sequenz (447–455), die in der SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist.
Es ist auch gefunden worden, dass nicht alle Löschungen im Bereich des NP-Gens, welche die Kodier-Sequenzen einer immunodominanten Epitope umfassen, gestattet sind. Eine Löschung der Nukleotide, die den NP Aminosäuren 443–460 (NDV-Δ18 Mutante) entsprechen, führt zu der Wiedergewinnung einer infektiösen NDV-Mutante aus der Zellkultur nach Transfektion mit den geeigneten Plasmiden, wohingegen eine Löschung der Nukleotide, die den NP Aminosäuren 444–455 (NDV-Δ12 Mutante) oder 442–489 (NDV-Δ48 Mutante) entsprechen, dies nicht tat.
Die Analyse der Protein-Sekundär-Struktur (Garnier-Osguthorpe-Robson Analyse) zeigte, dass die Aminosäuren-Positionen (444–459) des NP eine Alpha-Helix ausbilden. Es ist gefunden worden, dass die Entfernung der kompletten Helix und der flankierenden Nukleotide (Δ443–460) nicht die Erzeugung einer lebensfähigen, infektiösen rekombinanten NDV verhinderten, wohingegen die Entfernung einer teilweisen Helix-Struktur oder zusätzlicher Teile des NP-Proteins nicht zur Wiedergewinnung der infektiösen NDV aus der Zellkultur führten.
Daher umfasst eine bevorzugte NDV-Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung eine Löschung der Aminosäuren 443 ± 1–460 ± 1.
Bei einem besonders bevorzugten Aspekt dieses Ausführungsbeispiels der Erfindung ist eine NDV NP Mutante vorgeschlagen, die eine Löschung der Aminosäuren 443–460 umfasst.
Eine besonders vorteilhafte NDV-Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung ist eine NDV-Mutante, wie oben beschrieben, die zusätzliche dämpfende Mutationen umfasst.
Solche NDV-Mutanten können aus jeglichen konventionellen ND-Impfstämmen abgeleitet werden. Beispiele von solchen geeigneten NDV-Impfstämmen, die in kommerziell verfügbaren ND-Impfstoffen vorliegen, sind: Clone-30^®, La Sota, Hitchner B1, NDW, C2 und AV4, wobei Clone-30^® der bevorzugte Impfstamm ist.
Gemäss einem weiteren Aspekt dieses Ausführungsbeispiels liefert die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Vektor-Virus, das auf der oben beschriebenen NDV-Mutante basiert. Solch ein rekombinantes Vektor-Virus kann nicht nur für die Herstellung eines Impfstoffs gegen NDV, sondern auch gegen jegliche andere Geflügel-Infektionskrankheiten eingesetzt werden. Alternativ kann solch ein rekombinantes Vektor-Virus auch eine besondere zusätzliche Sicherheit in einem Diagnose-Test liefern und macht die rekombinanten Viren zu attraktiven Dual-Markierungs-Kandidaten.
Ein NDV-Vektor kann durch Substitution innerhalb eines Rahmens (teilweise oder vollständig) des Bereichs erhalten werden, der die NP-Immunodominante Epitope kodiert, wie oben definiert, durch eine heterologe Nukleinsäure-Sequenz, die eine immuno-dominante Epitope eines Polypeptids anders als das NP kodiert, beispielsweise ein Polypeptid eines anderen aviären Pathogens. Die immuno-dominante Epitope stellt einen Bereich eines Polypeptids dar, der mit virtuell allen Anti-Seren wechselwirkt, die durch das Polypeptid (oder eine Zusammensetzung, die dieses enthält) induziert wird.
Bei einem bevorzugten NDV-Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung werden die Nukleotide, die die NP-Aminosäuren-Sequenz 444–459 oder 444–455 kodieren, durch eine heterologe Nukleotid-Sequenz substituiert, insbesondere durch eine heterologe Nukleotid-Sequenz, die 16 beziehungsweise 12 Aminosäuren kodiert.
In Beispiel 5 ist dargelegt, dass eine B-Zellen Epitope eines Virus, welche nicht in Beziehung zu NDV steht, eingesetzt werden kann, um die NP immuno-dominante Epitope von NDV zu ersetzen. Die rekombinanten NDV-Vektoren sind fähig, spezifische Antikörper gegen die fremde Epitope zu induzieren, ohne Antikörper zu induzieren, die gegen die immuno-dominante Epitope auf NP gerichtet sind. Weiterhin ist dargelegt, dass die exprimierte fremde Epitope fähig ist, Schutz gegen einen Challenge durch das entsprechende Wildtyp-Virus zu induzieren.
Ein NDV-Vektor kann also erhalten werden durch das Einfügen einer heterologen Nukleinsäure-Sequenz, die ein Polypeptid eines anderen aviären Pathogens kodiert, in einen nicht übersetzten Bereich der NDV-Mutante. Nicht übersetzte Bereiche, die für diesen Zweck geeignet sind, sind zwischen dem genomischen Promoter und dem Beginn des NP-Gens angeordnet und an den NP/P, P/M, M/F, F/HN und HN/L Gen-Verbindungen, sowohl als auch am Ende des L-Gens und dem antigenomischen Promoter. Die heterologe Nukleinsäure-Sequenz kann ein Antigen oder ein aviäres Pathogen kodieren wie das infektiöse Bursalkrankheits-Virus, das infektiöse Bronchitis-Virus, das Marek-Krankheits-Virus, das aviäre Encephalomyelitis-Virus, das aviäre Reovirus, das aviäre Influenza-Virus, das Hühneranämie-Virus, Salmonella spp., E. Coli, und Eimeria spp.
Eine NDV NP Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden durch das Mittel des wohlbekannten „reversen genetischen" Verfahrens, welches die genetische Modifikation von nicht segmentierten, negativ-strängigen RNS-Viren gestattet (eine Übersicht findet sich bei Conzelmann, Annu. Rev. Genet. 32, 123–162, 1998, und Roberts und Rose, Virology 247, 1–6, 1998).
Zusätzlich ist solch ein Verfahren für NDV durch Peeters et al. (J. Virology, 73, 5001–5009, 1999) und Römer-Oberdörfer et al. (J. Gen. Virol. 80, 2987–2995, 1999) offenbart und in Beispiel 1 beschrieben.
Die gewünschten Mutationen können in das NDV-Genom durch das Mittel von Verfahren eingeführt werden, die im Stand der Technik für diesen Zweck allgemein bekannt sind. Insbesondere sind die Mutationen durch das Mittel der ortsgerichteten Mutagenese eingeführt. Solch ein Verfahren ist beispielsweise hier beschrieben, aber auch im Stand der Technik allgemein bekannt (Peeters et al., 1999, supra; Current Protocols in Molecular Biology, Herausgeber: F. M. Ausubel et al., Wiley N. Y., Ausgabe 1995, Seiten 8.5.1–8.5.9 und Kunkel et al., Methods in Enzymology Band 154, 376–382, 1987).
Zusätzlich zu dem unerwarteten Auffinden, dass eine NDV NP Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung fähig ist, eine Antikörper-Antwort in Hühnern zu induzieren, die sich von denen unterscheiden lässt, die durch natürlich auftretende NDV-Stämme induziert wird, ist auch gefunden worden, dass die NDV NP Mutante, die oben beschrieben worden ist, fähig ist, eine Schutz-Immun-Antwort zu induzieren.
Daher wird gemäss einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung ein Impfstoff gegen die Newcastle-Krankheit bei Geflügel angegeben, die eine NDV NP Mutante, wie sie oben beschrieben worden ist, in einer lebenden oder inaktivierten Form umfasst, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Ein Impfstoff gemäss der Erfindung kann hergestellt werden durch konventionelle Verfahren wie solche, die üblicherweise bei kommerziell verfügbaren lebenden und inaktivierten NDV-Impfstoffen eingesetzt werden.
Kurz gesagt wird ein entsprechend empfindliches Substrat mit der NDV NP Mutante inokuliert und gezüchtet, bis das Virus sich zu einem gewünschten Titer repliziert hat, wonach das NDV-enthaltende Material geerntet wird. Nachfolgend wird das geerntete Material in einem pharmazeutischen Präparat mit immunisierenden Eigenschaften formuliert.
Jedes Substrat, welches fähig ist, die Replikation der ND-Viren zu unterstützen, kann bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, umfassend primäre (aviäre) Zellkulturen, wie Hühnerembryo-Fibroplast-Zellen (CEF) oder Hühnernieren-Zellen (CK) oder Säugetier-Zell-Linien wie die VERO Zell-Linie oder die Babyhamsternieren-Zell-Linie (BHK).
Ein besonders geeignetes Substrat, auf dem die NDV NP Mutante gewachsen werden kann, sind SPF embryonierte Eier. Embryonierte Eier können beispielsweise mit 0.2 ml NDV inokuliert werden, welches ein allantoisches Fluid enthält, welches mindestens 10^2.0 EID₅₀ je Ei umfasst (EID für Embryo infizierende Dosis).
Vorzugsweise werden 9 bis 11 Tage alte embryonierte Eier mit ungefähr 10^5.0 EID₅₀ inokuliert und nachfolgend bei 37°C für 2–4 Tage inkubiert. Nach 2–4 Tagen kann das ND Virus-Produkt geerntet werden, vorzugsweise durch Aufsammeln des allantoischen Fluids. Diese Flüssigkeit kann danach für 10 Min. bei 2500 g zentrifugiert werden, gefolgt vom Filtern des Supernatanten durch einen Filter (100 μm).
Der Impfstoff gemäss der Erfindung umfasst die NDV NP Mutante, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, der üblicherweise für solche Zusammensetzungen eingesetzt wird.
Der Impfstoff, der den lebenden Virus enthält, kann in Gestalt einer Suspension oder in einer lyophilisierten Form hergestellt und vermarktet werden. Träger umfassen Stabilisierungsmittel, Konservierungsmittel und Puffer. Verdünnungsmittel umfassen Wasser, wässrige Puffer und Polyole.
Falls gewünscht, kann der Lebend-Impfstoff gemäss der Erfindung ein Adjuvans enthalten. Beispiele von geeigneten Verbindungen und Verbindungen mit Adjuvans-Aktivität sind dieselben, wie unten für den inaktivierten NDV-Impfstoff beschrieben.
Obwohl die Verabreichung durch Injektion, beispielsweise intramuskulär, subkutan von dem lebenden Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung möglich ist, wird der Impfstoff vorzugsweise durch kostengünstige Massenanwendungs-Techniken verabreicht, wie sie häufig für die NDV-Impfung verwendet werden. Für NDV-Impfungen umfassen diese Techniken das Trinkwasser und Sprüh-Impfung.
Eine zusätzliche unerwartete Eigenschaft der NDV NP Mutante gemäss der Erfindung liegt darin, dass die Virulenz für Hühner-Embryos in signifikanter Weise gedämpft ist, so dass er in ovo verabreicht werden kann. Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung auch einen Impfstoff, der auf einer NDV NP Mutante basiert, wie sie oben beschrieben worden ist, welche für die in ovo Impfung benutzt werden kann.
Der Impfstoff umfassend die NDV NP Mutante kann in embryonierte Eier gemäss den üblichen in ovo Impfmethoden injiziert werden. Üblicherweise wird der Impfstoff in embryonierte Eier während der späten Stufen der Embryonierung injiziert, allgemein während dem letzten Drittel der Inkubations-Periode (Tag 15–21), vorzugsweise am Tag 18 und 19 der Inkubations-Periode. Der Injektionsmechanismus der inkubierten Eier ist nicht besonders kritisch, soweit er nicht nicht-notwendiges Beschädigen der Gewebe und Organe des Embryos verursacht. Beispielsweise wird ein kleines Loch mit einer Nadel (1-1+/2 Zoll, ungefähr 22 Gauge), welche an einer Spritze befestigt ist, am grossen Ende der Schale gebohrt, und der Impfstoff wird unterhalb der inneren Schalen-Membrane und der chorioallantoischen Membrane injiziert. Nachfolgend werden die geimpften embryonierten Eier in einen Inkubator überführt, um dort auszuschlüpfen ( US 4'458'630 , US 5'427'791 , WO 98/56413 und WO 95/35121). Vorzugsweise wird der gesamte Embryo-Impfprozess ausgeführt unter Einsatz eines automatischen Impf-Systems, wie das kommerziell verfügbare Inovoject^®.
Gemäss einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff vorgeschlagen, der die NDV NP Mutante in einer inaktivierten Form umfasst. Die Hauptvorteile eines inaktivierten Impfstoffes liegen in seiner Sicherheit und den hohen Niveaus von Schutz-Antikörpern von langer Dauer, die induziert werden können.
Das Ziel der Inaktivierung der Viren, die nach dem Wachstumsschritt geerntet werden, liegt in der Elimination der Reproduktion der Viren. Im Allgemeinen kann dies durch wohlbekannte chemische oder physikalische Mittel erreicht werden.
Ein Impfstoff, der die inaktivierte NP-Mutante gemäss der Erfindung umfasst, kann beispielsweise eine oder mehrere der oben erwähnten pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfassen, die für diesen Zweck geeignet sind.
Vorzugsweise umfasst ein inaktivierter Impfstoff gemäss der Erfindung eine oder mehrere Verbindungen mit Adjuvans-Aktivität. Geeignete Verbindungen oder Zusammensetzungen für diesen Zweck umfassen Aluminium-Hydroxid, -Phosphat, oder -Oxyd, Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl Emulsion, die beispielsweise auf einem mineralischen Öl wie Bayol F^® oder Marcol 52^® oder einem pflanzlichen Öl wie Vitamin E Acetat und Saponinen basieren.
Der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst eine effektive Dosismenge der NDV NP Mutante als aktivem Wirkstoff, d.h. eine Menge von immunisierendem NDV-Material, welches Immunität in den geimpften Vögeln gegen ein Challenge durch ein virulentes Virus induziert. Immunität ist hierunter als die Induktion eines signifikant höheren Niveaus von Schutz in einer Vogelbevölkerung gegen Sterblichkeit und klinische Symptome nach der Impfung gegenüber einer nicht geimpften Gruppe definiert.
Insbesondere verhindert der Impfstoff gemäss der Erfindung bei einem grossen Anteil von geimpften Tieren das Auftreten von klinischen Symptomen der Krankheit und Sterblichkeit.
Typischerweise kann der Lebend-Impfstoff in einer Dosis zwischen 10^2.0–10^8.0 für Embryo-infektiöse Dosen (EID₅₀) verabreicht werden, vorzugsweise in einem Dosis-Bereich zwischen 10^4.0–10^7.0 EID₅₀. Inaktivierte Impfstoffe können das antigene Äquivalent von 10^4.0–10^9.0 EID₅₀ umfassen.
Inaktivierte Impfstoffe werden üblicherweise parenteral, beispielsweise intramuskulär oder subkutan verabreicht.
Obwohl der NDV-Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung effektiv gegen Hühner eingesetzt werden kann, können auch andere Geflügelarten wie Truthahn, Tauben, Wachteln, Fasane, Perlhühner und Rebhühner oder Feldhühner in erfolgreicher Weise mit dem Impfstoff geimpft werden. Hühner umfassten Hähnchen, Reproduktionsschwärme und Legeschwärme.
Das Alter der Tiere, die nach dem Schlüpfen einen lebenden oder inaktivierten Impfstoff gemäss der Erfindung erhalten ist das selbe wie bei den Tieren, die konventionelle lebende oder inaktivierte NDV-Impfstoffe erhalten. Beispielsweise können Hähnchen mit dem Alter von einem Tag oder im Alter von 1–3 Wochen geimpft werden, insbesondere Hähnchen mit hohen Niveaus von MDA. Legeschwärme oder Reproduktionsschwärme können im Alter von 1–10 Tagen geimpft werden und mit einem lebenden oder inaktivierten Impfstoff im Alter von 6–12 und 16–20 Wochen geimpft werden.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Kombinations-Impfstoffe, umfassend zudem NDV NP Mutanten gemäss der Erfindung eines Impfstam mes, der fähig ist, Schutz gegen ND oder irgend ein anderes aviäres Pathogen zu gestalten.
Vorzugsweise umfassen Kombinations-Impfstoffe zusätzlich einen oder mehrere Impfstämme des Mareks Krankheitsvirus (MDV), infektiösem Bronchitis-Virus (IBV), Newcastle Krankheitsvirus (NDV), Eifall-Syndrom (EDS) Virus, Truthahn Rhinotracheitis Virus (TRTV) oder Reovirus.
Der zusätzliche ND Impfstamm in dem Kombinations-Impfstoff ist vorzugsweise ein rekombinanter (Virus) Impfstoff-Vektor, der fähig ist, das F oder HN-Protein des NDV zu exprimieren. Solche virale Impfvektoren sind wohl bekannt und ihre Sicherheit und Wirksamkeit ist intensiv studiert worden: Morgan et al., Avian Diseases 36, 858–870, 1992 und Avian Diseases 37, 1032–1040, 1993; Heckert et al., Avian Diseases 40, 770–777, 1996; Sakaguchi et al., Vaccine 16, 472–479, 1998 und Sonoda et al., J. Virol. 74, 3217–3226, 2000.
Bei einem bevorzugtesten Ausführungsbeispiel ist der rekombinante Impfstoff-Vektor in einem Kombinations-Impfstoff gemäss der Erfindung ein rekombinanter HVT Vektor, der fähig ist, das NDV F oder HN-Protein zu exprimieren.
Im Falle, dass der Kombinations-Impfstoff über die in ovo Route verabreicht wird, sollte der zusätzliche Impfstoff ein Embryonen-sicherer Impfstamm sein, d.h. ein Lebend-Impfstamm, der, falls er in SPF Eier am Embryonations-Tag 18 inokuliert wird, in dem Schlüpfen von mindestens 70% der embryonierten Eier resultiert.
Der oben beschriebene NDV Marker-Impfstoff ermöglicht es, im Zusammenspiel mit einem Diagnose-Verfahren, die Unterscheidung zwischen Tieren zu treffen, die mit diesem Impfstoff geimpft sind und Tieren, die mit natürlich auftretenden NDV-Stämmen infiziert worden sind oder mit üblichen ND-Impfstoffen geimpft worden sind.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein unschätzbares Werkzeug, um ND Kontroll-Massnahmen zu überwachen, die zur Ausradierung von NDV führen können, falls sie in grossräumigen Ausrottungs-Programmen angewandt werden. Dieses Werkzeug betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der NDV-Infektion in einem Geflügel, umfassend den Schritt des Examinierens einer Probe des Tieres auf Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern, die mit der immuno-dominanten Epitope innerhalb eines Bereichs des NP reagieren, welcher die Aminosäuren-Sequenz (447–455) hat.
Die Probe des in diesem Verfahren eingesetzten Tieres kann jede Probe sein, bei welcher NDV Antikörper erfasst werden können, beispielsweise eine Blut-, Serum- oder Gewebe-Probe, wobei eine Serum-Probe bevorzugt wird.
Als Antigen in solch einem Verfahren wird ein Fragment des NP eingesetzt, welches den (447–455) Bereich als einzigen Epitope enthaltenden Bereich aufweist. Daher umfasst ein Verfahren zur Bestimmung der NDV-Infektion in einem Tier die folgenden Schritte.

(i) Inkubieren einer Probe, die verdächtigt wird, Anti-NDV Antikörper zu enthalten, mit einem Fragment des NP umfassend den Aminosäurenbereich (447–455) als einzige Epitope enthaltenem Bereich,
(ii) Gestatten der Ausbildung eines Antikörper-Antigen Komplexes, und
(iii) Erfassen der Gegenwart des Antikörper-Antigen Komplexes.

Bei einem bevorzugten diagnostischen Verfahren ist das Fragment des NP das Polypeptid, welches die Aminosäure-Sequenz 360–470 hat, oder ein Teil davon, welcher die Bereiche (447–455) umfasst.
Bei einem besonders bevorzugten Diagnose-Verfahren ist das eingesetzte Antigen das 18-mer Peptid mit der Aminosäure-Sequenz 443–460.
Das Design des Immunoassays kann variieren. Beispielsweise kann der Immunoassay auf einer Wettbewerbs- oder einer direkten Reaktion beruhen. Weiterhin können Protokolle feste Stützpunkte oder zelluläres Material benutzen. Die Erfassung des Antikörper-Antigen Komplexes kann den Einsatz von markierten Antikörpern umfassen; die Markierer können beispielsweise Enzyme, fluoreszierende, chemolumineszierende, radioaktive oder Farb-Moleküle enthalten.
Geeignete Verfahren zur Feststellung von NDV Antikörpern in der Probe umfassen das Enzym-verbundene immunosorbierende Assay (ELISA), den Immunoflureszenz-Test (IFT) und Western Blot Analyse, wobei das ELISA die bevorzugteste Methode ist.
Bei einem beispielhaften ELISA sind die Wände einer Polystyrol Mikrotiterplatte mit einem geeigneten Fragment des NP beschichtet, welches eine immuno-dominante Epitope umfasst. Danach werden die Proben der beschichteten Platten mit Hühner-Serum gefüllt und serielle Verdünnungen werden durchgeführt. Nach der Inkubation wird die Gegenwart oder Abwesenheit von relevanten Hühner anti-NP Serum Antikörpern, die gegen eine immuno-dominante Epitope gerichtet sind, durch einen markierten (beispielsweise Meerrettich Peroxidase konjugiert) Erfassungs-Antikörper bestimmt, der an gefangenen anti-NP Antikörpern bindet (falls im Test-Serum vorhanden). Die Menge an relevanten Antikörpern, die in dem Serum enthalten sind und die an das NP-Fragment gebunden sind, kann durch Inkubation der Platten mit Enzym-Substrat bestimmt werden, wonach der Absorbanz-Wert (OD) in einem Mikroplatten-Autoleser ausgelesen wird.
Bei einem alternativen Ausführungsbeispiel des Diagnose-Verfahrens wird das Vorhandensein von spezifischem Antikörper-Hühnerserum durch Inkubieren des Serums und eines geeigneten Antigen in Gegenwart eines monoklonalen Antikörpers geprüft, der spezifisch mit einer Epitope reagiert, die in dem (447–455) Bereich angeordnet ist.
Antikörper erfassungs-basierte ELISA's für NDV infizierten gegen NDV (subunit) geimpfte Hühner, basierend auf dem gesamten NP als das Antigen, sind durch Makkay et al., (1999, supra) und Errington et al. (J. Virol. Methods 55, 357–365, 1995) beschrieben worden und das darin beschriebene Prinzip kann demgemäss angewandt werden, wenn das relevante Antigen eingesetzt wird.
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein Diagnose-Test-Kit geliefert, welches geeignet ist, das Diagnose-Verfahren gemäss der Erfindung wie oben beschrieben durchzuführen.
Insbesondere wird ein Diagnose-Kit geliefert, welches zusätzlich zu den üblicherweise vorhandenen Komponenten ein geeignetes NP-Fragment aufweist, wie es oben beschrieben worden ist, vorzugsweise das 18-mer (443–460) Peptid, vorzugsweise verbunden mit einem Träger-Molekül (falls gewünscht auf einer Fest-Phase beschichtet), als das antigene Reagenz. Andere Komponenten, die üblicherweise in solch einem Test-Kit vorhanden sind, umfassen Biotin oder Meerrettich Peroxidase konjugierte Antikörper, Enzym-Substrate, Wasch-Puffer etc..
Beispiel 1
Erzeugung eines rekombinanten NDV, dem eine immuno-dominante Epitope auf dem Nukleoprotein (NP) fehlt
Materialien und Verfahren
Einführung der Mutation in das Voll-Längen NDV cDNS
Um mutante NDV's zu erzeugen, ist das Plasmid pflNDV, das Volllängen-Antigenom RNS des lentogenen ND Impfstammes exprimierend, Clone-30 (Römer-Oberdörfer et al., J. Gen. Virol. 80, 2987–2995, 1999), eingesetzt worden, um Mutationen einzuführen. Innere Löschungen im Bereich, wo die immuno-dominante Epitope angeordnet ist, sind eingeführt worden unter Einsatz des so genannten „quick change site directed mutagenesis kit" gemäss den Instruktionen des Lieferanten (Stratagene). Zuerst ist ein DNS-Fragment, welches die Nukleotide 77–2289 des NDV-Genoms umfasst, durch Aufschliessen von pflNDV mit MluI, aufgefüllt mit Klenow und behandelt mit ApaI hergestellt worden. Das ~2.2 kB DNS-Fragment ist in den pSKT7T Vektor ligiert worden, der mit ApaI und EcoRI aufgeschlossen worden ist. PCR-Mutagenese ist dann auf dem oben beschriebenen Template durchgeführt worden unter Einsatz des folgenden Sets von Primern (SEQ ID Nr: 5–10):
Um die Nukleotide 1451–1486 zu löschen, entsprechend den NP Aminosäuren 444–455
Um die Nukleotide 1448–1501 zu löschen, entsprechend den NP Aminosäuren 443–460
Um die Nukleotide 1445–1588 zu löschen, entsprechend den NP Aminosäuren 442–489
Mutagenisierte Klone sind durch AatII/ApaI ausgeschlossen worden und in dieselben Orte von pflNDV kloniert worden. Die Gegenwart von eingeführten Mutationen ist durch Sequenzierung der jeweiligen Klone bestätigt worden. Die sich ergebenden Volllängen-Klone, mit Löschungen auf dem NP-Gen, entsprechend den Aminosäuren-Positionen 444–455, 443–460, oder 442–489 sind NDV-Δ12, NDV-Δ18, respektive NDV-Δ48 genannt worden (1).
Wiedergewinnung der rekombinanten Viren
Ungefähr 1.5 × 10⁶ BSR-T7/5 Zellen, die stabil Phagen T7 RNS Polymerase exprimieren, sind über Nacht auf 90% Konfluenz in 3.2 cm aufweisende Petri-Schalen aufgezogen worden. Die Zellen sind mit Plasmid-Mischungen transfektiert worden, die 5 μg pCite-NP, 2.5 μg pCite-P, 2.5 μg pCite-L und 10 μg von einem der Volllängen-Klone, enthalten unter Einsatz eines Säugetier-Transfektions-Kits (CaPO₄ Transfektions-Protokoll; Stratagene). Drei bis fünf Tage nach der Transfektion sind die Supernatanten geerntet worden und in den allantoischen Hohlraum von 9–11 Tage alten embryonierten SPF Hühnereiern inokuliert worden. Nach 3–4 Tagen der Inkubation ist die Anwesenheit des Virus in dem allantoischen Fluid durch einen Schnell-Platten Hämagglutination (HA) Test unter Einsatz von Hühner-Erythrocyten bestimmt worden.
Ergebnisse
Um die immuno-dominante Epitope auf dem NP-Gen zu löschen oder die Exprimierung des C-terminierten Teils von NP zu blockieren, sind die Modifikationen durchgeführt worden, die unter Materialien und Verfahren beschrieben worden sind. Jeder modifizierte Volllängen-cDNS Klon, zusammen mit drei Unterstützungsplasmiden, die die NDV NP, P und L Proteine exprimieren, sind in BSR-T7/5 Zellen transfektiert worden. Nach 3–5 Tagen der Inkubation sind die Supernatanten geerntet worden und in 9–11 Tage alte embryonierte SPF Hühnereier inokuliert worden. Nach 3–4 Tagen der Inkubation sind allantoische Fluidproben geerntet worden und einem HA-Test unterzogen worden. HA ist in Eiern festgestellt worden, die mit dem Supernatanten inokuliert worden sind, der aus Zellen stammt, die mit der unmodifizierten pflNDV transfektiert worden sind. Überraschenderweise ist unter Einsatz des HA Tests nach einer zusätzlichen Ei-Passage NDV-Δ18 festgestellt worden. NDV-Δ18 ist dann seriell für eine Gesamtheit von acht Passagen in embryonierten SPF Eiern passagiert worden. RNS ist aus Zellen isoliert worden, die bei jeder Passage infiziert worden sind und einer RT-PCR unterworfen wurden. Bei allen Passagen ist die eingeführte Löschung beibehalten worden, was die Stabilität des rekombinanten Virus demonstriert. Der infektiöse Virus ist nicht in dem allantoischen Fluid der embryonierten Eier gefunden worden, welche mit dem Supernatanten inokuliert worden sind, welcher aus den NDV-Δ12 und NDV-Δ48 Transfektionen stammt, selbst nach drei aufeinander folgenden Ei-Passagen.
Beispiel 2
NDV-Δ18 kann als Marker-Impfstoff eingesetzt werden
Materialien und Verfahren
Immunisierung von Hühnern mit NDV-Δ18 und Analyse der Seren.
Fünfzehn SPF Hühner im Alter von 3 Wochen sind mit NDV-Δ18 über den oculo-nasalen Weg mit einer Dosis von 6.5log₁₀ EID₅₀ je 0.2 ml immunisiert worden und 5 Wochen nach der ersten Immunisierung mit der selben Dosis geboostet worden. Serum-Proben sind kurz vor der Impfung und 2, 5 und 7 Wochen nach der ersten Immunisierung gesammelt worden. Die Serumproben sind auf Hämagglutinations-Inhibition (HI) Test und ELISA's getestet worden, um das Niveau der Serokonversion festzustellen.
Enzym-verbundener immunosorbanter Assay (ELISA).
Ein 18-mer synthetisches Peptid (SEQ ID Nr. 1) umfassend die Aminosäure-Sequenz (443–460) des Nukleoproteins ist synthetisiert worden und mit dem bovinen Serumalbumin (BSA) verbunden worden. Kurz, das synthetische Peptid (2 mg) ist mit BSA verbunden worden (jeweils 4:1 molares Verhältnis) durch Einsatz von 20 mM Glutaraldehyd in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) als ein Quervernetzer (Crosslinker). Parallel dazu ist ein negatives Kontroll-Antigen hergestellt worden durch Querverbinden einer BSA-Mischung ohne Hinzufügung des Peptids. Infolge einer Inkubation über Nacht bei Umgebungstemperatur ist die Querverbindungs-Reaktion durch Hinzufügung eines stabilisierenden Puffers, welcher Glycin enthielt, zu der Reaktionsmischung gestoppt worden. Die BSA/Peptid Mischungen sind aufgeteilt und bei –20°C gelagert worden.
Mikrotiter-Platten sind über Nacht bei 2–8°C mit 0.5 μg synthetischem Peptid beschichtet worden, welches mit BSA gekoppelt ist oder mit BSA alleine in einem beschichteten Puffer (Carbonat-Puffer, pH-Wert 9.6). Ungebundenes Antigen ist durch Waschen der Näpfe viermal mit PBST-Lösung (PBS, Tween-20) entfernt worden.
Vor dem Testen sind die Serum-Proben 50-fach in IB-EIA Lösung (0.2 M Na₂HPO4-2H₂O Puffer, pH-Wert 7.0, 0.05% Tween-20, 0.5 M NaCl, 0.1% BSA) verdünnt und zu den beschichteten Proben hinzugefügt worden. Infolge einer 1.5-stündigen Inkubation bei 37°C in befeuchteter Atmosphäre sind die Näpfe mit PBST-Lösung gewaschen worden und mit 100 μl Meerrettich Peroxidase konjugierten Kaninchen Anti-Hühner Immunoglobinen inkubiert worden, aufgelöst in EIA-Lösung. Nach 45 Minuten Inkubation bei 37°C sind die Näpfe mit PBST gewaschen worden und die Antigen-Antikörper Komplexe sind durch Hinzufügung von TMB als Substrat festgestellt worden.
Nach 15 Minuten Inkubation bei Umgebungstemperatur ist die Reaktion durch Hinzufügung von 50 μl 2 M Schwefelsäure zu jedem Napf gestoppt worden. Optische Dichten sind bei 450 nm gemessen worden. Der Grenzwert, der sogenannte Cut-Off-Wert (COV) ist bei drei Standard-Abweichungen oberhalb der mittleren P/N Verhältnisse der negativen Kontroll-Proben aus SPF Hühnern gesetzt worden (wobei P = optische Dichte (OD) der Proben von den mit Peptid beschichteten Näpfen und; N = OD der Proben von BSA beschichteten Näpfen).
Um die gesamten NDV-spezifischen Antikörper-Antworten in den getesteten Serum-Panels zu messen, sind Mikrotiter-Platten mit Saccharose-Gradienten gereinigten NDV Clone 30 Antigenen beschichtet worden. Kurz gesagt sind die Näpfe über Nacht mit 0.5% Triton X-100 behandelten viralen Antigenen (1.0 μg/ml) in 40 mM Phosphat Puffer (PBS, pH-Wert 7.2) beschichtet worden. Infolge der Entfernung von ungebundenen Antigenen durch Waschen mit PBST sind die Proben nachträglich mit 10% v/v Donor-Pferdeserum in PBS nachbeschichtet worden. Näpfe, die ausschliesslich die nachbeschichteten Antigene enthielten, sind als negative Kontrolle eingesetzt worden. Die getesteten Serum-Proben sind (1:150) in IB-EIA Lösung verdünnt worden und sowohl zu den positiven als auch zu den negativen Kontrollproben hinzugefügt worden. Die verbleibenden Inkubations-Schritte der ELISA-Prozedur sind identisch zu dem Peptid-basierten ELISA, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme des konjugierten Verdünnungspuffers IB-EIA, der mit 5%-igem Donor-Pferdeserum versetzt worden ist. Der Grenzwert (COV) ist auf drei Standard-Abweichungen oberhalb des P/N Verhältnisses der negativen Kontroll-Proben von SPF Hühnern gesetzt worden.
Ergebnisse
Die Seren von Tieren, die mit dem rekombinanten NDV-Δ18 geimpft worden sind, sind 2, 5 und 7 Wochen gesammelt worden und einem HI Test und ELISA unterworfen worden. Wie in 2 dargestellt, waren die mittleren HI Titer 4.7, 4.9 und 7.7 bei 2, 5 beziehungsweise 7 Wochen nach der ersten Immunisierung. Es gab auch eine entsprechende hohe Reaktion in dem gesamten Virus-basierten ELISA, welches die Induktion einer beträchtlichen Immun-Antwort gegen das rekombinante Virus zeigt. Im Gegensatz dazu reagierte keines der Seren in dem ELISA, welches mit dem Peptid beschichtet worden ist, was zeigt, dass Hühnern, die mit dem NDV-Δ18 immunisiert worden sind, vollständig Antikörper fehlen, die gegen die immuno-dominante Epitope des NP Proteins gerichtet sind, selbst nach einer Booster-Immunisierung (Seren nach 7 Wochen). Die Analyse der Seren, die von Tieren erhalten worden sind, die mit konventionellen inaktivierten oder lebenden Virus-Impfstoffen geimpft worden sind, zeigten Reaktivität gegen den Gesamtvirus ELISA. Darüber hinaus waren alle getesteten Seren positiv bei dem Peptid-basierten ELISA (2), was die Präsenz der Antikörper zeigt, welche gegen die immuno-dominante Epitope von NP in den Seren gerichtet ist, die von Tieren gesammelt worden sind, die mit üblichen ND-Impfstoffen immunisiert worden sind. Daher kann das Peptid-basierte ELISA die Antikörper-Antwort auf das rekombinante NDV-Δ18 gegenüber den konventionellen ND-Stämmen unterscheiden.
Beispiel 3
NDV-Δ18 als in ovo Marker-Impfstoff, verabreicht alleine oder in Kombination mit einem anderen Vektor-Impfstoff
Materialien und Verfahren
Virus-Ausbreitung in embryonierten Eiern.
Um den Virus-Titer und die Embryo-Sterblichkeit zu bestimmen, sind seriell 10-fache Verdünnungen des rekombinanten NDV-Δ18 Virus hergestellt worden und 9 bis 11 Tage alte embryonierte SPF Hühnereier sind in den allantoischen Hohlraum inokuliert worden. Die Eier sind täglich auf Embryo-Sterblichkeit für mindestens 7 Tage beobachtet worden und die 50%-ige embryo-letale Dosis (ELD₅₀) ist unter Einsatz des Verfahrens von Reed und Muench (Am. J. Hyg. 27, 493–497, 1938) bestimmt worden. Ein Schnellplatten-HA-Test (auch sogenannter „Rapid plate HA Test") ist auch auf einem anderen Satz von Eiern 4 Tage nach der Inkubation ausgeführt worden und der Titer, ausgedrückt als 50%-ige embryo-infektiöse Dosis (EID₅₀) ist mit demselben Verfahren berechnet worden.
In ovo Impfung und Challenge
Achtzehn Tage alte embryonierte SPF Hühnereier sind mit dem rekombinanten NDV-Δ18 Virus alleine oder in Kombination mit einem HVT-Vektor exprimierenden NDV F Protein (Morgan et al., Avian Dis. 37, 1032–1040, 1993) inokuliert worden. Unter Einsatz einer 23G Nadel, sind 0.1 ml der Virusverdünnung oder negatives allantoisches Fluid injiziert worden, durch ein Loch, welches an dem stumpfen Ende des Eis erzeugt worden ist, gerade unterhalb der Luftsack-Membrane. Die Eier sind weiter bis zum Schlüpfen inkubiert worden. Die in Prozent ausgedrückte Schlüpf-Fähigkeit ist aufgezeichnet worden und die Hühner sind täglich auf ihren allgemeinen Gesundheitszustand untersucht worden. Im Alter von 3 Wochen sind Blutproben genommen worden und die Viren sind auf NDV-Antikörper in dem NDV Hämagglutinations-Inhibitions-Test (HI) Test und ELISA's in Assays untersucht worden. Im Alter von 3 Wochen sind alle Tiere mit intramuskulär verabreichtem virulenten NDV Herts-Stamm gechallenged worden. Die Hühner sind täglich über eine Zeitdauer von 10 Tagen auf das Auftreten von klinischen Symptomen von Krankheit oder Sterblichkeit untersucht worden.
Ergebnisse
NDV-Δ18 ist in seiner Pathogenizität für Hühner-Embryos gedämpft worden.
Um die Embryo-Sterblichkeit zu bestimmen, die durch NDV-Δ18 bewirkt worden ist, sind 10-fache serielle Verdünnungen von Passage 3 des NDV-Δ18 in 11 Tage alte embryonierte SPF Hühnereier (0.2 ml/Ei) inokuliert worden und diese für 1 Woche inkubiert worden. In erstaunlicher Weise ist keinerlei Embryo-Sterblichkeit während der 7 Tage Inkubationsdauer festgestellt worden, was zeigt, dass NDV-Δ18 in beträchtlichem Mass für Embryos gedämpft worden ist (3). Hühner-Embryos, die mit dem Eltern-Virus inokuliert worden sind, dem rekombinanten NDV(rNDV), begannen bereits drei Tage nach der Inokulation zu sterben, bei Dosen, die höher als 4log₁₀ EID₅₀/ml betrugen. Der Unterschied zwischen der 50%-igen infektiösen Dosis und der 50%-igen letalen Dosis von rNDV lag nur bei 0.3log₁₀. Im Gegensatz dazu war dieser Unterschied so gross wie 8.0log₁₀ für NDV-Δ18, was zeigt, dass es in signifikanter Weise gedämpft ist (3).
NDV-Δ18 ist ein wirksamer in ovo Marker-Impfstoff.
NDV-Δ18 ist in grossem Masse für Hühner-Embryos gedämpft worden, wenn es 9 bis 11 Tage alten Embryos verabreicht worden ist; dafür ist ein in ovo (Embryo) Impf-Experiment ausgeführt worden, um die Sicherheit und die Wirksamkeit des NDV-Δ18 (Tabelle 1) zu bestimmen. Hühner, die von in ovo geimpften embryonierten Eiern geschlüpft sind, sind mit einem velogenen Herts-Stamm des NDV gechallenged worden. Hühner, die als Embryos mit NDV-Δ18 geimpft worden sind, entwickelten hohe Antikörper-Niveaus und der Schutz gegen einen letalen Challenge war 100%, unabhängig davon, ob NDV-Δ18 alleine oder in Kombination mit HVT rekombinant-exprimierendem NDV-F (Tabelle 1) gegeben worden war. Alle Kontroll-Hühner starben innerhalb von 3 Tagen nach dem Challenge. Diese Daten zeigen, dass NDV-Δ18 einen vollen Schutz bereitstellen kann, wenn es 18 Tage alten SPS Hühner-Embryos verabreicht wird.
Um zu bestimmen, ob Tiere, die in ovo mit NDV-Δ18 geimpft worden sind, sich in serologischer Weise von infizierten Tieren oder Tieren unterscheiden, die mit konventionellen Impfstoffen geimpft worden sind, sind Blutproben beim Alter von 3 Wochen genommen worden und dem ELISA unterworfen worden, wie er in Beispiel 2 beschrieben worden ist. Wie erwartet, reagierten alle Seren von NDV-Δ18 geimpften Tieren nicht mit dem ELISA, welcher auf dem Peptid basiert, welches die immuno-dominante Epitope auf dem NP-Gen umfasst, wohingegen alle Seren mit dem Gesamtvirus-ELISA und dem HI-Test (4) reaktiv waren. Dies zeigt, dass die in ovo-Verabreichung des NDV-Δ18 nicht die Möglichkeit beeinträchtigte, NDV-Δ18 geimpfte Tiere von den infizierten Tieren zu unterscheiden. Die Abwesenheit einer Antwort auf die immuno-dominante Epitope des NP-Gens ist auch bestätigt worden, wenn NDV-Δ18 in ovo in Kombination mit HVT-NDV/F verabreicht worden ist, einem Vektor-Impfstoff, der das NDV Fusion (F) Protein (4) exprimiert. Dies zeigt, dass NDV-Δ18 mit anderen Vektor-Impfstoffen kombiniert werden kann, die nicht den immuno-dominanten Bereich des NDV Nukleoproteins exprimieren. Tabelle 1 Sicherheit und Wirksamkeit von NDV-Δ18 und NDV-Δ18 plus HVT-NDV/F in SPF Hühnern, geimpft in ovo nach 18 Tagen der Embryonierung.

^a Dosis in log₁₀ EID₅₀ je Ei für NDV und pBE je Ei für HVT-NDV/F, berechnet nach der Rück-Titrierung der Proben
^b Hämagglutinations-Inhibition (HI) Titer (2log) gegen NDV im Alter von zwei Wochen
^c Hühner sind mit Herts-Stamm des NDV im Alter von 3 Wochen mit einer Dosis von 5.5log₁₀ EID₅₀/Huhn intramuskulär gechallenged worden.

Wie in Tabelle 1 dargestellt, ist die Schlüpffähigkeit von SPF-Tieren vermindert, insbesondere, wenn höhere Dosen von NDV-Δ18 eingesetzt worden sind. Um zu bestimmen, ob die mütterlich abgeleiteten Antikörper (MDA) die Sicherheit von NDV-Δ18 modulieren, sind kommerzielle Hühner in in ovo mit NDV-Δ18 alleine oder in Kombination mit HVT-NDV/F geimpft worden. Die Schlüpf-Fähigkeit von embryonierten kommerziellen Hühnereiern war vollständig unbeeinträchtigt durch die in ovo Verabreichung von NDV-Δ18 alleine oder in Kombination mit HVT-NDV/F (Tabelle 2), was die Sicherheit von NDV-Δ18 bei Tieren mit MDA zeigt. Tabelle 2. Sicherheit von NDV-Δ18 oder NDV-Δ18 in Kombination mit HVT-NDV/F bei kommerziellen Hühnern, die in ovo am 18. Tag der Embryonierung geimpft worden sind.

^a Dosis in log₁₀ EID₅₀ je Ei für NDV und pBE je Ei für HVT-NDV/F, berechnet nach der Rück-Titrierung der Proben
^b Der mittlere HI-Titer von NDV-spezifischer MDA zur Zeit des Schlüpfens lag bei 5.3 ± 1.1.

Zusätzlich ist die Schlüpf-Fähigkeit nach der Verabreichung von NDV-Δ18 am Tag 18 oder 19 der Embryonierung verglichen worden. Wie es in Tabelle 3 dargestellt ist, war die Schlüpf-Fähigkeit von SPF-Embryos, die am Tag 19 der Embryonierung geimpft worden sind, 100%, im Vergleich zu 76% der Embryos, die 18 Tage nach der Embryonierung geimpft worden sind.
Tabelle 3 Sicherheit von NDV-Δ18 in SPF-Hühnern, die in ovo am Tag 18 oder 19 der Embryonierung geimpft worden sind.
Beispiel 4
NDV-Δ18 als ein wirksamer Marker-Impfstoff nach dem Schlüpfen
Materialien und Verfahren
Um die Sicherheit und Wirksamkeit von NDV-Δ18 als Impfstoff nach dem Schlüpfen zu bestimmen, sind ein Tag alte SPF-Hühner über den Augentropfen-Weg mit einer Dosis von 6log₁₀ EID₅₀/Huhn geimpft worden. Die Hühner sind täglich auf klinische Anzeichen hin untersucht worden und im Alter von 3 Wochen sind Blutproben genommen worden und alle Tiere sind mit intramuskulär verabreichtem virulenten NDV Herts-Stamm gechallenged worden. Die Seren sind auf NDV-Antikörper in dem NDV Hämagglutinations-Inhibitions (HI) Test und ELISA's untersucht worden. Die Hühner sind täglich für eine Zeitdauer von 2 Wochen nach dem Challenge auf das Auftreten von klinischen Anzeichen von Krankheit oder Sterblichkeit beobachtet worden.
Ergebnisse
Hühner, die nach dem Schlüpfen mit NDV-Δ18 geimpft worden sind, entwickelten NDV-spezifische Antikörper und der Schutz gegen den letalen Challenge war bei der verabreichten Dosis (Tabelle 4) grösser als 90%. Alle Kontrollhühner starben innerhalb von 3 Tagen nach dem Challenge. Während der Beobachtungsdauer vor dem Challenge sind keine auf die Impfung bezogene nachteilige Zeichen festgestellt worden. Um zu bestimmen, ob die mit dem NDV-Δ18 geimpften Tiere serologisch von infizierten Tieren unterschieden werden konnten, oder von Tieren, die mit konventionellen Impfstoffen geimpft worden waren, sind Blutproben gerade vor dem Challenge im ELISA, wie in Beispiel 2 beschrieben, unterworfen worden. Wie erwartet, waren alle Seren reaktiv mit dem Gesamtvirus-ELISA und im HI-Test, aber nicht mit dem ELISA, der auf dem Peptid basiert, welches die immuno-dominante Epitope des NP-Gens umfasst. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass NDV-Δ18 nicht nur für die in ovo Verabreichung geeignet ist, sondern auch ein sicherer und wirksamer Marker-Impfstoff nach dem Schlüpfen ist. Tabelle 4. Sicherheit und Wirksamkeit des NDV-Δ18 in ein Tag alten SPF-Hühnern, die über den Augentropfen-Weg geimpft worden sind.

^a Dosis in log₁₀ EID₅₀ je Huhn
^b Hämagglutinations-Inhibition (HI) Titer (2log) gegen NDV im Alter von 3 Wochen
^c Hühner sind mit dem Herts-Stamm des NDV im Alter von 3 Wochen mit einer Dosis von 6.0log₁₀ EID₅₀/Huhn intramuskulär gechallenged worden.

Beispiel 5
Marker-Impfstoff, welcher eine fremde Epitope exprimiert
Materialien und Verfahren
Konstruktion und Erzeugung von rekombinanten Viren.
Um die Möglichkeit des Exprimierens einer fremden Epitope durch ein rekombinantes NDV zu bestimmen, ist eine wohl charakterisierte B-Zellen Epitope des S2 Glykoproteins des Maus-Hepatitis- Virus (MHV) (Talbot et al., Virology, 132, 250–260, 1984; Luyties et al., J. Virol. 63, 1408–1415, 1989) gewählt worden, um die NP immuno-dominante Epitope des NDV zu ersetzen. Der Ersatz im Rahmen ersetzte entweder 16 Aminosäuren (Nukleotid-Positionen 1451 bis 1499, entsprechend den Aminosäuren 444 bis 459 des NP) oder 12 Aminosäuren (Nukleotid-Positionen 1451 bis 1486, entsprechend den Aminosäuren 444 bis 455 des NP) mit zwei überlappenden Sequenzen von 16 Aminosäuren (MHV Epitope-1) beziehungsweise 10 Aminosäuren (MHV Epitope-2), umfassend die Epitope auf dem S2 Glykoprotein des MHV.
Die Sequenz der MH Eptiope-1 (Zugangs-Nr. NCBI NC_001846; Nukleotide 26464–26511 des gesamten Genoms; Aminosäuren 845–860 des S2-Proteins):
Sequenz der MHV Epitope-2 (Zugangs-Nr. NCBI NC_001846; Nukleotide 26470–26499 des gesamten Genoms; Aminosäuren 847–856 des S2-Proteins):
PCR-Mutagenese ist auf dem 2.2 kb MluI/ApaI Subklon, der im Beispiel 1 beschrieben worden ist, unter Einsatz von einem geeigneten Paar von Primern, durchgeführt worden:
Mutagenisierte Klone sind durch AatII/ApaI aufgeschlossen worden und in dieselben Orte des pflNDV geklont worden. Die Gegenwart der eingeführten Mutationen ist bestätigt worden durch Sequenzierung der entsprechenden Klone. Die sich ergebenden Volllängen-Klone, bei denen die NP-Aminosäuren 444–459 durch die MHV-Epitopen-1 Sequenz ersetzt worden waren, oder bei denen die NP-Aminosäuren 444–455 durch die MHV-Epitopen-2 Sequenz ersetzt worden waren, sind jeweils NDV-MHV1, respektive NDV-MHV2 genannt worden. Die Transfektion und die Wiedergewinnung der Viren ist ausgeführt worden, wie in Beispiel 1 beschrieben. Drei bis fünf Tage nach der Transfektion sind die Supernatanten geerntet worden und in den allantoischen Hohlraum von 9 bis 11 Tage alten embryonierten SPF-Hühnereiern inokuliert worden. Nach 3–4 Tagen der Inkubation ist die Gegenwart des Virus in dem allantoischen Fluid bestimmt worden durch Schnellplatten Hämagglutinations (HA) Test unter Einsatz von Huhn-Erythrozyten.
Immunofluoreszenz-Analyse
Um die Exprimierung der eingeführten MHV-Epitope zu bestimmen, sind BSR-T7 Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (moi) von 0.01 mit dem Eltern-rekombinanten Clone-30, NDV-Δ18, NDV-MHV1 und NDV-MHV2 infiziert worden. Nach 24 Stunden der Inkubation sind die infizierten Zellen mit kaltem Ethanol (96%) während 1 Std. bei Raumtemperatur fixiert worden. Nach dem dreimaligen Waschen mit PBS sind die Zellen mit monoklonalen Antikörpern inkubiert worden, die gegen das F-Protein, die immuno-dominante Epitope des NP-Proteins oder die MHV-Epitope gerichtet war. Die Zellen sind gewaschen und mit FITC konjugiertem Anti-Maus Antikörper gefärbt worden und durch Fluoreszenz-Mikroskopie betrachtet worden.
Immunisierung von Hühnern mit NDV-HMV1 oder NDV-MHV2 und Analyse der Seren.
Zwei Gruppen von jeweils zehn SPF-Hühnern im Alter von 3 Wochen sind entweder mit NDV-MHV1 oder NDV-HMV2 über den oculo-nasalen Weg mit einer Dosis von 6.0log₁₀ EID₅₀ je 0.2 ml immunisiert worden und 5 Wochen nach der ersten Immunisierung mit derselben Dosis geboostet worden. Serum-Proben sind gerade vor der Impfung und 2, 5 und 7 Wochen nach der ersten Immunisierung genommen worden. Serum-Proben sind durch Hämagglutionations-Inhibitions (HI) Test und ELISA's getestet worden, um das Niveau der Serokonversion zu bestimmen.
Enzym-verbundener immunosorbanter Assay (ELISA)
Um zu bestimmen, ob die Hühner, die mit den NDV-MHV1 und NDV-MHV2 Viren immunisiert worden sind, Antikörper entwickelt haben, die speziell gegen die exprimierte MHV-Epitope spezifisch sind, sind ELISA-Platten mit Saccharose gradient-gereinigtem MHV-Stamm A59 Antigen beschichtet worden. Die Näpfe sind über Nacht mit 1% Triton X-100 behandeltem viralen Antigen in 40 mM Phosphat-Puffer (PBS), pH-Wert 7.2) über Nacht beschichtet worden. Die Entfernung von ungebundenen Antigenen, das Blockieren und die verbleibenden Inkubations-Schritte der ELISA-Prozedur waren identisch zu dem NDV-basierten ELISA, wie dies unter Beispiel 2 beschrieben worden ist. In ähnlicher Weise ist die gesamte NDV-spezifische Antikörper-Antwort in ELISA-Platten gemessen worden, die mit Saccharose gradient-gereinigten NDV Clone 30 Antigenen beschichtet waren, wie dies in Beispiel 2 beschrieben worden ist.
Immunisierung und Challenge der Mäuse
Um die Schutzfähigkeit der MHV-Epitope, exprimiert durch NDV, zu bestimmen, sind Gruppen von 4 Wochen alten Balb/c weibliche MHV-seronegative Mäuse zur Immunisierung und für Challenge-Experimente eingesetzt worden. Zwei Gruppen von jeweils 10 Mäusen sind mit NDV-MHV1 und NDV-MHV2 mit einer Dosis von 6.0log₁₀ EID₅₀/Maus immunisiert worden und mit einer ähnlichen Dosis 4 Wochen später geboostet worden. Die immunisierten wie die 10 Kontrolltiere von ähnlichem Alter sind im Alter von 10 Wochen (zwei Wochen nach der Booster-Immunisierung) mit dem Wildtyp MHV A59 Stamm mit einer Dosis von LD₅₀/Maus auf dem intraperitonealen Weg gechallenged worden. Die Tiere sind für zwei Wochen nach dem Challenge auf klinische Zeichen und Sterblichkeit aufgrund des MHV betrachtet worden.
Ergebnisse
Supernatanten, die von transfektierten Zellen stammen, sind geerntet worden und zwei mal in 9 bis 11 Tage alten SPF-Hühnereiern passagiert worden. Allantoische Fluid-Proben sind dann geerntet worden und dem HA-Test unterworfen worden. HA ist in Eiern festgestellt worden, die mit dem Supernatanten aus Zellen inokuliert worden waren, die mit NDV-MHV1 sowohl als auch mit NDV-MHV2 Rekombinanten transfektiert worden waren. Die wiedergewonnenen Viren sind weiterhin zwei mal mehr in embryonierten Eiern passagiert worden. Die Wiedergewinnung dieser rekombinanten Viren zeigt, dass die NP immmuno-dominante Epitope nicht nur für die Virus-Replizierung entbehrlich ist, sondern auch durch gesamte fremde Sequenzen oder Epitope ersetzt werden kann.
Um zu bestimmen, ob die rekombinanten Viren die neu eingeführte Epitope exprimieren, sind BSR-Zellen wie unter Materialen und Verfahren infiziert worden und der Immunofluoreszenz-Analyse unterworfen worden. Unter Einsatz eines monoklonalen Antikörpers (Mab), der gegen das Fusions-Protein gerichtet ist, war die Exprimierung des F-Proteins in allen Viren ununterscheidbar. Im Gegensatz dazu reagierte ein monoklonaler Antikörper, der gegen die NP immuno-dominante Epitope gerichtet war, nur mit dem Eltern-Virus Clone 30. Wie erwartet, reagierte ein monoklonaler Antikörper, der gegen die MHV-Epitope gerichtet war, nur mit Zellen, die mit NDV-MHV1 oder NDV-MHV2 infiziert worden waren, was zeigt, dass die Epitope in korrekter Weise im offenen Leserahmen des NP-Gens exprimiert worden war.
Seren gerade vor der Immunisierung (T = 0) oder nach 7 Wochen (T = 7) nach der ersten Immunisierung sind dann dem HI-Test und Gesamt-NDV ELISA unterworfen worden. Wie dies in den Figuren dargestellt ist, waren die HI-Titer in allen Hühnern 7 Wochen nach der Impfung oberhalb von 6log₂ HI Einheiten und die Reaktion, die in dem Gesamt-NDV basierten ELISA gemessen worden ist, war auch ziemlich hoch (5–8). Interessanterweise reagierten 80% bis 90% der Hühner, die mit NDV-MHV1 oder NDV-MHV2 immunisiert worden waren, in positiver Weise in einem ELISA, der auf dem MHV Gesamt-Virus Antigen basierte, was zeigt, dass die Hühner spezifische Antikörper gegen die MHV-Epitope erzeugen, die durch rekombinante NDV's exprimiert worden sind (9–11). Im Gegensatz dazu reagierte keines der Seren in dem ELISA, der mit dem 18mer Peptid beschichtet worden war, was zeigt, dass den Hühnern, die mit dem NDV-MHV1 oder NDV-MHV2 immunisiert worden waren, vollständig Antikörper fehlten, die gegen die immuno-dominante Epitope des NP gerichtet sind. Diese Eigenschaft liefert einen zusätzliche Sicherheit in dem Diagnose-Test, sowohl als ein positiver als auch als ein negativer Marker, und macht die rekombinanten Viren als Doppelmarker-Kandidaten attraktiv.
Um weiter die Fähigkeit der eingeführten Epitope zu zeigen, gegen einen letalen Challenge zu schützen, immunisierten wir Mäuse mit den rekombinanten Viren und challengten diese 6 Wochen nach der ersten Immunisierung. Obwohl Mäuse nicht natürliche Wirte für NDV sind, wurden signifikante Schutz-Niveaus in den immunisierten Mäusen gegen einen letalen MDV-Challenge erreicht (Tabelle 5). Daher sind diese rekombinanten Viren nicht nur attraktiv als Marker-Impfstoffe, sondern auch als Vektoren, um fremde Epitope zu exprimieren, um gegen unbezogene Pathogene zu schützen.
Tabelle 5.
Legende der Figuren
1. Rekombinante NDV Konstrukte. Eine schematische Darstellung der NDV Gen-Ordnung wird in dem negativ-strängigen genomischen RNS dargestellt. Sequenzen um die immuno-dominante Epitope des NP-Gens (Position 1442–1501, NP Aminosäuren 441–460 sind in einem positiven Sinn dargestellt. Die gestrichelten Linien zeigen Löschungen von 12 oder 18 Aminosäuren in NDV-Δ12, respektive NDV-Δ18. Die NDV-Δ48 besitzt ein C-terminiertes abgeschnittenes NP (48 Residuen), wie dies durch das Zeichen eines Stop-Codons (*) angezeigt wird, welches der letzten Aminosäure folgt.
2. Fünfzehn SPF-Hühner sind über den oculo-nasalen Weg mit NDV-Δ18 im Alter von drei Wochen geimpft worden und im Alter von 5 Wochen geboostet worden. Serenproben, die gerade vor der Impfung (D18 0W), 2 Wochen (D18 2W), 5 Wochen (D18 5W) und 7 Wochen (D18 7W) nach der ersten Impfung gesammelt worden sind, sind ELISA unterworfen worden und dem HI-Test wie in Materialien und Verfahren beschrieben. Die serologische Antwort gegen einen lebenden kommerziellen ND-Impfstoff, Clone 30, ist in ähnlicher Weise bei 19 SPF Hühnern festgestellt worden, die im Alter von 1 Woche geimpft worden sind und denen 4 Wochen später das Blut entnommen worden ist. Für die NEWCAVAC-Gruppe, ein inaktivierter kommerzieller Impfstoff, sind 21 SPF-Hühner im Alter von 3 Wochen geimpft worden und ähnliche serologische Assays sind in Seren-Proben durchgeführt worden, die 3 Wochen nach der Immuni sierung gesammelt worden sind. (D18 = NDV-Δ18).
3. Pathogenizität des rNDV und NDV-Δin SPF Hühner-Embryos. Elf Tage alte embryonierte SPF-Hühnereier sind mit dem Eltern-rNDV oder dem mutanten NDV-Δ18 inokuliert worden und für 7 Tage inkubiert worden, oder bis dass der Tod der Embryos eingetreten ist. NDV-Δ18 bewirkte keine Embryo-Sterblichkeit für 7 Tage bei allen angegebenen Dosen, wohingegen rNDV letal war, selbst mit einer Dosis, die so gering war wie 1 EID₅₀/ml (ungefähr 10% Sterblichkeit). Embryos, die mit rNDV inokuliert worden waren, begannen so früh wie drei Tage nach der Inokulation bei höheren Dosen zu sterben.
4. Serologische Antwort von SPF-Hühnern, die in ovo mit NDV-Δ18 alleine oder in Kombination mit HVT-NDV/F geimpft worden waren, einem Vektor-Impfstoff, der das NDV Fusions-Protein exprimiert. Tiere sind am Tag 18 der Embryonierung geimpft worden und ein HI-Test und ELISA sind durchgeführt worden, wie in Materialien und Verfahren beschrieben worden ist, mit Seren, die im Alter von drei Wochen gesammelt worden sind. (D18 = NDV-Δ18).
5–8. Serologische Antwort von SPF-Hühnern, die mit NDV-MHV1 oder NDV-MHV2 geimpft worden waren. Serum-Proben sind gerade vor der Impfung (T = 0) und 7 Wochen (T = 7) nach der ersten Impfung einem HI-Test und ELISA unterworfen worden, basierend auf dem Gesamt-NDV-Antigen.
9–11. Hühner produzieren Antikörper spezifisch für die MHV-Epitope. Dieselben Seren, wie unter 5 beschreiben (für NDV-MHV1 und NDV-MHV2) oder 2 (für NDV-Δ18) sind einem ELISA unterworfen worden, der auf dem Gesamt-MHV-Antigen basiert.
Sequenz Listing
Übersetzung der Header der einzelnen Sequenzen:

Claims

Newcastle-Krankheit Virus (NDV) Mutante, der eine immunodominante Epitope auf einem NDV-Protein als Ergebnis einer Mutation in einem Gen fehlt, welches das Protein kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass der NDV-Mutante eine Epitope fehlt, die innerhalb eines Bereiches des Nukleoproteins (NP) angeordnet ist, wobei der Bereich die Aminosäuresequenz (447–455) aufweist, die in SEQ ID NR. 1 dargestellt ist.
NDV-Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei Hühnern die NDV-Mutante ein Antiserum induziert, dem Antikörper fehlen, die mit einer immunodominanten Epitope reagieren, die innerhalb des Aminosäurebereichs (447–455) des NP angeordnet ist.
NDV-Mutante nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass dem Antiserum, welches in Hühnern induziert ist, Antikörper fehlen, die mit einem 18-mer Peptid reagieren, welches die NP-Aminosäuresequenz (443–460) aufweist, welche in SEQ ID NR. 2 dargestellt ist.
NDV-Mutante gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante eine Löschung oder einen Ersatz von einer oder mehreren Aminosäuren in einem Bereich des NP-Gens umfasst, welcher die Aminosäurensequenz (447–455) aufweist.
NDV-Mutante nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren 443 +/– 1 bis 460 +/– 1 gelöscht sind.
NDV-Mutante nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren 443 bis 460 gelöscht sind.
NDV-Mutante gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Nukleotide, die eine oder mehrere Aminosäuren in dem Bereich kodieren, durch eine heterologe Nukleinsäuresequenz ersetzt sind, welche eine immunodominante Epitope eines Polypeptids kodiert.
NDV-Mutante gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die NDV-Mutante zusätzliche dämpfende Mutationen umfasst.
NDV-Mutante gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die NDV-Mutante zusätzliche eine heterologe Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein Antigen eines aviären Pathogens kodiert.
Impfstoff gegen Newcastle-Krankheit im Geflügel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine NDV-Mutante wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert in einer lebenden oder inaktivierten Form und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Lösungsmittel umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff zusätzlich einen Impfstamm umfasst, der fähig ist, einen Schutz gegen NDV oder gegen andere aviäre Pathogene zu induzieren.
Impfstoff nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der zusätzliche Impfstamm ein rekombinanter Impfvektor ist, der fähig ist, das F- oder HN-Protein von NDV zu exprimieren.
Impfstoff nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Impfvektor HVT ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der zusätzliche Impfstamm ein Embryonen-sicherer Impfstamm ist.
Verwendung einer NDV NP Mutante, wie in Ansprüchen 1 bis 9 definiert, für die Herstellung eines Impfstoffs gegen die Newcastle-Krankheit in Geflügel für die in ovo Verabreichung.
Verfahren zur Bestimmung der NDV-Infektion in Geflügel umfassend den Schritt des Prüfens einer Probe des Tieres auf Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern, die mit einer immunodominanten Epitope reagieren, welche in dem Aminosäurenbereich (447–455) des NP angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst: (i) Inkubieren einer Probe, die verdächtigt wird, Anti-NDV Antikörper zu enthalten, mit einem Fragment des NP umfassend den Aminosäurenbereich (447–455) als einzige Epitope enthaltenem Bereich, (ii) Gestatten der Ausbildung eines Antikörper-Antigen Komplexes, und (iii) Erfassen der Gegenwart des Antikörper-Antigen Komplexes.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das NP Fragment ein 18-mer Peptid ist, welches die Aminosäuresequenz (443–460) hat.
Diagnosetestkit, geeignet zum Ausführen eines Verfahrens gemäss den Ansprüchen 16 bis 18, enthaltend ein NP Fragment umfassend den Aminosäurenbereich (447–455), vorzugsweise den Aminosäurebereich (443–460).
Verwendung eines Impfstoffs wie in Ansprüchen 10 bis 14 definiert in einem Newcastle-Krankheit Kontrollprogramm, um geimpfte Tiere von Tieren zu unterscheiden, die mit natürlich auftretendem NDV infiziert sind.