DE69818913T2

DE69818913T2 - Rekombinanter Birnavirusimpfstoff

Info

Publication number: DE69818913T2
Application number: DE1998618913
Authority: DE
Inventors: E. Mundt; H.D. Lütticken; A.A.W.M. Van Loon
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1997-05-26
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2018-05-23
Also published as: BR9801685A; CA2238659A1; BR9801685B1; CA2238659C; DE69818913D1; ATE252153T1; AU725129B2; ES2209052T3; JP4316025B2; JPH114683A; PT887412E; AU6900298A; US7022327B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Birnavirus Mutante, einen Impfstoff umfassend diese Mutante, ein Verfahren zur Bestimmung einer Birnavirus Infektion in einem Tier sowie ein Testkit zur Durchführung dieses Verfahrens.
Das infektiöse Bursitisvirus (Infectious Bursal Disease Virus, IBDV) und das infektiöse Pankreasnekrosis Virus (Infectious Pancreatic Necrosis Virus, IPNV) sind Mitglieder der Birnaviridae Familie. Die Viren in dieser Familie haben eine sehr ähnliche genomische Organisation und einen ähnlichen Replikationszyklus. Die Genome dieser Viren bestehen aus 2 Segmenten (A und B) aus doppelsträngiger (ds) RNS. Das grössere Segment A kodiert ein Polyprotein, welches mittels Autoprotolyse gespalten wird, um die reifen, viralen Proteine VP2, VP3 und VP4 zu bilden (Hudson, P. J. et al, Nucleic Acids Res., 14, 5001–5012, 1986); Dobos, P., Annual review of fish diseases 5, 25–54, 1995). VP2 und VP3 sind die bedeutendsten Strukturproteine des Virions. VP2 ist das bedeutendste Wirt-schützende Immunogen der Birnaviren und enthält die antigenen Regionen, die für die Induktion der neutralisierenden Antikörper verantwortlich sind. Das VP4 Protein scheint eine Virus-kodierte Protease zu sein, die in der Verarbeitung eines Vorläufer Polyproteins der VP2, VP3 und VP4 Proteine involviert ist. Das grössere Segment A besitzt ebenso einen zweiten offenen Leserahmen (open reading frame, ORF), der dem Polyprotein Gen vorgelagert ist und mit diesem teilweise überlappt. Dieser zweite offene Leserahmen kodiert ein Protein VP5 von unbekannter Funktion, welches in IBDV infizierten Zellen vorhanden ist (Mundt E. et al, J. Gen. Virol., 76, 437–443, 1995).
Das kleinere Segment B kodiert VP1, ein 90 kDa multifunktio nelles Protein mit Polymerase und Capping-Enzym Funktionen (Spies, U. et al., Virus Res., 8, 127–140, 1987 und Spies, U. et al, J. Gen Virol., 71, 977–981, 1990; Duncan, R. et al, Virology, 181, 541–552, 1991).
Für IBDV existieren zwei Serotypen, Serotyp 1 und 2. Die 2 Serotypen können mittels Virus Neutralisationstests (VN) differenziert werden. Zudem wurden Untertypen von Serotyp 1 isoliert. Diese sogenannten Virus „Varianten" von Serotyp 1 können mittels Cross-Neutralisationstests (Diseases of Poultry, 9th edition, 1991, Wolfe Publishing Ltd., ISBN 0 7234 1706 7, Kapitel 28, P. D. Lukert und Y. M. Saif, 648–663), einer Auswahl monoklonaler Antikörper (Snyder, D. B. et al, Arch. Virol., 127, 89–101, 1992) oder RT-PCR (Jackwood, D. J., Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anemia, Rauischholzhausen, Germany, 155–161, 1994) identifiziert werden. Gewisse dieser Untertypen von Serotyp 1 von IBDV wurden in der Literatur beschrieben, zum Beispiel Klassische, Variant-E, GLS RS593 und DS326 Stämme (Van Loon et al, Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anemia, Rauischholzhausen, Germany, 179–187, 1994).
Die infektiöse Bursitis (Infectious Bursal Disease, IBD), ebenso Gumboro Krankheit genannt, ist eine akute, hochansteckende, virale Infektion in Hühnern, wobei das lymphatische Gewebe das primäre Ziel darstellt mit einem selektiven Tropismus für Zellen der Bursa Fabricii. Die Morbiditätsrate anfälliger Herden ist hoch mit raschem Gewichtsverlust und gemässigten Sterblichkeitsraten. Hühner, die sich von dieser Krankheit erholen, können aufgrund der Zerstörung der Bursa Fabricii, die für den Abwehrmechansimus der Hühner notwendig ist, Immunmängel aufweisen. Das IBD Virus verursacht eine schwerwiegende Immun suppression in Hühnern, die weniger als 3 Wochen alt sind und induziert Läsionen der Bursa in Küken, die bis zu 3 Monaten alt sind.
Über viele Jahre hinweg konnte die Krankheit durch Induktion hoher Mengen an Antikörpern in Brutherden mittels Anwendung eines inaktivierten Impfstoffes an Hühner, die mit einem abgeschwächten IBDV-Lebendimpfstoff geprimt wurden, verhindert werden. Dadurch wurden durch IBD verursachte, wirtschaftliche Verluste minimal gehalten. Mütterliche Antikörper in Hühnern, die von geimpften Bruthühnern stammen, verhindern eine frühe Infektion mit IBDV und verringern mit Immunosuppression verbundene Probleme. Zusätzlich wurden nach einer Abnahme der mütterlichen Antikörper abgeschwächte Lebendimpfstoffe ebenso in käuflichen Hühnerherden verwendet.
Kürzlich verursachten äusserst virulente IBDV-Stämme Ausbrüche der Krankheit mit hoher Sterblichkeit in Europa. Die gegenwärtigen Impfprogramme versäumten es die Hühner ausreichend zu schützen. Impfmisserfolge ergaben sich hauptsächlich aufgrund der Unfähigkeit der Lebendimpfstoffe, die Vögel vor einem Challenge mit einem virulenten Feldvirus zu infizieren.
Eine Ausrottung der Krankheit durch andere vorbeugende Massnahmen als eine Impfung ist nicht durchführbar, da das Virus weitverbreitet ist und da es mit den gegenwärtig verabreichten abgeschwächten, lebenden oder inaktivierten IBDV-Impfstoffen nicht möglich ist zu bestimmen, ob ein spezifisches Tier mit einem IBDV-Feldvirus infiziert ist oder ob das Tier mit einem IBDV-Impfstoff geimpft wurde. Um ein Ausrottungs-Kontrollprogramm für IBDV einzuleiten, ist es höchst wünschenswert, zwischen mit einem IBDV-Impfstoff geimpften Tieren und denjenigen, die mit einem Feldvirus infiziert wurden, unterscheiden zu können, um geeignete Massnahmen treffen zu können, d. h. infizierte Herden zu entfernen um die Ausbreitung des viru lenten Feldvirus zu verhindern. Die Einführung von zum Beispiel einem serologisch identifizierbaren Marker kann durch eine Mutation in Genen erzielt werden, die nicht-wesentliche (Glyko)Proteine des IBDV kodieren und die dennoch die Produktion von Antikörpern in einem infizierten Wirtstier hervorrufen. Ein Markerimpfstoff für die Aujeszky-Krankheit diagnostische Begleittests bewiesen ihre praktischen Wert in der Kontrolle dieser Krankheit. Während solche Kontrollprogramme für andere virale Infektionskrankheiten in Tieren in Entwicklung sind, wurde bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung ein auf einem IBDV-Impfstoffstamm basierender Impfstoff, der für IBDV Kontrollprogramme passend wäre, noch nicht beschrieben.
Mundt und Köllner (Annual Meeting of the German Federal Research Institute for virus diseases in animals, March 1997) offenbaren die Konstruktion einer IBDV-Mutante, die es aufgund einer gentechnologischen Mutation im Startcodon des VP5 Gens unterlässt, ein VP5 Protein zu exprimieren. Diese Mutation umfasst die Substitution eines Nukleotides im Startcodon des VP5 Gens.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Birnavirus Mutante gemäss den Ansprüchen bereit, die als Folge einer Mutation im VP5 Gen des Birnavirus Genoms nicht fähig ist, ein natives VP5 Protein zu produzieren.
Die Birnavirus Mutante ist vorzugsweise eine IBDV Mutante oder eine IPNV Mutante, wobei die IBDV Mutante am meisten bevorzugt ist, insbesondere wird von der vorliegenden Erfindung eine IBDV Mutante, die von einem Serotyp 1 IBD Virus hergeleitet ist, bereitgestellt.
Es wird gezeigt, dass eine IBDV Mutante, die nicht fähig ist ein VP5 Protein zu produzieren, nach wie vor fähig ist, Geflügel zu infizieren und sich in vivo in den infizierten Wirtstieren zu replizieren, d. h. es werden Beweise bereitge stellt, dass das VP5 Protein kodierende Gen ein nicht-wesentliches Gen ist. Beispiele 3 und 4 zeigen, dass VP5 IBDV von Organen von mit der IBDV Mutante infizierten Tieren reisoliert werden kann und dass die IBDV Mutante eine schützende Immunantwort in den infizierten Tieren hervorruft.
Zudem wurde hierin erwiesen, dass Teil der normalen anti-IBDV-Immunantwort in Geflügel gegen die VP5 Region gerichtet ist. Dies ist eher überraschend, da das VP5 Protein bedacht wird, ein nicht-strukturelles, virales Protein darzustellen (Mundt et al., J. Gen. Virol. 76, 437–443, 1995) und die Immunantwort in einem Tier gegen win virales Pathogen im allgemeinen gegen Struktur(glyko)proteine des Virus hervorgerufen wird. Diese Erkenntnisse machen die IBDV Mutante und andere Birnavirus Mutanten gemäss der Erfindung zu einem geeigneten Viruskandidaten für einen Markerimpfstoff. Solch ein Markerimpfstoff gewährt die Möglichkeit zu bestimmen, ob Tiere mit einem Wildtyp Birnavirus, d. h. IBDV, oder mit einem Impfstoffvirus infiziert sind.
Zusätzlich wurde festgestellt, dass das VP5 Protein in der Expression der Virulenz der Birnaviren, insbesondere von IBDV, involviert sind und dass die Unfähigkeit der Virusmutanten das native VP5 Protein zu produzieren zu einer Abschwächung des Virus führt.
Unter dem Begriff „welches nicht fähig ist, ein natives VP5 Protein zu produzieren" versteht man dass die Birnavirus Mutante ein Polypeptid produziert, das mittels serologischer Tests vom nativen VP5 Protein unterschieden werden kann, oder gar kein VP5 Protein produziert. Im ersteren Fall zum Beispiel produziert die Birnavirus Mutante nur ein Fragment des nativen Birnavirus VP5 Proteins, dem ein oder mehrere immunogene Epitope fehlen.
Die Birnavirus Mutante gemäss der Erfindung produziert kein VP5 Protein nach Infektion einer Wirtszelle.
Wie oben beschrieben ist die genomische Organisation der Birnaviren gur ergründet: das IBDV und IPNV Genom umfasst ein grosses Segment A und ein kleineres Segment B. Das Segment A von IBDV umfasst einen grossen offenen Leserahmen (open reading frame, ORF), der ein Polyprotein von ungefähr 110 kDa (VP2-VP3-VP4) kodiert. Das das VP5 Protein kodierende Gen ist im Stand der Technik identifiziert und hierin als der kleine ORF auf dem Segment A des Birnavirus Genoms definiert, der dem das Polyprotein kodierenden ORF vorgelagert ist und mit diesem teilweise überlappt (Bayliss et al., J. Gen. Virol. 71, 1303–1312, 1990; Spies et al., J. Gen Virol. 71, 977–981, 1990; Havarstein L. S. et al., J. Gen. Virology 71, 299–308, 1990; Dobos et al., 1995, supra; 1–3 hierin und SEQ ID No.'s 1–7). Die im VP5 Gen eingeführte Mutation ist derart, dass sie die Expression des Polyproteins nicht verhindert. SEQ ID No. 1 umfasst die vollständige (full length) cDNA Nukleotidsequenz des Segmentes B des IBDV Stammes P2 sowie die durch das Segment B kodierte Aminosäurensequenz des VP1 Proteins (siehe auch SEQ ID No. 2). SEQ ID No. 3 und 5 illustrieren die vollständige (full length) cDNA Nukleotidsequenz des Segmentes A des IBDV Stammes D78 sowie die kodierende Region des VP5 Proteins beziehungsweise des Polyproteins. SED ID No. 3 und 4 zeigen ebenfalls die Aminosäurensequenz des D78 VP5 Proteins. SED ID No. 5 und 6 zeigen die Aminosäurensequenz des Polyproteins VP2-VP4-VP3 von D78. SED ID No. 7 zeigt das 5'-Ende des Segmentes A des Stammes D78, einschliesslich der in der VP5 kodierenden Region eingeführten Mutationen. SED ID No. 8 zeigt die Nukleotidsequenz des Segmentes B des Stammes D78 und die Aminosäurensequenz des D78 VP1 Proteins. Die genomische Organisation beider Segmente ist ebenso in 1 dargestellt.
Der für VP5 kodierende ORF ist in allen bis jetzt publizierten Segment A Sequenzen erhalten. Der IBDV ORF kodiert 145 Aminosäuren, was zu einer berechneten Molekularmasse von 16.5 kDA führt. Die Nukleotidsequenz des ORF, der das VP5 Protein des hierin verwendeten IBDV Stammes D78 kodiert, ist in SEQ ID No. 3 und 4 wiedergegeben. Natürliche Variationen können zwischen den individuellen IBDV Isolaten bestehen. Diese natürlichen Variationen entstehen aus geringfügigen Unterschieden in den Genomen dieser Viren. Die Nukleotidsequenz des Segmentes A, einschliesslich der Nukleotidsequenz des VP5 Gens wurde für viele IBDV Isolate im Stand der Technik beschrieben (Vakharia et al., Avian Diseases 36, 736–742, 1992; Bayliss et al., J. Gen. Virol. 71, 1303–1314, 1990; Hudson et al., Nucl. Acid Res. 14, 5001–5012, 1986; Schnitzler et al., J. Gen. Virol. 47, 1563– 1571, 1993; Kibenge et al., J. Gen. Virol. 71, 569–577, 1990 und Virology 184, 437–440, 1992; Mundt et al, Virology 209, 10–18, 1995; Lana et al, Virus Genes 6, 247–259, 1992; Vakharia et al., Virus Res. 31, 265–273, 1994; Brown et al., Virus Res. 40, 1–15, 1996). Die Aminosäurensequenz des VP5 Proteins der Serotyp I IBDV Stämme weisen eine Homologie von mindestens 95% mit der in SEQ ID No. 3 und 4 gezeigten VP5 Aminosäurensequenz, während die Homologie zwischen der Serotyp II VP5 Sequenz und und der in SEQ ID No. 3 und 4 gezeigten VP5 Aminosäurensequenz mindestens 75 beträgt. Demzufolge ist eine bevorzugte IBDV Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung eine IBDV Mutante, worin die Mutation im VP5 Gen eingeführt ist mit einer Homologie auf der Stufe der Aminosäurensequenz von mindestens 75%, insbesondere mindestens 95% mit der hierin gezeigten VP5 Aminosäurensequenz.
Vorzugsweise wird eine IBDV Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung von jeglichen der klassischen oder Varianten (z. Bsp. Variante E oder GLS) IBDV Impfstoffstämme hergeleitet, wie zum Beispiel diejenigen die gegenwärtig im Einsatz verwendet werden. Solche geeigneten IBDV Stämme umfassen die in den kommerziell erhältlichen Impfstoffene D78, PBG 98, LZ 228E, 89-03 (Intervet nternational B. V.), Bursine 2 (Fort Dodge Animal Heath und 5706 (Rhône Mérieux) vorhandenen IBDV Impfstoffstämme.
Eine besonders bevorzugte IBDV Mutante gemäss der Erfindung wird vom D78 Stamm umfassend ein VP5 Gen, das ein Protein mit einer wie in SEQ ID No. 3 und 4 gezeigten Aminosäurensequenz kodiert, hergeleitet.
Als Alternative ist der Eltern Birnavirusstamm für die Virusmutante gemäss der Erfindung ein virulenter Birnavirus Feldstamm. Es wurde hierin festgestellt, dass das VP5 Protein ein mit der Virulenz assoziierter Faktor ist und dass die Abwesenheit des nativen VP5 Proteins in einem Birnavirus zu einer abgeschwächten Form des Virus führt.
Die Erfindung stellt vorzugsweise eine Birnavirus Mutante bereit, die als Folge einer Mutation in dem Teil des VP5 Gens, der nicht mit dem grossen, das Polyprotein kodierenden ORF überlappt, unfähig ist, ein natives VP5 Protein zu produzieren.
Insbesondere umfasst die Birnavirus Mutante gemäss der Erfindung eine Mutation im 5'-Ende des VP5 Gens umfassend die Nukleotide 1–30, vorzugsweise 1–20, noch mehr bevorzugt 1–10. Am meisten bevorzugt ist eine Birnavirus Mutante mit einer Mutation in den Nukleotiden 1–3 des VP5 Gens.
Unter einer Mutation versteht man eine Änderung der genetischen Information im VP5 Gen in Bezug auf die genetische Information, die in dieser Region des Genoms eines natürlich vorkommenden Birnavirus-produzierenden, nativen VP5 Proteins vorhanden ist. Die Mutation ist zum Beispiel eine Nukleinsäuren Substitution, Deletion, Insertion oder Inversion, oder eine Kombination davon.
In einer bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung wird eine Birnavirus Mutante bereitgestellt, worin die Mutation eine Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden ist. Insbesondere wird eine Nukleinsäurensubstitution im Startcodon eingeführt, infolgedessen das neue Codon eine von Methionin unterschiedliche Aminosäure kodiert oder ein Stopcodon darstellt, vorzugsweise umfasst die Nukleinsäurensubstitution mindestens zwei der Nukleinsäuren des Startcodons.
Eine weitere Birnavirus Mutante gemäss der Erfindung umfasst eine Substitution eines oder mehrerer Nukleotide in einem vom Startcodon unterschiedlichen Codon(s), was zu einem oder mehreren Stopcodons führt, vorzugsweise im 5'-Ende des VP5 Gens wie hierin zuvor definiert, falls erwünscht zusätzlich zu einer wie hierin zuvor beschriebenen Substitution im Startcodon. Vorzugsweise umfasst die Birnavirus Mutantein dieser Region des VP5 Gens ein Stopcocon in jedem der drei Leserahmen.
Solch eine bevorzugte Birnavirus Mutante kann eine IBDV Mutante mit einer Mutation im Startcodon, dem vierten und dem sechsten Codon des VP5 Gens sein, was vorzugsweise zu den in SEQ ID No. 7 und 3 dargestellten, mutierten Codons führt.
Als Alternative wird eine Birnavirus Mutante bereitgestellt, worin die Mutation eine Deletion darstellt. Die Deletion umfasst insbesondere weniger als 20, weniger als 10 oder weniger als 5 Nukleotide. Die Deletion umfasst vorzugsweise eine Gesamtzahl an Nukleotiden, die nicht durch drei teilbar ist, was zu einer Verschiebung des Leserahmens führt.
Die Deletion umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Nukleotide des Startcodons des VP5 Gens.
In einer alternativen Variante der vorliegenden Erfindung wird eine Birnavirus Mutante bereitgestellt, worin die Mutation die Insertion einer heterologen Nukleinsäurensequenz in das Birnavirus Genom umfasst. Eine heterologe Nukleinsäuresequenz ist eine Nukleinsäurensequenz, die normalerweise an der spezifischen Insertionsstelle der bestimmten Virusart nicht vorhanden ist.
Die heterologe Nukleinsäuresequenz, die in das Birnavirus Genom eingeführt wird, ist ein Nukleinsäurenfragment, das entweder ein Polypeptid kodiert oder eine nicht-kodierende Sequenz darstellt. Das Nukleinsäurenfragment kann von jeglicher Quelle hergeleitet werden, z. Bsp. viraler, eukaryotischer, prokaryotischer oder synthetischer, einschliesslich Oligonukleotide, die für eine Unterbrechung der Expression des VP5 Gens geeignet sind.
Ein geeignetes Oligonukleotid für die Unterbrechung der VP5 Expression kann drei translatorische Stopcodons in jedem der drei möglichen Leserahmen in beiden Richtungen umfassen, zusätzlich zu einer oder mehrere Spaltungsstellen für Restriktionsenzyme, die für die Insertion einer zweiten heterologen Nukleinsäurensequenz nützlich sind. Die Länge und Nukleotidsequenz solch einer nicht-kodierenden heterologen Nukleinsäurensequenz ist nicht kritisch, bewegt sich jedoch vorzugsweise zwischen 8– 50 Nukleotiden.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung wird eine Birnavirus Mutante bereitgestellt, die nicht nur zur Herstellung eines Impfstoffes gegen eine Infektion durch ein spezifisches Birnavirus verwendet werden kann, sondern auch gegen andere Infektionskrankheiten in Geflügel oder Fisch. Zum Beispiel bietet ein auf solch einer IBDV Mutante basierender Vektorimpfstoff die Möglichkeit einer Immunisierung gegen andere Geflügel Pathogene mittels Expression von Antigenen dieser Geflügel Pathogene innerhalb der infizierten Zellen des immunisierten Wirts. Solch ein IBDV Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung kann durch Insertion einer heterologen Nukleinsäurensequenz erhalten werden, wobei die heterolge Nukleinsäurensequenz ein Polypeptid kodiert, das heterolog zu dem hierin definierten IBDV im VP5 Gen ist.
Die heterologe Nukleinsäurensequenz kann ein Antigen eines Geflügel Pathogens, wie zum Beispiel des Newcastle Disease Virus, des Infektiösen Bronchitisvirus, des Marek'schen Krankheits Virus, des Encephalomyelitis Virus, des Geflügel Reovirus, des Geflügel Influenzavirus, des Hühner Anämievirus, Salmonella spp., E. coli und Eimeria spp kodieren.
Ferner umfasst eine IBDV Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung zusätzlich zur Mutation im VP5 Gen eine Mutation im VP2 Gen, wobei dieses Gen ein chimäres Protein umfassend neutra lisierende Epitope von mehr als einem antigenen Typ von IBDV (z. Bsp. Klassisch, Variant-E und/oder GLS) exprimiert. Solch eine Mutante umfasst vorzugsweise die relevanten, schützenden VP2 Epitope einer Variante des GLS Stammes und des klassischen Stammes. Insbesondere stellt das mutierte VP2 Gen ein GL2 VP2 Gen dar umfassend ein Nukleinsäurensequenzfragment, das das B69 Epitop kodiert. Die Konstruktion von solchen mutierten VP2 Genen ist in Snyder et al., Avian Diseases 38, 701–707, 1994 beschrieben.
Ferner können Nukleinsäurensequenzen, die Polypeptide für pharmazeutische oder diagnostische Anwendungen kodieren, insbesondere Immunomodulatoren, wie zum Beispiel Lymphokine, Interferone oder Cytokine, in das VP5 Gen eingebaut werden. Die heterologe Nukleinsäurensequenz kann ebenso einen sortierbaren Marker kodieren, wie zum Beispiel E. coli β-Galactosidase oder E. coli β-Glucoronidase.
Die Konstruktion von Birnavirus Mutanten, insbesondere IBDV Mutanten gemäss der vorliegenden Erfindung kann mittels des kürzlich erstellten infektiösen cRNA Systems für IBDV (Mundt und Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131–11136, 1996) erzielt werden. Dieses Reverse Genetics-System bietet die Möglichkeit Mutationen in das RNA Genom des IBD Virus, insbesondere in das VP5 Gen, einzuführen. Der wichtigste Schritt im Reverse Genetics-System stellt die Bereitstellung von vollständigen (full length) cDNA Klonen der Segmente A und B des IBD Virus dar. cDNA Konstrukte umfassend das Segment A oder B, einschliesslich der Nukleotide der 5'- und 3'-Enden beider dieser Segmente, können gemäss der von Mundt und Vakharia beschriebenen Methode (1996, supra) erzeugt werden. Zusätzlich umfassen diese Konstrukte einen RNA Polymerase Promotor, der funktionell mit einem der beiden Segmente verbunden ist. Der Promotor kann den Promotor für die T7, SP6 oder T3 Polymerase darstellen, wobei der T7 Promotor bevorzugt ist. Die Mutationen können in das VP5 Gen mittels Verfahren eingeführt werden, die zu diesem Zweck in Fachkreisen im allgemeinen bekannt sind. Insbesondere werden die Mutation(en) mittels ortsspezifischer Mutagenese eingeführt.
Zum Beispiel wird in einem ersten Schritt ein cDNA Fragment bereitgestellt, das mindestens einen wesentlichen Teil des VP5 Gens umfasst. Im nächsten Schritt werden geeignete Primerpaare konstruiert und mit dem die VP5 Sequenz enthaltenden Fragment hybridisiert. Der 5'-Primer umfasst zusätzlich zu Sequenzen, die zur VP5 Sequenz komplementär sind, Nukleotide, die die gewünschte Mutation beherbergen, z. Bsp. eine Mutation, die das ATG Startcodon in ein AGG (Arginin) Codon umwandelt. Zudem wird der 5'-Primer mit einer upstream Nukleotidsequenz bereitgestellt, die eine geeignete Restriktionsenzymspaltungsstelle darstellt, welche eine Wiederherstellung der gesamten nicht-kodierenden Sequenz am 5'-Ende ermöglicht. Anschliessend wird das neue mutierte Fragment mittels PCR amplifiziert und das neue Fragment wird durch Ersetzen der nativen Nukleinsäuresequenz mittels geeigneter Restriktionsenzyme in die Anfangssequenz eingeführt. Im nächsten Schritt werden plus sense Transkripte des Segements A und B in vitro mittels (T7) RNA Polymerase hergestellt, wonach die synthetischen Transkripte mittels konventioneller RNA-Reinigungsmethoden gereinigt werden. Die rekombinante IBDV Mutante gemäss der Erfindung wird nach Transfektion der geeigneten Zellen (z. Bsp. VERO Zellen, QM-7 Zellen oder CEC Zellen) mit den synthetischen RNA Transkripten beider Segmente des IBDV Genoms erhalten, falls erwünscht in Gegenwart von Transkriptions-fördernden Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Lipofectin. Schlussendlich wird das rekombinante IBDV vom Überstand der transformierten Zellen geerntet.
Verfahren zur Einführung einer Mutation in das Birnavirusgenom werden hierin beschrieben, werden jedoch ebenso generell in Fachkreisen verwendet (Mundt and Vakharia, 1996, supra; Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F. M. Ausubel et al., Wiley N. Y., 1995 Edition, Seiten 8.5.1.–8.5.9.).
Zusätzlich zum unerwarteten Befund der derzeitigen Erfinder, dass der VP5 ORF von IBDV eine nicht-wesentliche Region des IBDV-Genoms ist, wurde ebenfalls festgestellt, dass eine IBDV Mutante der vorliegenden Erfindung fähig ist, eine schützende Immunantwort zu induzieren, d. h. Tiere, die mit einem Impfstoff umfassend die IBDV Mutante immunisiert sind, sind gegen einen virulenten Challenge geschützt. Zudem wurde festgestellt, dass Antiseren von mit natürlich vorkommendem IBDV infizierten Tieren gegen das nicht-strukturelle VP5 Protein gerichtete Antikörper umfassen und dass diese Antiseren von Antiseren, die von mit einer IBDV Mutante gemäss der Erfindung infizierten Tieren hergeleitet sind, unterschieden werden können. Zusätzlich wurde festgestellt, dass die hierin zuvor beschriebene IBDV Mutante verglichen mit dem Eltern IBD Virus, das fähig ist, das native VP5 Protein zu produzieren, abgeschwächt ist.
Demzufolge betrifft ein anderer Aspekt dieser Erfindung einen Impfstoff zur Verwendung beim Schutz von Tieren gegen eine Birnavirus Infektion umfassend die wie hierin zuvor charkterisierte Birnavirus Mutante zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel. Insbesondere ist der Impfstoff gemäss der Erfindung ein Impfstoff zur Verwendung beim Schutz von Gerflügel gegen infektiöse Bursitis umfassend die wie hierin zuvor beschriebene IBDV Mutante.
Die Birnavirus Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung kann als Lebendvirus oder inaktiviertes Virus in den Impfstoff eingebaut werden.
Ein Impfstoff gemäss der Erfindung kann mittels konventioneller, wie zum Beispiel die für die kommerziell erhältlichen Lebend- und inaktivierten IBDV Impfstoff gebräuchlich verwendeten, Methoden hergestellt werden. In Kurzform, ein empfängli ches Substrat wird mit einer IBDV Mutante gemäss der Erfindung inokuliert und propagiert bis sich das Virus zu einem gewünschten infektiösen Titer repliziert hat, wonach das IBDV-enthaltende Material geerntet wird.
Jedes Substrat, das zu einer Unterstützung der Replikation von IBD Viren fähig ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschliesslich primäre (Geflügel) Zellkulturen, wie zum Beispiel Hühnerembryo Fibroblasten (chicken embryo fibroblast cells, CEF) oder Hühnernierenzellen (chicken kideny cells, CK), Säugetier-Zelllinien, wie zum Beispiel die VERO Zelllinie oder die BGM-70 Zelllinie, oder Geflügel Zelllinien wie zum Beispiel QT-35, QM-7 oder LMH. Normalerweise wird das Virus nach Inokulation der Zellen für 3–10 Tage propagiert, wonach der Zellkultur-Überstand geerntet wird und falls erwünscht filtriert oder zentrifugiert wird um Zelltrümmer zu entfernen.
Als Alternative wird die IBDV Mutante in embryonierten Hühnereiern propagiert. Insbesondere stellt das Substrat auf welchem diese IBD Viren propagiert werden, SPF embryonierte Eier dar. Embryonierte Eier können zum Beispiel mit einer 0.2 ml IBV Mutante enthaltenden Suspension oder Homogenat, die mindestens 10² TCID₅₀ pro Ei umfassen, inokuliert werden und anschliessend bei 37°C inkubiert werden. Nach ungefähr 2–5 Tagen kann das IBD Virusprodukt durch Sammeln der Embryonen und/oder der Membranen und/oder der Allantoisflüssigkeit geerntet werden, gefolgt von entsprechender Homogenisation dieses Materials. Das Homogenat kann danach für 10 Minuten bei 2500 × g zentrifugiert werden, gefolgt von Filtration des Überstandes über einen Filter (100 μm).
Der den Lebendvirus enthaltenden Impfstoff gemäss der Erfindung kann in Form einer Suspension oder in lyophilisierter Form hergestellt und vertrieben werden und enthält zusätzlich einen für solche Zusammensetzungen gebräuchlich verwendeten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel. Träger umfassen Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Puffer. Geeignete Stabilisatoren sind zum Beispiel SPGA, Carbohydrate (wie zum Beispiel Sorbitol, Mannitol, Stärke, Sukrose, Dextran, Glutamat oder Glukose), Proteine (wie zum Beispiel getrocknetes Milchserum, Albumin oder Casein) oder Abbauprodukte davon. Geeignete Puffer sind zum Beispiel Alaklimetallphosphate. Geeignete Konservierungsmittel sind Thimerosal, Merthiolat und Gentamycin. Verdünnungsmittel schliessen Wasser, wässrige Puffer (wie zum Beispiel gepufferte Salzlösung), Alkohole und Polyole (wie zum Beispiel Glycerol) ein.
Falls erwünscht können die Lebendimpfstoffe gemäss der Erfindung ein Adjuvans enthalten. Beispiele solcher geeigneter Verbindungen und Zusammensetzungen mit Adjuvansaktivität sind dieselben wie hiernach erwähnt.
Obwohl eine Verabreichung mittels Injektion des Lebendimpfstoffs gemäss der vorliegenden Erfindung möglich ist, z. Bsp. intramuskulär, subkutan, wird der Impfstoff vorzugsweise mittels der für eine IBDV Impfung gebräuchlich verwendeten, günstigen Massenanwendungsverfahren. Für eine IBDV Impfung schliessen diese Verfahren Trinkwasser und Sprayimpfung ein.
Alternative Verfahren zur Verabreichung des Lebendimpfstoffs umfassen eine Verabreichung in ovo, mittels Augentropfen und Schnabeltauchen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff bereitgestellt, der eine Birnavirus Mutante in einer inaktivierten Form umfasst. Der bedeutendste Nachteil eines inaktivierten Impfstoffs sind die extrem hohen Spiegel an schützenden Antikörpern von langer Dauer, die erzeugt werden können.
Das Ziel der Inaktivierung der nach dem Propagationsschritt geernteten Viren ist es, die Reproduktion der Viren zu eliminieren. Im allgemeinen kann dies mittels chemischer oder physikalischer Mittel erreicht werden. Eine chemische Inaktivierung kann durch Behandlung der Viren mit zum Beispiel Enzymen, Formaldehyd, β-Propiolacton, Ethylenimin oder einem Derivat davon bewirkt werden. Falls notwendig wird die inaktivierende Verbindung danach neutralisiert. Mit Formaldehyd inaktiviertes Material kann zum Beispiel mit Thiosulphat neutralisiert werden. Eine physikalische Inaktivierung kann vorzugsweise durch Aussetzen der Viren einer energiereichen Strahlung durchgeführt werden, wie zum Beispiel UV Licht oder γ-Strahlen. Falls erwünscht, kann der pH nach der Behandlung auf einen Wert von ungefähr 7 eingestellt werden.
Ein Impfstoff, der die inaktivierte Birnavirus Mutante enthält, kann zum Beispiel einen oder mehrere der hierin zuvor erwähnten, für diesen Zweck geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfassen.
Vorzugsweise umfasst ein inaktivierter Impfstoff gemäss der Erfindung eine oder mehrere Verbindungen mit Adjuvansaktivität. Für diesen Zweck geeignete Verbindungen oder Zusammensetzungen schliessen Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, eine Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl Emulsion, die zum Beispiel auf einem Mineralöl, wie zum Beispiel Bayol F^® oder Marcol 52^®, oder einem pflanzlichen Öl, wie zum Beispiel Vitamin E Acetat, und Saponine ein.
Der Impfstoff gemäss der Erfindung umfasst eine wirksame Dosis der Birnavirus Mutante als aktive Komponente, d. h. eine Menge an immunisierendem Birnavirus Material, das in den geimpften Vögeln Immunität gegen einen Challenge durch ein virulentes Virus induziert. Immunität wird hierin als Induktion eines bedeutend höheren Grades an Schutz in einer Vogelpopulation nach Impfung verglichen mit einer ungeimpften Gruppe definiert.
Typischerweise kann der Lebendimpfstoff gemäss der Erfindung in einer Dosis von 10²–10⁹ TCID₅₀ infektiösen Dosis (TCID₅₀) pro Tier verabreicht werden, vorzugsweise in einer Dosis, die sich zwischen 10^5.0–10^7.0 TCID₅₀ bewegt, und ein inaktivierter Impfstoff kann das antigene Äquivalent von 10⁵–10⁹ TCID₅₀ pro Tier enthalten.
Inaktivierte Impfstoffe werden normalerweise parenteral verabreicht, z. Bsp. intramuskulär oder subkutan.
Obwohl der IBDV Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung wirksam in Hühnern verwendet werden kann, kann anderes Geflügel, wie zum Beispiel Truthähne, Perlhühner und Rebhühner, ebenso mit dem Impfstoff erfolgreich geimpft werden. Hühner umfassen Masthühner, Zuchttiere sowie Legetiere.
Das Alter der Tiere, die einen Lebend- oder inaktivierten Impstoff gemäss der Erfindung erhalten, ist dasselbe wie das der Tiere, die konventionelle Lebend- oder inaktivierte IBDV Impfstoffe erhalten. Zum Beispiel können Masthühner (frei von mütterlich hergeleiteten Antikörper-MDA) in einem Alter von einem Tag geimpft werden, während Masthühner mit hohem Spiegel an MDA vorzugsweise in einem Alter von 2–3 Wochen geimpft werden. Legetiere oder Zuchttiere mit niedrigem Spiegel an MDA können in einem Alter von 1–10 Tagen geimpft werden, gefolgt von Boosterimpfungen mit inaktiviertem Impfstoff in einem Alter von 6–8 und 16–20 Wochen.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Kombinationsimpfstoffe, die zusätzlich zu der IBDV oder IPNV Mutante gemäss der Erfindung ein oder mehrere Immunogene umfassen, die von anderen für Geflügel beziehungsweise Fisch infektiöse Immunogene hergeleitet sind.
Der Kombinationsimpfstoff umfasst vorzugsweise zusätzlich ein oder mehrere Impfstoff-Stämme des Infektiösen Bursitis Virus (IBV), Newcastle Disease Virus (NDV), Egg Drop Syndrom (EDS) Virus, Puten Rhinotracheitis Virus (TRTV) oder Reovirus.
Zusätzlich zu einem Markerimpfstoff für Birnaviren ist die Verfügbarkeit eines geeigneten, diagnostischen Tests eine notwendige Voraussetzung für eine Anwendung eines Kontrollprogramms zur Ausrottung von Birnaviren. Solch ein diagnostischer Test wird hierin bereitgestellt und umfasst ein Verfahren zur Bestimmung einer IBDV Infektion in Geflügel und IPNV Infektion in Fisch, d. h. es wird ein Verfahren bereitgestellt, um ein mit einem hierin zuvor beschriebenen Impfstoff geimpftes Tier im Feld von einem mit einem natürlich vorkommenden IBDV oder IPNV infizierten Tier zu unterscheiden.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Birnavirus Infektion bereit, insbesondere zum Nachweis einer IBDV Infektion in einem Tier umfassend den Schritt der Überprüfung einer Probe des Tiers für das Vorhandensein von VP5 Antikörpern oder Antigenen. Das Tier ist ein Tier vom Einsatzort und ist insbesondere eine Vogelart, vorzugsweise ein Huhn. Die vom Tier stammende Probe kann jegliche Probe sein, in der IBDV Antikörper oder Antigene vorhanden sind, z. Bsp. Blut, Serum oder eine Gewebeprobe, wobei die Serumprobe bevorzugt wird.
Eine bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung einer Birnavirus Infektion in einem Tier ist ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen das VP5 Protein, umfassend die Schritte:

(i) Inkubieren einer unter Verdacht stehenden Probe Anti-Birnavirus Antikörper zu enthalten mit VP5 Antigen,
(ii) Bildung eines Antikörper-Antigen Komplexes, und
(iii) Nachweis des Vorhandenseins des Antikörper-Antigen Komplexes.

Das Design dieses Immunoassays kann unterschiedlich sein. Zum Beispiel kann der Immunoassay auf Kompetition oder direkter Reaktion basieren. Zudem können die Protokolle feste Träger verwenden oder können Zellmaterial verwenden. Der Nachweis des Antikörper-Antigen Komplexes kann den Gebrauch von markierten Antikörpern enthalten; die Label können zum Beispiel Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszierende, radioaktive oder Farbstoffmoleküle darstellen.
Geeignete Verfahren zum Nachweis der VP5 Antikörper in der Probe umfassen den Enzym-gekoppelten Immunosorbent Assay (ELISA), Immunofluoreszenztest (IFT) und Western Blot Analyse.
In einem exemplifizierten ELISA sind die Vertiefungen einer Polystyrol Mikrotitrationsplatte mit VP5 Antigen beschichtet. Als nächstes werden die Vertiefungen der beschichteten Platten mit Hühnreserum gefüllt und Verdünnungreihen werden durchgeführt. Nach der Inkubation werden Hühner anti-VP5 Protein Serumantikörper bestimmt mittels Nachweis von Antikörper (monoklonale oder polyklonale) mit derselben Spezifizität wie der Beschichtete, wobei dieser jedoch markiert ist (z. Bsp. mit Biotin). Der markierte Antikörper wird die freien Antigene, die nicht durch anti-VP5 Antikörper im Hühnreserum okkupiert wurden, okkupieren. Zum Beispiel kann an Avidin gekoppelte Meerrettichperoxidase hinzugegeben werden und die Menge an Peroxidase kann mittels einer enzymatischen Reaktion gemessen werden. Falls keine Antikörper gegen VP5 in der Hühnerserumprobe vorhanden sind dann wird eine maximale Absorption erhalten. Andrerseits kann nach der Inkubation mit Hühnerserum die im Serum vorhandene Menge an Antikörper, die an das VP5 Antigen banden direkt unter Verwendung eines Anti-Hühner Konjugats gefolgt von einer enzymatischen Reaktion bestimmt werden.
In einem Sandwich ELISA können die Vertiefungen einer Polystyrol Mikrotitrationsplatte mit einem gegen das VP5 Protein gerichteten, monoklonalen Antikörper beschichtet werden. Als nächstes werden die Vertiefungen dieser beschichteten Platten mit VP5 Antigen inkubiert. Nachdem das Antigen gebunden wurde werden die Vertiefungen mit dem Hühnreserum gefüllt und Verdünnungsreihen werden durchgeführt. Anschliessend kann das wie hierin zuvor beschriebene Protokoll befolgt werden. Dieser Test kann ebenso unter Verwendung von polyklonalem Serum gegen VP5 anstatt der beschichteten monoklonalen Antikörper durchgeführt werden.
In einem anderen diagnostischen Test (Western Blot Analyse) wird das VP5 Antigen (enthaltende) Material einer SDS-PAGE unterzogen. Als nächstes werden die aufgetrennten Proteine mittels Elektroblot auf Nitro-Zellulose Membranen aufgebracht. Danach können die Membranen in Bahnen geschnitten werden und die Bahnen werden mit dem Hühnerserum inkubiert. Das Vorhandensein von VP5 Antikörper in der Probe kann durch Untersuchen ob Antikörper an das VP5 Protein banden bestimmt werden, zum Beispiel unter Verwendung eines Anti-Hühner Konjugates gefolgt von einer enzymatischen Reaktion. Falls Antikörper gegen VP5 vorhanden sind, dann ist eine Bande von ungefähr 17 kDa identifizierbar.
Das VP5 Antigen kann jegliches VP5 Protein (Fragment)-umfassende Material sein, das die Bildung des VP5 Antigen-VP5 Antikörper Komplexes zulässt. Vorzugsweise umfasst das VP5 Antigen das Expressionsprodukt einer gängigen rekombinanten Wirtszelle oder Virus, z. Bsp. wie durch E. coli exprimiertes VP5 (Munst et al., J. Gen. Virol. 76, 437–443, 1995) oder Baculovirus exprimiertes Protein (Vakharia et al., Vaccine 12, 452–456, 1994; Vakharia et al., J. Gen. Virol. 74, 1201–1206, 1993), In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung wird ein diagnostisches Kit bereitgestellt, das zur Durchführung des diagnostischen Tests gemäss der Erfindung wie hierin zuvor beschrieben geeignet ist.
Insbesondere wird ein diagnostischens Kit bereitgestellt, das zusätzlich zu den im allgemeinen vorhandenen Komponenten das VP5 Antigen (falls erwünscht beschichtet auf einer Festplatte) als das immunologische Reagens umfasst. Andere normalerweise in solch einem Testkit vorhandenen Komponenten umfassen Biotin oder Meerrettichperoxidase konjugierte Antikörper, ein Enzymsubstrat, Waschpuffer, etc.
Um das Birnavirus VP5 Antigen in einer Messprobe eines Tie res im Feld zu bestimmen werden VP5-spezifische Antikörper als das immunologische Reagens, vorzugsweise fixiert auf einer Festphase, verwendet. Die Messprobe wird hinzugegeben und nach einer Inkubationszeit um die Bildung eines Antikörper-Antigen Komplexes zu gewähren, kann ein zweiter markierter Antikörper hinzugegeben werden, um den Komplex nachzuweisen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Konstruktion und Analyse eines rekombinanten VP5^–IBD Virus
Konstruktion eines vollständigen (full length) VP5^– Klons des IBDV Segmentes A.
Um ein VP5 negatives IBDV zu konstruieren, wurde die unmittelbar auf das 3'-Ende der vollständigen (full length) cDNA des Stamm D78 Segmentes A folgende EcoR1 Stelle gelöscht (pUC19FLAD78; Mundt und Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131–11136, 1996). Ein EcoR1 – KpnI Fragment, das die T7 Polymerase Bindungsstelle gefolgt von der kompletten Segment A Sequenz enthält wurde ausgeschnitten und in den EcoR1 – KpnI gespaltenen Vektor pUC18 eingefügt, nach Inaktivierung der einzigartigen NdeI innerhalb der Vektorsequenz, was zum Plasmid pAD78/EK führte. Danach wurde die genomische Region, die das Initiationscodon für VP5 umfasste in zwei Stücken mithilfe der A1F5' und VP5MutR Primer beziehungsweise VP5MutF und A2R Primer amplifiziert (für Sequenz und Lage der Primer siehe Tabelle 1). Die PCR Fragmente wurden separat kloniert und wurden anschliessend via einer einzigartigen AflII Stelle, die durch Mutationen innerhalb der entsprechenden Primer hergestellt wurden, zusammengefügt (siehe 2). Ein EcoR1 – NdeI Fragment, das die T7 Polymerase Bindungsstelle und den 5'-Teil des Segmentes A einschliesslich der eingeführten Mutationen enthält, wurde ausgeschnitten und dazu verwendet, das Wildtyp EcoR1 – NdeI Fragment in pAD78/EK zu ersetzen, um das Plasmid pAD78/VP5^– zu ergeben. Von den drei eingeführten Mutationen änderte eine das Initiations Methionincodon für VP5 in ein Arginincodon (2).
Tabelle 1: Sequenz der zur Herstellung der Mutantenkonstrukte verwendeten Oligonukleotidprimer.
Virus Wiedergewinnung von cRNA. Für die in vitro Transkription der RNA Plasmide wurden pAD78/EK, pAD78/VP5^– und pBP2 (2) durch Spaltung mit BrsGI beziehungsweise PstI linearisiert. Behandlung der linearisierten DNA, Transkription und Reinigung der RNA sowie Transfektion wurden wie von Mundt und Vahkharia (1996, supra) beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme, dass sekundäre CEC für die Transfektionsexperimente verwendet wurden. Drei Tage nach Transfektion wurde ein CPE in CEC sichtbar. Die Zellen wurden gefroren/aufgetaut, bei 700 × g zentrifugiert um Zelltrümmer zu entfernen und die erhaltenen Überstände wurden durch 0.45 μm Filter filtriert und bei –20°C aufbewahrt. Für die Transfektionsexperimente wurden vollständi ge (full length) cDNA Klone des Segmentes A des Stammes D78, die fähig sind (pAD78/EK) zu exprimieren oder unfähig sind VP5 (pAD78/VP5^–) exprimieren, in synthetische RNA transkribiert und mit Segment B vollständiger (full length) cRNA in CEC. Die erhaltene Virus Nachkommenschaft IBDV/EK und IBDV/VP5^– wurde zusätzlich charakterisiert.
Analyse der Transfektions-Nachkommenschaft mittels Immu nofluoreszenz und Radioimmunopräzipitations-Assay (RIPA)
VP5 wurde wie in Mundt et al. (J. Gen. Virol. 76, 437–443, 1995) in E. coli exprimiert. Hasen-monospezifisches polyklonales Antiserum und Maus monoklonale Antikörper gegen VP5 wurden gemäss Standardprotokollen hergestellt. Mit IBDV/VP5^–, IBDV/EK infizierte Vero Zellen beziehungsweise nicht-infizierte Zellen wurden mit Hasen anti-IBDV Serum, Hasen anti-VP5 Serum und mit anti-VP5 mAb DIE 7 inkubiert und mit Fluorescein konjugierten, sekundären Antikörpern gefärbt. Beide Antiseren und der monoklonale Antikörper erkannten die IBDV Antigene im Cytoplasma der IBDV/EK infizierten Zellen. Im Gegenteil, während das anti-IBDV Serum einfach virale Antigene in IBDV/VP5^– infizierten Zellen nachwies, zeigten weder das monospezifische anti VP5-Serum noch der monoklonale anti-VP5 Antikörper spezifische Reaktivität. Keine dieser immunologischen Reagenzien reagierte mit den nicht-infizierten Kontrollen.
Um während der Replikation exprimierte virale Proteine zu analysieren, wurden Lysate von radioaktiv markierten, mit IBDV/VP5^– (4, Bahnen 1–3) und IBDV/EK (4, Bahnen 4–6) infizierte Zellen mit Hasen anti-IBDV Serum, Hasen anti-VP5 Serum und mAb DIE 7 immunopräzipiert. Nicht-infizierte CEC wurden als Kontrolle verwendet (4, Bahnen 7–9). IBDV/EK (Bahn 4) sowie IBDV/VP5^– (Bahn 1) infizierte CEC zeigten nach Präzipitation mit Hasen anti-IBDV Serum die viralen Proteine VP2, VP3 und VP4 auf. Das Hasen anti-VP5 Serum (Bahn 5) und mAb DIE 7 (Bahn 6) fällten VP5 mit einer Molekularmasse von 21 kDa nur von IBDV/EK infizierten Zellen. Keine spezifische Reaktivität war in IBDV/VP5^– infizierten CEC nach Präzipitation mit Hasen anti-VP5 (Bahn 2) sowie dem VP5 spezfischen mAb DIE 7 (Bahn 3) nachweisbar. Nicht-infizierte CEC zeigten keine spezifische Reaktivität (Bahnen 7–9).
Replikation von IBDV/VP5^– in CEC. Um die Replikation von IBDV/VP5^–detaillierter nachzuweisen, wurde die One-Step-Growth analysiert (5). Konfluente, sekundäre CEC wurden mit IBDV/EK beziehungsweise IBDV/VP5^– mit 10⁷² TCID₅₀ infiziert. Unmittelbar nach dem Überschichten der infizierten Zellen mit 5 ml Wachstumsmedium wurde der Überstand von einer infizierten CEC Gewebekulturplatte jedes Virus entfernt und bei –20°C (0 h p. i.) aufbewahrt. Die restlichen Gewebekulturplatten wurden weiter inkubiert und 4 h, 8 h, 16 h, 24 h und 48 h p. i. wurden die Überstände entfernt und bei –20 °C aufbewahrt. Die Überstände wurden zentrifugiert und gemäss Standardmethoden titriert. Der TCID₅₀ bei verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion zeigte, dass das VP5 exprimierende Virus (IBDV/EK) sich schneller replizierte als die Virusmutante ohne VP5 (IBDV/VP5^–). 16 Std nach Infektion war IBDV/EK um das 100fache höher als IBDV/VP5^– ( 5). Bei 48 Std p. i. erreichte IBDV/VP5^– jedoch einen Titer von 10^7.2 TCID₅₀/ml, der ähnlich zu IBDV/EK war (10^7.45/ml).
Herstellung von rekombinantem IBDV/VP5^–-2. Das Plasmid pAD78/VP5^–-2 wurde mittels Verfahren, die den oben beschriebenen ähnlich waren, hergestellt. Die Nukleotidsequenz von Teil des mutierten VP5 Gens ist in SEQ ID No. 7 und 3 dargestellt. Ein die Mutationen beinhaltendes Restriktionsenzymfragment wurde verwendet um das Wildtyp EcoR1-NdeI Fragment in pAD78/EK zu ersetzen. Eine Übersicht des Protokolls zur Herstellung des rekombinanten Plasmides ist in 3 dargestellt. Die Organisation von pBD78 ist ebenfalls in 3 wiedergegeben. Das rekombinante Virus wurde wie oben beschrieben hergestellt, mit Ausnahme der Tatsache, dass das Segment B des Stammes D78 (SEQ ID No. 8) verwendet wurde und QM-7 Zellen für das Transfektionsexperiment verwendet wurden.
Beispiel 2
Identifizierung von VP5 Protein in verschiedenen IBDV Stämmen.
Verschiedene Stämme von IBDV wurden nach der Expression des VP5-Gens untersucht. Dies wurde durch Verwendung des Immunofluoreszenz Verfahrens (Immuno fluorescence technique, IFT) bewerkstelligt. In Mikrotiterplatten gezogene Hühnerembryo Fibroblasten wurden mit verschiedenen IBDV Stämmen infiziert. Drei bis 5 Tage nach Inkubation bei 37°C wurden die Zellen mit 70% Ethanol fixiert und dann mit polyklonalem Hasen anti IBDV Serum (R1928) beziehungsweise polyklonalem Hasen anti VP5 Serum (RaVPS) oder monoklonalem, gegen VP5 gerichteten Antikörper (DIE7) behandelt. Eine Bindung der poly- oder monoklonalen Antikörper an die verschiedenen IBDV Stämme wurde durch Verwendung eines Fluoreszenz-markierten Konjugates (Ziege-anti-Hase oder Ziege-anti-Maus) visualisiert. Die Resultate sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Identifizierung von verschiedenen Sero- und Subtypen von IBDV Stämmen. Bestimmung des Vorhandenseins von VP5 Protein.
Von diesen Daten kann geschlossen werden, dass die verschiedenen Stämme von IBDV, die zu verschiedenen Sero- und Subtypen gehören, das VP5-Gen exprimieren. Ferner kann der rekombinante VP5^– IBDV Impfstoffstamm von Feld- und Impstoffviren unterschieden werden, was ermöglicht, dass das rekombinante VP5^– Virus als Markerimpfstoff verwendet werden kann.
Beispiel 3
In vivo Testen der rekombinanten VP5⁺ und VP5^– IBDV Imfstoffe im Vergleich mit einem kommerziell erhältlichen, lebenden IBDV Impfstoff.
Herstellung des IHDV Impfstoffes. Primäre Hühnerembryo Fibroblasten (CEF) Zellen wurden in einer Konzentration von 2 × 10⁶/ml hergestellt. Die Zellen wurden in Eagles Minimum Essential Medium enthaltend 5% fötales Kälberserum kultiviert. Zu 25 ml dieser Zellsuspension wurde 0.1 ml IBDV/EK oder IBDV/VP5^– Virus) mit einem infektiösen Titer von ungefähr 3.0 log10 TCID₅₀/ml) hinzugegeben. Nach Inkubation für 5 Tage in einem Hoch-Feuchtigkeits-Inkubator bei 37°C wurde die gesamte Suspension in einem Tierexperiment ohne weitere Reinigung verwendet. Der infektiöse Titer des Überstandes betrug 10^7.1 TCID₅₀/ml.
Tierexperiment. In dieser Studie wurde die Potenz verschiedener Impfstoffe (ein VP5 positiver Stamm IBDV/EK und ein VP5 negativer Stamm IBDV/VP5^–, und der kommerziell erhältliche IBDV Impfstoff Nobilis Stamm D78, Intervet International B. V., NL) untersucht. 3 Wochen alte SPF Küken wurden wie im Behandlungsplan angegeben behandelt. Behandlungsplan:

VP5⁺: Bursitis Impfung mit VP5 positivem Impfstoffklon, Augentropfen Route, Dosis 10^4.6 TCID₅₀/Tier, 0.1 ml/Tier
VP5⁺: Bursitis Impfung mit VP5 negativem Impfstoffklon, Augentropfen Route, Dosis 10^5.9 TCID₅₀/Tier, 0.1 ml/Tier
D78: Bursitis Impfung mit IBDV IMPFSTOFF NOBILIS STAMM D78, Augentropfen Route, eine Felddosis.
ch: Challenge mit Bursitisvirus, Farragher Stamm F52/70, Augentropfen Route, Dosis 10^2.0 TCID₅₀/Tier, 0.1 ml/Tier.
b1: Serologische Untersuchung; VN-Test und/oder Western Blotting.
x: Histologische Untersuchung (H. E. Färbung) und MCA-8 ELISA on bursae
x1: Histologische Untersuchung (H. E. Färbung) und MCA-8 ELISA on bursae und Reisolierung des Virus von der Bursa Fabricii.
+: Klinische Untersuchung und nach 10 Tagen histologische Untersuchung der Bursa.

Nachweis des Virus in der Bursa Fabricii.
Drei, 7, 14 und 20 Tage nach der Augentropfen-Impfung wurden die Tiere getötet und Blut und Bursa wurden entnommen. Das Vorhandensein des Virus in der Bursa wurde mit einem Enyzmverbundenen Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 8 (MAB-8) bestimmt. MAB-8 ist spezifisch gegen IBDV gerichtet. Die Daten sind in Tabelle 3 wiedergegeben.
Ferner wurden 3 und 7 Tage nach der Impfung die Bursae der Tiere der Gruppe 2 auf das Vorhandensein von rekombinantem VP5^– Virus untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Bursae homogenisiert und auf Hühnerembryo Fibroblasten kultiviert. Das Vorhandensein von VP5^– Virus wurde mittels IFT bestimmt unter Verwendung von polyklonalen Hasen Seren gegen IBDV oder VP5 oder monoklonalen Antikörpern gegen VP5. Von 13 der 15 untersuchten Bursae (87%) konnte VP5^– Virus reisoliert und identifiziert werden (positiv für R1928 und negativ für RαVP5 und DIE7). Dies deutet darauf hin, dass das Virus nach einer Tierpassage nach wie vor VP5^– ist, was darauf hinweist dass das Virus stabil ist und sich nicht in VP5⁺ zurückwandelt. Ferner kann das VP5^– Impfstoffvirus durch die Verwendung der verschiedenen poly- und monoklonalen Antikörper von allen anderen Impfstoff und/oder Feld IBDV Viren unterschieden werden. Demzufolge kann der VP5^– Impfstoff als Markerimpfstoff verwendet werden.
Drei Tage nach dem Challenge konnte in den Gruppen 1, 2 und 3 kein Virus mittels MCA-8 ELISA nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu enthielten alle Tiere der Gruppe 4 (nicht-geimpfte Kontrollgruppe) das Challenge Virus in der Bursa Fabricii 3 Tage nach dem Challenge. Die Resultate zeigen, dass die mit rekombinantem VP5⁺ (Gruppe 1), rekombinantem VP5^– (Gruppe 2) und IBDV Impfstoff Nobilis D78 (Gruppe 3) geimpften Tiere gegen schweren Challenge geschützt waren.
Tabelle 3: Individuelle Daten zum Nachweis von Virus in der Bursa Fabricii mit MCA-8 ELISA an verschiedenen Tagen nach Impfung oder Challenge.
Nachweis von Läsionen in der Bursa Fabricii.
Der mikroskopische, durchschnittliche Läsionenwert (microscopic average lesion score), die durch die verschiedenen IBDV (rekombinanten) Impfstoffe oder das Challenge Virus induziert wurden, ist in Tabelle 4 dargestellt.
Vor dem Challenge zeigten mit rekombinantem VP5⁺ IBDV Impfstoff (Gruppe 1) geimpfte oder mit IBDV Impfstoff Nobilis D78 (Gruppe 3) geimpfte Tiere milde bis mässige Läsionen in der Bursa Fabricii, was darauf hindeutet dass die Tiere der Gruppen 1 und 3 gegen einen Challenge geschützt waren. Zudem wurden 10 Tage nach dem Challenge nur sehr milde Läsionen (0–20% Lymphozyten Depletion) in der Bursa der mit VP5⁺ rekombinantem IBDV Impfstoff oder mit dem Nobilis Impfstoff D78 geimpften Tiere beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten nicht geimpfte Tiere 10 Tage nach dem Challenge schwere Läsionen. Mit anderen Worten, alle mit dem VP5⁺ rekombinanten IBDV Impfstoff oder mit dem Nobilis Impfstoff D78 geimpften Tiere (100%) der Gruppen 1 und 3 waren gegen einen schweren Challenge geschützt.
Drei, 7, 14 und 20 Tage nach der Impfung und 3 und 10 Tage nach dem Challenge mit dem rekombinanten VP5^– IBDV Impfstoff zeigten die Tiere der Gruppe 2 keine oder kaum Läsionen (0–20% Lymphozyten Depletion) in der Bursa. Alle mit dem VP5^– rekombinanten IBDV Impfstoff geimpften Tiere der Gruppe 2 waren gegen einen schweren Challenge geschützt. Bei einem Vergleich von rekombinanten VP5^– IBDV Impfstoff geimpften Tieren mit den Tieren der Gruppen 1 und 3 (mit einem rekombinanten VP5⁺ oder kommerziell erhältlichen Impfstoff geimpft), induzierte der rekombinante VP5^– Impfstoff weniger Läsionen und ist deshalb sicherer und milder als die in diesem Experiment getesteten Impfstoffe.
Drei Tage nach dem Challenge zeigten alle nicht geimpften Tiere der Gruppe 4 schwere, akute Läsionen in der Bursa (vollständige Lymphozyten Depletion, Wert 5.0). Zehn Tage nach dem Challenge zeigten alle Tiere (17 von 17 Tieren) vollständige Lymphozyten Depletion, was darauf hinwies dass diese Tiere gegen einen scheren Challenge nicht geschützt waren. Tiere, die nach dem Challenge starben, zeigten alle schwere Läsionen in der Bursa Fabricii. Daraus wurde geschlossen, dass die Kontrollgruppe 4 gegen einen schweren Challenge nicht geschützt war, was darauf hinwies, dass die Testbedingungen optimal waren.
Tabelle 4: Durchschnittlicher Läsionenwert in der Bursa an verschiedenen Tagen nach Impfung oder Challenge. Der durchschittliche Läsionenwert wird wiefolgt berechnet: alle Läsionenwerte der Tiere pro Gruppe an einem bestimmten Tag werden zusammengezählt. Diese Zahl wird dann durch die Gesamtzahl an untersuchten Tieren in dieser Gruppe an diesem Tag geteilt. Individuelle Werte reichen von 1 bis 5. Wert 0 = keine Lymphozyten Depletion, Wert 1 = 0–20%; Wert 2 = 20–40%; Wert 3 = 40– 60%; Wert 4 = 60–80%; und Wert 5 = 80–100% Lymphozyten Depletion (vollständige Lymphozyten Depletion).
Serologische Antwort.
Die serologische Antwort der Tiere wurde in einem Virus Neutralisationstest (VN) durch Messen der Fähigkeit von Blutserum, einen klassischen, infektiösen Bursitis Virusstamm zu neutralisieren, bestimmt. Das Serum wurde 3, 7, 14 und 20 Tage nach der Impfung untersucht. Die durchschnittlichen Neutralisationstiter sind in Tabelle 5 aufgezeigt.
Die Resultate zeigen, dass bei Hühnern der Gruppe 1 angewandter, rekombinanter IBDV Impfstoff VP5⁺ 20 Tage nach der Impfung eine gute und hohe serologische Antwort induzierte, die mit der serologischen Antwort von mit kommerziellem IBDV Impfstoff Nobilis D78 (Gruppe 3) geimpften Hühnern vergleichbar ist. Der bei Hühnern der Gruppe 2 angewandte, rekombinante IBDV Impfstoff VP5^– induzierte ebenfalls eine gute serologische Antwort. Ein Titer von 9.4 log2 wurde 20 Tage nach der Impfung beobachtet. Die durch den rekombinanten IBDV VP5^– Impfstoff induzierte, serologische Antwort war verglichen mit der durch den rekombinanten IBDV VP5⁺ Impfstoff oder den kommerziellen IBDV Impfstoff Nobilisstamm D78 induzierte, serologische Antwort verzögert.
Die nicht geimppfte Gruppe 4 zeigte keinrlei serologische Antwort gegenüber IBDV.
Tabelle 5: Durchschnittliche IBDV-VN Titer der Gruppen 1 bis 4 an verschiedenen Tagen nach der Impfung, ausgedrückt als log2 der Verdünnung.
Serologische Differenzierung zwischen Antiseren.
Die serologische Antwort gegen VP5 wurde unter Verwendung von Western Blot Analyse untersucht. Zu diesem Zweck wurde das VP5 Protein im E.coli oder Baculo Expressionssystem exprimiert. Die exprimierten Protein wurden mittels SDS PAGE getrennt. Als nächstes wurden die Proteine mittels Elektroblot auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht. Danach wurde die Membran in Bahnen geschnitten und die Bahnen wurden mit Hasen anti-VP5 Serum, gegen VP5⁺ rekombinanten Impfstoff gerichtetes Hühnerserum, gegen VP5^– rekombinanten Impfstoff gerichtetes Hühnerserumoder negatives Serum von SPF Hühnern inkubiert. Die Daten sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Wie aus Tabelle 6 ersichtlich ist, induziert das VP5^– Serum keine serologische Antwort gegen VP5. Im Gegensatz dazu erkennen das Hasen anti-VP5 Serum und das gegen VP5⁺ rekombinanten Impfstoff gerichtete Hühnerserum das VP5-Protein und induzieren demzufolge eine serologische Antwort gegen VP5. Dies deutet darauf hin, dass Hühnerserum dazu verwendet werden kann zu untersuchen, ob Tiere einem Virus, das das VP5 Protein exprimiert (z. Bsp. einem Feldvirus) oder dem VP5^– rekombinanten Impfstoff ausgesetzt waren.
Tabelle 6: Western Blot Analyse. Serum von mit VP5⁺ oder VP5^– rekombinantem Impfstoff geimpften Tieren sowie SPF Hühnerserum und anti VP5-Hasen Serum wurden auf ihre Reaktion mit dem VP5-Protein untersucht.
Sterblichkeit und klinische Symptome.
Keine der mit dem VP5⁺ IBDV Impfstoff (Gruppe 1)geimpften, dem rekombinanten VP5^– IBDV Impfstoff (Gruppe 2) geimpften oder mit dem kommerziellen IBDV Impfstoff Nobilisstamm D78 (Gruppe 3) geimpften Tiere starben oder zeigten klinische Symptome von infektiöser Bursitis nach dem Challenge, was darauf hinweist, dass die Tiere gegen schweren Challenge geschützt waren. Alle Tiere in der nicht geimpften Kontrollgruppe waren gegen schweren Challenge nicht geschützt.
Beispiel 4
In vivo Testen des rekombinanten VP5-2 Imfstoffes
Herstellung der IBDV Impfstoffe. Primäre Hühnerembryo Fibroblasten (CEF) Zellen wurden in einer Konzentration von 2 × 10⁶/ml hergestellt. Die Zellen wurden in Eagles Minimum Essential Medium enthaltend 5% fötales Kälberserum kultiviert. Zu 15 ml dieser Zellsuspension wurde 0.1 ml IBDV/VP5--2 (D78/D78/VP5^–) Virus hinzugegeben. Nach Inkubation für 6 Tage in einem Hoch-Feuchtigkeits-Inkubator bei 37°C wurde der Überstand titriert. Der infektiöse Titer des Überstands betrug 10^8.2 TCID₅₀/ml. Für das zweite Tierexperiment wurde der Überstand verdünnt um eine Impfstoffdosis von 10^5.5 TCID₅₀/Tier zu ergeben und für das erste Tierexperiment wurde der Überstand verdünnt um eine Impfstoffdosis von 10^4.0 TCID₅₀/Tier oder 10^5.0 TCID₅₀/Ei zu ergeben.
Erstes Tierexperiment. Der Effekt des Impfstoffs wird durch Messung der serologischen Antwort und Resistenz gegenüber einem Challenge, der durch Verabreichung eines Challenge Virus im Alter von 14 Tagen erhalten wurde, beurteilt. Der Impfstoff (10^5.0 TCID₅₀/Ei oder 10^4.0 TCID₅₀/Tier von D78/D78/VP5^–) wurde in ovo oder intramuskulär bei einem Alter von einem Tag angewendet. Mikroskopische Läsionen in der Bursa wurden 3 und 10 Tage nach dem Challenge untersucht. Der Schutz gegen den Challenge wurde bestimmt und die serologische Antwort wurde bei einem Alter von 14 Tagen mit dem VN-Test bestimmt.
1. Durchschnittliche mikroskopische Läsionenwerte in der Bursa 3 und 10 Tage nach dem Challenge
2. Schutz nach Challenge
3. Serologische Antwort gegen IBDV
Der VN-Titer ist als log2 der Verdünnung ausgedrückt. Tiere mit einem Titer < 4.0 log2 werden berücksichtigt.
Schussfolgerungen

1 Der D78/D78/VP5^– Stamm ist ein höchst abgeschwächtes IBD-Virus
2 Der Virusstamm ist sehr mild
3 Das Virus kann eine serologische Antwort induzieren
4 Das Virus kann Schutz induzieren
5 Der Virusstamm kann mittels intramuskulärer Injektion bei 1 Tage alten SPF Hühnern und in ovo bei 18-Tage alten embryonierten SPF-Eieren angewendet werden

Zweites Tierexperimeat. Der Effekt des Impfstoffs wird durch Messung der serologischen Antwort gegen IBDV und Resistenz gegenüber einem Challenge, der durch Verabreichung eines Challenge Virus 21 Tage nach Verabreichung des Gumboro Impfstoffes erhalten wurde, beurteilt. Der Impfstoff (10^5.5 TCID₅₀/Tier von D78/D78/VP5^–) wurde 14 Tage alten SPF Hühnern über die intramuskuläre Route verabreicht. Drei, 7, 14 und 20 tage nach Impfung und 3 Tage nach Challenge wurden die Bursa, Milz, Thymus, Leber, Duodenum, Pankreas, ceacalen Tonsillen und der Hardereian Drüsen auf mikroskopische Läsionen untersucht. Zehn Tage nach Challenge wurden die Bursae auf mikroskopische Läsionen untersucht.
Die Seren wurden im VN-Test getestet. Sowie die Sterblichkeit wurde nach dem Challenge bewertet. 1. Prozent Sterblichkeit nach Challenge:
2. Mikroskopische Läsionen der geimpften gruppe vor und nach dem Challenge:

A: Nicht geimpfte Tiere zeigten eine Lymphozyten Depletion von 5.0 (100%) und 4.25, 3 beziehungsweise 10 Tage nach dem Challenge.
ND: nicht bestimmt.

3. Serologische Antwort nach Impfung
Schussfolgerungen

1. Der D78/D78/VP5^– Stamm ist ein höchst abgeschwächtes IBD-Virus
2. Der Virusstamm ist sehr mild und induziert keine Läsionen in Organen
3. Das Virus kann eine serologische Antwort induzieren
4. Das Virus kann Schutz induzieren

LEGENDE ZU DEN FIGUREN
1 Genomische Organisation von Segment A und Segment B des IBDV. Die Zahlen geben die Nukleotidpositionen der Start-, End- und kodierenden Region der Segmente an.
2 Konstruktion der genomischen cDNA Klone zur Herstellung des IBDV/VP5^–. Das Plasmid pAD78/EK enthält die gesamte D78 Segment A cDNA, die das Polyprotein (VP2-VP4-VP3) und VP5 kodiert. Das Plasmid pBP2 enthält das gesamte Stamm P2 Segment B, das VP1 kodiert. Mutationen wurden im Plasmid pAD78/VP5^– durch Änderung des Methionin Startcodons für VP5 zu Arginin und Erstellung einer künstlichen Afl II Sopaltungsstelle eingeführt. Rekombinante Plasmide wurden mit den unterstrichenen Restriktionsenzymen linearisiert, gefolgt von T7 Polymerase Transkription.
3 Konstruktion der genomischen cDNA Klone zur Herstellung des IBDV/VP5^–-2. Das Plasmid pAD78/EK enthält die gesamte D78 Segment A cDNA, die das Polyprotein (VP2-VP4-VP3) und VP5 kodiert. Das Plasmid pBP2 enthält das gesamte Stamm D78 Segment B, das VP1 kodiert. Mutationen wurden im Plasmid pAD78/VP5^– durch Änderung des Methionin Startcodons für VP5 zu Glutaminsäure und Erstellung einer künstlichen BstBI Sopaltungsstelle eingeführt. Weitere Mutationen wurden in den Arginin und Glutamin Codons eingeführt. Rekombinante Plasmide wurden mit den unterstrichenen Restriktionsenzymen linearisiert, gefolgt von T7 Polymerase Transkription.
4 Radioimmunopräzipitation von Proteinen von CEC infizierten Zellen mit rekombinanten IBDV. CEC infizierte Zellen mit IBDV/VP5^– (Bahnen 1–3), IBDV/EK (Bahnen 4–6) und nicht infizierte Kontrollen wurden mit Hasen anti-IBDV Serum (Bahnen 1, 4, 7), Hasen anti-VP5 Serum (Bahnen 2, 5, 8) und mAb DIE7 (Bahnen 3, 6, 9) immunopräzipitiert. Die Position der Molekulargewichtsmarker (M) ist angegeben. Die Stellen der viralen Proteine VP2, VP3, VP4 und VP5 sind markiert.
5 Replikationskinetik von IBDV/EK und IBDV/VP5. Infektiöse Titer der Überstände (vertikale Achse) wurden zu den angegebenen Zeiten bestimmt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine Birnavirus Mutante, die aufgrund einer Mutation im VP5 Gen des Birnavirus Genoms kein natives VP5 Protein produzieren kann, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation: (i) eine Substitution von mindestens zwei Nukleotiden des Startcodons des VP5 Gens, und (ii) ein Stopcodon in jedem der drei offenen Leserahmen am 5'-Ende des VP5 Gens. umfasst.
Eine Birnavirus Mutante gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass das Birnavirus ein Infektiöses Bursitis Virus (IBDV) darstellt.
Eine Birnavirus Mutante gemäss Ansprüchen 1–2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation im Genom eines virulenten Feldvirus ist.
Eine Birnavirus Mutante gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation im Genom eines Impfstoff-Stammes, vorzugsweise im Impfstoff-Stamm D78, ist.
Eine Birnavirus Mutante gemäss Ansprüchen 2–4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante ein mutiertes Startcodon und drei Stopcodons am 5'-Ende des VP5-Gens wie in SEQ ID No: 7 dargestellt besitzt.
Eine Birnavirus Mutante gemäss Ansprüchen 2–5, dadurch gekennzeichnet, dass das IBDV ein chimäres VP2 Protein expri miert, das Virus-neutralisierende Epitope von unterschiedlichen, antigenen IBDV-Typen umfasst.
Ein Impfstoff gegen eine Birnavirus Infektion in Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Birnavirus Mutante gemäss Ansprüchen 1–6 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verfahren zur Abschwächung der Virulenz eines Birnavirus in einem Tier, welches den Schritt des Einführens einer Mutation in das VP5 Gen umfasst, als Folge dessen das Birnavirus kein VP5 Protein produzieren kann.
Verfahren gemäss Anspruch 8, worin die Mutation eine Substitution darstellt.
Verfahren gemäss Ansprüchen 8–9, worin das Birnavirus ein Infektiöses Bursitis Virus (IBDV) darstellt.
Verfahren gemäss Ansprüchen 8–10, worin die Mutation im Genom eines virulenten Feldvirus ist.
Verfahren gemäss Ansprüchen 8–11, worin die Mutation eine Substitution von mindestens zwei Nukleotiden des Startcodons des VP5 Gens umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 12, worin die Mutation zusätzlich ein oder mehrere Stopcodons am 5'-Ende des VP5-Gens umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 13, worin die Mutation in jedem der drei offenen Leserahmen ein Stopcodon umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 14, worin die Mutation im Startcodon ist und drei Stopcodons am 5'-Ende des VP5-Gens wie in SEQ ID No: 7 dargestellt umfasst.