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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine Birnavirus Mutante, einen Impfstoff umfassend diese Mutante, ein
Verfahren zur Bestimmung einer Birnavirus Infektion in einem Tier
sowie ein Testkit zur Durchführung
dieses Verfahrens.
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Das infektiöse Bursitisvirus (Infectious
Bursal Disease Virus, IBDV) und das infektiöse Pankreasnekrosis Virus (Infectious
Pancreatic Necrosis Virus, IPNV) sind Mitglieder der Birnaviridae
Familie. Die Viren in dieser Familie haben eine sehr ähnliche
genomische Organisation und einen ähnlichen Replikationszyklus.
Die Genome dieser Viren bestehen aus 2 Segmenten (A und B) aus doppelsträngiger (ds)
RNS. Das grössere Segment
A kodiert ein Polyprotein, welches mittels Autoprotolyse gespalten
wird, um die reifen, viralen Proteine VP2, VP3 und VP4 zu bilden
(Hudson, P. J. et al, Nucleic Acids Res., 14, 5001–5012, 1986);
Dobos, P., Annual review of fish diseases 5, 25–54, 1995). VP2 und VP3 sind
die bedeutendsten Strukturproteine des Virions. VP2 ist das bedeutendste
Wirt-schützende
Immunogen der Birnaviren und enthält die antigenen Regionen,
die für
die Induktion der neutralisierenden Antikörper verantwortlich sind. Das
VP4 Protein scheint eine Virus-kodierte Protease zu sein, die in
der Verarbeitung eines Vorläufer
Polyproteins der VP2, VP3 und VP4 Proteine involviert ist. Das grössere Segment
A besitzt ebenso einen zweiten offenen Leserahmen (open reading
frame, ORF), der dem Polyprotein Gen vorgelagert ist und mit diesem
teilweise überlappt.
Dieser zweite offene Leserahmen kodiert ein Protein VP5 von unbekannter
Funktion, welches in IBDV infizierten Zellen vorhanden ist (Mundt
E. et al, J. Gen. Virol., 76, 437–443, 1995).
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Das kleinere Segment B kodiert VP1,
ein 90 kDa multifunktio nelles Protein mit Polymerase und Capping-Enzym
Funktionen (Spies, U. et al., Virus Res., 8, 127–140, 1987 und Spies, U. et
al, J. Gen Virol., 71, 977–981,
1990; Duncan, R. et al, Virology, 181, 541–552, 1991).
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Für
IBDV existieren zwei Serotypen, Serotyp 1 und 2. Die 2 Serotypen
können
mittels Virus Neutralisationstests (VN) differenziert werden. Zudem
wurden Untertypen von Serotyp 1 isoliert. Diese sogenannten Virus „Varianten" von Serotyp 1 können mittels
Cross-Neutralisationstests (Diseases of Poultry, 9th edition, 1991,
Wolfe Publishing Ltd., ISBN 0 7234 1706 7, Kapitel 28, P. D. Lukert
und Y. M. Saif, 648–663),
einer Auswahl monoklonaler Antikörper
(Snyder, D. B. et al, Arch. Virol., 127, 89–101, 1992) oder RT-PCR (Jackwood, D.
J., Proceedings of the International symposium on infectious bursal
disease and chicken infectious anemia, Rauischholzhausen, Germany,
155–161,
1994) identifiziert werden. Gewisse dieser Untertypen von Serotyp
1 von IBDV wurden in der Literatur beschrieben, zum Beispiel Klassische,
Variant-E, GLS RS593 und DS326 Stämme (Van Loon et al, Proceedings
of the International symposium on infectious bursal disease and
chicken infectious anemia, Rauischholzhausen, Germany, 179–187, 1994).
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Die infektiöse Bursitis (Infectious Bursal
Disease, IBD), ebenso Gumboro Krankheit genannt, ist eine akute,
hochansteckende, virale Infektion in Hühnern, wobei das lymphatische
Gewebe das primäre
Ziel darstellt mit einem selektiven Tropismus für Zellen der Bursa Fabricii.
Die Morbiditätsrate
anfälliger
Herden ist hoch mit raschem Gewichtsverlust und gemässigten
Sterblichkeitsraten. Hühner,
die sich von dieser Krankheit erholen, können aufgrund der Zerstörung der
Bursa Fabricii, die für
den Abwehrmechansimus der Hühner
notwendig ist, Immunmängel
aufweisen. Das IBD Virus verursacht eine schwerwiegende Immun suppression
in Hühnern,
die weniger als 3 Wochen alt sind und induziert Läsionen der
Bursa in Küken,
die bis zu 3 Monaten alt sind.
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Über
viele Jahre hinweg konnte die Krankheit durch Induktion hoher Mengen
an Antikörpern
in Brutherden mittels Anwendung eines inaktivierten Impfstoffes
an Hühner,
die mit einem abgeschwächten
IBDV-Lebendimpfstoff geprimt wurden, verhindert werden. Dadurch
wurden durch IBD verursachte, wirtschaftliche Verluste minimal gehalten.
Mütterliche
Antikörper
in Hühnern,
die von geimpften Bruthühnern
stammen, verhindern eine frühe
Infektion mit IBDV und verringern mit Immunosuppression verbundene
Probleme. Zusätzlich
wurden nach einer Abnahme der mütterlichen
Antikörper
abgeschwächte
Lebendimpfstoffe ebenso in käuflichen
Hühnerherden
verwendet.
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Kürzlich
verursachten äusserst
virulente IBDV-Stämme
Ausbrüche
der Krankheit mit hoher Sterblichkeit in Europa. Die gegenwärtigen Impfprogramme
versäumten
es die Hühner
ausreichend zu schützen.
Impfmisserfolge ergaben sich hauptsächlich aufgrund der Unfähigkeit
der Lebendimpfstoffe, die Vögel
vor einem Challenge mit einem virulenten Feldvirus zu infizieren.
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Eine Ausrottung der Krankheit durch
andere vorbeugende Massnahmen als eine Impfung ist nicht durchführbar, da
das Virus weitverbreitet ist und da es mit den gegenwärtig verabreichten
abgeschwächten, lebenden
oder inaktivierten IBDV-Impfstoffen nicht möglich ist zu bestimmen, ob
ein spezifisches Tier mit einem IBDV-Feldvirus infiziert ist oder
ob das Tier mit einem IBDV-Impfstoff geimpft wurde. Um ein Ausrottungs-Kontrollprogramm
für IBDV
einzuleiten, ist es höchst
wünschenswert,
zwischen mit einem IBDV-Impfstoff geimpften Tieren und denjenigen,
die mit einem Feldvirus infiziert wurden, unterscheiden zu können, um geeignete
Massnahmen treffen zu können,
d. h. infizierte Herden zu entfernen um die Ausbreitung des viru lenten
Feldvirus zu verhindern. Die Einführung von zum Beispiel einem
serologisch identifizierbaren Marker kann durch eine Mutation in
Genen erzielt werden, die nicht-wesentliche (Glyko)Proteine des
IBDV kodieren und die dennoch die Produktion von Antikörpern in
einem infizierten Wirtstier hervorrufen. Ein Markerimpfstoff für die Aujeszky-Krankheit
diagnostische Begleittests bewiesen ihre praktischen Wert in der
Kontrolle dieser Krankheit. Während
solche Kontrollprogramme für
andere virale Infektionskrankheiten in Tieren in Entwicklung sind,
wurde bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung ein auf einem
IBDV-Impfstoffstamm
basierender Impfstoff, der für
IBDV Kontrollprogramme passend wäre,
noch nicht beschrieben.
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Mundt und Köllner (Annual Meeting of the
German Federal Research Institute for virus diseases in animals,
March 1997) offenbaren die Konstruktion einer IBDV-Mutante, die
es aufgund einer gentechnologischen Mutation im Startcodon des VP5
Gens unterlässt,
ein VP5 Protein zu exprimieren. Diese Mutation umfasst die Substitution
eines Nukleotides im Startcodon des VP5 Gens.
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Die vorliegende Erfindung stellt
eine Birnavirus Mutante gemäss
den Ansprüchen
bereit, die als Folge einer Mutation im VP5 Gen des Birnavirus Genoms
nicht fähig
ist, ein natives VP5 Protein zu produzieren.
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Die Birnavirus Mutante ist vorzugsweise
eine IBDV Mutante oder eine IPNV Mutante, wobei die IBDV Mutante
am meisten bevorzugt ist, insbesondere wird von der vorliegenden
Erfindung eine IBDV Mutante, die von einem Serotyp 1 IBD Virus hergeleitet
ist, bereitgestellt.
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Es wird gezeigt, dass eine IBDV Mutante,
die nicht fähig
ist ein VP5 Protein zu produzieren, nach wie vor fähig ist,
Geflügel
zu infizieren und sich in vivo in den infizierten Wirtstieren zu
replizieren, d. h. es werden Beweise bereitge stellt, dass das VP5
Protein kodierende Gen ein nicht-wesentliches
Gen ist. Beispiele 3 und 4 zeigen, dass VP5 IBDV von Organen von
mit der IBDV Mutante infizierten Tieren reisoliert werden kann und dass
die IBDV Mutante eine schützende
Immunantwort in den infizierten Tieren hervorruft.
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Zudem wurde hierin erwiesen, dass
Teil der normalen anti-IBDV-Immunantwort
in Geflügel
gegen die VP5 Region gerichtet ist. Dies ist eher überraschend,
da das VP5 Protein bedacht wird, ein nicht-strukturelles, virales
Protein darzustellen (Mundt et al., J. Gen. Virol. 76, 437–443, 1995)
und die Immunantwort in einem Tier gegen win virales Pathogen im
allgemeinen gegen Struktur(glyko)proteine des Virus hervorgerufen
wird. Diese Erkenntnisse machen die IBDV Mutante und andere Birnavirus
Mutanten gemäss
der Erfindung zu einem geeigneten Viruskandidaten für einen
Markerimpfstoff. Solch ein Markerimpfstoff gewährt die Möglichkeit zu bestimmen, ob
Tiere mit einem Wildtyp Birnavirus, d. h. IBDV, oder mit einem Impfstoffvirus
infiziert sind.
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Zusätzlich wurde festgestellt,
dass das VP5 Protein in der Expression der Virulenz der Birnaviren,
insbesondere von IBDV, involviert sind und dass die Unfähigkeit
der Virusmutanten das native VP5 Protein zu produzieren zu einer
Abschwächung
des Virus führt.
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Unter dem Begriff „welches
nicht fähig
ist, ein natives VP5 Protein zu produzieren" versteht man dass die Birnavirus Mutante
ein Polypeptid produziert, das mittels serologischer Tests vom nativen
VP5 Protein unterschieden werden kann, oder gar kein VP5 Protein
produziert. Im ersteren Fall zum Beispiel produziert die Birnavirus
Mutante nur ein Fragment des nativen Birnavirus VP5 Proteins, dem
ein oder mehrere immunogene Epitope fehlen.
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Die Birnavirus Mutante gemäss der Erfindung
produziert kein VP5 Protein nach Infektion einer Wirtszelle.
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Wie oben beschrieben ist die genomische
Organisation der Birnaviren gur ergründet: das IBDV und IPNV Genom
umfasst ein grosses Segment A und ein kleineres Segment B. Das Segment
A von IBDV umfasst einen grossen offenen Leserahmen (open reading
frame, ORF), der ein Polyprotein von ungefähr 110 kDa (VP2-VP3-VP4) kodiert. Das
das VP5 Protein kodierende Gen ist im Stand der Technik identifiziert
und hierin als der kleine ORF auf dem Segment A des Birnavirus Genoms
definiert, der dem das Polyprotein kodierenden ORF vorgelagert ist
und mit diesem teilweise überlappt
(Bayliss et al., J. Gen. Virol. 71, 1303–1312, 1990; Spies et al.,
J. Gen Virol. 71, 977–981,
1990; Havarstein L. S. et al., J. Gen. Virology 71, 299–308, 1990;
Dobos et al., 1995, supra; 1–3 hierin und SEQ ID No.'s 1–7). Die
im VP5 Gen eingeführte
Mutation ist derart, dass sie die Expression des Polyproteins nicht
verhindert. SEQ ID No. 1 umfasst die vollständige (full length) cDNA Nukleotidsequenz
des Segmentes B des IBDV Stammes P2 sowie die durch das Segment
B kodierte Aminosäurensequenz
des VP1 Proteins (siehe auch SEQ ID No. 2). SEQ ID No. 3 und 5 illustrieren
die vollständige (full
length) cDNA Nukleotidsequenz des Segmentes A des IBDV Stammes D78
sowie die kodierende Region des VP5 Proteins beziehungsweise des
Polyproteins. SED ID No. 3 und 4 zeigen ebenfalls die Aminosäurensequenz
des D78 VP5 Proteins. SED ID No. 5 und 6 zeigen die Aminosäurensequenz
des Polyproteins VP2-VP4-VP3 von D78. SED ID No. 7 zeigt das 5'-Ende des Segmentes
A des Stammes D78, einschliesslich der in der VP5 kodierenden Region
eingeführten
Mutationen. SED ID No. 8 zeigt die Nukleotidsequenz des Segmentes
B des Stammes D78 und die Aminosäurensequenz
des D78 VP1 Proteins. Die genomische Organisation beider Segmente
ist ebenso in 1 dargestellt.
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Der für VP5 kodierende ORF ist in
allen bis jetzt publizierten Segment A Sequenzen erhalten. Der IBDV
ORF kodiert 145 Aminosäuren,
was zu einer berechneten Molekularmasse von 16.5 kDA führt. Die
Nukleotidsequenz des ORF, der das VP5 Protein des hierin verwendeten
IBDV Stammes D78 kodiert, ist in SEQ ID No. 3 und 4 wiedergegeben.
Natürliche
Variationen können
zwischen den individuellen IBDV Isolaten bestehen. Diese natürlichen
Variationen entstehen aus geringfügigen Unterschieden in den
Genomen dieser Viren. Die Nukleotidsequenz des Segmentes A, einschliesslich
der Nukleotidsequenz des VP5 Gens wurde für viele IBDV Isolate im Stand
der Technik beschrieben (Vakharia et al., Avian Diseases 36, 736–742, 1992;
Bayliss et al., J. Gen. Virol. 71, 1303–1314, 1990; Hudson et al.,
Nucl. Acid Res. 14, 5001–5012,
1986; Schnitzler et al., J. Gen. Virol. 47, 1563– 1571, 1993; Kibenge et al.,
J. Gen. Virol. 71, 569–577,
1990 und Virology 184, 437–440,
1992; Mundt et al, Virology 209, 10–18, 1995; Lana et al, Virus
Genes 6, 247–259,
1992; Vakharia et al., Virus Res. 31, 265–273, 1994; Brown et al., Virus
Res. 40, 1–15,
1996). Die Aminosäurensequenz
des VP5 Proteins der Serotyp I IBDV Stämme weisen eine Homologie von
mindestens 95% mit der in SEQ ID No. 3 und 4 gezeigten VP5 Aminosäurensequenz,
während
die Homologie zwischen der Serotyp II VP5 Sequenz und und der in
SEQ ID No. 3 und 4 gezeigten VP5 Aminosäurensequenz mindestens 75 beträgt. Demzufolge ist
eine bevorzugte IBDV Mutante gemäss
der vorliegenden Erfindung eine IBDV Mutante, worin die Mutation im
VP5 Gen eingeführt
ist mit einer Homologie auf der Stufe der Aminosäurensequenz von mindestens
75%, insbesondere mindestens 95% mit der hierin gezeigten VP5 Aminosäurensequenz.
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Vorzugsweise wird eine IBDV Mutante
gemäss
der vorliegenden Erfindung von jeglichen der klassischen oder Varianten
(z. Bsp. Variante E oder GLS) IBDV Impfstoffstämme hergeleitet, wie zum Beispiel
diejenigen die gegenwärtig
im Einsatz verwendet werden. Solche geeigneten IBDV Stämme umfassen
die in den kommerziell erhältlichen
Impfstoffene D78, PBG 98, LZ 228E, 89-03 (Intervet nternational
B. V.), Bursine 2 (Fort Dodge Animal Heath und 5706 (Rhône Mérieux)
vorhandenen IBDV Impfstoffstämme.
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Eine besonders bevorzugte IBDV Mutante
gemäss
der Erfindung wird vom D78 Stamm umfassend ein VP5 Gen, das ein
Protein mit einer wie in SEQ ID No. 3 und 4 gezeigten Aminosäurensequenz
kodiert, hergeleitet.
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Als Alternative ist der Eltern Birnavirusstamm
für die
Virusmutante gemäss
der Erfindung ein virulenter Birnavirus Feldstamm. Es wurde hierin
festgestellt, dass das VP5 Protein ein mit der Virulenz assoziierter
Faktor ist und dass die Abwesenheit des nativen VP5 Proteins in
einem Birnavirus zu einer abgeschwächten Form des Virus führt.
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Die Erfindung stellt vorzugsweise
eine Birnavirus Mutante bereit, die als Folge einer Mutation in
dem Teil des VP5 Gens, der nicht mit dem grossen, das Polyprotein
kodierenden ORF überlappt,
unfähig
ist, ein natives VP5 Protein zu produzieren.
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Insbesondere umfasst die Birnavirus
Mutante gemäss
der Erfindung eine Mutation im 5'-Ende
des VP5 Gens umfassend die Nukleotide 1–30, vorzugsweise 1–20, noch
mehr bevorzugt 1–10.
Am meisten bevorzugt ist eine Birnavirus Mutante mit einer Mutation
in den Nukleotiden 1–3
des VP5 Gens.
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Unter einer Mutation versteht man
eine Änderung
der genetischen Information im VP5 Gen in Bezug auf die genetische
Information, die in dieser Region des Genoms eines natürlich vorkommenden
Birnavirus-produzierenden, nativen VP5 Proteins vorhanden ist. Die
Mutation ist zum Beispiel eine Nukleinsäuren Substitution, Deletion,
Insertion oder Inversion, oder eine Kombination davon.
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In einer bevorzugten Variante der
vorliegenden Erfindung wird eine Birnavirus Mutante bereitgestellt, worin
die Mutation eine Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden
ist. Insbesondere wird eine Nukleinsäurensubstitution im Startcodon
eingeführt,
infolgedessen das neue Codon eine von Methionin unterschiedliche
Aminosäure
kodiert oder ein Stopcodon darstellt, vorzugsweise umfasst die Nukleinsäurensubstitution mindestens
zwei der Nukleinsäuren
des Startcodons.
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Eine weitere Birnavirus Mutante gemäss der Erfindung
umfasst eine Substitution eines oder mehrerer Nukleotide in einem
vom Startcodon unterschiedlichen Codon(s), was zu einem oder mehreren
Stopcodons führt,
vorzugsweise im 5'-Ende
des VP5 Gens wie hierin zuvor definiert, falls erwünscht zusätzlich zu
einer wie hierin zuvor beschriebenen Substitution im Startcodon.
Vorzugsweise umfasst die Birnavirus Mutantein dieser Region des
VP5 Gens ein Stopcocon in jedem der drei Leserahmen.
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Solch eine bevorzugte Birnavirus
Mutante kann eine IBDV Mutante mit einer Mutation im Startcodon, dem
vierten und dem sechsten Codon des VP5 Gens sein, was vorzugsweise
zu den in SEQ ID No. 7 und 3 dargestellten,
mutierten Codons führt.
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Als Alternative wird eine Birnavirus
Mutante bereitgestellt, worin die Mutation eine Deletion darstellt. Die
Deletion umfasst insbesondere weniger als 20, weniger als 10 oder
weniger als 5 Nukleotide. Die Deletion umfasst vorzugsweise eine
Gesamtzahl an Nukleotiden, die nicht durch drei teilbar ist, was
zu einer Verschiebung des Leserahmens führt.
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Die Deletion umfasst vorzugsweise
ein oder mehrere Nukleotide des Startcodons des VP5 Gens.
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In einer alternativen Variante der
vorliegenden Erfindung wird eine Birnavirus Mutante bereitgestellt, worin
die Mutation die Insertion einer heterologen Nukleinsäurensequenz
in das Birnavirus Genom umfasst. Eine heterologe Nukleinsäuresequenz
ist eine Nukleinsäurensequenz,
die normalerweise an der spezifischen Insertionsstelle der bestimmten
Virusart nicht vorhanden ist.
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Die heterologe Nukleinsäuresequenz,
die in das Birnavirus Genom eingeführt wird, ist ein Nukleinsäurenfragment,
das entweder ein Polypeptid kodiert oder eine nicht-kodierende Sequenz
darstellt. Das Nukleinsäurenfragment
kann von jeglicher Quelle hergeleitet werden, z. Bsp. viraler, eukaryotischer,
prokaryotischer oder synthetischer, einschliesslich Oligonukleotide,
die für
eine Unterbrechung der Expression des VP5 Gens geeignet sind.
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Ein geeignetes Oligonukleotid für die Unterbrechung
der VP5 Expression kann drei translatorische Stopcodons in jedem
der drei möglichen
Leserahmen in beiden Richtungen umfassen, zusätzlich zu einer oder mehrere
Spaltungsstellen für
Restriktionsenzyme, die für
die Insertion einer zweiten heterologen Nukleinsäurensequenz nützlich sind.
Die Länge
und Nukleotidsequenz solch einer nicht-kodierenden heterologen Nukleinsäurensequenz
ist nicht kritisch, bewegt sich jedoch vorzugsweise zwischen 8– 50 Nukleotiden.
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In einer weiteren Variante der vorliegenden
Erfindung wird eine Birnavirus Mutante bereitgestellt, die nicht
nur zur Herstellung eines Impfstoffes gegen eine Infektion durch
ein spezifisches Birnavirus verwendet werden kann, sondern auch
gegen andere Infektionskrankheiten in Geflügel oder Fisch. Zum Beispiel
bietet ein auf solch einer IBDV Mutante basierender Vektorimpfstoff
die Möglichkeit
einer Immunisierung gegen andere Geflügel Pathogene mittels Expression
von Antigenen dieser Geflügel
Pathogene innerhalb der infizierten Zellen des immunisierten Wirts.
Solch ein IBDV Vektor gemäss
der vorliegenden Erfindung kann durch Insertion einer heterologen
Nukleinsäurensequenz
erhalten werden, wobei die heterolge Nukleinsäurensequenz ein Polypeptid
kodiert, das heterolog zu dem hierin definierten IBDV im VP5 Gen
ist.
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Die heterologe Nukleinsäurensequenz
kann ein Antigen eines Geflügel
Pathogens, wie zum Beispiel des Newcastle Disease Virus, des Infektiösen Bronchitisvirus,
des Marek'schen
Krankheits Virus, des Encephalomyelitis Virus, des Geflügel Reovirus,
des Geflügel
Influenzavirus, des Hühner
Anämievirus,
Salmonella spp., E. coli und Eimeria spp kodieren.
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Ferner umfasst eine IBDV Mutante
gemäss
der vorliegenden Erfindung zusätzlich
zur Mutation im VP5 Gen eine Mutation im VP2 Gen, wobei dieses Gen
ein chimäres
Protein umfassend neutra lisierende Epitope von mehr als einem antigenen
Typ von IBDV (z. Bsp. Klassisch, Variant-E und/oder GLS) exprimiert.
Solch eine Mutante umfasst vorzugsweise die relevanten, schützenden
VP2 Epitope einer Variante des GLS Stammes und des klassischen Stammes.
Insbesondere stellt das mutierte VP2 Gen ein GL2 VP2 Gen dar umfassend
ein Nukleinsäurensequenzfragment,
das das B69 Epitop kodiert. Die Konstruktion von solchen mutierten VP2
Genen ist in Snyder et al., Avian Diseases 38, 701–707, 1994
beschrieben.
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Ferner können Nukleinsäurensequenzen,
die Polypeptide für
pharmazeutische oder diagnostische Anwendungen kodieren, insbesondere
Immunomodulatoren, wie zum Beispiel Lymphokine, Interferone oder Cytokine,
in das VP5 Gen eingebaut werden. Die heterologe Nukleinsäurensequenz
kann ebenso einen sortierbaren Marker kodieren, wie zum Beispiel
E. coli β-Galactosidase
oder E. coli β-Glucoronidase.
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Die Konstruktion von Birnavirus Mutanten,
insbesondere IBDV Mutanten gemäss
der vorliegenden Erfindung kann mittels des kürzlich erstellten infektiösen cRNA
Systems für
IBDV (Mundt und Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131–11136,
1996) erzielt werden. Dieses Reverse Genetics-System bietet die
Möglichkeit
Mutationen in das RNA Genom des IBD Virus, insbesondere in das VP5
Gen, einzuführen.
Der wichtigste Schritt im Reverse Genetics-System stellt die Bereitstellung
von vollständigen
(full length) cDNA Klonen der Segmente A und B des IBD Virus dar.
cDNA Konstrukte umfassend das Segment A oder B, einschliesslich der
Nukleotide der 5'-
und 3'-Enden beider
dieser Segmente, können
gemäss
der von Mundt und Vakharia beschriebenen Methode (1996, supra) erzeugt
werden. Zusätzlich
umfassen diese Konstrukte einen RNA Polymerase Promotor, der funktionell
mit einem der beiden Segmente verbunden ist. Der Promotor kann den
Promotor für
die T7, SP6 oder T3 Polymerase darstellen, wobei der T7 Promotor
bevorzugt ist. Die Mutationen können
in das VP5 Gen mittels Verfahren eingeführt werden, die zu diesem Zweck
in Fachkreisen im allgemeinen bekannt sind. Insbesondere werden
die Mutation(en) mittels ortsspezifischer Mutagenese eingeführt.
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Zum Beispiel wird in einem ersten
Schritt ein cDNA Fragment bereitgestellt, das mindestens einen wesentlichen
Teil des VP5 Gens umfasst. Im nächsten
Schritt werden geeignete Primerpaare konstruiert und mit dem die
VP5 Sequenz enthaltenden Fragment hybridisiert. Der 5'-Primer umfasst zusätzlich zu
Sequenzen, die zur VP5 Sequenz komplementär sind, Nukleotide, die die
gewünschte
Mutation beherbergen, z. Bsp. eine Mutation, die das ATG Startcodon
in ein AGG (Arginin) Codon umwandelt. Zudem wird der 5'-Primer mit einer upstream
Nukleotidsequenz bereitgestellt, die eine geeignete Restriktionsenzymspaltungsstelle
darstellt, welche eine Wiederherstellung der gesamten nicht-kodierenden Sequenz
am 5'-Ende ermöglicht.
Anschliessend wird das neue mutierte Fragment mittels PCR amplifiziert
und das neue Fragment wird durch Ersetzen der nativen Nukleinsäuresequenz
mittels geeigneter Restriktionsenzyme in die Anfangssequenz eingeführt. Im nächsten Schritt
werden plus sense Transkripte des Segements A und B in vitro mittels
(T7) RNA Polymerase hergestellt, wonach die synthetischen Transkripte
mittels konventioneller RNA-Reinigungsmethoden gereinigt werden.
Die rekombinante IBDV Mutante gemäss der Erfindung wird nach
Transfektion der geeigneten Zellen (z. Bsp. VERO Zellen, QM-7 Zellen
oder CEC Zellen) mit den synthetischen RNA Transkripten beider Segmente
des IBDV Genoms erhalten, falls erwünscht in Gegenwart von Transkriptions-fördernden
Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Lipofectin. Schlussendlich wird
das rekombinante IBDV vom Überstand
der transformierten Zellen geerntet.
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Verfahren zur Einführung einer
Mutation in das Birnavirusgenom werden hierin beschrieben, werden jedoch
ebenso generell in Fachkreisen verwendet (Mundt and Vakharia, 1996,
supra; Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F. M. Ausubel
et al., Wiley N. Y., 1995 Edition, Seiten 8.5.1.–8.5.9.).
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Zusätzlich zum unerwarteten Befund
der derzeitigen Erfinder, dass der VP5 ORF von IBDV eine nicht-wesentliche
Region des IBDV-Genoms ist, wurde ebenfalls festgestellt, dass eine
IBDV Mutante der vorliegenden Erfindung fähig ist, eine schützende Immunantwort
zu induzieren, d. h. Tiere, die mit einem Impfstoff umfassend die
IBDV Mutante immunisiert sind, sind gegen einen virulenten Challenge
geschützt.
Zudem wurde festgestellt, dass Antiseren von mit natürlich vorkommendem
IBDV infizierten Tieren gegen das nicht-strukturelle VP5 Protein
gerichtete Antikörper
umfassen und dass diese Antiseren von Antiseren, die von mit einer IBDV
Mutante gemäss
der Erfindung infizierten Tieren hergeleitet sind, unterschieden
werden können.
Zusätzlich
wurde festgestellt, dass die hierin zuvor beschriebene IBDV Mutante
verglichen mit dem Eltern IBD Virus, das fähig ist, das native VP5 Protein
zu produzieren, abgeschwächt
ist.
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Demzufolge betrifft ein anderer Aspekt
dieser Erfindung einen Impfstoff zur Verwendung beim Schutz von
Tieren gegen eine Birnavirus Infektion umfassend die wie hierin
zuvor charkterisierte Birnavirus Mutante zusammen mit einem pharmazeutisch
verträglichen
Träger
oder Verdünnungsmittel.
Insbesondere ist der Impfstoff gemäss der Erfindung ein Impfstoff
zur Verwendung beim Schutz von Gerflügel gegen infektiöse Bursitis
umfassend die wie hierin zuvor beschriebene IBDV Mutante.
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Die Birnavirus Mutante gemäss der vorliegenden
Erfindung kann als Lebendvirus oder inaktiviertes Virus in den Impfstoff
eingebaut werden.
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Ein Impfstoff gemäss der Erfindung kann mittels
konventioneller, wie zum Beispiel die für die kommerziell erhältlichen
Lebend- und inaktivierten IBDV Impfstoff gebräuchlich verwendeten, Methoden
hergestellt werden. In Kurzform, ein empfängli ches Substrat wird mit
einer IBDV Mutante gemäss
der Erfindung inokuliert und propagiert bis sich das Virus zu einem
gewünschten
infektiösen
Titer repliziert hat, wonach das IBDV-enthaltende Material geerntet wird.
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Jedes Substrat, das zu einer Unterstützung der
Replikation von IBD Viren fähig
ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschliesslich
primäre
(Geflügel)
Zellkulturen, wie zum Beispiel Hühnerembryo
Fibroblasten (chicken embryo fibroblast cells, CEF) oder Hühnernierenzellen
(chicken kideny cells, CK), Säugetier-Zelllinien,
wie zum Beispiel die VERO Zelllinie oder die BGM-70 Zelllinie, oder
Geflügel
Zelllinien wie zum Beispiel QT-35, QM-7 oder LMH. Normalerweise
wird das Virus nach Inokulation der Zellen für 3–10 Tage propagiert, wonach
der Zellkultur-Überstand
geerntet wird und falls erwünscht
filtriert oder zentrifugiert wird um Zelltrümmer zu entfernen.
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Als Alternative wird die IBDV Mutante
in embryonierten Hühnereiern
propagiert. Insbesondere stellt das Substrat auf welchem diese IBD
Viren propagiert werden, SPF embryonierte Eier dar. Embryonierte
Eier können
zum Beispiel mit einer 0.2 ml IBV Mutante enthaltenden Suspension
oder Homogenat, die mindestens 102 TCID50 pro Ei umfassen, inokuliert werden und
anschliessend bei 37°C
inkubiert werden. Nach ungefähr 2–5 Tagen
kann das IBD Virusprodukt durch Sammeln der Embryonen und/oder der
Membranen und/oder der Allantoisflüssigkeit geerntet werden, gefolgt
von entsprechender Homogenisation dieses Materials. Das Homogenat
kann danach für
10 Minuten bei 2500 × g
zentrifugiert werden, gefolgt von Filtration des Überstandes über einen
Filter (100 μm).
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Der den Lebendvirus enthaltenden
Impfstoff gemäss
der Erfindung kann in Form einer Suspension oder in lyophilisierter
Form hergestellt und vertrieben werden und enthält zusätzlich einen für solche
Zusammensetzungen gebräuchlich
verwendeten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel. Träger umfassen
Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Puffer. Geeignete Stabilisatoren
sind zum Beispiel SPGA, Carbohydrate (wie zum Beispiel Sorbitol,
Mannitol, Stärke,
Sukrose, Dextran, Glutamat oder Glukose), Proteine (wie zum Beispiel
getrocknetes Milchserum, Albumin oder Casein) oder Abbauprodukte
davon. Geeignete Puffer sind zum Beispiel Alaklimetallphosphate.
Geeignete Konservierungsmittel sind Thimerosal, Merthiolat und Gentamycin.
Verdünnungsmittel
schliessen Wasser, wässrige
Puffer (wie zum Beispiel gepufferte Salzlösung), Alkohole und Polyole
(wie zum Beispiel Glycerol) ein.
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Falls erwünscht können die Lebendimpfstoffe gemäss der Erfindung
ein Adjuvans enthalten. Beispiele solcher geeigneter Verbindungen
und Zusammensetzungen mit Adjuvansaktivität sind dieselben wie hiernach erwähnt.
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Obwohl eine Verabreichung mittels
Injektion des Lebendimpfstoffs gemäss der vorliegenden Erfindung möglich ist,
z. Bsp. intramuskulär,
subkutan, wird der Impfstoff vorzugsweise mittels der für eine IBDV
Impfung gebräuchlich
verwendeten, günstigen
Massenanwendungsverfahren. Für
eine IBDV Impfung schliessen diese Verfahren Trinkwasser und Sprayimpfung
ein.
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Alternative Verfahren zur Verabreichung
des Lebendimpfstoffs umfassen eine Verabreichung in ovo, mittels
Augentropfen und Schnabeltauchen.
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In einem weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung wird ein Impfstoff bereitgestellt, der eine Birnavirus
Mutante in einer inaktivierten Form umfasst. Der bedeutendste Nachteil
eines inaktivierten Impfstoffs sind die extrem hohen Spiegel an
schützenden
Antikörpern
von langer Dauer, die erzeugt werden können.
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Das Ziel der Inaktivierung der nach
dem Propagationsschritt geernteten Viren ist es, die Reproduktion der
Viren zu eliminieren. Im allgemeinen kann dies mittels chemischer
oder physikalischer Mittel erreicht werden. Eine chemische Inaktivierung kann
durch Behandlung der Viren mit zum Beispiel Enzymen, Formaldehyd, β-Propiolacton,
Ethylenimin oder einem Derivat davon bewirkt werden. Falls notwendig
wird die inaktivierende Verbindung danach neutralisiert. Mit Formaldehyd
inaktiviertes Material kann zum Beispiel mit Thiosulphat neutralisiert
werden. Eine physikalische Inaktivierung kann vorzugsweise durch
Aussetzen der Viren einer energiereichen Strahlung durchgeführt werden,
wie zum Beispiel UV Licht oder γ-Strahlen.
Falls erwünscht,
kann der pH nach der Behandlung auf einen Wert von ungefähr 7 eingestellt
werden.
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Ein Impfstoff, der die inaktivierte
Birnavirus Mutante enthält,
kann zum Beispiel einen oder mehrere der hierin zuvor erwähnten, für diesen
Zweck geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel
umfassen.
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Vorzugsweise umfasst ein inaktivierter
Impfstoff gemäss
der Erfindung eine oder mehrere Verbindungen mit Adjuvansaktivität. Für diesen
Zweck geeignete Verbindungen oder Zusammensetzungen schliessen Aluminiumhydroxid,
-phosphat oder -oxid, eine Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl Emulsion,
die zum Beispiel auf einem Mineralöl, wie zum Beispiel Bayol F® oder
Marcol 52®,
oder einem pflanzlichen Öl,
wie zum Beispiel Vitamin E Acetat, und Saponine ein.
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Der Impfstoff gemäss der Erfindung umfasst eine
wirksame Dosis der Birnavirus Mutante als aktive Komponente, d.
h. eine Menge an immunisierendem Birnavirus Material, das in den
geimpften Vögeln
Immunität
gegen einen Challenge durch ein virulentes Virus induziert. Immunität wird hierin
als Induktion eines bedeutend höheren
Grades an Schutz in einer Vogelpopulation nach Impfung verglichen
mit einer ungeimpften Gruppe definiert.
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Typischerweise kann der Lebendimpfstoff
gemäss
der Erfindung in einer Dosis von 102–109 TCID50 infektiösen Dosis
(TCID50) pro Tier verabreicht werden, vorzugsweise
in einer Dosis, die sich zwischen 105.0–107.0 TCID50 bewegt,
und ein inaktivierter Impfstoff kann das antigene Äquivalent
von 105–109 TCID50 pro Tier
enthalten.
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Inaktivierte Impfstoffe werden normalerweise
parenteral verabreicht, z. Bsp. intramuskulär oder subkutan.
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Obwohl der IBDV Impfstoff gemäss der vorliegenden
Erfindung wirksam in Hühnern
verwendet werden kann, kann anderes Geflügel, wie zum Beispiel Truthähne, Perlhühner und
Rebhühner,
ebenso mit dem Impfstoff erfolgreich geimpft werden. Hühner umfassen
Masthühner,
Zuchttiere sowie Legetiere.
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Das Alter der Tiere, die einen Lebend-
oder inaktivierten Impstoff gemäss
der Erfindung erhalten, ist dasselbe wie das der Tiere, die konventionelle
Lebend- oder inaktivierte IBDV Impfstoffe erhalten. Zum Beispiel
können
Masthühner
(frei von mütterlich
hergeleiteten Antikörper-MDA)
in einem Alter von einem Tag geimpft werden, während Masthühner mit hohem Spiegel an MDA
vorzugsweise in einem Alter von 2–3 Wochen geimpft werden. Legetiere
oder Zuchttiere mit niedrigem Spiegel an MDA können in einem Alter von 1–10 Tagen
geimpft werden, gefolgt von Boosterimpfungen mit inaktiviertem Impfstoff
in einem Alter von 6–8
und 16–20
Wochen.
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Die Erfindung umfasst ebenfalls Kombinationsimpfstoffe,
die zusätzlich
zu der IBDV oder IPNV Mutante gemäss der Erfindung ein oder mehrere
Immunogene umfassen, die von anderen für Geflügel beziehungsweise Fisch infektiöse Immunogene
hergeleitet sind.
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Der Kombinationsimpfstoff umfasst
vorzugsweise zusätzlich
ein oder mehrere Impfstoff-Stämme
des Infektiösen
Bursitis Virus (IBV), Newcastle Disease Virus (NDV), Egg Drop Syndrom
(EDS) Virus, Puten Rhinotracheitis Virus (TRTV) oder Reovirus.
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Zusätzlich zu einem Markerimpfstoff
für Birnaviren
ist die Verfügbarkeit
eines geeigneten, diagnostischen Tests eine notwendige Voraussetzung
für eine
Anwendung eines Kontrollprogramms zur Ausrottung von Birnaviren.
Solch ein diagnostischer Test wird hierin bereitgestellt und umfasst
ein Verfahren zur Bestimmung einer IBDV Infektion in Geflügel und
IPNV Infektion in Fisch, d. h. es wird ein Verfahren bereitgestellt,
um ein mit einem hierin zuvor beschriebenen Impfstoff geimpftes
Tier im Feld von einem mit einem natürlich vorkommenden IBDV oder
IPNV infizierten Tier zu unterscheiden.
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Demzufolge stellt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Birnavirus Infektion
bereit, insbesondere zum Nachweis einer IBDV Infektion in einem
Tier umfassend den Schritt der Überprüfung einer
Probe des Tiers für
das Vorhandensein von VP5 Antikörpern
oder Antigenen. Das Tier ist ein Tier vom Einsatzort und ist insbesondere
eine Vogelart, vorzugsweise ein Huhn. Die vom Tier stammende Probe
kann jegliche Probe sein, in der IBDV Antikörper oder Antigene vorhanden
sind, z. Bsp. Blut, Serum oder eine Gewebeprobe, wobei die Serumprobe
bevorzugt wird.
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Eine bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung
einer Birnavirus Infektion in einem Tier ist ein Verfahren zum Nachweis
von Antikörpern
gegen das VP5 Protein, umfassend die Schritte:
- (i)
Inkubieren einer unter Verdacht stehenden Probe Anti-Birnavirus
Antikörper
zu enthalten mit VP5 Antigen,
- (ii) Bildung eines Antikörper-Antigen
Komplexes, und
- (iii) Nachweis des Vorhandenseins des Antikörper-Antigen Komplexes.
-
Das Design dieses Immunoassays kann
unterschiedlich sein. Zum Beispiel kann der Immunoassay auf Kompetition
oder direkter Reaktion basieren. Zudem können die Protokolle feste Träger verwenden
oder können
Zellmaterial verwenden. Der Nachweis des Antikörper-Antigen Komplexes kann
den Gebrauch von markierten Antikörpern enthalten; die Label
können
zum Beispiel Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszierende, radioaktive
oder Farbstoffmoleküle
darstellen.
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Geeignete Verfahren zum Nachweis
der VP5 Antikörper
in der Probe umfassen den Enzym-gekoppelten Immunosorbent Assay
(ELISA), Immunofluoreszenztest (IFT) und Western Blot Analyse.
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In einem exemplifizierten ELISA sind
die Vertiefungen einer Polystyrol Mikrotitrationsplatte mit VP5 Antigen
beschichtet. Als nächstes
werden die Vertiefungen der beschichteten Platten mit Hühnreserum
gefüllt und
Verdünnungreihen
werden durchgeführt.
Nach der Inkubation werden Hühner
anti-VP5 Protein Serumantikörper
bestimmt mittels Nachweis von Antikörper (monoklonale oder polyklonale)
mit derselben Spezifizität wie
der Beschichtete, wobei dieser jedoch markiert ist (z. Bsp. mit
Biotin). Der markierte Antikörper
wird die freien Antigene, die nicht durch anti-VP5 Antikörper im
Hühnreserum
okkupiert wurden, okkupieren. Zum Beispiel kann an Avidin gekoppelte
Meerrettichperoxidase hinzugegeben werden und die Menge an Peroxidase kann
mittels einer enzymatischen Reaktion gemessen werden. Falls keine
Antikörper
gegen VP5 in der Hühnerserumprobe
vorhanden sind dann wird eine maximale Absorption erhalten. Andrerseits
kann nach der Inkubation mit Hühnerserum
die im Serum vorhandene Menge an Antikörper, die an das VP5 Antigen
banden direkt unter Verwendung eines Anti-Hühner Konjugats gefolgt von
einer enzymatischen Reaktion bestimmt werden.
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In einem Sandwich ELISA können die
Vertiefungen einer Polystyrol Mikrotitrationsplatte mit einem gegen
das VP5 Protein gerichteten, monoklonalen Antikörper beschichtet werden. Als
nächstes
werden die Vertiefungen dieser beschichteten Platten mit VP5 Antigen
inkubiert. Nachdem das Antigen gebunden wurde werden die Vertiefungen
mit dem Hühnreserum
gefüllt
und Verdünnungsreihen
werden durchgeführt.
Anschliessend kann das wie hierin zuvor beschriebene Protokoll befolgt
werden. Dieser Test kann ebenso unter Verwendung von polyklonalem
Serum gegen VP5 anstatt der beschichteten monoklonalen Antikörper durchgeführt werden.
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In einem anderen diagnostischen Test
(Western Blot Analyse) wird das VP5 Antigen (enthaltende) Material
einer SDS-PAGE unterzogen. Als nächstes
werden die aufgetrennten Proteine mittels Elektroblot auf Nitro-Zellulose
Membranen aufgebracht. Danach können
die Membranen in Bahnen geschnitten werden und die Bahnen werden
mit dem Hühnerserum
inkubiert. Das Vorhandensein von VP5 Antikörper in der Probe kann durch
Untersuchen ob Antikörper
an das VP5 Protein banden bestimmt werden, zum Beispiel unter Verwendung
eines Anti-Hühner
Konjugates gefolgt von einer enzymatischen Reaktion. Falls Antikörper gegen
VP5 vorhanden sind, dann ist eine Bande von ungefähr 17 kDa
identifizierbar.
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Das VP5 Antigen kann jegliches VP5
Protein (Fragment)-umfassende
Material sein, das die Bildung des VP5 Antigen-VP5 Antikörper Komplexes
zulässt.
Vorzugsweise umfasst das VP5 Antigen das Expressionsprodukt einer
gängigen
rekombinanten Wirtszelle oder Virus, z. Bsp. wie durch E. coli exprimiertes
VP5 (Munst et al., J. Gen. Virol. 76, 437–443, 1995) oder Baculovirus
exprimiertes Protein (Vakharia et al., Vaccine 12, 452–456, 1994;
Vakharia et al., J. Gen. Virol. 74, 1201–1206, 1993), In einer weiteren
Variante der vorliegenden Erfindung wird ein diagnostisches Kit
bereitgestellt, das zur Durchführung
des diagnostischen Tests gemäss
der Erfindung wie hierin zuvor beschrieben geeignet ist.
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Insbesondere wird ein diagnostischens
Kit bereitgestellt, das zusätzlich
zu den im allgemeinen vorhandenen Komponenten das VP5 Antigen (falls
erwünscht
beschichtet auf einer Festplatte) als das immunologische Reagens
umfasst. Andere normalerweise in solch einem Testkit vorhandenen
Komponenten umfassen Biotin oder Meerrettichperoxidase konjugierte
Antikörper,
ein Enzymsubstrat, Waschpuffer, etc.
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Um das Birnavirus VP5 Antigen in
einer Messprobe eines Tie res im Feld zu bestimmen werden VP5-spezifische
Antikörper
als das immunologische Reagens, vorzugsweise fixiert auf einer Festphase,
verwendet. Die Messprobe wird hinzugegeben und nach einer Inkubationszeit
um die Bildung eines Antikörper-Antigen
Komplexes zu gewähren,
kann ein zweiter markierter Antikörper hinzugegeben werden, um
den Komplex nachzuweisen.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Konstruktion und Analyse
eines rekombinanten VP5–IBD Virus
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Konstruktion eines vollständigen (full
length) VP5– Klons
des IBDV Segmentes A.
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Um ein VP5 negatives IBDV zu konstruieren,
wurde die unmittelbar auf das 3'-Ende
der vollständigen (full
length) cDNA des Stamm D78 Segmentes A folgende EcoR1 Stelle gelöscht (pUC19FLAD78;
Mundt und Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131–11136,
1996). Ein EcoR1 – KpnI
Fragment, das die T7 Polymerase Bindungsstelle gefolgt von der kompletten
Segment A Sequenz enthält
wurde ausgeschnitten und in den EcoR1 – KpnI gespaltenen Vektor pUC18
eingefügt,
nach Inaktivierung der einzigartigen NdeI innerhalb der Vektorsequenz,
was zum Plasmid pAD78/EK führte.
Danach wurde die genomische Region, die das Initiationscodon für VP5 umfasste
in zwei Stücken
mithilfe der A1F5' und
VP5MutR Primer beziehungsweise VP5MutF und A2R Primer amplifiziert
(für Sequenz
und Lage der Primer siehe Tabelle 1). Die PCR Fragmente wurden separat
kloniert und wurden anschliessend via einer einzigartigen AflII
Stelle, die durch Mutationen innerhalb der entsprechenden Primer
hergestellt wurden, zusammengefügt
(siehe 2). Ein EcoR1 – NdeI Fragment,
das die T7 Polymerase Bindungsstelle und den 5'-Teil des Segmentes A einschliesslich
der eingeführten
Mutationen enthält,
wurde ausgeschnitten und dazu verwendet, das Wildtyp EcoR1 – NdeI Fragment in
pAD78/EK zu ersetzen, um das Plasmid pAD78/VP5– zu
ergeben. Von den drei eingeführten
Mutationen änderte
eine das Initiations Methionincodon für VP5 in ein Arginincodon (2).
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Tabelle
1: Sequenz der zur Herstellung der Mutantenkonstrukte verwendeten
Oligonukleotidprimer.
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Virus Wiedergewinnung von cRNA. Für die in
vitro Transkription der RNA Plasmide wurden pAD78/EK, pAD78/VP5– und
pBP2 (2) durch Spaltung
mit BrsGI beziehungsweise PstI linearisiert. Behandlung der linearisierten
DNA, Transkription und Reinigung der RNA sowie Transfektion wurden
wie von Mundt und Vahkharia (1996, supra) beschrieben durchgeführt, mit
Ausnahme, dass sekundäre
CEC für
die Transfektionsexperimente verwendet wurden. Drei Tage nach Transfektion
wurde ein CPE in CEC sichtbar. Die Zellen wurden gefroren/aufgetaut,
bei 700 × g
zentrifugiert um Zelltrümmer
zu entfernen und die erhaltenen Überstände wurden
durch 0.45 μm
Filter filtriert und bei –20°C aufbewahrt.
Für die
Transfektionsexperimente wurden vollständi ge (full length) cDNA Klone
des Segmentes A des Stammes D78, die fähig sind (pAD78/EK) zu exprimieren oder
unfähig
sind VP5 (pAD78/VP5–) exprimieren, in synthetische
RNA transkribiert und mit Segment B vollständiger (full length) cRNA in
CEC. Die erhaltene Virus Nachkommenschaft IBDV/EK und IBDV/VP5– wurde zusätzlich charakterisiert.
-
Analyse der
Transfektions-Nachkommenschaft mittels Immu nofluoreszenz und Radioimmunopräzipitations-Assay
(RIPA)
-
VP5 wurde wie in Mundt et al. (J.
Gen. Virol. 76, 437–443,
1995) in E. coli exprimiert. Hasen-monospezifisches polyklonales
Antiserum und Maus monoklonale Antikörper gegen VP5 wurden gemäss Standardprotokollen
hergestellt. Mit IBDV/VP5–, IBDV/EK infizierte
Vero Zellen beziehungsweise nicht-infizierte Zellen wurden mit Hasen
anti-IBDV Serum, Hasen anti-VP5 Serum und mit anti-VP5 mAb DIE 7
inkubiert und mit Fluorescein konjugierten, sekundären Antikörpern gefärbt. Beide
Antiseren und der monoklonale Antikörper erkannten die IBDV Antigene
im Cytoplasma der IBDV/EK infizierten Zellen. Im Gegenteil, während das
anti-IBDV Serum
einfach virale Antigene in IBDV/VP5– infizierten
Zellen nachwies, zeigten weder das monospezifische anti VP5-Serum
noch der monoklonale anti-VP5 Antikörper spezifische Reaktivität. Keine
dieser immunologischen Reagenzien reagierte mit den nicht-infizierten
Kontrollen.
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Um während der Replikation exprimierte
virale Proteine zu analysieren, wurden Lysate von radioaktiv markierten,
mit IBDV/VP5– (4, Bahnen 1–3) und IBDV/EK (4, Bahnen 4–6) infizierte Zellen mit Hasen anti-IBDV
Serum, Hasen anti-VP5 Serum und mAb DIE 7 immunopräzipiert.
Nicht-infizierte CEC wurden als Kontrolle verwendet (4, Bahnen 7–9). IBDV/EK (Bahn 4) sowie
IBDV/VP5– (Bahn
1) infizierte CEC zeigten nach Präzipitation mit Hasen anti-IBDV
Serum die viralen Proteine VP2, VP3 und VP4 auf. Das Hasen anti-VP5
Serum (Bahn 5) und mAb DIE 7 (Bahn 6) fällten VP5 mit einer Molekularmasse
von 21 kDa nur von IBDV/EK infizierten Zellen. Keine spezifische
Reaktivität
war in IBDV/VP5– infizierten CEC nach
Präzipitation mit
Hasen anti-VP5 (Bahn
2) sowie dem VP5 spezfischen mAb DIE 7 (Bahn 3) nachweisbar. Nicht-infizierte CEC
zeigten keine spezifische Reaktivität (Bahnen 7–9).
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Replikation von IBDV/VP5– in
CEC. Um die Replikation von IBDV/VP5–detaillierter
nachzuweisen, wurde die One-Step-Growth analysiert (5). Konfluente, sekundäre CEC wurden
mit IBDV/EK beziehungsweise IBDV/VP5– mit
1072 TCID50 infiziert.
Unmittelbar nach dem Überschichten
der infizierten Zellen mit 5 ml Wachstumsmedium wurde der Überstand
von einer infizierten CEC Gewebekulturplatte jedes Virus entfernt und
bei –20°C (0 h p.
i.) aufbewahrt. Die restlichen Gewebekulturplatten wurden weiter
inkubiert und 4 h, 8 h, 16 h, 24 h und 48 h p. i. wurden die Überstände entfernt
und bei –20 °C aufbewahrt.
Die Überstände wurden zentrifugiert
und gemäss
Standardmethoden titriert. Der TCID50 bei
verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion zeigte, dass das VP5
exprimierende Virus (IBDV/EK) sich schneller replizierte als die
Virusmutante ohne VP5 (IBDV/VP5–).
16 Std nach Infektion war IBDV/EK um das 100fache höher als
IBDV/VP5– ( 5). Bei 48 Std p. i. erreichte
IBDV/VP5– jedoch
einen Titer von 107.2 TCID50/ml,
der ähnlich
zu IBDV/EK war (107.45/ml).
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Herstellung von rekombinantem IBDV/VP5–-2.
Das Plasmid pAD78/VP5–-2 wurde mittels Verfahren, die
den oben beschriebenen ähnlich
waren, hergestellt. Die Nukleotidsequenz von Teil des mutierten
VP5 Gens ist in SEQ ID No. 7 und 3 dargestellt.
Ein die Mutationen beinhaltendes Restriktionsenzymfragment wurde
verwendet um das Wildtyp EcoR1-NdeI Fragment in pAD78/EK zu ersetzen.
Eine Übersicht
des Protokolls zur Herstellung des rekombinanten Plasmides ist in 3 dargestellt. Die Organisation
von pBD78 ist ebenfalls in 3 wiedergegeben.
Das rekombinante Virus wurde wie oben beschrieben hergestellt, mit Ausnahme
der Tatsache, dass das Segment B des Stammes D78 (SEQ ID No. 8)
verwendet wurde und QM-7 Zellen für das Transfektionsexperiment
verwendet wurden.
-
Beispiel 2
-
Identifizierung von VP5
Protein in verschiedenen IBDV Stämmen.
-
Verschiedene Stämme von IBDV wurden nach der
Expression des VP5-Gens untersucht. Dies wurde durch Verwendung
des Immunofluoreszenz Verfahrens (Immuno fluorescence technique,
IFT) bewerkstelligt. In Mikrotiterplatten gezogene Hühnerembryo
Fibroblasten wurden mit verschiedenen IBDV Stämmen infiziert. Drei bis 5
Tage nach Inkubation bei 37°C
wurden die Zellen mit 70% Ethanol fixiert und dann mit polyklonalem Hasen
anti IBDV Serum (R1928) beziehungsweise polyklonalem Hasen anti
VP5 Serum (RaVPS) oder monoklonalem, gegen VP5 gerichteten Antikörper (DIE7)
behandelt. Eine Bindung der poly- oder monoklonalen Antikörper an
die verschiedenen IBDV Stämme
wurde durch Verwendung eines Fluoreszenz-markierten Konjugates (Ziege-anti-Hase
oder Ziege-anti-Maus) visualisiert. Die Resultate sind in Tabelle
2 dargestellt.
-
Tabelle
2: Identifizierung von verschiedenen Sero- und Subtypen von IBDV
Stämmen.
Bestimmung des Vorhandenseins von VP5 Protein.
-
-
Von diesen Daten kann geschlossen
werden, dass die verschiedenen Stämme von IBDV, die zu verschiedenen
Sero- und Subtypen gehören,
das VP5-Gen exprimieren. Ferner kann der rekombinante VP5– IBDV
Impfstoffstamm von Feld- und Impstoffviren unterschieden werden,
was ermöglicht,
dass das rekombinante VP5– Virus als Markerimpfstoff
verwendet werden kann.
-
Beispiel 3
-
In vivo Testen der rekombinanten
VP5+ und VP5– IBDV
Imfstoffe im Vergleich mit einem kommerziell erhältlichen, lebenden IBDV Impfstoff.
-
Herstellung des IHDV Impfstoffes.
Primäre
Hühnerembryo
Fibroblasten (CEF) Zellen wurden in einer Konzentration von 2 × 106/ml hergestellt. Die Zellen wurden in Eagles
Minimum Essential Medium enthaltend 5% fötales Kälberserum kultiviert. Zu 25
ml dieser Zellsuspension wurde 0.1 ml IBDV/EK oder IBDV/VP5– Virus)
mit einem infektiösen
Titer von ungefähr
3.0 log10 TCID50/ml) hinzugegeben. Nach
Inkubation für
5 Tage in einem Hoch-Feuchtigkeits-Inkubator bei 37°C wurde die
gesamte Suspension in einem Tierexperiment ohne weitere Reinigung
verwendet. Der infektiöse
Titer des Überstandes
betrug 107.1 TCID50/ml.
-
Tierexperiment. In dieser Studie
wurde die Potenz verschiedener Impfstoffe (ein VP5 positiver Stamm IBDV/EK
und ein VP5 negativer Stamm IBDV/VP5
–,
und der kommerziell erhältliche IBDV
Impfstoff Nobilis Stamm D78, Intervet International B. V., NL) untersucht.
3 Wochen alte SPF Küken
wurden wie im Behandlungsplan angegeben behandelt. Behandlungsplan:
- VP5+
- Bursitis Impfung
mit VP5 positivem Impfstoffklon, Augentropfen Route, Dosis 104.6 TCID50/Tier,
0.1 ml/Tier
- VP5+
- Bursitis Impfung
mit VP5 negativem Impfstoffklon, Augentropfen Route, Dosis 105.9 TCID50/Tier,
0.1 ml/Tier
- D78
- Bursitis Impfung
mit IBDV IMPFSTOFF NOBILIS STAMM D78, Augentropfen Route, eine Felddosis.
- ch
- Challenge mit Bursitisvirus,
Farragher Stamm F52/70, Augentropfen Route, Dosis 102.0 TCID50/Tier, 0.1 ml/Tier.
- b1
- Serologische Untersuchung;
VN-Test und/oder Western Blotting.
- x
- Histologische Untersuchung
(H. E. Färbung)
und MCA-8 ELISA on bursae
- x1
- Histologische Untersuchung
(H. E. Färbung)
und MCA-8 ELISA on bursae und Reisolierung des Virus von der Bursa
Fabricii.
- +
- Klinische Untersuchung
und nach 10 Tagen histologische Untersuchung der Bursa.
-
Nachweis des Virus in
der Bursa Fabricii.
-
Drei, 7, 14 und 20 Tage nach der
Augentropfen-Impfung wurden die Tiere getötet und Blut und Bursa wurden
entnommen. Das Vorhandensein des Virus in der Bursa wurde mit einem
Enyzmverbundenen Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung des
monoklonalen Antikörpers
8 (MAB-8) bestimmt. MAB-8 ist spezifisch gegen IBDV gerichtet. Die
Daten sind in Tabelle 3 wiedergegeben.
-
Ferner wurden 3 und 7 Tage nach der
Impfung die Bursae der Tiere der Gruppe 2 auf das Vorhandensein
von rekombinantem VP5– Virus untersucht. Zu
diesem Zweck wurden die Bursae homogenisiert und auf Hühnerembryo
Fibroblasten kultiviert. Das Vorhandensein von VP5– Virus
wurde mittels IFT bestimmt unter Verwendung von polyklonalen Hasen
Seren gegen IBDV oder VP5 oder monoklonalen Antikörpern gegen VP5.
Von 13 der 15 untersuchten Bursae (87%) konnte VP5– Virus
reisoliert und identifiziert werden (positiv für R1928 und negativ für RαVP5 und DIE7).
Dies deutet darauf hin, dass das Virus nach einer Tierpassage nach wie
vor VP5– ist,
was darauf hinweist dass das Virus stabil ist und sich nicht in
VP5+ zurückwandelt.
Ferner kann das VP5– Impfstoffvirus durch
die Verwendung der verschiedenen poly- und monoklonalen Antikörper von allen
anderen Impfstoff und/oder Feld IBDV Viren unterschieden werden.
Demzufolge kann der VP5– Impfstoff als Markerimpfstoff
verwendet werden.
-
Drei Tage nach dem Challenge konnte
in den Gruppen 1, 2 und 3 kein Virus mittels MCA-8 ELISA nachgewiesen
werden. Im Gegensatz dazu enthielten alle Tiere der Gruppe 4 (nicht-geimpfte
Kontrollgruppe) das Challenge Virus in der Bursa Fabricii 3 Tage
nach dem Challenge. Die Resultate zeigen, dass die mit rekombinantem
VP5+ (Gruppe 1), rekombinantem VP5– (Gruppe
2) und IBDV Impfstoff Nobilis D78 (Gruppe 3) geimpften Tiere gegen
schweren Challenge geschützt
waren.
-
Tabelle
3: Individuelle Daten zum Nachweis von Virus in der Bursa Fabricii
mit MCA-8 ELISA an verschiedenen Tagen nach Impfung oder Challenge.
-
Nachweis von Läsionen in
der Bursa Fabricii.
-
Der mikroskopische, durchschnittliche
Läsionenwert
(microscopic average lesion score), die durch die verschiedenen
IBDV (rekombinanten) Impfstoffe oder das Challenge Virus induziert
wurden, ist in Tabelle 4 dargestellt.
-
Vor dem Challenge zeigten mit rekombinantem
VP5+ IBDV Impfstoff (Gruppe 1) geimpfte
oder mit IBDV Impfstoff Nobilis D78 (Gruppe 3) geimpfte Tiere milde
bis mässige
Läsionen
in der Bursa Fabricii, was darauf hindeutet dass die Tiere der Gruppen
1 und 3 gegen einen Challenge geschützt waren. Zudem wurden 10
Tage nach dem Challenge nur sehr milde Läsionen (0–20% Lymphozyten Depletion)
in der Bursa der mit VP5+ rekombinantem
IBDV Impfstoff oder mit dem Nobilis Impfstoff D78 geimpften Tiere
beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten nicht geimpfte Tiere 10 Tage
nach dem Challenge schwere Läsionen.
Mit anderen Worten, alle mit dem VP5+ rekombinanten
IBDV Impfstoff oder mit dem Nobilis Impfstoff D78 geimpften Tiere (100%)
der Gruppen 1 und 3 waren gegen einen schweren Challenge geschützt.
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Drei, 7, 14 und 20 Tage nach der
Impfung und 3 und 10 Tage nach dem Challenge mit dem rekombinanten
VP5– IBDV
Impfstoff zeigten die Tiere der Gruppe 2 keine oder kaum Läsionen (0–20% Lymphozyten Depletion)
in der Bursa. Alle mit dem VP5– rekombinanten IBDV
Impfstoff geimpften Tiere der Gruppe 2 waren gegen einen schweren
Challenge geschützt.
Bei einem Vergleich von rekombinanten VP5– IBDV
Impfstoff geimpften Tieren mit den Tieren der Gruppen 1 und 3 (mit
einem rekombinanten VP5+ oder kommerziell
erhältlichen
Impfstoff geimpft), induzierte der rekombinante VP5– Impfstoff
weniger Läsionen
und ist deshalb sicherer und milder als die in diesem Experiment
getesteten Impfstoffe.
-
Drei Tage nach dem Challenge zeigten
alle nicht geimpften Tiere der Gruppe 4 schwere, akute Läsionen in
der Bursa (vollständige
Lymphozyten Depletion, Wert 5.0). Zehn Tage nach dem Challenge zeigten
alle Tiere (17 von 17 Tieren) vollständige Lymphozyten Depletion,
was darauf hinwies dass diese Tiere gegen einen scheren Challenge
nicht geschützt
waren. Tiere, die nach dem Challenge starben, zeigten alle schwere Läsionen in
der Bursa Fabricii. Daraus wurde geschlossen, dass die Kontrollgruppe
4 gegen einen schweren Challenge nicht geschützt war, was darauf hinwies,
dass die Testbedingungen optimal waren.
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Tabelle
4: Durchschnittlicher Läsionenwert
in der Bursa an verschiedenen Tagen nach Impfung oder Challenge.
Der durchschittliche Läsionenwert
wird wiefolgt berechnet: alle Läsionenwerte
der Tiere pro Gruppe an einem bestimmten Tag werden zusammengezählt. Diese
Zahl wird dann durch die Gesamtzahl an untersuchten Tieren in dieser
Gruppe an diesem Tag geteilt. Individuelle Werte reichen von 1 bis
5. Wert 0 = keine Lymphozyten Depletion, Wert 1 = 0–20%; Wert
2 = 20–40%;
Wert 3 = 40– 60%;
Wert 4 = 60–80%;
und Wert 5 = 80–100%
Lymphozyten Depletion (vollständige
Lymphozyten Depletion).
-
Serologische Antwort.
-
Die serologische Antwort der Tiere
wurde in einem Virus Neutralisationstest (VN) durch Messen der Fähigkeit
von Blutserum, einen klassischen, infektiösen Bursitis Virusstamm zu
neutralisieren, bestimmt. Das Serum wurde 3, 7, 14 und 20 Tage nach
der Impfung untersucht. Die durchschnittlichen Neutralisationstiter sind
in Tabelle 5 aufgezeigt.
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Die Resultate zeigen, dass bei Hühnern der
Gruppe 1 angewandter, rekombinanter IBDV Impfstoff VP5+ 20
Tage nach der Impfung eine gute und hohe serologische Antwort induzierte,
die mit der serologischen Antwort von mit kommerziellem IBDV Impfstoff
Nobilis D78 (Gruppe 3) geimpften Hühnern vergleichbar ist. Der bei
Hühnern
der Gruppe 2 angewandte, rekombinante IBDV Impfstoff VP5– induzierte
ebenfalls eine gute serologische Antwort. Ein Titer von 9.4 log2
wurde 20 Tage nach der Impfung beobachtet. Die durch den rekombinanten
IBDV VP5– Impfstoff
induzierte, serologische Antwort war verglichen mit der durch den
rekombinanten IBDV VP5+ Impfstoff oder den
kommerziellen IBDV Impfstoff Nobilisstamm D78 induzierte, serologische Antwort
verzögert.
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Die nicht geimppfte Gruppe 4 zeigte
keinrlei serologische Antwort gegenüber IBDV.
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Tabelle
5: Durchschnittliche IBDV-VN Titer der Gruppen 1 bis 4 an verschiedenen
Tagen nach der Impfung, ausgedrückt
als log2 der Verdünnung.
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Serologische Differenzierung
zwischen Antiseren.
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Die serologische Antwort gegen VP5
wurde unter Verwendung von Western Blot Analyse untersucht. Zu diesem
Zweck wurde das VP5 Protein im E.coli oder Baculo Expressionssystem
exprimiert. Die exprimierten Protein wurden mittels SDS PAGE getrennt.
Als nächstes
wurden die Proteine mittels Elektroblot auf eine Nitrozellulosemembran
aufgebracht. Danach wurde die Membran in Bahnen geschnitten und
die Bahnen wurden mit Hasen anti-VP5 Serum, gegen VP5+ rekombinanten
Impfstoff gerichtetes Hühnerserum,
gegen VP5– rekombinanten
Impfstoff gerichtetes Hühnerserumoder
negatives Serum von SPF Hühnern
inkubiert. Die Daten sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Wie aus
Tabelle 6 ersichtlich ist, induziert das VP5– Serum
keine serologische Antwort gegen VP5. Im Gegensatz dazu erkennen
das Hasen anti-VP5 Serum und das gegen VP5+ rekombinanten
Impfstoff gerichtete Hühnerserum
das VP5-Protein und induzieren demzufolge eine serologische Antwort
gegen VP5. Dies deutet darauf hin, dass Hühnerserum dazu verwendet werden
kann zu untersuchen, ob Tiere einem Virus, das das VP5 Protein exprimiert
(z. Bsp. einem Feldvirus) oder dem VP5– rekombinanten
Impfstoff ausgesetzt waren.
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Tabelle
6: Western Blot Analyse. Serum von mit VP5
+ oder
VP5
– rekombinantem
Impfstoff geimpften Tieren sowie SPF Hühnerserum und anti VP5-Hasen
Serum wurden auf ihre Reaktion mit dem VP5-Protein untersucht.
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Sterblichkeit und klinische
Symptome.
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Keine der mit dem VP5+ IBDV
Impfstoff (Gruppe 1)geimpften, dem rekombinanten VP5– IBDV
Impfstoff (Gruppe 2) geimpften oder mit dem kommerziellen IBDV Impfstoff
Nobilisstamm D78 (Gruppe 3) geimpften Tiere starben oder zeigten
klinische Symptome von infektiöser
Bursitis nach dem Challenge, was darauf hinweist, dass die Tiere
gegen schweren Challenge geschützt
waren. Alle Tiere in der nicht geimpften Kontrollgruppe waren gegen
schweren Challenge nicht geschützt.
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Beispiel 4
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In vivo Testen des rekombinanten
VP5-2 Imfstoffes
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Herstellung der IBDV Impfstoffe.
Primäre
Hühnerembryo
Fibroblasten (CEF) Zellen wurden in einer Konzentration von 2 × 106/ml hergestellt. Die Zellen wurden in Eagles
Minimum Essential Medium enthaltend 5% fötales Kälberserum kultiviert. Zu 15 ml
dieser Zellsuspension wurde 0.1 ml IBDV/VP5--2 (D78/D78/VP5–) Virus
hinzugegeben. Nach Inkubation für
6 Tage in einem Hoch-Feuchtigkeits-Inkubator
bei 37°C
wurde der Überstand
titriert. Der infektiöse
Titer des Überstands
betrug 108.2 TCID50/ml.
Für das
zweite Tierexperiment wurde der Überstand
verdünnt
um eine Impfstoffdosis von 105.5 TCID50/Tier zu ergeben und für das erste Tierexperiment
wurde der Überstand
verdünnt
um eine Impfstoffdosis von 104.0 TCID50/Tier oder 105.0 TCID50/Ei zu ergeben.
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Erstes Tierexperiment. Der Effekt
des Impfstoffs wird durch Messung der serologischen Antwort und Resistenz
gegenüber
einem Challenge, der durch Verabreichung eines Challenge Virus im
Alter von 14 Tagen erhalten wurde, beurteilt. Der Impfstoff (105.0 TCID50/Ei oder
104.0 TCID50/Tier
von D78/D78/VP5–) wurde in ovo oder
intramuskulär
bei einem Alter von einem Tag angewendet. Mikroskopische Läsionen in
der Bursa wurden 3 und 10 Tage nach dem Challenge untersucht. Der
Schutz gegen den Challenge wurde bestimmt und die serologische Antwort
wurde bei einem Alter von 14 Tagen mit dem VN-Test bestimmt.
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1.
Durchschnittliche mikroskopische Läsionenwerte in der Bursa 3
und 10 Tage nach dem Challenge
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3.
Serologische Antwort gegen IBDV
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Der VN-Titer ist als log2 der Verdünnung ausgedrückt. Tiere
mit einem Titer < 4.0
log2 werden berücksichtigt.
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Schussfolgerungen
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- 1 Der D78/D78/VP5– Stamm
ist ein höchst
abgeschwächtes
IBD-Virus
- 2 Der Virusstamm ist sehr mild
- 3 Das Virus kann eine serologische Antwort induzieren
- 4 Das Virus kann Schutz induzieren
- 5 Der Virusstamm kann mittels intramuskulärer Injektion bei 1 Tage alten
SPF Hühnern
und in ovo bei 18-Tage alten embryonierten SPF-Eieren angewendet
werden
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Zweites Tierexperimeat. Der Effekt
des Impfstoffs wird durch Messung der serologischen Antwort gegen
IBDV und Resistenz gegenüber
einem Challenge, der durch Verabreichung eines Challenge Virus 21
Tage nach Verabreichung des Gumboro Impfstoffes erhalten wurde,
beurteilt. Der Impfstoff (105.5 TCID50/Tier von D78/D78/VP5–)
wurde 14 Tage alten SPF Hühnern über die
intramuskuläre
Route verabreicht. Drei, 7, 14 und 20 tage nach Impfung und 3 Tage
nach Challenge wurden die Bursa, Milz, Thymus, Leber, Duodenum,
Pankreas, ceacalen Tonsillen und der Hardereian Drüsen auf
mikroskopische Läsionen
untersucht. Zehn Tage nach Challenge wurden die Bursae auf mikroskopische
Läsionen
untersucht.
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Die Seren wurden im VN-Test getestet.
Sowie die Sterblichkeit wurde nach dem Challenge bewertet.
1.
Prozent Sterblichkeit nach Challenge:
2.
Mikroskopische Läsionen
der geimpften gruppe vor und nach dem Challenge:
- A
- Nicht geimpfte Tiere
zeigten eine Lymphozyten Depletion von 5.0 (100%) und 4.25, 3 beziehungsweise 10
Tage nach dem Challenge.
- ND
- nicht bestimmt.
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3.
Serologische Antwort nach Impfung
-
Schussfolgerungen
-
- 1. Der D78/D78/VP5– Stamm
ist ein höchst
abgeschwächtes
IBD-Virus
- 2. Der Virusstamm ist sehr mild und induziert keine Läsionen in
Organen
- 3. Das Virus kann eine serologische Antwort induzieren
- 4. Das Virus kann Schutz induzieren
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LEGENDE ZU
DEN FIGUREN
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1 Genomische
Organisation von Segment A und Segment B des IBDV. Die Zahlen geben
die Nukleotidpositionen der Start-, End- und kodierenden Region
der Segmente an.
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2 Konstruktion
der genomischen cDNA Klone zur Herstellung des IBDV/VP5–.
Das Plasmid pAD78/EK enthält
die gesamte D78 Segment A cDNA, die das Polyprotein (VP2-VP4-VP3)
und VP5 kodiert. Das Plasmid pBP2 enthält das gesamte Stamm P2 Segment
B, das VP1 kodiert. Mutationen wurden im Plasmid pAD78/VP5– durch Änderung
des Methionin Startcodons für
VP5 zu Arginin und Erstellung einer künstlichen Afl II Sopaltungsstelle
eingeführt.
Rekombinante Plasmide wurden mit den unterstrichenen Restriktionsenzymen
linearisiert, gefolgt von T7 Polymerase Transkription.
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3 Konstruktion
der genomischen cDNA Klone zur Herstellung des IBDV/VP5–-2.
Das Plasmid pAD78/EK enthält
die gesamte D78 Segment A cDNA, die das Polyprotein (VP2-VP4-VP3)
und VP5 kodiert. Das Plasmid pBP2 enthält das gesamte Stamm D78 Segment
B, das VP1 kodiert. Mutationen wurden im Plasmid pAD78/VP5– durch Änderung
des Methionin Startcodons für
VP5 zu Glutaminsäure
und Erstellung einer künstlichen
BstBI Sopaltungsstelle eingeführt.
Weitere Mutationen wurden in den Arginin und Glutamin Codons eingeführt. Rekombinante
Plasmide wurden mit den unterstrichenen Restriktionsenzymen linearisiert, gefolgt
von T7 Polymerase Transkription.
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4 Radioimmunopräzipitation
von Proteinen von CEC infizierten Zellen mit rekombinanten IBDV. CEC
infizierte Zellen mit IBDV/VP5– (Bahnen 1–3), IBDV/EK
(Bahnen 4–6)
und nicht infizierte Kontrollen wurden mit Hasen anti-IBDV Serum
(Bahnen 1, 4, 7), Hasen anti-VP5 Serum (Bahnen 2, 5, 8) und mAb
DIE7 (Bahnen 3, 6, 9) immunopräzipitiert.
Die Position der Molekulargewichtsmarker (M) ist angegeben. Die
Stellen der viralen Proteine VP2, VP3, VP4 und VP5 sind markiert.
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5 Replikationskinetik
von IBDV/EK und IBDV/VP5. Infektiöse Titer der Überstände (vertikale
Achse) wurden zu den angegebenen Zeiten bestimmt.
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