DE69534354T2

DE69534354T2 - CHIMÄRE cDNA-KLONE DES VIRUS DER INFEKTIÖSEN BURSAL-KRANKHEIT, EXPRESSIONSPRODUKTE UND DARAUF BASIERENDE IMPFSTOFFE

Info

Publication number: DE69534354T2
Application number: DE69534354T
Authority: DE
Inventors: Vikram Vakharia; David B. Snyder; Stephanie A. Mengel-Whersat
Original assignee: University of Maryland at Baltimore; University of Maryland at College Park
Current assignee: University of Maryland at Baltimore; University of Maryland at College Park
Priority date: 1994-03-29
Filing date: 1995-03-29
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2015-03-30
Also published as: EP0755259A1; AU696656B2; WO1995026196A1; JP2005200420A; EP0755259A4; US6017759A; ATE300950T1; US6156314A; JPH09510873A; CA2186856A1; ES2249769T3; DK0755259T3; AU2129195A; EP0755259B1; US5788970A; DE69534354D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung stellt chimäre IBDV-Immunogene zur Verfügung, welche aktiv gegen virulente und letale Herausforderung durch klassische IBDV-Stämme und deren Varianten schützen, und Verfahren zum Erhalten von Impfstoffen, die diese chimären Immunogene und Impfstoffe enthalten.
Hintergrund und Stand der Technik
Das infektiöse Bursitisvirus (IBDV) ist für eine stark ansteckende immunosuppressive Erkrankung in jungen Hühnern verantwortlich, welche signifikante Verluste der Geflügelindustrie weltweit verursacht (rückblickend zusammengefasst in Kibenge (1988) "J. Gen. Virol", 69: 1757–1775). Die Infektion von empfänglichen Hühnern mit virulenten IBDV-Stämmen kann zu einem hochansteckenden immunosuppressiven Zustand führen, der als infektiöse Bursitis (IBD) bekannt ist. Schaden, der den Lymphoidfollikeln der Schleimhaut von Fabricius und der Milz zugefügt wird, kann Infektionen erleichtern, die durch andere Mittel zugefügt werden, und kann die Fähigkeit eines Huhns reduzieren, auf Impfungen anzusprechen (Cosgrove (1962) "Avian Dis.", 6: 385–3894).
Es gibt zwei Serotypen von IBDV (McFerran et al. (1980) "Avian Path.", 9: 395–404). Serotyp-1-Viren sind pathogen für Hühner und unterscheiden sich deutlich in ihrer Virulenz (Winterfield et al. (1978) "Avian Dis.", 5: 253–260), wohingegen Serotyp-2-Viren, die aus Truthähnen isoliert wurden, für Hühner avirulent sind (Ismail et al. (1988) "Avian Dis.", 32: 757–759; Kibenge (1991) "Virology", 184: 437–440).
IBDV ist ein Mitglied der Birnaviridae-Familie, und dessen Genom besteht aus zwei Segmenten doppelsträngiger RNA (Dobos et al. (1979) "J. Virol.", 32: 593–605). Das kleinere Segment B (–2800 bp) codiert für VP1, die dsRNA-Polymerase, Das größere genomische Segment A (–3000 bp) codiert für ein 110-kDA-Vorläuferpolyprotein in einem einzelnen offenen Leserahmen (ORF), das zu reifem VP2, VP3 und VP4 weiterverarbeitet wird (Azad et al. (1985) "Virology", 143: 35–44). Aus einem kleinen ORF, der teilweise mit dem Polyprotein ORF überlappt, kann Segment A ebenso für VP5 codieren, ein 17-kDa-Protein mit unbekannter Funktion (Kibenge et al. (1991) "J. Gen. Virol.", 71: 569–577).
Während VP2 und VP3 die strukturellen Haupt-Proteine des Virions sind, ist VP2 das Haupt-Wirt-schützende Immunogen und verursacht die Induktion von neutralisierenden Antikörpern (Becht et al. (1988) "J. Gen. Virol.", 69: 631–640; Fahey et al. (1989) "J. Gen. Virol.", 70: 1473–1481). VP3 wird als ein gruppenspezifisches Antigen angesehen, da es durch monoklonale Antikörper (Mabs), die gegen VP3 von beiden Stämmen von sowohl Serotyp 1 als auch Serotyp 2 gerichtet sind, erkannt wird (Becht et al. (1988) "J. Gen. Virol.", 69: 631–640). VP4 ist eine viruscodierte Protease und ist in die Verarbeitung des Vorläuferproteins involviert (Jagadish et al. (1988) "J. Virol.", 62: 1084–1087).
In der Vergangenheit wurde die Kontrolle der IBDV-Infektion bei jungen Hühnern durch Lebendimpfung mit avirulenten Stämmen erreicht oder im Wesentlichen durch den Transfer eines maternalen Antikörpers, induziert durch die Verabreichung von lebenden und getöteten IBDV- Impfstoffen an Bruthennen. Unglücklicherweise wurden in den letzten Jahren virulente variante Stämme von IBDV aus geimpften Vogelscharen in den Vereinigten Staaten isoliert (Snyder et al. (1988b) "Avian Dis"., 32: 535–539; Van der Marel et al. (1990) "Dtsch. Tierärztl. Wschr.", 97: 81–83). Die Verwendung eines ausgewählten Angebots an Mabs, gezogen gegen verschiedene IBDV-Stämme, hat zu der Identifizierung von natürlich auftretenden GLS, DS326, RS593 und Delaware-varianten Viren in den Vereinigten Staaten geführt. Erhebliche ökonomische Verluste sind durch das Auftreten dieser antigenen Varianten (Delaware und GLS) auf dem Gebiet entstanden (Snyder et al. (1992) "Arch. Virol.", 127: 89–101).
Diese varianten Stämme sind antigen verschieden von den klassischen IBDV-Stämmen, die typischerweise vor 1985 isoliert wurden, und ihnen fehlt ein Epitop oder Epitope, definiert durch das Neutralisieren von monoklonalen Antikörpern (Mabs) B69 und R63 (Snyder et al. (1988a) "Avian Dis.", 32: 527–534; Snyder et al. (1988b) "Avian Dis.", 32: 535–539; Snyder et al. (1992) "Arch. Virol.", 127: 89–101). Seit dem Auftreten dieser varianten Stämme auf dem Gebiet wurden viele kommerziell erhältliche lebende und getötete Impfstoffe für IBDV umformuliert in einem Versuch, um dem größeren antigenen Spektrum von Viren, von denen erkannt wurde, dass sie auf dem Gebiet zirkulieren, zu entsprechen.
Versuche, einen rekombinanten Impfstoff für IBDV zu entwickeln, wurden ausgeführt, und das Genom von IBDV wurde kloniert (Azad et al. (1985) "Virology", 143: 35–44). Das VP2-Gen von IBDV wurde kloniert und in Hefe (Macreadie et al. (1990) "Vaccine", 8: 549–552), ebenso wie in einem rekombinanten Geflügelpockenvirus (Bayliss et al. (1991) "Arch. Virol.", 120: 193–205) exponiert. Wenn Hühner mit dem VP2-Antigen, das in Hefe exprimiert wurde, immunisiert wurden, ergaben die Antiseren einen passiven Schutz in Hühnern gegen die IBDV-Infektion. Wenn sie im Rahmen von aktiven Immunisierungsstudien verwendet wurden, ergab das Geflügelpockenvirus-übertragene VP2-Antigen Schutz gegen die Sterblichkeit, aber nicht gegen den Schaden an der Bursa (Schleimbeutel) von Fabricius.
Kürzlich wurde die Synthese von VP2-, VP3- und VP4-strukturellen Proteinen des varianten GLS-IBDV-Stammes in einem baculovirus-Expressionssystem beschrieben (Vakharia et al. (1993) "J. Gen. Virol.", 74: 1201–1206). Bei einer initialen Zwei-Dosen aktiven Immunitätsstudie in SPF-Hühner waren Baculovirus-exprimierte GLS-Proteine in der Lage, einen 79%igen Schutz gegen eine virulente GLS-Herausforderung zu verleihen (Vakharia et al. (1993) "J. Gen. Virol.", 74: 1201–1206). In einer anschließenden ausgedehnten Studie der aktiven Crossimmunität durch das Erhöhen der antigenen Masse des baculovirus-exprimierten GLS-Proteins wurde ein vollständiger Schutz gegen die varianten GLS- und E/Del-Stämme mit einer einzelnen Dosis erhalten, aber lediglich ein teilweiser Schutz wurde gegen den klassischen STC-Stamm erhalten, es sei denn, zwei Dosen wurden verabreicht.
In den letzten Jahren wurden die Nucleinsäuresequenzen des großen Segments A von fünf Serotyp-1-IBDV-Stämmen; 002-73 (Hudson et al. (1986) "Nucleic Acids Res.", 14: 001–5012), Cu-1, PBG98, 52/70 (Bayliss et al. (1990) "J. Gen. Virol.", 71: 1303–1312), STC (Kibenge (1990) "J. Gen. Virol.", 71: 569–577) und Serotyp-2-OH-Stamm (Kibenge (1991) "Virology", 184: 437–440) bestimmt. Zusätzlich wurde das VP2-Gen von japanischen IBDV-Stämmen (Lin et al. (1993) "Avian Dis.", 37: 315–323) und Delaware-Varianten A und E (Lana et al. (1992) "Virus Genes", 6: 247–259; Heine et al. (1991) "J. Gen. Virol.", 22: 1835–1843) sequenziert. Jedoch hat niemand vollständig das gesamte lange Segment irgendeiner United States IBDV-Variante vollständig kloniert und charakterisiert.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder haben nun den Bereich des IBDV-Genoms bestimmt, welcher für die antigene Variation verantwortlich ist. Eine DNA-Sequenz, enthaltend die zentrale variable Region des VP2-Bereichs, ebenso wie ein Plasmid, das diese DNA-Sequenz enthält, wurde konstruiert. Diese DNA-Sequenz kann so manipuliert werden, dass sie gewünschte virusneutralisierende Epitope oder immunogene Polypeptide irgendeines IBDV-Stammes bildet. Diese immunogenen Segmente können wiederum in neue rekombinante IBDV-Impfstoffe mit einbezogen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 illustriert die Konstruktion von verschiedenen chimären Plasmiden, die für IBDV-spezifische Polyproteine codieren. Eine Karte des IBDV-Genoms mit dessen codierenden Regionen ist am oberen Rand der Figur gezeigt. Ausgewählte Restriktionsorte werden in die Figur mit einbezogen: B, BamHI; E, BstEII; N, NdeI, R, NarI; S, SpeI. Gestrichelte Linien zeigen die Substitution der D78-Sequenz (NdeI-NarI-Fragment) in der GLS-Sequenz an, um die B69-Epitop-Region wiederherzustellen. Durchgezogene Linien und gepunktete Linien zeigen die Substitution der E/Del-22- bzw. DS326-Sequenzen in die GLS-Sequenz an, um die B63-Epitop-Region wiederherzustellen bzw. um die 179-Epitop-Region zu deletieren.
2 sind Elektronenmikroskopaufnahmen von IBDV-virusartigen Partikeln (|--| = 100 nm). A. Tatsächlich leere Partikel (ohne RNA) aus aufgereinigtem Virus. B. Virusartige Partikel (leere Kapside), abgeleitet von einem rekombinanten Baculovirus, das das große Genomsegment von IBDV in Insektenzellen exprimiert.
3 ist ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz der strukturellen Proteine (VP2, VP3 und VP4) von zehn IBDV-Stämmen. Gestrichelte Linien (-) zeigen Aminosäureidentität an, und Kreuze (x) zeigen einen Bereich an, wo die Sequenz nicht bestimmt wurde. Gefüllte Balken (|) zeigen eine Lücke in der Sequenz an, und vertikale Pfeilköpfe (↓) zeigen die möglichen Spaltorte von VP2/VP4 und VP4/VP3 an. Die zwei hydrophilen Peaks in dem variablen Bereich sind überstrichen.
4 ist ein phylogenetischer Stammbaum für die IBDV-strukturellen Proteine unter Verwendung des PAUP (phylogenetische Analyse unter Verwendung von Parsimonie) Version 3.0-Programms (Illinois Natural History Survey, Champaign, Illinois).
5 stellt die DNA- und Aminosäuresequenz für das GLS-virusstrukturelle Proteinfragment VP2/VP4/VP3 dar. Eine vertikale Linie zeigt die Start-/Stopppunkte für die VP2-, VP4- und VP3-Bereiche an.
6 reflektiert die DNA- und Aminosäuresequenz für das E/Del22-Virus strukturelle Proteinfragment VP2/VP4/VP3.
7 ist eine Tabelle der Aminosäureidentitäten für wesentliche Orte (epitopische Determinanten) von acht unterschiedlichen IBDV.

IBD: – infektiöse Bursitis wie oben beschrieben.
IBDV-infektiöses: Bursitis-Virus, ein Virus, das in der Lage ist, wenigstens Läsionen in dem Schleimbeutel von Fabricius bei infiziertem Geflügel zu induzieren.
Epitopische Determinanten: – Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen, welche Epitopen entsprechen, die durch einen oder mehrere monoklonale Antikörper erkannt werden. Die Gegenwart der Aminosäure oder Aminosäuresequenz an dem entsprechenden ORF-Ort verursacht, dass das Polypeptid das entsprechende Epitop aufzeigt. Eine epitopische Determinante wird durch Aminosäureidentität und Sequenzanordnung bestimmt.
Genetische epitopische Determinanten: – Nucleotidsequenzen des ORF, welche für epitopische Determinanten codieren.
Konformationale Epitope: – Epitope, die teilweise oder vollständig durch die quartäre (dreidimensionale) Struktur eines IBDV-Polypeptids induziert werden. Konformationale Epitope können das Binden zwischen einem IBDV und einem monoklonalen Antikörper verstärken oder können Bindung induzieren, wohingegen dieselbe Sequenz, der das konformationale Epitop fehlt, nicht in der Lage wäre, eine Bindung zwischen dem Antikörper und dem IBDV-Polypeptid überhaupt zu induzieren.
Virusartige Partikel: – dreidimensionale Partikel mit natürlichen oder rekombinanten Aminosäuresequenzen, die die dreidimensionale Struktur von IBDV nachahmen (für die das große Genomsegment A codiert), aber denen virale RNA fehlt. Virusartige Partikel zeigen konformationale Epitope auf, die durch native Viren mit ähnlicher Sequenz aufgezeigt werden. Virusähnliche Partikel werden für die angemessene Expression von DNA, die für VP2-, VP4-, VP3-strukturelle Proteine in einem angemessenen ORF codiert, entwickelt.
Epitopische Determinantenregion: – limitierter Bereich einer Aminosäuresequenz von VP2 von IBDV, die mit epitopischen Determinanten übersättigt ist, wobei die Variation unter Aminosäuren in diesem limitierten Bereich eine große Anzahl an Epitopen entstehen lässt, die durch unterschiedliche monoklonale Antikörper erkannt werden.

Bestes Verfahren zum Ausführen der Erfindung
Rekombinante, immunogene Polypeptide, die die Epitope von zwei oder mehreren nativen IBDV aufzeigen, ebenso wie rekombinante virusartige Partikel, die die Epitope von zwei oder mehreren nativen IBDV aufzeigen, und konformationale Epitope sind effektive Immunogene für Impfstoffe, welche verwendet werden können, um einen Schutz gegen eine breite Vielfalt an IBDV-Herausforderungen bei inokuliertem Geflügel zu verleihen. Die rekombinanten Polypeptide und virusähnlichen Partikel werden durch die Expression von chimärer DNA, die durch die Insertion von epitopischen Determinanten für wenigstens ein zweites IBDV in die VP2-Region von Basis-IBDV hergestellt wird, erhalten. Dies wird am einfachsten durch die Substitution der genetischen epitopischen Determinanten für die Aminosäureidentitäten und -anordnungen ausgeführt, die in 7 dargestellt sind. Daher wird, wo die epitopische Determinante des zweiten IBDV von derjenigen des Basis-IBDV differiert, die genetische epitopische Determinante für das unterschiedliche zweite IBDV anstelle der genetischen epitopischen Determinante an dem Ort des Basis-IBDV eingefügt. Ein Beispiel für das Kombinieren der epitopischen Determinanten von D78-, E/Del22- und DS326-IBDV in das Basis-GLS-IBDV ist in 1 ausgeführt. Somit kann eine DNA-Sequenz mit genetischen epitopischen Determinanten für eine Vielzahl von nativen IBDV hergestellt werden. Diese rekombinanten Plasmide können in eine Vielzahl von Verpackungs-/Expressionsvektoren eingefügt werden, einschließlich baculovirus, Geflügelpockenvirus, Herpesvirus von Truthähnen, Adenovirus und ähnlichen Transfektionsvektoren. Die Vektoren können verwendet werden, um konventionelle Expressionszellen zu infizieren, so wie SF9-Zellen, Hühnerembryofibroblastenzelllinien, Hühnerembryonierenzellen, Verozellen und ähnliche Expressionsvehikel. Verfahren für die Transfektion und Verfahren für die Expression sowie die Plasmidinsertion in Transfektionsvehikel sind gut bekannt und stellen per se keinen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.
Die Expression der chimären cDNA der Erfindung erzeugt immunogene Polypeptide, die Epitope einer Vielzahl von nativen IBDV widerspiegeln, und die Expression eines rekombinanten VP2-, VP4-, VP3-cDNA-Segments, mit der VP2-Region, die wiederum genetische epitopische Determinanten für wenigstens zwei native IBDV umfasst, lässt immunogene virusähnliche Partikel entstehen.
Die immunogen Polypeptide und virusähnlichen Partikel können unter Verwendung von konventionellen Techniken geerntet werden (Dobos et al. "J. Virol", 32: 593–605 (1979)). Die Polypeptide und virusähnlichen Partikel können verwendet werden, um Impfstoffe herzustellen, welche einen Schutz für inokuliertes Geflügel verleihen werden, insbesondere Hühner, und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Brathühner, Schutz gegen eine Herausforderung durch jedes IBDV, das ein Epitop enthält, welches in der Vielzahl von epitopischen Determinanten, die in dem Inokulum enthalten sind, widergespiegelt wird. Somit gibt ein einzelnes Immunogen Anlass für Immunität gegen eine Vielzahl von IBDV, jedes IBDV, dessen genetische epitopische Determinante in die chimäre cDNA mit aufgenommen wurde.
Die Verabreichung der Impfstoffe kann wirksam gemäß gut etablierten Verfahren ausgeführt werden. Im US-Patent 5,064,646 werden Verfahren für die wirksame Inokulation von Hühnern beschrieben, basierend auf der damals neuen Isolation von GLS IBDV. Ähnliche Verabreichungs- und Dosierungsrahmen können hierin verwendet werden. Da die Polypeptide und virusartigen Partikel keine virale RNA aufweisen, sind sie avirulent. Die Impfstoffe können daher durch die einfache Miteinbeziehung der immunogenen Polypeptide und der virusähnlichen Partikel in einen pharmazeutischen Träger, typischerweise eine Suspension oder Mischung, hergestellt werden. Entsprechende Dosierungswerte werden am besten durch routinegemäße Trial- und Errortechniken herausgefunden, wobei die unterschiedlichen Antikörpertiter, die induziert werden, und/oder die Quantität der unterschiedlichen Epitope, die vorhanden sind, berücksichtigt werden, welche eine vollständige Crossimmunität gegenüber der virulenten Herausforderung induzieren werden. Im Allgemeinen können pharmakologisch akzeptable Träger, so wie phosphatgepufferte Salzlösung, Zellkulturmedium, Marek's Virusimpfstoff-Verdünnungsölhilfsstoffe und andere Hilfsstoffe usw. verwendet werden. Die Verabreichung geschieht vorzugsweise einmal an Hennen, die in die Eierlegzeit eintreten, was die Induktion eines Antikörpers zur Verfügung stellt, welcher passiv durch das Ei an das Küken weitergegeben wird, um einer frühen Infektion durch virulente IBDV-Feldstärken vorzubeugen. Andersherum kann der rekombinante Impfstoff in einen Replikationsvektor zu jedem Zeitpunkt im Lebensraum eines Huhns übertragen werden, vorzugsweise in einem Alter von einem Tag. Die Erfahrung hat gezeigt, dass im Allgemeinen das Schutzniveau durch eine zweite Inokulation verbessert werden kann.
Die Erfindung kann weiterhin durch Bezugnahme auf die spezifischen Beispiele, die hierunter ausgeführt sind, verstanden werden.
Beispiele
Methodologischer Hintergrund
Um die molekulare Basis der antigenen Variation in IBDV zu bestimmen, wurde das genomische Segment A von vier IBDV-Stämmen, GLS, DS326, Delaware-Variante E (E/Del) und D78, kloniert und durch Sequenzieren charakterisiert. Durch Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen dieser Stämme mit anderen Serotyp-1- und Serotyp-2-Sequenzen, die vorher publiziert worden sind, wurden die putativen Aminosäurereste identifiziert, die in das Binden mit verschiedenen neutralisierenden Mabs involviert sind, und die phylogenetische Verwandtschaft der IBDV-strukturellen Proteine wurde untersucht.
GLS-, DS326- und STC-Stämme von IBDV wurden in dem Schleimbeutel von spezifischen pathogenfreien Hühner (SPA-FAS, Inc., Norwich, CT, USA) propagiert. Gewebekultur-adaptierte E/Del-22-, D78- und OH-(Serotyp 2)-Stämme von IBDV wurden in primären Hühnerembryofibroblastenzellen, die von 10 Tage alten embryonierten Eiern (SPAFAS, Inc.) abgeleitet wurden, propagiert und aufgereinigt, wie beschrieben (Snyder et al. (1988a) "Avian Dis.", 32: 527–534). Die Mabs gegen verschiedene IBDV-Stämme wurden produziert und unter Verwendung von Protokollen charakterisiert, die vorher aufgezeigt wurden (Snyder et al. (1988a) "Avian Dis." 32: 527–534; Snyder et al. (1988b) "Avian Dis.", 32: 535–539). Mabs B69 und R63 wurden gegen einen D78-Stamm hergestellt, wohingegen Mabs 8, 10, 57 und 179 gegen einen GLS-Stamm hergestellt wurden. Zusätzlich wurde ein neues Mab 67 hergestellt, welches neutralisierend und für den E/Del-Stamm spezifisch war. Die Identifizierung von IBDV-Antigenen durch modifizierte Antigen-Capture-ELISA (AC-ELISA) wurde wie beschrieben ausgeführt (Snyder et al. (1992) "Arch. Virol.", 127: 89–101).
Verschiedene IBDV-Stämme wurden durch deren Reaktivitäten mit einer Auswahl an neutralisierenden Mabs charakterisiert, wie in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1 Antigene Charakterisierung von verschiedenen IBDV-Stämmen nach deren Raktivitäten mit einer Auswahl an neutralisierenden MAbs
Alle Standard-Serotyp-1-Viren reagierten mit Mabs B69, R63, 179 und 8, außer PBG98 (ein britischer Impfstoffstamm, Intervet, UK), welcher nicht mit Mab B69 reagierte. Im Gegensatz dazu fehlt allen US-varianten Viren das virusneutralisierende B69-Epitop. Zusätzlich fehlt GLS- und DS326-Varianten ein R63-Epitop, aber sie teilen ein gemeinsames Epitop, das durch Mab57 definiert wird. Somit wurden diese Viren auf der Basis der Reaktivitäten mit verschiedenen Mabs bezüglich ihrer Antigenizität als klassisch, GLS-, DS326- und E/Del-Varianten eingestuft.
Komplementäre DNA-Klone, die den gesamten codierenden Bereich des großen RNA-Segments von verschiedenen IBDV-Stämmen enthielten, wurden unter Verwendung von Standardklonierungsverfahren und Methoden hergestellt, die vorher beschrieben wurden (Vakharia et al. (1992) "Avian Dis.", 36: 736–742; Vakharia et al. (1993) "J. Gen. Virol.", 74: 1201–1206). Die vollständige Nucleotidsequenz dieser cDNA-Klone wurde durch das Dideoxyverfahren unter Verwendung eines Sequenaee-DNA-Sequenzierkits (U.S. Biochem. Corp., Columbus, OH) bestimmt. DNA-Sequenzen und abgeleitete Aminosäuresequenzen wurden durch ein PC/GENE Software Package (Intelligenetics, Inc.) analysiert. Diese sind in den 5 und 6 dargestellt. Die Nucleotidsequenzdaten des GLS-Stammes wurden bei den GenBank-Datenbibliotheken hinterlegt und ihnen wurde die Zugangsnummer M97346 zugewiesen.
Vergleiche der Nucleotidsequenz des GLS-Stammes (3230 bp lang) mit acht Serotyp-1- und einem Serotyp-2-IBDV-Stamm zeigen eine ≥ 92%ige bzw. eine ≥ 82%ige Sequenzhomologie; was anzeigt, dass diese Viren eng verwandt sind. Es ist interessant, herauszufinden, dass es nur sechs bis neun Basensubstitutionen zwischen D78-, PBG98- und Cu-1-Stämmen gibt, was einem Unterschied von etwa 0,2% bis 0,3% entspricht (Resultate nicht gezeigt). 3 und Tabelle 2 zeigen einen Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen und der Prozenthomologie des großen ORF von Segment A der zehn IBDV-Stämme, einschließlich vier IBDV-Stämme, die in dieser Studie verwendet wurden.
TABELLE 2 Prozent Aminosäuresequenzhomologie des großen ORF von Segment A von zehn IBDV-Stämmen
Diese Vergleiche zeigen, dass die Proteine hochkonserviert sind. Der Grad des Unterschieds in der Aminosäuresequenz rangiert von 0,4% für den D78 – Cu-1-Vergleich und 10,3% für den Serotyp-1-(E/Del) – Serotyp-2-(OH)-Vergleich (Tabelle 2).
In 3 zeigen Sequenzalignments der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des großen ORF (1012 Reste) von zehn IBDV-Stämmen (einschließlich der vier, die in dieser Studie verwendet werden), dass die meisten Aminosäureveränderungen in dem zentralen variablen Bereich zwischen den Resten 213 und 332 des VP2-Proteins auftreten, wie früher gezeigt durch Bayliss et al. (1990) "J. Gen. Virol. M.", 71: 1303–1312. Es ist interessant zu bemerken, dass alle US-Varianten (GLS, DS326 und E/Del) von den anderen Stämmen in den zwei hydrophilen Bereichen differieren, welche in 3 überstrichen sind (Reste 212 bis 223 und Reste 314 bis 324). Es wurde gezeigt, dass diese zwei hydrophilen Bereiche wichtig beim Binden von neutralisierenden Mabs sind und daher in die Bildung eines virusneutralisierenden Epitops involviert sein können (Heine et al. (1991) "J. Gen. Virol.", 22: 1835–1843). Kürzlich haben wir gezeigt, dass die konformationsabhängigen Mabs B69, R63, 8, 179, 10 und 57 (siehe Tabelle 2) VP2-Protein immunopräzipitieren (Snyder et al. (1992) "Arch. Virol.", 127: 89–101). Zusätzlich bindet E/Del-spezifisches Mab 67 ebenso an VP2-Protein. Daher haben wir, um die Aminosäuren zu identifizieren, die in die Bildung von virusneutralisierenden Epitopen involviert sind, und daher in die antigene Variation, die Aminosäuresequenzen von VP2-Protein von klassischen und varianten Viren verglichen.
Ein Vergleich der D78-Sequenz mit der PBG98-Sequenz zeigt nur vier Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 76, 249, 280 und 326. Jedoch differieren STC- und 52/70-Stämme ebenso von der D78-Sequenz an den Positionen 76, 280 und 326, aber diese Viren binden an Mab B69. Dies impliziert, dass Gln an Position 249 (Gln249) in das Binden mit Mab B69 involviert sein kann. Es sollte bemerkt werden, dass alle US-varianten Viren eine Gln→Lys-Substitution an dieser Position aufweisen und daher dem Binden mit neutralisierendem Mab B69 ausweichen. Auf ähnliche Weise zeigt ein Vergleich der GLS-Sequenzen mit der DS326-Sequenz in dem variablen Bereich sechs Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 222, 253, 269, 274, 311 und 320. Jedoch haben andere IBDV-Stämme, die an Mab 179 binden, Aminosäuresubstitutionen an Positionen 222, 253, 269 und 274, die in der Natur konservativ sind. Daher suggeriert dies, dass Glu311 und Gln320 in das Binden mit Mab 179 involviert sein können. Wiederum zeigt ein Vergleich von GLS- und DS326-Sequenzen mit allen anderen IBDV-Sequenzen eine einzigartige Ala→Glu-Substitution an Position 321, was den Beitrag dieses Restes an der Bindung mit Mab 57 suggeriert. Da Mab 57 mit Mab R63 nicht im Wettbewerb steht, ist es denkbar, dass Ala321 zur Bindung an Mab R63 beitragen kann. Auf ähnliche Weise zeigt ein Vergleich der E/Del-Sequenz mit andern Sequenzen fünf einzigartige Substititionen an den Positionen 213, 286, 309, 318 und 323. Jedoch suggeriert ein Vergleich dieser E/Del-Sequenz (aus Gewebekultur abgeleitetem Virus) mit vorher publizierten VP2-A/Del- und -E/Del-Sequenzen (Bursitis-abgeleiteter Virus) die Involvierung von Ile286, Asp318 und Glu323 in das Binden an Mab67, da Reste an Positionen 213 und 309 in den A/Del- bzw. E/Del-Sequenzen nicht substituiert sind (Heine et al. (1991) "J. Gen. Virol.", 22: 1835–1843; Lana et al. (1992) "Virus Genes", 6: 247–259 Vakharia et al. (1992) "Avian Dis.", 36: 736–742).
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz zeigt ebenso einen auffallenden Unterschied zwischen Serotyp-1- und Serotyp-2-Sequenzen. Im Serotyp-2-OH-Stamm gibt es eine Insertion eines Aminosäurerestes an Position 249 (Serin) und eine Deletion eines Restes an Position 680. Vorher wurde gezeigt, dass Serotyp-2-Viren natürlich avirulent sind und keine pathologischen Läsionen in Hühnern verursachen (Ismail et al. (1988) "Avian Dis.", 32: 757–759). Daher könnten diese geringfügigen Veränderungen in den Strukturproteinen des Serotyp-2-OH-Stammes eine wichtige Rolle bei der Pathogenität des Virus spielen. Darüber hinaus wurde hypothetisiert, dass ein Aminosäuresequenzmotiv, S-W-S-A-S-G-S, (Reste 326 bis 332) nur in virulenten Stämmen konserviert ist und in die Virulenz involviert sein könnte (Heine et al. (1991) "J. Gen. Virol.", 22: 1835–1843). Dieses Sequenzmotiv war ebenso in verschiedenen pathogenen Stämmen von IBDV konserviert, die in Japan isoliert wurden (Lin et al. (1993) "Avian Dis.", 37: 315–323). Ein Vergleich der Aminosäuresegenzen in diesem Heptapeptidbereich ergibt, dass nicht-pathogene Serotyp-2-OH-Stämme drei Substitutionen haben, wohingegen mild-pathogene Stämme vom Serotyp 1 (D78, Cu-1, PBG98 und 002-73) eine oder zwei Substitutionen in diesem Bereich haben. Darüber hinaus zeigt ein Vergleich der Hydrophilieplots der variablen Region (Aminosäuren 213 bis 332) der varianten Serotyp-1-Stämme und des Serotyp-2-OH-Stammes eine drastische Reduktion in dem zweiten hydrophilen Peakbereich (Aminosäurereste 314 bis 324) für Serotyp 2 (Ergebnisse nicht gezeigt). Da die meisten der Aminosäurereste, die eine antigene Variation verursachen, in dieser Region residieren, können diese Reste eine wichtige Rolle bei der Bildung von virusnneutralisierenden Epitopen ebenso wie bei der Serotypspezifität spielen.
Um die antigene Verwandtschaft von strukturellen Proteinen verschiedener IBDV-Stämme zu bewerten, wurde ein phylogenetischer Stammbaum basierend auf der großen ORF-Sequenz von zehn IBDV-Stämmen, einschließlich der US-varianten Stämme, die in dieser Studie untersucht wurden (4), konstruiert. Drei unterscheidbare Stammlinien wurden gebildet. Die erste, welche diejenige ist, die von den anderen am weitesten entfernt ist, ist der Serotyp-2-OH-Stamm, und der zweite ist der geographisch entfernte australische Serotyp-1-Stamm (002-73). Die dritte Herkunftslinie besteht aus vier separaten Gruppen. Die erste und zweite Gruppe beinhalten hochpathogene Stämme, nämlich den Standard-Challenge-Stamm (STC) aus den US und den britischen Feldstamm (52/70). Die dritte Gruppe umfasst alle europäischen Stämme: die Impfstoffstämme D78 (Holland), PBG98 (UK) und den mild-pathogenen Stamm Cu-1 (Deutschland). Die vierte Gruppe besteht aus den US-varianten Stämmen, in welchen E/Del eine unterschiedliche Subgruppe bildet. Die Gruppen, die durch die phylogenetische Analyse gebildet wurden, korrelieren sehr gut mit den Mabs-Reaktivitätsmustern (siehe Tabelle 1). Wie in 4 gezeigt, bilden alle US-varianten Viren, welchen das B69-Epitop fehlt, eine eigene Gruppe, wohingegen alle die klassischen Viren, die ein B69-Epitop enthalten, eine weitere Gruppe bilden (außer PBG98). Zusätzlich konnten die eng verwandten GLS- und DS326-Stämme, die ein gemeinsames Mab-57-Epitop enthalten und denen ein R63-Epitop fehlt, von dem anderen varianten E/Del-Stamm getrennt werden.
Basierend auf dieser Information wurde ein rekombinanter Impfstoff wie folgt konstruiert:
Konstruktion von rekombinanten Baculovirus-Klonen, enthaltend chimäre IBDV-Gene
Ein rekombinantes baculovirus, welches ein chimäres VP2-, VP3- und VP4-strukturelles Protein des GLS-Stammes exprimiert, wurde konstruiert und hergenommen. Das rekombinante Baculovirus exprimierte ein chimäres VP2-Protein, einschließlich aller Mab-definierten GLS-Neutralisierungsorte sowie eines Neutralisierungsorts (B69), welcher für klassische Stämme von IBDV in der Form eines VP2-VP$-VP3-Segments spezifisch ist.
Komplementäre DNA-Klone, enthaltend den gesamten codierenden Bereich des großen RNA-Segments von GLS- und D78-IBDV-Stämmen, wurden unter Verwendung von Standardklonierungsverfahren und Methoden hergestellt, die vorher beschrieben worden sind (Vakharia et al (1992) "Avian Dis.", 36: 736–742; Vakharia et al. (1993) "J. Gen. Virol.", 74: 1201–1206). Um die Gensequenz einzufügen, die für das B69-Epitop des D78-IBDV-Stammes codiert, wurde Plasmid pB69GLS wie folgt konstruiert (siehe 1). Gesamtlängen-cDNA-Klone von D78 und GLS (Plasmide pD78 und pGLS-5) wurden mit NdeI-NarI- und NarI-SpeI-Enzymen verdaut, um ein NdeI-NarI (0,26 kb)- bzw. ein NarI-SpeI (0,28 kb)-Fragment freizusetzen. Diese zwei Fragmente wurden dann in das NdeI-SpeI-geschnittene Plasmid pGLS-5 ligiert, um ein chimäres Plasmid pB69GLS zu erhalten. Als ein Ergebnis dieser Insertion wurden drei Aminosäuren in dem GLS-VP2-Protein substituiert. Diese Substitutionen waren an Positionen 222 (Thr-Pro), 249 (Lys-Gln) und 254 (Ser-Gly) in dem variablen Bereich des VP2-Proteins (Vakharia et al. (1992) "Avian Dis.", 36: 736–742). Um die chimären IBDV-strukturellen Gene in das Baculovirus-Genom zu inserieren, wurde Plasmid pB69GLS vollständig mit BstEII-Enzym und teilweise mit dem BamHI-Enzym verdaut, mit dem NheI-BstEII-Fragment (abgeleitet vom Plasmid pGLSBacI, siehe Vakharia et al. (1993) "J. Gen. Virol", 74: 1201–120b) kombiniert und dann in den NheI-BamHI-geschnittenen Transfervektor pBlueBacII (Invitrogen Corp., San Diego, CA) ligiert. Schließlich wurde ein rekombinantes baculovirus I-7 unter Verwendung von vorgeschriebenen Verfahren (Vakharia et al. (1993) "J. Gen. Virol.", 74: 1201–1206) erhalten. Siehe Tabelle 3.
Herstellung eines Inokulums für die Immunisierung
Spodoptera frugiperda SF9-Zellen, infiziert mit einer Multiplizität an 5 PFU pro Zelle mit dem I-7-rekombinanten baculovirus, wurden als Suspensionskulturen in Ein-Liter-Flaschen, enthaltend Hink's TNM-FH-Medium (JHR Biosciences, Lenxa, KS), angereichert mit 10% fötalem Kalbsserum, bei 28°C für 3 bis 4 Tage propagiert. Die infizierten Zellen wurden durch Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit zurückgewonnen, zweimal mit PBS gewaschen und in einem minimalen Volumen an PBS resuspendiert. Die Zellaufschlämmung wurde auf einem Eisbad dreimal für 1 min mit 2-min-Intervallen sonifiziert und durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geklärt. Ein Aliquot jedes Zelllysats wurde mit anti-IBDV-Mabs durch AC-ELISA getestet, um die anwesende antigene Masse einzuschätzen (Snyder et al. (1998b) "Avian Dis.", 32: 535–539). Die Präparationen mit der größten antigenen Masse wurden gepoolt und vergleichsweise in AC-ELISA gegen V-IBDV-7-1-rekombinanten baculovirus-IBDV-Impfstoff titriert, der in einer vorherigen Studie (Vakharia et al. (1993) "J. Gen. Virol.", 74: 1201–1206) verwendet wurde. Die antigene Masse der I-7-rekombinanten Präparation, wie bestimmt durch AC-ELISA mit gruppenspezifischem neutralisierenden Mab 8, wurde durch Verdünnung so angepasst, dass sie die gleiche war wie in dem V-IBDV-7-1-Impfstoff, und dann wurde sie mit einem gleichen Volumen an Freund's unvollständigem Adjuvans emulgiert und für die Inokulation verwendet.
Viren
Die Herausforderungsviren: Die klassischen Stämme IM und STC und variante Stämme E/Del und GLS-5 wurden von vorher bekannten Quellen bezogen (Snyder et al. (1988a) "Avian Dis.", 32: 527–534, Snyder et al. (1992) "Arch. Virol.", 127: 89–101). Nach einer intraokularen Instillation wurden die Herausforderungsviren in die Schleimbeutel von spezifischen pathogenfreien (SPF) Hühnern titriert (SPAFAS, Inc., Storrs, Conn.). Für die Stämme STC, E/Del und GLS-5 wurde eine 100-Hühner-infektive 50%-Dosis (100 CID₅₀) bestimmt, basierend auf den Schleimbeutel-zu-Körpergewicht-Messungen. Hundert letale Dosen (100 LD) des IM-Stammes wurden kalkuliert, basierend auf der Mortalität 8 Tage nach der Inokulation (PI).
Hühnerinokulationen und IBDV-Herausforderung
Weiße Leghorn SPF-Hühner wurden in HEPA-gefilterten Isolationseinheiten schlüpfen gelassen und aufgezogen (Monair Anderson, Peachtree City, GA). Acht Wochen alte Hühner wurden vorgeblutet, individuell flügelbeschnitten, in 10 Gruppen mit jeweils 15 Hühnern unterteilt und wie folgt behandelt. Hühner der Gruppen I–V erhielten keine Inokulationen und dienten entweder als negative oder positive Herausforderungskontrollen. Die Hühner der Gruppen V–X wurden intramuskulär mit 0,5 ml des 1-7-Inokulums, hergestellt oben aus rekombinanten Baculovirus-infizierten Zelllysaten, inokuliert. Nach 3 Wochen PI wurde allen Hühner Blut entnommen, und die Hühner der Gruppen II–IX wurden mit dem entsprechenden IBDV-Herausforderungsstamm durch okulare Instillation herausgefordert. Vier Tage nach der Herausforderung wurden 5 Hühner jeder Gruppe human geopfert und deren kloakaler Schleimbeutel wurde entfernt. Jeder Schleimbeutel wurde verarbeitet und anschließend hinsichtlich der Gegenwart von IBDV-Antigen durch AC-ELISA wie beschrieben evaluiert (Snyder et al. (1998b) "Avian Dis.", 32: 535–539). Zusätzlich wurden Hühner in den IM-herausgeforderten Gruppen als tot eingestuft und human geopfert, wenn sie offensichtlich aufgrund der IM-Herausforderung todgeweiht waren. Acht Tage nach der Infektion wurden die verbleibenden Hühner in allen Gruppen geopfert und gewogen. Der Schleimbeutel der Fabricius von jedem Huhn wurde vorsichtig ausgeschnitten und ebenso gewogen. Das Schleimbeutel-zu-Körpergewicht-Verhältnis wurde für jedes Huhn berechnet, wie durch Lucio und Hitchner (Lucio et al. (1979) "Avian Dis.", 23: 466–478) beschrieben. Jeder Wert für individuell herausgeforderte Hühner, der um mehr als zwei Standardabweichungseinheiten von dem Mittelwert der entsprechenden Kontrollgruppe abwich, wurde als positiver Indikator für die IBDV-Infektion bewertet. Geöffnete Schleimbeutel wurden durch Eintauchen in 10% neutrales gepuffertes Formalin fixiert. Transverse Portionen von Schleimbeuteln wurden durch gradierte Alkohole und Xylen prozessiert und in Paraffin eingebettet, sektioniert und mit Hämatoxylineosin gefärbt und durch ein Lichtmikroskop untersucht. Schutz gegen die Herausforderung wurde definiert als die Abwesenheit von irgendwelchen IBDV-induzierten Läsionen in dem Schleimbeutel von Fabricius.
Serologische Bewertung
Der klassische D78-Stamm sowie der Zellkultur-adaptierte variante GLS-Stamm von IBDV wurden in primären Hühnerembryofibroblastenzellen wachsen gelassen und in Virusneutralisierungs (VN)-Tests verwendet, um Seren aus den Impfstoffversuchen im Wesentlichen wie beschrieben (Snyder et al. (1988a) "Avian Dis.", 32: 527–534) zu testen. Serum aus den Versuchen wurde ebenso für die Gegenwart von anti-IBDV-Antikörpern unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen IBDV-Antikörper-ELISA-Kits (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) getestet.
Bewertung von Impfstoffen und Herausforderungsviren
Der antigene Gehalt des I-7-GLS-chimären IBDV-Impfstoffs wurde in AC-ELISA mit einer Auswahl an VP2- und VP3-spezifischen Mabs überprüft. Die relative antigene Masse jedes Epitops, das in dem I-7-Impfstoff exprimiert wurde, wurde mit vorher getesteten Chargen von in Baculovirus exprimierten nicht modifizierten GLS-Untereinheitsimpfstoffen verglichen (Vakharia et al. (1993) "J. Gen. Virol.", 74: 1201–1206). Der Status jedes Mab-definierten Epitops auf dem I-7-chimären Impfstoff wurde ebenso mit dem Status derjenigen Mab-definierten Epitope verglichen, die bei Wildtyp-IBDV-Herausforderungsviren auftreten, die verwendet werden, um die Wirksamkeit des I-7-Impfstoffs zu bewerten. Tabelle 3 zeigt, dass antigene Massenniveaus bei den 7-, 57- und B29-Epitopen für den gegenwärtigen I-7-chimären Impfstoff ähnlich zu einem vorher getesteten nicht modifizierten V-IBDV-7-1-GLS-Untereinheitsimpfstoff waren, aber ungefähr vierfach höher als der ursprünglich nicht modifizierte V-IBDV-7-Impfstoff.
Ein Hauptunterschied bei den nicht modifizierten und chimären Impfstoffen war das Erscheinen des klassischen B69-Epitops in dem chimären GLS-Produkt. Das Niveau des B69-Epitops wurde frei als 9 bestimmt, da kein Vergleich zu den nicht modifizierten GLS-Untereinheitsimpfstoffen gemacht werden konnte. Durch Vergleichen des Status von Mab-definierten Epitopen auf den Herausforderungsviren mit den nicht modifizierten und chimären GLS-Untereinheitsimpfstoffen (Tabelle 3) konnte herausgefunden werden, dass, während das chimäre Produkt das B69-Epitop exprimierte, das auf den klassischen STC- und IM-Herausforderungsviren gefunden wurde, es ebenso die gesamten homologen GLS-Epitope beibehielt.
Aktiver Kreuzschutz
Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse eines Kreuzschutzversuchs und serologische Resultate, die vor der Herausforderung erhalten wurden.
Die Gruppen II–V dienten als Herausforderungskontrollen und, wie durch AC-ELISA, Schleimbeutel-zu-Körpergewicht und histologische Herangehensweisen gezeigt, waren alle nicht geimpften Hühner vollständig empfänglich gegenüber einer virulenten IBDV-Herausforderung mit allen verwendeten Stämmen. Die IM-Herausforderung produzierte eine letale Erkrankung bei einem Drittel der Hühner der Kontrollgruppe. Im Gegensatz dazu wurden 8 Wochen alte Hühner, umfassend VI–IX, einmal mit dem GLS-chimären Impfstoff geimpft, und 3 Wochen PI waren alle geimpften Hühner vollständig gegenüber der Herausforderung durch alle Herausforderungsviren geschützt, einschließlich der letalen Erkrankung, die bei den Kontrollen durch den IM-Stamm produziert wurde. Serologische Titer der reziproken Kreuz-VN-Tests, die mit Seren vor der Herausforderung mit dem D78- und dem GLS-Gewebekulturvirus ausgeführt wurden, befanden sich im Wesentlichen innerhalb des Zweifachen voneinander. Die mittleren ELISA-Titer waren relativ niedrig, aber sie waren ebenso zwischen den geimpften Gruppen uniform.
Charakterisierung der Impfstoffe
In initialen Studien mit Baculovirus-exprimierten Untereinheits-GLS-Impfstoffen konnten die V-IBDV-7-GLS-Impfstoffe nach der Verabreichung von zwei Dosen (Tabelle 3) nur aktive Antikörperniveaus induzieren, die in der Lage waren, einen 79%igen Schutz gegen eine homologe GLS-Herausforderung zu produzieren (Vakharia et al. (1993) "J. Gen. Virol.", 74: 1201–1206). In einer anschließenden Studie wurde die antigene Masse des ursprünglichen V-IBDV-7-Impfstoffs ungefähr vierfach erhöht (berechnet nach dem gruppenspezifischen Mab-8-Ort) und initiierte Ein-Dosis- und Zwei-Dosis-Impfungskreuzherausforderungsversuche mit dem nicht modifizierten GLS-Untereinheitsimpfstoff, bezeichnet als V-IBDV-7-1 (Tabelle 3). Bei diesen Versuchen ergaben zwei Dosen des Impfstoffs einen vollständigen Kreuzschutz gegen virulente STC-, E/Del und GLS-Herausforderung. Jedoch wurde bei dem Ein-Impfstoffdosisversuch, während ein vollständiger Schutz gegen die Herausforderung mit varianten E/Del- und GLS-Viren erreicht wurde, nur 44% Schutz gegen die entfernter verwandten klassischen STC-Viren erzielt. Diese Studien könnten bedeuten, dass einfach durch Erhöhen der antigenen Masse und/oder der Dosis ein besserer Kreuzschutz erhalten werden könnte. Jedoch war es ebenso augenfällig in der Abwesenheit von homologen Impfstoffen, dass niedrige Niveaus an Antikörpern, induziert durch eine Dosis des GLS-V-IBDV-7-1-Untereinheitsimpfstoffs, nicht ausreichend kreuzschützend gegen eine klassische IBDV-Herausforderung waren. Dies könnte bedeuten, dass bei sogar niedrigeren Niveaus an Antikörpern, so wie in Fällen von abflauendem maternalem Antikörper, es wahrscheinlich wäre, dass Kreuzschutz sogar noch mehr reduziert wird. Tatsächlich war, auch wenn nicht mit dem STC-Virus herausgefordert, in einigen passiven maternalen Antikörperstudien, die unter Verwendung einer anderen Dosierung des V-IBDV-7-Impfstoffs ausgeführt wurden, während ein homologer GLS-Schutz gewährleistet wurde, die Nachkommenschaft der geimpften Hennen nur 57% gegen eine enger verwandte E/Del-Herausforderung geschützt.
Bei Einzeldosisimpfungskreuzherausforderungsversuchen wurde der chimäre GLS-I-7-Impfstoff, welcher das klassische B69-Neutralisierungsepitop enthielt, evaluiert. Um den gegenwärtigen Versuch mit den vorherigen Versuchen vergleichbar zu machen, wurde der I-7-Impfstoff so formuliert, dass durch AC-ELISA die relative antigene Masse des I-7-chimären Untereinheitsimpfstoff annähernd identisch zu dem nicht modifizierten V-IBDV-7-1-Impfstoff war, der vorher verwendet wurde (Tabelle 3). Tabelle 4 zeigt die Resultate der Kreuzherausforderung, nachdem eine einzelne Dosis des I-7-Impfstoffs verabreicht wurde. Die Resultate waren ähnlich zu denen, die mit dem nicht modifizierten V-IBDV-7-1-Impfstoff erhalten wurden, der vorher verwendet wurde, dahingehend, dass Schutz gegen die GLS- und E/Del-Stämme vollständig war. Jedoch ergab der I-7-Impfstoff einen vollständigen Schutz gegen pathogene und letale Herausforderung durch die klassischen STC- bzw. IM-Stämme. Da die antigene Masse der GLS- und der gruppengemeinen Epitope auf V-IBDV-7- und I-7-Impfstoffe sorgsam äquilibriert und gleich war, ist es vernünftig zu schließen, dass der vergleichsweise Anstieg in der Wirksamkeit des I-7-Impfstoffs gegen die Herausforderung mit klassischen IBDV-Stämmen einzig und allein in der Miteinbeziehung des klassischen IBDV-B69-Neutralisierungsepitops in die GLS-VP2-Proteinsequenz begründet lag.
VIRUSÄHNLICHE PARTIKEL
Wie oben bemerkt, können die rekombinante cDNA und die dadurch exprimierten Immunogene dieser Erfindung der VP2-immunogenen Region zugeschrieben werden. In anderen Worten kann es ausreichend sein, einen cDNA-Klon herzustellen, der für epitopische Determinanten für einen Basis-IBDV, z. B. GLS, ebenso wie eine zweite IBDV-epitopische Determinante, so wie D78, codiert. Andere epitopische Determinanten, alle in der VP2-epitopischen Determinantenregion, können mit einbezogen, kloniert und exprimiert werden, wie oben beschrieben.
Wie in 2 dargestellt, werden virusähnliche Partikel durch die Expression von DNA, die für die VP2-VF4-VP3-strukturellen Proteinsequenzen codiert, gebildet. Diese virusartigen Partikelimmunogene können von den entsprechenden nur-VP2-Immunogenen, sowohl in Bezug auf den monoklonalen Antikörper als auch durch konventionelle Trennmaßnahmen, so wie Elektrophorese und Chromatographie, getrennt werden. Der Unterschied in der Reaktivität mit monoklonalen Antikörpern zeigt jedoch an, dass Epitope, die in den VP2-VP4-VP3-strukturelle Proteinsequenz-induzierten virusartigen Partikeln vorhanden sind, nicht in Immunogenen vorhanden sind, die durch die identische nur-VP2-Region exprimiert werden. Diese Epitope sind "sowohl lineare als auch konformationale" Epitope. Konformationale Epitope unterscheiden sich von linearen Epitopen und sind in der Konformation, nicht nur in der Aminosäuresequenz des tatsächlichen Virus, widergespiegelt. Als ein Ergebnis kann die Inokulation von Geflügel mit einem rekombinanten virusartigen Partikel sogar besseren Schutz gegen eine Feldherausforderung von IBDV als eine Inokulation mit den Immunogenen der VP2-Region allein verleihen. Dies liegt an der spontanen Ansammlung aller strukturellen Elemente des Virus.
Die Anmelder haben herausgefunden, dass die Expression des VP2-Bereichs als Teil des VP2-VP4-VP3-strukturellen Proteineinzelsegments virusartige Partikel bildet, so wie diejenigen aus 2. Von diesen Partikeln wurde gezeigt, dass sie mit Antikörpern reagieren, welche nicht auf gleiche Weise mit dem identischen rekombinanten VP2-Immunogen reagieren. Daher können virusartige Partikel größere Antikörpertiter entstehen lassen und/oder subtil unterschiedlichen (breiteren) Schutz, wenn ein Geflügelwirt damit inokuliert wird.
Die Erfindung hierin umfasst daher (1) rekombinante VP2-Immunogene, umfassend epitopische Determinanten von wenigstens zwei unterschiedlichen IBDV-Stämmen und (2) virusartige Partikel aus VP2-VP4-VP3-Segmenten, wobei die VP2-Region wiederum epitopische Determinanten von wenigstens zwei unterschiedlichen IBDV-Stämmen umfasst, ebenso wie die Nucleotidsequenzen, die für sowohl 1 als auch 2 codieren, und Impfstoffe, die diese umfassen.
REKOMBINANTE EPITOPE DETERMINANTENKOMBINATIONEN
Wie in den hierüber ausgeführten Beispielen dargestellt, können genetische epitopische Determinanten für einen IBDV-Stamm in die VP2-Region einer unterschiedlichen Basis-IBDV-genetischen Sequenz eingefügt werden und anschließend verwendet werden, um ein Immunogen anzeigende Epitope für beide IBDV zu exprimieren. Tatsächlich demonstrieren die obigen Beispiele die Kombination von wenigstens drei unterschiedlichen IBDV-epitopischen Determinanten. Mehr können kombiniert werden. Die resultierenden Impfstoffe beinhalten ein aktives Mittel, das exprimierte Immunogen, welches Schutz gegen die Herausforderung von einem breiten Spektrum an IBDV zur Verfügung stellt, eher als virusbasierende Impfstoffe des Standes der Technik, welche Schutz gegen einen einzelnen Stamm oder eine einzelne Familie an Stämmen zur Verfügung stellen.
7 reflektiert die Aminosäureidentitäten für den Bereich der epitopischen Determinanten für sieben unterschiedliche IBDV. Diese sind nicht dafür vorgesehen, limitierend zu sein, aber sie sind repräsentativ. Wünschenswerte rekombinante Immunogene, sowohl VP2 allein als auch virusartige Partikel-VP2-VP4-VP3-Immunogene, werden durch Substituieren der genetischen epitopischen Determinanten für die variierenden Aminosäuren an den identifizierten Orten in 7 (Anordnungen, die nicht identifiziert sind, sind bei den IBDV-Stämmen konserviert) hergestellt. Diese induziert die Expression der erfinderischen Immunogene. Klar ist, dass die möglichen Kombinationen limitiert sind, auch wenn sie eine größere Anzahl aufweisen, und dass sie routinegemäß untersucht werden können. Repräsentative Kombinationen werden dazu tendieren, Kombinationen aus epitopischen Determinanten für dominante IBDV widerzuspiegeln.
Eine E/Del/GLS-Rekombinante kann Veränderungen in der E/Del-epitopischen Determinantenregion an Position 213 Asn-Asp, 253 Gln-His und 269 Thr-Ser enthalten.
Eine DS326/D78-Rekombinante kann die Aminosäure und entsprechende Nucleotidsubstitutionen an 76 Ser-Gly-, 249 Lys-Gln-, 253 Gln-His- und 270 Ala-Thr-Substitutionen enthalten:
Offensichtlich ist eine breite Vielfalt an Kombinationen möglich und wird Fachleuten einfallen. Die epitopische Determinantenregion, grob beinhaltend den Bereich von Aminosäure 5–433 der VP2-Region, stellt somit eine rekombinante "Kassette" dar, welche durch ortsspezifische Mutagenese so zugeschnitten werden kann, dass eine Aminosäureeinfügung und/oder -deletion erreicht wird, um gewünschte rekombinante cDNA-Klone, Polypeptide, virusähnliche Partikel und Impfstoffe mit verbessertem Schutz gegen eine breite Vielfalt an IBDV zu erzielen.
LETALE IBDV, MONOKLONALE ANTIKÖRPER und IMPFSTOFF DAFÜR
Wie bemerkt, bildet eine IBDV-Infektion typischerweise einen immunosuppressiven Zustand, der in Läsionen in dem Schleimbeutel von Fabricius widergespiegelt wird. Dies ist typisch für IBDV, die in den Vereinigten Staaten angetroffen werden. Es gibt jedoch letale IBDV, das heißt, IBDV-Infektionen, welche in einem Sterben der Hühner direkt als Ergebnis der IBDV- Infektion resultieren. Während Impfstoffe auf der Basis der Isolation dieser IBDV entwickelt wurden, sind die resultierenden Impfstoffe "heiß", das heißt, sie bilden selbst oder induzieren einen immunosuppressiven Zustand, und das inokulierte Huhn muss mit Antikörpern gegen andere infektiöse Mittel ausgestattet werden. Dieses Verfahren des Schutzes ist so nicht wünschenswert, so dass es in den meisten kommerziellen Geflügelhäusern in Europa nicht fortgeführt wird. Kein adäquater sicherer Impfstoff gegen das letale IBDV ist gegenwärtig erhältlich.
Die Erfinder haben einen monoklonalen Antikörper, Mab 21, entwickelt, der unter dem Budapest-Frieden bei der American Type Culture Collection, Zugangsnr. ATCC HB11566 hinterlegt wurde. Dieser monoklonale Antikörper ist spezifisch und für letale IBDV-Stämme neutralisierend. Die Spezifität wird in Tabelle 5 wiedergegeben, welche bestätigt, dass, anders als andere monoklonale Antikörper, Mab 21 spezifisch für ein Epitop ist, das nur durch IBDV-Stämme mit letalem Potential aufgezeigt wird.
Es sollte bemerkt werden, dass im Laufe dieser Patentanmeldung auf eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern Bezug genommen wurde, die verwendet werden, um die Gegenwart von Epitopen von unterschiedlichen IBDV bei den erfinderischen rekombinanten chimären Immunogenen der Anmeldung zu bestätigen. Diese monoklonalen Antikörper wurden ebenso unter dem Budapest-Frieden hinterlegt und sind frei erhältlich. Sie sind jedoch nicht nötig, um die Erfindung ausführen zu können, und daher stellen sie keinen Aspekt der Erfindung dar. Dies sollte mit Mab 21 kontrastiert werden.
Wie andere Mab, die durch die Erfinder hierin für IBDV entwickelt wurden, kann eine passive Immunisierung gegen IBDV-letale Stämme, die insbesondere entworfen wurden, um eine Immunisierung auf einem uniformen, standardisierten Niveau zu erzielen und um jegliche maternal abgeleitete Niveaus gegen letale IBDV-Feldinfektion zu verstärken, erhalten werden durch Impfen von 1 Tag alten Hühnern mit einem Impfstoff, der einen pharmakologisch akzeptablen Träger umfasst, so wie diejenigen, die oben beschrieben sind, in welchem eine Menge an Mab 21 vorhanden ist, die wirksam darin ist, einen erhöhten Schutz für die inokulierten Hühner zur Verfügung zu stellen.
Das erforderliche Niveau an Schutz kann durch eine einzelne Dosis des Impfstoffes, verabreicht in ova oder an ein 1 Tag altes Huhn, mit einer Mab-21-Konzentration von zwischen 1 μg und 1 mg oder durch wiederholte Impfungen mit kleineren effektiven Dosen, die mit der Zeit ausgeführt werden, verliehen werden. wenn wiederholte Impfungen verwendet werden, sollten die Dosierungsniveaus zwischen 1 μg und 1 mg rangieren. Das Konzentrationsniveau, das erforderlich ist, um ältere Hühner zu impfen, erhöht sich mit dem Gewicht des Vogels und kann empirisch bestimmt werden.
Eine weitere Untersuchung der Aminosäuresequenzen der letalen Stämme in der epitopischen Determinantenregion reflektiert die hochkonservierte 279-Identität Asn an Position 279 von VP2 in nicht-letalen Stämmen mit einer konservierten Asp-Identität an der gleichen Position in letalen Stämmen. Dementsprechend unterscheidet sich die epitopische Determinante des letalen Stammes, die durch Mab 21 erkannt wird und die einzigartig bei den letalen Stämmen ist, empirisch von nicht-letalem IBDV doch die Substitution 279 Asp-Asn. Entsprechend den Verfahren, die oben ausgeführt wurden, kann eine chimäres rekombinantes Immunogen, das einen wirksamen Schutz gegen letales IBDV verleiht, etwas, das bisher mit jeglichem Typ an Impfstoff ohne die Induktion eines immunosuppressiven Zustands nicht möglich war, durch Einfügen der genetischen epitopischen Determinante für 279 Asp in ein nicht-letales Basis-IBDV, so wie GLS, hergestellt werden. Dies wird Schutz gegen das Basis-IBDV, das letale IBDV, ebenso wie alle anderen IBDV verleihen, deren genetische epitopische Determinanten inseriert sind. Impfstoffe, die aus diesen Immunogenen hergestellt werden, ob VP2 allein oder in der Form von virusartigen Partikeln aus VP2-VP-VP3-Segmenten, werden auf dieselbe Art und Weise verwendet, wie oben erwähnt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Chimäres Polypeptid-Immunogen, das die VP-2-Aminosäuresequenz eines ersten Virus der infektiösen Bursitis (IBDV) oder Basis-IBDV-Stamms außer wenigstens einer Aminosäure X umfasst, wobei X eine epitopische Determinante aus einem zweiten IBDV-Stamm ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid-Immunogen Schutz vor einem Angriff bzw. einer Stimulation durch klassisches IBDV oder eine IBDV-Variante verleiht und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht: – einem chimären Polypeptid-Immunogen, wobei der Basis-IBDV-Stamm GLS IBDV ist und der zweite IBDV-Stamm D78 IBDV ist und wobei die epitopische Determinante aus dem zweiten IBDV-Stamm aus drei Aminosäuresubstitutionen in GLS IBDV in den Positionen 222, 249 und 254 von Thr durch Pro, Lys durch Gln und Ser durch Gly besteht; – einem chimären Polypeptid-Immunogen, wobei der Basis-IBDV-Stamm GLS IBDV ist und der zweite IBDV-Stamm E/Del IBDV ist und wobei die epitopische Determinante aus dem zweiten IBDV-Stamm aus fünf Aminosäuresubstitutionen in dem GLS IBDV in den Positionen 269, 284, 286, 321 und 323 von Ser durch Thr, Thr durch Ala, Thr durch Ile, Gly durch Asp, Glu durch Ala und Asp durch Glu besteht; – einem chimären Polypeptid-Immunogen, wobei der Basis-IBDV-Stamm GLS IBDV ist und der zweite IBDV-Stamm DS326 IBDV ist und wobei die epitopische Determinante aus dem zweiten IBDV- Stamm aus vier Aminosäuresubstitutionen in dem GLS IBDV in den Positionen 269, 284, 311 und 320 von Ser durch Thr, Thr durch Ala, Glu durch Lys und Gln durch Leu besteht; – einem chimären Polypeptid-Immunogen, wobei der Basis-IBDV-Stamm E/Del IBDV ist und der zweite IBDV-Stamm GLS IBDV ist und wobei die epitopische Determinante aus dem zweiten IBDV-Stamm aus drei Aminosäuresubstitutionen indem E/Del IBDV in den Positionen 213, 253 und 269 von Asn durch Asp, Gln durch His und Thr durch Ser besteht; – einem chimären Polypeptid-Immunogen, wobei der Basis-IBDV-Stamm DS326 IBDV ist und der zweite IBDV-Stamm D78 IBDV ist und wobei die epitopische Determinante aus dem zweiten IBDV-Stamm aus vier Aminosäuresubstitutionen in dem DS326 IBDV in den Positionen 76, 249, 253 und 270 von Ser durch Gly, Lys durch Gln, Gln durch His und Ala durch Thr besteht.
Vakzin, das Schutz gegen IBDV bei Geflügel verleiht, das ein chimäres Polypeptid-Immunogen nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Chimäre cDNA, die, wenn sie als heterologe DNA in die DNA eines Expressionswirts funktionell inseriert ist, für das Immunogen nach Anspruch 1 codiert.
Transfektionsvehikel für die Infektion eines Expressionswirts, das die cDNA nach Anspruch 3 umfasst, wie sie funktionell mit der DNA von Baculovirus-Geflügelpockenvirus, Puten-Herpesvirus oder Adenovirus verknüpft ist.
Expressionsvehikel für die Expression des Immunogens nach Anspruch 1, umfassend einen Expressionswirt, der aus der Gruppe bestehend aus SF9-Zellen, Hühnerembryofibroblastenzellen, Hühnerembryonierenzellen und Verozellen, die mit dem Vehikel nach Anspruch 4 transfiziert sind, ausgewählt ist.