CN100381565C - 表达典型和变异ibdv株系特异性的病毒中和表位的传染性法氏囊病病毒(ibdv)突变株 - Google Patents

表达典型和变异ibdv株系特异性的病毒中和表位的传染性法氏囊病病毒(ibdv)突变株 Download PDF

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Abstract

本发明提供了另外包含病毒中和表位67(变体-E IBDV特异性的)的典型IBDV突变株。

Description

表达典型和变异IBDV株系特异性的病毒中和表位的传染性法氏囊病病毒(IBDV)突变株
本发明涉及典型的传染性法氏囊病病毒(IBDV)突变株和包含这种典型的IBDV突变株的疫苗。
传染性法氏囊病病毒(IBDV)是双RNA病毒家族的成员。这个家族中的病毒具有非常相似的基因组结构和相似的复制周期。这些病毒的基因组由双链(ds)RNA的两个片段(A和B)组成。较大的片段A编码多蛋白，它被自体蛋白水解切割形成成熟病毒蛋白VP2、VP3和VP4。VP2和VP3是该病毒粒子的主要结构蛋白。VP2是双RNA病毒的主要宿主保护性免疫原，并含有对病毒中和抗体的诱导负责的免疫原性区域。
对于IBDV，存在两个血清型，血清型1和2。通过病毒中和(VN)试验可以区分这两个血清型。已经表明血清型1病毒对小鸡致病，而血清型2IBDV仅仅对火鸡引起亚急性疾病。传染性法氏囊病(IBD)，也称作Gumboro疾病，是小鸡中的急性、高传染性病毒感染，以淋巴组织作为它的主要目标，对于腔上囊细胞具有选择向性。易感群中的发病率高，重量减轻迅速和死亡率中度至高度。由于腔上囊的破坏，由该疾病痊愈的小鸡可能具有免疫缺陷，腔上囊对小鸡的防御机制必不可少。IBD病毒对比3周龄年幼的小鸡引起严重的免疫抑制并对直至3月龄的小鸡诱导囊的损害。
多年来，通过给已经接触过减毒活IBDV疫苗的小鸡应用灭活疫苗，在种鸡群中诱导高水平抗体可以预防该疾病。这使由IBD引起的经济损失保持在最低。来源于接种过的种畜的小鸡中的母体抗体预防IBDV的早期感染并减少与免疫抑制相关的问题。此外，在母体抗体下降后，减毒活疫苗也已成功用于商品化小鸡群。
历史上，IBD病毒仅由一个类型组成，已知是″典型的″IBD病毒。然而，在19世纪80年代中期，在用基于典型IBDV的疫苗接种过的群中观察到急性疾病，特别是在美国。据发现这个疾病是由具有不同免疫原性组成的IBD病毒引起的。这些新病毒大概是由于遗传漂变的结果而出现的。这些所谓的“变异”IBDV株系的出现需要设计新的IBD接种程序，因为典型的IBDV疫苗株不能诱导足够的交叉保护。过去鉴定的血清型1IBDVs的最重要突变株亚型是Delaware-E、GLS、RS/593和DS326突变株。病毒中和试验、单克隆抗体板或RT-PCR可以鉴定变异株系并与典型株系区分开来。
Rosenberger等人(Proc.20thNatl.Meet.on Poultry Health andCondemnations；Ocean City，MD，USA，94-101，1985)和Snyder等人(Avian Diseases 32，535-539，1985)报道了Delaware变体-E。1987年在美国分离了GLS病毒和1988年在美国分离了DS326(GLS样)(Snyder等人，Arch.Virol.127，89-101，1992和van Loon等人Proceedings of the International symposium on infectious bursaldisease and chicken infectious anaemia，Rauischholzhausen，Germany，179-187，1994)。1993年，在美国也分离了株系RS/593(变体-E样)(Snyder等人Proceedings of the International symposiumon infectious bursal disease and chicken infectiousanaemia，Rauischholzhausen，Germany，65-70，1994)。
在本领域中，抗原捕获酶免疫试验(AC-ELISA)中通常使用病毒中和单克隆抗体(moab)板鉴定各种IBDV类型。下表1总结了这些moabs与存在的IBDV株系的反应模式。
表1：moab板模式确定的不同变异I BDV株系
  株系↓/moab→  8   B69   R63   10   BK9   67   57   44A1   179
  典型的  +   +   +   +   -   -   -   +   +
  Delaware突变株(-E)  +   -   +   -   +   +   -   +   +
  RS/593  +   -   -   -   -   +   -   -   +
  GLS  +   -   -   +   -   -   +   +   +
  DS 326  +   -   -   +   -   -   +   +   -
VN moabs R63和B69中和典型IBDV株系至高滴度和moab B69特异性与典型株系结合。moab BK9独一结合Delaware变体-E株系。moab57引起的阳性反应可用于将GLS和DS 326株系与典型的和Delaware变异株系分离开来。这些及其它moabs通常通过确定可利用的moabs板的反应模式，用于IBDV(突变株)株系之间区分的领域。分泌moabs的杂交瘤也可以从ATCC(Rochville，美国)获得，具有下列保藏号：R63(HB-9490)、8(HB-10174)、B29(HB-9746)、BK-9(HB-10157)、67(HB-11122)、57(HB-10156)、B69(HB-9437)和179(HB-10158)。变异IBDV株系和杂交瘤也可以从法国巴黎Collection Nationale deCul tures de Microorganismes of the Institute Pasteur获得，具有下列保藏号：DS 326(I-910)、GLS(I-792和I-793)和moab10(I-2812)。
尽管已经提出IBDV VP2蛋白内的一些区域和不同氨基酸对IBDV株系之间抗原性变异的重要性(Vakharia等人，Virus Research 31，265-273，1994和Snyder等人，Avian Diseases 38，701-707，1994)，但是尚未确定所有氨基酸对于IBDV中和表位形成的强制存在。VirusReaearch 49，131-137，1997，Vakharia等报道了变体-E IBDV中存在氨基酸脯氨酸。在国际专利申请WO 95/26196Vakharia等提示了在变体-E VP2蛋白与moab 67的结合中氨基酸286(IIe)、318(Asp)和323(Glu)的参与。此外，公开了IBDV典型VP2蛋白和变异VP2之间的多个氨基酸序列差异。认为222(Pro)、249(Gln)和254(Gly)位氨基酸与GLS VP2蛋白中B69表位的形成相关。
EP1170302(Akzo Nobel N.V.)公开了比IBDV株系的免疫原性提高的变体-E IBDV突变株的制备。这个IBDV突变株是通过在变体-E VP2编码区的氨基酸253(Gln至His)、284(Ala至Thr)和254(Ser至Gly)、270(Ala至Thr)的密码子中引入突变获得的。
然而，其中没有公开允许表达变体-E病毒中和表位的典型IBDV突变株产生的信息。这种突变株将在疫苗中非常有效诱发抗本领域中典型和变异IBDV株系所引起疾病的保护。
在本发明中，已经基于典型IBDV构建了新的IBDV突变株，通过在VP2编码区中引入突变，使得病毒表达的VP2蛋白包含变异IBDVs典型的病毒中和表位67。
本发明人发现在典型VP2蛋白的范围内，与moab 67的反应性受分开相隔大约100个氨基酸的氨基酸序列的影响。此外，Vakharia等作出的假设(即286(IIe)、318(Asp)和323(Glu)影响67表位的存在是不正确的。事实上，本发明人已经发现典型IBDV VP2蛋白范围中67表位的出现取决于222位脯氨酸变为丝氨酸或苏氨酸和318-322位某些氨基酸序列的存在。在典型IBDV VP2蛋白318-323位天然存在的氨基酸序列(Gly-Gly-Gln-Ala-Gly-Asp)存在下，222位脯氨酸变为丝氨酸或苏氨酸导致典型IBDV VP2蛋白中67表位的出现。
因此，本发明提供了表达与单克隆抗体(moab)B69结合的VP2蛋白的典型传染性法氏囊病病毒突变株，其特征在于VP2蛋白也分别与保藏在美国Rockville ATCC的杂交瘤细胞系HB-9437和HB-11122分泌的moab 67结合。
IBDV VP2蛋白由512个氨基酸组成并位于多蛋白的1-512位氨基酸上。已经确定了许多典型IBDV株系的VP2编码区的核苷酸序列(包含完整A片段)和相应的VP2蛋白的氨基酸序列(对于D78，US5,871,744、EP 887,412；NCBI GeneBank)。
显示病毒中和性质的所有已知moabs，包括典型IBDV株系特异性的moab B69，专门抗VP2蛋白和识别构象依赖性表位。Vakharia等(1994，同上)和Heine等(J.Gen.Virol.72，1835-1843，1991)中公开了许多典型和变异VP2氨基酸序列的比较，尤其是变体-E和GLS。尽管病毒株当中存在生物变异，在典型类型IBDV株系内，VP2蛋白的氨基酸序列强烈保守。在蛋白全长中，典型VP2氨基酸序列之间的氨基酸同源性在98％-99.4％之间变化(以与IBDV株系D78的VP2氨基酸序列比较为基础)。鉴定了含有VP2最大可变部分的VP2蛋白内的中部区域。这个区域位于206至350位氨基酸(Bayliss等人，J.Gen.Virol.71，1303-1312，1987)和这个区域内典型VP2氨基酸序列之间的氨基酸同源性在95.9％-97.9％之间变化(以与IBDV株系D78的VP2氨基酸序列比较为基础)。在这个中部区域内鉴定了两个高变区，在212-224和314-326位，其中发生不同类型IBDV株系之间大多数氨基酸的改变(Vakharia等人，1994，前述)。尽管如此，大多数典型IBDV株系在200-230区域包含与IBDV株系D78的VP2中的序列相同的氨基酸序列：Ser-Asp-Arg-Pro-Arg-Val-Tyr-Thr-Ile-Thr-Ala-Ala-Asp-Asp-Tyr-Gln-Phe-Ser-Ser-Gln-Tyr-Gln-Pro-Gly-Gly-Val-Thr-Ile-Thr-Leu-Phe(SEQ ID no.19)。这里用Wisconsin Package，version8(Genetics Computer Group，Madison，Wis.)分析序列。
因此，典型IBDV这里定义为包含表达能够与moab B69结合的VP2蛋白的VP2编码区的分离的IBDV。
更特别地，典型IBDV定义为包含与D78株系相同的200-230位的VP2氨基酸序列(SEQ ID no.19)的分离的IBDV。
可以通过为此目的本领域常用的AC-ELISA测定moab与IBDV的反应，如Snyder等(1992，同上)和van derMarel等(Dtsch.Tierartzl.Wschr.97，81-83，1990)描述。
或者，还可以通过如实施例1所述的免疫荧光试验来测定IBDV与moab的反应。
优选的根据本发明的典型IBDV突变株表达VP2蛋白，该蛋白除与moab B69和moab 67结合之外，还与保藏在美国Rockville ATCC的杂交瘤细胞系HB-9490分泌的moab R63结合。moab R63能够中和IBDV的典型和变体-E株系。
本发明首次鉴定了典型VP2蛋白范围中(i)与moab R63(典型和变体-E)结合的中和表位的形成、(ii)与moab 67(变体-E)结合的中和表位的另外形成和(iii)与moab 57(GLS)结合的中和表位的另外形成所需要和足够的氨基酸残基。
本发明人通过在典型IBDV株系的VP2编码区中引入突变制备了很多如上定义的IBDV突变株(实施例1)。获得的结果证明不同的氨基酸序列可以折叠成相同的表位，而其它氨基酸序列不能产生变异表位。因此，特异表位存在特异编码能力。表2列出了67、57和R63表位适当折叠所需的相关氨基酸序列的总结(分别是SEQ ID No.1-5、6-9和10-18)。表2提供了信息允许技术人员制出能够表达除病毒中和表位B69之外还包含对于变体-E IBDV株系特异性的病毒中和表位67的VP2蛋白的典型IBDV突变株。
表2：对表位折叠不可缺少的氨基酸的总结
  表位   氨基酸222   氨基酸318   氨基酸319   氨基酸320   氨基酸321   氨基酸322   氨基酸323   氨基酸330   SEQ ID no.(318-323)
  67   S或T   G   G   Q   A   G   D   R或S   1
  67   S或T   G   G   Q   A   G   E   R或S   2
  67   S或T   D   G   Q   A   G   D   R或S   3
  67   S或T   D   G   Q   A   G   E   R或S   4
  67   S或T   N   G   Q   A   G   E   R或S   5
  57   P、S或T   G   G   Q   E   G   D   R或S   6
  57   P、S或T   D   G   Q   E   G   D   R   7
  57   P、S或T   N   G   Q   E   G   D   R   8
  57   P、S或T   N   G   Q   E   G   E   R   9
  R63   P、S或T   G   G   Q   A   G   D   R或S   10
  R63   P、S或T   G   G   Q   A   G   E   R或S   11
  R63   P、S或T   D   G   Q   A   G   D   R或S   12
  R63   P、S或T   D   G   Q   A   G   E   R或S   13
  R63   P、S或T   D   G   Q   E   G   D   S   14
  R63   P、S或T   N   G   Q   A   G   D   R或S   15
  R63   P、S或T   N   G   Q   A   G   E   R或S   16
  R63   P、S或T   N   G   Q   E   G   D   S   17
  R63   P、S或T   N   G   Q   E   G   E   S   18
因此，特别优选的典型IBDV突变株是这样的突变株，该突变株与moab B69和moab 67结合，并包含典型VP2编码区中的一个或多个突变，使得该编码区包含(i)222位氨基酸编码丝氨酸或苏氨酸的密码子，和(ii)编码SEQ ID.no.1-5任何一个的318-323位所示氨基酸序列的核苷酸序列。
据发现如表2所示318-323位氨基酸序列仅在222位氨基酸(脯氨酸)变为丝氨酸或苏氨酸的情况下引起67表位的正确折叠，暗示表位的正确折叠受分开相隔100个位点的氨基酸的影响。
尽管330位的氨基酸不是关键的，但是有益的IBDV突变株进一步包含编码这个位置的氨基酸精氨酸或丝氨酸的密码子。
如上定义的典型IBDV突变株的更多有益性质是这种突变株，它还表达具有R63病毒中和表位正确折叠所需的氨基酸序列的VP2蛋白。表2和实施例1证明了表达(222位为丝氨酸或苏氨酸)具有如SEQ IDno.14-15和17-18任何一个所示的318-323位氨基酸序列的VP2蛋白的IBDV显示表位R63，但不能显示表位67。
本发明人作出的更多惊奇观察结果是典型IBDV株系的VP2编码区的318-323位氨基酸的交换导致这种突变株的生长性能降低。这种突变株显示对小鸡减毒的表型并可以有利地用作安全特性提高的疫苗候选物，尤其是在通过蛋途径(in ovo route)施用的疫苗中。因此，本发明还提供了包含典型VP2编码区中的一个或多个突变的典型I BDV突变株，这样使得编码区包含编码不同于天然氨基酸序列G1y-G1y-G1n-Ala-Gly-Asp(SEQ ID no.1)的318-323位氨基酸序列的核苷酸序列。优选，这些典型IBDV突变株包含如SEQ ID No.2-9和11-18中任何一个所示的这些位置的氨基酸序列，任选，和如上定义的222位和/或330位氨基酸。
根据本发明的典型IBDV突变株可以通过在来源于可由野外分离的或用于疫苗的任何典型IBDV株系的VP2编码区引入需要的突变来制备。合适的IBDV株系包括市场上可买到的疫苗中存在的熟知IBDV株系，如D78、PBG98、228E和89-03(Intervet Interntional B.V.)。IBDV株系D78(美国专利4,530,831)也可以从ATCC保藏号VR-2041获得。美国专利5,871,744和欧洲申请887,412中公开了D78株系的完整片段A的核苷酸序列(包括VP2编码区)和相应(多)蛋白的氨基酸序列。
尤其是，提供了包含IBDV株系D78的VP2编码区中的一个或多个突变的典型IBDV突变株。
更优选的根据本发明的典型IBDV突变株包含典型IBDV株系片段A的完整基因主链，包括如上所述的突变的典型VP2编码区。更特别地，如上定义的典型IBDV突变株来源于IBDV株系D78。
然而，根据本发明的典型IBDV突变株还可以基于变异IBDV株系的基因主链，如变体-E或GLS株系。在这种“嵌合的”典型IBDV突变株中，变异IBDV株系片段A的基因主链上的VP2编码序列被另外包含负责典型IBDV突变株上新变异表位的期望突变的相应相关典型VP2编码序列取代。
根据本发明的典型IBDV突变株的生产可以通过最近建立的IBDV的传染性cRNA系统完成(Mundt和Vakharia，Proc.Matl.Acad.Sci.USA93，11131-11136，1996)。这个反向基因系统提供了在IBDV的RNA基因组中引入突变的可能性。这个反向基因系统中最重要的步骤是提供IBDV的片段A和B的全长cDNA克隆，包括这两个片段的5′和3′末端核苷酸。克隆步骤后，片段A和B的全长序列可操作性连接能够结合DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，如T7、SP6或T3聚合酶，优选T7启动子。DNA依赖性聚合酶能够分别从片段A和B的全长cDNA克隆描绘病毒cRNA。这个cRNA能够诱导病毒复制和有活力病毒的分离。可以对每个天然存在的IBDV实施这个步骤。
已经描述了各种IBDV株系的反向基因系统，如D78(Yao等人，J.Virol.72，2647-2657，1998)、株系HK46(Lim等人，J.Virol.73，2854-2862，1999)、CEF 94(Boot等人，Virology 265，330-341，1999)和uK661(van Loon等人，J.Gen.Virol.83，121-129，2002)。
通过为此目的的本领域通常已知方法可以将期望突变引入IBDV基因组。特别地，通过定点诱变引入突变。这里描述了在IBDV基因组中引入突变的方法，但这些方法在本领域也通常使用(Mundt和Vakharia，1996，前述；Yao等人，J.Virology 72，2647-2654，1998；Mundt等人，1999，同上；欧洲专利申请1170302；CurrentProtocols in Molecular Biology，eds.：F.M.Ausubel等人，WileyN.Y.，1995编辑，pages 8.5.1.-8.5.9.和Kunkel等人Methodsin Enzymology vol.154，376-382，1987)。
这里为表示氨基酸位置使用的编号是指本领域中通常使用的IBDV多蛋白中氨基酸的编号方式。表示核苷酸位置的编号以Mundt和Müller描述的IBDV基因组片段A的完整核苷酸序列为基准(J.Gen.Virol.77，437-443，1995；NCBI登记号X84034)。
根据本发明的典型IBDV突变株的片段B可以来源于任何IBDV株系，优选来自典型IBDV株系，最优选来自D78或P2株系(美国专利5,871,744和EP专利申请887412)。
如实施例中证明，根据本发明的典型IBDV突变株显示出以前在典型IBDV株系未观察到的免疫原性组成。新的典型IBDV突变株可以形成可有效保护家禽抵抗由典型和变异IBDV株系感染引起的疾病病症的新型IBDV疫苗的基础。因此，这个发明的另一个方面是用于保护家禽抵抗由IBDV感染引起的疾病的疫苗，其特征在于该疫苗包含如上定义的典型IBDV突变株和药物可接受载体或稀释剂。
典型IBDV突变株可以作为减毒活病毒或灭活病毒合并入疫苗。
可以用常规方法制备根据本发明的疫苗，例如通常用于市场上可买到的活和灭活IBDV疫苗的方法。简言之，给易感基质接种根据本发明的典型IBDV突变株并繁殖直至病毒复制至期望传染性滴度，其后收获含有IBDV的原料，任选灭活，并与药物可接受载体或稀释剂混合。
能够支持IBDVs复制的每种基质可用于制备根据本发明的疫苗，包括原代(鸟类)细胞培养物，如鸡胚成纤维细胞(CEF)或鸡胚肝细胞(CEL)，哺乳动物细胞系如VERO细胞系或BGM-70细胞系，或鸟类细胞系如QT-35、QM-7或LMH。通常，细胞接种后，病毒繁殖3-14天，其后收获细胞培养上清液，并且如果期望，为除去细胞碎片进行过滤或离心。
典型IBDV突变株还可以在含胚鸡蛋中繁殖。
如果期望，可以通过病毒在细胞培养物中标准连续传代完成典型IBDV的减毒，例如在原代细胞培养物或上述已建立的细胞系中(Bayyari等人，Avian Diseases40，516-532，1996；Tsai等人，Aviandiseases 36，415-422，1992)。
或者，典型IBDV可以在感染小鸡体内繁殖，继之从这些感染动物中分离腔上囊，将它与稀释剂混合并使混合物均匀。用这种方法繁殖的IBDV通常形成灭活疫苗的基础。
可以制备含有活病毒的根据本发明的疫苗并以悬浮液形式或冻干形式销售，并且另外含有通常用于这种组合物的药物可接受载体或稀释剂。载体包括稳定剂、防腐剂和缓冲液。合适的稳定剂是例如SPGA、碳水化合物(如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、谷氨酸或葡萄糖)、蛋白(如奶粉血清、白蛋白或酪蛋白)或其降解产物。
合适的缓冲液是例如碱金属磷酸盐。合适的防腐剂是硫汞撒(thimerosal)、硫柳汞和庆大霉素。稀释剂包括水、含水缓冲液(如缓冲盐水)、醇类和多元醇(如甘油)。
如果期望，根据本发明的活疫苗可以含有佐剂。
具有佐剂活性的合适化合物和组合物的实例与以下提及的相同。
尽管可能通过注射，如肌内注射、皮下或蛋内施用根据本发明的活疫苗，但是优选通过通常用于IBDV接种疫苗的廉价集体应用途径施用疫苗。对于IBDV接种疫苗，这个途径包括饮用水、喷雾和气雾接种疫苗。
或者，本发明提供了包含灭活(杀死)形式的变异IBDV的疫苗。灭活IBDV疫苗的优点是可以获得的高水平长期的保护性抗体。
繁殖步骤后灭活收获病毒的目的是清除病毒复制。通常，这可以通过本领域熟知的化学或物理方法实现。
含有灭活变异IBDV的疫苗可以包含例如适于这个目的的一个或多个上述药物可接受载体或稀释剂。
优选，根据本发明的灭活疫苗包含具有佐剂活性的一个或多个化合物。为此目的的合适化合物或组合物包括氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、基于例如矿物油，如Bayol F或Marcol 52，或植物油如维生素E醋酸和皂苷的水包油或油包水乳剂。
根据本发明的疫苗包含有效剂量的典型IBDV突变株作为活性成分，即在接种鸟中诱导抗有毒力病毒挑战的免疫性的免疫IBDV物质的量。这里免疫性定义为接种疫苗后，与未接种疫苗组相比，在鸟群中诱导显著高水平的保护。
典型地，根据本发明的活疫苗可以以每只动物100-109TCID50的剂量施用，优选每只动物在103-106TCID50的剂量范围内。灭活疫苗可以含有每只动物106-1010TCID50的抗原当量。
灭活疫苗通常经胃肠外施用，如肌内注射或皮下。
尽管根据本发明的IBDV疫苗可以在小鸡中有效使用，但该疫苗也可以成功接种其它家禽，如火鸡、珍珠鸡和鹌鹑。小鸡包括童子鸡(broiler)、小母鸡、繁殖牲畜(reproduction stock)和产蛋牲畜(laying stock)。
接受根据本发明的活或灭活疫苗的动物的年龄与接受常规活或灭活IBDV疫苗的动物年龄相同。例如，童子鸡(不含来自母体的抗体-MDA)可以在一日龄或蛋中接种，而具有高水平MDA的童子鸡优选在2-3周龄接种。具有低水平MDA的产蛋牲畜或繁殖牲畜可以在1-10日龄接种，随后在6-12和16-20周龄用灭活疫苗加强接种。
本发明也包括除上述典型IBDV突变株之外，还包含对家禽有传染性的其它病原体的一个或多个疫苗组分的组合疫苗。
优选，组合疫苗另外包含禽疱疹病毒1型(MDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、卵降综合征(egg drop syndrome，EDS)病毒、火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)或呼肠孤病毒中的一个或多个疫苗株系。
实施例
实施例1
典型IBDV突变株的制备和单克隆抗体反应的测定
材料和方法
突变片段A的产生
对于定点诱变实验，使用pD78A(Mundt和Vakharia，前述，1996；欧洲申请887412)。为此目的，EcoRl/Kpnl切割pD78A，含有片段A的片段连接到适当切割的pBlueScript KS+，获得pSK+-D78A。制备单链DNA后，根据Kunkel等(前述，1987)进行定点诱变实验，使用表3中具体的寡核苷酸。使用寡核苷酸Mut1、Mut2、Mut3、Mut4、Mut5、Mut6、Mut7、Mut8、Mut9、Mut10、Mut11分别产生突变质粒pMut1、pMut2、pMut3、pMut4、pMut5、pMut6、pMut7、pMut8、pMut9、pMut10和pMut11。使用这十一个突变质粒，制备单链DNA，并在定点诱变实验中与pSK+-D78A的单链DNA一起使用。在一个实验中用一个(P222S或R339S)或两个寡核苷酸(P222S和R339S)进行这些实验，获得一个或两个碱基三联密码子的交换。对获得的诱变质粒(表4显示)进行测序并用于进一步的实验。
cRNA的转染、免疫荧光试验和所产生病毒的传代
对于体外转录，通过BsrG I切割使含有pD78A的质粒和诱变质粒线性化。使用Pst1线性化pP2B(Mundt & Vakharia，前述，1996；欧洲申请887412)。如Mundt所述进行线性化DNA的更多处理、RNA转录和转染入BHK 21细胞(J.Gen.Virol.80，2067-2076，1999)。对于免疫荧光试验，转染在24孔组织培养皿中生长的BHK21细胞，转染24小时后，丙酮/甲醇(50％/50％)固定5分钟并干燥。固定细胞分别与单克隆抗体67、B69、57、R63和兔抗I BDV血清培养(Mundt等人，J.Gen.Virol.76，437-443，1995)，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释30分钟并用PBS短暂漂清。现在细胞在PBS稀释的DTAF偶合山羊抗兔IgG或DTAF偶合山羊抗小鼠IgG(Dianova，Hamburg，Germany)中培养30分钟，随后用PBS洗涤三次并用蒸馏水洗涤一次。空气干燥后，细胞置于含有PBS和90％甘油的2.5％1.4.-重氮二环(2.2.2.)-辛烷(DABCO，Sigma，Deisenhofen，Germany)中。使用浸渍荧光显微镜目测荧光。对于所产生病毒的传代，在转染实验中，以24孔组织培养皿并行转染6孔组织培养皿中生长的BHK21细胞，并培养24小时-48小时。在-70℃冻/融至少一小时后，所得上清以6400x g离心10分钟并在25m2组织培养瓶中生长的QM细胞上传代，直到CPE可见。如上获得上清，等分并保存在-70℃。对于活力和与mmAb的反应性存在的分析，用一个等份感染在24孔组织培养皿中生长的QM细胞并培养24小时。如上所述进行免疫荧光试验。
细胞培养中产生的病毒的生长分析
为了监测生长，在37℃，用选择的IBDV以MOI为1感染在24孔组织培养皿中生长的CEC1小时。之后，移出接种物，用培养基洗涤细胞并添加1ml培养基。立即(0小时)、37℃培养后8、12、16、24和36小时后分开收集上清，并保存在-70℃。使用在96孔组织培养皿中生长的QM细胞(鹌鹑肌肉细胞)测定TCID50来获得病毒滴度。为此目的，融解上清并以log10梯次滴定。每100μl适当稀释液用吸移入组织培养皿的四个孔中，随后添加100μl QM细胞悬液(106个细胞/ml)。在37℃孵育皿。五天后，含有CPE的孔计算为阳性并遵循Spaerman(Birt.J.Psychol.，2，227-242，1908)和Karber(Arch.Exp.Path.Pharmak.，162，480-487，1931)测定TCID50。计算三次独立实验的平均值和标准差。
结果
VP2可变区中氨基酸的交换对单克隆抗体的反应性的影响
在不同组合中(见表4)，位于D78株系序列中的222(脯氨酸)、318(甘氨酸)、321(丙氨酸)和323(天冬氨酸)位氨基酸分别交换为氨基酸丝氨酸、苏氨酸(P222S、P222T)、天冬氨酸、天冬酰胺(G318D、G318N、谷氨酸(A321E)，和谷氨酸(D323E)。如果从318位至323位氨基酸的氨基酸序列是下列组合，则222位脯氨酸交换为丝氨酸引起moab 67的额外反应性：GGQAGD、DGQAGD、DGQAGE、GGQAGE、NGQAGE。318至323位氨基酸序列的其余组合(DGQEGD、DGQEGE、GGQEGD、GGQEGE、NGQAGD、NGQEGD、NGQEGE)看来阻碍moab 67特征性表位折叠，即使222位脯氨酸交换为丝氨酸。不依靠222(脯氨酸)、318(甘氨酸)和323(天冬氨酸)位氨基酸，321位氨基酸从丙氨酸交换为谷氨酸后，检测到了moab57的结合。但是330位精氨酸交换为丝氨酸影响57表位的存在。这里如果进行的交换(R330S)分别是在DGQEGD、NGQEGD、NGQEGE组合存在下进行的，共转染实验后检测到与moab57无反应。相比之下，在GGQEGD组合存在下，R330S交换显示对与moab 57的反应性无影响。在进行的实验中moab 57和R63的反应性的存在是彼此排斥的，因为如果57表位存在，则R63表位缺乏。
此外，不依赖222位氨基酸(脯氨酸)或330位氨基酸(精氨酸)是否被交换，使用编码VP2区中位于318至323位GGQAGD、DGQAGD、DGQAGE、GGQAGE、NGQAGD和NGQAGE组合的质粒，记录了共转染后与moab R63的反应性。编码多蛋白基因的318至323位的氨基酸序列DGQEGE或GGQEGE的质粒的cRNA的翻译蛋白仅仅与moab 69反应。这里氨基酸222和/或330的交换看来也对反应性无影响。所有转染实验后，冻/融细胞并传代获得的上清。在每种情况下产生了有活力病毒，表明进行的诱变氨基酸对病毒的细胞培养物的活力和传染性没有影响。
细胞培养中生长的分析
为测试氨基酸交换是否影响突变病毒的生长，分析了几个突变IBDV(D78、Mut1、Mut2、PS-D78、PS-Mut1、PS-Mut2、Mut10、Mut11)。为此目的，从产生的IBDV中选择含有与使用的moab组相同反应性模式的IBDV。如图所示，病毒生长受某些区域氨基酸交换的影响。222位氨基酸从脯氨酸交换为丝氨酸显示对细胞培养物中生长无影响。相比之下，318至323位氨基酸区域中的交换影响研究的突变株的生长。在所研究的所有时间点，这些突变株生长至较低滴度表明318位氨基酸至323位氨基酸的区域对于细胞培养物中的生长很重要。
表3：定点诱变中使用的寡核苷酸
  序列   方向   位置   氨基酸交换   名称   SEQ IDNo.
  GACCATGACATCTGATCCCCTGCCTGACCgtCACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   G318D   Mut1   20
  GACCATGACATCTGtTCCCCTGCCTGACCgtCACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   G318DD323E   Mut2   21
  GACCATGACATCTGATCCCCTtCCTGACCgtCACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   G318DA321E   Mut3   22
  GACCATGACATCTGtTCCCCTtCCTGACCgtCACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   G318DA321ED323E   Mut4   23
  GACCATGACATCTGtTCCCCTGCCTGACCACCACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   D323E   Mut5   24
  GACCATGACATCTGATCCCCTtCCTGACCACCACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   A321E   Mut6   25
  GACCATGACATCTGtTCCCCTtCCTGACCACCACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   A321ED323E   Mut7   26
  GACCATGACATCTGATCCCCTGCCTGACCgttACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   G318N   Mut8   27
  GACCATGACATCTGtTCCCCTGCCTGACCgttACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   G318ND323E   Mut9   28
  GACCATGACATCTGATCCCCTtCCTGACCgttACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   G318NA321E   Mut10   29
  GACCATGACATCTGtTCCCCTtCCTGACCgttACTTTTGGAGGTC   反义   1069-1113   G318NA321ED323E   Mut11   30
  ATTGTTACCCCACCGGTTtGgTACTGTGATGAGAATTGG   反义   772-810   P222T   P222T   31
  GATTGTTACCCCACCgctTTGGTACTGTGA   反义   782-811   P222S   P222S   32
  GTCACTGCTAGGCTCCCagaTGCCGACCATGACATC   反义   1102-1137   R330S   R330S   33
表4：定点诱变、转染实验和免疫荧光试验结果
  寡核苷酸<sup>a</sup>   质粒<sup>b</sup>   氨基酸<sup>c</sup>序列   57   R63   67   B69   有活力的   SEQ IDNo.
  pD78A   GGQAGD   -   +   -   +   +   1
  P222S   pD78A-P222S   GGQAGD   -   +   +   +   +   1
  P222T   pD78A-222T   GGQAGD   1
  R330S   pD78A-R330S   GGQAGD   -   +   -   +   +   1
  P222S，R330S   pD78A-P222S-R330S   GGQAGD   -   +   +   +   +   1
  Mut1   pMut1   DGQAGD   -   +   -   +   +   3
  Mut1，P222S   pMut1-P222S   DGQAGD   -   +   +   +   +   3
  Mut1，R330S   pMut1-R330S   DGQAGD   -   +   -   +   +   3
  Mut1，P222S，R330S   pMut1-P222S-R330S   DGQAGD   -   +   +   +   +   3
  Mut2   pMut2   DGQAGE   -   +   -   +   +   4
  Mut2，P222S   pMut2-P222S   DGQAGE   -   +   +   +   +   4
  Mut2，P222T   pMut2-P222T   DGQAGE   -   -   -   -   -   4
  Mut2，R330S   pMut2-R330S   DGQAGE-   -   +   -   +   +   4
  Mut2，P222S，R330S   pMut2-P222S-R330S   DGQAGE   -   +   +   +   +   4
  Mut3   pMut3   DGQEGD   +   -   -   +   +   7
  Mut3，P222S   pMut3-P222S   DGQEGD   +   -   -   +   +   7
  Mut3，R330S   pMut3-R330S   DGQEGD   -   +   -   +   +   7
  Mut4   pMut4   DGQEGE   -   -   -   +   +   34
  Mut4，P222S   pMut4-P222S   DGQEGE   -   -   -   +   +   34
  Mut4，R330S   pMut4-R330S   DGQEGE   -   -   -   +   +   34
  Mut5   pMut5   GGQAGE   -   +   -   +   +   2
  Mut5，P222S   pMut5-P222S   GGQAGE   -   +   +   +   +   2
  Mut5，P222T   pMut5-P222T   GGQAGE   2
  Mut5，R330S   pMut5-R330S   GGQAGE   -   +   -   +   +   2
  Mut6   pMut6   GGQEGD   +   -   -   +   +   6
  Mut6，P222S   pMut6-P222S   GGQEGD   +   -   -   +   +   6
  Mut6，R330S   pMut6-R330S   GGQEGD   +   -   -   +   +   6
  Mut7   pMut7   GGQEGE   -   -   -   +   +   35
  Mut7，P222S   pMut7-P222S   GGQEGE   -   +   -   +   +   35
  Mut7，R330S   pMut7-R330S   GGQEGE   -   -   -   +   +   35
  Mut8   pMut8   NGQAGD   -   +   -   +   +   15
  Mut8，P222S   pMut8-P222S   NGQAGD   -   +   -   +   +   15
  Mut8，R330S   pMut8-R330S   NGQAGD   -   +   -   +   +   15
  Mut9   pMut9   NGQAGE   -   +   -   +   +   16
  Mut9，P222S   pMut9-P222S   NGQAGE   -   +   +   +   +   16
  Mut9，P222T   pMut9-P222T   NGQAGE   16
  Mut9，R330S   pMut9-R330S   NGQAGE   -   + -   +   +   16
  Mut10   pMut10   NGQEGD   +   - -   +   +   8
  Mut10，P222S   pMut10-222S   NGQEGD   +   - -   +   +   8
  Mut10，R330S   pMut10-330S   NGQEGD   -   + -   +   +   8
  Mut11   pMut11   NGQEGE   +   - -   +   +   9
  Mut11，P222S   pMut11-222S   NGQEGE   +   - -   +   +   9
  Mut11，R330S   pMut11-330S   NGQEGE   -   + -   +   +   9
a用于定点诱变实验的寡核苷酸
b用于转染实验的获得的诱变质粒
c位于318-323位氨基酸的氨基酸序列以单字母代码显示并且与D78序列相比交换的氨基酸是黑体字
实施例2
典型IBDV突变株的抗原性能
材料和方法
通过中和试验表征突变病毒
为测试产生的病毒是否被单克隆抗体中和，基本上如(Schrder等人，J.Gen.Virol.，81，533-540，2000)描述进行中和试验。简言之，含有750TCID50/100μl的100μl病毒溶液吸移入96孔组织培养皿的每孔中，除了每排的第一孔。然后，100μl不同moabs(67、B69、57、R63)或多克隆兔抗IBDV血清吸移入每排的第一空孔。接着向含有抗体的孔中添加100μl含有1500TCID50/100μl的病毒悬液。
病毒和血清混合后，通过连续转移100μl/孔进行系列稀释。室温培养1小时后，向每孔添加100μl QM细胞(106个细胞/ml)并在37℃培养。六天后对每孔的CPE的存在进行打分。血清样品VN-测试的终点确定为最高稀释度的倒数，以log2表示，其中无CPE可见。
结果
中和试验中的抗原性能
为试验产生的突变株是否可以被合适的单克隆抗体中和，进行中和试验。为这个试验，选择显示基于一个氨基酸交换的不同mAb模式(D78、PSD78；Mut1、PS-Mut1；Mut2、PS-Mut2)或相同模式但氨基酸序列不同(D78、Mut1、Mut2；PS-D78、PS-Mut1、PS-Mut2；Mut10、Mut11)的病毒对。结果显示(表5)在大多数情况下(D78、Mut1、Mut2、PS-D78、PSMut1、PS-Mut2、Mut11)发生与荧光试验中模式相同的中和。一个例外是Mut 11，它不被mAb 57中和，尽管它在荧光试验中是阳性，表明存在该表位，但是丧失了它的中和性能。
表5：使用多克隆血清和单克隆抗体的IBDV突变株的中和试验
Figure C20048000798300251
a中和试验中使用的重组IBDV
b使用moabs(57、R63、67、B69)的间接免疫荧光试验中的板模式结果，如表4所示。
c在中和试验中，四个moabs(57、R63、67、B69)和一个多克隆兔抗IBDV血清。
d稀释血清的log2中和滴度
序列表
<110>AKZO Nobel NV
<120>表达典型和变异IBDV株系特异性的病毒中和表位的传染性法氏囊病病毒(IBDV)突变株
<130>2003-002-FF
<160>35
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>典型IBDV的突变株
<400>1
Gly Gly Gln Ala Gly Asp
1               5
<210>2
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>典型IBDV的突变株
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<210>3
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<223>典型IBDV的突变株
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Asp Gly Gln Ala Gly Glu
1               5
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>典型IBDV的突变株
<400>14
Asp Gly Gln Glu Gly Asp
1               5
<210>15
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>典型IBDV的突变株
<400>15
Asn Gly Gln Ala Gly Asp
1               5
<210>16
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>典型IBDV的突变株
<400>16
Asn Gly Gln Ala Gly Glu
1               5
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>典型IBDV的突变株
<400>17
Asn Gly Gln Glu Gly Asp
1               5
<210>18
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>典型IBDV的突变株
<400>18
Asn Gly Gln Glu Gly Glu
1               5
<210>19
<211>31
<212>PRT
<213>传染性法氏囊病病毒
<400>19
Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln
1               5                   10                  15
Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly Val Thr Ile Thr Leu Phe
            20                  25                  30
<210>20
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>20
gaccatgaca tctgatcccc tgcctgaccg tcacttttgg aggtc    45
<210>21
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>21
gaccatgaca tctgttcccc tgcctgaccg tcacttttgg aggtc     45
<210>22
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>22
gaccatgaca tctgatcccc ttcctgaccg tcacttttgg aggtc    45
<210>23
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>23
gaccatgaca tctgttcccc ttcctgaccg tcacttttgg aggtc    45
<210>24
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>24
gaccatgaca tctgttcccc tgcctgacca ccacttttgg aggtc    45
<210>25
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>25
gaccatgaca tctgatcccc ttcctgacca ccacttttgg aggtc    45
<210>26
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>26
gaccatgaca tctgttcccc ttcctgacca ccacttttgg aggtc    45
<210>27
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>27
gaccatgaca tctgatcccc tgcctgaccg ttacttttgg aggtc    45
<210>28
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>28
gaccatgaca tctgttcccc tgcctgaccg ttacttttgg aggtc    45
<210>29
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>29
gaccatgaca tctgatcccc ttcctgaccg ttacttttgg aggtc    45
<210>30
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>30
gaccatgaca tctgttcccc ttcctgaccg ttacttttgg aggtc    45
<210>31
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>31
attgttaccc caccggtttg gtactgtgat gagaattgg
<210>32
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>32
gattgttacc ccaccgcttt  ggtactgtga          30
<210>33
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>定点诱变的寡核苷酸
<400>33
gtcactgcta ggctcccaga tgccgaccat gacatc    36
<210>34
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>典型IBDV的突变株
<400>34
Asp Gly Gln Glu Gly Glu
1               5
<210>35
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>典型IBDV的突变株
<400>35
Gly Gly Gln Glu Gly Glu
1               5

Claims (21)

1.一种表达与单克隆抗体(moab)B69结合的VP2蛋白的典型传染性法氏囊病病毒(IBDV)突变株，其特征在于该VP2蛋白也与分别由保藏在美国Rockville ATCC的杂交瘤细胞系HB-9437和HB-11122分泌的moab 67结合。
2.根据权利要求1的典型IBDV突变株，其特征在于该VP2蛋白与保藏在美国Rockville ATCC的杂交瘤细胞系HB-9490分泌的moab R63、moab B69和moab 67结合。
3.根据权利要求1的典型IBDV突变株，其特征在于该突变株在典型VP2编码区中包含一个或多个突变，这样使得该编码区包含(i)编码丝氨酸或苏氨酸的222位氨基酸的密码子和(ii)编码SEQ ID No.1-5任何一个所示的318-323位氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求3的典型IBDV突变株，其特征在于该编码区包含编码精氨酸或丝氨酸的330位氨基酸的密码子。
5.根据权利要求1-4任一项的典型IBDV突变株，其特征在于该突变株包含IBDV株系D78的VP2编码区的一个或多个突变。
6.根据权利要求1的典型IBDV突变株，其特征在于该突变株包含典型IBDV的基因组片段A。
7.根据权利要求6的典型IBDV突变株，其特征在于该突变株包含IBDV株系D78的基因组片段A。
8.一种用于保护家禽抵抗由IBDV感染引起的疾病的疫苗，其特征在于该疫苗包含根据权利要求1-7任一项的典型IBDV突变株和药物可接受载体或稀释剂。
9.根据权利要求8的疫苗，其特征在于典型IBDV突变株是活的形式。
10.根据权利要求8或9的疫苗，其特征在于该疫苗进一步包含对家禽有传染性的其它病原体的一个或多个疫苗组分。
11.根据权利要求10的疫苗，其特征在于该疫苗包含佐剂。
12.一种制备根据权利要求1-7任一项的典型IBDV突变株的方法，其特征在于在细胞培养物中繁殖典型IBDV突变株和随后从细胞培养物中收获典型IBDV突变株。
13.一种制备根据权利要求8-11任一项的疫苗的方法，其特征在于将根据权利要求1-7任一项的典型IBDV突变株与药物可接受载体或稀释剂混合。
14.一种制备典型传染性法氏囊病病毒(IBDV)突变株的方法，该突变株表达与分别由保藏在美国Rockville ATCC的杂交瘤细胞系HB-9437和HB-11122分泌的单克隆抗体(moab)B69和moab 67结合的VP2蛋白，其特征在于在典型IBDV株系的VP2编码区中引入一个或多个突变，这样使得(i)222位氨基酸的密码子编码丝氨酸或苏氨酸和(ii)编码318-323位氨基酸序列的核苷酸序列编码SEQ ID No.1-5任何一个所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于在典型IBDV株系VP2编码区222位氨基酸的密码子中引入突变，该株系包含编码SEQ ID No.1的氨基酸序列的核苷酸序列。
16.根据权利要求14或15的方法，其特征在于VP2蛋白也与保藏在美国Rockville ATCC的杂交瘤细胞系HB-9490分泌的moab R63结合。
17.根据权利要求14的方法，其特征在于VP2编码区包含编码精氨酸或丝氨酸的330位氨基酸的密码子。
18.根据权利要求14的方法，其特征在于在IBDV株系D78的VP2编码区引入一个或多个突变。
19.根据权利要求14的方法，其特征在于在典型IBDV的基因组片段A中引入一个或多个突变。
20.根据权利要求19的方法，其特征在于在IBDV株系D78的基因组片段A中引入一个或多个突变。
21.一种制备用于保护家禽抵抗由IBDV感染引起的疾病的疫苗的方法，其特征在于将根据权利要求14-20中任一项所述方法制备的典型IBDV突变株与药物可接受载体或稀释剂混合。
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