KR102421249B1

KR102421249B1 - 국내 분리 미주형 항원변이형 닭전염성 f낭병 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물

Info

Publication number: KR102421249B1
Application number: KR1020200106490A
Authority: KR
Inventors: 장일; 김혜령; 권용국; 윤소윤; 뚜엣 응언 타이; 김현아
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2020-08-24
Publication date: 2022-07-15
Also published as: KR20220025571A

Abstract

본 발명은 항원변이형 닭전염성 F낭병 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물에 관한 것으로, 본 발명의 수탁번호 KCTC18836P의 전염성 F낭병 바이러스주는 국내에서 분리된 신규한 미주형의 항원변이성 전염성 F낭성 바이러스주로서, 본 발명의 바이러스주는 국내 유행중인 항원변이형 전염성 F낭성 바이러스 감염증을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

국내 분리 미주형 항원변이형 닭전염성 F낭병 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물 {American type Antigen variant Infectious Bursal Disease Virus isolated in South Korea and Vaccine composition comprising the same}

본 발명은 항원변이형 닭전염성 F낭병 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 국내에서 신규 분리된, 미주형의 항원변이형 닭전염성 F낭병 바이러스(American antigen variant IBDV) 및 이를 포함하는 백신조성물에 관한 것이다.

전염성 F낭병(Infectious bursal disease, IBD)은 감보로병(Gumboro disease)이라고도 알려져 있으며, 조류의 급성의 고전염성 면역억제성 바이러스 질병이다. 이 질병은 IBDV (infectious bursal disease virus)에 의해 야기되며, 버나비리대(Birnaviridae) 과의 에이비버나바이러스(Avibirnavirus) 속에 속한다. IBDV는 어린 닭에서 F낭의 B 림프구를 파괴함으로써 면역억제를 유도하여 다른 질병에 대한 감수성을 높인다. IBDV는 A 세그먼트 및 B 세그먼트, 2개의 세그먼트로 된 이중가닥 RNA 지놈을 포함하는 비-봉입성 캡시드 구조체를 가진다. 세그먼트 A는 두개의 오버래핑 ORF를 가지고, 4개의 바이러스 단백질(VP5, 및 VP2-VP3-VP4)를 인코딩한다. 이중 ORF1은 VP2(outer capsid), VP3 (inner capsid), VP4 (protease)를 발현하고, ORF2는 VP5 단백질(비구조 단백질)을 발현한다. 많은 연구들은 VP2 유전자의 과변이성 영역(hypervariable region)의 아미노산 잔기인 206 내지 350 번째 아미노산 잔기의 분석에 집중하며, 이 아미노산 잔기는 병원성과 항원 변이성을 결정하는 네 개의 친수성 영역을 포함한다는 점에서 중요하다. 한편, 세그먼트 B는 RNA-의존적 RNA 폴리머라제인 VP1을 인코딩하고, 이는 바이러스 복제에 있어 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. VP1과 VP2는 모두 IBDV의 병원성에 기여하며, 이 바이러스의 분자적인 특성을 연구하는데 사용된다. IBDV는 두가지 혈청형이 알려져 있으나, 오직 혈청형 1형만이 닭에 병원성을 가지며, 병원성 및 항원성에 따라서 4개의 표현형으로 분류된다: i) classical virulent(cv), ii) antigenic variant (av), iii) very virulent (vv), 및 iv) attenuated type으로 분류된다.

IBDV는 1960년대 초반에 처음 발견되었고, classical virulent 타입으로 알려졌다. 항원 변이형주(antigen variant strain)는 1980년대 후반 미국에서 발견되었다. 최근 가장 주목받고 있는 IBDV는 very virulent 타입으로 높은 감염성과 치사율을 가지고 있다. Classical virulent 타입의 바이러스 백신은 very virulent 타입에도 방어 효능이 있으나, antigen variant 타입에는 방어 효능을 제공할 수 없음이 밝혀졌다. 항원변이형 IBDV 감염증은 낮은 치사율과 임상적인 증상이 없기 때문에 subclinical 감염으로 검출이 어려우며, 지속적인 면역체계의 억제를 야기한다. 북미와 유럽지역의 가금류 농장에서는 항원 변이형 IBDV 감염증으로 크게 고통받고 있다. 2019년에는 항원 변이형 IBDV가 중국에서 팬데믹을 일으킨 바 있다. 우리나라에서 IBD는 1980년대 처음으로 발병이 보고된 이래로 지금까지 네 가지 타입 모두가 분리된 바 있다. 그러나, 항원변이형의 IBDV는 2010년에 한 번 발병하였고, 지금까지는 모두 very virulent 타입의 IBDV였기 때문에, 약독화 백신과 사독백신은 모두 classical virulent IBDV에서 유래한 바이러스 주를 사용해왔다. 2019년 중반기에, 국내에서도 항원변이형 IBD가 발병하고 있다는 소문이 있었으며, 본 발명자들은 이를 확인하고자 수동적 예찰을 통하여 IBDV의 검출 및 분리를 지속해왔다. 본 발명자들은 이를 통해 국내에서 신규로 분리된 6종의 항원변이형 IBDV를 발견하였다.

He X, Wei P, Yang X, Guan D, Wang G, Qin A. Molecular epidemiology of infectious bursal disease viruses isolated from Southern China during the years 2000-2010. Virus Genes. 2012;45(2):246-255. Stoute ST, Jackwood DJ, Sommer-Wagner SE, Crossley BM, Woolcock PR, Charlton BR. J Vet Diagn Invest.　2013;25(3):352-8. Michel Lo, Jackwood DJ. Classification of infectious bursal disease virus into genogroups. Arch Virol. 2017;162(12):3661-3670.

본 발명자들은 국내에서 발병하고 있는 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스주를 분리하고, 이를 백신조성물로 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 2019년도에 수동적 예찰의 결과로 의뢰된 가검물에서 5종의 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스주를 검출하고 분리하는데 성공하였으며, 이의 면역원성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC18836P의 국내분리 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스(infectious bursal disease virus) 19D44주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이러스주를 포함하는 전염성 F낭병 예방용 백신조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스의 VP2의 과변이 영역의 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열로 이루어진 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스의 VP2의 과변이성 영역의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCTC18836P의 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스(infectious bursal disease virus) 19D44주를 제공한다.

상기 바이러스주는 2020년 8월 10일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC18836P로 기탁되었다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바이러스의 VP2 단백질은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바이러스의 VP2 단백질은 221Q, 222T, 242V, 252V, 256V, 279N, 294L, 299N의 아미노산 잔기를 포함하는 것이다.

상기 아미노산의 위치와 잔기를 나타내기 위하여 XY 형태로 기재된 표현에 있어서, 상기 X는 단백질의 아미노산 잔기의 X번째 위치를 의미하고, 상기 Y는 X번째 아미노산 위치의 아미노산 잔기의 종류를 표시하는 약어를 의미한다. 예컨대, 221Q는 VP2 단백질의 221번째 위치에 Q (glutamine, Gln)이 존재한다는 의미이다. 상기 아미노산 위치를 표시하는 숫자는 Michel Lo의 문헌(Michel Lo, Jackwood DJ. Classification of infectious bursal disease virus into genogroups. Arch Virol. 2017;162(12):3661-3670.)에 기재된 것과 같은 IBDV 게놈의 segment A 서열에 기초한 것이다.

본 발명에 따른 상기 국내에서 분리된 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스는 종래 분리 및 개발되어 있는 클래식 타입의 바이러스주(classical virulent), 또는 강독주(very virulent strain, vvIBD) 타입과는 달리 항원변이형에 해당하는 바이러스주로서 최근에 국내로 유입되고 있는 미주형의 항원변이형 전염성 F낭병을 예방하기 위한 백신 개발에 유용하게 사용될 수 있다. 일례로 국내에서 분리된 vvIBDV는 대한민국 등록특허 제10-1511712호에 개시된 바 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCTC18836P의 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스 19D44주를 포함하는 전염성 F낭병의 예방용 백신조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백신은 약독화 백신(attenuated vaccine) 또는 사독 백신(불활화 백신, inactivated vaccine)으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 백신은 시판되는 IBDV 약독화 백신 및 IBDV 불활화 백신에 보편적으로 이용되는 것과 같은 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 요약하면, IBDV에 감수성이 있는 세포 또는 개체에 본 발명에 따른 IBDV를 접종하고, 원하는 감염 역가로 바이러스가 복제될 때까지 증식시킨 후, IBDV 함유 물질을 회수하고, 선택에 따라 약독화 또는 불활화한 후, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합한다.

1차 (조류) 세포 배양물(예컨대 닭 배아 섬유아 세포(CEF) 또는 닭 배아 간 세포(CEL)), 포유동물 세포주(예컨대 Vero 세포주 또는 BGM-70 세포주), 또는 조류 세포주(예컨대 QT-35, QM-7 또는 LMH)를 비롯하여 IBDV를 복제할 수 있는 어떠한 기질도 본 발명에 따른 백신을 제조하는 데 사용될 수 있다. 통상적으로, 세포 접종 후에, 바이러스를 3~14일간 증식시키고, 그 후에 세포 배양물 상청액을 회수하며, 세포 잔해물을 제거하기 위해 필요에 따라 여과 또는 원심분리한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 IBDV는 계태아에서 증식시킬수도 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 IBDV의 약독화는 세포 배양물에서, 예를 들어 1차 세포 배양물 또는 상기한 확립된 세포주에서 바이러스의 표준 연속 계대배양에 의해 얻을 수 있다(Bayyari 등, Avian Diseases 40, 516-532, 1996; Tsai 등, Avian diseases 36, 415-422, 1992).

대안으로, 본 발명의 IBDV는, 감염된 닭의 생체내에서 증식시킨 후에 상기 감염된 닭으로부터 F낭을 분리하여 이를 희석제와 혼합하고 혼합물을 균질화할 수 있다. 이러한 방식으로 증식된 IBDV는 일반적으로 불활화 백신의 기본 재료가 된다.

생바이러스(live virus)를 포함하는 본 발명에 따른 약독화 백신은 현탁액의 형태로 또는 동결건조된 형태로 제조 및 시판될 수 있으며, 그러한 조성물에 통상 사용되는 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다. 담체는 안정화제, 보존제 및 완충제를 포함한다. 적합한 안정화제는, 예를 들어 SPGA, 탄수화물(예컨대 솔비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란, 글루타메이트 또는 글루코스), 단백질(예컨대 알부민 또는 카세인) 또는 이의 분해 생성물이다. 적합한 완충제는, 예를 들어 알칼리 금속 인산염이다. 적합한 보존제는 티메로살, 메르티올레이트 및 젬타미신이다. 희석제는 물, 수성 완충용액(예컨대 PBS), 알코올 및 폴리올(예컨대 글리세롤)을 포함한다.

필요에 따라, 본 발명에 따른 약독화 생백신은 면역 보조제(adjuvant)를 포함할 수 있다. 면역보조 활성을 갖는 적합한 화합물 및 조성물의 예는 하기에 언급하는 것과 같다.

본 발명에 따른 생 백신은 주사에 의해, 예를 들어 근육내 주사, 피하 주사에 의해 또는 난에 투여할 수 있지만, IBDV 백신 접종에 통상적으로 이용되는 저렴한 집단 적용(mass application) 경로에 의해 투여하는 것이 바람직하다. IBDV 백신 접종의 경우, 이 경로는 음용수, 분무 및 에어로졸 백신 접종을 포함한다.

대안으로, 본 발명은 불활화(inactivation, or killed) 형태의 IBDV를 포함하는 백신을 제공한다. 불활화 IBDV 백신의 장점은 고농도의 보호 항체를 장기간 동안 유지할 수 있다는 것이다.

증식 단계 이후에 회수되는 바이러스의 불활성화의 목적은 바이러스의 복제를 방지하는 것이다. 일반적으로, 이는 당분야에 공지된 화학적 또는 물리적 수단에 의해 행할 수 있다.

불활화된 IBDV를 포함하는 백신은, 예를 들어 상기 목적에 적합한 전술한 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 불활성화 백신은 면역 보조 활성을 갖는 1종 이상의 화합물을 포함한다. 이러한 용도에 적합한 화합물 또는 조성물은 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알루미늄, 예를 들어 미네랄 오일에 기초한 수중유 또는 유중수 에멀젼(예, Bayol F(등록상표) 또는 Marcol 52(등록상표)) 또는 식물성 오일, 예컨대 비타민 E 아세테이트 및 사포닌을 포함한다.

본 발명에 따른 백신은 활성 성분으로서 본 발명의 분리된 IBDV를 유효량 포함하며, 즉 야생의 IBDV에 의한 공격에 대항하여 백신 접종된 조류에서 면역을 유도하는 함량의 IBDV을 포함한다. 본원에서 면역이란, 백신 비접종 그룹과 비교하여 백신을 접종한 조류 집단에서 유의적으로 높은 수준의 보호 효과를 유도하는 것으로 정의된다.

일반적으로, 본 발명에 따른 생 백신은 동물 1 마리당 10⁰~10⁹ TCID₅₀, 바람직하게는 동물 1 마리당 10³~10⁶ TCID50의 용량으로 투여할 수 있다. 불활화 백신은 동물 1 마리당 10⁶~10¹⁰ TCID₅₀의 항원성 당량을 함유할 수 있다.

불활화 백신은 통상적으로 비경구, 예를 들어 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.

본 발명에 따른 IBDV 백신은 닭에 효과적으로 사용될 수 있지만, 다른 가금류, 예컨대 칠면조, 뿔닭 등에도 효과적으로 사용될 수 있다. 상기 닭은 어린 닭, 육계 및 산란계를 포함한다

본 발명에 따른 약독화 생백신 또는 불활화 백신을 투여하는 동물의 나이는 종래의 IBDV 약독화 생백신 또는 IBDV 불활화 백신을 투여하는 동물들의 나이와 동일하다. 예를 들어, 어린 닭(모계 유래 항체-MDA가 없음)은 1일령에 또는 난에 백신을 접종할 수 있는 반면, MDA 수준이 높은 어린 닭은 2~3주령에 백신을 접종하는 것이 바람직하다. MDA 수준이 낮은 산란계 또는 육계에는 1~10일령에 백신을 접종한 후에 6~12주령 및 16~20주령에 불활화 백신을 추가 접종한다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 IBDV 이외에도 가금류에 대해 감염성이 있는 다른 병원체 또는 이로부터 제조된 1 이상의 백신 성분을 포함하는 조합 백신을 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 조합 백신은 마렉병 바이러스(Mareks Disease virus; MDV), 감염성 기관지염 바이러스 (infectious bronchitis virus; IBV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus; NDV), 산란 저하 증후군(egg drop syndrome; EDS) 바이러스, 칠면조 비기관염 바이러스(turkey rhinotracheitis virus; TRTV) 또는 레오바이러스 등의 1종 이상의 병원체 또는 이로부터 제조된 백신을 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스의 VP2의 과변이성 영역의 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 핵산 분자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열로 이루어진 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스의 VP2의 과변이성 영역의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산(nucleic acids)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

상기 핵산 분자는 상기 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 아니하며, 상기 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열도 포함한다. 이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 스위치 분자를 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트(alignment) 방법은 당업계에 공지되어있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에 따른 핵산 분자 또는 폴리펩타이드는 항원변이형 IBDV의 VP2 영역의 과변이성 영역을 인코딩하거나, 이를 이루는 것으로서 IBDV의 VP2 단백질 단편을 제조하거나, 이를 이용한 서브유닛 백신, 이를 항원으로 이용하는 IBDV의 진단시약 등으로 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 수탁번호 KCTC18836P의 전염성 F낭병 바이러스주는 국내에서 분리된 신규한 미주형의 항원변이성 전염성 F낭성 바이러스주로서, 본 발명의 바이러스주는 국내 유행중인 항원변이형 전염성 F낭성 바이러스 감염증을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명자들이 분리한 미국 계통의 신규 항원변이형 IBDV(19D44)의 VP2 유전자의 염기서열을 기준으로 작성한 계통수이다.
도 2는 본 발명자들이 분리한 미국 계통의 신규 항원변이형 IBDV(19D44)의 VP1 유전자의 염기서열을 기준으로 작성한 계통수이다.
도 3은 본 발명자들이 분리 및 기탁한 미국 계통의 항원 변이형 IBDV(19D44)에 감염되어 림프구가 고갈된 F낭 조직 사진을 나타낸 도이다(배율 : x40).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실험재료 및 방법

샘플 준비

2019년 6월부터 12월까지, 2 내지 9주령의 닭 사체가 농림축산검역본부 조류질병과에 의뢰되어 닭전염성 F낭병 바이러스(infectious bursal disease virus, IBDV)에 대한 검사 및 분리를 수행하였다. 닭의 F낭을 적출하여 50 μg/mL 겐타마이신을 첨가한 10% (w/v) PBS에서 유제하고, 4℃에서 5000 x g로 5분간 원심분리한 후, 상층액을 회수하여 이하의 검출 및 분석에 사용하였다. 의뢰된 2019년 국내 발생 항원변이형 IBDV 6종에 대한 히스토리 및 관련 정보를 표 1에 나타내었다. 표 1의 합병증, 육안 병변 및 현미경 병변은 이하에서 수행된 검사결과를 취합한 것이다.

바이러스주명	축종	지역	규모	일령	치사율(%)	백신여부	합병증	육안병변	현미경병변
19D38	육계	전남	60000	28	3	X	전염성기관지염, 콕시듐증, 대장균증	없음	림프구 결실
19D44	육계	전남	198000	23	7	O	전염성기관지염, 대장균증, malabsorption syndrome	없음	림프구결실, cyst,충혈
19D51	육계	전남	198000	24	2	O	전염성기관지염, 대장균증	없음	림프구결실, cyst, 상피탈락
19D69	토종닭	충북	32000	47	0	O	전염성기관지염, 괴사성 장염, 대장균증	F낭종대 (1/6마리)	상피탈락, 이염백혈구 및 림프구 침윤
19D75	육계	경기	25000	27	데이터 없음	X	전염성기관지염, 콕시듐증	F낭 종대 및 출혈(5/6마리)	림프구 결실, 헤테로필 침윤
20D39	육계	경기	56000	29	데이터 없음	O	전염성기관지염, 대장균증	F낭 위축	림프구 괴사, 상피 소실

RNA 추출 및 RT-PCR

Viral Gene-Spin DNA/RNA Extraction Kit (Intron Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 F낭 유제액에서 각 바이러스 주의 바이러스 RNA를 추출하였다. IBDV 양성 샘플에서 하기 표 1에 기재된 프라이머를 사용하여 전장 VP1 및 전장 VP2를 증폭하였다. Maxime RT-PCR Premix (Intron Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 i) 48℃에서 30분, ii) 94℃에서 10 분간 수행한 후, iii) 94℃에서 30초, 프라이머-특이 조건(어닐링) 및 72℃에서 1.5분간 수행하는 사이클을 35회 반복하고, iv) 마지막으로 72°C에서 10 분간 연장하였다. 상기 RT-PCR 결과물을 QIAquick purification Kit (QAGIEN, Germany)를 이용하여 정제하고, 하기 표 1의 PCR 프라이머(Bionics, Korea)를 이용, Sanger method로 서열을 확인하였다.

서열번호	프라이머명	유전자 부위 및 염기서열	위치	증폭크기
-	-	VP2	-	-
1	GA1F	GGT TAG TAG AGA TCA GAC A	100-118	600
2	GA1R	GCC TGT CAC TGC TGT CAC AT	719-738	600
3	743-F	GCC CAG AGT CTA CAC CAT	737-754	580
4	1331-R	ATG GCT CCT GGG TCA AAT CG	1296-1315	580
5	GA4nF	GAA CCT GGT CAC AGA ATA CG	1274-1293	500
6	GA4nR	ATA GCG TGG CAC CCT CTC T	1752-1770	500
-	-	VP1	-	-
7	B1F	TTA GAA TTC TAG GAT ACG ATG GGT CTG AC	5' end	1200
8	BIR	CAC GGG CCA GGT TAT CAT TGA G	1157-1178	1200
9	B2F	GCT GCT CAG CAT GCT AAG TGA C	1019-1040	900
10	B2R	GAT CCC RAG ATC TTT GCT GTA	1842-1862	900
11	B3R	CCT TGC ACA ACC AGG GTA CCT GAG	1751-1774	1000
12	B3R	ATT TCT AGA TGG GGG CCC CCG CAG GCG AA	3' end	1000

서열 분석

검출된 각 바이러스주의 전장 VP1 및 VP2의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 CLC Workbench version 6.7.2 (CLC bio, Aarhus, Denmark)을 이용하여 편집 및 어셈블리하였다. VP2의 과변이성 영역(hypervariable region, HVR)의 579-bp 뉴클레오타이드 단편 (bp 743-1331) 및 VP1의 과변이성 영역의 1051-bp 뉴클레오타이드 단편 (bp 319-1369)의 서열을 얼라인하고, MEGA X software 를 이용하여 1000 bootstraps replication의 neighbor-joining method로 계통수를 작성하였다(Michel Lo, Jackwood DJ. Classification of infectious bursal disease virus into genogroups. Arch Virol. 2017;162(12):3661-3670.). 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다.

바이러스 분리

각 바이러스주가 감염된 닭의 F낭 유제액을 11일령의 SPF 계태아의 CAM(chorio-allantoic membrane)에 접종하였다. 접종 5일 후, CAM을 채취하여 유제하고, RNA 추출 및 분자생물학적 분석을 수행하였다.

클로닝

각 바이러스주의 VP2 과변이 유전자 부분을 증폭시킨 PCR 결과물을 TOPO TA 벡터에 클로닝하고, HIT-DH5α competent cell에 TOPO TA Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 형질전환하였다. 세 개의 독립적인 양성 클론을 서열분석하였고, 어셈블리된 서열은 추가 시험에 사용되었다.

조직학 검사

조직학 검사를 위하여 의뢰된 닭의 F낭 조직을 10% 중성 포르말린에 고정하였다. 파라핀-포매 된 조직을 처리하고, 4 μm 두께로 세절하여 H&E 염색을 하였다.

실시예 1: 국내 변이 IBDV 스트레인의 분자적 특성확인

2019년 6월부터 총 29마리의 2주령 내지 9주령의 닭 사체가 농림축산검역본부 조류질병과에 의뢰되었다. 수동적 예찰로서, 의뢰된 닭들의 F낭 유제액을 이용하여 RT-PCR로 IBDV 스크리닝을 수행하였다. 그 결과, 9개의 샘플이 IBDV 양성으로 확인되었고, 그 중 6개의 IBDV가 항원 변이형 타입인 것으로 동정되었다. 결과는 표 3에 나타내었다.

IBDV의 분자적 특성확인은 상술한 바와 같이, 과변이성 VP2 인코딩 영역에 초점을 맞추어 이루어진다. 6개의 국내 바이러스주가 기존의 항원변이형 IBDV와는 다른 그룹으로 분류되었다. 나아가, VP2의 부분적 아미노산 서열에 근거하여, 핵심적인 아미노산 잔기를 비교하였다.

바이러스주

VP2 중 아미노산 위치

VP1 중 아미노산 위치

-

221

222

242

252

256

279

294

299

145

146

147

508

19D38 (American)

Q

T

V

N

L

N

E

G

R

19D44 (American)

Q

T

V

N

L

N

E

G

R

19D51 (Chinese)

K

T

V

I

V

N

L

S

ND

19D69 (Chinese)

K

T

V

I

V

N

L

S

N

E

D

K

19D75-av (Chinese)

K

T

V

I

V

N

L

S

ND

20D39
(Chinese)

K

A

V

I

V

N

L

S

N

E

D

K

SHG19¹

K

A

V

I

V

N

L

S

N

E

D

K

SHG49¹

K

T

V

I

V

N

L

S

N

E

D

K

SHG99¹

K

T

V

I

V

N

L

S

N

E

D

K

VariantE²

Q

T

V

N

L

N

E

G

R

9109²

Q

T

V

N

L

N

E

G

R

¹Chinese type

²American type

ND=No Data

1-1. VP2 분석

표 3에 나타낸 바와 같이, 6개의 바이러스주가 모두 전형적인 항원 변이형 IBDV의 아미노산 잔기인 242V, 256V, 279N, 294L 아미노산 잔기를 가짐을 확인하였다.

본 발명자들의 작성한 계통수와 상기 표 3 에 따르면, 국내 분리된 항원변이형 바이러스주 6종은 서로 분자적으로 상이한 특성을 가지는 것이 확인되었으며, 지리적으로 2개의 서브 그룹, 즉, 미주형(19D38, 19D44) 및 중국형(19D69, 19D51, 19D75-av, 20D39)으로 나뉘었다. 19D38 및 19D44는 중국형 항원 변이형 바이러스와 91.5~92.9%의 아미노산 상동성을 보이는 한편, 미주형 항원 변이형 바이러스주와 93.5~96.1%의 아미노산 상동성을 나타내어 미주형(American lineage)으로 분류되었다. 19D51, 19D69, 20D39는 미주형 계통과 91.7~94.0% 동일성을 나타내는 한편, 새로운 중국형 항원변이형 계통과 상대적으로 더 높은 95.6~98.62% 동일성을 나타내어 중국형(Chinese lineage)으로 분류되었다. 또한, 이들 중국형 항원 변이형 IBDV는 미주형 항원변이형 IBDV와 구별되는 특징으로 221K, 252I, 및 299S의 세 개의 보존적 아미노산 잔기를 보유하였다.

19D75의 경우, VP2 과변이성 영역을 RT-PCR 및 시퀀싱하였을 때, 혼재된 피크를 나타내어 두 가지 종류의 IBDV 스트레인이 동시 감염되었을 수 있음을 시사하였다. 이 바이러스 주를 계태아에 접종 및 클로닝하여 분리를 시도한 결과, 부분적인 VP2 클로닝 시퀀스(19D75-av)는 중국의 항원 변이형 계통과 매우 연관성이 높은 것으로 나타났으나, CAM 접종으로부터 분리된 스트레인(19D75-vv)은 vvIBDV와 유사한 분자적 패턴을 공유하였다.

1-2. VP1 분석

VP1의 부분적 뉴클레오타이드 서열에 의하여 제작된 계통수에 근거하여 볼 때, 19D75-vv를 제외한 6종의 국내 분리 바이러스주는 93.9% 이상의 아미노산 상동성을 나타내었으며 non-vvIBDV 가지로 분류되었다.

19D38 및 19D44 바이러스주는 다른 항원변이형 바이러스주와는 다른 분리된 가지를 형성하였으며, 이는 IBDV의 VP1의 진화적 특징을 나타낸다. 중국으로부터 온 신규 변이주와 19D69가 non-vvIBDV 가지로 분류되었지만, 이들은 다른 non-vvIBDV 와는 구별되는 서브-가지를 형성하였다. 미주형 항원변이성 IBDV와 비교하여, VP1에서 두개의 구별되는 보존적 아미노산 잔기(147D 및 508K)들이 중국 항원변이형에서 관찰되었다. 그러나 아쉽게도 very virulent 타입의 19D75 바이러스주(19D75-vv)는 분리되었으나, 항원 변이형 바이러스주(19D75-av)의 전장 VP1 코딩 서열은 분리되지 않았다.

실시예 2: 국내 분리 항원 변이형 IBDV의 F낭에서의 병변

표 1에 나열된 6종의 국내 항원 변이주 중 미주형인 19D44 strain이 감염된 개체에서의 F낭의 병변과 대표적인 조직학적 사진을 도 3에 나타내었다. 19D75 주를 제외한 나머지 주에서는 육안으로 관찰할 수 있는 병변이 거의 없었다. IBDV의 F낭에서의 전형적인 조직학적 병변인 림프구 결실은 6종의 바이러스주 모두에서 관찰되었다.

F낭에서의 낭강(Cystic cavity)의 생성은 19D44 및 19D51에서 명확하게 관찰되었다. 19D51 및 19D69에서는 F낭의 절단면에서 상피의 소실이 관찰되었다. 19D69의 경우, F낭 내에 헤테로필(heterophil)의 침윤이 관찰되었다. 19D75에서는, 특이하게도 F낭의 종대가 6마리중 5마리에서 발견되었다. 19D75의 조직병리적 병변은 또한 출혈, 림프구 감소, 헤테로필 침윤 및 소포(follicle) 파괴와 같은 vvIBDV에 의해 발생하는 전형적인 병변을 나타내었다.

실시예 3: 분자적 특성 분석 및 병변 분석 결과

표 1에 따르면, 6종의 국내 분리 항원변이형 IBDV에 감염된 닭에서 다른 전염성 병원체들 뿐만 아니라 다른 바이러스 들도 높은 비율로 검출되었다. IBDV 감염이 주된 감염인지 2차적인 감염인지 확신할 수는 없지만, 이러한 다중 공동감염은 항원변이형 IBD의 주요 병원성 특징이 면역억제와 관련되어 있을 수 있으며, 이로 인해 IBDV에 감염된 닭이 다른 전염성 병원체에도 쉽게 감염된 것일 수 있음을 시사한다는 몇몇 연구들의 결론과 일치하였다.

항원 변이형 IBDV는 지난 30년 이상 북미에서, 그리고 최근에는 유럽 또는 호주에서 유래하였으며, 널리 분포되어 있는 것으로 잘 알려져 있다. 최근까지 항원변이형 타입의 IBDV는 2019년까지는 아시아에 제한적이었으나, 최근 많은 수의 중국에서 분리된 IBDV가 항원변이형인 것으로 밝혀졌다. 분자적 특성 뿐만 아니라, 이러한 신규 중국 변이형의 병원성은 기존에 미국에서 분리된 항원변이형 IBDV와는 구별된다. 이러한 정보는 금번에 분리된 국내 5종의 항원 변이형 IBDV가 두 개의 그룹에 진화적으로 모두 속해 있을 수 있다는 시사점을 뒷받침한다.

추가적인 실험적 연구가 중국 신규 항원 변이주인 SHG19로 공격접종 된 닭에서 림프구 결실, 대식세포 침윤, 및 폴리클 파괴와 함께 F낭의 위축을 나타내었다. 이러한 항원변이형의 IBDV로서의 비전형적 병원성은 19D51 및 19D69의 조직학적 병변과 상관성이 있는 것으로 보인다. 또한, 같은 F낭에서 분리된 서로 다른 타입의 IBDV는 공동감염이 가능하다는 점을 암시한다(He X et al., Virus Genes. 2012;45(2):246-255.). 고병원성 바이러스주(rB)와 미주 아임상적 변이형 바이러스주 (American subclinical variant (Del-E or T1))를 닭에 공동으로 공격접종한 병원성 시험은 치사율 및 F낭 병변의 심각도가 rB 단독 감염과 비교하여 상당히 감소되었음을 입증하였다(Stoute ST et al., J Vet Diagn Invest.　2013;25(3):352-8.). 또한, PCR 및 서열 분석은 rB 스트레인만을 검출하였으며, 이는 vvIBDV와 항원성 변이주와 같은 병원성이 덜한 타입의 바이러스주 사이에 바이러스 경쟁이 가능함을 의미한다. 이러한 결과는 19D75에 감염된 대부분의 닭의 F낭에서의 조직학적 검사 결과 및 공동감염 중에서 고병원성의 타입만 분리된 결과와 상관 관계가 있음을 알 수 있다.

본 수동적 예찰 결과에 근거하면, 17%의 닭이 항원변이형 IBDV에 의해 감염되어 있으며, 현재의 항-IBDV 백신 전략은 항원 변이성 IBDV를 방어할 수 없으므로 본 발명자들이 국내에서 신규 분리한 미주형 항원변이형 IBDV 19D44와 같은 신규 IBDV strain에 대한 항원성 테스트와 새로운 백신 프로그램 개발의 시급하다는 점을 확인하였다.

한국생명공학연구원

KCTC18836P

20200810

한국생명공학연구원

KCTC18835P

20200810

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> American type Antigen variant Infectious Bursal Disease Virus isolated in South Korea and Vaccine composition comprising the same <130> PN200175 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2 GA1F <400> 1 ggttagtaga gatcagaca 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2 GA1R <400> 2 gcctgtcact gctgtcacat 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2 743-F <400> 3 gcccagagtc tacaccat 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2 1331-R <400> 4 atggctcctg ggtcaaatcg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2 GA4nF <400> 5 gaacctggtc acagaatacg 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2 GA4nR <400> 6 atagcgtggc accctctct 19 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 B1F <400> 7 ttagaattct aggatacgat gggtctgac 29 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 BIR <400> 8 cacgggccag gttatcattg ag 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 B2F <400> 9 gctgctcagc atgctaagtg ac 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 B2R <400> 10 gatcccraga tctttgctgt a 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 B3F <400> 11 ccttgcacaa ccagggtacc tgag 24 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 B3R <400> 12 atttctagat gggggccccc gcaggcgaa 29 <210> 13 <211> 550 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 19D44 HVR VP2: (position 752-1304 in Segment A) <400> 13 ccataactgc agccgataat taccagttct catcacagta ccaaacaggt ggggcaacaa 60 tcacactgtt ctcagccaac attgatgcca tcacaagtct cagtgttggg ggagagctcg 120 tattcaaaac aagcgtccaa agccttgtac tgggcgccac catctacctt ataggcttcg 180 atgggactgc ggtaatcacc agagctgtgg ccgcaaacaa tgggctgacg gccggtatcg 240 acaatcttat gccattcaac cttgtgattc caaccaatga gataacccag ccaattacat 300 ccatcaaact ggagatagta acctccaaaa gcaatggcca ggaaggagac cagatgtcat 360 ggtcggcaag tgggagccta gcagtgacga tccacggtgg caactaccca ggagccctcc 420 gtcccgtcac actagtggcc tacgaaagag tggcaaaagg atctgtcgtt acggtcgccg 480 gggtgagcaa cttcgagctg atcccaaatc ctgaactggc aaagaacctg gtaacagaat 540 acggccgatt 550 <210> 14 <211> 550 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20D39 HVR VP2: (position 752-1304 in Segment A) <400> 14 ccataacagc agctgataat taccaattct catcacagta caaggcaggt ggggtaacaa 60 tcacactgtt ctcagccaac atcgatgcca tcactagtct cagcgttggg ggggagcttg 120 tgttcaatac aagcatccaa aaccttgtac tgggtgccac catctacctt ataggctttg 180 atgggactgc ggtaatcaca agagctgtag ctgcaaacaa tgggctgaca gccggtatcg 240 acaatctcat gccatttaac cttgtgatcc cgaccagtga gataacccag ccaatcacat 300 ccatcaaatt ggagatagtg acttccaaaa gtgatggcca ggcaggggaa cagatgtcgt 360 ggtcggcaag tgggagtcta gcagtgacga tccatggtgg caactaccca ggagctctcc 420 gtcccgtcac gctagtggcc tacgaacgag tggcaacagg atctgtcgtt acggtcgccg 480 gggtgagcaa cttcgagctg atcccaaatc ctgaactagc aaagaacctg gttacagaat 540 acggccgatt 550

Claims

수탁번호 KCTC18836P의 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스(infectious bursal disease virus) 19D44주.
제1항에 있어서, 상기 바이러스의 VP2는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스 19D44주.
제1항에 있어서, 상기 바이러스의 VP2 단백질은 221Q, 222T, 242V, 252V, 256V, 279N, 294L, 299N의 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스 19D44주.
삭제
삭제
서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 미주형 항원변이형 전염성 F낭병 바이러스의 VP2 단백질의 일부 단편을 인코딩하는 핵산 분자.
제6항의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.