JP3756219B2 - レオウイルス株2177及び該株を含むワクチン - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は2177株と呼称される非病原性レオウイルス及び2177株を含むワクチンに関する。
【0002】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】
ニワトリレオウイルスは商業用家禽の種々の疾病に関連付けられている。経済的に最も重要なレオウイルス疾患は関節炎/腱滑膜炎症候群である。この症状の特徴は踝関節の直上の中足腱の腱鞘の腫張とそれに起因する種々の程度の跛行である。腫張が進行すると、ニワトリは運動を厭うようになる。患部腱は硬化し、繊維症になり、腱鞘及び皮膚に癒着すると腱の部分的機能障害をもたらす[Johnsonら,Avian Dis.15:829−834 (1971)]。高齢のニワトリでは腱断裂に至る恐れがある[Jones,Vet.Rec.,96:153−154(1975)]。
【0003】
レオウイルスは吸収不良又は虚弱ニワトリ症候群にも関連付けられている[Pageら,Avian Dis.,26:618−624(1982)]。この腸管症状は発育阻害、羽毛生育不良、色素減少、前胃肥大、腸炎及び足弱化により特徴付けられる。この疾患はレオウイルス感染の結果として飼料栄養の吸収不良に起因すると考えられていた[Hieronymusら,Avian Dis.,27:246−254(1983)]。
【0004】
レオウイルスに起因すると考えられる他の疾病は肝炎、心膜水腫、腹水、腎臓虚弱、小脾臓、心膜炎及び心筋炎である。
【0005】
これらの諸症状は、ブロイラーの品質低下及び種畜の繁殖能の低下をもたらし、控えめに見積もっても年間15,000,000ドルの経済的損失を招いている。
【0006】
米国では、van der Heideにより腱滑膜炎のフィールド症例から単離及び特徴付けされたニワトリレオウイルス株であるS1133の種々の継代段階から生ワクチンが開発されている。該株は漿尿膜(CAM)で37℃で235代、次いでニワトリ胚フィブロブラスト(CEF)で32℃で65代連続増殖された。CEFで37℃で更に135代継代された[van der Heideら,Avian Dis.,27:698−706(1983)]。
【0007】
現用の種畜ワクチン接種プログラムは、高代のS1133に由来する低毒性ワクチンを幼齢(7〜14日)のニワトリに接種し、該ワクチンよりもやや毒性の低代S1133ワクチンウイルスを6〜11週齢で生ワクチン接種し、場合によりこのやや毒性のS1133ワクチンで第3の生ワクチン接種を行った後、不活化ワクチンを接種することを推奨している。
【0008】
ブロイラーの場合もできるだけ早期に低毒性ワクチンを接種する。
【0009】
レオウイルスはマレック病ワクチン接種に干渉する恐れがあるので、現用ワクチンを1日齢で接種するのは推奨されない。公知レオウイルスワクチンはマレック病ワクチンに干渉するため、他の免疫感作と同時に公知レオウイルスワクチンを投与することができず、二次ワクチン接種が必要であった。Rosenberger,J.K.,Western Poultry Disease Conference Proceedings,pp.50−51,(1983)。
【0010】
更に、現用ワクチンは接種動物の腱に残存することが判明し(Montgomery,R.D.及びMaslin,W.R.,Avian Dis.,Vol.32,pp.461−468,1988)、増殖して関節炎や他の足障害を誘発し、卵を介して子孫に伝播(感染)される恐れがあった。
【0011】
理想的なワクチンとは、非病原性であり、ニワトリの体内に残存せず、マレック病ワクチンに干渉せず、従って1日齢でも投与することが可能なワクチンであると考えられる。
【0012】
【課題を解決するための手段】
レオウイルス疾患を有するニワトリから単離された新規ニワトリレオウイルス株が茲に発見された。この新規ウイルスは米国、Rockvill,MarylandのATCCに1994年3月10日付けで寄託され、寄託番号VR2499を付された。このウイルスの特性は非病原性であることと、ニワトリに接種するとレオウイルスの病原株に対する防御を提供することである。
【0013】
この発見に鑑み、本発明はレオウイルスに起因する疾病に対する家禽の防御のための、レオウイルス株2177を含むワクチンを提供する。本発明は更に単離株2177に関し、該株は本質的に非病原性であることが判明し、この株を接種した家禽の体内に残存せず、幼齢(例えば1日齢)で投与することが可能である。
【0014】
本発明のワクチンは株2177を単独で含んでもよいし、マレック病ウイルス、伝染性ファブリシウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、ニワトリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス及びニワトリ貧血因子のワクチン等、他の家禽用ワクチンと併用してもよい。
【0015】
Rosenbergerは、大腿頭骨壊死及び踝関節の炎症により主に特徴付けられる症状を有する商業的に飼育された幼齢ブロイラーからの109個のレオウイルス単離株の単離を開示している(Proc.Internatl.Union of Immunol.Soc.,No.66,Disease Prevention and Control in Poultry Production,Sydney NSW,Australia Aug.31−Sept.2,1983)。ウイルス単離は、臨床症状を有する1日齢〜約4週齢のニワトリから抽出した足関節スワブ及び均質化組織(骨髄、肝臓、脾臓及び腱)を5〜7日齢胚形成卵の卵黄嚢に接種することにより行われた。レオウイルス単離株は、死滅した胚からの漿尿膜を回収し、群特異的レオウイルス抗原の存在を立証することにより、接種した胚で同定された。レオウイルスを含む卵黄を集め、トリプトースリン酸ブロスで希釈し、−70℃で保存した。
【0016】
肉趾経路で感受性1日齢ブロイラーニワトリに接種することにより109個のレオウイルス単離株の病原性をスクリーニングした。単離株の11個は接種後3〜14日の間に肉趾と足の他の部分に炎症を生じた。これらの11個の単離株を選択して更に試験した。
【0017】
これらの11個の単離株の卵黄シードプールを一次ニワトリ胚フィブロブラスト(CEF)に接種した。1個の単離株(単離株2177)はCEFに接種した場合に細胞変性作用を生じないことが判明した。その後、細胞変性が観察されるまでこのウイルスを反復継代(14代)した。細胞及び細胞培養液を集め、凍結及び融解し、遠心分離により清澄化し、CEF中で成長するのに適した2177レオウイルス単離株を含む上清をアリコートに分割し、−70℃で保存した。
【0018】
標準プラークアッセイシステムを使用して細胞培養に適したレオウイルス2177をCEF細胞培養物で増殖させた。個別プラーク選択によりウイルスをプラーク精製した。プラーク精製したレオウイルス2177を6日齢ニワトリ胚形成卵の卵黄嚢に接種した。接種後24時間以上経過後に死滅した胚から卵黄を集め、レオウイルス2177の精製培養ストックとして使用した。
【0019】
このクローン化精製2177レオウイルスの遺伝子特徴及びニワトリにおける病原性をin vitro及びin vivoで特徴付けた。一般に、2177レオウイルスはニワトリにおいて本質的に非病原性であることが判明した。従って、このウイルス株は生ワクチンとして使用するのに理想的である。
【0020】
本発明のワクチンは生きた形態、弱毒形態又は不活化形態の2177ウイルスを含む。もっとも、好ましくはワクチンは生きたウイルスを含み、非病原性であるため、弱毒化又は不活化は不要である。
【0021】
生ワクチンを製造するためには、(CEFで14代継代後、ニワトリ胚で5〜6代継代することにより調製した)シードウイルスを細胞培養物、例えばCEF培養物もしくは他の哺乳動物細胞培養物(例えばVERO細胞)又は胚形成卵で増殖させる。こうして増殖したウイルスを組織培養液及び/又は細胞又は胚形成卵の組織もしくは液から回収する。生ワクチンは懸濁液として調製してもよいし、凍結乾燥してもよい。懸濁液形態を凍結保存してもよい。凍結乾燥形態では1種以上の安定剤を加えるのが好ましい。適切な安定剤としては例えば炭水化物(例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、デキストラン、グルコース)、タンパク質(例えばアルブミン又はカゼイン)又はその分解生成物、及び緩衝液(例えばアルカリ金属リン酸塩)を挙げることができる。任意に、アジュバント活性を有する1種以上の化合物も添加し得る。本発明のワクチンには任意の従来の安定剤及びアジュバントを添加し得る。
【0022】
ワクチンが凍結乾燥形態であるか懸濁液形態であるかを問わず、ワクチンはウイルスを回収する細胞培地から調製することができ、このような培地は例えばウイルス、胎児、新生又は子ウシ血清及び抗生物質を含む。使用される細胞培地の型は制限されず、ウイルスを増殖する細胞培養に従来使用されている任意の培地及び助剤であり得る。凍結乾燥製剤は更に、上述のようにウイルスと安定剤を単独又は培地助剤と共に含む。不活化ウイルスを含むワクチンは例えば、油エマルジョン又はトコールエマルジョン製剤中にウイルス、胎児、新生又は子ウシ血清、抗生物質を含有する細胞培地から構成され得る。
【0023】
ワクチン接種は任意の年齢で実施することができる。一般に生ワクチンは12週齢までに接種し、不活化ワクチンは14〜18週齢で接種する。in ovoワクチン接種は胚発生の最後の4分の1に実施する。ワクチンは皮下、スプレー、経口、眼内、気管内、鼻側又はin ovoのいずれの経路で投与してもよい。好ましくは、1日齢のニワトリにワクチン接種する。それ以後のニワトリは加齢耐性を生じると思われるが、ブリーダーニワトリは例えば8及び30週(2回接種)でもワクチン接種することができる。2177を接種した場合にはウイルスは残存せず、子孫に垂直伝播(感染)しないことが判明した。これに対して、S1133株は子孫に伝播される。
【0024】
一般に、ワクチン中の2177ウイルスの力価は1.0〜9.0log10TCID50/用量、より好ましくは2.0〜7.5log10TCID50/用量、最適には約4.0log10TCID50/用量である。
【0025】
2177株を含むワクチンの固有の特徴の1つは、干渉を生じることなく他のレオウイルスも含めた他のウイルスと組み合わせて多価ワクチンを形成できることである。レオウイルスはワクチン中で他のウイルスの活性に干渉することが示されているので、この特徴は固有である。これはマレック病ワクチンの場合に特に問題であった。例えばPoultry Science,Vol.62:1488,1983を参照されたい。2177ウイルスは以下のワクチン製剤:(a)血清型1(例えばCVI 988)、血清型2(例えばSB−1)及び血清型3(HVT)の全3種の血清型のマレック病ワクチン;(b)従来株(例えばD78)、デラウェア変異株(例えば変異株E,89−03)及び他の変異株(例えばGLS)を含む伝染性ファブリシウス病ウイルス(IBDVワクチン);(c)マレック病及びIBDV両者のワクチン;(d)ニューカッスル病ウイルス(NDV)/伝染性ファブリシウス嚢病ウイルス(IBV)ワクチン;(e)ニワトリ脳脊髄炎(AE);(f)鶏痘;並びに(g)ニワトリ貧血因子と組み合わせることができる。
【0026】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する。
【0027】
実施例1.レオウイルス2177病原性
A.ブロイラーにおける特徴付け
1.3経路でブロイラーに接種することによる特徴付け
a.手順
腹腔内、大脳内及び肉趾経路で1日齢ニワトリに接種することにより上記11個の単離株のin vivo特徴付けを行った。
【0028】
b.結果
単離株のうちの数個は全経路で病原性が高く、壊死、炎症、出血及び肝周囲炎を含む肝障害により特徴付けられる有意死亡率を生じることが判明した。2週間以上生存したニワトリの多くは肝周囲炎を発症した。他の単離株の病原性は多様であり、ただ1個のウイルス(2177)のみが比較的非病原性であった。
【0029】
これらの結果を表1に示す。
【0030】
【表1】
【0031】
2.体重減少、死亡率及び抗体産生
a.手順
上記レオウイルス単離株をin vivoで更に特徴付けるために、より自然な感作経路(経口及び気管内)で1日齢及び2週齢のブロイラーニワトリにウイルスを接種した。体重、死亡率及び抗体産生を接種後数週間モニターした。
【0032】
b.結果
結果は、2177が比較的非病原性であるという最初の分類を裏付けるものであった。病原性の高い殆どのウイルス単離株はレオウイルス2177に比較して死亡率が高く(表2)、平均体重が低く(表3)、高頻度の抗体応答を誘発した(表4)。これとは対照的に、2177を注射したニワトリの死亡率及び平均体重は対照の死亡率及び平均体重と同等であった。更に、2177を注射したニワトリにおける血清抗体応答は、より毒性の単離株を注射したニワトリにおける抗体応答より低頻度であった。この実験及び結果は、Rosenbergerら,Avian Dis.33:535−544(1989)に報告されている。
【0033】
【表2】
【0034】
【表3】
【0035】
【表4】
【0036】
3.組織向性及び組織病理
a.手順
感染組織の組織向性とそれに続く組織病理試験の結果も同様に、2177が他の単離株よりも非病原性であることを示した。1日齢ブロイラーニワトリに経口及び気管内経路で種々のレオウイルス単離株を接種した。接種後(PI)4、7、10及び14日目に各接種材料群からのニワトリを殺し、膵臓、肝臓、気管、腓腹筋及び腸の3領域の切片を採取し、ウイルス単離及び組織病理評価を行った。
【0037】
b.結果
結果によると、より毒性な単離株である1733及び2408は14日間のサンプリング期間を通して全組織から単離された。2177単離株は接種後17日目に肝臓、気管及び腸から回収されたが、10及び14日目にはウイルスが単離される器官とされない器官があった。2177単離株は腱からはどの時点でも単離されなかった(表5参照)。
【0038】
これらの組織の組織病理評価の結果、2177を除く全レオウイルス単離株は顕微的病変を誘発することが判明した(表6)。単離株2177を接種したニワトリでは顕微的病変は検出されなかったので、同単離株は表から省略した。
【0039】
【表5】
【0040】
【表6】
【0041】
実施例2:SPFレグホンにおける2177の特徴付け
1.3種の異なる経路でレグホンに接種することによる特徴付け
a.手順
SPFレグホンで同様にレオウイルス2177のin vivo特徴付けを行った。これは、レオウイルス2177、2035、S1133、2408及び1733の連続希釈液を調製し、経口、気管内又は肉趾経路で1日齢ニワトリに接種することにより実施した。ニワトリの肉趾炎症、死亡率及び体重減少の相違を観察した。
【0042】
b.結果
1)肉趾炎症
結果は、肉趾炎症を生じさせるために必要なウイルスの量が非常に少量であることを示した。2177を除く全単離株は1.0log10胚致死量(ELD)50未満で炎症を誘発した。レオウイルス2177で炎症を誘発するには2.2log10ELD50が必要であった(表7参照)。
【0043】
2)死亡率
ニワトリの死亡率の結果によると、一定した死亡率パターンをもたらした唯一の接種経路は肉趾接種経路であった。また、2177は高ウイルス濃度(4.3log10ELD50)で接種したニワトリで死亡が生じなかったので、非病原性であることが判明した。他のレオウイルス単離株の場合には、ニワトリ50%致死量は1.6〜3.7log10ELD50であった(表8参照)。
【0044】
3)体重減少
気管内及び肉趾経路で接種したニワトリで成長率の低下が生じた。経口接種したニワトリでは1733を最高濃度で接種した場合のみに体重減少を生じた。体重減少が最も顕著であったのは肉趾経路で接種したニワトリであった。レオウイルス単離株2408及び1733は夫々<0.7及び1.0log10ELD50で26%もの体重減少を生じた。単離株2035及びS1133も体重減少を生じた。単離株2177は試験ウイルス濃度では全く体重減少を生じなかった(表9参照)。
【0045】
【表7】
【0046】
【表8】
【0047】
【表9】
【0048】
2.SPFレグホンにおける2177感染の組織向性及び組織病理試験
a.手順
3種のレオウイルス単離株2177、2035及び1733を使用して気管内(IT)経路で1日齢SPFレグホンに接種した。接種後種々の時点で各ウイルス群からの3羽のニワトリから採血し、殺して胸腺(th)、気管(tr)、肝臓(li)、腸(in)、盲腸扁桃(ct)、脾臓(sp)、ファブリシウス嚢(bu)、腱(te)、赤血球(RBC)、白血球(WBC)及び血漿(p)を取り出した。組織を処理してウイルス単離及び組織病理を試験した。
【0049】
b.結果
1)肉眼的病変及び死亡率
剖検における肉眼的病変の出現及び死亡率百分率は1733を接種したニワトリで最大であった(表10参照)。1733及び2035の両者は感染及び致死性の兆候を示したが、2177接種群では際立った致死性又は病変は観察されなかった。
【0050】
2)ウイルス単離
1日齢で3種の疾病型を接種したニワトリからのウイルス単離の結果、1733は感染組織数が多く、最も毒性であることが判明した(表11参照)。他方、2177はウイルスが主に盲腸扁桃から再単離されたので、非毒性であった。
【0051】
3)残存性
高毒性単離株である1733は最も長期間残存することが立証された。ウイルスは接種後22週目にもニワトリの腱から再回収された。単離株2035も腱に残存することが観察されたが、接種後49日間に過ぎなかった。単離株2177は腱ではどの時点でも検出されず、28日齢まで盲腸扁桃で検出されたのみであった。
【0052】
4)顕微的病変
ウイルス単離に陽性であった組織(胸腺、肝臓、脾臓、ファブリシウス嚢及び腱)を選択し、更に顕微的病変を評価した。これらの感染組織及び病変評点系で観察された病変を表12に示す。これらの病変の重篤度は単離株に依存した(表13参照)。単離株1733は胸腺で中度の病変を示し、脾臓、ファブリシウス嚢及び腱で重度の病変を示したので、他の単離株よりも毒性であると思われた。2035の重篤度は著しく低く、2177は顕微的病変を生じなかった。
【0053】
【表10】
【0054】
【表11】
【0055】
【表12】
【0056】
【表13】
【0057】
3.SPFレグホンにおける2177の免疫抑制試験
a.手順
1日齢にSPFレグホンに2177、2035又は1733をIT経路で接種した。7日及び21日齢に採取した末梢血液リンパ球(PBL)でマイトジェン刺激アッセイを実施した。
【0058】
b.結果
1日齢のレグホンに単離株1733を接種後7日目にPBLの芽体発生トランスフォーメーション能の顕著な低下が観察された(表14参照)。ニワトリから採取したPBLの刺激指数は38.0に過ぎず、これに対して非接種対照並びに2177及び2035からのPBLはいずれも84.4〜116.9という著しく高い刺激指数を示した。
【0059】
【表14】
【0060】
接種後21日目にニワトリからPBLを採取した処、1733の抑制作用はもはや観察されず、2035又は2177を接種したニワトリでは免疫抑制は観察されなかった。
【0061】
実施例3:分子特徴付け
ニワトリレオウイルスは2本鎖RNA(dsRNA)の10セグメントから構成されるゲノムを有する。生化学的特徴付けによると、種々の単離株の2本鎖セグメントの泳動パターンには顕著な相違が存在することが立証されている。参考資料として本明細書の一部とするGouvea及びSchnitzer,J.Virology,43:465−471(1982)を参照されたい。
【0062】
感染細胞からの細胞質RNAをSharpe及びFields(J.Virology 38:389−392,1981)により記載されているように抽出した。Cross及びFields(J.Virology,19:162−173,1976)により記載されているように不連続Tris−グリシン緩衝液系中、スラブゲル中でポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を実施した。X−Omatフィルム(Kodak)を−70℃で乾燥ゲルに密着させることによりラジオオートグラフィーを実施し、標準写真技術により現像した。
【0063】
数年間にわたって採取されたフィールドサンプルである相当数の種々のニワトリレオウイルス単離株をコネチカット州及びデラウェア州から入手した。更に、米国内の他の地域、英国、スコットランド及びドイツから入手したレオウイルス単離株並びに原型日本株も分析した。これらのデータによると、同一地域内から単離されたウイルスのdsRNA泳動パターンが最もよく似ていた。他方、単離株2177は同一地域内で得られた他の単離株と著しく異なる泳動パターンを示した。恐らく、2177に感染したニワトリは他の単離株に感染したニワトリと同様の育種に由来するものであった。更に、地理的にすぐ近接する地域以外からのニワトリは最近は導入されていなかった。
【0064】
特に、同一地域から得た他の全単離株からの同一RNAバンドに比較して、M2 RNAバンドはゆっくりと泳動し、S3 RNAバンドは迅速に泳動した。
【0065】
実施例4.生レオウイルスワクチンの最小防御量試験
本試験の目的は、皮下(SC)経路で1日齢SPFニワトリに接種した場合に生成物継代におけるレオウイルス単離株2177の効力を立証することであった。この試験及びその後のワクチン試験のために、CEFで14代継代後、ニワトリ胚で5〜6代継代することによりマスターシードを調製した。細胞培養物(CEF)で更に4代継代することにより所謂生成物継代を得た。
【0066】
161日齢ニワトリを各40羽ずつの3群と各20羽ずつの2群に分け、ステンレス鋼負圧アイソレーターユニットに入れた。各40羽を含む群にSC経路で接種物(マスターシードウイルスから第4代目の継代でニワトリ胚フィブロブラストで調製し、トリプトースリン酸ブロスで希釈したレオウイルス株2177)0.1mlを接種し、1羽当たり約2.5、3.0及び3.5log10TCID50の用量の2177を与えた。各20羽を含む2群は一緒に1つのアイソレーターに入れ、非ワクチン接種非攻撃対照及び非ワクチン接種攻撃対照として使用した。
【0067】
ワクチン接種後3週目に全ニワトリをコロニーハウスに移した。ワクチン接種動物と一方の非ワクチン接種動物群に肉趾経路でS1133攻撃ウイルス0.1mlで攻撃した(攻撃ウイルスはTPBで1:10,000に希釈したU.S.D.A.S1133とした)。非ワクチン接種非攻撃対照は攻撃せずにおいた。
【0068】
攻撃後6〜14日目の肉趾読み取りを使用して防御百分率を決定した。レオウイルス攻撃後5日以内に生じる腫張は非特異的であると見なされるので4及び5日目の読み取りは使用しなかった。各ニワトリの肉趾炎症得点の9日間累積を求めた。
【0069】
非ワクチン接種攻撃対照の肉趾腫張の平均及び標準偏差を使用して防御を決定した。肉趾炎症累積値が非ワクチン接種攻撃対照の肉趾炎症の平均から2つの標準偏差を減じた差よりも小さい場合にニワトリは防御されていると判定した。
【0070】
この試験の結果を下記表15に示す。データによると、肉趾炎症により判定した場合、ワクチン接種後3週目にS1133攻撃ウイルスで攻撃したニワトリではこの試験で使用したレオウイルス2177の最小用量である2.5log10TCID50で有効である。このデータによると更に、2.5log10TCID50の用量でレオウイルス2177をワクチン接種したニワトリの100%が防御されたことから、レオウイルス2177の最小防御量は<2.5log10TCID50であると思われる。
【0071】
【表15】
【0072】
実施例5:レオウイルス単離攻撃モデル、生レオウイルスワクチン
この試験の目的は、ウイルス単離攻撃モデルを分析し、一般に吸収不良症候群に関連する毒性レオウイルス(1733株)で攻撃した際のレオウイルス単離株2177の効力を立証することであった。
【0073】
要約すると、1日齢ニワトリを4群に分け、群1及び3は皮下経路で0.1ml用量当たり約5.0log10TCID50の2177をワクチン接種した(ワクチン調製物は実施例4と同一とした)。群1のニワトリは気管内(IT)経路で攻撃した。群3のニワトリは肉趾経路で攻撃した。群2及び4は対照群としてワクチン接種しなかった。結果を下記表16に示す。
【0074】
攻撃ウイルスは、0.1ml用量当たり約4.0log10TCID50を含有するようにTPBで希釈したレオウイルス1733の調製物とした。
【0075】
ワクチン群1及び2のニワトリは気管内経路で0.1ml用量当たり4.0log10TCID50のレオウイルス1733を16日齢で攻撃した。ワクチン接種群3及び4のニワトリは肉趾経路で攻撃1733レオウイルスの同一調製物で攻撃した。
【0076】
攻撃日にワクチン接種動物(群1)からの5羽及び非ワクチン接種対照(群2)からの5羽を殺し、脾臓を取り出してウイルス単離した。この時点で単離されたウイルスはワクチンウイルスであった。
【0077】
IT経路で攻撃したニワトリ(群1及び2)を攻撃後5日目に殺して脾臓を取り出し、ウイルス単離した。攻撃後5日目から出発して、肉趾経路で攻撃したニワトリ(群3及び4)に肉趾の腫張が生じたか否かを5日間毎日観察した。
【0078】
ニワトリから取り出した脾臓を、0.75%ネオマイシンを含有するTPB 1ml中に置いた。組織を組織グラインダーで粉砕した。サンプルに更に1.0mlを加え、5日齢胚形成卵に0.1mlを接種した。卵を10日間毎日明かりに透かして死亡率を調べた。10日間以内に死滅した胚から漿尿膜を取り出し、寒天ゲル沈殿によりレオウイルス抗原の存在を試験した。未知サンプルと陽性公知レオウイルスサンプルとの間に同一線が形成された場合に組織はレオウイルス陽性であると判定した。
【0079】
【表16】
【0080】
本実験の目的は、吸収不良症候群に一般に結び付けられるレオウイルスである1733株で攻撃した場合にレオウイルス2177が腱滑膜炎攻撃株(S1133)よりもニワトリを防御することができたか否かを判定することであった。実験は、防御を決定するための手段として肉趾攻撃の代わりに脾臓からのウイルス単離を使用するように設計した。胚形成卵に粉砕脾臓サンプルを接種し、寒天ゲル沈殿試験で漿尿膜にレオウイルス抗原が存在するか否かを試験することによりウイルス単離を実施した。
【0081】
その結果、ウイルス単離法で試験したワクチン接種ニワトリの90%が防御され、これに対して肉趾経路で攻撃したニワトリの防御は100%であった。非ワクチン接種対照では、ウイルス単離法で試験したニワトリの95%が感受性であり、これに対して肉趾炎症法で試験したニワトリでは91%が感受性であった。
【0082】
この試験の結果は以下の2点を立証するものである。(1)レオウイルス2177株でワクチン接種し且つ腱滑膜炎株S1133の代わりにレオウイルス吸収不良株1733で攻撃したニワトリにおける防御を判定するために、ウイルス単離法を使用することができる。(2)2177ワクチンは吸収不良1773で攻撃した際にニワトリに防御を提供する。
【0083】
実施例6:レオウイルス株2177のHVT/SB−1ワクチン接種干渉試験
本試験の目的は、レオウイルス株2177がHVT/SB−1ワクチン接種効力に干渉するか否かを判定することであった。試験の設計を下記表17に示す。
【0084】
【表17】
【0085】
ワクチン接種日にHVTのアンプル2個及びSB−1のアンプル2個を融解し、一緒にしてマレック希釈剤400mlに再懸濁した。次いで、この混合物を100mlずつ4つのアリコートに分割した。1つのアリコートはHVT/SB−1ワクチン接種群として別にした。残りのアリコートの1つに1mlのレオウイルス2177を加え、2177/HVT/SB−1群とした。残りの2つのアリコートは使用しなかった。
【0086】
ワクチン接種日に再懸濁HVT/SB−1組み合わせを10回反復滴定した。これらの反復滴定の5回は一次CEF細胞で実施してSB−1力価を測定し、これらの反復滴定の5回は二次CEFで実施し、TVT力価を測定した。
【0087】
レオウイルス2177/HVT/SB−1を含有するワクチンを凍結し、レオウイルス2177を一次CEFで5回反復滴定した。
【0088】
用量当たり約500プラーク形成単位のマレック病ウイルスのRB1B株を使用して5日齢のニワトリに腹腔内攻撃した。マレック病はマレック病の肉眼的病変及び臨床兆候が観察されるまでに約3〜4週間のインキュベーション期間を有するので、攻撃後第1週以内に死亡したニワトリは非特異的原因で死亡したと判断した。これらのニワトリと攻撃前に死亡したニワトリは防御評価から除外した。この攻撃期間後1週間後に病変を有するか又は死亡したニワトリの数を攻撃後第1週後に生存し続けているニワトリの合計数で除して、防御されたニワトリの百分率を決定した。
【0089】
各ウイルスで反復滴定した結果、2種のワクチンの調製物は下記ウイルス力価を含むことが判明した。
【0090】
【表18】
【0091】
防御結果から明らかなように、HVT/SB−1ワクチン接種動物ではニワトリの88%が防御された。2177/HVT/SB−1をワクチン接種した群では89%が防御された。非ワクチン接種攻撃対照ではニワトリの4%は病変を示さなかった(下記表19参照)。換言するならば、結果はレオウイルス株2177を含むHVT/SB−1ワクチンの効力がレオウイルス2177を含まないHVT/SB−1の同一調製物と相違しないことを示す。従って、レオウイルス2177をHVT/SB−1ワクチンに加えてもマレック病ワクチンの効力に干渉しない。
【0092】
【表19】
【0093】
更に、HVT/SB−1ワクチンが2177ワクチンの効力を干渉したか否かについて試験した。その結果、用量当たり4.2log10TCID50のレオウイルス2177、用量当たり5636PFUのHVT及び5733PFUのSB−1を含有するワクチンを調製した処、レオウイルス2177ワクチンの効力に何ら影響しなかった。混合ワクチンの防御百分率は93%であり、これに対してレオウイルス2177を単独で使用した場合の防御は100%であった。
Claims (18)
- ニワトリに投与するワクチン製剤中に有効量で配合され、病原性トリレオウイルスによる攻撃に対する防御を提供し、同時投与したマレック病ワクチンの活性に干渉しない、ATCCに寄託番号VR2449で寄託された2177株と呼称される非病原性トリレオウイルス。
- 請求項1に記載の非病原性トリレオウイルスを含むワクチン。
- レオウイルスが不活化形態である請求項2に記載のワクチン。
- 請求項1に記載の非病原性トリレオウイルスと少なくとも1種のマレック病ワクチンとを含む混合ワクチン。
- 少なくとも1種のマレック病ワクチンがSB−1、HVT及びCVI 988からなる群から選択される請求項4に記載の混合ワクチン。
- 少なくとも1種のマレック病ワクチンがSB−1及びHVTからなる群から選択される請求項4に記載の混合ワクチン。
- 請求項1に記載の非病原性トリレオウイルスと伝染性ファブリシウス嚢病ウイルスワクチンとを含む混合ワクチン。
- 少なくとも1種のマレック病ワクチン及び少なくとも1種の伝染性ファブリシウス嚢病ウイルスワクチンと共に請求項1に記載の非病原性トリレオウイルスを含む混合ワクチン。
- 請求項1に記載の非病原性トリレオウイルス、ニューカッスル病ウイルスワクチン及び伝染性気管支炎ウイルスワクチンを含む混合ワクチン。
- 鶏脳脊髄炎、鶏痘及び鶏貧血因子からなる群から選択される1種以上のウイルスのワクチンと共に請求項1に記載の非病原性トリレオウイルスを含む混合ワクチン。
- 請求項1に記載の非病原性レオウイルスを含む有効量のワクチンを投与することからなる、トリレオウイルス感染に対するニワトリの免疫方法。
- ワクチンが有効量の少なくとも1種のマレック病ワクチンを更に含む請求項11に記載の方法。
- 少なくとも1種のマレック病ワクチンがSB−1、HVT及びCVI 988からなる群から選択される請求項11に記載の方法。
- 少なくとも1種のマレック病ワクチンがSB−1及びHVTからなる群から選択される請求項13に記載の方法。
- ワクチンが有効量の伝染性ファブリシウス嚢病ウイルスワクチンを更に含む請求項11に記載の方法。
- ワクチンが少なくとも1種のマレック病ワクチンと少なくとも1種の伝染性ファブリシウス嚢病ウイルスワクチンを更に含む請求項11に記載の方法。
- ワクチンがニューカッスル病ウイルスワクチン及び伝染性気管支炎ウイルスワクチンを更に含む請求項11に記載の方法。
- ワクチンが鶏脳脊髄炎、鶏痘及び鶏貧血因子からなる群から選択される1種以上のウイルスのワクチンを更に含む請求項11に記載の方法。-
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