ES2328300T3 - Cepa 2177 de reovirus y vacunas que contienen la misma. - Google Patents

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Donald Eugene Roessler
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Abstract

Un reovirus aviar, denominado cepa 2177, como se ha depositado en la ATCC bajo el número de entrada VR 2449.

Description

Cepa 2177 de reovirus y vacunas que contienen la misma.
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Campo de la invención
La presente invención se refiere a un reovirus apatógeno, denominado cepa 2177 y vacunas que comprenden la cepa 2177.
Antecedentes de la invención
Los reovirus aviares se han asociado con una amplia variedad de patologías en aves de corral comerciales. La enfermedad de reovirus más económicamente importante es el síndrome de artritis/tenosinovitis. Esta afección se caracteriza por hinchazón de la vaina del tendón del metatarso inmediatamente por encima de la articulación del corvejón dando como resultado cojera de grados variables. La hinchazón global puede dar como resultado la renuencia del pollo al moverse. Los tendones afectados se pueden volver firmes y fibróticos y las adhesiones a la vaina del tendón y la piel pueden dar como resultado un tendón parcialmente no funcional [Johnson et al., Avian Dis 15: 829-834 1971)]. La ruptura del tendón puede ocurrir en aves mayores [Jones et al., Vet.Rec., 96: 153-154 (1975)].
Los reovirus también se han asociado con un síndrome denominado síndrome de mala absorción o del ave pálida [Page et al., Avian Dis., 26: 618-624 (1982)]. Esta afección intestinal se ha caracterizado por crecimiento retardado, plumaje escaso, pérdida de pigmentación, agrandamiento de los pro-ventrículos, enteritis y debilidad de la patas. Esta enfermedad se ha pensado que se debe a la mala absorción de nutrientes alimenticios como resultado de infección por reovirus [Hieronymus et al., Avian Dis., 27: 246-254 (1983).
Otras patologías que se cree que están causadas por reovirus son hepatitis, hidropericardio, ascitis, riñones pálidos, vasos pequeños, pericarditis y miocarditis.
Estas afecciones dan como resultado pérdidas económicas debido a la bajada de categoría de pollos y mal rendimiento en reproductores que se ha estimado, de forma conservadora, en 15 millones de dólares por año.
Las vacunas vivas en los Estados Unidos se han desarrollado a partir de diversos niveles de pases de una cepa de reovirus aviar, S1133, aislada y caracterizada por van der Heide a partir de un caso de campo de tenosinovitis. La cepa se cultivó en serie 235 veces en la membrana corioalantoidea (CAM) a 37ºC y después 65 veces en fibroblastos de embrión de pollo (CEF) a 32ºC. Se realizaron 135 pases adicionales a 37ºC en CEF [van der Heide et al., Avian Dis., 27: 698-706 (1983)].
Los programas de vacunación actuales en reproductores recomiendan vacunar pollos siendo muy pequeños (7-14 días) con una vacuna suave obtenida a partir de un pase elevado de S1133, un vacunación viva a las 6-11 semanas de edad con un virus de vacuna S1133 ligeramente más virulento obtenido a partir de un pase inferior, con posiblemente una tercera vacunación viva con la misma vacuna de S1133 ligeramente más virulenta, seguido de vacunación con productos muertos.
En pollos de engorde, la vacunación también se realiza tan jóvenes como sea posible con una vacuna suave.
La vacunación a 1 día de edad no se recomienda con vacunas actuales debido a la posibilidad de interferencia de reovirus con vacunación de Marek. La interferencia con vacuna de Marek ha evitado la administración de las vacunas de reovirus conocidas al mismo tiempo que otras inmunizaciones y ha requerido una segunda serie de vacunaciones. Rosenberger, J. K., Wester Poultry Disease Conference Proceedings, págs. 50-51, (1983).
Además, se ha observado que las vacunas actuales persisten en los tendones de los vacunados (Montgomery, R. D. y Maslin, W. R., Avian Dis., Vol. 32, págs. 461-468, 1988) con el potencial de multiplicarse y provocar artritis u otros problemas de las patas así como transmitirse a través del huevo a los descendientes.
Una vacuna ideal sería una que fuera no patógena, que no persistiera en los pollos y que no interfiriera con las vacunas de Marek y, por tanto, se pueda administrar a 1 día de edad.
Sumario de la invención
Ahora se ha encontrado una nueva cepa de reovirus aviar, que se aisló a partir de pollos con enfermedad de reovirus. Este nuevo virus se depositó en la ATCC, Rockville, Maryland, EE.UU. el 10 de Marzo de 1994 y se le asignó el Número de Entrada VR 2449. Una propiedad característica de este virus es que es apatógeno y que cuando se inocula en pollos proporciona protección frente a cepas patógenas de reovirus.
Considerando este descubrimiento, de acuerdo con la presente invención, se proporciona una vacuna para la protección de aves de corral frente a patologías causadas por reovirus, donde la vacuna comprende cepa 2177 de reovirus. La presente invención también se refiere a la cepa 2177 aislada, que se ha observado que es básicamente no patógena, no persiste en pollos que se inoculan con la cepa y que se puede administrar a muy corta edad (por ejemplo, un día de edad).
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La vacuna de la presente invención puede incluir cepa 2177 sola o en combinación con otras vacunas virales de aves de corral, tales como las de Virus de Enfermedad de Marek, Virus de Enfermedad Bursal Infecciosa, Virus de Enfermedad de Newcastle, Virus de Bronquitis Infecciosa, Virus de Encefalomielitis Aviar, Virus de Viruela Aviar y Agente de Anemia del Pollo.
Descripción detallada de la invención
Rosenberger describió el aislamiento de ciento nueve aislados de reovirus a partir de pollos de engorde jóvenes criados comercialmente aquejados con una afección caracterizada principalmente por necrosis de la cabeza femoral e inflamación de las articulaciones del corvejón (Proc. Internatl. Union of Immunol. Soc., Nº 66, Disease Prevention and Control in Poultry Production, Sydney NSW, Australia 31 de agosto - 2 de sept. de 1983). Los aislamientos de virus se consiguieron mediante inoculación de huevos embrionados de 5 a 7 días de edad a través del saco vitelino con frotis de articulación de la pata y con tejidos homogeneizados (médula ósea, hígado, bazo y tendones) de pollos aquejados clínicamente que variaban en edad de 1 día de edad a aproximadamente 4 semanas de edad. Los aislados de reovirus se identificaron en los embriones inoculados recogiendo las membranas corioalantoideas de los embriones que murieron y demostrando la presencia del antígeno de reovirus específico de grupo. La yema, que contenía reovirus, se recogió, diluyó en caldo de fosfato de triptosa y se almacenó a -70ºC.
Los ciento nueve asilados de reovirus se exploraron para determinar patogenicidad inoculando pollos de engorde de un día de edad sensibles a través de la vía de la almohadilla plantar. Once de los aislados produjeron inflamación de la almohadilla plantar y otras partes de la pata entre 3 y 14 días después de la inoculación. Estos once aislados se seleccionaron para estudios adicionales.
Los conjuntos de siembra de yema de estos once aislados se inocularon en fibroblastos de embrión de pollo primario (CEF). Un aislado (aislado 2177) se observó que era incapaz de producir ningún efecto citopático cuando se inoculaba en CEF. Después se realizaron pases repetidamente de este virus (14 veces) hasta que se observó citopatología. Las células y líquidos del cultivo celular se recogieron, congelaron y descongelaron, se clarificaron por centrifugación y se realizaron alícuotas del sobrenadante que contenía el aislado de reovirus 2177 adaptado para el cultivo en CEF y se almacenó a -70ºC.
El reovirus 2177 adaptado para cultivo celular se propagó en cultivos de células CEF usando un sistema de ensayo de placa convencional. El virus se purificó por placa mediante selección de placa individual. El virus 2177 purificado por placa se inoculó en el saco vitelino de huevos de pollo embrionados de 6 días de edad. Se recogieron yemas de los embriones que murieron 24 horas o más después de la inoculación y se usaron como reservas de trabajo purificadas de reovirus 2177.
Este reovirus 2177 clonado purificado se caracterizó in vitro e in vivo para determinar características genéticas y patogenicidad en pollos. En general, se observó que el reovirus 2177 era básicamente no patógeno en pollos. Esto hace a esta cepa viral ideal para uso como una vacuna viva.
Las vacunas de acuerdo con la presente invención comprenden el virus 2177 en forma viva, atenuada o inactivada. Sin embargo, preferiblemente la vacuna contiene virus vivo; debido a su no patogenicidad, no son necesarias atenuación o inactivación.
Para la preparación de la vacuna viva, el virus de base (preparado mediante 14 pases en CEF seguido por 5 a 10 pases en embriones de pollo) se puede cultivar en cultivo celular, por ejemplo cultivo de CEF u otros cultivos de células de mamífero (por ejemplo, células VERO) o en huevos embrionados. El virus cultivado de este modo se puede recoger recolectando los líquidos y/o células del cultivo tisular o a partir de los tejidos o líquidos de los huevos embrionados. La vacuna viva se puede preparar en forma de una suspensión o puede ser liofilizada. La forma de suspensión se puede almacenar congelada. En la forma liofilizada, es preferible añadir uno o más estabilizantes. Los estabilizantes adecuados incluyen, por ejemplo, carbohidratos (tales como sorbitol, manitol, almidón, sucrosa, dextrano y glucosa), proteínas (tales como albúmina o caseína) o productos de degradación de las mismas y tampones (tales como fosfatos de metales alcalinos). Opcionalmente, también se pueden añadir uno o más compuestos que tengan actividad adyuvante. Se puede incluir cualquiera de los estabilizantes y adyuvantes convencionales en una vacuna de acuerdo con esta invención.
Para la forma liofilizada o la forma de suspensión de la vacuna, las vacunas se pueden formular del medio de cultivo celular a partir del cual se obtiene el virus, lo que incluiría el virus, suero fetal, de recién nacido o de ternera y antibióticos. El tipo de medio de cultivo celular empleado no está limitado y puede ser cualquier medio y complementos usados convencionalmente para el cultivo celular en el que se cultiva el virus. Las formulaciones liofilizadas comprenderán además el virus y estabilizantes, solos o en combinación con los complementos del medio, como se ha mencionado anteriormente. Una vacuna que contenga virus inactivado puede, por ejemplo, comprender el medio del cultivo celular que contiene el virus, suero fetal, de recién nacido o de ternera, antibióticos, en una formulación de emulsión oleosa o emulsión de tocol.
La vacunación se puede realizar a cualquier edad. Normalmente, la vacunación se produciría hasta a las 12 semanas de edad para el producto vivo y entre 14-18 semanas para la vacuna inactivada. Para la vacunación in ovo, la vacunación se debería realizar en el último cuarto del desarrollo embrionario. La vacuna se puede administrar por vía subcutánea, por pulverización, por vía oral, intraocular, intratecal, nasal o in ovo. Preferiblemente, los pollos se vacunan a un día de edad. Parece que los pollos mayores desarrollan resistencia por edad; pero los pollos reproductores todavía se pueden vacunar a, por ejemplo, 8 y 30 semanas (2 inoculaciones). Se ha observado que la inoculación con 2177 no produce virus persistente y no existe transmisión vertical a la descendencia. Por otra parte, La cepa S1133 se pasa a la descendencia.
En general, el título del virus 2177 en la vacuna puede ser un valor de 1,0 a 9,0 logaritmo en base 10 de TCDI_{50} por dosis; más preferiblemente, el título es 2,0 a 7,5 por dosis; y lo más preferible, el título de virus es aproximadamente 4,0 logaritmo en base 10 de TCDI_{50} por dosis.
Una de las características únicas de vacunas que comprenden la cepa 2177 es que se pueden combinar para formar una vacuna multivalente con otros virus, incluso otros reovirus, sin causar interferencia. Esto es único entre los reovirus, que han demostrado interferir con la actividad de otros virus en vacunas. Esto ha sido un problema particular con las vacunas de enfermedad de Marek. Véase, por ejemplo, Poultry Science, Vol. 62: 1488, 1983. El virus 2177 se puede combinar con las siguientes formulaciones de vacuna: (a) los tres serotipos de vacunas de Enfermedad de Marek: serotipo 1 (por ejemplo, CVI988); serotipo 2 (por ejemplo, SB-1) y serotipo 3 (HVT); (b) Virus de la Enfermedad Bursal Infecciosa (vacunas de IBDV): cepas clásicas (por ejemplo, D78); variantes de Delaware (por ejemplo, variante E, 89-03) y otras variantes (por ejemplo, GLS); (c) vacunas tanto de la Enfermedad de Marek como de IBDV; (d) vacunas del Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV)/Virus de Bronquitis Infecciosa (IBV); (e) Encefalomielitis Aviar (AE); (f) Viruela Aviar y (g) Agente de Anemia del Pollo.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente las realizaciones de la presente invención.
Ejemplo I Patogenicidad de reovirus 2177 A. Caracterización en pollos de engorde 1. Caracterización inoculando pollos de engorde a través de tres vías a. Procedimiento
La caracterización in vivo de los once aislados a los que se ha hecho referencia anteriormente se condujo inoculando pollos de 1 día de edad por las vías intra-abdominal, intracerebral y de la almohadilla plantar.
b. Resultados
Se observó que varios de los aislados eran altamente patógenos por todas las vías produciendo mortalidad significativa caracterizada por daño de hígado que incluía necrosis, inflamación, hemorragia y perihepatitis. La pericarditis no fue poco común en aves que sobrevivieron durante dos semanas o más. Otros aislados variaron en patogenicidad con sólo un virus (2177) siendo relativamente apatógeno.
Estos resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1 Patogenicidad de varios reovirus aviares para pollos de engorde comerciales de 1 día de edad cuando se inoculaban^{1} por diversas vías
1
2. Disminución de peso, mortalidad y producción de anticuerpo a. Procedimiento
Para caracterizar adicionalmente los aislados de reovirus anteriores in vivo, los virus se inocularon en pollos de engorde de 1 día de edad y 2 semanas de edad mediante vías más naturales de exposición (oral e intratraqueal). Los pesos, mortalidad y producción de anticuerpo se supervisaron durante varias semanas después de la inoculación.
b. Resultados
Los resultados apoyaron la clasificación original de que 2177 era relativamente apatógeno. Los aislados de virus más patógenos produjeron tasas de mortalidad más altas (Tabla 2), pesos corporales promedio más bajos (Tabla 3) e indujeron una respuesta de anticuerpo más consistente que el reovirus 2177 (Tabla 4). Por el contrario, la mortalidad y pesos corporales medios en pollos infectados con 2177 fueron equivalentes a la mortalidad y los pesos corporales medios de los controles. Además, la respuesta de anticuerpo en suero en pollos a los que se inyectó 2177 fue menos consistente que la respuesta de anticuerpo en pollos a los que se inyectaron aislados más virulentos. Este experimento y resultados se informaron en Rosenberger et al. Avian Dis. 33: 535-544 (1989).
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TABLA 2
3
TABLA 3
5
TABLA 4
7 
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3. Tropismo e histopatología de tejidos a. Procedimiento
El tropismo de tejido e histopatología posterior de tejidos infectados también indicó que 2177 fue apatógeno en comparación con los otros aislados. Pollos de engorde de un día de edad se inocularon con los diferentes aislados de reovirus a través de la vía oral e intratraqueal. A los 4, 7, 10 y 14 días después de la inoculación (PI) los pollos de cada grupo de inóculo se sacrificaron y se recogieron cortes del páncreas, hígado, tráquea, tendón gastrocnemio y tres áreas del intestino para aislamiento de virus y evaluación histopatológica.
b. Resultados
Los resultados indicaron que los aislados más virulentos, 1733 y 2408, se podían aislar a partir de todos los tejidos a través del periodo de muestreo de 14 días. El aislado 2177 se recuperó del hígado, tráquea e intestino el día 7 PI, pero el día 10 y 14 el aislamiento del virus fue irregular. El aislado 2177 no se aisló del tendón en ningún momento (véase la Tabla 5).
La evaluación histopatológica de estos tejidos indicó que todos los aislados de reovirus excepto 2177 causaron lesiones microscópicas (Tabla 6). El aislado 2177 se omitió de la tabla ya que no observaron lesiones microscópicas en pollos inoculados con este aislado.
TABLA 5
8 
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TABLA 6
9
Ejemplo II Caracterización de 2177 en leghorns SPF 1. Caracterización mediante inoculación de leghorns a través de tres vías diferentes. a. Procedimiento
La caracterización in vivo de reovirus 2177 también se realizó en leghorns SPF. Esto se realizó preparando una serie de diluciones de reovirus 2177, 2035, S1133, 2408 y 1733 e inoculando pollos a 1 día de edad mediante las vías oral, intratraqueal o de la almohadilla plantar. Los pollos se observaron para determinar diferencias en inflamación de almohadilla plantar, mortalidad y disminución de peso.
b. Resultados 1). Inflamación de almohadilla plantar
Los resultados indicaron que la cantidad de virus necesaria para causar inflamación de la almohadilla plantar era muy pequeña. Para todos los aislados excepto 2177, se necesitó menos de un valor de 1,0 logaritmo en base 10 de la Dosis Letal de Embrión (ELD) 50 para inducir inflamación. Reovirus 2177 necesitó un valor de 2,2 logaritmo en base 10 de ELD 50 para provocar inflamación (véase la Tabla 7).
2). Mortalidad
Los resultados de mortalidad en pollos indicaron que la única vía de inoculación que causó un patrón consistente de mortalidad fue la vía de inoculación de la almohadilla plantar. Los resultados indicaron que 2177 fue apatógena ya que no ocurrieron muertes en pollos inoculados con concentraciones altas del virus (4,3 logaritmo en base 10 de ELD 50). Con otros aislados de reovirus, la dosis letal del 50% de pollo varió de 1,6 a 3,7 logaritmo en base 10 de ELD 50 (véase la Tabla 8).
3). Reducción de peso
En pollos inoculados a través de las vías intratraqueal y de la almohadilla plantar se encontraron índices de crecimiento disminuidos. En los pollos inoculados por vía oral, sólo la concentración más alta de 1733 provocó disminución de peso. La disminución de peso más grave se produjo en pollos inoculados a través de la vía de la almohadilla plantar. Los aislados de reovirus 2408 y 1733 provocaron tanto como el 26% de reducción de peso a un valor <0,7 y 1,0 logaritmo en base 10 de ELD 50, respectivamente. Los aislados 2035 y S1133 también provocaron disminución de peso. El aislado 2177 no provocó disminución de peso en ninguna concentración de virus ensayada (véase la Tabla 9).
TABLA 7
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TABLA 8
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TABLA 9
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2. Estudios de tropismo e histopatología de tejidos de infección de 2177 en leghorns SPF a. Procedimiento 
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Se usaron 3 aislados de reovirus; 2177, 2035 y 1733 para inocular leghorns SPF de 1 día de edad a través de la vía intratraqueal (IT). En diversos momentos después de la inoculación, se tomaron muestras de sangre de 3 pollos de cada grupo de virus y se sacrificaron para la recolección de timo (th), tráquea (tr), hígado (li), intestino (in), amígdala cecal (ct), bazo (sp), bursa (bu), tendón (te), glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC) y plasma (p). Los tejidos se procesaron para aislamiento de virus e histopatología.
b. Resultados 1). Lesiones macroscópicas y mortalidad
El aspecto de lesiones macroscópicas a la necropsia y el porcentaje de mortalidad fue mayor en pollos inoculados con 1733 (véase la Tabla 10). Tanto 1733 como 2035 presentaron signos de infección y mortalidad mientras que en el grupo inoculado con 2177, no se observaron mortalidad o lesiones específicas.
2). Aislamiento de virus
Los resultados de aislamiento de virus de pollos inoculados a 1 día de edad con los tres patotipos indicaron que 1733 fue el más virulento como se indicó por el gran número de tejidos infectados (véase la Tabla 11). Por otra parte, 2177 fue avirulento ya que el virus se reaisló principalmente a partir de las amígdalas cecales.
3). Persistencia
El aislado altamente virulento, 1733, demostró que persiste durante más tiempo. Se podría recuperar virus a las 22 semanas PI de los tendones de pollo. El aislado 2035 también se observó que persistía en el tendón, pero sólo durante 49 días PI. El aislado 2177 no se encontró en el tendón en ningún momento y sólo se encontró en las amígdalas cecales hasta los 28 días de edad.
4). Lesiones microscópicas
Tejidos seleccionados (timo, hígado, bazo, bursa y tendón) que fueron positivos para aislamiento de virus también se valuaron para determinar lesiones microscópicas. Las lesiones que se observaron en estos tejidos infectados y el sistema de valoración de lesión se describen en la Tabla 12. La gravedad de estas lesiones dependía del aislado (véase la Tabla 13). El aislado 1733 parecía ser más virulento que los otros aislados como lo indicaron las lesiones moderadas en el timo y las lesiones graves en el bazo, bursa y tendón. La gravedad de 2035 fue mucho menor y 2177 no causó lesiones microscópicas.
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TABLA 13 Lesiones microscópicas observadas en tejidos a partir de los cuales se reaisló reovirus. Los tejidos se retiraron a la necropsia de leghorns SPF inoculados a 1 día de edad por la vía intratraqueal con 10^{3,5} ELD_{50} de patotipos de reovirus
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3. Estudios de inmunosupresión de 2177 en leghorns SPF a. Procedimiento
Se inocularon leghorns SPF a 1 día de edad con 2177, 2035 ó 1733 por la vía IT. Se realizó un ensayo de estimulación con mitógeno en linocitos de sangre periférica (PBL) recogidos a 7 y 21 días de edad.
b. Resultados
Siete días después de la inoculación de leghorns a 1 día de edad con aislado 1733, se observó una disminución significativa en la capacidad de los PBL de experimentar transformación blastogénica (véase la Tabla 14). PBL recogidos a partir de pollos mostraron un índice de estimulación de sólo 38,0 mientras que PBL de los controles no inoculados así como 2177 y 2035 mostraron índices de estimulación similares y significativamente mayores que variaban de 84,4 a 116,9.
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TABLA 14
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A los 21 días después de la inoculación, los PBL de los pollos mostraron que el efecto depresivo de 1733 ya no se observaba y no se observó inmunosupresión en los pollos inoculados con 2035 ó 2177.
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Ejemplo III Caracterización molecular
Los reovirus aviares tiene un genoma que consiste en 10 segmentos de ARN de doble hélice (ARNdh). La caracterización bioquímica ha demostrado que existen diferencias significativas en los patrones de migración de los segmentos de doble hélice entre aislados diferentes. Véase Gouvea y Schnitzer, J. Virology, 43: 465-471 (1982), incorporado en este documento como referencia.
Se extrajo ARN citoplasmático de células infectadas como se ha descrito por Sharpe y Fields (J. Virology 38: 389-392, 1981). Se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en placas de gel en un sistema de tampón Tris-glicina discontinuo como se ha descrito por Cross y Fields (J. Virology 19: 162-173, 1976). Se realizó radioautografía exponiendo película X-Omat (Kodak) al gel seco a -70ºC y el revelado se realizó mediante técnicas fotográficas convencionales.
Un número bastante grande de diferente aislados de reovirus aviar estaban disponibles en Connecticut y Delaware y representaban muestras de campo recogidas a lo largo de un periodo de varios años. Además, también se analizaron los aislados de reovirus de otras áreas dentro de los Estados Unidos, Inglaterra, Escocia y Alemania y cepas de prototipo japonesas. A partir de estos datos, es evidente que los virus aislados de dentro de la misma área geográfica eran los más parecidos con respecto a sus patrones de migración de ARNdh. Sin embargo, el aislado 2177 tenía un patrón de migración extraordinariamente diferente al de los otros aislados obtenidos dentro de la misma área geográfica. Hasta donde se sabe, el ave infectada con 2177 se originó a partir de una reserva de reproductores parecida a la de las aves infectadas por otros aislados. Además, no se han introducido recientemente aves de fuera de los alrededores geográficos inmediatos.
En particular, la banda de ARN M2 migró más lentamente y la banda de ARN S3 migró más rápidamente que las mismas bandas de ARN de todos los otros aislados obtenidos de la misma región geográfica.
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Ejemplo IV Estudio de Dosis Protectora Mínima de Vacuna Viva de Reovirus
El propósito de este estudio era demostrar la eficacia de aislado 2177 de reovirus en el pase de producto cuando se inoculaba en pollos SPF de un día de edad a través de la vía subcutánea (SC). Para este estudio y estudios de las vacunas que siguieron, la semilla maestra se preparó mediante 14 pases en CEF, seguido de 5-6 pases en embriones de pollo. El denominado pase de producto se obtuvo mediante 4 pases adicionales en cultivo celular (CEF).
Pollos de ciento sesenta y un días de edad se dividieron en tres grupos iguales de 40 aves cada uno y dos grupos de 20 aves cada uno y se colocaron en unidades aislantes de presión negativa de acero inoxidable. Los grupos que contenían 40 aves cada uno se inocularon por la vía SC con 0,1 ml de inóculo (cepa de reovirus 2177 preparada en fibroblastos de embriones de pollo en el cuarto pase por encima del virus de semilla maestra y diluida en caldo de fosfato de triptosa) para dar aproximadamente 2,5, 3,0 y 3,5 logaritmo en base 10 de TCDI_{50} de dosis de 2177 por pollo. Se usó un grupo de 40 aves por dosis. Los dos grupos que contenían 20 aves cada uno se colocaron juntos en un aislador para servir como controles no vacunados no expuestos y como controles no vacunados expuestos.
A las tres semanas después de la vacunación todos los pollos se llevaron a una casa de colonia. Los vacunados y un grupo de no vacunados se expusieron a 0,1 ml del virus de desafío S113 a través de la vía de la almohadilla plantar (el virus de desafío fue el desafío U.S.D.A. S1133, diluido 1: 10.000 en TPB). Los controles no vacunados no expuestos permanecieron sin exponerse.
Las lecturas de almohadillas plantares tomadas el día 6 hasta el día 14 después del desafío se usaron para determinar el porcentaje de protección. Las lecturas tomadas el día 4 y el día 5 no se usaron ya que la hinchazón que aparece dentro de los 5 días después de la exposición a reovirus se considera inespecífica. Se determinó un valor de inflamación de almohadilla plantar acumulativo para cada pollo para el periodo de 9 días.
Se usó la desviación media y típica de la hinchazón de la almohadilla plantar de los controles no vacunados expuestos para determinar la protección. Se determinó que un pollo estaba protegido si el valor acumulativo de inflamación de almohadilla plantar era menor que la media de la inflamación de la almohadilla plantar de los controles no vacunados expuestos menos dos desviaciones típicas.
Los resultados de este estudio se exponen en la Tabla 15 mas adelante. Los datos indican que la dosis más baja de reovirus 2177 usada en este experimento, un valor de 2,5 logaritmo en base 10 de TCID_{50} por dosis, es eficaz en pollos expuestos a las tres semanas después de vacunación con virus de desafío S1133, como se determinó mediante la inflamación de la almohadilla plantar. Los datos también sugieren que la dosis protectora mínima de reovirus 2177 puede ser inferior a un valor de 2,5 logaritmo en base 10 de TCID_{50}, ya que el 100% de los pollos vacunados con esta dosis estuvieron protegidos.
TABLA 15
20
Ejemplo V Modelo de Exposición de Aislamiento de Reovirus, Vacuna de Reovirus Vivo
El propósito de este estudio era analizar un modelo de exposición de aislamiento de virus para demostrar la eficacia de aislado de reovirus 2177 cuando se exponía con un reovirus virulento típicamente asociado con un síndrome de mala absorción (cepa 1733).
En resumen, pollos de un día de edad se dividieron en cuatro grupos: los grupos 1 y 3 se vacunaron con aproximadamente 5,0 logaritmo en base 10 de TCID_{50} de 2177 por dosis de 0,1 ml a través de la vía subcutánea (la formulación de la vacuna es como en el Ejemplo 5). Los pollos en el grupo 1 se expusieron a través de la vía intratraqueal (IT). Los pollos del grupo 3 se expusieron a través de la vía de la almohadilla plantar. Los grupos 2 y 4 eran grupos de control que permanecieron sin vacunarse. Los resultados se muestran en la Tabla 16 más adelante.
El virus de desafío fue una preparación de reovirus 1733, diluida en TPB para contener aproximadamente 4,0 logaritmo en base 10 de TCDI_{50} por dosis de 0,1 ml.
Los pollos en los grupos de vacuna 1 y 2 se expusieron a los 16 días de edad con 4,0 logaritmo en base 10 de TCID_{50} de reovirus 1733 por dosis de 0,1 ml a través de la vía intratraqueal. Los pollos en los grupos de vacunación 3 y 4 se expusieron a la misma preparación de reovirus 1733 de desafío a través de la vía de la almohadilla plantar.
En el día de la exposición, 5 pollos de los vacunados (grupo 1) y 5 pollos de los controles no vacunados (grupo 2) se sacrificaron para recoger el bazo para aislamiento de virus. El virus aislado en este momento era virus de vacuna.
Cinco días después de la exposición, los pollos expuestos a través de la vía IT (grupos 1 y 2) se sacrificaron para recoger el bazo para aislamiento de virus. Los pollos expuestos a través de la vía de la almohadilla plantar (grupos 3 y 4) se observaron diariamente durante 5 días comenzando el día 5 después de la exposición para determinar evidencia de hinchazón de la almohadilla plantar.
Los bazos recogidos de pollos se colocaron en 1 ml de TPB que contenía neomicina al 0,75%. Después los tejidos se molieron con molinillos de tejido. Se añadió un 1,0 ml adicional a la muestra y se inoculó 0,1 ml en huevos embrionados de 5 días de edad. Los huevos se examinaron al trasluz diariamente para determinar mortalidad durante 10 días. Las membranas corioalantoideas se recogieron de cualquiera de los embriones que murieron dentro del periodo de 10 días y se ensayaron para determinar antígeno de reovirus mediante precipitación en gel agar. Se consideró que un tejido era positivo para reovirus si se formaba una línea de identidad entre la muestra desconocida y una muestra de reovirus conocida positiva.
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TABLA 16
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El propósito de este experimento era determinar si el reovirus 2177 podía proteger a los pollos cuando se exponían a un reovirus normalmente asociado con síndrome de mala absorción, cepa 1733, en lugar de la cepa de desafío de tenosinovitis (S1133). El experimento se diseñó para usar aislamiento de virus a partir del bazo como un medio para determinar la protección en lugar de exposición de almohadilla plantar. El aislamiento de virus se realizó inoculando huevos embrionados con muestras de bazo molido y ensayando la membrana corioalantoidea para determinar antígeno de reovirus en un ensayo de precipitación en gel de agar.
Los resultados indicaron que el 90% de los pollos vacunados ensayados con la técnica de aislamiento de virus estaban protegidos en comparación con el 100% de protección en los pollos expuestos a través de la vía de la almohadilla plantar. En los controles no vacunados, se observó que el 95% de los pollos ensayados con el método de aislamiento de virus eran sensibles, en comparación con el 91% de los pollos ensayados con el método de inflamación de la almohadilla plantar.
Los resultados de este estudio demuestran dos puntos: (1) la técnica de aislamiento de virus se puede usar para determinar protección en pollos vacunados con cepa 2177 de reovirus y expuestos a una cepa 1733 de mala absorción de reovirus en lugar de la cepa S1133 de tenosinovitis y (2) la vacuna de 2177 proporciona protección a pollos cuando se exponen a 1773 de mala absorción.
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Ejemplo VII Estudio de Interferencia de Cepa 2177 de Reovirus con Vacunación de HVT/SB-1
El propósito de este estudio era determinar si la cepa 2177 de reovirus interfiere con la eficacia de la vacunación de HVT/SB-1. El diseño del experimento se expone en la Tabla 17 más adelante.
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TABLA 17
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El día de la vacunación, 2 ampollas de HVT y 2 ampollas de SB-1 se descongelaron y resuspendieron juntas en 400 ml de diluyente de Marek. Después esta mezcla se separó en 4 alícuotas de 100 ml. Una alícuota constituyó el grupo de vacunación con HVT/SB-1 y se dejó a un lado. A una de las otras alícuotas, se añadió 1 ml de reovirus 2177 para constituir el grupo 2177/HVT/SB-1. Las dos alícuotas restantes no se usaron.
El día de la vacunación, se condujeron 10 réplicas de valoraciones de la combinación de HVT/SB-1 resuspendida. Cinco de estas réplicas de valoraciones se condujeron en células CEF primarias para determinar el título de SB-1 y cinco de estas réplicas de valoraciones se condujeron en CEF secundarias para determinar el título de HVT.
La vacuna que contenía reovirus 2177/HVT/SB-1 se congeló y se condujeron cinco réplicas de valoraciones del reovirus 2177 en CEF primarias.
Se usó la cepa RD1B del Virus de Enfermedad de Marek a aproximadamente 500 unidades formadoras de placa por dosis para exponer los pollos a los 5 días de edad intra-abdominalmente. Se consideró que los pollos que murieron dentro de la primera semana después de la exposición morían por causas no específicas ya que la Enfermedad de Marek tiene un periodo de incubación de aproximadamente 3 a 4 semanas antes de que se observen lesiones y signos clínicos macroscópicos de la Enfermedad de Marek. Estos pollos y los pollos que murieron antes de la exposición no se incluyeron en la evaluación de protección. El número de pollos con lesiones o que murieron después de este periodo de una semana posterior a la exposición se dividió entre el número total de pollos que permanecieron después de la primera semana posterior a la exposición para determinar el porcentaje de pollos protegidos.
Las réplicas de valoraciones en cada virus indicaron que las preparaciones de las dos vacunas contenían los siguientes títulos de virus:
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TABLA 18
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Los resultados de protección indicaron que en los vacunados con HVT/SB-1, el 88% de los pollos estaba protegido. En el grupo vacunado con 2177/HVT/SB-1, el 89% estaba protegido. En los controles no vacunados expuestos, el 4% de los pollos no tenía lesiones (véase la Tabla 19 más adelante). En otras palabras, los resultados indican que la eficacia de una vacuna de HVT/SB-1 que contiene la cepa 2177 de reovirus, no es diferente de la misma preparación de HVT/SB-1 sin el reovirus 2177. Por lo tanto, se puede añadir reovirus 2177 a las vacunas de HVT/SB-1 sin provocar interferencia con la eficacia de las vacunas de Marek.
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TABLA 19
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También se condujeron estudios sobre si la vacuna HVT/SB-1 interfería con la eficacia de la vacuna 2177. Los resultados indicaron que cuando se preparaba una vacuna que contenía 4,2 logaritmo en base 10 de TCDI_{50} por dosis de reovirus 2177, 5636 PFU de HVT y 5733 PFU de SB-1 por dosis, no había efecto en la eficacia de la vacuna de reovirus 2177. El porcentaje de protección de la vacuna de combinación fue del 93% en comparación con el 100% de protección cuando se usaba reovirus 2177 solo.

Claims (16)

1. Un reovirus aviar, denominado cepa 2177, como se ha depositado en la ATCC bajo el número de entrada VR 2449.
2. Una vacuna que comprende el reovirus aviar de la reivindicación 1.
3. La vacuna de la reivindicación 2, en la que el reovirus está en forma inactivada.
4. Una vacuna de combinación, que comprende el reovirus aviar de la reivindicación 1 y al menos una vacuna de Enfermedad de Marek.
5. La vacuna de combinación de la reivindicación 4, en la que al menos una vacuna de Enfermedad de Marek se selecciona entre el grupo que consiste en SB-1, HVT y CVI 988.
6. Una vacuna de combinación, que comprende el reovirus aviar de la reivindicación 1 y una vacuna de Virus de Enfermedad Bursal Infecciosa.
7. Una vacuna de combinación, que comprende el reovirus aviar de la reivindicación 1, junto al menos una vacuna de Enfermedad de Marek y al menos una vacuna de Virus de Enfermedad Bursal Infecciosa.
8. Una vacuna de combinación, que comprende el reovirus aviar de la reivindicación 1, vacuna de Virus de la Enfermedad de Newcastle y vacuna de Virus de Bronquitis Infecciosa.
9. Una vacuna de combinación, que comprende el reovirus aviar de la reivindicación 1, junto con una vacuna o vacunas de uno o más virus seleccionados entre el grupo que consiste en Encefalomielitis Aviar, Viruela Aviar y Agente de Anemia del Pollo.
10. Uso de una cantidad eficaz del reovirus aviar de la reivindicación 1 para la preparación de una vacuna para inmunizar pollos frente a infección por reovirus aviar.
11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la vacuna comprende además una cantidad eficaz de al menos una vacuna de Enfermedad de Marek.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que al menos una vacuna de Enfermedad de Marek se selecciona entre el grupo que consiste en SB-1, HVT y CVI 988.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la vacuna comprende además una cantidad eficaz de una vacuna de Virus de Enfermedad Bursal Infecciosa.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la vacuna comprende además al menos una vacuna de Enfermedad de Marek y al menos una vacuna de Virus de Enfermedad Bursal Infecciosa.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la vacuna comprende además vacuna de Virus de Enfermedad de Newcastle y vacuna de Virus de Bronquitis Infecciosa.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la vacuna comprende además una vacuna o vacunas de uno o más virus seleccionados entre el grupo que consiste en Encefalomielitis Aviar, Viruela Aviar y Agente de Anemia del Pollo.
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