KR100187317B1 - 무세포 마레크 질병 바이러스 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마레크'스 질병으로 부터 가금류를 보호하기 위한 왁진에 관한 것이다.

본 발명의 무세포 왁진은 조작하기가 용이하며 물리적인 오용의 가능성을 경감시킨다. 본 발명은 또한 마레크'스 질병 바이러스 그룹의 바이러스, 즉 HVT를 추가로 포함하는 이가 또는 다가의 왁진에 관한 것이다.

Description

무세포 마레크 질병 바이러스 백신

제1도는 항원 투여 이후 각 경우마다 치사 조류의 수 및 그후 부검이나 조직 검사시 마레크 질병을 갖는 것으로 밝혀진 수를 나타내는 막대 그래프이다.

제2도는 백시 접종 병아리 및 비-백신 접종 병아리에서 항원 투여후 MD의 발생을 나타내는 막대 그래프이다.

본 발명는 마레크 질병(Marek's Disease)으로부터 가금류를 보호하기 위한 백신 및 이 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

마레크 질병(MD)은 헤르페스 바이러스(마레크 질병 바이러스(Marek's Disease Virus : MDV)에 의해 발생하는 가금류의 악성 임파구 증식 질환이다.

MD는 세계 전역의 가금류-산출국에서 편재하여 발생한다. 집약 생산 시스템하에서 사육하는 병아디들은 불가피하게 MD로 손실을 입게 될 것이다. MD는 생후 약 6주일의 병아리에 영향을 미치며, 생후 12주 내지 24주 사이에서 가장 빈번하게 발생한다.

3가지 형태의 MD가 임상적으로 인식되었는데, 고전적 MD, 급성 MD 및 일시적 마비가 있다.

고전적 MD는 임파구 침윤 및 수초 탈락에 의해 야기되는 말초 신경 확장을 특지응로 하며, 마비가 주요한 임상 징후이다. 치사율은 변화 가능하지만 정상적으로는 10-15%이다.

금성 MD의 경우 내장 기관에서 다중의 확산성 임파종 종양이 나타난다. 이것의 치사율은 고전적 형텨 보다 보통 더 높다. 10-30%의 발생 빈도가 비-백신 접종 군에서는 흔하며, 군의 70%까지 발생하는 경우도 있을 수 있다. 고전적 MD 및 급성 MD의 병리학적 병변은 본질적으로 유사하며, 악성으로 변형된 T-임파 아세포의 증식 및 정상조직(고전적 형태의 경우 말초 신경이고, 급성 형태의 경우 내장 기관)으로의 침윤을 포함한다.

또한, MDV는 갑작스런 마비를 특징으로 하는 어린 닭의 뇌염에 관혀하는 것으로 밝혀졌다.

MD 관련 바이러스의 혈청학적 분류는 다음 3가지의 혈청형으로 나눈다:

Ⅰ형 : 닭에 대해 병원성 및 종양원성이 있는 마레크 질병의 자연적으로 존재하는 병원성 균주 및 그로부터 유도된 약독화된(attenuated) 비 병원성 균조;

Ⅱ형 : 마레크 질병 바이러스의 자연적으로 존재하는 비병원성 균조;

Ⅲ형 : 닭에 비병원성 칠면조의 헤르페스 바이러스(HVT).

현재 이용되고 있는 몇가지 실용적인 마레크 질병 백시 타입이 있다. 이것은 MD 바이러스의 병원성 혈청형 1 균주로부터 유도되는 백신을 포함한다. 이 균주의 계대 배양(serial passage)은 병원성 및 종양원성을 상실시키지만 면역원성은 상실시키지 않는 것으로 밝혀졌다.

HPRS-16 균주로부터 유도된 약독화된 바이러스, 원형 MD 백신 (Churchill, A.E. et al., J. Gen. Virol. 4, 557, 1969) 및 CVI-988 균주는 살아 있는 형청형 1 MD 백신으로서의 시판 사용이 이미 인가되어 왔다.

형청형 2 MD 바이러스는 천연적으로 비-종양원성이며, 따라서 백신 접종된 닭의 종양 유발 가능성이 없다. 따라서, 상기 바이러스는 일련의 계대 배양에 의한 인공적인 약독화를 필요로 하지 않으며, 그것이 자연 상태에 있기 때문에, 독성 형태로 전환될 수 없다. 1983년 이후 미국에서 인가된 SB-1 균주(미국 특허 제 4,160,024호)에 부가하여 HN-1 균주는 백신 접종에 성공적인 것으로 나타났다. 지금까지 형청형 1과 형청형 2 백신은 세포-결합(cell-associated)제재로서 투여 되어야만 했다(Powell, P.C., World's Poultry Science Journal 42, 205, 1986 ; Witter, R. L., et al., Avian Diseases 31, 829, 1987; Schat, K.A., Internews 3, 13, 1989). 실제적으로, 이것은 상기 백신의 보관 및 수송을 약 -196℃의 액체 질소중에서 해야 한다는 것을 의미한다.

백신 보관 및 취급에 잘못이 생기면 MD 바이러스의 생조력이 감소하여 백신 접종에 실패하게 된다. 특히 액체 질소 보관이 실제적으로 불가능한 국가에서는, 세포-결합 MD 백신을 사용할 수 없다. 또한 세포-결합 백신중에 현탁시킨 MDV 함유 입자는 침전되는데, 이것은 투여하기 전에 현탁액의 균질화를 필요로 한다. 불충분한 균질화(homogenization)는 백신 투여량을 부정확하게 하여 백신 접종의 실패를 야기할 수 있다. 더욱, 상기 백신의 엄격한 세포-결합 상태는 백신의 물리적인 오용에 대한 민감성에 관련되다. 앰풀의 부정확한 해동 및 부화장에서의 백신 취급 뿐만 아니라 최적하한의 채취 및 동결 과정에 의한 감염 세포 손상은 세포 손상 및 치사와 이후의 백신 역사 상실을 일으킬 것이다.

최근에, 흔히 사용되는 MD 백신은 HVT 로부터 유도된다. HVT는 먼저 칠면조로부터 분리되었으며, 칠면조와 가금류에서 비병원성이며, 혈청형 1과 2 MD 바이러스에 대하여 항원적으로 관련된다. HVT는 MD 에 대한 백신으로서 광범위하게 사용되며, FC126 균주가 가장 널리 사용된다.

HVT는 세포-결합 제제로서 흔히 사용되지만, 실질적인 양의 무세포(cell-free) 바이러스가 감영 세포로부터 추출될 수 있기 때문에, 그것은 또한 동결 건조된 무세포 백신으로서 사용될 수 있다.

MD로 인한 경제적인 손실을 감소시키기 위한 계속되는 압력 때문에, MD 백신의 효능을 연속적으로 개선하려는 필요성이 존재한다. 특히 현재는 MD 바이러스의 매수 병원성이 강한 균주의 발생으로 인해 양계업에서의 광범위한 손실이 미국과 유럽 두 지역에서 보고되었다. 따라서, HVT 백신 접종은 상기 분리물에 대하여 충분한 보호를 제공하지 못하며, 심지어 높은 투여량에서나 또는 백신 접종과 항원 투여 사이의 연장된 간격 이후에도 충분한 보호를 제공하지 못한다. 이러한 매우 병원성이 강한 MD 바이러스 균주의 만연은 HVT 만에 의한 비교적 비효율적인 백신 접종으로 인하여 가속화될 것이다.

매우 병원성이 강한 MD 바이러스에 감염됨으로써 야기되는 질병을 억제하는데 현재 이용가능한 유용한 방법은 MD 바이러스 그룹의 상이한 혈청형에 속하는 백신 바이러스의 혼합물을 포함하는 2가 또는 다가 백신을 사용하는 것이다. HVT 와 SB-1 또는 다른 혈청형 2 MD 바이러스로 이루어진 2가 백신의 임의의 성분 바이러스 단독의 경우보다 더 우수한 보호를 제고하는 것이 발견되었다. 이러한 현상은 보호성 상승 작용(protective synergy)으로 규정되는 기작으로서, 이 기작에 의해 하나의 MD 백신 바이러스에 의해 제공되는 보호의 크기가 두 번째 백신 바이러스의 첨가에 의해 증가된다(Witter, R.L., Avian Pathology 11, 49, 1982 ; Witter, R.L. 및 Lee, L.F., Avian Pahtology 13, 75, 1984 ; Witter, R.L., Avian Dissease 31, 752, 1987 ; Schat, K.A. 외., Avian Phatholygy 11, 593, 1982).

유감스럽게도, 상기 상승 작용으로부터 효과를 얻기 위해서는, 상기 2가의 백신이 세포-결합 제제이어야 하는데, 그것은 지금까지 무세포 혈청형 2MD 바이러스 백신을 이용할 수 없기 때문이다.

모든 MD 바이러스 형청형에 대한 MDA(maternal derived antibody)(모체 유도 항체)는 MD 바이러스 번식 동물을 자연적으로 누출시키고 및/또는 형청형 1,2 및 3 바이러스로 번식 동물을 백신 접종시키기 때문에 시판용 닭에 산재한다. 백신 접종에 대한 상동성 MDA의 부작용은 일반적으로 알려져 있다. MDV 항체는 단지 저 농도에서 HVT 백신(무세포)을 간섭한다. 따라서, HVT-결핍성 MD 바이러스 백신으로 번식 동물 무리를 백신 접종함으로써 그의 자손이 HVT 에 더 잘 보호될 수 있도록 하는 것이 유용하다. 이러한 소위 세대교번 백신 접종은 HVT-함유 2가 또는 다가 백신으로 그 자손을 접종시킬 때 조차 잠재적인 장점을 갖는다. 그러나, 상기 백신 접종 전략의 적용은 만족할 만한 HVT-결핍 백신의 이용 가능성을 필요로 한다.(Witter, R.L. 및 Lee, L.F. Avian Pathology 13, 75,1984). 무세포 혈청형 2MD 바이러스(예, SB-1)을 함유하는 백신의 이용 가능성은 이러한 세대 교번 접종시 매우 유용할 것이다.

본 발명에 따른 백신은 MD에 대한 가금류의 보호를 제공하며, 이 백신이 약제학적 허용 담체와 함께 무세표 MD 형청형 2 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 한다.

혈청형 1 및 2 MD 바이러스를 사용한 초기 연구는 무세포 바이러스의 양(주요 플라크 형성 단위(plaque forming unit)(pfu)로 측정)이 백신 접종 목적에 사용하기에는 불충분한 역가를 갖는다는 것을 나타냈다(미국 특허 제4,895,718호 ; Witter, R.L. Avian Disease 31, 829, 1987 ; Powell, P.C., World's Poultry Science Journal 42, 205, 1986 ; Schat, K.A., Internews 3, 13, 1989). 특히, SB-1 바이러스는 많은 양의 무세포 바이러스를 산출하지 못하는 것으로 입증되었다.

이제 혈청형 2 MD 바이러스를 추가로 계대 접종함으로써, 무세포 바이러스의 양이 크게 증가하며, 그렇게 수득된 무세포 바이러스는 여전히 그것의 보호 특성을 보유한다는 것을 발견하였다.

이러한 발견은 더 놀랍게도 Witter(Avian Disease 31, 752, 1987)에 의하여, 세포-결합 형청형 2 MD 바이러스의 보호 효능에 대한 계대 접종의 네가티브(negative) 효과가 명백하게 입증되었다.

또한, Witter(상기 문헌, 1987)는 계대 접종 횟수가 증가할 때 상승 작용이 감소하는 것을 나타냈다 ; 추가의 계대 접종된 세포-결합 혈청형 2 MD 바이러스는 적은 계대 접종 횟수의 세포-결합 형청형 2 MD 바이러스와 비교할 때 HVT 균주 FC 126 의 효능을 증가시키지 않았다.

놀랍게도, 무세포 HVT 에 의해 제공되는 보호의 크기는 무세포 혈청형 2 MD 바이러스의 첨가에 의해서 증가하는 것이 발견되었다.

본 발명에 의한 백신은, 먼저 혈청형 2MD 바이러스, 즉, 적당한 세포 배양물 중에서 배양하는 경우, 백신 목적에 유용하도록 충분한 양의 무세포 바이러스를 생성하지 못하는 형청형 2 MD 바이러스를 낮은 횟수로 계대 접종하고 그 결과 수득한 바이러스를 배양하며, 그리고 세번째로 상기 배양물로부터 수득할 수 있는 무세포 바이러스를 면역화 특성을 갖는 제제로 가공함으로써 수득할 수 있다.

본 발명에 의거한 무세포 백신은, 예컨대 HPRS B-24 균주, SB-1 균주(Schat et al., 미국 특허 제4,160,024호 ; Intervet Inc. 로부터 시판됨), HN-1 균주(Cho, B.R. 및 Kenzy, S.G. Appl. Microbiol. 24, 299, 1972) 또는 30/B/1 균주와 같은 Witter에 의해 개시된 분리물(미국 특허 제4,895,718호, Avian Diseases 31, 752, 1987) 등의 임의의 형청형 2 MD 바이러스 균주로부터 유도될 수 있으며, SB-1 균주가 가장 바람직한 균주이다.

혈청형 2 MD-바이러스를 계대 접종하는 경우, 이러한 목적으로 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 요컨대, 바이러스는 적당한 세포 배양물 중에서 증식하고, 그로부터 수거하여, 신선한 세포 배양물을 함유하는 배지에 접종한다. 혈청형 2MD 바이러스는 사용 가능한 양의 무세포 바이러스를 세포 배양물로부터 수득할 수 있을 때까지, 세포 배양물에서 몇차례 계대 접종을 한 후 백신으로 가공 처리했다.

계대 접종법에 적당한 세포 배양물은 특히, 병아리 신장(CK), 닭의 태아 섬유아세포(CEF) 및 오리의 태아 섬유 아세포(DEF) 배양물이다.

특히, 혈청형 2MD 바이러스를 CK, CEF 또는 DEF 배양물의 24 내지 48시간 단일층상에 접종한 후, 성장 배지를 주기적으로 교환하면서 37℃에서 수일간 유지할 수있다. 적당한 성장 배지의 함량은 예컨대 다음과 같다;

이글즈 기본 배지(BME), 트립토즈 포스페이트 브로쓰(broth), 중탄산 나트륨, 소 태아 형청 및 항생제, 75% 이상의 단일층이 세포 병리학적으로 영향을 받았을 때 세포를 계대 접종한다. 배양 기간이 종결 시점에서, 전체 세포 덩어리를 인산염 완층 염수로 세척하고, 트립신으로 분산시키며, 소량의 배양 배지 중에 재현탁시키고, 전술한 바와 같이 신선한 단일층 세포 배양물상에서 증식시킨다. 계대 접종의 횟수는 배양물로부터 수득 가능한 무세포 바이러스의 양과 계대 접종된 바이러스의 면역원성 및 감염성의 보존에 따라 결정된다. 최종 계대 접종 세포를 세척하고, 트립신 처리하며, 원심분리하고 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 함유한 소량의 배양 배지 중에 분산시킬 수 있다. 이 제제는 액체 질소 온도(-70℃)에서 서서히 동결시켜서 시드(seed) 바이러스 배양물로서 사용할 수 있다.

전형적으로는, 무세포 제제는 전술한 방법에 의거하여 수득할 수 있으며, 역가 범위는 10⁴sow 10⁷pfu/㎖이다.

충분한 양의 무세포 바이러스를 산출하는 혈청형 2MD 바이러스를 수득하는데 필요한 계대 접종 횟수는 특히 특이적인 혈청형 2 MD 균주와 무세포 바이러스의 원하는 양 또는 역가에 따라 결정된다.

본 발명의 백신을 제조하는데 필요한 혈청형 2MD 바이러스의 전형적인 총계대 접종 횟수는 25 내지 40회 사이이며, 28 내지 35회가 바람직하다.

그후, 혈청형 2 MD 바이러스를 증식하기 위해서, CEF 세포로 접종된 롤러(roller) 배양물을 24시간 동안 배양한 후 전술한 바 대로 수득된 무세포 또는 세포-결합 바이러스로 접종할 수 있다. 수일간 더 배양한 후, 상청액 배지를 버리고, 세포를 트립신 버센(versene) 혼합물로 제거한 후 상기 세포를 원심 분리로 침전시킬 수 있고 상청액은 버린다.

무세포 제제를 제조하기 위하여, 침전된 세포를 완충액, 예를 들면 인산염 완층 염수(PBS) 또는 바람직하게 안정화제를 포함하는 배지 중에서 현탁시킬 수 있는데, 여기서 SPGA(Bovarnik et al., J. Bacteriology 59, 509, 1950)가 가장 바람직한 안정화제이다.

세포 파쇄는 몇가지 방법(예, 초음파 처리 또는 냉동-해빙)에 의해 실시할 수 있다. 어떤 온전한 세포의 존재는 헤마사이토미터로 조사하여 결정할 수 있다. 초음파 처리 제제 또는 금속 냉동 제제는 바이알에 채울 수 있으며, EDTA 의 존재하에 필요하다면 냉동 건조시킬 수 있다. 선택적으로, 냉동 건조시키기 전에 세포 찌꺼기를 여과 또는 원심분리에 의해 제거한다.

전술한 방법에 의해 수득 가능한 무세포 혈청형 2 MD 바이러스를 살아 있는 바이러스로서 또는 불활성화 바이러스로서 백신내에 혼합시킬 수 있다.

살아 있는 바이러스를 함유하는 백신을 제조하여 현탁액 형태 또는 동결 건조 형태로 시판될 수 있다.

동결 건조된 백신은 바람직하게는 하나 이상의 안정화제를 포함할 수 있다. 적당한 안정화제의 예는 SPGA(Bovarnik et al., J.Bacteriology 59, 509, 950), 탄수화물(예, 소르비톨, 만니톨, 전분, 슈크로즈, 덱스트란 또는 글루코즈), 단백질(예, 알부민 도는 카제인), 또는 그것의 분해 생성물, 단백질 함유물 및 완충액(예, 알칼리 금속 인산염)이다.

필요하다면, 보조제 활성을 갖는 하나 이상의 화합물을 또한 첨가할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 화합물은, 예를 들면 비타민-E 아세테이트 o/w-유제, 수산화 알루미늄, 인산염 또는 산화물, 광유(예, Bayol F^(R), Marchol 52^(R)) 및 사포닌이 있다.

MD 바이러스의 불활성화 목적은 바이러스의 생식을 제거하는 것이다. 일반적으로, 이것은 화학적 또는 물리적 수단에 의해 이루어질 수 잇다. 화학적 불활성화는 예컨대 효소, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 에틸렌-이민 또는 그것의 유도체, 유기 용매(예, 할로겐화 탄화수소) 및/또는 세정제(예, Tween^(R), Triton X^(R), 소듐 데옥시-콜레이트, 설포베타인 또는 세틸 트리메틸 암모늄 염)으로 바이러스를 처리함으로써 수행될 수 있다. 필요하다면, 불활성화 물질을 그후 중화시키는데, 포름알데히드로 불활성화된 물질은, 예를 들면 터이설페이트로 중화시킬 수 있다. 물리적 불활성화는 바람직하게는 바이러스를 고에너지 방사선(예, 자외선, X 선 또는 γ선)으로 처리함으로써 수행할 수 있다. 원한다면, 처리 후 pH를 약 7로 회복시킬 수 있다.

대개는, 보조제(예, 전술한 바와 같음), 및 원한다면, 하나 이상의 유화제(예, Tween^(R)및 Span^(R))를 불활성화된 바이러스 물질에 첨가한다.

바이러스 약물의 유효한 투여량, 즉, 병원성 MD 바이러스에 의한 항원 투여에 대하여 닭의 면역성을 유도하게 되는 무세포 바이러스 물질을 면역화시키는 양만큼 백신을 투여한다. 면역성은 비-백신 접종 그룹에 비해 백신 접종후 닭 집단에서 현저히 더 높은 레벨의 보호성을 유도하는 것으로서 정의 된다.

살아 있는 백신의 경우 병아리 1 마리당 투여 비율은 1 내지 6 logs pfu 범위일 수 있다.

전형적으로는, 본 발명에 의한 살아 있는 백신은 적어도 2.2 logs pfu 무세포 바이러스의 투여량, 바람직하게는 적어도 2.7 logs pfu 무세포 바이러스의 투여량, 더 바람직하게는 적어도 3.2 logs pfu의 투여량으로 투여한다.

자연적인 투여 경로의 경우(분무, 점안 및 점비)에는 10⁶내지 10⁷pfu/병아리의 투여량을 투여할 수 있다.

불활성화 백신은 3 내지 7 logs pfu/조류의 투여량, 바람직하게는 4 내지 6 logs pfe/조류의 투여량의 항원성 동등물을 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 백신은 어떤 연령에서도 고역가의 분무, 점안, 점비, 경구적(예, 음료수)으로 투여하거나, 또는 근육내, 피하 또는 난소에 주사함으로써 투여할 수 있고, 그후 닭은 면역 능력(immunocompetence)을 얻게 된다.

정상적으로 백신은 부하이후 24 내지 48 시간 경과된 병아리에게 투여된다.

본 발명의 또 다른 특징은 2가 백신으로서 무세포 HVT 와 무세포 MD 혈청형 2 바이러스의 조합물이다. 놀랍게도, 무세포 MD 형청형 2 바이러스는 계대 접종 단계가 증가하더라도 여전히 HVT 의 효능을 증가시킬 수 있다는 것이 발견되었다.

특히, SB -1 균주의 무세포 혈청형 2 MD 바이러스는 무세포 HVT 와의 조합물로 사용된다. 본 발명에 의한 백신속에 혼합되는 HVT 바이러스는 어떤 사용 가능한 균주일 수 있는데, 예컨대 FC126 또는 THV PB1(Intervet Inc. 에서 시판함)등이다. 선택적으로, HVT 바이러스는 가금류 병원체의 항원을 코딩하는 외부 유전자를 그것의 바이러스 게놈속에 삽입하고 있는데, 이것은 다가 백신을 형성한다.

본 발명은 또한 가금류에 감염성 있는 다른 병원체로부터 유도된 백신을 무세포 혈청형 2 MD 바이러스 물질에 부가하여 함유하는 조합 백신을 포함한다. 무세포 혈청형 2MD 바이러스는 뉴캣슬 질병 바이러스(NDV), 감염성 기관지염 바이러스(IBV) 및 감염성 점액낭 질병 바이러스(IBDV) 중에서 선택되는 백신 바이러스와의 조합물로 투여할 수 있다.

[실시예 1]

A. 혈청형 2 MD 바이러스 SB-1 및 B-24 의 계대 접종

세포-결합 SB-1 또는 B-24 바이러스를 6㎝ 직경의 팰콘 페트리 디쉬(1.5 × 10⁶CEF/디쉬) 상에서 중식시킨 병아리 태아 세포 배양물에서 유도된 24 시간된 SPF 에 접종했다. 100 pfu 이상을 포함하는 접종물 0.1㎖르 플레이트 상의 5㎖의 조직 배양 배지에 접종하고 세포 결합 바이러스를 단일층상에 놓고 그것을 감염시킨다.

5% CO₂대기하에서 38.5℃에서 5일간 배양한 후, 세포를 다음과 같이 디쉬로부터 제거했다 :

1. 배지를 쏟아 붓고 ;

2. 트립신 버센 PBS 용액을 첨가하여, 페트리 디쉬에 대한 세포의 부착을 느슨하게 하고 ;

3. 페트리 디쉬에서 세포가 떨어지기 전에, 트립신/버센 PBS 혼합물을 버리고;

4. 성장 배지로 상기 디쉬로부터 세포를 세척해 낸다 .

상기 단계 4로부터 수득된 세포-결합 바이러스의 현탁액을 CEF 세포에 대한 다음 계대 접종시 접종물로 사용한다. 상기 바이러스는 전술한 바와 같이 입수이후 5차례 계대 접종했다. 6회 계대 접종(초기 계대 접종 포함) 이후 4 일간의 배양시간이 채택되었다.

[결과 ]

SB-1

코넬 대학에서 입수한 SB-1 바이러스는 입수시에 이미 10회 계대 접종되었다(CEF 및 CK 세포에서, 조직 배양 계대 접종 7회, 이어서 SPF 병아리에서 계대 접종 2회 CEF 세포상에서 추가로 1번 더 계대 접종함).

페트리 디쉬에서 심하게 감염된 세포(10회 계대 접종)를 무세포 바이러스를 수득할 수 있도록 처리하고 5㎖의 SPGA 중에 재현탁시켰을 때, 분석시 살아 있는 무세포 바이러스가 10^-2희석액에서 전혀 검출되지 않았다.

코넬 대학으로부터 입수한 후 SB-1 균주를 총 21회 계대 접종하고 유사한 방식으로 처리하였을 때, 10^4.9pfu/㎖ 역가의 살아 있는 무세포 바이러스를 수득했다.

총 26회 계대 접종한 SB-1 바이러스는 10^6.0pfu/㎖ 역가의 무세포 바이러스를 산출했다. 이러한 무세포 SB-1 바이러스는 여전히 닭에 감염성이 있었고, 바이러스혈증을 유도하였으며, 조류의 접촉으로 확산되었고, 보호성 면역 반응을 유도할 수 있었다.

B-24

B-24의 9회 계대 접종으로 심하게 감염된 세포를 전술한 바와 같이 처리하여 무세포 바이러스를 수득하는 경우, 그 역가는 10²pfu/㎖이하였다. 35회 계대 접종으로 심하게 감염된 세포를 처리하는 경우, 10^4.7pfu/㎖의 역가를 수득했다.

B. SB-1 무세포 혈청형 2MD 백신의 제조

200×10⁶CEF 세포로 접종한 2개의 롤러 배양물(1750 ㎠)을 1㎖의 세포-결합 SB-1 시드(seed) 바이러스를 갖는 배지에 접종하였는데, 여기서 상기 바이러스는 상술한 방법에 의해 수득하였으며, 배양 24시간후 역가는 10^-5pfu/㎖이었다.

5일간 더 배양한 후, 상청액 배지를 따라 버리고, 트립신 버센 혼합물로 상기 세포를 제거했다. 이 세포를 원심분리로 침전시키고 상청액을 버리고, 세포를 20㎖의 SPGA 안정화제와 혼합한 후 20초 동안 초음파 처리했다.

상기 초음파 처리된 제제를 바이아라에 1㎖분애긍로 채우고 동결 건조시켰다.

동결 건조 이전의 역가 10^4.8pfu/㎖

동결 건조 이후의 역가 10⁵pfu/㎖

[실시예 2]

무세포 혈청형 2 MD 백신의 효능

혈청형 1,2 및 3에 대한 MDA를 깆는 10마리 브로일러 병아리로 이루어진 3 그룹을 1일째에 각기 다른 투여량의 무세포 SB-1으로 근육내 투여했다.

사용한 투여량은 176pfu/병아리, 460pfu/병아리 및 1520pfu/병아리 였다.

백신의 효능을 바이러스 혈증 검사로 시험했다. 초기 실험에서는 비-백신 접종 병아리를 SB-1 으로 백신 접종된 병아리(고 계대 접종)와 접촉시키는 경우, 접종(백신 투여량은 세포-결합 바이러스 200pfu임) 2주후에 접촉 병아리중 1/3이 감염된 것으로 나타났기 때문에, 2주후에는 바이러스 혈증에 대해 시험하지 않는 것으로 결정되었다. 백신 접종 1주와 2주후에 황갈색 피부가 나타났으며, 표준 방법에 의해 SB-1 바이러스에 대해 CEF 세포를 시험했다. 상기 배양물을 1주 동안 배양한 후 판독했다. 하기 표 1에 제시한 결과는 176 pfu/병아리를 투여한 병아리의 발병률이 56% 이인인 반면, 460 pfu/병아리 또는 1520 pfu/병아리로 백신 접종한 후에는 모든 병아리가 바이러스 혈증을 나타냈다.

[실시예 3]

MDA 포지티브 닭에 있어서 HVT 무세포 및 HVT/SB-1 백신에 의해 유도되는 면역성의 비교

바이러스 -사용된 바이러스 균주는 다음과 같다.

HVT - 이것은 Intervet PB1 THV 균주이다.

SB -1 - 이 균주는 바이러스가 급속 성장하여 무세포 바이러스를 방출할 때까지 추가로 계대 접종되었다. 무세포 제제는 SPGA 안정화제 중에서 감염 CEF세포를 초음파 처리함으로써 제조되었다.

혈청형 1, 2 및 3 MD 바이러스에 대한 모계 유도 항체(MDA) 를 갖는 2-3일 된 병아리를 하기 3 그룹으로 나누었다.

A 그룹 37 마리 백신 없음

B 그룹 42 마리 HVT 백신의 1000 pfu/병아리로 백신 접종함

C 그룹 42 마리 HVT 백신의 1000 pfu/병아리와 250 pfu SB-1 바이러스를 함께 백신 접종함

상기 모든 그룹은 생후 9일경에 독성 바이러스 RBIB 로 항원 투여를 했다. 실험기간 동안, 시간이 경과됨에 따라 상기 격리체(isolator)의 혼잡을 피하기 위하여 각 그룹마다 병아리를 죽여야만 했다.

치사 또는 사망한 모든 병아리를 마레크 질병(MD)의 육안 및 현미경상 병변에 대해 조사했다.

항원 투여후에, 각 백신 접종 그룹에서 항원 투여후 (pc) 4일째에 한 마리의 병아리가 죽었으며, 비-백신 접종 그룹에서는 5일과 9일 사이에 5마리가 죽었다. 조직 검사 결과 특히 점액낭에서 임파구 결핍이 나타났지만, 또한 흉선에서도 나타났다. 죽은 시기와 함께 상기 관찰은 이것이 MD 의 세포용해 작용으로 인한 것임을 나타냈다.

높은 MD 발생이 비-백신 접종 그룹(제1도 및 제2도)에서 관찰되었다. pc 11일경에 죽은 7마리의 병아리중 3마리가 MD 종양이 있었다. pc 11일경웨 MD로 인한 사망이 시작되었으며, pc 28일경웨 8마리의 병든 병아리가 죽었고, pc 32일경웨 나머지 8마리가 죽었으며, 2마리를 제외하고 모두 심하게 병든 것으로 보였다. 전체 16마리의 병아리가 간,신장 및 기타 기관에서 MD 종양을 갖고 있었다. 총 37마리중, 5마리는 '세포용해성 MD'로 죽었으며, 27마리는 MD 종양을 갖고 있거나 또는 MD로 죽었다. MD 병변을 갖지 않는 4마리의 병아리는 pc 11일경에 죽었으며, MD 가 진행될 시간을 거의 제공하지 않았다(비특이적이 원인으로 한마리가 죽었다).

HVT 백신을 투여한 그룹 중에서, 육안 관찰의 MD 종양은 죽은 10마리 병아리중 2마리에서 21일째에 첫번째로 나타났을 뿐만 아니라, 그 시점에서 사망한 2마리의 병아리에서도 나타났다. 32일과 42일경에 죽은 5마리의 병든 병아리를 부검후 검사한 결과, 모두 MD 종양이 있는 것으로 밝혀졌다. 총 7마리의 조류가 시험 과정 동안 MD로 죽었다. pc 53일경에 죽은 나머지 8마리의 조류는 MD 징후가 없었다. 총 42마리의 병아리중 16마리는 죽었을 때 MD 종양이 있거나 MD로 죽었다. pc 11일경에 죽은 10마리, pc 21일경에 죽은 8마리 및 pc 53일경웨 죽은 8마리는 병변이 없는 것으로 나타났다.

이중 백신 접종 그룹에 있어서 MD 발생은 매우 낮아서, pc 53일경에 죽었을때 한마리의 조류만이 간에 MD 종양을 갖는 것으로 나타났다. 총 42마리의 병아리중, 4마리는 비특이적인 원인으로 죽었고, 그중 하나는 세포 용해성 MD로 죽었을 가능성이 있다. pc 11일경에 죽은 10마리 병아리, pc 21일경에 죽은 11마리, pc 42일경에 죽은 3마리 및 pc 53일경에 죽은 14마리중 13마리 병아리는 MD 병변이 발견되지 않았다.

이러한 결과들은 상기 무세포 이중 백신 SB-1/HVT 는 혈청형 2 및 3 바이러스에 대한 MDA를 갖는 브로일러 병아리에 있어서 RBIB 로 심하게 항원 투여하는 것에 대하여 매우 높은 정도로 보호성을 제공하는 것을 나타낸다.

HVT 백신은 심하게 항원 투여 하는 것에 대하여 현저한 보호성을 제공하지만 37%의 병아리는 약간의 MD 징후를 나타냈다.

생존한 비-백신 접종 병아리중 대부분은 약 pc 4주일경에 MD의 현저한 임상적 징후를 나타냈으며, pc 32일경에 모두 죽었다는 것을 주목하여야 한다 .

pc 53일경에 실험을 완료한 시점에서, 이중 백신을 접종한 병아리가 HVT 만을 백신 접종한 것보다 더 체중이 높은 것이 관찰되었다.

8마리의 HVT 배신 접종 병아리중 어느 것도 죽었을때 명백하게 현저한 MD 병변을 갖는 것이 없음은 놀랍다.

[실시예 4]

MDA 가 없는 닭에 있어서 무세포 SB-1 바이러스와 HVT/SB-1 백신에 의해 유도되는 면역성의 비교

SPGA 0.1㎖/병아리에 재조성한 동결 건조된 무세포 SB-1 바이러스의 200 pfu로 20일된 SPF 병아리를 피하 접종했다. 두번째 그룹의 병아리는 1000 pfu의 HVT 백신 바이러스와 함께 200 pfu의 SB-1 백신을 투여했다. 1주일후, 동일한 출처 및 연령을 갖는 비-백신 접종 병아리 20마리와 함께 상기 병아리를 RBIB 의 독성 균주로 근육내 항원 투여 했다. 6주일 기간 동안 각 그룹마다 마레크 질병으로 죽은 병아리의 수를 측정하였다.

Claims (11)

1. 무세포 마레크 질병(cell-free Marek's Disease)혈청형 2 바이러스와 약제학적 허용 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 마레크 질병으로부터 가금류를 보호하기 위한 백신.
2. 제1항에 있어서, 무세포 SB-1 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
3. 제1항에 있어서, 무세포 B-24 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
4. 제1항에 있어서, 무세포 마레크 질병 혈청형 2 바이러스의 투여량이 2.2pfu/병아리 이상인 것을 특징으로 하는 백신.
5. 제4항에 있어서, 상기 투여량이 2.7pfu/병아리 이상인 것을 특징으로 하는 백신.
6. 제5항에 있어서, 상기 투여량이 3.2pfu/병아리 이상인 것을 특징으로 하는 백신.
7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, 무세포 HVT 를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
8. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, 동결 건조되는 것을 특징으로 하는 백신.
9. a) 면역화 유효 투여량을 제조하기에 필요한 충분한 양의 무세포 바이러스가 수득될 수 있도록, 세포 배양물내에서 혈청형 2마레크 질병 바이러스를 증식시키는 단계, b) 상기 세포를 파쇄하는 단계, c) 그후 무세포 바이러스를 수거하는 단계, 및 d) i) 원심분리, 여과 또는 원심분리 및 여과에 의한 정제; ⅱ) 완충액 첨가; ⅲ) 안정화제 첨가; ⅳ)바이알(vial)에 상기 물질의 충진; ⅴ)동결 건조 중 적어도 하나의 처리법으로 상기 c)단계로부터 수득한 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 마레크 질병으로부터 가금류를 보호하기 위한 백신의 제조방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 b)단계 이후 무세포 바이러스의 역가가 4 logs pfu/㎖ 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 의한 백신을 조류에 투여하는 것을 포함하는 가금류의 마레크 질병을 억제하는 방법.