JP3410744B2 - 無細胞マレック病ウイルスワクチン - Google Patents
無細胞マレック病ウイルスワクチンInfo
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- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
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Description
【０００１】本発明は、家禽のマレック病防御用ワクチ
ン、及びこのようなワクチンの製造方法に関する。
ン、及びこのようなワクチンの製造方法に関する。
【０００２】マレック病（ＭＤ）は、ヘルペスウイル
ス、即ちマレック病ウイルス（ＭＤＶ）によって引き起
こされる家禽の悪性リンパ球増殖性疾患である。ＭＤ
は、世界中の家禽生産地域で発生する。集約生産システ
ム下で飼育されているニワトリがＭＤによる損失を蒙る
のは避けがたい。ＭＤは最低約６週令のニワトリで発症
し、１２〜２４週令のニワトリで最も高頻度に発症す
る。
ス、即ちマレック病ウイルス（ＭＤＶ）によって引き起
こされる家禽の悪性リンパ球増殖性疾患である。ＭＤ
は、世界中の家禽生産地域で発生する。集約生産システ
ム下で飼育されているニワトリがＭＤによる損失を蒙る
のは避けがたい。ＭＤは最低約６週令のニワトリで発症
し、１２〜２４週令のニワトリで最も高頻度に発症す
る。
【０００３】臨床的には、３種類のＭＤ、即ち定型的Ｍ
Ｄ、急性ＭＤ、及び一過性麻痺が確認されている。
Ｄ、急性ＭＤ、及び一過性麻痺が確認されている。
【０００４】定型的ＭＤは、リンパ球浸潤及び脱髄によ
って引き起こされる末梢神経の腫大が特徴であって、麻
痺が主要な臨床徴候である。死亡率は不定であるが、普
通は１０〜１５％である。
って引き起こされる末梢神経の腫大が特徴であって、麻
痺が主要な臨床徴候である。死亡率は不定であるが、普
通は１０〜１５％である。
【０００５】急性ＭＤの場合は、内臓器官に多発性・散
在性リンパ腫が認められる。この種のＭＤによる死亡率
は、定型的ＭＤよりも通常高い。非予防接種群では１０
〜３０％の発症率が一般的であって、群の７０％までが
発症する可能性もある。定型的及び急性ＭＤにおける病
理学的病変は本質的に同様であって、悪性化Ｔ−リンパ
芽球の正常組織（定型的ＭＤの場合は末梢神経、急性Ｍ
Ｄの場合は内臓器官）への増殖及び浸潤を伴う。
在性リンパ腫が認められる。この種のＭＤによる死亡率
は、定型的ＭＤよりも通常高い。非予防接種群では１０
〜３０％の発症率が一般的であって、群の７０％までが
発症する可能性もある。定型的及び急性ＭＤにおける病
理学的病変は本質的に同様であって、悪性化Ｔ−リンパ
芽球の正常組織（定型的ＭＤの場合は末梢神経、急性Ｍ
Ｄの場合は内臓器官）への増殖及び浸潤を伴う。
【０００６】さらに、ＭＤＶが、突発性麻痺を特徴とす
る若鶏の脳炎の原因となることも判明している。
る若鶏の脳炎の原因となることも判明している。
【０００７】ＭＤ関連ウイルスの血清学的分類は以下の
３つのセロタイプに分けられている： タイプＩ：ニワトリに対して病原性且つ腫瘍形成性であ
るマレック病ウイルスの天然有毒株、及びそこから得ら
れる弱毒化非病原性株； タイプＩＩ：マレック病ウイルスの天然非病原性株；及
び タイプＩＩＩ：ニワトリに対して非病原性である七面鳥
のヘルペスウイルス（“ＨＶＴ”）。
３つのセロタイプに分けられている： タイプＩ：ニワトリに対して病原性且つ腫瘍形成性であ
るマレック病ウイルスの天然有毒株、及びそこから得ら
れる弱毒化非病原性株； タイプＩＩ：マレック病ウイルスの天然非病原性株；及
び タイプＩＩＩ：ニワトリに対して非病原性である七面鳥
のヘルペスウイルス（“ＨＶＴ”）。
【０００８】数種類のマレック病ワクチンが実際に広く
用いられている。これらの例としては、ＭＤウイルスの
病原性セロタイプ１株由来のワクチンが挙げられる。こ
れらの株を連続継代培養すると、病原性及び腫瘍原性は
失われるが、しかし免疫原性は失われないことが判明し
た。ＨＰＲＳ−１６株由来の弱毒化ウイルス、基本型Ｍ
Ｄワクチン（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４，５５７，１９６
９）及びＣＶＩ−９８８株の、生セロタイプ１ＭＤワク
チンとしての使用に関してはすでに認可されている。
用いられている。これらの例としては、ＭＤウイルスの
病原性セロタイプ１株由来のワクチンが挙げられる。こ
れらの株を連続継代培養すると、病原性及び腫瘍原性は
失われるが、しかし免疫原性は失われないことが判明し
た。ＨＰＲＳ−１６株由来の弱毒化ウイルス、基本型Ｍ
Ｄワクチン（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４，５５７，１９６
９）及びＣＶＩ−９８８株の、生セロタイプ１ＭＤワク
チンとしての使用に関してはすでに認可されている。
【０００９】セロタイプ２ＭＤウイルスは、本質的には
非腫瘍原性であり、したがって予防接種してもニワトリ
で腫瘍が形成される可能性はない。したがって、これら
のウイルスは継代培養による人工的弱毒化を必要とせ
ず、また天然の状態であるために有毒型に戻ることがな
い。ＨＮ−１株は、１９８３年以来米国で認可されてい
るＳＢ−１株（米国特許第４，１６０，０２４号）に加
えて、予防接種に成功していることが判明している。従
来、セロタイプ１及びセロタイプ２ワクチンは、細胞性
製剤として投与されるべきものであった（Ｐｏｗｅｌ
ｌ，Ｐ．Ｃ．，Ｗｏｒｌｄ′ｓ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ４２，２０５，１９８
６；Ｗｉｔｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ａｖｉａｎ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３１，８２９，１９８７；Ｓｃｈａ
ｔ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎｔｅｒｎｅｗｓ ３，１３，１９８
９）。これは、事実上、上記ワクチンの貯蔵及び輸送が
約−１９６℃の液体窒素中で行わねばならないことを意
味する。
非腫瘍原性であり、したがって予防接種してもニワトリ
で腫瘍が形成される可能性はない。したがって、これら
のウイルスは継代培養による人工的弱毒化を必要とせ
ず、また天然の状態であるために有毒型に戻ることがな
い。ＨＮ−１株は、１９８３年以来米国で認可されてい
るＳＢ−１株（米国特許第４，１６０，０２４号）に加
えて、予防接種に成功していることが判明している。従
来、セロタイプ１及びセロタイプ２ワクチンは、細胞性
製剤として投与されるべきものであった（Ｐｏｗｅｌ
ｌ，Ｐ．Ｃ．，Ｗｏｒｌｄ′ｓ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ４２，２０５，１９８
６；Ｗｉｔｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ａｖｉａｎ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３１，８２９，１９８７；Ｓｃｈａ
ｔ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎｔｅｒｎｅｗｓ ３，１３，１９８
９）。これは、事実上、上記ワクチンの貯蔵及び輸送が
約−１９６℃の液体窒素中で行わねばならないことを意
味する。
【００１０】ワクチンの貯蔵及び取扱の失敗は、ＭＤウ
イルスの生存率の低下を招き、ワクチン接種の失敗を引
き起こす。特に、液体窒素貯蔵が実際上不可能な国では
細胞性ＭＤワクチンは使用できない。さらに、細胞性ワ
クチン中に懸濁させたＭＤＶ含有粒子は沈殿するので、
投与前に懸濁物を均質化する必要がある。均質化が不適
切であると、ワクチンの量が不正確になり、したがって
予防接種が成功しない可能性がある。さらに、上記のワ
クチンの厳密な細胞性(cell-associated nature)は、物
理的酷使(abuse) に対するワクチンの感受性に関与す
る。次善の採集及び凍結手順、アンプルの不正確な解凍
並びに養鶏場でのワクチンの取扱いによる感染細胞への
損傷は、細胞の損傷及び死、引いてはワクチン力価の損
失を引き起こす。
イルスの生存率の低下を招き、ワクチン接種の失敗を引
き起こす。特に、液体窒素貯蔵が実際上不可能な国では
細胞性ＭＤワクチンは使用できない。さらに、細胞性ワ
クチン中に懸濁させたＭＤＶ含有粒子は沈殿するので、
投与前に懸濁物を均質化する必要がある。均質化が不適
切であると、ワクチンの量が不正確になり、したがって
予防接種が成功しない可能性がある。さらに、上記のワ
クチンの厳密な細胞性(cell-associated nature)は、物
理的酷使(abuse) に対するワクチンの感受性に関与す
る。次善の採集及び凍結手順、アンプルの不正確な解凍
並びに養鶏場でのワクチンの取扱いによる感染細胞への
損傷は、細胞の損傷及び死、引いてはワクチン力価の損
失を引き起こす。
【００１１】今日、高頻度に用いられているＭＤワクチ
ンはＨＶＴから得たものである。ＨＶＴは七面鳥から初
めて単離され、七面鳥及びニワトリでは非病原性で、抗
原的にセロタイプ１及び２ＭＤウイルスに関連する。Ｈ
ＶＴはＭＤに対するワクチンとして広範に用いられてお
り、ＦＣ１２６株が最も広く用いられている。ＨＶＴは
一般に細胞性製剤として用いられるが、しかし多量の無
細胞ウイルスが感染細胞から抽出され得るため、凍結無
細胞ワクチンとして用いてもよい。
ンはＨＶＴから得たものである。ＨＶＴは七面鳥から初
めて単離され、七面鳥及びニワトリでは非病原性で、抗
原的にセロタイプ１及び２ＭＤウイルスに関連する。Ｈ
ＶＴはＭＤに対するワクチンとして広範に用いられてお
り、ＦＣ１２６株が最も広く用いられている。ＨＶＴは
一般に細胞性製剤として用いられるが、しかし多量の無
細胞ウイルスが感染細胞から抽出され得るため、凍結無
細胞ワクチンとして用いてもよい。
【００１２】ＭＤによる経済的損失を低レベルに抑える
という継続的要請のために、ＭＤワクチンの効力を耐え
ず改良する必要がある。特に、今日、ＭＤの非常に有毒
な株が出現したため、家禽産業で過度の損失を受けたこ
とが米国及び欧州で報告されている。今までのところ、
ＨＶＴワクチン接種は、高用量を接種しても又は予防接
種と攻撃との間隔を長くしても、該分離体に対して適切
な防御を提供しない。ＨＶＴのみを用いた相対的に効力
の乏しい予防（ワクチン）接種では、これらのＭＤウイ
ルスの非常に有毒株は蔓延するであろう。
という継続的要請のために、ＭＤワクチンの効力を耐え
ず改良する必要がある。特に、今日、ＭＤの非常に有毒
な株が出現したため、家禽産業で過度の損失を受けたこ
とが米国及び欧州で報告されている。今までのところ、
ＨＶＴワクチン接種は、高用量を接種しても又は予防接
種と攻撃との間隔を長くしても、該分離体に対して適切
な防御を提供しない。ＨＶＴのみを用いた相対的に効力
の乏しい予防（ワクチン）接種では、これらのＭＤウイ
ルスの非常に有毒株は蔓延するであろう。
【００１３】非常に有毒なＭＤウイルスの感染によって
引き起こされる病気を防御するために現在用いられてい
る有用な方法では、ＭＤウイルス群のセロタイプが別個
のワクチンウイルスの混合物を含有する二価又は多価ワ
クチンを使用する。ＨＶＴとＳＢ−１又は別のセロタイ
プ２ＭＤウイルスとから成る二価ワクチンはいずれかの
成分ウイルス単独の場合より良好な防御を提供すること
が判明した。この現象は、“防御共働”と呼ばれ、ある
ＭＤワクチンウイルスにより得られる防御の大きさが第
２のワクチンウイルスを加えることにより増大される機
序による（Ｗｉｔｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ａｖｉａｎ Ｐａ
ｔｈｏｌｏｇｙ １１，４９，１９８２；Ｗｉｔｔｅ
ｒ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｌ．Ｆ．，Ａｖｉａｎ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３，７５，１９８４；Ｗｉｔｔ
ｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３
１，７５２，１９８７；Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１，５９
３，１９８２）。不都合にも、この共働による効果を得
るためには、今日まで無細胞セロタイプ２ＭＤウイルス
ワクチンは用いられていないので、二価ワクチンは細胞
性製剤でなければならない。
引き起こされる病気を防御するために現在用いられてい
る有用な方法では、ＭＤウイルス群のセロタイプが別個
のワクチンウイルスの混合物を含有する二価又は多価ワ
クチンを使用する。ＨＶＴとＳＢ−１又は別のセロタイ
プ２ＭＤウイルスとから成る二価ワクチンはいずれかの
成分ウイルス単独の場合より良好な防御を提供すること
が判明した。この現象は、“防御共働”と呼ばれ、ある
ＭＤワクチンウイルスにより得られる防御の大きさが第
２のワクチンウイルスを加えることにより増大される機
序による（Ｗｉｔｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ａｖｉａｎ Ｐａ
ｔｈｏｌｏｇｙ １１，４９，１９８２；Ｗｉｔｔｅ
ｒ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｌ．Ｆ．，Ａｖｉａｎ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３，７５，１９８４；Ｗｉｔｔ
ｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３
１，７５２，１９８７；Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１，５９
３，１９８２）。不都合にも、この共働による効果を得
るためには、今日まで無細胞セロタイプ２ＭＤウイルス
ワクチンは用いられていないので、二価ワクチンは細胞
性製剤でなければならない。
【００１４】すべてのＭＤウイルスセロタイプに対する
ＭＤＡ（母由来抗体）は、種畜がＭＤウイルスに自然に
曝されるため及び／又は種畜にセロタイプ１、２及び３
ウイルスが予防接種されるために市販のニワトリには必
ず存在する。予防接種に及ぼす同種ＭＤＡの副作用は一
般に公知である。ＭＤＶ抗体は、低レベルでも（無細
胞）ＨＶＴワクチンを妨害する。したがって、子孫をＨ
ＶＴで良好に防御するためには、ＨＶＴ−欠如ＭＤウイ
ルスワクチンを用いて種畜群に予防接種し得ることが有
利である。このいわゆる世代交代予防接種は、子孫にＨ
ＶＴ含有二価又は多価ワクチンを予防接種した場合でさ
え、潜在的な価値を有する。しかしながら、このワクチ
ン接種計画を実行するには、申し分ないＨＶＴ欠如ワク
チンの提供が要求される（Ｗｉｔｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ａｎ
ｄ Ｌｅｅ，Ｌ．Ｆ．，ＡｖｉａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ
１３，７５，１９８４）。無細胞セロタイプ２ＭＤウ
イルス、例えばＳＢ−１含有ワクチンが提供できれば、
この世代交代予防接種に非常に有用である。
ＭＤＡ（母由来抗体）は、種畜がＭＤウイルスに自然に
曝されるため及び／又は種畜にセロタイプ１、２及び３
ウイルスが予防接種されるために市販のニワトリには必
ず存在する。予防接種に及ぼす同種ＭＤＡの副作用は一
般に公知である。ＭＤＶ抗体は、低レベルでも（無細
胞）ＨＶＴワクチンを妨害する。したがって、子孫をＨ
ＶＴで良好に防御するためには、ＨＶＴ−欠如ＭＤウイ
ルスワクチンを用いて種畜群に予防接種し得ることが有
利である。このいわゆる世代交代予防接種は、子孫にＨ
ＶＴ含有二価又は多価ワクチンを予防接種した場合でさ
え、潜在的な価値を有する。しかしながら、このワクチ
ン接種計画を実行するには、申し分ないＨＶＴ欠如ワク
チンの提供が要求される（Ｗｉｔｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ａｎ
ｄ Ｌｅｅ，Ｌ．Ｆ．，ＡｖｉａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ
１３，７５，１９８４）。無細胞セロタイプ２ＭＤウ
イルス、例えばＳＢ−１含有ワクチンが提供できれば、
この世代交代予防接種に非常に有用である。
【００１５】本発明によれば、無細胞ＭＤセロタイプ２
ウイルスと製薬上許容可能な担体を含有することを特徴
とする、ＭＤに対する家禽の防御用ワクチンが提供され
る。
ウイルスと製薬上許容可能な担体を含有することを特徴
とする、ＭＤに対する家禽の防御用ワクチンが提供され
る。
【００１６】セロタイプ１＆２ＭＤウイルスを用いた初
期の研究は、無細胞ウイルスの量（主プラーク形成単
位：ｐｆｕとして測定）が予防接種の目的には不十分な
力価であったことを実証した（米国特許第４，８９５，
７１８号；Ｗｉｔｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ａｖ
ｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３１，８２９，１９８７；
Ｐｏｗｅｌｌ，Ｐ．Ｃ．，Ｗｏｒｌｄ′ｓ Ｐｏｕｌｔ
ｒｙ ＳｃｉｅｎｃｅＪｏｕｒｎａｌ ４２，２０５，
１９８６；Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎｔｅｒｎｅｗｓ
３，１３，１９８９）。特に、ＳＢ−１ウイルスが十
分量の無細胞ウイルスを産生しなかったことが文献に記
載されている。
期の研究は、無細胞ウイルスの量（主プラーク形成単
位：ｐｆｕとして測定）が予防接種の目的には不十分な
力価であったことを実証した（米国特許第４，８９５，
７１８号；Ｗｉｔｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ａｖ
ｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３１，８２９，１９８７；
Ｐｏｗｅｌｌ，Ｐ．Ｃ．，Ｗｏｒｌｄ′ｓ Ｐｏｕｌｔ
ｒｙ ＳｃｉｅｎｃｅＪｏｕｒｎａｌ ４２，２０５，
１９８６；Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎｔｅｒｎｅｗｓ
３，１３，１９８９）。特に、ＳＢ−１ウイルスが十
分量の無細胞ウイルスを産生しなかったことが文献に記
載されている。
【００１７】セロタイプ２ＭＤウイルスをさらに継代培
養することにより、無細胞ウイルスの量が非常に増大
し、したがって得られた無細胞ウイルスはその防御特性
を保有するという所見が今日得られた。
養することにより、無細胞ウイルスの量が非常に増大
し、したがって得られた無細胞ウイルスはその防御特性
を保有するという所見が今日得られた。
【００１８】この所見は、Ｗｉｔｔｅｒ（Ａｖｉａｎ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３１，７５２，１９８７）が継代培
養は細胞性セロタイプ２ＭＤウイルスの防御効力に負の
影響を及ぼすことを明確に立証していたので、意外であ
る。
Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３１，７５２，１９８７）が継代培
養は細胞性セロタイプ２ＭＤウイルスの防御効力に負の
影響を及ぼすことを明確に立証していたので、意外であ
る。
【００１９】さらに、Ｗｉｔｔｅｒ（上記，１９８７）
は、継代数が増加すると共働効果が低下する、さらに継
代培養した細胞性セロタイプ２ＭＤウイルスは継代数が
少ない細胞性セロタイプ２ＭＤウイルスに比してＨＶＴ
株ＦＣ１２６の効力を増大しなかった、ということを示
した。
は、継代数が増加すると共働効果が低下する、さらに継
代培養した細胞性セロタイプ２ＭＤウイルスは継代数が
少ない細胞性セロタイプ２ＭＤウイルスに比してＨＶＴ
株ＦＣ１２６の効力を増大しなかった、ということを示
した。
【００２０】意外にも、無細胞ＨＶＴによる防御の大き
さは、無細胞セロタイプ２ＭＤウイルスを加えることに
よって増大することが判明した。
さは、無細胞セロタイプ２ＭＤウイルスを加えることに
よって増大することが判明した。
【００２１】本発明のワクチンは、先ず、低継代数のセ
ロタイプ２ＭＤウイルス、即ち適切な細胞培養中で培養
した場合にワクチンとして有用であるのに十分な量の無
細胞ウイルスを産生しないセロタイプ２ＭＤウイルスを
継代培養し、次にこのようにして得られたウイルスを培
養し、それからその培養から得られる無細胞ウイルスを
免疫特性を有する製剤に加工することによって製造し得
る。
ロタイプ２ＭＤウイルス、即ち適切な細胞培養中で培養
した場合にワクチンとして有用であるのに十分な量の無
細胞ウイルスを産生しないセロタイプ２ＭＤウイルスを
継代培養し、次にこのようにして得られたウイルスを培
養し、それからその培養から得られる無細胞ウイルスを
免疫特性を有する製剤に加工することによって製造し得
る。
【００２２】本発明の無細胞ワクチンは、任意のセロタ
イプ２ＭＤウイルス株、例えばＨＰＲＳ Ｂ−２４株、
ＳＢ−１株（Ｓｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第
４，１６０，０２４号；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｃ．か
ら市販されている）、ＨＮ−１株（Ｃｈｏ，Ｂ．Ｒ．ａ
ｎｄ Ｋｅｎｚｙ，Ｓ．Ｇ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．２４，２９９，１９７２）、又はＷｉｔｔｅｒが
記載の３０／Ｂ／１株のような分離体（米国特許第４，
８９５，７１８号、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３
１，７５２，１９８７）から得られうるが、ＳＢ−１株
が最も好ましい株である。
イプ２ＭＤウイルス株、例えばＨＰＲＳ Ｂ−２４株、
ＳＢ−１株（Ｓｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第
４，１６０，０２４号；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｃ．か
ら市販されている）、ＨＮ−１株（Ｃｈｏ，Ｂ．Ｒ．ａ
ｎｄ Ｋｅｎｚｙ，Ｓ．Ｇ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．２４，２９９，１９７２）、又はＷｉｔｔｅｒが
記載の３０／Ｂ／１株のような分離体（米国特許第４，
８９５，７１８号、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３
１，７５２，１９８７）から得られうるが、ＳＢ−１株
が最も好ましい株である。
【００２３】セロタイプ２ＭＤウイルスの継代培養(ser
ial passage)のためには、この目的のために当業界で公
知の方法を用い得る。要するに、ウイルスを適当な細胞
培養物中で増殖させ、そこから採集し、新鮮な細胞培養
物を含有する培地に接種する。セロタイプ２ＭＤウイル
スを、使用可能量の無細胞ウイルスがそこから得られる
まで、細胞培養物中で数世代継代培養し、その後ワクチ
ンに加工する。
ial passage)のためには、この目的のために当業界で公
知の方法を用い得る。要するに、ウイルスを適当な細胞
培養物中で増殖させ、そこから採集し、新鮮な細胞培養
物を含有する培地に接種する。セロタイプ２ＭＤウイル
スを、使用可能量の無細胞ウイルスがそこから得られる
まで、細胞培養物中で数世代継代培養し、その後ワクチ
ンに加工する。
【００２４】継代培養に好適な細胞培養物は、中でもニ
ワトリ腎臓（ＣＫ）、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥ
Ｆ）、及びアヒル胚繊維芽細胞（ＤＥＦ）の培養物であ
る。
ワトリ腎臓（ＣＫ）、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥ
Ｆ）、及びアヒル胚繊維芽細胞（ＤＥＦ）の培養物であ
る。
【００２５】さらに、セロタイプ２ＭＤウイルスを、２
４〜４８時間単層ＣＫ、ＣＥＦ又はＤＥＦ培養物上に接
種し、次にこれを増殖培地を周期的に変化させて、３７
℃で数日間保持する。好適な増殖培地の内容物は、例え
ばイーグルの基礎培地（ＢＭＥ）、りん酸トリプトース
ブロス、重炭酸ナトリウム、ウシ胎仔血清及び抗生物質
である。７５％又はそれ以上の単層が細胞変性的に影響
を受けたときに、細胞を継代培養する。インキュベーシ
ョン期間終了時に、細胞の全塊を燐酸塩緩衝液で洗浄
し、トリプシンを用いて分散し、少量の培地に再懸濁し
て、取り換え、上記のように新鮮な単層細胞培養物上で
増殖させる。その後の継代培養数は、培養から得られる
無細胞ウイルスの量と、継代接種ウイルスの免疫及び感
染特性の保持とに依存している。最終継代培養細胞を洗
浄し、トリプシン処理し、遠心分離し、ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）を含有する少量の培地中に分散させ
る。この製剤を、種ウイルス培養物として用いるために
液体窒素温度（−７０℃）まで徐々に凍結させる。
４〜４８時間単層ＣＫ、ＣＥＦ又はＤＥＦ培養物上に接
種し、次にこれを増殖培地を周期的に変化させて、３７
℃で数日間保持する。好適な増殖培地の内容物は、例え
ばイーグルの基礎培地（ＢＭＥ）、りん酸トリプトース
ブロス、重炭酸ナトリウム、ウシ胎仔血清及び抗生物質
である。７５％又はそれ以上の単層が細胞変性的に影響
を受けたときに、細胞を継代培養する。インキュベーシ
ョン期間終了時に、細胞の全塊を燐酸塩緩衝液で洗浄
し、トリプシンを用いて分散し、少量の培地に再懸濁し
て、取り換え、上記のように新鮮な単層細胞培養物上で
増殖させる。その後の継代培養数は、培養から得られる
無細胞ウイルスの量と、継代接種ウイルスの免疫及び感
染特性の保持とに依存している。最終継代培養細胞を洗
浄し、トリプシン処理し、遠心分離し、ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）を含有する少量の培地中に分散させ
る。この製剤を、種ウイルス培養物として用いるために
液体窒素温度（−７０℃）まで徐々に凍結させる。
【００２６】一般に、無細胞製剤は、上記の方法によっ
て製造され、１０4 〜１０7 ｐｆｕ／ｍｌの範囲の力価
を有する。
て製造され、１０4 〜１０7 ｐｆｕ／ｍｌの範囲の力価
を有する。
【００２７】十分量の無細胞ウイルスを産生するセロタ
イプ２ＭＤウイルスを得るのに必要な継代数は、特に特
異的セロタイプ２ＭＤ株及び無細胞ウイルスの所望の量
又は力価に依存する。
イプ２ＭＤウイルスを得るのに必要な継代数は、特に特
異的セロタイプ２ＭＤ株及び無細胞ウイルスの所望の量
又は力価に依存する。
【００２８】本発明のワクチンを製造するのに必要なセ
ロタイプ２ＭＤウイルスの典型的な総継代数は２５〜４
０であり、好ましくは２８〜３５である。
ロタイプ２ＭＤウイルスの典型的な総継代数は２５〜４
０であり、好ましくは２８〜３５である。
【００２９】次に、セロタイプ２ＭＤウイルスを増殖さ
せるために、２４時間インキュベーション後に、ＣＥＦ
細胞を接種したローラー培地に上記のようにして得られ
た細胞性又は無細胞ウイルスを接種する。さらに数日間
インキュベーション後、上澄を捨て、細胞をトリプシン
−ベルセン混合物を用いて取り出し、その後細胞を遠心
分離して沈殿させ、上澄を捨てる。
せるために、２４時間インキュベーション後に、ＣＥＦ
細胞を接種したローラー培地に上記のようにして得られ
た細胞性又は無細胞ウイルスを接種する。さらに数日間
インキュベーション後、上澄を捨て、細胞をトリプシン
−ベルセン混合物を用いて取り出し、その後細胞を遠心
分離して沈殿させ、上澄を捨てる。
【００３０】無細胞製剤を製造するために、沈殿細胞を
緩衝液、例えば燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、又は好ましく
は安定剤を含有する培地中に懸濁する。ＳＰＧＡ（Ｂｏ
ｖａｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ ５９，５０９，１９５０）が最も好ましい安定
剤である。
緩衝液、例えば燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、又は好ましく
は安定剤を含有する培地中に懸濁する。ＳＰＧＡ（Ｂｏ
ｖａｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ ５９，５０９，１９５０）が最も好ましい安定
剤である。
【００３１】細胞破壊は、いくつかの方法、例えば音波
処理、又は凍結−解凍によって実施しうる。任意の無傷
細胞の存在は、血球計での検査時に測定されうる。音波
処理、又は瞬間凍結された製剤をバイアルに詰め、所望
によりＥＤＴＡの存在下で凍結乾燥する。任意に、凍結
乾燥前に、細胞砕片を濾過又は遠心分離によって除去す
る。
処理、又は凍結−解凍によって実施しうる。任意の無傷
細胞の存在は、血球計での検査時に測定されうる。音波
処理、又は瞬間凍結された製剤をバイアルに詰め、所望
によりＥＤＴＡの存在下で凍結乾燥する。任意に、凍結
乾燥前に、細胞砕片を濾過又は遠心分離によって除去す
る。
【００３２】上記の方法によって得られる無細胞セロタ
イプ２ＭＤウイルスを生ウイルス又は不活性ウイルスと
してワクチン中に混入する。
イプ２ＭＤウイルスを生ウイルス又は不活性ウイルスと
してワクチン中に混入する。
【００３３】生ウイルスを含有するワクチンは、懸濁液
又は凍結乾燥した形態で調製し、市販されうる。
又は凍結乾燥した形態で調製し、市販されうる。
【００３４】凍結乾燥ワクチンは、好ましくは１つ又は
それ以上の安定剤を含有し得る。好適な安定剤は、例え
ばＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５９，５０９，１９５０）、
炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、デンプ
ン、ショ糖、デキストラン、又はグルコース）、蛋白質
（例えばアルブミン又はカゼイン）、又はその分解生成
物、蛋白質含有物質、及び緩衝液（例えばアルカリ金属
燐酸塩）である。所望により、アジュバント活性を有す
る化合物を１つ以上加えてもよい。このために好適な化
合物は、例えばビタミンＥ酢酸塩ｏ／ｗ−乳濁液、アル
ミニウムの水酸化物、燐酸塩又は酸化物、鉱油（例えば
Ｂａｙｏｌ Ｆ(R) 、Ｍａｒｃｏｌ ５２(R) ）、及び
サポニンである。
それ以上の安定剤を含有し得る。好適な安定剤は、例え
ばＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５９，５０９，１９５０）、
炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、デンプ
ン、ショ糖、デキストラン、又はグルコース）、蛋白質
（例えばアルブミン又はカゼイン）、又はその分解生成
物、蛋白質含有物質、及び緩衝液（例えばアルカリ金属
燐酸塩）である。所望により、アジュバント活性を有す
る化合物を１つ以上加えてもよい。このために好適な化
合物は、例えばビタミンＥ酢酸塩ｏ／ｗ−乳濁液、アル
ミニウムの水酸化物、燐酸塩又は酸化物、鉱油（例えば
Ｂａｙｏｌ Ｆ(R) 、Ｍａｒｃｏｌ ５２(R) ）、及び
サポニンである。
【００３５】ＭＤウイルスの不活性化の目的は、ウイル
スを複製させないことである。概して、これは、化学的
又は物理的方法によって達成し得る。化学的不活性化
は、ウイルスを、例えば酵素、ホルムアルデヒド、β−
プロピオラクトン、エチレン−イミン又はその誘導体、
有機溶剤（例えばハロゲン化炭化水素）、及び／又は洗
剤（例えばＴｗｅｅｎ(R) 、トリトン Ｘ(R) 、デスオ
キシコール酸ナトリウム、スルホベタイン又はセチルト
リメチルアンモニウム塩）で処理することにより実施し
うる。必要な場合は、不活性化物質をその後中和する。
ホルムアルデヒドで不活性化した材料は、例えばチオ硫
酸塩で中和する。物理的不活性化は、好ましくはウイル
スを、例えばＵＶ線、Ｘ線、又はγ線のような高エネル
ギー放射線で処理することによって実施しうる。所望に
より、処理後、ｐＨを約７に戻してもよい。
スを複製させないことである。概して、これは、化学的
又は物理的方法によって達成し得る。化学的不活性化
は、ウイルスを、例えば酵素、ホルムアルデヒド、β−
プロピオラクトン、エチレン−イミン又はその誘導体、
有機溶剤（例えばハロゲン化炭化水素）、及び／又は洗
剤（例えばＴｗｅｅｎ(R) 、トリトン Ｘ(R) 、デスオ
キシコール酸ナトリウム、スルホベタイン又はセチルト
リメチルアンモニウム塩）で処理することにより実施し
うる。必要な場合は、不活性化物質をその後中和する。
ホルムアルデヒドで不活性化した材料は、例えばチオ硫
酸塩で中和する。物理的不活性化は、好ましくはウイル
スを、例えばＵＶ線、Ｘ線、又はγ線のような高エネル
ギー放射線で処理することによって実施しうる。所望に
より、処理後、ｐＨを約７に戻してもよい。
【００３６】通常、アジュバント（例えば上記のよう
な）、及び所望により１つ又はそれ以上の乳化剤、例え
ばＴｗｅｅｎ(R) 及びＳｐａｎ(R) を不活性ウイルス材
料に加えてもよい。
な）、及び所望により１つ又はそれ以上の乳化剤、例え
ばＴｗｅｅｎ(R) 及びＳｐａｎ(R) を不活性ウイルス材
料に加えてもよい。
【００３７】ワクチンは、ウイルス剤の有効量、即ち有
毒ＭＤウイルスによる攻撃に対する免疫性をニワトリに
誘発する無細胞ウイルス材料を免疫化する量で投与す
る。免疫性とは、非ワクチン接種群に比して、ワクチン
接種群のニワトリにおいて有意に高レベルの防御が誘発
されることであると定義される。
毒ＭＤウイルスによる攻撃に対する免疫性をニワトリに
誘発する無細胞ウイルス材料を免疫化する量で投与す
る。免疫性とは、非ワクチン接種群に比して、ワクチン
接種群のニワトリにおいて有意に高レベルの防御が誘発
されることであると定義される。
【００３８】生ワクチンに関しては、ニワトリあたりの
量は１〜６対数ｐｆｕの範囲である。
量は１〜６対数ｐｆｕの範囲である。
【００３９】一般に、本発明の生ワクチンは、少なくと
も２．２対数ｐｆｕ、好ましくは少なくとも２．７対数
ｐｆｕ、さらに好ましくは少なくとも３．２対数ｐｆｕ
無細胞ウイルスの量で投与する。
も２．２対数ｐｆｕ、好ましくは少なくとも２．７対数
ｐｆｕ、さらに好ましくは少なくとも３．２対数ｐｆｕ
無細胞ウイルスの量で投与する。
【００４０】自然投与経路（噴霧、点眼及び点鼻）の場
合は、１０6 〜１０7 ｐｆｕ／ニワトリの量を投与す
る。
合は、１０6 〜１０7 ｐｆｕ／ニワトリの量を投与す
る。
【００４１】不活性ワクチンは、３〜７対数ｐｆｕ、好
ましくは４〜６対数ｐｆｕ／トリの抗原当量を含有し得
る。
ましくは４〜６対数ｐｆｕ／トリの抗原当量を含有し得
る。
【００４２】本発明のワクチンは、高力価での噴霧、点
眼、点鼻により、経口的（例えば飲み水）に、あるい
は、ニワトリが免疫能を得た後の任意の時期に筋肉内、
皮下又は卵注射による方法によって、投与される。普通
は、ワクチンは孵化後２４〜４８時間目にニワトリに投
与する。
眼、点鼻により、経口的（例えば飲み水）に、あるい
は、ニワトリが免疫能を得た後の任意の時期に筋肉内、
皮下又は卵注射による方法によって、投与される。普通
は、ワクチンは孵化後２４〜４８時間目にニワトリに投
与する。
【００４３】本発明の別の態様は、二価ワクチンとして
の無細胞ＭＤセロタイプ２ウイルスと無細胞ＨＶＴとの
組み合わせである。意外にも、無細胞ＭＤセロタイプ２
ウイルスは、継代数が増加しても、ＨＶＴの効力をまだ
増大し得ることが判明した。
の無細胞ＭＤセロタイプ２ウイルスと無細胞ＨＶＴとの
組み合わせである。意外にも、無細胞ＭＤセロタイプ２
ウイルスは、継代数が増加しても、ＨＶＴの効力をまだ
増大し得ることが判明した。
【００４４】特に、ＳＢ−１株の無細胞セロタイプ２Ｍ
Ｄウイルスを、無細胞ＨＶＴと組み合わせて使用する。
本発明のワクチンに混入すべきＨＶＴウイルスは、任意
の有用な株、例えばＦＣ１２６又はＴＨＶ ＰＢ１（Ｉ
ｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｃ．から市販されている）のもの
であってもよい。任意に、ＨＶＴウイルスは、そのウイ
ルスゲノムに挿入される家禽病原の抗原をコードする外
来遺伝子を含有して、多価ワクチンを形成してもよい。
Ｄウイルスを、無細胞ＨＶＴと組み合わせて使用する。
本発明のワクチンに混入すべきＨＶＴウイルスは、任意
の有用な株、例えばＦＣ１２６又はＴＨＶ ＰＢ１（Ｉ
ｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｃ．から市販されている）のもの
であってもよい。任意に、ＨＶＴウイルスは、そのウイ
ルスゲノムに挿入される家禽病原の抗原をコードする外
来遺伝子を含有して、多価ワクチンを形成してもよい。
【００４５】本発明はさらに、無細胞セロタイプ２ＭＤ
ウイルス材料に加えて家禽に対して感染性のその他の病
原体に由来するワクチンを含有する配合ワクチンを含
む。無細胞セロタイプ２ＭＤウイルスは、ニューカッス
ル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（Ｉ
ＢＶ）、及び感染性滑液嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）か
ら成る群から選択されるワクチンウイルスと組み合わせ
て投与し得る。
ウイルス材料に加えて家禽に対して感染性のその他の病
原体に由来するワクチンを含有する配合ワクチンを含
む。無細胞セロタイプ２ＭＤウイルスは、ニューカッス
ル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（Ｉ
ＢＶ）、及び感染性滑液嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）か
ら成る群から選択されるワクチンウイルスと組み合わせ
て投与し得る。
【００４６】
【実施例】実施例１
Ａ．セロタイプ２ＭＤウイルスＳＢ−１及びＢ−２４の
継代培養 細胞性ＳＢ−１又はＢ−２４ウイルスを、直径６ｃｍの
Ｆａｌｃｏｎ ペトリ皿上で増殖させた２４時間齢ＳＰ
Ｆ由来ニワトリ胚細胞培養物（１．５×１０6 ＣＥＦ／
皿）に接種する。少なくとも１００ｐｆｕを含有する接
種物０．１ｍｌをプレート上の５ｍｌの組織培地中に接
種し、細胞性ウイルスを単層上に置き、それを感染させ
る。５％のＣＯ2 中で３８．５℃で５日間インキュベー
ション後、１．培地から洗い流し、 ２．トリプシン／ベルセンＰＢＳ溶液を加えてペトリ皿
への細胞の付着をゆるめ、 ３．細胞をペトリ皿から剥す前にトリプシン／ベルセン
ＰＢＳ混合液を捨て、 ４．増殖培地で細胞を皿から洗い落とすことによって、
細胞を皿から除去する。工程４から得られた細胞性ウイ
ルスの懸濁物を、ＣＥＦ細胞上の次の継代培養のための
接種物として用いる。上記のように受理(receipt) 後、
ウイルスを５代継代培養する。６代継代培養（最初の継
代培養をプラス）から、４日間インキュベーションし
た。
継代培養 細胞性ＳＢ−１又はＢ−２４ウイルスを、直径６ｃｍの
Ｆａｌｃｏｎ ペトリ皿上で増殖させた２４時間齢ＳＰ
Ｆ由来ニワトリ胚細胞培養物（１．５×１０6 ＣＥＦ／
皿）に接種する。少なくとも１００ｐｆｕを含有する接
種物０．１ｍｌをプレート上の５ｍｌの組織培地中に接
種し、細胞性ウイルスを単層上に置き、それを感染させ
る。５％のＣＯ2 中で３８．５℃で５日間インキュベー
ション後、１．培地から洗い流し、 ２．トリプシン／ベルセンＰＢＳ溶液を加えてペトリ皿
への細胞の付着をゆるめ、 ３．細胞をペトリ皿から剥す前にトリプシン／ベルセン
ＰＢＳ混合液を捨て、 ４．増殖培地で細胞を皿から洗い落とすことによって、
細胞を皿から除去する。工程４から得られた細胞性ウイ
ルスの懸濁物を、ＣＥＦ細胞上の次の継代培養のための
接種物として用いる。上記のように受理(receipt) 後、
ウイルスを５代継代培養する。６代継代培養（最初の継
代培養をプラス）から、４日間インキュベーションし
た。
【００４７】結果：ＳＢ−１
コーネル大学から入手したＳＢ−１ウイルスは受理時に
すでに１０回の継代培養を受けていた（組織培養をＣＥ
Ｆ及びＣＫ細胞で７代継代し、その後ＳＰＦニワトリで
２代継代培養して、さらにＣＥＦ細胞上で継代培養し
た）。
すでに１０回の継代培養を受けていた（組織培養をＣＥ
Ｆ及びＣＫ細胞で７代継代し、その後ＳＰＦニワトリで
２代継代培養して、さらにＣＥＦ細胞上で継代培養し
た）。
【００４８】無細胞ウイルスを得るためにペトリ皿から
の重感染細胞（継代１０レベル）を処理して５ｍｌのＳ
ＰＧＡに再懸濁した場合は、検定時に生無細胞ウイルス
は１０-2希釈では検出されなかった。
の重感染細胞（継代１０レベル）を処理して５ｍｌのＳ
ＰＧＡに再懸濁した場合は、検定時に生無細胞ウイルス
は１０-2希釈では検出されなかった。
【００４９】ＳＢ−１株を、コーネル大学から受理後に
計２１回継代培養し、同様の方法で処理した場合、１０
4.9 ｐｆｕ／ｍｌの力価の生無細胞ウイルスが得られ
た。
計２１回継代培養し、同様の方法で処理した場合、１０
4.9 ｐｆｕ／ｍｌの力価の生無細胞ウイルスが得られ
た。
【００５０】計２６回継代培養したＳＢ−１ウイルス
は、１０6.0 ｐｆｕ／ｍｌの力価の無細胞ウイルスを生
じた。これらの無細胞ＳＢ−１ウイルスはニワトリに対
して依然として感染性であって、ウイルス血症を誘発
し、蔓延してトリに接触し、防御的免疫反応を誘発し得
た。
は、１０6.0 ｐｆｕ／ｍｌの力価の無細胞ウイルスを生
じた。これらの無細胞ＳＢ−１ウイルスはニワトリに対
して依然として感染性であって、ウイルス血症を誘発
し、蔓延してトリに接触し、防御的免疫反応を誘発し得
た。
【００５１】Ｂ−２４
Ｂ−２４の９代継代からの重感染細胞を処理して上記の
ような無細胞ウイルスを得た場合、力価は１０2 ｐｆｕ
／ｍｌ未満であった。３５代継代からの重感染細胞を試
験したところ、１０4.7 ｐｆｕ／ｍｌの力価であった。
ような無細胞ウイルスを得た場合、力価は１０2 ｐｆｕ
／ｍｌ未満であった。３５代継代からの重感染細胞を試
験したところ、１０4.7 ｐｆｕ／ｍｌの力価であった。
【００５２】Ｂ．ＳＢ−１無細胞セロタイプ２ＭＤワク
チンの調製 ２００×１０6 ＣＥＦ細胞を接種した２つのローラー培
養物（１７５０ｃｍ2 ）を培地中に、上記の方法で得ら
れた１ｍｌの細胞性ＳＢ−１種ウイルスと共に接種した
結果、２４時間インキュベーション後の力価は１０5 ｐ
ｆｕ／ｍｌであった。
チンの調製 ２００×１０6 ＣＥＦ細胞を接種した２つのローラー培
養物（１７５０ｃｍ2 ）を培地中に、上記の方法で得ら
れた１ｍｌの細胞性ＳＢ−１種ウイルスと共に接種した
結果、２４時間インキュベーション後の力価は１０5 ｐ
ｆｕ／ｍｌであった。
【００５３】さらに５日間インキュベーション後、上澄
を捨て、トリプシン／ベルシン混合液で細胞を除去し
た。遠心分離して細胞を沈殿させ、上澄を捨てて、細胞
を２０ｍｌのＳＰＧＡと混合し、次に２０秒間超音波処
理した。
を捨て、トリプシン／ベルシン混合液で細胞を除去し
た。遠心分離して細胞を沈殿させ、上澄を捨てて、細胞
を２０ｍｌのＳＰＧＡと混合し、次に２０秒間超音波処
理した。
【００５４】音波処理製剤をバイアル中に詰めて１ｍｌ
アリコートとし、凍結乾燥した。
アリコートとし、凍結乾燥した。
【００５５】
凍結乾燥前の力価 １０4.8 ｐｆｕ／ｍｌ
凍結乾燥後の力価 １０5 ｐｆｕ／ｍｌ実施例２ 無細胞セロタイプ２ＭＤワクチンの効力
セロタイプ１、２及び３に対するＭＤＡを有する１０羽
のブロイラーの３群に、異なる量の無細胞ＳＢ−１を孵
化後１日目に投与した（ｉ／ｍ）。
のブロイラーの３群に、異なる量の無細胞ＳＢ−１を孵
化後１日目に投与した（ｉ／ｍ）。
【００５６】用いた量は、１７６ｐｆｕ／ニワトリ、４
６０ｐｆｕ／ニワトリ及び１５２０ｐｆｕ／ニワトリで
あった。
６０ｐｆｕ／ニワトリ及び１５２０ｐｆｕ／ニワトリで
あった。
【００５７】ワクチンの効力を、ウイルス血症を測定す
ることにより試験した。初期実験では、非ワクチン接種
ニワトリをＳＢ−１（高継代数）をワクチン接種したニ
ワトリと接触させておいた場合、接種（この場合ワクチ
ン接種量は２００ｐｆｕの細胞性ウイルスであった）後
２週間で３羽の接触トリ中１羽に蔓延したことが確認さ
れたので、２週間後にウイルス血症に関する試験はしな
いことを決定した。軟膜をワクチン接種後１及び２週間
目に採取し、標準手法によりＳＢ−１ウイルスに関して
ＣＥＦ細胞上で試験した。培養物を、読み取り前に１週
間インキュベートした。下表１に報告された結果は、１
７６ｐｆｕ／ニワトリをワクチン接種したニワトリの発
症率（ｔａｋｅ ｒａｔｅ）は少なくとも５６％であ
り、一方４６０ｐｆｕ／ニワトリ又は１５２０ｐｆｕ／
ニワトリをワクチン接種した全ニワトリがウイルス血症
になったことを示す。
ることにより試験した。初期実験では、非ワクチン接種
ニワトリをＳＢ−１（高継代数）をワクチン接種したニ
ワトリと接触させておいた場合、接種（この場合ワクチ
ン接種量は２００ｐｆｕの細胞性ウイルスであった）後
２週間で３羽の接触トリ中１羽に蔓延したことが確認さ
れたので、２週間後にウイルス血症に関する試験はしな
いことを決定した。軟膜をワクチン接種後１及び２週間
目に採取し、標準手法によりＳＢ−１ウイルスに関して
ＣＥＦ細胞上で試験した。培養物を、読み取り前に１週
間インキュベートした。下表１に報告された結果は、１
７６ｐｆｕ／ニワトリをワクチン接種したニワトリの発
症率（ｔａｋｅ ｒａｔｅ）は少なくとも５６％であ
り、一方４６０ｐｆｕ／ニワトリ又は１５２０ｐｆｕ／
ニワトリをワクチン接種した全ニワトリがウイルス血症
になったことを示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】実施例３ ＭＤＡ陽性ニワトリにおけるＨＶＴ無細胞及びＨＶＴ／
ＳＢ−１ワクチンにより誘発される免疫性の比較 ウイルス − 使用したウイルス株は以下の通りであっ
た： ＨＶＴ −これはＩｎｔｅｒｖｅｔ ＰＢ１ ＴＨＶ
株である。
ＳＢ−１ワクチンにより誘発される免疫性の比較 ウイルス − 使用したウイルス株は以下の通りであっ
た： ＨＶＴ −これはＩｎｔｅｒｖｅｔ ＰＢ１ ＴＨＶ
株である。
【００６０】ＳＢ−１ −この株は、ウイルスが急速に
増殖し、無細胞ウイルスを放出するようになるまで継代
培養した。無細胞製剤は、ＳＰＧＡ安定剤中で感染ＣＥ
Ｆ細胞を音波処理して調製した。
増殖し、無細胞ウイルスを放出するようになるまで継代
培養した。無細胞製剤は、ＳＰＧＡ安定剤中で感染ＣＥ
Ｆ細胞を音波処理して調製した。
【００６１】セロタイプ１、２及び３ＭＤウイルスに対
する母由来抗体（ＭＤＡ）を有する２〜３日齢のブロイ
ラーを３群に分けた： Ａ群 ３７羽 ワクチン接種なし； Ｂ群 ４２羽 １０００ｐｆｕ／ニワトリのＨＶＴ
ワクチンでワクチン接種； Ｃ群 ４２羽 １０００ｐｆｕ／ニワトリのＨＶＴ
ワクチンを２５０ｐｆｕのＳＢ−１ウイルスとともワク
チン接種。
する母由来抗体（ＭＤＡ）を有する２〜３日齢のブロイ
ラーを３群に分けた： Ａ群 ３７羽 ワクチン接種なし； Ｂ群 ４２羽 １０００ｐｆｕ／ニワトリのＨＶＴ
ワクチンでワクチン接種； Ｃ群 ４２羽 １０００ｐｆｕ／ニワトリのＨＶＴ
ワクチンを２５０ｐｆｕのＳＢ−１ウイルスとともワク
チン接種。
【００６２】９日齢に、全群に有毒性ウイルスＲＢＩＢ
で攻撃した。実験中、時々、分離体の過密を防ぐために
各群のニワトリを屠殺しなければならなかった。死亡又
は屠殺した全ニワトリを、マレック病（ＭＤ）の肉眼的
及び顕微鏡的病変に関して調べた。
で攻撃した。実験中、時々、分離体の過密を防ぐために
各群のニワトリを屠殺しなければならなかった。死亡又
は屠殺した全ニワトリを、マレック病（ＭＤ）の肉眼的
及び顕微鏡的病変に関して調べた。
【００６３】攻撃後、各ワクチン接種群では攻撃後（ｐ
ｃ）４日目に１羽のニワトリが死亡し、非ワクチン接種
群では５〜９日目に５羽のニワトリが死亡した。組織学
的検査により、特に包嚢及び胸腺にリンパ球欠乏（ｌｙ
ｍｐｈｏｉｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）が明示された。こ
れらの観察と死亡時期を考慮すると、ＭＤの細胞溶解作
用によるものであったことが示唆される。
ｃ）４日目に１羽のニワトリが死亡し、非ワクチン接種
群では５〜９日目に５羽のニワトリが死亡した。組織学
的検査により、特に包嚢及び胸腺にリンパ球欠乏（ｌｙ
ｍｐｈｏｉｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）が明示された。こ
れらの観察と死亡時期を考慮すると、ＭＤの細胞溶解作
用によるものであったことが示唆される。
【００６４】図１及び図２のヒストグラムは、攻撃後の
各時期に屠殺されたトリの数、及びその後死後に又は組
織学的検査時にマレック病を患っていることが判明した
数を示す。図３及び図４のヒストグラムは、ワクチン接
種及び非ワクチン接種ニワトリにおける攻撃後のＭＤの
頻度を示す。高頻度のＭＤは、非ワクチン接種群で観察
された（図２及び４）。攻撃後１１日目に屠殺された７
羽のうち、３羽がＭＤ腫瘍を有していた。ＭＤによる死
亡は、ｐｃ１１日目に始まった。ｐｃ２８日目には８羽
の疾病ニワトリを屠殺し、ｐｃ３２日目には全体で８羽
の疾病ニワトリを屠殺したが、しかし２羽が重症である
と思われた。１６羽すべてが、肝臓、腎臓、及びその他
の臓器にＭＤ腫瘍を有していた。計３７羽のうち、５羽
が“細胞溶解性ＭＤ”による死亡であり、２７羽はＭＤ
腫瘍を有するか又はＭＤで死亡した。ＭＤ病変を有して
いなかった４羽は、ｐｃ１１日目に屠殺されたが、これ
らはほとんどＭＤを発症していなかった（１羽は非特異
的病因で死亡した）。
各時期に屠殺されたトリの数、及びその後死後に又は組
織学的検査時にマレック病を患っていることが判明した
数を示す。図３及び図４のヒストグラムは、ワクチン接
種及び非ワクチン接種ニワトリにおける攻撃後のＭＤの
頻度を示す。高頻度のＭＤは、非ワクチン接種群で観察
された（図２及び４）。攻撃後１１日目に屠殺された７
羽のうち、３羽がＭＤ腫瘍を有していた。ＭＤによる死
亡は、ｐｃ１１日目に始まった。ｐｃ２８日目には８羽
の疾病ニワトリを屠殺し、ｐｃ３２日目には全体で８羽
の疾病ニワトリを屠殺したが、しかし２羽が重症である
と思われた。１６羽すべてが、肝臓、腎臓、及びその他
の臓器にＭＤ腫瘍を有していた。計３７羽のうち、５羽
が“細胞溶解性ＭＤ”による死亡であり、２７羽はＭＤ
腫瘍を有するか又はＭＤで死亡した。ＭＤ病変を有して
いなかった４羽は、ｐｃ１１日目に屠殺されたが、これ
らはほとんどＭＤを発症していなかった（１羽は非特異
的病因で死亡した）。
【００６５】ＨＶＴワクチンを投与した群では、肉眼的
ＭＤ腫瘍が、２１日目に屠殺した１０羽のうち２羽、並
びにその時期に死亡した２羽で観察された。３２日目及
び４２日目に屠殺した５羽の疾病ニワトリの死後検査か
らは、それらのニワトリのすべてがＭＤ腫瘍を有してい
たことが明示された。計７羽は、実験中にＭＤで死亡し
た。ｐｃ５３日目に屠殺した残り８羽には、ＭＤの徴候
が認められなかった。ＭＤで屠殺された又は死亡した場
合、計４２羽のうち１６羽がＭＤ腫瘍を有していた。ｐ
ｃ１１日目に屠殺した１０羽、２１日目に屠殺した８
羽、及び５３日目に屠殺した８羽には、病変は認められ
なかった。
ＭＤ腫瘍が、２１日目に屠殺した１０羽のうち２羽、並
びにその時期に死亡した２羽で観察された。３２日目及
び４２日目に屠殺した５羽の疾病ニワトリの死後検査か
らは、それらのニワトリのすべてがＭＤ腫瘍を有してい
たことが明示された。計７羽は、実験中にＭＤで死亡し
た。ｐｃ５３日目に屠殺した残り８羽には、ＭＤの徴候
が認められなかった。ＭＤで屠殺された又は死亡した場
合、計４２羽のうち１６羽がＭＤ腫瘍を有していた。ｐ
ｃ１１日目に屠殺した１０羽、２１日目に屠殺した８
羽、及び５３日目に屠殺した８羽には、病変は認められ
なかった。
【００６６】二重ワクチン接種群におけるＭＤの頻度
は、ｐｃ５３日目に屠殺した場合に肝臓にＭＤ腫瘍を有
していた１羽のトリのみで、非常に低かった。計４２羽
のうち、４羽が非特異的病因で死亡し、そのうち１羽は
“細胞溶解性ＭＤ”で死亡したと考えられる。ｐｃ１１
日目に屠殺した１０羽、ｐｃ２１日目に屠殺した１１
羽、ｐｃ４２日目に屠殺した３羽、及びｐｃ５３日目に
屠殺した１４羽のうちの１３羽には、ＭＤ病変は認めら
れなかった。
は、ｐｃ５３日目に屠殺した場合に肝臓にＭＤ腫瘍を有
していた１羽のトリのみで、非常に低かった。計４２羽
のうち、４羽が非特異的病因で死亡し、そのうち１羽は
“細胞溶解性ＭＤ”で死亡したと考えられる。ｐｃ１１
日目に屠殺した１０羽、ｐｃ２１日目に屠殺した１１
羽、ｐｃ４２日目に屠殺した３羽、及びｐｃ５３日目に
屠殺した１４羽のうちの１３羽には、ＭＤ病変は認めら
れなかった。
【００６７】結果は、無細胞二重ワクチンＳＢ−１／Ｈ
ＶＴがセロタイプ２＆３ウイルスに対するＭＤＡを有す
るブロイラーニワトリにおけるＲＢＩＢの重度攻撃に対
して非常に高レベルの防御を提供することを示す。ＨＶ
Ｔワクチンは、この重度攻撃に対して有意の防御を提供
するが、しかし約３７％のニワトリがＭＤの何らかの徴
候を示した。生存した非ワクチン接種ニワトリのほとん
どがｐｃ約４週間でＭＤの顕著な臨床徴候を示していた
ため、それらはすべて、ｐｃ３２日目までに屠殺した、
ということに留意すべきである。ｐｃ５３日目の実験完
了時に、二重ワクチンを投与されたニワトリはＨＶＴの
みをワクチン接種したニワトリより重症のであることが
観察された。これは、屠殺した場合に８羽のＨＶＴワク
チン接種ニワトリはどれも明らかに有意なＭＤ病変を有
していなかったので、意外である。
ＶＴがセロタイプ２＆３ウイルスに対するＭＤＡを有す
るブロイラーニワトリにおけるＲＢＩＢの重度攻撃に対
して非常に高レベルの防御を提供することを示す。ＨＶ
Ｔワクチンは、この重度攻撃に対して有意の防御を提供
するが、しかし約３７％のニワトリがＭＤの何らかの徴
候を示した。生存した非ワクチン接種ニワトリのほとん
どがｐｃ約４週間でＭＤの顕著な臨床徴候を示していた
ため、それらはすべて、ｐｃ３２日目までに屠殺した、
ということに留意すべきである。ｐｃ５３日目の実験完
了時に、二重ワクチンを投与されたニワトリはＨＶＴの
みをワクチン接種したニワトリより重症のであることが
観察された。これは、屠殺した場合に８羽のＨＶＴワク
チン接種ニワトリはどれも明らかに有意なＭＤ病変を有
していなかったので、意外である。
【００６８】実施例４ 無ＭＤＡニワトリにおける無細胞ＳＢ−１ウイルス及び
ＨＶＴ／ＳＢ−１ワクチンにより誘発される免疫性の比
較 ２０日齢のＳＰＦニワトリに、ＳＰＧＡ０．１ｍｌ／ニ
ワトリ中で再構成した２００ｐｆｕの凍結乾燥無細胞Ｓ
Ｂ−１ウイルスを皮下接種した。第２群のニワトリに
は、２００ｐｆｕのＳＢ−１ワクチンを、１０００ｐｆ
ｕのＨＶＴワクチンウイルスとともに投与した。１週間
後、これらのニワトリ及び出所及び年齢が同じ２０羽の
非ワクチン接種ニワトリを、ＲＢＩＢの有毒性株を用い
たｉ／ｍ接種により攻撃した。６週間に亘って、マレッ
ク病で死亡したニワトリ数／群を調べた。
ＨＶＴ／ＳＢ−１ワクチンにより誘発される免疫性の比
較 ２０日齢のＳＰＦニワトリに、ＳＰＧＡ０．１ｍｌ／ニ
ワトリ中で再構成した２００ｐｆｕの凍結乾燥無細胞Ｓ
Ｂ−１ウイルスを皮下接種した。第２群のニワトリに
は、２００ｐｆｕのＳＢ−１ワクチンを、１０００ｐｆ
ｕのＨＶＴワクチンウイルスとともに投与した。１週間
後、これらのニワトリ及び出所及び年齢が同じ２０羽の
非ワクチン接種ニワトリを、ＲＢＩＢの有毒性株を用い
たｉ／ｍ接種により攻撃した。６週間に亘って、マレッ
ク病で死亡したニワトリ数／群を調べた。
【００６９】
【表２】
【図１】ＨＶＴワクチン及び二重ワクチン接種群の攻撃
後の各時期に屠殺されたトリの数及びその後死後に又は
組織学的検査時にマレック病を患っていることが判明し
たトリの数を示すヒストグラムである。
後の各時期に屠殺されたトリの数及びその後死後に又は
組織学的検査時にマレック病を患っていることが判明し
たトリの数を示すヒストグラムである。
【図２】非ワクチン接種群の攻撃後の各時期に屠殺され
たトリの数、及びその後死後に又は組織学的検査時にマ
レック病を患っていることが判明したトリの数を示すヒ
ストグラムである。
たトリの数、及びその後死後に又は組織学的検査時にマ
レック病を患っていることが判明したトリの数を示すヒ
ストグラムである。
【図３】ワクチン接種ニワトリにおける攻撃後のＭＤの
頻度を示すヒストグラムである。
頻度を示すヒストグラムである。
【図４】非ワクチン接種ニワトリにおける攻撃後のＭＤ
の頻度を示すヒストグラムである。
の頻度を示すヒストグラムである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 米国特許4160024（ＵＳ，Ａ)
国際公開89／02278（ＷＯ，Ａ１)
Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，1974,
Ｖｏｌ．35，Ｎｏ．11，ｐｐ．1449−
1453
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 39/255
A61P 31/22
ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ)
ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)
Claims (11)
- 【請求項１】 無細胞マレック病セロタイプ２ウイルス
及び製薬上許容可能な担体を含有することを特徴とする
家禽のマレック病防御用ワクチン。 - 【請求項２】 無細胞ＳＢ−１ウイルスを含有すること
を特徴とする請求項１記載のワクチン。 - 【請求項３】 無細胞Ｂ−２４ウイルスを含有すること
を特徴とする請求項１記載のワクチン。 - 【請求項４】 無細胞マレック病セロタイプ２ウイルス
の量が少なくとも２．２ｐｆｕ／ニワトリであることを
特徴とする請求項１記載のワクチン。 - 【請求項５】 上記量が少なくとも２．７ｐｆｕ／ニワ
トリであることを特徴とする請求項４記載のワクチン。 - 【請求項６】 上記量が少なくとも３．２ｐｆｕ／ニワ
トリであることを特徴とする請求項５記載のワクチン。 - 【請求項７】 さらに無細胞ＨＶＴ（七面鳥ヘルペスウ
イルス）を含有することを特徴とする請求項１〜６記載
のワクチン。 - 【請求項８】 凍結乾燥されていることを特徴とする請
求項１〜７記載のワクチン。 - 【請求項９】 以下の工程： ａ．有効免疫化量を調製するのに必要な十分量の無細胞
ウイルスが得られる細胞培養物中でセロタイプ２マレッ
ク病ウイルスを増殖させ、 ｂ．細胞を破壊させ、 ｃ．その後無細胞ウイルスを収集し、そして ｄ．工程ｃから得られた材料に以下の処置： ｉ 遠心分離及び／又は濾過により清澄にする； ｉｉ 緩衝液を加える； ｉｉｉ 安定剤を加える； ｉｖ バイアル中に該材料を入れる； ｖ 凍結乾燥する； の少なくとも１つを施すことから成ることを特徴とする
家禽のマレック病防御用ワクチンの製造方法。 - 【請求項１０】 工程ｂの後の無細胞ウイルスの力価が
少なくとも４ｌｏｇｓ ｐｆｕ／ｍｌであることを特徴
とする請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 トリに請求項１〜７記載のワクチンを
投与することからなることを特徴とする家禽のマレック
病の防御方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90314297 | 1990-12-24 | ||
| GB90314297.4 | 1990-12-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04295433A JPH04295433A (ja) | 1992-10-20 |
| JP3410744B2 true JP3410744B2 (ja) | 2003-05-26 |
Family
ID=8205666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34156491A Expired - Fee Related JP3410744B2 (ja) | 1990-12-24 | 1991-12-24 | 無細胞マレック病ウイルスワクチン |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5378467A (ja) |
| EP (1) | EP0496135B1 (ja) |
| JP (1) | JP3410744B2 (ja) |
| KR (1) | KR100187317B1 (ja) |
| CN (1) | CN1034554C (ja) |
| AT (1) | ATE109007T1 (ja) |
| CA (1) | CA2058386C (ja) |
| DE (1) | DE69103130T2 (ja) |
| DK (1) | DK0496135T3 (ja) |
| DZ (1) | DZ1550A1 (ja) |
| ES (1) | ES2061165T3 (ja) |
| HU (2) | HUT62200A (ja) |
| IL (1) | IL100386A (ja) |
| MX (1) | MX9102757A (ja) |
| NZ (1) | NZ241122A (ja) |
| SA (1) | SA92120430B1 (ja) |
| ZA (1) | ZA9110022B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| FR2719056B1 (fr) * | 1994-04-20 | 1996-09-06 | Rhone Merieux | Herpesvirus transformés pour exprimer gD in vitro. |
| IL114501A (en) * | 1994-07-14 | 1999-08-17 | Akzo Nobel Nv | Marek's disease virus vaccine |
| EP0703294A1 (en) * | 1994-07-14 | 1996-03-27 | Akzo Nobel N.V. | Marek's disease virus vaccine |
| US5565202A (en) * | 1994-08-12 | 1996-10-15 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Low enhancement serotype 2 vaccine for marek's disease |
| FR2857671B1 (fr) * | 2003-07-18 | 2007-10-05 | Centre Nat Rech Scient | Nouveau procede de culture de keratinocytes et ses applications |
| ES2436317T3 (es) * | 2010-05-07 | 2013-12-30 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Parvovirus de roedor modificado capaz de propagarse y difundirse en gliomas humanos |
| CN111542337A (zh) | 2017-12-20 | 2020-08-14 | 英特维特国际股份有限公司 | 用于细胞相关联的α疱疹病毒疫苗的改良稀释剂 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4160024A (en) * | 1978-05-01 | 1979-07-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Marek's disease vaccine |
| US4895718A (en) * | 1987-07-10 | 1990-01-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Serotype 2 Marek's disease vaccine |
| JPS62212326A (ja) * | 1987-09-14 | 1987-09-18 | Gen Corp:Kk | マレツク病２価生ワクチンとその製造方法 |
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1991
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-
1992
- 1992-03-18 SA SA92120430A patent/SA92120430B1/ar unknown
-
1993
- 1993-11-23 US US08/156,967 patent/US5378467A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-12-29 HU HU94P/P00059P patent/HU210344A9/hu unknown
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，１９７４，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１１，ｐｐ．１４４９−１４５３ |
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