ES2284277T3 - Vacunacion en huevo contra el virus de la enfermedad de marek del tipo i. - Google Patents
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Abstract
El empleo de una composición constando de virus vivos atenuados libres de células, del tipo I de la enfermedad de Marek, para la preparación de una vacuna para la inmunización de pollos, en donde dicha vacuna es para ser inoculada en un huevo en crecimiento.
Description
Vacunación en huevo contra el virus de la
enfermedad de Marek del tipo I.
La presente invención tiene que ver con una
profilaxis para la enfermedad de Marek en pollos, inducida por el
virus tipo I de la enfermedad de Marek (de ahora en adelante
mencionado también como "MDV-1"). Más
específicamente, la presente invención se refiere a un método para
inmunizar pollos comprendiendo el inocular, en un huevo de pollo en
crecimiento, una composición constando de MDV-1 vivo
atenuado libre de células. Además, la presente invención
proporciona un método para inmunizar eficazmente pollos contra
múltiples enfermedades con MDV-1 recombinante.
La enfermedad de Marek es una enfermedad
infecciosa de los pollos causada por el MDV-1 y
caracterizada por la infiltración o proliferación tumoral de células
linfáticas. Está asociada con síntomas tales como la parálisis de
las piernas, la formación de linfomas en diversos órganos de las
vísceras, pérdida de peso, anemia, diarrea, etc. En la
especialidad, la enfermedad de Marek conduce a la muerte del pollo
o provoca la inspección de las aves de corral para su destrucción
total o parcial, y por lo tanto, produce mucha pérdida económica en
el granjero de aves de corral.
Para la protección de la enfermedad de Marek,
hasta ahora se han utilizado vacunas vivas atenuadas, esto es,
MDV-1, MDV-2 o el virus herpes del
pavo (HVT, MDV-3), solas o en mezcla inoculadas
subcutáneamente en pollos recién nacidos. En tal caso, se empleaba
por regla general una composición de células infectadas por virus.
Sin embargo, las vacunas MDV-2 y HVT son escasamente
eficaces contra un virus de la enfermedad de Marek con muy alta
patogenicidad, tal como la cepa muy virulenta o muy virulenta (+)
reportada en estos últimos años. Únicamente se puede utilizar
eficazmente una vacuna MDV-1 (R. L. Witter, AVIAN
DISEASE 41: 149-163, 1997).
Hoy en día, se han desarrollado algunas vacunas
para diversas enfermedades infecciosas de los pollos. La profilaxis
de las enfermedades mediante vacunación es una medida predominante
de sanitización en el ámbito de acción de la crianza de aves de
corral, con independencia de si tiene que ver con la reproducción
de pollos, gallinas ponedoras o pollos para carne. Por otra parte,
el coste de la mano de obra debido al aumento a escala de la
crianza de aves de corral y del programa preparado apresuradamente
para la inoculación frecuente de la vacuna es una carga en el
granjero de aves de corral. Para obviar esto, se ha intentado el
desarrollo de una vacunación más eficaz y eficiente, tal como la
reducción en la frecuencia de inoculación mezclando varias vacunas
(esto es, una vacuna mixta).
Como manera eficiente de vacunación, Sharma y
col. informaron de la vacunación en huevos de pollo en crecimiento
(inoculación in ovo) (J. M. Sharma y col., AVIAN DISEASE
26(1): 134-149, 1982). Según Sharma y col.,
el pollo salido de huevos de pollo en crecimiento inoculados con
células infectadas por HVT, y el pollo inoculado con dicho HVT
después de eclosionar, fueron desafiados con el virus de la
enfermedad de Marek (de ahora en adelante mencionados también como
"MDV"). Por consiguiente, se descubrió que el pollo de huevos
en crecimiento vacunados exhibieron una resistencia más potente
contra el desafío, comparados con el pollo vacunado después de
eclosionar, demostrando que la inoculación in ovo puede ser
eficazmente utilizada para inmunización.
Reddy y col. prepararon un HVT recombinante
(rHVT) en donde un gen de la proteína de fusión (proteína F) del
virus de la enfermedad de Newcastle (de ahora en adelante mencionado
también como "NDV") y el gen de la glicoproteína
hemaglutinina-neuraminidasa (HN) fueron insertados
dentro del genoma del HVT (S. K. Reddy y col., Vaccine,
14(6): 469-477, 1996). Ellos inocularon
células infectadas con este virus dentro de huevos de pollo en
crecimiento, en el día 18. Después de eclosionar, los pollos fueron
desafiados con ambos virus NDV y MDV para, de ese modo, demostrar
que el virus recombinante podría proteger eficazmente al pollo del
desafío con ambos virus. El efecto de la vacunación in ovo
también ha sido evaluado para una vacuna inactivada del NDV,
emulsificada en aceite, y del virus influenza aviar (H. Stone, AVIAN
DISEASE 41: 856-863, 1997), y para la vacuna viva
de esporozoíto Eimeria (Evans y col., WO 96/40233).
Se puede esperar que la inmunización de pollos
en la fase de huevo en crecimiento como se describió antes,
denominada "vacunación in ovo", elimine o reduzca la
mano de obra y coste, y por lo tanto, llegue a imponerse un enfoque
automatizado para la inoculación en huevos de pollo.
Sin embargo, Sharma y col. informaron de que
células infectadas con MDV-1 fueron inoculadas en
huevos de pollo en crecimiento. Se investigó el crecimiento de dicho
virus en el tejido de embrión de pollo, y no se observó crecimiento
viral (J. M. Sharma y col., AVIAN DISEASES 31:
570-576, 1987). También informaron de que los
pollos salidos de dichos huevos en crecimiento no estaban protegidos
del desafío con la cepa virulenta de MDV. Este resultado sugiere
que no es fácil la vacunación in ovo contra la enfermedad de
Marek con MDV-1. Por consiguiente, la situación
actual es que se han utilizado vacunas univalentes o mixtas de HVT
MDV-2 cepa SB-1 en lugar de
MDV-1, el virus que causa la enfermedad de
Marek.
Por otra parte, existe un informe de un intento
de inocular MDV-1, el cual había sido considerado
como no apropiado para la vacunación in ovo, en un huevo de
pollo en crecimiento (Taniguchi y col., extracto de la 117th Japan
Veterinary Science Association, pág. 198, 1994, Tokio). En este
caso, cuando la inoculación fue hecha directamente en el feto, el
virus creció eficazmente y se logró la inmunización con éxito. Sin
embargo, verdaderamente, la inoculación directa en el feto fracasa
frecuentemente. A pesar de tales circunstancias, se ha favorecido
la aplicación sobre el terreno porque se cree que, si incluso
algunos individuos fracasasen para ser inmunizados, la infección
por contacto que ocurre aproximadamente dos semanas después de la
inoculación con MDV-1 impartiría la inmunización a
aquellos individuos que fracasaron para ser inmunizados.
Sin embargo, si los pollos no inmunizados son
expuestos a la cepa virulenta del MDV en el campo después de
eclosionar, y antes de la infección con dicha vacuna
MDV-1, entonces dicho pollo no puede ser protegido
de la enfermedad de Marek, y por lo tanto, producirá una
considerable pérdida económica. De este modo, para una protección
completa de la enfermedad de Marek, es sumamente importante si se
logra o no la inmunización antes de una semana justo después de la
eclosión. Por consiguiente, si fuese posible, es conveniente
infectar ciertamente al feto, en el huevo en crecimiento, con el
virus de la vacuna.
Existe también la preocupación de que la
inoculación directa con una aguja dentro del feto pudiese
posiblemente dañar malamente al feto en algunos casos.
En estas circunstancias, existe la necesidad de
desarrollar una vacuna MDV-1 más eficaz para la
enfermedad de Marek, que sea apropiada para la vacunación in
ovo.
Los presentes inventores investigaron a fondo
para desarrollar una vacuna MDV-1 más eficaz para
la enfermedad de Marek, que sea apropiada para la vacunación in
ovo. Por consiguiente, se descubrió que una solución
conteniendo virus libre de células, preparada a partir de una
solución de células rotas infectadas con MDV-1
atenuado o MDV-1 recombinante, puede ser inoculada
en huevos en crecimiento para, de ese modo, exhibir crecimiento
viral. También se descubrió que los anticuerpos para el
MDV-1 y para otros antígenos virales incorporados
en el MDV-1, fueron inducidos en suero de pollo que
eclosionó de dicho huevo en crecimiento inoculado con el virus. En
consecuencia, los presentes inventores desarrollaron la presente
invención.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método para inmunizar pollos, el cual comprende
inocular en un huevo en crecimiento una composición constando de
MDV-1 vivo atenuado libre de células. La presente
invención también proporciona un método para inmunizar eficazmente
pollos contra múltiples enfermedades, utilizando un
MDV-1 recombinante en el anterior método para
inmunización.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método para inmunizar pollos, el cual comprende
inocular en huevos en crecimiento una vacuna mixta constando del
anterior MDV-1 libre de células más otra vacuna
obtenida a partir de al menos un microorganismo seleccionado del
grupo que se compone de virus que no sean el
MDV-1.
El método de la presente invención se
caracteriza por una composición que consta de MDV-1
vivo atenuado libre de células, un proceso para preparar la misma, y
la vacunación in ovo de dicha composición.
El término "virus libre(s) de
células", como se utiliza aquí, significa virus que han sido
separados de células.
Para preparar una composición constando de
MDV-1 vivo atenuado libre de células, los virus
MDV-1 atenuados son infectados en células huésped y
cultivados allí dentro. Las células infectadas por virus son
después recolectadas mediante centrifugación a baja velocidad. Para
el propósito de la presente invención, la centrifugación a baja
velocidad se realiza a 1.000 hasta 3.000 rpm, durante 3 a 10
minutos, utilizando una KUBOTA KN-30F u otra
máquina centrifugadora con equivalente radio de giro. Después de la
adición de un tampón complementado con una cantidad adecuada de
azúcares, las células son rotas por sonicación, por
congelación-descongelación o mediante medios
físicos, los virus MDV-1 son después extraídos de la
fase líquida de las células rotas y purificados. Alternativamente,
la fase líquida de células rotas puede ser utilizada directamente,
tal como está, sin ningún tratamiento.
El MDV-1 atenuado incluye las
cepas CVI-988, 61-554 (Sakaguchi y
col., Publicación de Patente Japonesa Nº 6-22757),
Md11/75C (R. L. Witter, AVIAN DISEASE 31: 752-765,
1987) y otras, así como virus recombinantes derivados de ahí.
Como una célula huésped para la infección viral,
se puede utilizar cualquier célula de cultivo siempre que ese
MDV-1 atenuado pueda crecer allí dentro y no
produzca virus contaminados. Preferentemente, se utilizan células
de cultivos obtenidas de aves. Se utilizan células fibroblásticas de
embrión de pollo (células FEP), células fibroblásticas de embrión
de pato, células obtenidas de embrión de pollo de la cepa
CHCC-OU2 (Ogura, H. y col., Acta Med Okayama
41(3): 141-143, 1987; y Coussens y col.,
Publicación de Patente Japonesa Nº 9-173059),
células obtenidas de codorniz de la cepa QT-35
(Spijkers y col., Publicación de Patente Japonesa Nº
9-98778) y otras, siendo preferidas las células
fibroblásticas de pollo (células FEP).
Un medio de cultivo para cultivar células
huésped incluye un medio comúnmente utilizado para cultivo celular
tal como M199 Earle's Base (Nissui), Eagle MEM
(E-MEM) (Nissui), Dulbecco MEM
(D-MEM) (Nissui), SC-UCM102
(Nissui), UP-SFM (GIBCO BRL),
EX-CELL302 (Nichirei),
EX-CELL293-S (Nichirei),
TFBM-01 (Nichirei), ASF104, etc. Estos medios de
cultivo son utilizados con suplementos de aminoácidos, sales,
agentes antifúngicos o antibacterianos, suero animal y otros. Ellos
pueden ser utilizados opcionalmente como medio sin suero, no
suplementando con suero.
Las células o células infectadas por virus son
cultivadas en condiciones normales. Esto es, la temperatura y el
periodo del cultivo se pueden ajustar adecuadamente dependiendo de
diversos factores tales como los tipos de células, la cantidad de
inoculación de virus, y la escala y proceso del cultivo o una
combinación de los mismos. Las temperaturas de cultivo pueden
oscilar desde 35ºC hasta 41ºC, preferentemente desde 37ºC hasta
38ºC. Los periodos de cultivo pueden variar desde 2 hasta 7 días,
preferentemente desde 3 hasta 4 días.
La composición de la presente invención es
inoculada en un huevo de pollo en crecimiento. El término "huevo
de pollo en crecimiento", como se utiliza aquí, significa un
huevo fertilizado (embrionado) en el proceso de ser incubado hasta
21 días después de la fertilización, cuando el pollo salga del
huevo. La vacunación para la enfermedad de Marek se puede llevar a
cabo después de una incubación de 17 a 19 días.
La composición de la presente invención puede
ser inoculada en huevos de pollo en crecimiento, por ejemplo,
inyectando la solución viral dentro de la cámara de aire (esto es,
en un sitio en ángulo obtuso del huevo) de un huevo de 18 días en
crecimiento, utilizando una aguja de inoculación (por ejemplo,
aguja 24 G x 1-1/4).
Conforme a la composición de la presente
invención, constando de MDV-1 atenuado libre de
células, el MDV-1 atenuado puede ser eficazmente
infectado en el huevo en crecimiento e inducir inmunización para la
enfermedad de Marek.
La composición de la presente invención también
se puede utilizar para la vacunación in ovo como vacuna
mixta, en combinación con al menos una vacuna seleccionada del grupo
que se compone de vacunas para otros virus tales como, por ejemplo,
el virus de la bronquitis infecciosa aviar, el virus infeccioso de
la bursitis aviar, el virus de la encefalomielitis aviar, el virus
del síndrome de caída de puesta, el virus influenza aviar, el
reovirus, el adenovirus, el virus del síndrome del hidropericardio,
etc.
El antígeno protector de la infección, expresado
mediante le virus de la enfermedad de Marek utilizado en la
presente invención, incluye, además de la proteína F del virus de la
enfermedad de Newcastle ejemplificada antes, la proteína HN del
virus de la enfermedad de Newcastle, o la proteína del núcleo, la
proteína de la cápside o glicoproteína de diversos virus (por
ejemplo, la proteína S o la proteína de la nucleocápside del virus
de la bronquitis infecciosa aviar, la VP2 del virus infeccioso de la
bursitis aviar (IBDV), la proteína de la cápside del virus de la
encefalomielitis aviar, la proteína de la cápside del virus del
síndrome de caída de puesta, las VP1 + VP2 del virus de la anemia
aviar, la glicoproteína B del virus de la laringotraqueitis
infecciosa aviar, la proteína de membrana o el gag del virus de la
leucemia aviar o virus de la reticuloendoteliosis, la glicoproteína
del virus de la rinotraqueitis del pavo, la proteína HA del virus
de la varicela aviar, la HA del virus influenza, la proteína de la
cápside del reovirus aviar, la proteína de la cápside del
adenovirus aviar, etc.), cilios, flagelos, toxinas, hemolisinas,
proteínas de membrana tales como la porina, péptidos con
antigenicidad del antígeno-O de bacterias (por
ejemplo, Haemophilus paragarinarum, Salmonella choleraesuis, E.
coli, Campylobacter, Clostridium, Micoplasma, enterococos,
etc.), y proteínas o glicoproteínas de protozoos (por ejemplo,
Leucocytozoon caulleryi, Eimeria tenella, E. maxima, E.
acervulina, E. brunetti, E. necatrix, malaria aviar), y
otros.
Tal virus recombinante de la enfermedad de Marek
puede ser preparado utilizando un proceso ordinario, para preparar
un virus recombinante, conocido en la técnica.
Otros antígenos que no sean el de la ND, que
fuesen realmente incorporados en un MDV-1
recombinante y reportados por ser inmunogénicos en pollos, abarcan
el antígeno VP2 de IBDV, como se reportó por Tsukamoto y col.,
Virology 257: 352-362, 1999. También se reportaron
algunos virus recombinantes que incorporan el gen marcador lacZ
(Sakaguchi y col., Virology 195: 140-148, 1993;
Percells y col., J. Virology 68: 8.239-8.253, 1994;
Schat y col., J. Gen. Virology 70: 841-849,
1998).
La presente invención es explicada con más
detalle mediante los Ejemplos siguientes.
Aproximadamente 1 x 10^{8} células FEP y
aproximadamente 1 x 10^{6} UFP de la cepa Rispens del
MDV-1 fueron suspendidas en medio
E-MEM (40 ml) suplementado con 5% de suero de bovino
fetal (FBS). La suspensión fue colocada en un matraz para cultivos
de 175 cm^{2} e incubada a 37ºC durante 4 días. Cuando se observó
un 80% o más de efecto citopático (ECP) se recogieron de la manera
habitual las células infectadas por virus, utilizando 0'1% de
EDTA-0'125% de tripsina (DIFCO). Las células
recogidas fueron suspendidas en 40 ml de medio
E-MEM. A partir de esta suspensión se prepararon
materias para su inoculación en el huevo de pollo en crecimiento,
mediante los dos procesos siguientes:
(a) Una solución de células infectadas por
virus:
- La suspensión anterior (1 ml) fue diluida 10 veces en serie con E-MEM para preparar una solución de células infectadas por virus (como control de referencia, no parte de la invención).
(b) Una solución de virus libres de células:
- La suspensión restante (39 ml) fue centrifugada a la baja velocidad de 1.500 rpm durante 5 minutos. Después de eliminar el sobrenadante por succión, las células fueron suspendidas añadiendo 2 ml de solución SPGA-SBT (preparada conforme a B. W. Calnek y col., Appl. Microbiol. (20): 723-726, 1970; B. R. Cho, Avian Dis. 22(1): 170-176, 1977; 0'218 M de sacarosa, 0'0038 M de bifosfato potásico, 0'0072 M de fosfato bipotásico, 0'0049 M de glutamato sódico, 1% de albúmina de suero bovino, 10% de sorbitol). La suspensión fue sonicada con un Handy Sonic UR-20P de TOMY SEICO Co, LTD., control de corriente 4 durante 1 minuto, y centrifugada después a la baja velocidad de 2.500 rpm durante 5 minutos. Se diluyó 10 veces en serie el sobrenadante para preparar una solución de virus libres de células.
- Los virus en las materias inoculadas se cuantificaron como sigue: las células FEP previamente cultivadas fueron recogidas con EDTA-tripsina y centrifugadas a 1.500 rpm durante 5 minutos. El sedimento celular obtenido fue suspendido nuevamente en 5% de FBS a una concentración de 6 x 10^{5} células/ml (de ahora en adelante mencionado como "FEP-segundas").
- Las células FEP-segundas (9 x 10^{6} células/15 ml en una placa Petri de 10 cm) fueron cultivadas durante 4 horas e inoculadas con 1 ml de una solución de vacuna de cada dilución, inclinando cada 20 minutos durante 1 hora. Después se añadieron las células a medio E-MEM (5 ml) y se incubaron en un incubador de CO_{2} a 37ºC durante la noche. Al siguiente día, se cubrió el E-MEM suplementado con 2% de metilcelulosa (Sigma) y 1% de FCS, y se incubaron las células en el incubador de CO_{2} a 37ºC durante 10 días. Se contó el número de placas que aparecieron.
Cada grupo constaba de seis huevos de pollo en
crecimiento, de 18 días de edad (SPF, manufacturados por Juridical
Foundation The
Chemo-Sero-Therapeutic Research
Institute). Una alícuota de 0'1 ml de cada una de las soluciones de
células infectadas por virus, diluidas 10 veces en serie,
respectivamente una alícuota de 0'1 ml de cada una de las
soluciones de virus libres de células, fueron inoculadas en los
huevos inyectando con una aguja de inoculación 24 G x
1-1/4 (Nipro) dentro de la cámara de aire (un sitio
en ángulo obtuso) del huevo, con una profundidad de aproximadamente
2'5 cm. Los huevos fueron incubados a 37ºC durante 3 días. Una
semana después de la eclosión, se extrajo 1 ml de sangre del corazón
con una jeringa desechable de 5 ml heparinizada (Nipro) y una aguja
de 21 G x 1 pulgada (Nipro). De dicha sangre se separó una fracción
de células mononucleares, utilizando Ficoll Paque Plus (Pharmacia)
conforme a las instrucciones del fabricante. La totalidad de esta
fracción fue inoculada en células FEP-segundas (9 x
10^{6} células/15 ml, en una placa Petri de 10 cm de diámetro),
cultivadas previamente durante 4 horas. Diez días después,
aparecieron placas de virus de la enfermedad de Marek, y se
contaron. En las Tablas 1 y 2, respectivamente, se muestran los
índices de recuperación de virus en el grupo inoculado con la
solución de células infectadas por virus, y en el grupo inoculado
con la solución de virus libres de células. Se extrajo sangre de 5
pollos en cada uno de los grupos, para examinar la recuperación
viral.
Como es evidente a partir de las Tablas 1 y 2,
los virus fueron recuperados a partir de sólo menos de la mitad de
los individuos entre los pollos de los huevos inoculados con 128 UFP
en el grupo inoculado con la solución de células infectadas por
virus. Por contraste, en el grupo inoculado con la solución de
virus libres de células, se recuperaron virus de los cinco pollos,
incluso en el grupo inoculado con tan poco como 5'4 UFP. Esto
demuestra que los virus MDV-1 verdaderamente se
propagan en el caso de la solución de virus libres de células, y
por lo tanto, se puede utilizar eficazmente.
Aproximadamente 1 x 10^{8} células FEP y
aproximadamente 1 x 10^{6} UFP de la cepa US10P(F) del
virus recombinante rMDV-1, en donde se incorporó un
gen de la proteína F del virus de la enfermedad de Newcastle
(NDV-F) (Sonoda y col., Current Research on Marek's
Disease, pág. 408, 1996), fueron suspendidas en medio
E-MEM (40 ml) suplementado con 5% de suero de bovino
fetal (FBS). La suspensión fue colocada en un matraz para cultivos
de 175 cm^{2} e incubada a 37ºC durante 4 días. Cuando se observó
un 80% o más de efecto citopático (ECP) se recogieron de la manera
habitual las células infectadas por virus, utilizando 0'1% de
EDTA-0'125% de tripsina (DIFCO). Las células
recogidas fueron suspendidas en 10 ml de medio
E-MEM. A partir de esta suspensión se prepararon
materias para su inoculación en el huevo de pollo en crecimiento,
mediante los dos procesos siguientes:
Preparación de una solución de virus libres de
células:
- Como se describió en el Ejemplo 1(1), la suspensión (40 ml) fue centrifugada a la baja velocidad de 1.500 rpm durante 5 minutos. Después de eliminar el sobrenadante por succión, se suspendieron las células añadiendo 2 ml de solución SPGA-SBT. La suspensión fue sonicada durante 1 minuto y centrifugada después a la baja velocidad de 2.500 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante obtenido fue diluido 10 veces en serie para preparar una solución de virus libres de células.
Como se describió en el Ejemplo 1(1), en
las materias de inoculación se contaron los virus como sigue: esto
es, las células FEP-segundas (9 x 10^{6}
células/15 ml en una placa Petri de 10 cm) fueron preparadas como
se describe en el Ejemplo 1(1) y cultivadas previamente
durante 4 horas. Las células fueron inoculadas con 1 ml de cada
dilución de la solución de vacuna, inclinando cada 20 minutos
durante 1 hora. Después se añadieron las células a medio
E-MEM (5 ml) y se incubaron en un incubador de
CO_{2} a 37ºC durante la noche. Al siguiente día, se cubrió el
E-MEM suplementado con 2% de metilcelulosa (Sigma) y
1% de FCS, se incubaron las células en el incubador de CO_{2} a
37ºC durante 10 días y se contó el número de placas que
aparecieron.
Cada grupo constaba de cinco huevos de pollo en
crecimiento, de 18 días de edad (SPF, manufacturados por Juridical
Foundation The
Chemo-Sero-Therapeutic Research
Institute).
Una alícuota de 0'1 ml de cada una de las
soluciones de virus libres de células fue inoculada en los huevos
inyectando con una aguja de inoculación 24 G x 1-1/4
(Nipro) dentro de la cámara de aire (un sitio en ángulo obtuso) del
huevo, con una profundidad de aproximadamente 2'5 cm. Los huevos
fueron incubados a 37ºC durante 3 días. Una semana después de la
eclosión, se extrajo 1 ml de sangre del corazón con una jeringa
desechable de 5 ml heparinizada (Nipro) y un aguja de 21 G x 1
pulgada (Nipro). De dicha sangre se separó una fracción de células
mononucleares, utilizando Ficoll Paque Plus (Pharmacia) conforme a
las instrucciones del fabricante. La totalidad de esta fracción fue
inoculada en células FEP-segundas (9 x 10^{6}
células/15 ml, en una placa Petri de 10 cm de diámetro), cultivadas
previamente durante 4 horas. Diez días después, aparecieron placas
de virus de la enfermedad de Marek, y se contaron.
Como es evidente a partir de la Tabla 3, se
recuperaron virus de los cinco pollos, incluso en el grupo
inoculado con tan poco como 32 UFP. De este modo, en el caso del
virus MDV-1 recombinante se confirmó la eficacia de
la solución de virus libres de células.
Se inocularon huevos de pollo en crecimiento,
como se describió antes. Cada grupo constaba de seis huevos de
pollo en crecimiento, de 18 días de edad (SPF, manufacturados por
Juridical Foundation The
Chemo-Sero-Therapeutic Research
Institute). Cuando los pollos salieron de los huevos eran de 8
semanas de edad, se extrajo sangre y se determinó el nivel de
anticuerpo para la proteína NDV-F.
El anticuerpo fue detectado mediante ELISA, con
células expresando NDV-F como antígeno. Los
detalles de este procedimiento están descritos en Sakaguchi M. y
col., Vaccine, junio de 1996, 14(8): 747-52.
En las Tablas 4 y 5, respectivamente, se muestran los niveles de
anticuerpo NDV-F de individuos positivos en el
grupo inoculado con la solución de células infectadas por virus, y
en el grupo inoculado con la solución de virus libres de
células
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 5, todos lo pollos
fueron positivos para el anticuerpo en el grupo de los pollos de
huevos inoculados con 70 UFP de virus libres de células. En el grupo
de los pollos de huevos inoculados con 7 UFP de virus libres de
células, fueron positivos cuatro de seis pollos. Por contraste, en
el grupo de los pollos inoculados con la solución de células
infectadas por virus, únicamente se encontraron positivos dos de
seis pollos cuando se inoculó 84 UFP. De este modo, el grupo
inoculado con virus libre de células mostró una transformación
positiva mayor, incluso con una cantidad 10 veces menor de virus que
en el grupo tratado con células infectadas por virus, demostrando
la utilidad de los virus libres de células para la inmunización de
huevos en crecimiento en vista de la respuesta de los
anticuerpos.
Según la presente invención, se proporcionan una
vacuna viva de MDV-1 libre de células para la
profilaxis de la enfermedad de Marek en pollos, y un método para
inmunización mediante la inoculación in ovo utilizando dicha
vacuna viva. El método de la presente invención permite una
protección más eficaz y eficientemente de la infección del virus de
la enfermedad de Marek, comparado con los métodos convencionales.
Además, el método de la presente invención permite también la
inmunización de productos genéticos extraños expresados
simultáneamente por el MDV-1, de una manera que
ahorre tiempo.
Claims (7)
1. El empleo de una composición
constando de virus vivos atenuados libres de células, del tipo I de
la enfermedad de Marek, para la preparación de una vacuna para la
inmunización de pollos, en donde dicha vacuna es para ser inoculada
en un huevo en crecimiento.
2. El empleo de una vacuna mixta
constando de virus atenuados libres de células, del tipo I de la
enfermedad de Marek, más otra vacuna de al menos un microorganismo
seleccionado del grupo que se compone de virus que no sean el
MDV-1, para la preparación de una vacuna para la
inmunización de pollos, en donde dicha vacuna es para ser inoculada
en un huevo en crecimiento.
3. El empleo de la reivindicación 2, en
donde dichos microorganismos son seleccionados del grupo que se
compone de virus de la bronquitis infecciosa aviar, virus de la
bursitis infecciosa aviar, virus de la encefalomielitis aviar,
virus del síndrome de caída de puesta, virus influenza, reovirus,
adenovirus y virus del síndrome del hidropericardio.
4. El empleo de la reivindicación 2 ó 3,
en donde dichos microorganismos no están inactivados.
5. El empleo de alguna de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde dichos virus atenuados del tipo I
de la enfermedad de Marek son un virus recombinante del tipo I de
la enfermedad de Marek.
6. El empleo de la reivindicación 5, en
donde los genes incorporados en dicho virus recombinante del tipo I
de la enfermedad de Marek codifican para antígenos de virus que no
sean el virus tipo I de la enfermedad de Marek, bacterias o
protozoos.
7. El empleo de la reivindicación 6, en
donde dichos antígenos son seleccionados del grupo que se compone
de la proteína F y la proteína HN del virus de la enfermedad de
Newcastle, la proteína S o la proteína del núcleo del virus de la
bronquitis infecciosa aviar, la VP2 del virus de la bursitis
infecciosa aviar (IBDV), la proteína de la cápside del virus de la
encefalomielitis aviar, la proteína de la cápside del virus del
síndrome de caída de puesta, las VP1 + VP2 del virus de la anemia
aviar, la glicoproteína B del virus de la laringotraqueitis
infecciosa aviar, la proteína de membrana o gag del virus de la
leucemia aviar o virus de la reticuloendoteliosis, la glicoproteína
del virus de la rinotraqueitis del pavo, la proteína HA del virus
de la varicela aviar, la HA del virus influenza, la proteína de la
cápside del reovirus aviar, la proteína de la cápside del
adenovirus aviar, cilios, flagelos, toxinas, hemolisinas, proteínas
de membrana, péptidos con antigenicidad del
antígeno-O y proteínas o glicoproteínas de
protozoos.
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