BR102015025152A2 - vírus da bronquite infecciosa, vírus da bronquite infecciosa inativado, ácido nucleico, vetor, polipeptídeo, vacina, uso de uma cepa de vbi, método para proteger aves domésticas contra o vírus da bronquite infecciosa, célula, método para preparar uma vacina, e método para detectar vbi em uma amostra - Google Patents

Abstract

vírus da bronquite infecciosa, vírus da bronquite infecciosa inativado, ácido nucleico, vetor, polipeptídeo, vacina, uso de uma cepa de vbi, método para proteger aves domésticas contra o vírus da bronquite infecciosa, célula, método para preparar uma vacina, e método para detectar vbi em uma amostra. a presente invenção se refere a novas cepas do vírus da bronquite infecciosa e aos usos destas. a invenção se refere, mais particularmente, a uma nova cepa de vbi atenuada do genótipo br-i, a formas inativadas desta, bem como a composições de vacinas compreendendo tais cepas. a invenção também se refere a ácidos nucleicos, células infectadas e métodos para a detecção de cepas de vírus da bronquite infecciosa da invenção em qualquer amostra.

Description

VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA, VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA INATIVADO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, POLIPEPTÍDEO, VACINA, USO DE UMA CEPA DE VBI, MÉTODO PARA PROTEGER AVES DOMÉSTICAS CONTRA O VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA, CÉLULA, MÉTODO PARA PREPARAR UMA VACINA, E MÉTODO PARA DETECTAR VBI EM UMA AMOSTRA

[001] A presente invenção se refere a novas cepas do vírus da bronquite infecciosa e aos usos destas. A invenção se refere, mais particularmente, a uma nova cepa atenuada de VBI do genótipo BR-I, a formas inativadas desta, bem como a composições de vacinas compreendendo tais cepas. A invenção também se refere a ácidos nucleicos, células infectadas e métodos para a detecção de cepas do vírus da bronquite infecciosa da invenção em qualquer amostra.

[002] A bronquite infecciosa (BI) é uma das principais doenças da indústria avícola e pode ser associada a doenças respiratórias, nefrite, problemas de fertilidade e produção ou qualidade reduzida de ovos. A doença é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI), um membro da família Coronaviridae (Cavanagh & Gelb, 2008) . O VBI é, principalmente, um agente patogênico respiratório, mas também foi observada a replicação do VBI em tecidos não respiratórios, tais como o rim. O genoma do VBI é uma molécula de RNA linear de fita simples. O vírion do VBI contém quatro proteínas estruturais, incluindo a glicoproteína S, que é processada proteoliticamente em dois peptídeos conhecidos como SI e S2. O sequenciamento de nucleotídeos da região do gene SI é considerado como a técnica mais útil para a diferenciação entre as cepas distintas do VBI (Worthington et al., 2008).

[003] Estudos epidemiológicos mostram que existem diferentes cepas do VBI, dependendo das manifestações clinicas e regiões geográficas. Várias cepas de VBI foram isoladas na técnica, incluindo, por exemplo, o serotipo Mass, o serotipo 793B, as variantes D274, as cepas de VBI do tipo QX ou do tipo BR. A vacinação contra o VBI é realizada, principalmente, com vacinas vivas e/ou inativadas e/ou atenuadas. A vacinação é, no entanto, apenas parcialmente bem sucedida por causa do surgimento de variantes antigênicas e da diversidade das cepas do VBI. Consequentemente, uma vacinação eficiente requer ou coquetéis de VBI, ou a identificação prévia da cepa de VBI prevalente no campo e/ou uma cepa de VBI com um forte poder imunogênico. Por conseguinte, existe uma necessidade no estado da técnica por novas cepas do VBI que permitam o desenvolvimento de vacinas e métodos de diagnóstico melhorados.

[004] A presente invenção se refere a uma nova cepa de VBI e ao seu uso para a vacinação. A invenção resulta da preparação, isolamento e caracterização de uma nova cepa de VBI do genótipo VBI BR-I. Conforme mostrado na seção experimental, esta nova cepa é atenuada e permite o desenvolvimento de uma vacina ou métodos de diagnóstico eficientes contra a doença BI.

[005] Um objeto particular da invenção se refere, assim, a um vírus da Bronquite Infecciosa (VBI) compreendendo um gene SI tendo uma sequência de nucleotídeos com, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta.

[006] Os inventores obtiveram, de fato, por várias passagens, uma nova cepa de VBI, que é atenuada e pode conferir uma forte imunidade protetora a galinhas. Mais particularmente, depois de várias passagens em cultura, os inventores foram capazes de produzir uma cepa atenuada de VBI altamente imunogênica. Além disso, eles caracterizaram esta cepa por análise genética. Em particular, as sequências de nucleotideos e de aminoácidos do gene SI e da proteína foram determinadas e analisadas por alinhamento de sequência, permitindo concluir que a sequência é totalmente nova e que a cepa atenuada pertence ao genótipo BR-I (Fraga et al. , Avian Diseases 57: 225-232, 2013). Os testes clínicos da cepa da invenção também permitiram conferir a forte imunidade protetora a galinhas, especialmente por desafio homólogo (isto é, contra o desafio por cepas do genótipo BR-I) . Esta nova cepa, bem como as variantes atenuadas ou análogos destas, pode, portanto, ser usada para desenvolver vacinas potentes e métodos de diagnóstico.

[007] A sequência de nucleotideos de comprimento completo está representada a seguir como SEQ ID NO: 1 (1563nt) : TCTTTTGTGTGCACTATGTAGTGCATTTTTGTACAATAATGATAGCTATGTTTATTATTA

CCAAAGTGGTTTTAGACCATTTAATGGTTGGCATTTACATGGAGGTGCTTATGCAGTAGT

TAACGTTTCTCAAGAAACAAGTAATGCAGGTTCTTCCTCAACTTGTACAGCTGGCGCTAT

CTATTGGAGTAAAAATTTTAGTGCGTCTTCAGTAGCTATGACAGCACCTTTACAGGGTAT

GCAATGGTCCACTGCACAATTCTGTACAGCCCATTGTAATTTTACTGATATTGTTGTATT

TGTTACTCATTGTTATAAAATTGGTGCATTAACATGCCCTTTAACAGGTCTCATTCCACA

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TAATTTAACAGTTCCTGTGACTAAGTATTCTAAGTTTAAGTCGCTTCAATGTGTTAATAA

TCAAACATCTGTGTACCTAAATGGTGATTTAGTTTTTACTTCTAATGAGACCAAAGATGT

TAGTGGCGCAGGTGTTTATTTCAAAGCTGGAGGACCCATAACTTATAAGGTTATGAGAGA

AGTTAAAGCTCTAGCTTATTTTGTTAATGGTACCGCACATGATGTTATATTGTGCGACGG

TTCACCTAGAGGTTTGTTAGCATGTCAGTATAATACCGGCAATTTTTCAGATGGTTTCTA

TCCTTTTACTAATGATACTTTAGTTAAGGAAAAGTTTATTGTGTATCGTGAAAATAGTGT

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TAATTTTAATTTTTCATTTCTGAGTAGTTTTCAGTATGTTGAATCTAATTTTATGTATGG

ATCTTATCATCCAAAATGTGGTTTTAGACCAGATTCCATTAATAATGGTTTGTGGTTTAA

CTCACTTTCTGTATCACTTGCTTATGGACCTCTTCAAGGCGGCTGTAAGCAATCTGTTTT

TAATGGTAGAGCAACTTGTTGTTATGCTTATTCTTATAACGGCCCTACCTTATGTAAAGG

AGTTTATTCAGGTGAGTTAACTCGTAGTTATCAATGTGGATTGTTAGTTTTTGTTACTAA

GAGTGATGGCTCTCGTATACAAACTTCAACAAAACCAATTGTATTAACTCAGCACAACTA

TAATAATATTACTTTAGATAGGTGTGTTGAGTATAATATATATGGCAGAGTTGGTCAAGG

TCTTATTACTAATGTAACTGAATCAGCGGCTGCTTTTAATTACTTAGAAGATGGTGGGTT

GGCTATCCTAGATACGTCAGGTGCCATAGACACTTTTGTTGTACAGGGTGAATATGGCTT

TAATTATTATAAAGTTAATCCTTGTGAAGATGTCAACCAACAGTTTGTAGTGTCTGGTGG

TAATTTGGTTGGTATTCTTACATCTCGTAATGAATCGGGTTCCCAACAGGTTGAGAATCA

GTT

[008] Conforme indicado, a invenção se refere a um vírus da bronquite infecciosa (VBI) compreendendo um gene SI tendo uma sequência de nucleotídeos com, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta.

[009] O grau de homologia entre duas sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos pode ser determinado por meio de programas de computador conhecidos por si mesmos na técnica, tal como GAP, fornecido no pacote de programa da GCG (Program Manual for the Wisconsin Package [Manual do Programa para o Pacote Wisconsin], Versão 8, agosto de 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA, 5371 1) (Needleman, S. B. e Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453) usando o GAP com as seguintes configurações para a comparação de sequências de DNA: penalidade de criação de lacunas de 5,0 e penalidade de extensão de lacuna de 0,3. Moléculas de ácidos nucleicos/aminoácidos podem ser alinhadas umas com as outras usando o software de alinhamento Pileup, disponível como parte do pacote de programa da GCG, usando, por exemplo, as configurações padrão de penalização de criação de lacuna de 5 e penalidade de largura de lacuna de 0,3. A identidade de sequência é, tipicamente, determinada ao longo de todo o comprimento das duas sequências.

[010] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a um VBI compreendendo um gene SI tendo uma sequência de nucleotídeos com, pelo menos, 98,5 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta, mais de preferência, pelo menos, 99 %, ainda mais de preferência, pelo menos, 99,5 %, ao longo de todo o comprimento do gene Sl.

[011] Em uma modalidade particular, a sequência do gene Sl tem, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta e tem uma base T na posição de nucleotídeo 321.

[012] Em outra modalidade particular, a sequência do gene Sl tem, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta e tem uma base T na posição de nucleotídeo 994.

[013] Em outra modalidade preferida, a sequência do gene Sl tem, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta e tem uma base T nas posições de nucleotídeo 321 e 994.

[014] Uma modalidade específica da invenção é uma cepa de VBI com uma sequência do gene Sl compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou a fita complementar desta, ou consistindo na SEQ ID NO: 1 ou a fita complementar desta. Tal cepa foi designada VBI BR-56 pelo requerente.

[015] Pesquisas de alinhamento de sequências realizadas pelos inventores mostraram que nenhuma cepa de VBI, com uma identidade de sequência superior a 98 % ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NO: 1, jamais foi reportada no estado da técnica. Este resultado confirma que as cepas de VBI da presente invenção são novas, substancialmente distintas do estado da técnica e, portanto, contêm novos epitopos que são particularmente vantajosos para o desenvolvimento de vacinas.

[016] As cepas de VBI da invenção são atenuadas e podem ser ainda mais inativadas. Uma cepa de VBI atenuada retém as propriedades imonugênicas e é, essencialmente, desprovida de propriedades patogênicas. A inativação pode ser obtida por técnicas geralmente conhecidas por si mesmas na técnica. A preparação de uma cepa de VBI inativada da invenção é realizada, de preferência, por meios químicos ou físicos. A inativação química pode ser obtida pelo tratamento da cepa de VBI com enzimas, formaldeído, β-propiolactona, etileno-imina binária ou um derivado desta. O VBI inativado assim obtido pode ser estabilizado ou neutralizado depois. A inativação física pode ser realizada submetendo a cepa de VBI à radiação rica em energia, tal como luz UV, radiação X ou radiação y.

[017] Outra modalidade da invenção é um VBI inativado obtenível pela inativação de um VBI da invenção, conforme definido acima.

[018] As cepas de VBI da presente invenção podem ser cultivadas, produzidas, expandidas ou mantidas usando técnicas de cultura convencionais. Em particular, o virus pode ser usado para infectar células competentes in vitro ou in vivo e o virus pode ser coletado mediante replicação ou amplificação. As células competentes incluem CEF (fibroblastos de embrião de galinhas), ovos embrionados livres de patógenos específicos (SPF) , células de rim de galinha e semelhantes. As células ou os vírus podem ser cultivados em um meio de cultura tal como, meio de cultura MEM de Eagle, Leibowitz-L-15/McCoy 5A (mistura 1:1), a cerca de 37 °C durante 3 a 6 dias. As células infectadas são, tipicamente, suspensas em um meio de cultura contendo 10 % de dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenadas congeladas em nitrogênio líquido. O vírus pode ser coletado usando técnicas convencionais (filtraçâo, precipitação, cromatografia, etc.) e pode ser armazenado em fase líquida, congelado ou liofilizado. A inativação geralmente é realizada após a produção.

[019] A invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta. Em uma modalidade particular, a molécula de ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1 e tem uma base T na posição de nucleotídeo 321 e/ou 994. Em outra modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico tem, pelo menos, 98,5 %, 99 %, ou 99,5 % de identidade com a SEQ ID NO: 1 e, mais de preferência, tem uma base T na posição de nucleotídeo 321 e/ou 994.

[020] A invenção se refere, ainda, a um vetor (por exemplo, um plasmídeo, vírus recombinante, um fago, etc.) compreendendo uma sequência genética de um VBI conforme definido acima, controlado por um promotor. Uma sequência genética preferida é uma sequência SI conforme definida acima.

[021] Outro objeto da invenção se refere a um polípeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 2 (ao longo de toda a sequência) . Em uma modalidade preferida, o polípeptídeo tem, pelo menos, 98,5 %, 99 %, ou 99,5 % de identidade com a SEQ ID NO: 1 e, mais de preferência, tem uma isoleucina na posição de aminoácido 107 e/ou um ácido aspártico na posição de aminoácido 331. A sequência SEQ ID NO: 2 está representada a seguir: LLCALCSAFLYNNDSYVYYYQSGFRPFNGWHLHGGAYAVVNVSQETSNAGSSSTCTAGAI YWSKNFSASSVAMTAPLQGMQWSIAQFCTAHCNFTDIVVFVTHCYKIGALTCPLTGLIPQ YHIRISAMKYGNTGPSSLFYNLTVPVTKYSKFKSLQCVNNQTSVYLNGDLVFTSNETKDV SGAGVYFKAGGPITYKVMREVKALAYFVNGTAHDVILCDGSPRGLLACQYNTGNFSDGFY PFTNDTLVKEKFIVYRENSVNTTLTLTKVTFHNESNAPPNNGGVDTIQLYQTYTAQSGYY NFNFSFLSSFQYVESNFMYGSYHPKCGFRPDSINNGLWFNSLSVSLAYGPLQGGCKQSVF NGRATCCYAYSYNGPTLCKGVYSGELTRSYQCGLLVFVTKSDGSRIQTSTKPIVLTQHNY NNITLDRCVEYNIYGRVGQGLITNVTESAAAFNYLEDGGLAILDTSGAIDTFVVQGEYGF

NYYKVNPCEDVNQQFVVSGGNLVGILTSRNESGSQQVENQX

[022] O VBI da presente invenção pode ser usado para induzir a imunidade protetora em aves, particularmente, aves domésticas, ou para tratar aves infectadas por VBI, particularmente, aves domésticas. A invenção é, particularmente, adequada para vacinar aves domésticas antes da infecção por VBI, em uma configuração preventiva.

[023] Assim, a invenção também se refere a um VBI ou um ácido nucleico, vetor ou polípeptídeo, conforme definido acima, para uso na imunização ou vacinação de aves domésticas.

[024] A invenção também se refere ao uso de uma cepa de VBI ou de um ácido nucleico, vetor ou polipeptídeo, conforme definido acima, para a preparação de uma vacina para uso na vacinação de aves domésticas contra o vírus da bronquite infecciosa.

[025] A invenção também se refere a um método para proteger uma ave, de preferência, uma ave doméstica, mais particularmente, uma galinha, contra o vírus da bronquite infecciosa, compreendendo a administração à dita ave de um VBI ou um ácido nucleico, vetor, polipeptídeo ou vacina, conforme definido acima.

[026] A invenção também se refere a um método para indução de uma imunidade contra VBI em uma ave, de preferência, uma ave doméstica, mais particularmente, uma galinha, compreendendo a administração à dita ave de um VBI ou um ácido nucleico, vetor, polipeptídeo ou vacina, conforme definido acima.

[027] A invenção também se refere a uma vacina ou composição compreendendo um VBI ou um ácido nucleico, vetor, ou polipeptídeo da invenção e, opcionalmente, um excipiente e/ou adjuvante adequado.

[028] As vacinas da invenção compreendem, tipicamente, uma quantidade eficaz de, pelo menos, uma cepa de VBI. Tal dose eficaz pode estar compreendida entre 1 e 5,0 loglO EID50, ou entre 2 e 4,0 loglO EID50. Além disso, a vacina ou composições da invenção podem compreender ainda, ou podem ser usadas em combinação com outras vacinas avícolas, por exemplo, Vírus da Doença de Newcastle (VDN), Vírus da Doença de Marek (VDM), Doença Infecciosa da Bursa e/ou outros sorotípos de VBI.

[029] A vacina de acordo com a presente invenção pode compreender qualquer excipiente adequado, tal como um solvente, diluente, veiculo ou semelhante. Exemplos de excipientes incluem, por exemplo, um tampão aquoso ou um tampão de fosfato, uma solução salina fisiológica (0,85 %) , solução salina tamponada com fosfato (PBS), tampões de citrato, tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), solução salina tamponada com Tris e semelhantes.

[030] De preferência, a vacina também compreende um adjuvante. Os adjuvantes podem ser obtidos de quaisquer fontes, incluindo proteínas e peptídeos derivados de animais (por exemplo, hormônios, citocinas, fatores coestimuladores), ácidos nucleicos derivados de vírus e de outras fontes (por exemplo, RNA de fita dupla, CpG) , hidróxido de alumínio, extratos de plantas e semelhantes, que são administrados com a vacina em uma quantidade suficiente para aumentar a resposta imune.

[031] A via de administração pode ser qualquer via, incluindo oral, ocular (por exemplo, por colírio), administração óculo-nasal usando aerossol, intranasal, pela cloaca na alimentação, em água, ou por pulverização, "in ovo" [no embrião], topicamente, ou por injeção (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraorbital, intraocular, intradérmica e/ou intraperitoneal). üm técnico no assunto pode adaptar, facilmente, a formulação da composição de vacina para cada tipo de via de administração.

[032] Cada dose de vacina contém, de preferência, uma dose adequada suficiente para desencadear uma resposta imune protetora em espécies de aves. A otimização de tal dose é bem conhecida no estado da técnica. A quantidade de antigeno por dose pode ser determinada por métodos conhecidos, usando lesões especificas em sistemas biológicos específicos, por exemplo, em células ou ovos embrionados; reações de antígeno/anticorpo, por exemplo, pelo método de ELISA.

[033] As vacinas da invenção podem ser administradas como doses únicas ou em doses repetidas, dependendo do protocolo de vacinação.

[034] A administração pode ser feita em qualquer idade, dependendo das condições, por exemplo, "in ovo", no dia 1, no dia 2, ou mais tarde, a qualquer momento.

[035] Outro objeto da invenção é uma célula infectada por um VBI conforme definido acima.

[036] A invenção também se refere a métodos para a detecção de VBI em uma amostra, compreendendo colocar a amostra em contato com uma sonda ou primer específico para uma sequência de VBI compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta e a detecção da presença de tal sequência na amostra.

[037] Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão revelados na seguinte seção experimental.

EXEMPLOS A, ISOLAMENTO E ANÁLISE GENÉTICA DO VBI BR-56 [038] VBI BR-56 foi preparado por diversas passagens em ovos SPF. Subsequentemente, para a identificação genética, em seguida ao isolamento do RNA do vírus padrão e da transcrição do cDNA, o gene da glicoproteína spike (Sl) foi amplificado por PCR usando primers específicos de VBI. 0 fragmento amplificado por PCR foi sequenciado e foi realizada a análise da sequência.

[039] A sequência de comprimento completo do gene da glicoproteína spike (Sl) está representada na SEQ ID NO: 1. A sequência de comprimento completo da proteína Sl está representada na SEQ ID NO: 2.

[040] Análises por BLAST no banco de dados de nucleotídeos mostraram que não existe nenhuma cepa de VBI, no estado da técnica, com uma identidade com a SEQ ID NO: 1 acima de 98 %, em 100 % de cobertura.

B. ESTUDO CLÍNICO

MATERIAIS E MÉTODOS • Cepa de VBI: VBI BR-56 (compreendendo o gene Sl tendo a SEQ ID NO: 1).

• Título da vacina: 2,8 e 3,0 loglO EID50/galinha • Via de inoculação: colírio e pulverização • Título do desafio: 4,5 loglO EID50/galinha • Galinhas: 180 galinhas SPF com 1 dia de idade na vacinação • Grupos: 6: 5 grupos vacinados com VBI BR-56 e 1 grupo não vacinado.

[041] Galinhas de corte com um dia de idade foram vacinadas com duas doses diferentes (2,8 e 3,0 loglO EID50/galinha) e duas vias diferentes de administração do vírus da vacina VBI BR-56. Um grupo foi vacinado por colírio. Para este grupo, 0,03 ml do vírus da vacina foram inoculados por colírio. A vacinação por pulverização foi realizada em gabinete de pulverização e as galinhas foram colocadas em caixas (100 galinhas/caixa) simulando as condições de chocadeira. Foi usado um bico vermelho (TXVK 6) a 0,4 MPa de pressão (tamanho da goticula: 153 pm) . As galinhas foram deixadas nas caixas por pelo menos 15 minutos após a vacinação.

[042] Três semanas após a vacinação, as galinhas foram desafiadas com um isolado de campo pertencente à cepa BR-I (desafio homólogo) . Cinco e seis dias após o desafio, a proteção contra o virus desafiante foi avaliada com base em pontuação de avaliação clinica, pontuação de ciliostase e quantificação da disseminação do virus. Também foram medidos o ganho de peso corporal diário e a temperatura da galinha. RESULTADOS E CONCLUSÃO: [043] No momento da vacinação (1 dia de idade), as galinhas tinham anticorpos maternos para VBI com um titulo médio geométrico (TMG) e um coeficiente de variação de variância (CV) de 4871 e 62,9, respectivamente. Estes resultados mostram que a cepa da vacina pode se replicar apesar da presença de um nivel elevado de MDA de Massa de VBI.

[044] Os dois títulos virais da vacina de VBI BR-56 se mostraram seguros para a vacinação, porque não produziram qualquer reação pós-vacinação. Não foi observada mortalidade relacionada com a vacina.

[045] Conforme mostrado na Tabela 1 abaixo, todos os grupos vacinados tiveram um Ganho de Peso Corporal Diário (GPCD) maior do que o grupo de controle não vacinado, com exceção do grupo 4. O GPCD do grupo 4 foi semelhante ao do grupo não vacinado. Tal grupo, no entanto, foi protegido, conforme mostrado por um bom desempenho dos outros parâmetros testados. TABELA 1, GPCD EM 5 E 6 DIAS APÓS 0 DESAFIO (DAD) [046] O grupo não vacinado tinha uma temperatura média claramente mais elevada do que os grupos vacinados. A temperatura média do grupo não vacinado era cerca de 1 grau mais elevada do que a dos grupos vacinados. Esta diferença de temperatura entre os grupos vacinados e o grupo não vacinado pode ser explicada pelo efeito do virus desafiante nas galinhas: as galinhas desprotegidas apresentaram hipertermia devido à replicação do virus desafiante in vivo. Assim, os resultados mostram o efeito protetor da cepa da vacina após o desafio.

[047] A boa proteção contra o desafio também foi confirmada em todos os grupos vacinados por causa da ausência, ou de uma presença muito pequena, de sinais clínicos nestes grupos. 0 grupo não vacinado se mostrou suscetível ao vírus desafiante, devido à pontuação intermediária. Os resultados são apresentados na Tabela 2 abaixo.

TABELA 2. PONTUAÇÃO CLÍNICA, NÚMERO E PORCENTAGEM DE GALINHAS QUE APRESENTARAM SINAIS CLÍNICOS EM 5 E 6 DIAS APÓS 0 DESAFIO • 0 número entre parêntesis indica o número de galinhas com sinais clínicos/total de galinhas [048] Uma diferença clara, em termos de proteção contra dano por atividade ciliar, também foi observada entre os grupos vacinados e não vacinado. 0 grupo não vacinado teve a pontuação de ciliostase e número de galinhas afetados mais elevada.

TABELA 3. PONTUAÇÃO DE CILIOSTASE MÉDIA EM 5 E 6 DIAS APÓS 0 DESAFIO • A pontuação máxima para cada traqueia é 40 = 100 % de ciliostase (para os 10 anéis/traqueia examinados). • O número entre parêntesis indica o número de galinhas protegidas contra dano ciliar/total de galinhas [049] Os dois grupos vacinados por colírio tiveram a melhor proteção. O grupo vacinado com a dose de vacina mais elevada teve a melhor proteção (100 % nos dois dias avaliados). A dose de vacina de 2,8 loglO EID50/galinha aplicada por colírio também conferiu bom nível de proteção. O grupo vacinado por pulverização teve desempenho diferente. O grupo vacinado com 3,0 loglO EID50/galinha teve 90 % de proteção.

[050] Com relação à disseminação do vírus, o vírus da vacina foi detectado em quatro de cinco galinhas testadas no momento do desafio (21 dias após a vacinação). Em contraste, após o desafio, a disseminação do vírus nos grupos vacinados foi baixa, em comparação com o grupo não vacinado e desafiado. A vacina aplicada por colírio conferiu a melhor proteção contra a disseminação do vírus, em termos de título de vírus e galinhas positivas para o vírus desafiante. A proteção conferida também foi boa, devido ao título de vírus baixo e ao número reduzido de galinhas positivas para VBI na traqueia em 5 dias após o desafio.

[051] Doses de 2,8 e 3,0 loglO EID50/vírus aplicadas por colírio podem ser consideradas suficientes para proteger galinhas contra a colonização e disseminação do vírus desafiante. Estes grupos tiveram título de vírus próximo do limite de positividade.

[052] Os resultados mostram a proteção conferida pela cepa da vacina contra o desafio, especialmente: avaliação clínica, temperatura da galinha, pontuação de ciliostase e quantificação da disseminação do desafio. 0 estudo mostrou a eficácia conferida pelo vírus VBI BR-56 da vacina. Com base nos resultados do teste ciliar, as doses de 2,8 e 3,0 loglO EID50 do vírus da vacina conferem mais de 80 % de proteção quando aplicadas por colírio e pulverização, respectivamente.

REIVINDICAÇÕES

Claims (20)

1. VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA (VBI), caracterizado por compreender um gene SI tendo uma sequência de nucleotideos com, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta.

2. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita sequência do gene SI ter uma base T na posição de nucleotídeo 321.

3. VÍRUS, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pela dita sequência do gene SI ter uma base T na posição de nucleotídeo 994.

4. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita sequência do gene SI ter, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1 e tem uma base T nas posições de nucleotídeo 321 e 994.

5. VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ter uma sequência do gene SI compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou a fita complementar desta.

6. VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser atenuado ou inativado.

7. VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA (VBI) INATIVADO, caracterizado por ser obtenível pela inativação de um VBI, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para uso na imunização ou vacinação de aves domésticas.

9. ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por compreender a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta.

10. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ter uma base T na posição de nucleotideo 321 e/ou 994.

11. VETOR, caracterizado por compreender uma sequência genética de um VBI, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, controlado por um promotor.

12. VETOR, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, controlado por um promotor.

13. POLIPEPTÍDEO, caracterizado por compreender a SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo, pelo menos, 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 2.

14. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ter uma isoleucina na posição de aminoácido 107 e/ou um ácido aspártico na posição de aminoácido 331.

15. VACINA, caracterizada por compreender um VBI, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, um ácido nucleico, conforme definido em uma das reivindicações 9 ou 10, um vetor, conforme definido em uma das reivindicações 11 ou 12, ou um polipeptideo, conforme definido em uma das reivindicações 13 ou 14 e, opcionalmente, um excipiente e/ou adjuvante adequado.

16. USO DE UMA CEPA DE VBI, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para a preparação de uma vacina para vacinar aves domésticas contra o virus da bronquite infecciosa.

17. MÉTODO PARA PROTEGER AVES DOMÉSTICAS CONTRA O VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA, caracterizado por compreender a administração de uma vacina, conforme definida na reivindicação 15, em aves suscetíveis.

18. CÉLULA, caracterizada por ser infectada por um VBI, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

19. MÉTODO PARA PREPARAR UMA VACINA, caracterizado por compreender a adição de uma cepa do VBI, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um excipiente e/ou adjuvante adequado.

20. MÉTODO PARA DETECTAR VBI EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender colocar a amostra em contato com uma sonda ou primer específico para uma sequência de VBI compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência tendo 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou a fita complementar desta e a detecção da presença de tal sequência na amostra.