ES2954910T3 - Vacuna de amplio espectro contra el reovirus aviar - Google Patents
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Abstract
Se divulga una vacuna de amplio espectro contra el Reovirus aviar, que es eficaz para reducir la infección por Reovirus aviar en un objetivo aviar. La vacuna comprende material antigénico derivado de Reovirus aviar de dos grupos de genotipos: 1 y 4, como se define en el presente documento. Esta vacuna es eficaz contra todos los reovirus aviares, homólogos o heterólogos de la vacuna, incluidas las cepas virulentas recientes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Vacuna de amplio espectro contra el reovirus aviar
La presente invención se refiere al campo de las vacunas veterinarias, en particular, a vacunas para aves de corral para reducir la infección por reovirus aviar. También a métodos para la preparación de tal vacuna y a usos médicos de tales vacunas.
Los reovirus aviares se clasifican taxonómicamente en la especie Avian Orthoreovirus que se encuentra dentro del género Orthoreovirus y en la familia Reoviridae. La partícula del virus no tiene envoltura pero tiene una cápside de proteína de doble cubierta. Esta cápside contiene el genoma de ARN de bicatenario que existe de 10 segmentos. Los segmentos genómicos se pueden agrupar en tres clases en función del tamaño: grande (L), medio (M) y pequeño (S); las proteínas virales codificadas a partir de estos segmentos se indican, por referencia a estos segmentos, respectivamente como: lambda (A), mu (|j) o sigma (a). En Benavente & Martinez-Costas (Virus Res., 2007, p. 105 119) se presenta una descripción general de la estructura de un reovirus aviar.
Los reovirus aviares son patógenos importantes que producen enfermedades graves en las aves y daños económicos significativos para las operaciones comerciales de cría de aves de corral; en su mayoría pollos, pero también pueden verse afectados pavos y otro tipo de aves. Se producen enfermedades graves e incluso la mortalidad principalmente en aves jóvenes, porque se desarrolla una resistencia relacionada con la edad a los síntomas del reovirus aviar y la infección en las aves a partir de aproximadamente 4 semanas de edad. Los síntomas incluyen, entre otros, enfermedades entéricas y respiratorias, miocarditis y hepatitis. La más típica es la artritis vírica, que conduce a una tenosinovitis (o: artritis reoviral) en articulaciones y tendones. La cojera resultante provoca dificultades para caminar hasta los contenedores de pienso. Como alternativa, la enfermedad entérica viral que produce una malabsorción impide una conversión eficaz del alimento. Ambas enfermedades son especialmente problemáticas para las razas de crecimiento rápido y más pesadas, tales como los pollos de engorde (aves de carne). Además, en combinación con otros diversos agentes de enfermedades entéricas víricas y bacterianas, el reovirus aviar es un factor en el denominado "síndrome de retraso en el crecimiento".
Todos estos síntomas conducen al sufrimiento de los animales y a pérdidas económicas por reducción de los pesos en el sacrificio y decomisos por mala calidad de la canal.
La principal forma de controlar la infección por reovirus aviar es mediante la vacunación, ya sea de los pollitos directamente a una edad muy temprana, o por vacunación de las madres reproductoras (gallinas madre que producen huevos fertilizados para la cría) antes de su período de puesta, para reducir la transmisión a los huevos y para proteger a los pollitos indirectamente a través de anticuerpos procedentes de la madre.
El reovirus aviar se puede cultivar in vitro, y se replica bien, por ejemplo, en células primarias de hígado de embrión de pollo. La replicación provoca un efecto citopático típico (cpe) que muestra grandes sincitios de células.
Las vacunas contra el reovirus aviar suelen ser vacunas de virus completo, que son del tipo vivo atenuado o del tipo inactivado. Son ejemplos de vacunas comerciales de reovirus aviar (todas de MSD AH, Países Bajos): vacunas vivas: Nobilis® Reo 1133 o Nobilis® Reo 2177; o una vacuna inactivada con adyuvante tal como Nobilis® Reo Inac (que comprende las cepas 1733 y 2408). Los orígenes de la cepa vacunal S1133 se remontan a principios de la década de 1980 (Van der Heide et al., 1983, Avian Dis., vol. 27, p. 698-706), pero se sigue utilizando en la actualidad.
En el régimen de vacunación estándar recomendado, las aves reproductoras se vacunan contra el reovirus aviar al menos dos veces: mediante una vacunación primaria (sensibilización) con vacuna viva a una edad muy temprana, y mediante una vacunación secundaria (refuerzo) con vacuna inactivada varias semanas después. Dependiendo de la gravedad de la presión de la infección de campo, se puede administrar otro refuerzo unas semanas más tarde, y las aves reproductoras normalmente reciben una vacuna de refuerzo adicional aproximadamente entre las 16 y las 18 semanas de edad, es decir, 4-6 semanas antes del inicio de la puesta. En la práctica, la presión de infección por reovirus aviar en el campo no siempre es alta, por lo tanto, a muchos avicultores les basta con administrar una sola vacuna a los pollitos o a las madres reproductoras. Sin embargo, en el caso de un brote de infección virulenta por reovirus aviar, las crías de pollitos pueden no estar lo suficientemente protegidas contra una infección de campo.
La protección inmunitaria frente al reovirus aviar se obtiene mediante una respuesta inmunitaria humoral eficaz, contra varias de las proteínas estructurales del virus. Sin embargo, los principales inmunógenos virales son las proteínas de la cápside externa sigmaB y sigmaC; sigmaB (o: aB) es la principal, y la proteína sigmaC (aC) es la proteína de la cápside externa secundaria. SigmaC sirve en la unión de la partícula viral a una célula hospedadora. Se codifica por la región 3' del segmento del genoma S1 y tiene un tamaño de aproximadamente 326 aminoácidos. Se observó que la proteína sigmaC era mucho más variable antigénicamente que sigmaB (documento WO 2009/093251 y: Meanger et al., 1995, Avian Pathol., vol. 24, p. 121-134).
La creencia general en el campo de la vacunología del reovirus aviar era que solo podía obtenerse una vacunación eficaz contra el reovirus aviar mediante una vacuna homóloga, y por tanto contra virus del mismo grupo de serotipos
que el antígeno de la vacuna (Wood et al., 1986, Comp. Pathol., vol. 86, p. 125-129). Por lo tanto, durante muchos años, las vacunas contra el reovirus aviar se han basado en antígenos de distintos grupos de un solo serotipo. Los programas de vacunación estándar estaban dirigidos al serotipo de reovirus presente en una bandada local; proporcionando la vacunación repetida una inmunidad sólida.
Cuando prevalecía más de un serotipo de reovirus aviar en un área, estas vacunas podían alternarse en la sensibilización y la vacunación de refuerzo, por ejemplo, mediante la administración de una vacuna de sensibilización con una cepa vacunal "clásica" de reovirus aviar, tal como S1133, 1733, 2177 o 2408, y seguimiento con una vacuna de refuerzo contra, p. ej., una cepa ERS. Durante muchos años, estos fueron los principales tipos de reovirus aviares predominantes en el campo.
Al ser un virus de ARN, el reovirus aviar puede desarrollar mutaciones en su genoma. En la práctica, esto lleva al encuentro ocasional de nuevas variantes en el campo, que pueden ser más o menos virulentas. Sin embargo, un problema a ese respecto es la dificultad de una diferenciación eficaz de los reovirus aviares, ya que las pruebas serológicas pueden mostrar variabilidad en los resultados. Por lo tanto, las cepas de reovirus aviares solían identificarse mediante ensayos de neutralización de virus utilizando sueros policlonales en un ensayo de reducción en placas, o determinando un patrón de unión específico usando un panel de anticuerpos monoclonales,
véase la caracterización de la cepa 2177 (documento EP 687.728) y de la cepa ERS (documento EP 1.024.189).
Como alternativa, las cepas de reovirus aviares se pueden caracterizar por los principales síntomas de enfermedad que induce el virus, tales como: tenosinovitis, malabsorción, o síntomas neurológicos (p. ej., una cepa ERS que induce síntomas neurológicos como se describe en el documento EP 1.551.961). Sin embargo, debido a la heterogeneidad en la patogenicidad, esto no es completamente concluyente.
Más recientemente, la clasificación de los reovirus aviares se ha realizado en función del diagnóstico molecular, mediante la comparación de secuencias de aminoácidos o nucleótidos de los virus. Particularmente útil a este respecto resultó ser la comparación de la secuencia de aminoácidos de la proteína sigmaC, ya que es la más variable entre las proteínas del reovirus aviar: mostrando solo un 35 % de identidad de secuencia de aminoácidos entre los aislados aviares menos relacionados (J. M. Day, 2009, Inf. Gen. & Evolution, vol. 9, p. 390-400).
Varios científicos han descrito la agrupación de aislamientos de reovirus aviares mediante análisis filogenéticos basados en la identidad de la secuencia de aminoácidos de sus proteínas sigmaC. Según se ha ido disponiendo de más secuencias de proteína sigmaC de aislados de reovirus aviares en bases de datos públicas, se han hecho posibles análisis más elaborados. Por ejemplo: Kant et al. (2003, Vet. Res., vol. 34, p. 203-212), han descrito una división de los reovirus aviares en 5 grupos genotípicos principales. No se pudo encontrar correlación entre los grupos de serotipo y genotipo, o entre los grupos de enfermedad y genotipo: todos los tipos de enfermedades asociadas con el reovirus aviar pueden ser el resultado de la infección con un reovirus aviar de cualquiera de los grupos genotípicos.
Utilizando diferentes parámetros, otros estudios filogenéticos basados en análisis de proteínas sigmaC describen otra agrupación: Liu et al. (2003, Virology, vol. 314, p. 336-349), definen 6 linajes; y Lublin et al. (2011, vaccine, vol. 29, p.
8683-8688), definen 4 grupos genotípicos.
El sistema descrito por Kant et al. (en 5 grupos genotípicos), parece recibir mayor apoyo científico. En esa clasificación, todas las cepas vacunales "clásicas" de reovirus aviar caen dentro del grupo genotípico 1 de Kant, mientras que la cepa ERS cae dentro del grupo genotípico 5 de Kant.
Lublin et al. (supra) estudiaron la vacunación contra los diferentes grupos genotípicos. De acuerdo con el consenso de que las vacunas contra el reovirus aviar protegen principalmente de forma homóloga, observaron que una vacuna eficaz contra todos los genotipos diferentes de reovirus aviares tenía que contener material antigénico de cada uno de estos grupos genotípicos.
En los últimos años ha habido un aumento en el número de infecciones irruptivas por reovirus aviares. Entre 2009 y 2013 se produjeron varios brotes de reovirus aviar en Europa y EE. UU., de modo que bandadas de pollos mostraron síntomas de infección grave por reovirus aviar con tenosinovitis, malabsorción e incluso mortalidad; esto a pesar de que los pollos habían sido debidamente vacunados con vacunas comerciales de reovirus aviar. Esto demostró que se habían desarrollado nuevas cepas virulentas de reovirus aviar y que las vacunas de tipo clásico y ERS no siempre podían proteger de manera eficaz.
Troxler et al. (2013, Vet. Record, vol. 172, p. 556) analizó varios brotes en 2011-2012 en dos regiones de Francia. Apoyándose en la división descrita por Kant et al. (supra) de cepas de reovirus aviares por comparación de la secuencia de aminoácidos de la proteína SigmaC en 5 grupos genotípicos, Troxler et al. clasificaron las cepas del brote que aislaron en Francia como una subclase del grupo genotípico 1 de Kant.
Debido a que las vacunas actuales parecían ineficaces contra estas modernas cepas innovadoras, Troxler et al. repiten la recomendación de Lublin et al. de que se necesitaría una vacuna amplia de protección cruzada para incorporar
todos los grupos genotípicos de los reovirus aviares.
Por consiguiente, existe una necesidad apremiante en el campo de la avicultura, de disponer de una vacuna contra el reovirus aviar que sea ampliamente protectora y que también sea eficaz contra cepas virulentas novedosas.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención es superar los inconvenientes de la técnica anterior y adaptarse a esta necesidad en el campo al proporcionar una vacuna que puede reducir la infección por un amplio espectro de reovirus aviares, entre otros, por cepas virulentas novedosas recientes de reovirus aviar.
Sorprendentemente, se descubrió que este objetivo puede cumplirse y por consiguiente, se pueden superar los inconvenientes de la técnica anterior, al proporcionar una vacuna para reducir la infección por reovirus aviar, de modo que la vacuna comprende material antigénico de reovirus aviar derivado de solo dos de los cinco grupos genotípicos de reovirus aviares, basándose en comparaciones de secuencias de aminoácidos de la proteína viral sigmaC.
Se observó que tal vacuna proporciona protección de amplio espectro, al reducir casi por completo la replicación de aislados novedosos recientes de reovirus aviar, después de una sola vacunación.
Los inventores han analizado unas 150 muestras de brotes de reovirus aviar entre 1993 y 2013 y de varios países. Curiosamente, al comparar las secuencias de aminoácidos de su proteína sigmaC, los reovirus aviares recién aislados pertenecían a todos los grupos genotípicos como se detalla a continuación. Esto amplía los hallazgos de Troxler et al., y muestra que los brotes recientes de reovirus aviar no están causados por ningún genotipo específico de reovirus aviar. Más bien parece haber un cambio general en las características del virus que hace que las vacunas existentes sean menos eficaces. Por consiguiente, existe la necesidad de una actualización de las vacunas contra el reovirus aviar, y la vacuna actualizada deberá proteger contra todos los genotipos existentes del virus.
Para la presente invención, las cepas y aislados de reovirus aviares se dividen en 5 grupos genotípicos, como se definen en el presente documento,
en función de la secuencia de aminoácidos de su proteína SigmaC. Esto proporcionó una división eficaz de todas las cepas conocidas, así como una forma de clasificar las cepas recientes novedosas. Además, se observó que esta división en 5 grupos genotípicos coincidía estrechamente con la división de genotipos descrita por Kant. et al. (supra).
Los inventores se sorprendieron al descubrir que una vacuna basada en una combinación específica de material antigénico de dos grupos genotípicos de reovirus aviares: los grupos genotípicos 1 y 4, tenía un efecto protector de amplio espectro. Por el contrario, una vacuna similar que contenía material antigénico de reovirus aviar de los grupos genotípicos 1 y 5, no proporcionaba una protección tan amplia.
Esta nueva vacuna proporcionó a las aves diana una protección de amplio espectro contra la replicación del reovirus aviar, ya que esta vacuna podía reducir casi por completo la replicación en una diana por los reovirus aviares. Esto se aplicaba tanto a los reovirus aviares del mismo grupo genotípico que el material antigénico incluido en la vacuna (reovirus aviar homólogo), como a los reovirus aviares de un grupo genotípico que era diferente de aquel del que formaba el material antigénico en la vacuna (es decir, reovirus aviar heterólogo). Este efecto de vacunación ya se obtuvo después de una única vacunación, e incluso fue eficaz contra cepas de brotes virulentos recientes de reovirus aviar.
Como resultado, esta nueva vacuna de amplio espectro contra el reovirus aviar reduce la enfermedad inducida por el reovirus aviar en los animales vacunados. Además, al reducir la carga viral, esto reduce la propagación del virus.
Esto fue inesperado, y está en contraste directo con la convicción general en el campo en el momento de la invención, donde la creencia general era que las vacunas de reovirus aviares solo eran completamente eficaces contra virus homólogos y no podían proporcionar una protección heteróloga eficaz sobre los diferentes grupos genotípicos, y que tal vacunación estándar requeriría al menos dos administraciones para ser eficaz. De hecho, esto fue confirmado por Lublin et al. (supra) que probó una amplia vacuna de reovirus aviar basada en material antigénico de representantes de cada uno de los grupos genotípicos descritos.
Por consiguiente, al seguir esta recomendación en el campo, el desarrollo de una vacuna eficaz con una amplia gama de protección contra estas modernas cepas novedosas de reovirus aviar requeriría la inclusión de material antigénico de reovirus aviares de todos los grupos genotípicos descritos.
No se sabe por qué esta combinación específica de material antigénico de los grupos genotípicos 1 y 4 de reovirus aviares puede proporcionar un efecto vacunal de amplio espectro tan eficaz. Aunque los inventores no pretenden quedar ligados a teoría alguna o modelo que pueda explicar estos hallazgos, especulan que esta combinación particular de material antigénico de reovirus aviar de los grupos genotípicos 1 y 4 debe presentar al sistema inmunitario de un ave diana una combinación de antígenos que desencadena una respuesta inmunitaria que es de protección cruzada en una amplia gama de las especificidades de antígenos que presentan los diferentes grupos genotípicos de reovirus aviar.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona una vacuna para reducir la infección por reovirus aviar como se define en las reivindicaciones, comprendiendo la vacuna material antigénico de reovirus aviar derivado de reovirus aviares de más de un solo grupo genotípico y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el material antigénico de reovirus aviar consiste en material antigénico derivado de reovirus aviares de cada uno de dos grupos genotípicos: grupo genotípico 1 y grupo genotípico 4.
Como es evidente para los expertos en la materia, una vacuna de amplio espectro que puede basarse solo en un número limitado de antígenos, proporciona varias ventajas claras sobre una vacuna combinada más amplia que comprende antígenos de todos los grupos genotípicos. Estas ventajas radican principalmente en los importantes ahorros que de esta forma se pueden obtener en mano de obra y capital, debido a la mejora de la eficacia y la simplicidad de la producción, almacenamiento y control de calidad.
Es bien sabido que una "vacuna" es una composición que tiene un efecto médico intrínseco, que comprende un componente inmunológicamente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El "componente inmunológicamente activo" es una (combinación de) molécula(s) antigénica(s) que es reconocida por el sistema inmunitario de la diana y que induce una respuesta inmunológica protectora. La respuesta puede originarse en el sistema inmunitario innato y/o adquirido de la diana y puede ser del tipo celular y/o humoral.
Para la vacuna de acuerdo con la invención, la respuesta inmunitaria inducida en el animal diana vacunado tiene el efecto de "reducir la infección por reovirus aviar". Esto se refiere a una reducción del nivel o la extensión de la infección, por ejemplo, al reducir la carga viral o acortar la duración de la replicación viral en el animal hospedador.
Este efecto se obtiene previniendo o reduciendo el establecimiento o la proliferación de una infección productiva por reovirus aviar en sus órganos diana, tales como tendones o intestinos. A su vez, esto conduce a una reducción en el animal diana del número, la intensidad o la gravedad de las lesiones y signos clínicos que pudieran ser causados por la infección vírica. Dicha vacuna se conoce coloquialmente como una vacuna "contra" el reovirus aviar, o como una "vacuna contra el reovirus aviar".
La determinación de la eficacia de una vacuna de acuerdo con la invención para reducir la infección por reovirus aviar, está bien dentro de las habilidades del médico de rutina y se puede realizar, por ejemplo, supervisando la respuesta inmunológica después de la vacunación o después de una infección de exposición, por ejemplo, supervisando los signos de enfermedad de la diana, la puntuación clínica, parámetros serológicos o volviendo a aislar el patógeno y comparando estos resultados con una respuesta de exposición a la vacunación observada en animales vacunados de forma simulada.
Un "reovirus aviar" es bien conocido en la técnica y es un virus que pertenece a la especie Avian Orthoreovirus. Estos virus y las enfermedades que inducen se describen, p. ej., en manuales conocidos, como: "The Merck veterinary manual" (10a ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X) y: "Diseases of Poultry" (12a ed., 2008, Y.M. Saif edt., ISBN-10: 0813807182).
Un reovirus aviar presenta las características que caracterizan a los miembros de su grupo taxonómico, tales como las características morfológicas, genómicas y bioquímicas, así como las características biológicas tales como el comportamiento fisiológico, inmunológico o patológico. Como es conocido en el campo, la clasificación de los microorganismos se basa en una combinación de tales características. Por lo tanto, la divulgación también incluye los reovirus aviares que se subclasifican de los mismos de alguna manera, por ejemplo, como una subespecie, cepa, aislado, genotipo, variante, subtipo o subgrupo y similares.
Será evidente para un experto en la materia que, si bien un reovirus aviar se clasifica actualmente en una especie o género particular, esa es una clasificación taxonómica que podría cambiar con el tiempo según los nuevos conocimientos conduzcan a la reclasificación en un grupo taxonómico nuevo o diferente. Sin embargo, como esto no cambia el propio microorganismo o su repertorio antigénico, sino solo su nombre científico o clasificación, tales microorganismos reclasificados permanecen dentro del alcance de la invención.
La expresión "que comprende" (así como las variaciones, tales como "comprenden", "comprende" y "comprendía"), como se utiliza en el presente documento, se refiere a todos los elementos y en cualquier combinación posible concebible para la invención, que están cubiertos por o incluidos en la sección de texto, párrafo, reivindicación, etc., en la que se aplica esta expresión, incluso si tales elementos o combinaciones no se citan explícitamente; y no se refiere a la exclusión de cualquiera de tal(es) elemento(s) o combinaciones. Por consiguiente, cualquier sección de texto, párrafo, reivindicación, etc., también puede referirse a una o más realizaciones en donde la expresión "que comprende" (o sus variantes) se sustituye por expresiones tales como "consiste en", "que consiste en" o "consiste esencialmente en".
El "material antigénico" puede ser, en principio, cualquier tipo de material derivado de un reovirus aviar para la invención, siempre que pueda inducir una respuesta inmunitaria protectora (ya sea por sí mismo o con un adyuvante). Por lo tanto, el material antigénico debe tener un tamaño, estructura, forma o calidad tal que la respuesta inmunitaria
que induce en el ave diana vacunada tenga la fuerza suficiente para poder reducir la infección por un reovirus aviar.
El material antigénico puede ser un reovirus aviar replicativo (es decir, un reovirus aviar "vivo"); un reovirus aviar inactivado ("muerto"); o una parte de un reovirus aviar tal como una subunidad, extracto, fracción, homogeneizado o sonicado.
En caso de que el material antigénico sea parte de un reovirus aviar, puede ser una proteína, lipoproteína, glucoproteína, molécula de ácido nucleico o una combinación de uno o más de estos. El material antigénico puede ser de origen biológico o sintético y puede derivar directa o indirectamente de un reovirus aviar para la invención.
Para la invención, una "proteína" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos. Una proteína no tiene una longitud específica, estructura o forma, y puede, si es necesario, modificarse in vivo o in vitro por ejemplo, por glicosilación, amidación, carboxilación, fosforilación, pegilación o cambios en el plegamiento espacial. Una proteína puede ser una proteína nativa o madura, una pre- o proproteína, o una parte de una proteína. Una proteína puede ser de origen biológico o sintético. Dentro de esta definición de proteína se incluyen, entre otros, polipéptidos y péptidos.
Para la invención, el material antigénico "deriva de" un reovirus aviar para la invención si se obtiene de algún modo de un reovirus aviar o de una parte del mismo. El material antigénico obtenido para la invención puede estar convenientemente contenido en un vehículo, tal como un tampón, y preferentemente estará en forma líquida, para permitir el uso o la manipulación del material antigénico para la invención. Un experto es perfectamente capaz de seleccionar y utilizar un vehículo adecuado para este fin.
Los ejemplos de formas de obtener material antigénico para la invención a partir de un reovirus aviar pueden ser la proliferación de un reovirus aviar para la invención en una célula hospedadora adecuada, después de lo cual el virus se puede recolectar y aislar mediante técnicas estándar bien conocidas en este campo. El virus replicativo recolectado puede usarse con o sin la célula hospedadora o partes de la misma.
El reovirus aviar de la invención también se puede obtener en forma inactivada, mediante el tratamiento del reovirus aviar replicativo con cualquier técnica adecuada, tal como con calor, radiación o con productos químicos tales como formalina, beta-propiolactona, etilenimina binaria o beta-etanolamina.
Además, el material antigénico derivado de un reovirus aviar para la invención, puede ser parte de un reovirus aviar, tal como una subunidad, extracto, fracción, homogeneizado o sonicado. Estos se pueden preparar mediante técnicas estándar bien conocidas en la técnica, y pueden comenzar a partir de virus replicativos o inactivados. El virus utilizado puede proceder de un cultivo de virus, tal como de uno procedente del sedimento de células, el sobrenadante de cultivo o el cultivo completo.
El material antigénico para la invención también puede obtenerse mediante la expresión de un gen de reovirus aviar en células de un sistema de expresión de ADN recombinante: estas células, el sobrenadante o todo el cultivo se puede recolectar y purificar, p. ej. por centrifugación o filtración, seguido opcionalmente de concentración. Como alternativa, cuando la proteína expresada permanece dentro de las células del sistema de expresión, estas células se pueden recolectar y la proteína se puede producir como una subunidad, extracto, fracción, homogeneizado o sonicado de estas células. Todo esto es bien conocido en la técnica. Los sistemas de expresión convenientes proceden de bacterias, levaduras, insectos, plantas o mamíferos; p. ej.: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. o Caulobacter crescentus; Sacharomyces cereviseae, Pichia pastoris; Célula de insecto/Baculovirus, Drosophila; Tabaco; o células Hela o CHO.
Los métodos y materiales requeridos para obtener material antigénico de reovirus aviar para la invención son técnicas estándar en virología, bioquímica y biología molecular, todo ello bien conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, en este campo se conocen bien técnicas y materiales de biología molecular para obtener ARN viral de un reovirus aviar para la invención, para preparar ADNc y manipularlo para su expresión, y se describen extensamente, p. ej., en manuales bien conocidos tales como: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989); "Basic Methods in Molecular Biology", Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986); y: Sambrook y Russell, 2001, en: "Molecular cloning: a laboratory manual', 3a ed. Nueva York, EE. UU.: Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Un "grupo genotípico" en el contexto de un reovirus aviar para la invención, se refiere a una serie de aislados de reovirus aviar que se pueden agrupar en función de los resultados de una alineación de la secuencia de aminoácidos de su proteína Sigma C, como se describe en el presente documento. Los miembros de dicho grupo están relacionados compartiendo un cierto nivel mínimo de identidad de secuencia de aminoácidos para su proteína sigmaC. De esta forma se definieron 5 grupos genotípicos de reovirus aviar.
Tal comparación de identidad de secuencia de aminoácidos es una forma bien conocida de determinar la relación evolutiva o "filogenia" entre proteínas. Se expresa como un porcentaje de aminoácidos que son idénticos al comparar las posiciones correspondientes entre las secuencias de aminoácidos, en relación con la longitud de la proteína alineada en número de aminoácidos. NB: esto no debe confundirse con la similitud de secuencia, donde también se cuentan los aminoácidos que son diferentes pero similares.
Tal alineación se realiza preferentemente utilizando un programa informático para realizar alineaciones por pares automatizadas (múltiples).
Con el fin de establecer un grupo genotípico de reovirus aviar para la invención, la prueba decisiva es mediante el uso del programa informático: "BLAST 2 SEQUENCES", disponible en el sitio web de NCBI (seleccionando "bl2seq" y subprograma: "blastP", que se puede encontrar en: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), utilizando su configuración de parámetros predeterminada. El programa optimiza la forma en que se alinean dos secuencias y muestra la región de solapamiento y el número y el porcentaje de coincidencias idénticas entre aminoácidos.
Para la invención, la alineación de la secuencia de aminoácidos se realiza sobre los aminoácidos 1 - 277 de la proteína sigmaC, contando la metionina derivada del codón de inicio como el aminoácido n.° 1.
En las Tablas adjuntas se presentan listas de puntuación de alineación de reovirus aviares en los diversos grupos genotípicos.
Para representar las relaciones evolutivas dentro y entre grupos genotípicos, los resultados de alineación se pueden presentar como un árbol filogenético. Esto también se puede hacer utilizando un ordenador, por ejemplo, utilizando el programa PHYLIP (por ejemplo, disponible en el sitio web: www.phylogeny.fr) o MEGA (Tamura et al., 2013, Mol. Biol. y Evol., vol. 30, p. 2725-2729; versión más reciente: MEGA6). En las figuras adjuntas se representan figuras que representan dichos árboles filogenéticos de los grupos genotípicos de los reovirus aviares analizados para la invención.
En bases de datos públicas tales como GenBank o EMBL, actualmente se encuentran disponibles más de 200 secuencias de aminoácidos de proteínas sigmaC de una amplia diversidad de aislados de reovirus aviares. Esto permitió hacer alineaciones comparativas y clasificar las cepas públicas de reovirus aviares en grupos genotípicos como se define en el presente documento.
Además de esta gran cantidad de información de secuencia pública, los inventores tenían disponibles las secuencias de aminoácidos de las proteínas sigmaC de muchas cepas de brotes recientes. Los detalles se describen en la sección de Ejemplos proporcionada a continuación; en resumen: se homogeneizó una muestra de tejido y se cultivó para amplificar cualquier virus. Se extrajo el ARN viral y se utilizaron cebadores específicos de SigmaC (Liu et al., supra) en una RT-PCR, se amplificó la sección del genoma del reovirus aviar que codifica la proteína sigmaC, todo ello utilizando técnicas estándar. A continuación se determinó la secuencia de ácido nucleico de este ADNc y la secuencia de ADN se tradujo en una supuesta secuencia de aminoácidos. Luego se comparó con otras secuencias de sigmaC, para determinar el grupo genotípico del aislado del brote. Como se ha descrito, se identificaron representantes de los 5 grupos genotípicos entre los aislados del brote.
La secuencia de aminoácidos de la proteína sigmaC de varios aislados novedosos representativos de los 5 grupos genotípicos, se presenta en la lista de secuencias adjunta.
A partir de estos análisis se observó que un reovirus aviar para la invención se clasifica como perteneciente al grupo genotípico 1 cuando ese reovirus aviar, en una forma replicativa contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 (secuencia de aminoácidos de la proteína SigmaC del aislado de reovirus aviar SL11A0823-2 BE).
De forma similar, un reovirus aviar para la invención se clasifica como perteneciente al grupo genotípico 4 cuando ese reovirus aviar, en una forma replicativa contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No .4 (secuencia de aminoácidos del aislado n.° SL11A0823-1 BE).
Las expresiones "en forma replicativa" se utilizan para referirse a un reovirus aviar que es capaz de replicarse, es decir, es un virus replicativo, no inactivado o "vivo". Por tanto, la vacuna de acuerdo con la invención emplea material antigénico derivado de un reovirus aviar que en algún momento estuvo en forma replicativa y luego contenía información genética que codificaba una proteína sigmaC con el nivel de identidad especificado. Sin embargo, esto no significa que el material antigénico en sí siga conteniendo esa información genética en absoluto, o que la contenga intacta.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" es un adyuvante en la preparación, almacenamiento o administración del compuesto inmunoactivo de una vacuna, sin causar efectos adversos (graves) en la salud del animal diana al que se administra. Dicho vehículo puede ser, por ejemplo, agua estéril o soluciones salinas tamponadas con fosfato o sal fisiológica. En una forma más compleja, el vehículo puede ser, p. ej., un tampón, que puede contener otros aditivos, tales como estabilizantes o conservantes. Los detalles y ejemplos se describen, por ejemplo, en manuales conocidos tales como: "Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, EE. UU., ISBN: 683306472) y: "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Ámsterdam, iSb N 0444819681).
Por lo tanto, pueden emplearse reovirus aviares que pertenecen a los grupos genotípicos 1 o 4 para preparar una vacuna de acuerdo con la invención. Dichos reovirus aviares se describen en detalle en el presente documento en la sección de Ejemplos, también son bien conocidos en la técnica y pueden obtenerse fácilmente por un experto en la materia.
Por ejemplo, se pueden utilizar reovirus aviares procedentes de muestras de reovirus aviares disponibles públicamente; estos pueden clasificarse ya como pertenecientes a los grupos genotípicos 1 o 4, o pueden clasificarse fácilmente como se describe en el presente documento. Tales muestras están disponibles en una diversidad de universidades e instituciones de investigación (avícola), así como en institutos depositarios tales como la ATCC (Manassas, VA, EE. UU.), el CNCM (Instituto Pasteur, París, Francia) o la ECACC (Porton Down, Reino Unido).
Como alternativa, los reovirus aviares de los grupos genotípicos 1 y 4 se pueden obtener de muestras de campo de pollos que presentan signos clínicos de infección por reovirus aviares, tales como artritis viral o malabsorción. Las muestras se pueden obtener a partir de órganos de las aves afectadas, tales como: tendón, articulación del espolón, hígado, bazo o intestino, tal como yeyuno. El virus puede cultivarse in vitro y puede identificarse como un reovirus aviar, por ejemplo, a partir de su cpe típico en cultivo celular, o usando anticuerpos específicos de reovirus aviar. También se puede analizar el ARN viral por RT-PCR, usando cebadores como se describe en la bibliografía o en el presente documento. El siguiente análisis informático de la secuencia de aminoácidos de sigmaC indicará el grupo genotípico de la muestra.
Usando estos métodos, los inventores han aislado y analizado un gran número de aislados de reovirus aviar. Se preparó una vacuna de acuerdo con la invención a partir de dos de estos que se aislaron a partir de brotes de reovirus aviar en diferentes granjas de pollos en Bélgica en 2011; los nombres de los aislados son: SL11A0823-2BE y SL11A0823-1 BE. Estos se clasificaron como pertenecientes a los grupos genotípicos 1 y 4 como se define en el presente documento, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de su proteína sigmaC se presenta en las SEQ ID NO: 1 y 4 respectivamente.
Las vacunas se prepararon usando procedimientos estándar, en resumen: el virus se había amplificado a partir de la muestra de campo y se había purificado en placa tres veces. El siguiente virus se cultivó en células Vero, se inactivó con formalina y se concentró, posteriormente el material antigénico viral se formuló como una emulsión de agua en aceite con aceite mineral ligero y emulsionantes.
Se administró una sola dosis de vacuna una vez a gallinas ponedoras SPF en diferentes grupos de tratamiento, mediante administración intramuscular. Los huevos fertilizados de estos pollos vacunados se recolectaron a partir de las 5 semanas posteriores a la vacunación. Estos eclosionaron y las crías recibieron una inoculación de exposición con reovirus aviar replicativo de diferentes grupos genotípicos. La eficacia de la vacuna para la descendencia se determinó mediante la detección del virus de exposición en muestras de sangre extraídas 3 días después de la inoculación de la exposición.
Los resultados de la vacunación se describen en detalle en la sección de Ejemplos, pero sólo se observó una protección eficaz de amplio espectro para la vacuna que contenía antígenos de reovirus aviar de los grupos genotípicos 1 y 4: casi ningún virus de exposición pudo aislarse de crías que recibieron las diversas inoculaciones de exposición homólogas o heterólogas.
Por el contrario, los grupos de pollitos que recibieron una vacuna que contenía material antigénico de un solo aislado de reovirus aviar solo estaban protegidos contra la cepa de exposición homóloga; los controles no vacunados fueron positivos para el virus de exposición en todas las muestras; y una vacuna combinada con antígenos de reovirus aviar de los grupos genotípicos 1 y 5 solo protegió contra el virus de exposición de los grupos genotípicos 1 o 2, lo mismo que una vacuna multivalente de genotipo 1.
En una realización preferida, un reovirus aviar perteneciente al grupo genotípico 1 de acuerdo con la invención, contiene (en forma replicativa) información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 76 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1. Más preferentemente: un 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o incluso un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, en ese orden de preferencia.
En una realización preferida, un reovirus aviar perteneciente al grupo genotípico 4 de acuerdo con la invención, contiene (en forma replicativa) información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 76 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1. Más preferentemente: un 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o incluso un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, en ese orden de preferencia.
En una realización de una vacuna de acuerdo con la invención, el material antigénico de reovirus aviar consiste en
material antigénico como se define en las reivindicaciones derivado de dos tipos de reovirus aviares; el primer tipo es un reovirus aviar que en una forma replicativa contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1; y el segundo tipo es un reovirus aviar que en una forma replicativa contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4.
Para la invención, las indicaciones "primero" y "segundo" se utilizan únicamente para facilitar la referencia y no para indicar ningún orden numérico o dependencia.
En una realización preferida, un primer tipo de reovirus aviar contiene (en una forma replicativa) información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 76 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1. Más preferentemente: un 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o incluso un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, en ese orden de preferencia.
En una realización preferida, un segundo tipo de reovirus aviar contiene (en una forma replicativa) información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 76 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4. Más preferentemente: un 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o incluso un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, en ese orden de preferencia.
En sus análisis de las cepas innovadoras recientes de reovirus aviar, los inventores encontraron que la mayoría de los aislados que clasificaron como grupo genotípico 1 (como se define en el presente documento), efectivamente formaban un subgrupo genotípico que era claramente distinto de las cepas de tipo de vacuna clásicas que también pertenecen al grupo genotípico 1. Esto también está en línea con los hallazgos de Troxler et al. (supra). Por lo tanto, los inventores se refieren al grupo genotípico de las cepas vacunales clásicas de reovirus aviar como subgrupo genotípico 1A y al grupo genotípico de esta sección de aislados novedosos como subgrupo genotípico 1B.
Por lo tanto, en una realización de una vacuna de acuerdo con la invención, el material antigénico derivado de reovirus aviar del grupo genotípico 1, deriva del reovirus aviar del subgrupo genotípico 1B.
Un reovirus aviar para la invención se clasifica como perteneciente al subgrupo genotípico 1B cuando ese reovirus aviar, en una forma replicativa, contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 78 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No . 1.
En una realización adicional, un reovirus aviar que pertenece al subgrupo genotípico 1B contiene (en forma replicativa) información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 79% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1. Más preferentemente: un 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o incluso un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, en ese orden de preferencia.
Con el fin de caracterizar adecuadamente los otros grupos genotípicos de reovirus aviar que se emplean en el presente documento, estos también se pueden definir por medio del nivel de identidad de la secuencia de aminoácidos de su proteína SigmaC en relación con una secuencia de aminoácidos de referencia:
Un reovirus aviar se clasifica como perteneciente al subgrupo genotípico 1A cuando ese reovirus aviar, en una forma replicativa, contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 79 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos representada en el número de registro de GenBank AAB61607 (cepa 1733 de reovirus aviar). Más preferentemente: un 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o incluso un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos representada en el número de registro de GenBank AAB61607, en ese orden de preferencia.
Un reovirus aviar se clasifica como perteneciente al grupo genotípico 2 cuando ese reovirus aviar, en una forma replicativa contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 58 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No .2 (secuencia de aminoácidos de la proteína SigmaC del aislado de reovirus aviar SL11A0294-12 FR). Más preferentemente: un 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o incluso un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, en ese orden de preferencia.
Un reovirus aviar se clasifica como perteneciente al grupo genotípico 3 cuando ese reovirus aviar, en una forma replicativa contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos
que tiene al menos un 57 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3 (secuencia de aminoácidos de la proteína SigmaC del aislado de reovirus aviar SL10A1581-32 ES). Más preferentemente: un 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o incluso un 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3, en ese orden de preferencia.
Un reovirus aviar se clasifica como perteneciente al grupo genotípico 5 cuando ese reovirus aviar, en una forma replicativa contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No .5 (secuencia de aminoácidos de la proteína SigmaC de la cepa de reovirus aviar ERS). Más preferentemente: un 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o incluso un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, en ese orden de preferencia.
En un aspecto, el material antigénico que deriva del reovirus aviar es: reovirus aviar replicativo, reovirus aviar inactivado, o una parte de reovirus aviar, tal como una subunidad, extracto, fracción, homogeneizado o sonicado de reovirus aviar. Es más preferido el reovirus aviar inactivado.
Cuando el material antigénico es un reovirus aviar inactivado o es parte de un reovirus aviar, el material antigénico todavía contiene (todos los) componentes de un reovirus aviar que contribuyen a una respuesta inmunitaria.
La cantidad de material antigénico de reovirus aviar contenido en una vacuna cuando ese material antigénico es reovirus aviar inactivado, o es parte de reovirus aviar, está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 1000 |jg por dosis en un animal. Preferentemente, la cantidad de material antigénico de reovirus aviar está entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 jg/dosis; más preferentemente entre 10 y 250 jg/dosis, y entre 25 y 100 jg/dosis en un animal.
Para la invención, la cantidad preferida de material antigénico de reovirus aviar por dosis en un animal puede estar relacionada con la cantidad de material antigénico de cada uno de los dos grupos genotípicos 1 y 4 por separado, o con la cantidad de ambos combinados. Además, la cantidad de material antigénico por dosis en un animal de un grupo genotípico no necesita ser la misma que la del material antigénico del otro grupo genotípico. Esta última realización permite una mayor optimización de la eficacia de la vacuna de acuerdo con la invención, mediante la adaptación de la cantidad de antígeno, en sentido absoluto y relativo.
Para el material antigénico derivado de un reovirus aviar para la invención en forma de reovirus aviar inactivado, la cantidad por dosis en un animal puede expresarse por referencia a la cantidad de virus replicativo que se usó para la inactivación.
Como alternativa, la cantidad por dosis en un animal se puede expresar en términos bioquímicos, p. ej. como una cantidad de proteína, o en unidades Elisa arbitrarias, con respecto a un patrón conocido. Todo esto es bien conocido por el experto en la materia.
Las vacunas de acuerdo con la invención, pueden administrarse en un volumen que sea aceptable para el animal diana y pueden estar, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml en volumen. Preferentemente, una dosis está en un volumen entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 3 ml.
En una realización, una vacuna de acuerdo con la invención comprende adicionalmente un estabilizante. Esto puede servir para proteger los componentes propensos a la degradación y/o para mejorar la vida útil de la vacuna. Generalmente, tales estabilizantes son moléculas grandes de alto peso molecular, tales como lípidos, carbohidratos o proteínas; por ejemplo, leche en polvo, gelatina, seroalbúmina, sorbitol, sacarosa, trehalosa, espermidina, NZ aminas, Dextrano o polivinilpirrolidona, y tampones, tales como fosfatos de metales alcalinos.
Preferentemente, el estabilizador está libre de compuestos de origen animal, o incluso: está definido químicamente, como se divulga en el documento WO 2006/094.974.
También se pueden añadir conservantes, tales como timerosal, mertiolato, compuestos fenólicos y/o gentamicina.
Las técnicas y procedimientos generales en vacunología son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en regulaciones gubernamentales tales como la Farmacopea y en manuales bien conocidos tales como: "Remington" y "Veterinary vaccinology" (supra).
Los animales diana para una vacuna de acuerdo con la invención son aves que son susceptibles a la infección por reovirus aviar. Las dianas aviares preferidas son las especies aviares de relevancia para los seres humanos o para el campo veterinario, por ejemplo: pollo, pavo, pato, ganso, perdiz, pavo real, codorniz, paloma, faisán, pintada, pinzón, cuervo, periquito, loro, ara, guacamayo, cacatúa, pinzón, halcón, gavilán, emú, casuario o avestruz.
Se prefieren las especies diana de aves seleccionadas del grupo que consiste en: pollo, pavo, pato y ganso. Es más preferido: el pollo, porque para esta especie diana aviar, el impacto económico de la infección y enfermedad por reovirus aviar es más pronunciado.
Para la invención, un ave puede ser de cualquier tipo, raza o variedad, tal como: ponedoras, reproductoras, aves de engorde, razas combinadas o líneas progenitoras de cualquiera de dichas razas. Los tipos preferidos son: aves de engorde, reproductoras y ponedoras. Los más preferidos son los pollos reproductores, en cuanto a este tipo de aves, su vacunación da como resultado la protección de su descendencia, que es más susceptible a la infección por el reovirus aviar.
Para la invención no es necesario que la especie aviar que es la diana de la vacunación sea la misma que la especie aviar de la que se aisló el reovirus aviar que se utilizó para obtener material antigénico para la vacuna de acuerdo con la invención.
En una realización preferida, un reovirus aviar que se aisló de un pollo se utiliza para una vacuna de acuerdo con la invención.
Una vacuna de acuerdo con la invención puede servir como vacunación de sensibilización eficaz, que más tarde puede ser seguida y amplificada por una vacunación de refuerzo.
El animal diana para la vacuna de acuerdo con la invención, en principio, puede estar sano o enfermo, y puede ser positivo o negativo para la presencia de reovirus aviar, o para anticuerpos contra reovirus aviar. La diana también puede ser de cualquier edad a la que sea susceptible a la vacunación. Sin embargo, evidentemente es favorable vacunar a dianas sanas, no infectadas, y vacunar lo antes posible para prevenir cualquier infección de campo.
Por lo tanto, una vacuna puede usarse como tratamiento profiláctico o terapéutico, o ambos, dado que interfiere tanto con el establecimiento como con la progresión de una infección por un reovirus aviar.
En ese sentido, otro efecto ventajoso de la reducción de la carga viral por la vacuna es la prevención o reducción de la excreción y, por lo tanto, la propagación del virus, tanto verticalmente a la descendencia, como horizontalmente dentro de una bandada o población, y dentro de un área geográfica. Por consiguiente, el uso de una vacuna conduce a una reducción de la prevalencia del reovirus aviar.
Por lo tanto, otros efectos ventajosos de la vacuna incluyen la reducción de la prevalencia del reovirus aviar en una población o en un área geográfica.
El esquema de administración de una vacuna de acuerdo con la invención a un ave diana puede ser en dosis únicas o múltiples, que pueden administrarse de forma concurrente, simultánea o secuencial, de una manera compatible con la dosificación y la formulación previstas, y en una cantidad tal que sea inmunológicamente eficaz.
El esquema para la administración de una vacuna de acuerdo con la invención idealmente se integra en los esquemas de vacunación existentes de otras vacunas que pueda requerir el ave diana, para reducir el estrés de las aves y reducir los costes de mano de obra.
En principio, la vacuna de reovirus aviar de acuerdo con la invención se puede administrar a una diana aviar por diferentes vías de aplicación y en diferentes momentos de su vida, siempre que la vacuna administrada pueda establecer una respuesta inmunitaria eficaz.
La vacuna se puede administrar a los pollitos el día de la eclosión o poco después, es decir, en el día 1-3 de edad. Como alternativa, la vacuna se puede administrar in ovo, poco antes de la eclosión; para los pollos esto es aproximadamente en el día 18 del desarrollo embrionario.
La vacuna se puede administrar preferentemente a un animal diana aviar, no menos de 4 semanas antes del inicio esperado de la puesta.
De esta manera, la descendencia puede protegerse eficazmente mediante anticuerpos derivados de la madre, y/o se reduce o previene la infección por transmisión vertical.
Las vías preferidas para la administración de una vacuna a un ave diana son: como aplicación parenteral por inyección, p. ej. intramuscular o subcutánea; por gotas gruesas, p. ej. como una aplicación de aerosol, gotas oculares u oronasal; o por vía alimentaria.
La vía de aplicación preferida es por inyección intramuscular o subcutánea; preferentemente por vía intramuscular en el músculo del muslo o del pecho, o por vía subcutánea en el cuello. Esto se aplica igualmente a cuando el material antigénico de un reovirus aviar es un virus replicativo, virus inactivado o una subunidad.
No hace falta decir que la vía óptima de aplicación dependerá de la formulación específica de la vacuna que se utilice y de las características particulares de las aves diana.
Está bien al alcance del experto en la materia optimizar aún más una vacuna de acuerdo con la invención. En general, esto implica el ajuste fino de la eficacia de la vacuna, para que proporcione suficiente protección inmunitaria. Esto se puede hacer adaptando la dosis de la vacuna, o usando la vacuna en otra forma o formulación, o adaptando los otros componentes de la vacuna (por ejemplo, el estabilizante o el adyuvante), o mediante la aplicación por una vía diferente.
La vacuna puede comprender adicionalmente otros compuestos, tales como un adyuvante, un antígeno adicional, una citocina, etc. Como alternativa, una vacuna de acuerdo con la invención puede combinarse ventajosamente con un componente farmacéutico, tal como un antibiótico, una hormona, un fármaco antiinflamatorio o antiparasitario.
Una vacuna de acuerdo con la invención comprende un adyuvante.
Esto es válido ya que el material antigénico derivado de un reovirus aviar para la invención está en forma de virus inactivado de acuerdo con la invención. Como formas no replicativas, dichos materiales antigénicos normalmente requieren una estimulación inmunitaria adicional para poder inducir una vacunación eficaz de amplio espectro.
Un "adyuvante" es un ingrediente de vacuna bien conocido que, en general, es una sustancia que estimula la respuesta inmunitaria de la diana de manera no específica. Se conocen en la técnica muchos adyuvantes diferentes. Son ejemplos de adyuvantes el adyuvante completo e incompleto de Freund, vitamina E, composiciones de aluminio tales como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio, poliaminas y polímeros de bloque no iónicos tales como dextranosulfato, Carbopol®, pirano, Saponina, tal como: Quil A® o Q-vac®. La saponina y los componentes de la vacuna se pueden combinar en un ISCOM® (documentos EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).
Por otra parte, a menudo se utilizan como adyuvantes péptidos tales como muramildipéptidos, dimetilglicina, tuftsina y emulsiones de aceite, que utilizan aceite mineral, p. ej., Bayol™ o Markol™, Montanide™ o aceite mineral ligero (parafina); o aceite no mineral tal como el escualeno, escualano o aceites vegetales, p. ej., oleato de etilo. También se pueden utilizar ventajosamente productos combinados tales como ISA™ de Seppic™ o DiluvacForte™. Una emulsión puede ser de agua en aceite (w/o), de aceite en agua (o/w), de agua en aceite en agua (w/o/w), o una emulsión doble de aceite (DOE), etc.
En una realización preferida, una vacuna de acuerdo con la invención comprende una emulsión de agua en aceite.
Dicha emulsión proporciona un efecto de depósito en el animal vacunado que libera lentamente el antígeno, proporcionando así una estimulación prolongada del sistema inmunitario de la diana.
En una realización preferida, la fase oleosa de la emulsión de agua en aceite comprende un aceite mineral o un oleato de etilo.
En una realización de la vacuna de acuerdo con la invención, el material antigénico es un reovirus aviar inactivado que se formula en una emulsión de agua en aceite, de manera que la fase oleosa de la emulsión de agua en aceite comprende un aceite mineral o un oleato de etilo.
No hace falta decir que dentro del alcance de la invención también están otras formas para añadir adyuvantes, añadir compuestos de vehículo o diluyentes, emulsionar o estabilizar una vacuna de acuerdo con la invención.
En una realización, una vacuna de acuerdo con la invención comprende además un oligodesoxinucleótido que es un oligodesoxinucleótido (INO) que contiene CpG no metilado inmunoestimulador. Un INO preferido es un agonista del receptor tipo Toll aviar (TLR) 21, tal como se describe en el documento WO 2012/089.800 (familia X4), WO 2012/160.183 (familia X43) o WO 2012/160.184 (familia X23).
Una vacuna de acuerdo con la invención puede combinarse ventajosamente con material antigénico adicional en una vacuna combinada. Sin embargo, no se requiere material antigénico adicional derivado de un reovirus aviar.
Por lo tanto, en una realización de una vacuna de acuerdo con la invención, la vacuna comprende material antigénico adicional que deriva de un microorganismo patógeno para un ave, pero no de un reovirus aviar.
El propio "material antigénico adicional" puede estar en forma replicativa o inactivada, o como una subunidad, y puede estar con o sin adyuvante. El material antigénico adicional deriva de otro microorganismo que es patógeno para el ave diana. Puede comprender, por ejemplo, una molécula biológica o sintética, tal como una proteína, un hidrato de carbono, un lipopolisacárido o un ácido nucleico que codifica un antígeno proteico. También pueden ser formas de suministrar el ácido nucleico o el material antigénico adicional al ave diana una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico, o un microorganismo portador recombinante vivo que contiene dicho ácido nucleico. Como alternativa, el material antigénico adicional puede comprender un microorganismo inactivado tal como un parásito, bacteria o virus.
Como alternativa, la propia vacuna de acuerdo con la invención puede añadirse a una vacuna.
Un efecto ventajoso de una vacuna combinada es que no solo induce una respuesta inmunitaria contra el reovirus aviar, sino también contra otros patógenos de un ave diana, aunque solo se requiere un solo manejo del animal diana para la vacunación, reduciendo de este modo la incomodidad de la diana, así como los costes de tiempo y mano de obra.
Un "microorganismo patógeno para un ave" para la invención, es bien conocido en la técnica. Por lo tanto, el material antigénico adicional puede derivar en principio de cualquier virus (excepto el reovirus aviar), bacteria, parásito, hongo, rickettsia, protozoo y/o parásito que sea patógeno para un ave que también es una diana para una vacuna para reducir la infección por reovirus aviar de acuerdo con la invención.
En una realización preferida, un virus patógeno para las aves se selecciona de: virus de la bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, adenovirus aviar, astrovirus aviar, paramixovirus aviar, virus del síndrome de la caída del huevo, adenovirus de las aves, IBDV, virus de la anemia de pollo, virus de la encefalomielitis aviar, virus de la viruela aviar, virus de la rinotraqueítis del pavo, virus de la peste del pato, virus de la hepatitis viral del pato, virus de la viruela de la paloma, virus de la enfermedad de Marek, virus de la leucosis aviar, virus de la laringotraqueítis infecciosa, metapneumovirus aviar, virus de la gripe aviar y parvovirus del ganso.
En una realización preferida, una bacteria patógena para las aves se selecciona de los géneros bacterianos: Escherichia, Salmonella, Ornithobacterium, Haemophilus, Pasteurella, Bordetella, Erysipelothrix, Mycoplasma, Campylobacter, Borrelia, Enterococcus, Avibacterium, Riemerella, Listeria, Shigella, Streptococcus, Staphylococcus, Mycobacterium, Chlamydia y Clostridium.
En una realización preferida, un parásito patógeno para las aves se selecciona de los géneros de parásitos: Eimeria y Cryptosporidium.
En una realización preferida, un hongo patógeno para las aves se selecciona de los géneros fúngicos: Aspergillus y Candida.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a métodos para la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención.
Dichos métodos dan como resultado la disponibilidad de una vacuna de acuerdo con la invención, teniendo la vacuna el efecto favorable de reducir la infección por reovirus aviar en un ave, como se ha descrito anteriormente.
La "preparación" de una vacuna de acuerdo con la invención se lleva a cabo por medios bien conocidos por el experto en la materia. Dichos métodos de fabricación comprenderán en general las etapas de mezclar y formular material antigénico derivado de un reovirus aviar para la invención con excipientes farmacéuticamente aceptables, seguido de la distribución en recipientes de tamaño adecuado. Las diversas etapas del proceso de fabricación deberán supervisarse mediante pruebas adecuadas, por ejemplo, mediante pruebas inmunológicas para la calidad y cantidad de los antígenos; por pruebas microbiológicas de esterilidad y ausencia de agentes extraños; y finalmente mediante experimentos in vitro o in vivo para determinar la eficacia y seguridad de la vacuna. Todos estos son bien conocidos por un experto en la materia y están prescritos en manuales y en reglamentos gubernamentales tales como la Farmacopea.
Una vacuna de acuerdo con la invención se puede preparar en una forma que sea adecuada para la administración a una diana aviar y que coincida con la vía de aplicación deseada y con el efecto deseado.
Preferentemente, una vacuna de acuerdo con la invención se formula como un líquido inyectable, tal como: una suspensión, solución, dispersión o emulsión. Normalmente estas vacunas se preparan de forma estéril.
Una vacuna de acuerdo con la invención se prepara a partir de un material antigénico de reovirus aviar que se inactivó. Dicha vacuna de reovirus aviar inactivado puede fabricarse ahora para la invención utilizando técnicas bien conocidas.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención, que comprende la etapa de inactivar el reovirus aviar de cada uno de los dos grupos genotípicos: grupo genotípico 1 y grupo genotípico 4.
La replicación de un reovirus aviar se puede realizar de muchas maneras, por ejemplo, utilizando un animal hospedador y recolectando el virus de la sangre y/u órganos. Sin embargo, se prefiere un sistema de cultivo in vitro que utiliza células hospedadoras susceptibles al reovirus aviar. Dicho sistema de cultivo puede supervisarse y controlarse mejor que la producción in vivo, y se pueden optimizar los rendimientos virales. Normalmente, un sistema de cultivo in vitro emplea un recipiente de cultivo y un medio de cultivo (semi)definido. Las células hospedadoras pueden derivar de un animal, produciendo células primarias, o pueden ser células inmortalizadas tales como las de
una línea celular establecida. A pequeña escala, el recipiente de cultivo puede ser un matraz de fondo plano o botella rodante; para cultivos a gran escala, el recipiente de cultivo puede ser un fermentados que también permite supervisar y ajustar varios parámetros críticos del cultivo cuando sea apropiado, e incluso puede automatizarse. Las técnicas, materiales y equipos para un sistema de cultivo in vitro para la invención a cualquier escala es bien conocido y se puede adquirir fácilmente de muchos proveedores comerciales para la industria de las ciencias de la vida.
En una realización, un método para la preparación de acuerdo con la invención comprende las etapas de:
a. propagar un reovirus aviar en un cultivo celular in vitro,
b. recolectar e inactivar dicho reovirus aviar, y
c. mezclar el reovirus aviar inactivado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización adicional, un método para la preparación de acuerdo con la invención comprende la etapa de mezclar material antigénico de reovirus aviar como se define en la invención, con un adyuvante.
Otros usos ventajosos que no forman parte de la invención se refieren a diferentes usos médicos de la vacuna o del material antigénico de reovirus aviar como se describe. Estos materiales y métodos dan como resultado el efecto favorable de reducir la infección por reovirus aviar en un ave, como se ha descrito anteriormente.
La invención se describirá adicionalmente a continuación mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
1. Aislamiento de reovirus aviar y preparación de muestras
El reovirus aviar se aisló de órganos de pollo mediante el cultivo de homogeneizados de tejido en células de hígado de embrión de pollo (CEL). En resumen: se obtuvieron tejidos tales como tendones, hígado, yeyuno y sangre de pollos (potencialmente) infectados. Se centrifugó la sangre y se recogió el suero. Se cortaron muestras de tejidos. Estas se pusieron en tubos de 6 ml que contenían aproximadamente 0,5 cc de perlas de vidrio de aproximadamente 1 mm de diámetro y 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía un cóctel de compuestos antibióticos y antifúngicos. Las muestras se homogeneizaron mediante agitación durante 20 minutos en un molino de bolas Mixer Mill (Retsch), seguido de clarificación por centrifugación. Se recogió el sobrenadante y se conservó congelado a -70 °C para su uso posterior.
Las células CEL primarias se prepararon frescas antes de su uso, de acuerdo con un protocolo estándar, en resumen: se utilizaron embriones de pollo SPF de 14-16 días para obtener hígados. Los hígados se lavaron dos veces en PBS para eliminar la sangre y después se incubaron mientras se agitaban en una solución de tripsina/PBS a 37 °C durante 15 minutos. La tripsina se neutralizó con FCS y la mezcla tripsinizada se centrifugó durante 10 minutos a 600xg. El sedimento se resuspendió en un medio de cultivo estándar (que comprendía un cóctel de antibióticos y un 5 % de suero bovino fetal (FCS)). Esto se filtró una vez para eliminar los grumos y después las células CEL se contaron y se utilizaron directamente.
Las células CEL se sembraron a 1,5 x 10“6 células/ml en 5 ml de medio de cultivo (FCS al 5 %) en matraces de cultivo T25 y se incubaron durante la noche en un incubador humedecido a 37 °C y con CO2 al 5 %, para permitir el establecimiento de una monocapa. Al día siguiente, el medio de cultivo se reemplazó por medio que comprendía FCS al 2 % y los matraces se inocularon con una muestra de virus como 50 μl de suero o sobrenadante de tejido, a continuación los matraces se incubaron durante 4-7 días
Después de la primera ronda de incubación, la capa de células CEL a menudo parecía dañada por los desechos, de modo que no se observó ningún efecto citopático (cpe) distintivo, de manera que generalmente sometía a un segundo pase: se prepararon CEL frescas, se sembraron y se incubaron como una monocapa y luego se inocularon 50 μl del sobrenadante del cultivo del primer pase. Esto incubó durante 4 días, después de lo cual se podía observar claramente en el matraz el cpe específico del reovirus aviar (las células CEL parecen volverse oscuras y granulares, con vesículas translúcidas que parecían dañadas). En el caso de los matraces cpe negativos, estos se pudieron someter a un tercer pase. Finalmente, el sobrenadante del cultivo del segundo o tercer pase se recolectó y se conservó congelado (-70 °C) para su uso posterior.
A los aislados se les asignó un nombre y un número, donde SL significa "laboratorio de servicio", seguido de dos dígitos que representan el año de aislamiento, un número de aislamiento cronológico y el código de 2 letras del país del material donante utilizado para el aislamiento.
Las muestras de virus aisladas se utilizaron directamente para el aislamiento de ARN, RT-PCR y análisis de secuencias. Los aislados que se utilizaron en experimentos con animales recibieron un tratamiento adicional: las muestras utilizadas para las inoculaciones de exposición se amplificaron directamente del aislado amplificado de la tercera ronda, para obtener títulos más altos y volúmenes más grandes por proliferación en CEL de células CEF en recipientes de cultivo sucesivamente más grandes, tal como en T75 (cultivo de 15 ml) o T175 (cultivo de 25 ml) en
matraces de cultivo celular de fondo plano Cellstar™ (Greiner Bio-One) o en botellas rodantes de 490 cm2 (cultivo de 150 ml) (Corning, Fischer Scientific), todo ello en medio de cultivo estándar y en condiciones de cultivo estándar. De esta manera, se prepararon inóculos de exposición de:
- SL11A823-2 BE (grupo genotípico 1): 7,95 Log10 TCID50/ml
- SL11A294-12 FR (grupo genotípico 2): 6,32 Log10 TCID50/ml
- SL10A1581-32 ES (grupo genotípico 3): 5,95 Log10 TCID50/ml
- SL11A823-1 BE (grupo genotípico 4): 7,70 Log10 TCID50/ml
Las muestras de aislados novedosos de reovirus aviar que se usaron para la preparación de vacunas se purificaron primero en placa 3 veces como se describe a continuación y luego se amplificaron de manera similar.
2. Confirmación de la virulencia de aislados virales en animales diana
De acuerdo con los postulados de Koch, se demostró la patogenicidad y reaislamiento de los aislados de reovirus aviares en infecciones experimentales de pollos. Se utilizaron pollitos de un día, de madres libres de patógenos especificados (SPF) o de madres vacunadas con reovirus. La prueba en estos últimos pollitos, que dieron positivo para anticuerpos procedentes de la madre (MDA+) contra cepas clásicas de reovirus, sirvió para confirmar la capacidad novedosa en la vacunación de estos aislados virales. Los virus utilizados para las inoculaciones de exposición fueron aislados: SL11A823-1BE, SL11A823-2BE, SL11A0294-12 FR y SL10A1581-32 ES, que se aislaron y amplificaron como se ha descrito anteriormente. Las inoculaciones se aplicaron por vía oral para imitar la vía de infección natural o, como alternativa, por vía intramuscular, que se ha observado que es una vía aún más eficaz de inoculación de exposición.
2.1. Diseño experimental
Se marcaron pollitos SPF de 200 días, de ambos sexos, utilizando bandas de ala, y se pusieron en separadores de presión negativa,
a 20 pollitos por grupo. Los pollitos eran de la raza ponedora White Leghorn, disponían de alimento y agua ad libitum, y evidentemente no se incluyeron pollitos débiles o pequeños. Además, se extrajo sangre de 10 pollitos de la misma puesta para proporcionar muestras de suero para evaluar el estado de los anticuerpos.
Se administró una inoculación de exposición el mismo día de la colocación, y en total se utilizaron 10 separadores para albergar a los diferentes grupos: 2 separadores para cada uno de los inóculos con aislados de reovirus aviar, recibiendo un grupo una inoculación oral y el otro una intramuscular. Como control positivo se añadió un separador en el que los pollitos recibieron una inoculación de control con la cepa vacunal de reovirus vivo atenuado 1133 por vía intramuscular. Además, un separador albergaba un grupo de control negativo que recibió solo una inoculación simulada.
Todas las inoculaciones se administraron en una dosis de 0,1 ml por pollito y a 4,5 Log10 TCID50/pollito, tanto para la vía oral como para la intramuscular. Las diluciones de inóculo de virus se prepararon frescas y dentro de la hora previa a la administración, y se mantuvieron en hielo hasta su uso. Los inóculos sobrantes se usaron para la titulación por retroceso, para confirmar la dosis de inóculo que se había aplicado.
Se observó diariamente a todos los pollitos durante el transcurso del experimento por personal cualificado para detectar la aparición de signos clínicos de enfermedad u otras anomalías. Los animales que mostraban dolor o molestias se sacrificaron y se sometieron a un examen post mortem.
Los pollitos seleccionados se tomaron para el muestreo a los 3 y 10 días después de la inoculación, de modo que se recogieron muestras de sangre y tejido. A partir de la sangre se obtuvo suero, del que la mitad se utilizó para el reaislamiento del virus y la otra mitad para la determinación de anticuerpos. Los diversos tejidos (tendón, hígado y yeyuno) se utilizaron para homogeneización y reaislamiento de virus.
2.2. Resultados de los experimentos de confirmación de virulencia
Los pollitos de control negativo, o cualquiera de sus muestras, así como los sueros de los compañeros de puesta del día cero, no mostraron ningún signo de enfermedad o infección que pudiera ser relevante para el experimento. Además, el grupo de control positivo inoculado con la cepa vacunal de reovirus aviar 1133, mostró muestras de tejido (tendón, hígado) y suero positivas para el virus (a los 10 días p.i.) como era de esperar, de manera que el experimento fue válido.
La titulación por retroceso de las muestras de inoculación mostró que todas las inoculaciones estaban dentro de ± 0,2 Log10 TCID50 de la dosis prevista de 4,5 Log10 TCID50 por pollito.
2.2.1. Observaciones generales:
- Los reaislamientos virales de la sangre solo fueron positivos a los 3 días p.i., no a los 10 días p.i.
- Detección de serorrespuesta negativa a los 3 o 10 días p.i. para los aislados de campo, solo los inóculos de aislado 1133 se volvieron positivos para anticuerpos de Reo a los 10 días p.i. Aparentemente, los títulos de anticuerpos aún no eran suficientemente altos en este momento para permitir la detección mediante la prueba comercial de anticuerpos contra el reovirus aviar utilizada (Elisa de anticuerpo REO de IDEXX).
- La inoculación intramuscular hizo que muchas más muestras fueran positivas para el reaislamiento del virus que la inoculación oral, para todos los aislados de virus probados, y tanto a los 3 como a los 10 días p.i.
- Todos los aislados de campo fueron virulentos tanto por vía oral como por vía i.m. Los signos clínicos observados fueron depresión y retraso del crecimiento, cojera en la pata inoculada o inmovilidad completa. También se observó con frecuencia inflamación intestinal y necrosis hepática. Ocasionalmente incluso se observó mortalidad en los animales de prueba: para el aislado SL11A823-2 BE (grupo genotípico 1) por vía oral, y para el aislado SL10A1581-32 ES (grupo genotípico 3) por vía i.m.
- Aunque la cepa 1133 demostró una preferencia por el tendón, los aislados de campo se volvieron a aislar en cantidades más altas a partir de hígado o yeyuno; el reaislamiento más alto en general se obtuvo para cada uno de los aislados de campo del yeyuno a los 7 días p.i.
3. Aislamiento de ácido nucleico, amplificación y secuenciación de ADN
Se utilizó sobrenadante de cultivo de un segundo o tercer pase de aislamiento para aislar el ARN viral total del reovirus aviar. Esto se utilizó para preparar y amplificar ADNc, que luego podría usarse para la secuenciación del ADN. Se aplicaron métodos y condiciones estándar para todos los procedimientos, empleando kits comerciales y equipos de laboratorio automatizados.
En resumen: el aislamiento de ARN viral se realizó en muestras de 200 μl de sobrenadante de cultivo, utilizando el MagNA Pure™ 96 (Roche). Este equipo aplica la lisis de la muestra y aísla el ácido nucleico utilizando perlas magnéticas. A continuación, el ácido nucleico eluido se utilizó para preparar la primera cadena de ADNc, por transcripción inversa con el kit de síntesis de primera cadena SuperScript™ III (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los cebadores utilizados, específicos para el gen SigmaC del reovirus aviar, fueron:
REO FW1: 5'- AGTATTTGTGAGTACGATTG - 3' (SEQ ID NO: 19)
REO REV5: 5'- GGCGCCACACCTTAGGT - 3' (SEQ ID NO: 20)
De modo que el cebador REO FW1 se une cadena arriba del gen SigmaC (ubicación aproximada en el segmento del genoma del reovirus aviar S1: nucleótidos 533-552) y el cebador REO REV5 se une al extremo 3' del gen SigmaC (ubicación aproximada del segmento S1: 1621-1605); esto hace que no se hayan determinado los penúltimos nucleótidos cadena abajo del gen SigmaC. El cebador REO FW1 se utilizó para la síntesis de la primera cadena y los dos cebadores, FW1 y REV5, se utilizaron para las reacciones de secuenciación y amplificación por PCR. Estos cebadores podían utilizarse para muestras de reovirus aviar de todos los grupos genotípicos, sin embargo, ocasionalmente, el cebador inverso no fue suficientemente eficaz, de modo que para algunas muestras de reovirus aviar se diseñaron y utilizaron cebadores adicionales, para amplificar aún más el ácido nucleico viral.
Después de la síntesis de ADNc, se amplificaron muestras por PCR, utilizando los cebadores FW1 y REV5 a una concentración final de 0,4 μM en muestras de 50 μl con 2 μl de muestra de ADNc, utilizando la mezcla maestra y la polimerasa de ADN de alta fidelidad Phusion™ (Thermo Scientific). Las condiciones de PCR utilizadas fueron: 60 s a 98 °C; 35 ciclos de: 10 s a 98 °C, 30 s de 58 °C y 30 s de 72 °C; seguido de 10 min a 72 °C.
La preparación de ADNc se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa en un gel de agarosa al 1 % (Hispanagar), que contiene bromuro de etidio, y por comparación con un carril de marcador Smartladder™ (Eurogentec) de 200-10.000 pb. Se obtuvieron rutinariamente bandas de gel de aproximadamente 1,1 kpb, lo cual es ilustrativo de la amplificación exitosa del gen SigmaC del reovirus aviar.
Las muestras de PCR positivas para una banda de 1088 pb se purificaron con el kit de purificación de PCR QIAquick™ (Qiagen). A continuación se midió la concentración de a Dn en un espectrofotómetro NanoDrop™ (Thermo Scientific). Normalmente se obtuvieron entre 10 y 40 ng/μl de ADNc viral.
La determinación de la secuencia de ADN se realizó utilizando un equipo de secuenciación de ciclos automatizado y se ensamblaron las lecturas de la secuencia, se alinearon y se analizaron utilizando un programa informático, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen: se realizó un primer ciclo de PCR de secuenciación con 20 a 70 ng de ADNc viral (típicamente 1 o 2 μl de la muestra de ADNc viral amplificada por PCR purificada) y 0,5 μM del cebador FW1 o REV5 en 20 μl por reacción, utilizando el kit de secuenciación de ciclos Big Dye™ Terminator (Applied Biosystems). El programa de PCR de secuenciación fue: 25 ciclos de: 10 s a 96 °C, 5 s a 50 °C y 2 min a 60 °C. A continuación, las muestras se mantuvieron a 15 °C hasta su análisis.
A continuación, las muestras de PCR de secuenciación se purificaron con el kit Dye Ex™ Spin (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y las muestras se conservaron a 4 °C hasta que comenzó la ronda de secuenciación.
La secuenciación del ADN se realizó mediante electroforesis capilar utilizando un ABI 3500 Genetic Analyzer™ y el programa informático correspondiente (Applied Biosystems). A continuación, los datos de la secuencia se analizaron utilizando el programa informático Sequencher™ v.54 (Gene Codes Corp.).
Algunas ambigüedades en las secuencias ensambladas pudieron resolverse mediante el uso de cebadores adicionales, que hibridaban con regiones internas del gen SigmaC, para proporcionar lecturas solapantes adicionales.
4. Alineaciones de secuencias y filogenia
Se analizaron las secuencias de aminoácidos de la proteína SigmaC del reovirus aviar, tanto de aislados de campo secuenciados como se ha descrito anteriormente como de bases de datos públicas. Las secuencias de aminoácidos se alinearon usando una combinación de programas, tales como: SIAS (http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html) para múltiples alineaciones de secuencias por pares y MEGA6 (supra) para la recopilación de resultados y la filogenia. Las alineaciones se verificaron mediante alineaciones uno a uno usando BlastP (supra), y las puntuaciones de este programa fueron decisivas para atribuir un grupo genotípico a una secuencia viral.
En varios de los aislados del brote de reovirus aviar, más o menos los últimos 30 ácidos nucleicos de la región 3' del gen que codifica la proteína sigmaC no se pudieron determinar con confianza, ya que estas bases siguieron directamente al cebador de PCR cadena abajo. Además, para varias de las secuencias de las bases de datos públicas faltaba información sobre el extremo C de la proteína sigmaC. De manera que para optimizar el solapamiento en las alineaciones, no se utilizó en estos análisis el extremo C de la secuencia de aminoácidos de la proteína sigmaC. Sin embargo, esto no parecía afectar a la fidelidad de la agrupación, como también ha señalado Kant et al. (supra): el uso de una secuencia de aminoácidos de la proteína sigmaC menos que completa todavía podría proporcionar una agrupación fiable. De forma similar, una ambigüedad de secuencia ocasional no obstaculizó el análisis.
Los alineamientos se realizaron utilizando los aminoácidos 1-277 de la proteína SigmaC cuando fue posible; en los análisis no se incluyeron secuencias que eran mucho más cortas. Se seguía incluyendo una secuencia un poco más corta, tal como ISR-5223, ya que proporcionaba una asociación con la agrupación genotípica del tipo de la técnica anterior.
Las puntuaciones de alineación se redondearon a números enteros, en línea con los resultados de puntuación proporcionados por el programa BLAST. Sin embargo, esto significa que estos números tienen una precisión de hasta el 0,49 %, que sobre una longitud de 277 aminoácidos corresponde a 2 aminoácidos.
Las tablas que describen las diversas secuencias analizadas y su agrupación se presentan en la sección de Tablas a continuación, y las representaciones gráficas de la filogenia de los cinco grupos genotípicos se presentan en las Figuras. De las muchas muestras de campo probadas, aquí solo se reproduce un número seleccionado de muestras relevantes y representativas: La Tabla 1 describe las más relevantes de estas muestras de campo, y se hizo una selección adicional para aquellas cuya secuencia completa de aminoácidos se presenta en la lista de secuencias adjunta, véase la Tabla 2. En la Tabla 3 se enumeran las más relevantes de las secuencias disponibles públicamente, con sus correspondientes números de registro de la base de datos y su agrupación de genotipo anterior.
La Tabla 4 presenta, en varias secciones, los resultados de alineaciones múltiples por pares de secuencias de aminoácidos de SigmaC de reovirus aviar para los diferentes grupos genotípicos; la secuencia de aminoácidos de la cepa de referencia del grupo genotípico se alineó con las secuencias enumeradas. Los resultados están expresados en porcentaje de identidad de aminoácidos y se presentan para miembros representativos del (sub)grupo genotípico, así como para las cepas de referencia de los demás grupos genotípicos. De estas alineaciones, se dedujeron los valores de corte que sirven para caracterizar los diferentes grupos genotípicos como se definen en el presente documento.
5. Purificación de placas de aislados de campo
Para dos de las cepas novedosas de reovirus aviar, se realizó el aislamiento de placas para obtener un aislado viral clonalmente puro para los estudios de vacunación. Estos fueron los aislados: SL11A823-1BE y: SL11A823-2BE, pertenecientes respectivamente a los grupos genotípicos: 4 y 1. Esto se hizo usando aislamiento estándar de placas virales en células CEL en cápsulas de cultivo de tejidos en agar. En resumen: se prepararon diluciones de los dos aislados de virus, hasta 1x10A-8. A continuación, se inocularon cápsulas de cultivo celular de 6 cm de diámetro con 1 ml de células CEL a 5x10A6 células/ml, 1 ml de dilución viral y 3 ml de medio de cultivo estándar con FCS y antibióticos. Las cápsulas se incubaron durante la noche. Al día siguiente se descartó el medio sobrenadante y la monocapa se lavó dos veces con PBS. A continuación, las cápsulas recibieron un recubrimiento de agarosa de 5 ml de una mezcla 1:1 de: bacto agar disuelto al 2,25 % en agua destilada a 49 °C, y medio de cultivo 2x a 37 °C. Las placas se incubaron durante 4 días y se tiñeron con rojo neutro: a cada cápsula se le suministraron 2 ml de una solución de rojo neutro al
0,04 % v/v en PBS. Se incubó durante 6 horas, después de lo cual eran visibles las placas virales.
Para cada aislado viral, se recogieron varias placas individuales de una cápsula con placas claramente separadas procedentes de diluciones altas. Las placas se recogieron en 0,5 ml de PBS. A continuación, cada aislado de placa se sometió a una ronda de amplificación en células CEL en un matraz de cultivo T25.
Los aislamientos de placa se repitieron durante dos rondas más utilizando 0,1 ml del amplificado de placa de la ronda anterior, hasta un total de tres rondas de purificación de placa; siempre se incluyeron cápsulas y matraces de control negativo.
A continuación, los aislados de reovirus aviar purificados en placa de la tercera ronda se amplificaron en células primarias de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) en matraces de cultivo tisular más grandes; las células CEF se prepararon prácticamente de la misma manera que las células CEL, con la excepción de que se utilizaron embriones completos para la tripsinización. Las amplificaciones produjeron grandes volúmenes de soluciones de reserva de virus de alto título para su uso posterior; rutinariamente se obtuvieron títulos de 7 - 8 Log10 TCID50/ml.
6. Preparación de vacunas
Los aislados de reovirus aviar purificados en placa se amplificaron adicionalmente para la producción de vacunas experimentales. Para ello, los virus se propagaron en células Vero, se recogieron los sobrenadantes del cultivo, se inactivaron con formaldehído, y el antígeno viral inactivado se utilizó para la emulsión con un adyuvante de aceite mineral en una vacuna de emulsión de agua en aceite. En resumen: se sembró una suspensión de células Vero a 1x10A5 células/ml en frascos rodantes de 1750 cm2 con 500 ml de medio de cultivo estándar con un 5 % de FCS y antibióticos. Los frascos rodantes se inocularon con 1 ml de aislados de reovirus aviar SL11A823-1BE o SL11A823-2BE amplificados y purificados en placa, y se incubaron a 37 °C mientras rodaban.
Después de 5 a 6 días, se observó un 100 % de cpe y se recolectó el sobrenadante del cultivo. Se añadió formalina diluida al sobrenadante del cultivo hasta una concentración final del 0,2 % v/v. Esta mezcla se dejó inactivar durante 48 horas a 37 °C, mientras se agitaba a 200 rpm.
Después de la inactivación, los antígenos del reovirus aviar se concentraron aproximadamente 20 veces por ultrafiltración. A escala de laboratorio esto se realizó utilizando un dispositivo de filtro centrífugo Centriprep™ (Millipore) con una membrana de corte de 10 kDa: se centrifugaron muestras de 15 ml de volumen durante 40 minutos a 3000xg a 20 °C. El antígeno viral concentrado se conservó refrigerado a 2-8 °C hasta su uso posterior.
Se preparó una vacuna con adyuvante combinando materiales antigénicos de reovirus aviar con una fase oleosa. La fase acuosa se había preparado agitando asépticamente agua para inyección con el antígeno viral concentrado. La fase oleosa contenía parafina líquida como aceite mineral y emulsionantes que (a escala de laboratorio) se homogeneizaron con el aceite utilizando un Ultra Turrax™ (IKA), a continuación, la fase oleosa se esterilizó por filtración a través de un filtro de nailon Ultipor™ de 0,2 μm (Pall). A continuación, las fases oleosa y acuosa se emulsionaron con Ultra Turrax, en tandas de unos minutos para evitar calentar la mezcla por encima de los 40 °C. A continuación se comprobó la homogeneidad mediante microscopía óptica. Esto se repitió hasta que todas las vesículas de agua fueron menores de 3 μm.
A continuación, la vacuna preparada se dispensó en frascos estériles etiquetados en condiciones asépticas, los frascos se cerraron con tapones de caucho de nitrilo y se sellaron con una tapa de aluminio codificada. El producto de vacuna final se conservó refrigerado hasta su uso.
De esta manera, se prepararon vacunas de reovirus aviar de acuerdo con la invención. Para una dosis de vacuna de 0,5 ml por pollo, la vacuna se preparó para contener un 1 % v/v por ml (sobre el volumen final de la vacuna emulsionada) de antígeno viral de s L11A823-1BE (a 8,32 Log10 TCID50/ml) y un 2 % v/v de SL11A823-2BE (a 6,45 Log10 TCID50/ml). Las vacunas de control no contenían antígeno viral o solo contenían uno de estos dos antígenos virales.
Se prepararon vacunas similares para servir como ejemplos comparativos, que contenían otros antígenos de reovirus aviar: las cepas vacunales "clásicas" 1733 y 2408, como vacuna multimérica de un solo grupo genotípico; o una combinación de las cepas 1733, 2408 y ERS, que contenían antígenos de los grupos genotípicos 1 (en dos veces) y 5. Las cantidades de antígeno utilizadas para estas vacunas comparativas fueron las mismas que en las vacunas comerciales actuales y se midieron en unidades Elisa arbitrarias frente a una referencia estándar conocida.
7. Experimentos de exposición a la vacunación
Las vacunas de agua en aceite preparadas como se ha descrito anteriormente se utilizaron en ensayos de exposición a la vacunación en animales. En una serie de experimentos, se vacunaron gallinas ponedoras con una vacuna de acuerdo con la invención, basándose en material antigénico de reovirus aviar de los grupos genotípicos 1 y 4, mientras que su descendencia se sometió, mediante inoculación de exposición, a una infección grave con reovirus aviar de
diferentes grupos genotípicos, para demostrar las propiedades protectoras de amplio espectro y de protección cruzada de tales vacunas, a la infección por virus de exposición homólogos y heterólogos.
7.1. Diseño experimental
7.1.1. Vacunación de los progenitores
Se asignaron pollos de raza ponedora SPF sanos normales a 8 grupos de 12 pollos cada uno. Los pollos eran de la raza ponedora White Leghorn, de aproximadamente 32 semanas de edad, y a cada grupo de 12 gallinas se le añadió un gallo.
Las gallinas se vacunaron con una dosis (0,5 ml) de la vacuna de agua en aceite como se ha descrito anteriormente, por vía intramuscular en el músculo pectoral derecho. Los gallos no se vacunaron para proporcionar muestras de suero de control negativo. A partir de las cinco semanas después de la vacunación, los huevos se recogieron diariamente para los posteriores experimentos de exposición e inoculación en la descendencia. Los huevos se conservaron a 4 °C hasta su uso.
Todos los pollos se alojaron en instalaciones de contención, con entradas y salidas de aire filtrado con Hepa. Se proporcionó disponibilidad ad libitum de pienso estándar para pollos y agua corriente.
Los pollos se asignaron a los grupos a medida que llegaron, aunque a cada grupo de gallinas se le proporcionó un gallo. Los pollos se marcaron individualmente usando bandas en las alas o etiquetas ligeras.
Todos los pollos se colocaron una semana antes de la vacunación para su aclimatación y fueron observados diariamente por personal cualificado durante el transcurso del experimento para detectar la aparición de signos clínicos de enfermedad u otras anomalías.
Calendario de vacunación de los progenitores:
Grupo 1: vacuna: antígeno SL11A823-1BE
Grupo 2: vacuna: antígeno SL11A823-2BE
Grupo 3: vacuna: antígeno SL11A823-1BE y antígeno SL11A823-2BE
Grupo 4: vacuna simulada (que no contiene antígeno de reovirus aviar)
Grupo 5: vacuna "clásica" de reovirus aviar: antígenos de las cepas 1733 y 2408 (vacuna similar a la vacuna comercial Nobilis® Reo Inac).
Grupo 6: vacuna "clásica" de reovirus aviar (antígenos de las cepas 1733 y 2408) con antígeno de la cepa ERS Gallos: sin vacuna
7.1.2. Inoculación de exposición de la descendencia
Este experimento sirvió para probar la protección en la descendencia de progenitores vacunados, por su capacidad de superar una infección grave por reovirus aviar, incluso cuando el virus de exposición era de un grupo genotípico diferente al virus de la vacuna. Debido a la escala y el tamaño, esto se realizó en dos experimentos consecutivos, una inoculación de exposición de prueba con aislados SL11A294-12 FR (grupo genotípico 2) y SL10A1581-32 ES (grupo genotípico 3) y, dos semanas después, en la nueva descendencia de los mismos progenitores, una serie adicional de inoculaciones de exposición usando los aislados: SL11A823-1 BE (grupo genotípico 4) y SL11A823-2 BE (grupo genotípico 1).
Para estos dos experimentos, se incubaron los huevos recolectados del experimento de vacunación de los progenitores, divididos por sus grupos de tratamiento de los progenitores, en incubadoras de eclosión estándar hasta la eclosión el día 21. Los pollitos de un día (de ambos sexos) se reunieron y se marcaron utilizando bandas de ala. No se incluyeron pollitos evidentemente débiles o pequeños. De cada grupo de tratamiento de progenitores, se extrajo sangre a 10 pollitos para proporcionar muestras de suero para probar el estado inicial de MDA de los pollitos. Después, los pollitos se dividieron colocándolos en separadores de presión negativa separados, de modo que de cada grupo de tratamiento de progenitores había un separador que contenía 24 - 30 pollitos. El pienso y el agua se proporcionaron ad libitum.
La inoculación de exposición se administró el mismo día de la colocación: se utilizó un tipo de virus de exposición por separador, de modo que la mitad de los pollitos recibieron la exposición por vía oral y la otra mitad por vía intramuscular. Se extrajo sangre de los pollitos para la recolección de muestras de sangre a los 3 o 10 días p.i.
Las inoculaciones de exposición se administraron en una dosis de 0,1 ml con 4,5 Log10 TCID50/pollito, para cada uno de los cuatro virus de exposición probados, y se inoculó por vía intramuscular (i.m.). Las diluciones de virus de exposición se prepararon frescas y dentro de la hora previa a la administración, y se mantuvieron en hielo hasta su uso. Los inóculos sobrantes se usaron para la titulación por retroceso, para confirmar la dosis de inóculo que se había aplicado.
Se observó diariamente a todos los pollitos durante el transcurso del experimento por personal cualificado para detectar la aparición de signos clínicos de enfermedad u otras anomalías. Los animales que mostraban dolor o molestias se sacrificaron y se sometieron a un examen post mortem.
7.2. Análisis de muestras
Se tomaron muestras de sangre de los progenitores a las 2 y 4 semanas después de la vacunación, así como 1 semana antes de la vacunación (día 0). Se tomaron muestras de sangre de la descendencia al inicio del experimento y a los 3 o 10 días p.i.
Las muestras de sangre se transportaron al laboratorio a temperatura ambiente. Después de la coagulación a temperatura ambiente, se recogió suero. Para la descendencia: la mitad del suero se conservó a -70 °C para el aislamiento del virus; las muestras de suero restantes se inactivaron con calor durante 30 minutos a 56 °C y, posteriormente, se conservaron a -20 °C hasta su uso.
La detección de anticuerpos contra el reovirus aviar en el suero se realizó utilizando el Elisa de anticuerpo REO de IDEXX, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La validez de los experimentos se determinó basándose en la ausencia de anticuerpos en los progenitores contra el reovirus aviar en las muestras del día 0 y en las muestras de control negativo.
La descendencia de las gallinas vacunadas fue MDA+ contra reovirus aviar, dependiendo del tratamiento de sus progenitores.
El suero para el reaislamiento del virus se había obtenido después de la coagulación de la muestra de sangre, y esta se congeló a -70 °C sin tratamiento adicional. Cuando se probaron estas muestras, las células CEL se habían sembrado en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos, a 2 ml por pocillo con 1x10“6 células/ml, en medio de cultivo estándar con un 5 % de FCS y antibióticos. Esto se incubó durante la noche para formar una monocapa. Al día siguiente, se eliminó el sobrenadante del cultivo y se reemplazó con 4 ml de medio estándar sin FCS. Los pocillos se inocularon con 40 μl del suero de prueba y se incubaron durante 5 días. Después se inocularon 100 μl del sobrenadante del pocillo en pocillos de una placa nueva de 6 pocillos con monocapa de CEL, y se incubaron nuevamente durante 5 días. A continuación, se juzgó el cpe específico del reovirus aviar mediante microscopía óptica. Como las muestras negativas seguían siendo negativas incluso después de un tercer pase, los dos pases se utilizaron como patrón.
7.3. Resultados de los experimentos de exposición a la vacunación
7.3.1. Controles
Como todas las muestras de control positivas y negativas obtuvieron la puntuación esperada, el experimento se consideró válido.
7.3.2. Método de evaluación de resultados
En la evaluación de los resultados de los experimentos sobre la vacunación de los progenitores y la exposición de la descendencia, se analizaron y compararon las numerosas muestras recolectadas a lo largo del experimento. Se obtuvo suero y se analizó para anticuerpos y reaislamiento de virus; en cuanto a la serología, se observó que el período de medición de 3 a 10 días no era lo suficientemente largo para dar resultados positivos claros. El reaislamiento positivo del virus a partir del suero fue un indicador de una viremia activa de reovirus aviar, y se observó que el reaislamiento del virus del suero recolectado 3 días después de la inoculación intramuscular daba una imagen clara del efecto de los diferentes tratamientos. De esta manera, se pudo determinar qué vacunación de los progenitores podía reducir la infección del virus de exposición, reovirus aviar, en la descendencia.
Para el grupo de tratamiento que recibió la exposición i.m. y del que se recolectó suero a los 3 días p.i., estuvo disponible el suero de 5 pollos por grupo (en un grupo, solo 4) para el reaislamiento del virus. Como corte, se consideró que los grupos que tenían 3 o más animales positivos para el reaislamiento del virus en suero tomado a los 3 días p.i. no mostraban una reducción de la infección por el virus de exposición; 2 animales positivos se consideraron dudosos; se consideró que cero o 1 positivo mostraba una reducción de la infección. Los resultados se muestran en la Tabla 5, en la que se indica si se inducía (SÍ), o no (NO), la reducción de la infección por la cepa de exposición de reovirus aviar en la descendencia por las diferentes vacunaciones de los progenitores. Entre paréntesis se indica la base para esa conclusión por el número de pollitos del total probado, para lo cual la muestra de suero tomada a los 3 d. p.i. fue positiva para reovirus aviar según lo determinado por la lectura de cpe después de dos pases en células CEL.
7.3.3. Análisis de los resultados
Como se presenta en la Tabla 5, para todos los pollitos procedentes de progenitores vacunados de forma simulada
(grupo de prueba de vacunación 4), se pudo reaislar el reovirus aviar del suero extraído el día 3 después de la inoculación, y esto ocurrió para todos los virus de exposición aplicados. Esto indicó que el virus de exposición se había replicado sin obstáculos en los pollitos y, en consecuencia, que los pollitos no habían sido protegidos por factores transferidos de sus progenitores (vacunados de forma simulada). Los signos clínicos no eran demasiado aparentes, ya que los pollos utilizados aquí eran de raza ponedora, que son menos sensibles que los pollos más pesados tales como los pollos de engorde. No obstante, se observaron claras diferencias en la eficacia de la vacunación.
Los progenitores del grupo de prueba 5 recibieron una sola vacuna con una vacuna que contenía material antigénico de dos cepas de reovirus aviar "clásico": cepas 1733 y 2408, para imitar a una vacuna del grupo genotípico 1 amplio. Esta vacuna indujo en la descendencia una reducción significativa de la infección por el virus de exposición reovirus aviar perteneciente a los grupos genotípicos 1 o 2 como se define en el presente documento. Sin embargo, no se indujo ninguna reducción de la infección contra el virus de exposición reovirus aviar de los grupos genotípicos 3 o 4.
Notablemente, los progenitores del grupo de prueba 6 no proporcionaron a su descendencia una protección más amplia que la que ya proporcionada por el material antigénico del grupo genotípico 1 utilizado para la vacunación del grupo de prueba 5. Esto ocurrió aunque la vacuna utilizada para el grupo 6 tenía material antigénico de reovirus aviar adicional: de la cepa ERS (cepa ERS que pertenece al grupo genotípico 5 como se define en el presente documento). Esto muestra que aparentemente no hay una ampliación automática de la protección obtenida mediante el uso de vacunas que contienen material antigénico de reovirus aviar de más de un solo grupo genotípico.
Las vacunas utilizadas para los grupos de prueba 1 o 2 contenían material antigénico de reovirus aviar del grupo genotípico 1 o 4 (respectivamente). Los progenitores de estos grupos de prueba proporcionaron protección total a su descendencia contra la replicación del virus de exposición reovirus aviar que era del mismo genotipo que la cepa de la vacuna. Sin embargo, no se indujo protección de amplio espectro o heteróloga, ya que estas vacunas no redujeron la infección por reovirus aviar de un grupo genotípico que era diferente de su propio grupo genotípico.
Sin embargo, sorprendentemente, se observó que se obtenía un fuerte efecto sinérgico con la combinación de material antigénico de reovirus aviar de los grupos genotípicos 1 y 4: los progenitores que recibieron la vacuna del grupo de prueba 3, que combinaba material antigénico de los grupos genotípicos 1 y 4 de reovirus aviar (como se define en el presente documento) proporcionaron protección de amplio espectro a su descendencia: los pollitos de estos progenitores pudieron reducir significativamente la infección de todas las cepas de exposición de reovirus aviar probadas, tanto homólogas como heterólogas, en la vacuna aplicada y tras una única vacunación.
Tablas
Tabla 1: Li i l r m r vir vi r m n i n n l mplos
continuación
Tabl 2: D ri i n l n i r n n l li ncias
T l : Li ^ r vir vi r l ni n ri r m n i n n l m l
continuación
Tabla 4: Alineaciones múltiples por pares de secuencias de aminoácidos de SigmaC de reovirus aviar.
continuación
continuación
Tabla 5: Resultados de la vacunación - ex erimentos de ex osición
Leyenda de las figuras
Figuras 1-6:
Árboles filogenéticos de alineaciones de secuencias de aminoácidos de proteínas sigmaC de reovirus aviares representativos que se analizaron y compararon en los Ejemplos, para todos los (sub)grupos genotípicos. Los árboles se dibujaron usando MEGA6, calculando primero las puntuaciones de alineación por pares y luego dibujando árboles sin raíz usando el método Neighbour-Joining (Saitou N. & Nei M., 1987, Mol. Biol. y Evol., vol. 4, p. 406-425). La barra de escala indica la distancia genética relativa.
Figura 1: Subgrupo genotípico 1 A
Figura 2: Subgrupo genotípico 1 B
Figura 3: Grupo genotípico 2
Figura 4: Grupo genotípico 3
Figura 5: Grupo genotípico 4
Figura 6: Grupo genotípico 5
Claims (5)
1. Vacuna para reducir la infección por reovirus aviar, comprendiendo la vacuna material antigénico de reovirus aviar derivado de reovirus aviares de más de un solo grupo genotípico y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el material antigénico de reovirus aviar consiste en reovirus aviares inactivados de cada uno de dos grupos genotípicos: grupo genotípico 1 y grupo genotípico 4; en donde un reovirus aviar que pertenece al grupo genotípico 1 contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1; en donde un reovirus aviar que pertenece al grupo genotípico 4 contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4; y en donde la vacuna comprende un adyuvante.
2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el reovirus aviar inactivado del grupo genotípico 1 es un reovirus aviar del subgrupo genotípico 1B; en donde un reovirus aviar se clasifica como perteneciente al subgrupo genotípico 1B cuando ese reovirus aviar contiene información genética que codifica una proteína sigmaC que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 78 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1.
3. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la vacuna comprende material antigénico adicional que deriva de un microorganismo patógeno para un ave, pero no de un reovirus aviar.
4. Un método para la preparación de una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende la etapa de inactivar el reovirus aviar de cada uno de los dos grupos genotípicos: grupo genotípico 1 y grupo genotípico 4, ambos como se define en la reivindicación 1.
5. Un método para la preparación de una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende la etapa de mezclar material antigénico de reovirus aviar como se define en las reivindicaciones 1 o 2 con un adyuvante.
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