ES2567712T3 - Nuevos Astrovirus aviares - Google Patents

Abstract

Astrovirus aviar que tiene una region genomica de fase de lectura abierta (ORF) 1a, caracterizada por que la ORF 1a de dicho Astrovirus aviar, cuando se compara con la ORF 1a del virus de la nefritis aviar 1, contiene una insercion de 12 nucleotidos, estando localizada dicha insercion entre los nucleotidos correspondientes a los nucleotidos numerados 2485 y 2486 de la SEQ ID NO: 1.

Description

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DESCRIPCION

Nuevos Astrovirus aviares

La presente invention se refiere a los cambios de la virologia y la inmunolog^a veterinaria. En particular, la invention se refiere a un nuevo Astrovirus aviar; a anticuerpos o fragmentos de los mismos contra el nuevo virus; a preparaciones antigenicas, proteinas, y moleculas de ADN del nuevo Astrovirus aviar; a vacunas del nuevo virus o sus preparaciones antigenicas, proteinas, o ADN; a metodos para la fabrication de dichas vacunas, y a kits diagnosticos.

Los Astrovirus son virus pequenos, redondos no envueltos que tienen un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo. La mayoria de los astrovirus se han asociado como causantes de algunos tipos de enteritis, dando lugar a diarrea, vomitos, mala absorcion, malestar general, y retraso del crecimiento. La infection puede ser letal en seres humanos o animales que sean menos resistentes, tales como jovenes, ancianos, o individuos inmunocomprometidos. Vease: Matsui y Greenberg (en: Fields virology, 3a ed., 1996, ed.: B. Fields et al., ISBN: 781702534, capitulo 26), y: Moser y Schultz-Cherry (2005, Viral Immunology, vol. 18, p. 4-10).

Asimismo, la gravedad de la patologia inducida por astrovirus puede variar como resultado de las diferencias en la virulencia entre especies o cepas de Astrovirus. Esto ha creado la creencia de que algunos de los Astrovirus actuan como patogenos secundarios, que por si mismos causan unicamente una enfermedad subclinica, mientras que los sintomas clinicos completos de enfermedad solo se manifiestan cuando hay causas adicionales de enfermedad a causa de otro patogeno.

El mecanismo mediante el que se logra inmunidad contra la infeccion por Astrovirus tampoco esta completamente claro; los anticuerpos neutralizantes de virus parecen desempenar un papel en la defensa y la memoria inmunologica, pero probablemente no son los unicos efectores de una respuesta inmunitaria contra la infeccion por Astrovirus. Esto se ha revisado por M. Koci (2005, Viral Immunology, vol. 18, p. 11-16).

Los Astrovirus se han detectado en todo el mundo y se han aislado de una gran variedad de animales. A su vez, entre las especies de Astrovirus que infectan a un determinado animal diana, se han descrito varios serotipos. Taxonomicamente, la familia Astroviridiae se divide en dos generos principales, los Astrovirus de mamifero: Mamastrovirus, y los Astrovirus aviares: Avastrovirus. Actualmente el genero Avastrovirus comprende las especies reconocidas formalmente: Virus de la nefritis aviar 1 y 2 (ANV1,2) (de pollo), y Astrovirus de pavo 1 y 2 (TAstV1,2).

Se han aislado varios Astrovirus aviares adicionales de patos, pollos, avestruces y pavos. Por ejemplo, el astrovirus de pollo 2 (CAstV2) ha sido descrito por Baxendale y Mebatsion (2004, Avian pathology, vol. 33, p. 364-370; y en la solicitud internacional de patente WO 2004/027053), y Todd et al. describieron un CAstV3 (documento WO 2007/077464), que esta estrechamente relacionado con CAstV2. Estos Astrovirus no se han clasificado aun formalmente, tal como se revisa por Koci y Schulz-Cherry (2002, Avian Pathology vol. 31, p. 213-227).

Los Astrovirus son muy estables en el ambiente, por ejemplo, pueden resistir a los disolventes de lipidos y detergentes comunes, tienen una amplia tolerancia de pH, y son comparativamente termoestables. Esto, combinado con su alta infectividad y facil transmision por la ruta fecal-oral, explica por que los Astrovirus o anticuerpos contra estos pueden encontrarse en muchos seres humanos y animales en todo el mundo.

La clasificacion y denomination de estos pequenos virus de ARN se ha sometido a cambios frecuentes, cuando se necesito su actualization para acomodar nuevos datos experimentales. Por ejemplo: el Astrovirus del pato (DAstV) se clasifico anteriormente como Picornavirus, y originalmente se denomino virus de la hepatitis del pato de tipo II, ya que provoca hepatitis. De manera similar, ANV1 se describio anteriormente como un Picornavirus, en particular un Enterovirus, pero se reclasifico entre los Avastrovirus (Imada et al., 2000, J. of Virology, vol. 74, p. 8487-8493). ANV1 tambien se denomina: Astrovirus de pollo 1 (CAstV1), y provoca nefritis.

La reclasificacion de estos virus se solicito tras la disponibilidad de nueva information de la secuencia y organization de su genoma viral. En particular para los Astroviridae, se demostro que las caracterizaciones fisicas, de microscopia electronica y bioquimicas a menudo no son suficientes para diferenciar los Astroviridiae de los otros conocidos como "virus redondos pequenos", o "virus similares a enterovirus", tales como Picorna-, Calici-, o Hepeviridae (virus similares a la hepatitis E), o incluso de virus de ARN envueltos, tales como Reo-, Rota-, o Coronavirus, que provocan sintomas de enfermedad que se asemejan en gran medida a los de los Astrovirus. Esto se debe a que los resultados de dichas caracterizaciones varian dependiendo del metodo y de las condiciones empleadas. Por lo tanto, estos no son lo suficientemente consistentes para hacer la determination correcta.

Por otra parte, la caracterizacion biologica molecular, tal como genotipado, en combination con la caracterizacion inmunologica es lo suficientemente detallada y reproducible para asignar a un microorganismo al grupo taxonomico adecuado (Van Regenmortel et al., 2000, en: Virus Taxonomy, 7th report of the ICTV, Academic Press, Nueva York). Por lo tanto, dichas determinaciones estan basadas, idealmente, en la secuenciacion de nucleotidos, ensayos de reaction en cadena de la polimerasa (PCR), y ensayos de tipado serologico.

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El genoma de ARN de los Astroviridiae es de aproximadamente 7 kb de tamano, con una organizacion del genoma que es tipica para esta familia de virus, vease: Jiang et al. (1993, PNAS-USA, vol. 90, p. 10539-10543) y Koci et al. (2000, J. of Virology, vol. 74, p. 6173-6177). De acuerdo con el conocimiento actual, el genoma incorpora tres fases de lectura abiertas (ORF) claramente reconocibles, de 5' a 3':

ORF 1a: es de aproximadamente 3 kb de tamano, codifica una proteina no estructural que tiene un motivo de serina proteasa.

ORF 1b: es de aproximadamente 1,5 kb de tamano, se solapa parcialmente con el ORF 1a, y codifica una ARN polimerasa dependiente de ARN no estructural.

ORF 2: codifica las proteinas virales estructurales, a traves de un ARN subgenomico de aproximadamente 2 kb.

La poliproteina expresada se escinde probablemente en partes mas pequenas antes del ensamblaje viral, y comprende a.o. la proteina de la capsida o la envoltura.

De las tres ORF, la ORF 1b tiene la secuencia de nucleotidos mas conservada comparada entre las secuencias de nucleotidos de los Astrovirus que estan disponibles publicamente, y la ORF 3 es la oRf mas variable en secuencia.

Se han observado algunos problemas de enfermedades entre 1987 y la actualidad, en las operaciones con aves de corral en los Paises Bajos, Alemania y los Emiratos Arabes Unidos, con pollos y pavos padeciendo diarrea, reduccion en la conversion de alimentos y el crecimiento, asi como problemas con la hinchazon y dolor de las articulaciones y tendones de las patas. Estos problemas se hallaron en aves de engorde, reproductoras y de mayor tamano, de diversas edades, y en diferentes granjas que no tenian aparentemente una conexion mutua.

Se observo cojera en los pajaros en su primera semana de edad, hasta varios meses de edad. Los animales presentaron corvejones (tobillos) y tendones inflamados de las patas, tanto rellenos con un liquido transparente ligeramente viscoso, como con sintomas de artritis. En estas aves se observo una reduccion de la utilizacion del alimento y del crecimiento, lo mas probablemente como consecuencia de problemas locomotores. En los peores casos, las aves ya no fueron capaces de moverse y por lo tanto de obtener alimento o bebida, dando como resultado mortalidad. Estas anomalias en las patas fueron mas prominentes en las aves de engorde mas pesadas, aunque el dano economico sostenido fue considerable en todos los tipos de aves.

La diarrea tuvo un impacto aun mayor que se observo, principalmente, en aves jovenes, pero tambien en aves en edad de puesta de huevos. Los sintomas variaron desde indigestion hasta enteritis evidente, y dieron como resultado la reduccion de la conversion de alimento; la reduccion del crecimiento o incluso perdida de peso; reduccion en la produccion de huevos ("puesta"); aumento en el numero de huevos de baja calidad; y mortalidad.

En algunas granjas estos problemas se observaron durante varios anos, dando como resultado datos sostenidos de mala produccion sin una causa definida.

Tras las investigaciones post mortem, se observo en varios casos que estaban afectadas partes del cuerpo distintas de los intestinos o las articulaciones de las patas, tal como se mostro por la erosion de la molleja o la inflamacion del higado.

Para detectar la causa de estos sintomas, se investigaron aspectos de la cria y la dieta pero estos no pudieron relacionarse con los problemas observados en estos casos. Tambien se investigaron patogenos que podrian ser responsables, en particular una infeccion por Reovirus, ya que se sabe que este virus causa mala absorcion y problemas en las articulaciones. Sin embargo, a pesar del uso de diversos ensayos, en muchos casos no pudieron detectarse Reovirus.

Tambien se investigaron otros diversos patogenos bien rutinariamente o especificamente al ser conocidos por causar problemas similares, tales como bacterias: Salmonella, Mycoplasma, Haemophilus, y Pasteurella; y los virus: Adenovirus, virus de la bronquitis infecciosa (IBV), virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), virus de la enfermedad bursal infecciosa (IBDV), sindrome de la puesta de huevos (EDS), y virus de la gripe aviar (AIV).

Hasta la actualidad, no pudo relacionarse un agente causal con los problemas en las patas e intestinales observados, a pesar de la gravedad, los problemas para el bienestar de los animales, y el consecuente mal rendimiento economico de estas operaciones con aves de corral.

Por consiguiente, existe una necesidad para identificar un agente relacionado con los sintomas de enfermedad observados y proporcionar vacunas y agentes diagnosticos, que proporcionen la prevencion de la enfermedad y la identificacion del agente causante.

Sorprendentemente, se ha descubierto un nuevo virus en pollos y pavos que padecen de enfermedad intestinal y locomotora. El virus pudo aislarse de aves enfermas de diversas edades, tipos y origenes, tanto de las articulaciones y tendones asi como de varios organos internos. El virus aislado, a su vez, indujo sintomas de enfermedad similares

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tras la infeccion de animales de ensayo sanos, y se pudo volver a aislar de los animales de ensayo enfermos, cumpliendo de este modo con los postulados de Koch.

El nuevo virus puede usarse para desarrollar ensayos diagnosticos y vacunas para detectar y combatir el virus y los problemas de salud que provoca en las aves de corral, en particular enfermedades de las articulaciones y tendones, asi como del tracto gastrointestinal.

El nuevo virus se analizo de diversas formas, y se identifico sorprendentemente como un Astrovirus. Debido a su prevalencia en pollos y pavos se califico a modo de tentativa como un Astrovirus aviar.

Entre muchas otras caracterizaciones, el hecho de que el nuevo virus, tal como se describe en el presente documento, no este envuelto se deduce de los resultados de dos extracciones consecutivas con cloroformo, tras las cuales la muestra de virus extraida todavia era capaz de provocar un efecto patogenico especifico en huevos SPF de pollo embrionados.

La presencia de un genoma de ARN en el nuevo virus se dedujo del hecho de que el acido nucleico usable para el analisis posterior solo pudo obtenerse extraccion de ARN y RT-PCR, no tras el aislamiento de ADN y PCR convencional.

Sorprendentemente, se observo que los parientes mas proximos (aunque distinguibles) eran los virus de tipo ANV1, por lo tanto, los nuevos Astrovirus aviares descritos en el presente documento representan un nuevo grupo de virus de la nefritis aviar, clasificados de manera tentativa como virus ANV3.

Sin embargo, los inventores han descubierto sorprendentemente una serie de caracteristicas que distingue a los nuevos Astrovirus aviares descritos en el presente documento de ANV y otros (Astro-) virus, y caracteriza de manera unica a los distintos aislados del nuevo Astrovirus aviar como pertenecientes a un grupo nuevo e independiente por si mismo.

El principal rasgo de caracterizacion se refiere a la presencia de una secuencia de nucleotidos especifica que es identificable por un analisis de secuencia de nucleotidos y mediante ensayo PCR.

Tambien se observaron sintomas patologicos distintos tras la infeccion de embriones. Las diferencias inmunologicas especificas fueron detectables mediante serotipado usando ensayos VN o IFT. Todos estos se describiran mas adelante con resultados y detalles experimentales.

La invencion se refiere a un nuevo Astrovirus aviar aislado que tiene una region genomica de fase abierta de lectura (ORF) 1 a, caracterizada por que la ORF 1 a de dicho Astrovirus aviar, cuando se compara con la ORF 1 a del virus de la nefritis aviar 1, contiene una insercion de 12 nucleotidos, estando localizada dicha insercion entre los nucleotidos correspondientes a los nucleotidos numerados del 2485 al 2486 de la SEQ ID NO: 1.

Los organismos "aviares" preferidos son aves de corral; los organismos aviares mas preferidos se seleccionan entre el grupo que consiste en pollos, pavos, patos y ocas. Los mas preferidos son pollos.

El termino "Astrovirus" indica la relacion del grupo de nuevos virus de acuerdo con la invencion con virus que actualmente se describen y/o caracterizan como pertenecientes a la familia taxonomica de los Astroviridiae. Sin embargo, el experto en la materia sera consciente de que dicha clasificacion taxonomica puede cambiar con el tiempo ya que nuevas revelaciones podrian dar lugar a la reclasificacion en grupos taxonomicos nuevos o distintos. Sin embargo, ya que esto no altera las caracteristicas del virus de acuerdo con la invencion, sino solo su clasificacion, dichos organismos reclasificados permanecen dentro del alcance de la invencion.

En particular, la invencion abarca todos los virus subclasificados a partir del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion en una subespecie, cepa, aislado, genotipo, serotipo, variante o subtipo y similares.

Por lo tanto, para la invencion, un "Astrovirus" es un virus que tiene los rasgos caracteristicos de un virus clasificado como Astrovirus. Dichos rasgos caracteristicos se relacionan, por ejemplo, con rasgos moleculares, bioquimicos, y biologicos; por ejemplo, con tener un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo que comprende ORF identificables como 1a, 1b y 2; siendo un virion no envuelto de aproximadamente 28-30 nm; y que provocan una enteritis.

Se entiende que la expresion "region genomica" indica una parte del material genetico del nuevo Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion. Dicha region consistira en acido nucleico; en el caso del nuevo Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, el acido nucleico es ARN.

El genoma del nuevo Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion comprende, al igual que todos los demas Astroviridiae, regiones reconocibles y correspondientes a las ORF 1a, 1b y 2.

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Sin embargo, sorprendentemente se descubrio que el nuevo Astrovirus aviar tiene algunos nucleotidos en su region genomica de ORF 1a que no estan presentes en la ORF 1a de ANV1 o de cualquier otro tipo de Astrovirus (aviar). Estos nucleotidos estan presentes en forma de una secuencia lineal y continua de 12 nucleotidos, y cuando se comparan con la secuencia de ORF 1a de ANV1 representa una insercion en esta region. La "insercion" de 12 nucleotidos estaba presente en la ORF 1a de todos los aislados ensayados del grupo de nuevos Astrovirus aviares descritos en el presente documento.

La localizacion en donde esta presente la insercion de 12 nucleotidos en la ORF 1a de los aislados de los nuevos Astrovirus aviares descritos en el presente documento, esta indicada por referencia a la numeracion tal como se describe para la secuencia genomica de la cepa de referencia de ANV1, que se describio por Imada et al. (2000, J. of Virology, vol. 74, p. 8487-8493). La secuencia de ADNc de la secuencia genomica de esta cepa de ANV1 tambien esta disponible a traves de la base de datos de nucleotidos de Internet de los American National Institutes of Health, conocida como GenBank, con el numero de referencia: AB033998, y esta representada en el presente documento como SEQ ID NO: 1.

Para todos los aislados de los nuevos Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, la insercion de 12 nucleotidos en la ORF 1a se localizo entre los nucleotidos correspondientes a los nucleotidos numerados del 2485 al 2486 de la SEQ ID NO: 1.

Actualmente no se sabe si, o como, esta insercion de 12 nucleotidos en la ORF 1a del nuevo Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, que no esta presente en la ORF 1a de ANV1, tiene influencia en el comportamiento de este nuevo Astrovirus aviar. Sin pretender quedar ligados a teoria alguna, los inventores asumen que el hecho de que exista la insercion de 12 nucleotidos, por lo tanto de 4 tripletes que mantienen el marco de traduccion de la ORF 1a intacto, hace que los 4 aminoacidos adicionales codificados se incorporen en las proteinas no estructurales que se expresan a partir de la ORF 1a. Es muy posible que esto influencie el comportamiento patobiologico de los virus, por ejemplo, su virulencia y su capacidad para provocar enfermedades del intestino asi como de las patas, articulaciones y tendones.

Sin embargo, el hecho de que estos 12 nucleotidos esten presentes en la region genomica ORF 1a de los nuevos Astrovirus aviares descritos en el presente documento, pero no en la ORF 1a de ANV1 u otros Astrovirus (aviares), proporciona un marcador genetico positivo para este nuevo grupo de virus.

Tal como se conoce bien en la tecnica, un marcador genetico es una caracteristica del material genetico de un organismo, situado en una determinada localizacion genomica, que es util para hacer una determinada distincion o correlation, y es detectable por medios quimicos. Cuando, como es el caso, una caracteristica esta presente en un grupo que se va a identificar, es un marcador genetico "positivo" para ese grupo.

La secuencia de nucleotidos de la insercion de 12 nucleotidos que caracteriza al nuevo Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, no es identica para todos los aislados del nuevo Astrovirus aviar descrito en el presente documento, aunque el tamano y la localizacion fueron identicos. El consenso de la secuencia de nucleotidos de la insercion de 12 nucleotidos es:

5'- TCYGGDMARYYT -3', representada en el presente documento como SEQ ID NO: 2.

Por lo tanto, en una realization preferida, la invencion se caracteriza por que la insercion de 12 nucleotidos tiene una secuencia de acido nucleico como la presentada en la SEQ ID NO: 2.

El experto en la materia sabra que la secuencia de la SEQ ID NO: 2 es una secuencia cebadora denominada "desnaturalizada", que indica que hay posiciones (en este caso: Y, D, M, y R), en donde puede estar presente uno de una serie de nucleotidos. El codigo usado comunmente para indicar las bases desnaturalizadas es el codigo IUPAC (publicado en Biochem. J., 1985, vol. 229, p. 281-286), en el que: R = G o A; Y = T o C; M = A o C; K = G o T; S = G o C; W = A o T; H = A, C, o T; B = G, T, o C; V = G, C, o A; D = G, A, o T; y N = G, A, T, o C.

Para el nuevo Astrovirus aviar descrito en el presente documento, la presencia de este marcador genetico detectable permite la identification del nuevo virus y su nuevo grupo mediante la detection por ejemplo, mediante secuenciacion de ADN o PCR.

La secuenciacion de ADN es una tecnica bien conocida; estan ampliamente disponibles protocolos y equipos convencionales, por ejemplo, para secuenciacion automatizada de alta velocidad. Mas comunmente, dichos protocolos emplean "secuenciacion dclica" basada en la PCR, seguidos de electroforesis de alta definition.

Para la secuenciacion del acido nucleico de virus de ARN, tales como Astroviridiae, el acido nucleico que se va a investigar tiene que estar en la forma de ADN copia (ADNc), ya que la secuenciacion de ARN aun no es factible. Para la preparation de ADNc hay disponibles muchos protocolos convencionales y kits comerciales. Dichos protocolos emplean una enzima transcriptasa inversa. Comunmente, se usa un cebador para iniciar el proceso de copiado.

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Un ejemplo de un cebador adecuado para la reaccion RT es el oligonucleotido de ADN presentado en el presente documento como SEQ ID NO: 3, siendo: 5'- TCG WTS CTA CYC -3'. Los inventores se refieren a este cebador como cebador 17.

Este cebador hibrida con la region 3' distante del genoma de muchos Astrovirus aviares, comenzando en el nucleotido correspondiente al numero de nucleotido 6731 de la SEQ ID NO: 1, y avanzando en direccion inversa.

En la figura 1 se muestra un alineamiento multiple de la secuencia de ADNc de una seccion de la ORF 1a de un numero seleccionado de aislados de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion. Estos se alinean con la parte correspondiente del genoma de un virus de referencia ANV1, segun se representa en la SEQ ID NO: 1. Tal como es claramente visible en el area recuadrada, todos los aislados poseen una region de 12 nucleotidos, que no esta presente en la ORF 1a de ANV1. Las SEQ ID NO de la secuencia de ADNc de la ORF 1a de los aislados del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion se listan en la tabla 1.

De manera similar, la figura 2 muestra un alineamiento multiple de las supuestas secuencias de aminoacidos, tal como se preparan mediante traduccion informatizada de las secuencias de ADNc listadas en la figura 1. Tal como es visible en el area recuadrada, la proteina codificada por la ORF 1a de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion contiene 4 aminoacidos que no estan presentes en la proteina codificada por la ORF 1a de ANV1. Las SEQ ID NO de la secuencia de ORF 1a traducida de los aislados de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion se listan en la tabla 1.

Con respecto a los aislados de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion: se recogio un gran numero de aislados de campo a lo largo del tiempo de pollos y pavos que padecian enfermedad en las patas y/o intestinos tal como se ha descrito anteriormente. Muchos de estos aislados se analizaron, lo que condujo a la invencion del nuevo grupo de Astrovirus aviares, tal como se describe en el presente documento. Sin embargo, en el presente documento solo se presenta una seleccion de todos los aislados analizados, para definir el nuevo Astrovirus aviar en el contexto de la variacion natural que sucede en ese grupo.

La tabla 1 presenta una descripcion de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, que se describen en el presente documento. Asimismo, la tabla 1 lista las SEQ ID NO de las secuencias de ADNc y de proteina putativas de las ORF 1a, 1b y 2 de una seleccion de aislados.

Tabla 1: Caracteristicas de una seleccion de aislados del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion; tambien las _____SEQ ID NO de las regiones de ADNc secuenciadas ("nt") y las proteinas putativas codificadas ("aa")._____

Numero de aislado

Animal donante: SEQ ID NO

especie

tipo edad tejido Orf 1a Orf 1b Orf 2

161319 "Aislado 19"

Pollo capa 36 s Traquea nt: 4 aa: 5 nt: 6 aa: 7 nt: 8 aa: 9

637

Pollo engorde 12 d Tendon y cartilago del corvejon nt: 10 aa: 11

686

Pollo engorde 10 d Varios organos nt: 12 aa: 13

714

Pollo engorde 30 d Amigdalas cecales nt: 14 aa: 15

715

Pollo engorde 30 d Amigdalas cecales nt: 16 aa: 17

1736

Pollo engorde -- Tendon y tibia nt: 18 aa: 19

2383

Pavo engorde -- Articulacion y fluido sinovial nt: 20 aa: 21

2388

Pavo engorde -- Tendon y tibia nt: 22 aa: 23

7279

Pollo — -- Pancreas nt: 24 aa: 25

161317

Pollo capa 36 s Traquea nt: 26 aa: 27

"nt" = secuencia de nucleotidos; "aa" = secuencia de aminoacidos; "--" = desconocido

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Puede obtenerse un aislado de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invention de aves que padecen problemas intestinales o en las patas tomando una muestra de uno o mas organos, o de las articulaciones o tendones de las patas. Las muestras pueden homogenizarse cuando sea necesario, y por ejemplo mezclarse con una solution tampon adecuada, preferentemente que contenga antibioticos.

Para amplificar el titulo viral de dichos aislados, pueden usarse diferentes sustratos, tales como lineas celulares aviares o huevos de aves embrionados. Cuando se usan huevos, la suspension puede inocularse en su interior y cultivarse en huevos de aves embrionados. Son posibles diferentes rutas de inoculation, tales como la membrana corio-alantoica (CAM), o dentro del saco vitelino, o la cavidad del fluido alantoico. Preferentemente, las primeras rondas de inoculacion son en el interior del saco vitelino, y las posteriores (en caso necesario) pueden ser en el fluido alantoico. Pueden usarse huevos SPF de pollo embrionados de 5-7 dias de edad. Dichas tecnicas se conocen bien por los expertos en la materia, y hay disponibles comercialmente huevos SPF de pollo de la calidad y edad adecuada, por ejemplo, de Spafas® o Lohmann®.

Despues de incubation durante 2 - 7 dias en condiciones adecuadas, pueden recogerse el embrion, la CAM, o (preferentemente) el fluido alantoico. En caso necesario, pueden efectuarse rondas adicionales de amplification en huevos, mediante inoculacion en el saco vitelino o el fluido alantoico. Finalmente, puede recogerse fluido alantoico que contiene altas cantidades del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion.

Para la secuenciacion por PCR de ambas hebras de una parte representativa de la ORF 1a pueden usarse convenientemente los siguientes cebadores:

SEQ ID NO: 28: 5'- AAA GGK AAG ACD AAG ARR RAC MG -3', y

SEQ ID NO: 29: 5'- TCG CCT TCT GGA AGG TCT TCA -3'.

Los inventores hacen referencia a estos cebadores de secuenciacion como cebadores F-II y R-II-3, respectivamente. La SEQ ID NO: 28 hibrida comenzando en los nucleotidos correspondientes al nt 2171 y posteriores de ANV1 (SEQ ID NO: 1); La SEQ ID NO: 29 hibrida con nucleotidos que comienzan en el nt 2640 de la SEQ ID NO: 1, y avanza en direction inversa (vease la tabla 4). De este modo, la region genomica de la ORF 1a del astrovirus aviar de acuerdo con la invencion que comprende los 12 nucleotidos no presentes en ANV, esta abarcada por parte de la ORF 1a que se secuencia.

Para los analisis informaticos de las secuencias de ADN determinadas, estas se cortan de tal forma que no contienen las secuencias desnaturalizadas de los cebadores en si. Asimismo, las secuencias comparadas necesitan ser de igual longitud para lograr alineamientos representativos. Asimismo, los alineamientos han de producirse sobre la longitud completa de las secuencias recortadas.

Esto significa, por ejemplo, en el caso de usar los cebadores de SEQ ID NO: 28 y 29, que la longitud de la secuencia que se va a comparar es de aproximadamente 400-425 nucleotidos.

Un programa informatico para dichas manipulaciones y alineamientos es Clone Manager™ (de: Scientific and Educational software™), como alternativa, hay programas disponibles a traves de internet: "ClustalW" para alineamientos multiples, y "Translate" para traducciones, ambos accesibles a traves de
www.expasy.org; o los programas "Blast" en
www.ncbi.nlm.nih.gov. Preferentemente, se usan los parametros de puntuacion por defecto.

La secuenciacion de ADNc usando los cebadores de SEQ ID NO: 28 y 29 se llevo a cabo para muchos aislados de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion. Una selection de las secuencias de nucleotidos recortadas resultantes se presentan en el presente documento como las SEQ ID NO: 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26, tal como se representan en la tabla 1.

Estas secuencias se alinean entre si, usando como referencia la secuencia de un aislado de pollo, numerado como 161319, al que los inventores se refieren como "aislado 19". Asimismo, se alinearon varias secuencias de ADN de las partes correspondientes de ORF 1a de otros Astrovirus disponibles en GenBank, por ejemplo, ANV1 (AB033998, SeQ ID NO: 1), Astrovirus de pavo 1 (TAstV1) (Y15936), Astrovirus de pavo 2 (AF206663), Astrovirus de oveja 2 (Y15937), Astrovirus de vison 2 (AY179509), y Astrovirus humano (Z25771); entre parentesis se encuentran los numeros de referencia de GenBank respectivos.

De estas otras secuencias de ORF 1a de Astrovirus, solo ANV1, en particular la parte de nt 2213 - 2607 de la SEQ ID NO: 1, tuvo una identidad de secuencia que fue significativa, lo que significa un porcentaje de identidad de nucleotidos muy por encima del 50 %. De los demas Astrovirus restantes, solo TAstV1 (n.° de ref. de GenBank: Y15936) tuvo una identidad de secuencia detectable, pero poco significativa en la parte de nucleotidos n.° 2450 - 2856. Esto se representa en la tabla 2.

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Tabla 2: Lista de porcentajes de identidad de secuencia de nucleotidos entre la SEQ ID NO: 4 (que forma parte de la ORF 1a del aislado 19), y la secuencia de la parte correspondiente de la ORF 1a de otros aislados de los Astrovirus ___________________aviares de acuerdo con la invencion, asi como de otros Astrovirus.___________________

Aislado/nombre del virus

% de identidad de secuencia de nucleotidos con SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO, o n.° de referencia de GenBank

637

90 SEQ ID NO: 10

686

88 SEQ ID NO: 12

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89 SEQ ID NO: 14

715

98 SEQ ID NO: 16

1736

89 SEQ ID NO: 18

2383

88 SEQ ID NO: 20

2388

88 SEQ ID NO: 22

7279

89 SEQ ID NO: 24

161317

89 SEQ ID NO: 26

ANV1

80 SEQ ID NO: 1 (parte: 2213-2607) GenBank: AB033998

TAstV1

56 GenBank: Y15936 (parte: 2450 - 2856)

TAstV2

< 50 GenBank: AF206663 (parte: no detectable)

En la figura 3 se presenta un arbol dendrografico de los resultados de estos alineamientos de secuencias de nucleotidos.

Por lo tanto, se descubrio sorprendentemente que el grupo de nuevos Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion se apartan de todos los demas Astrovirus, aviares o de mamifero, en que comparten una identidad de secuencia de nucleotidos del 88 % o mas cuando se compara una region de secuencias de ADN de ORF 1a correspondientes a la SEQ ID NO: 4.

Por lo tanto, en una realizacion preferida, la invencion se refiere al Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, caracterizado por que la ORF 1a de dicho Astrovirus aviar comprende una region que tiene una identidad de secuencia de nucleotidos de al menos el 88 % con la SEQ ID NO: 4.

Mas preferentemente, la invencion se refiere a un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, caracterizado por que la ORF 1a de dicho Astrovirus aviar comprende una region que tiene una identidad de secuencia de nucleotidos de al menos el 89 % con la SEQ ID NO: 4, aun mas preferentemente un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 % de identidad, en ese orden de preferencia.

A continuation de la SEQ ID NO: 4, cualquiera de las secuencias de nucleotidos parciales de ORF 1a descritas en las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26, pueden servir para caracterizar el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion en realizaciones preferidas adicionales.

De manera analoga al alineamiento multiple de las secuencias de nucleotidos de ORF 1a tal como se presentan en la tabla 2, pueden efectuarse alineamientos de las secuencias de aminoacidos putativas a partir de las secuencias de acido nucleico recortadas de la tabla 2, las SEQ ID NO: 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26. Las secuencias de aminoacidos resultantes, traducidas informaticamente, se presentan en el presente documento como las SEQ ID NO: 5, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, y 27. La secuencia de referencia es la SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoacidos putativa de parte de la ORF 1a del Aislado 19. Tambien se hizo el alineamiento usando el programa Align+, alineando sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 5. Los resultados se presentan en la tabla 3.

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Tabla 3: Lista de porcentajes de identidad de secuencia de aminoacidos entre la SEQ ID NO: 5 (que es una traduccion de una parte de la ORF 1a del aislado 19), y la secuencia de la parte correspondiente de la ORF 1a de ______otros aislados de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, asi como de ANV1 y TAstV2.______

Aislado/nombre del virus

% de identidad de secuencia de aminoacidos con SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO, o n.° de referencia de GenBank

637

97 SEQ ID NO: 11

686

97 SEQ ID NO: 13

714

97 SEQ ID NO: 15

715

99 SEQ ID NO: 17

1736

96 SEQ ID NO: 19

2383

94 SEQ ID NO: 21

2388

93 SEQ ID NO: 23

7279

96 SEQ ID NO: 25

161317

97 SEQ ID NO: 27

ANV1

88 GenBank: BAA92848 (parte: 734 - 864)

TAstV2

< 40 GenBank: Q9ILI6 (parte: 810-930; casi indetectable)

El alineamiento de aminoacidos detallado se representa en la figura 2.

El resultado de este analisis de secuencia de aminoacidos muestra un resultado comparable con los resultados en la tabla 2: las secuencias de aminoacidos de los aislados de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion estan mas relacionadas entre si, que cuando se comparan con otros Astrovirus aviares. Los porcentajes de identidad de las secuencias de aminoacidos de los diversos aislados de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion con la SEQ ID NO: 5, son de entre el 93 y el 99 %, mientras que la identidad con ANV1 es menor, del 88 %.

Por lo tanto, en una realizacion preferida, la invencion se refiere a un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, caracterizado por que el ORF 1a de dicho Astrovirus aviar codifica una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 93 % con la SEQ ID NO: 5.

Mas preferentemente, la invencion se refiere a un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, caracterizado por que el ORF 1a de dicho Astrovirus aviar codifica una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 94 % con la SEQ ID NO: 5, aun mas preferentemente un 95, 96, 97, 98, 99, o 100 % de identidad, en ese orden de preferencia.

A continuacion de la SEQ ID NO: 5, cualquiera de las secuencias de nucleotidos parciales de ORF 1a traducidas putativamente descritas en las SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, y 27, pueden servir para caracterizar el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion en realizaciones preferidas adicionales.

Ademas de la secuenciacion y alineamiento de nucleotidos, el marcador genetico positivo de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion puede identificarse usando una prueba PCR para detectar la presencia de los 12 nucleotidos en la region ORF 1a de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, que no estan presentes en la ORF 1a de ANV1, por ejemplo, en muestras de pajaros que padecen enfermedad intestinal o locomotora.

Por lo tanto, en una realizacion adicional preferida, el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion se caracteriza por que puede producirse un producto de PCR de aproximadamente 260 nucleotidos a partir de la ORF 1a de dicho Astrovirus aviar en un ensayo de PCR que usa un conjunto de cebadores representados en las SEQ ID NO: 30 y 31.

Los cebadores de PCR que se van a usar son:

SEQ ID NO: 30: 5'- GTY CTY ACC GAR GAR GAR TAY C -3'

SEQ ID NO: 31: 5'- AAD GTT ATY CTC CTA RGB TKH C -3'

Los inventores hacen referencia a estos cebadores como cebadores 29 y 30, respectivamente.

Estos cebadores hibridan con nucleotidos correspondientes al numero de nucleotido 2252 y posteriores y al numero de nucleotido 2499 de ANV1 (SEQ ID NO: 1) y procediendo en sentido inverso.

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El producto de la PCR que se produjo fue visible en un gel como una banda de aproximadamente 260 nucleotidos (esto es incluyendo la longitud de los cebadores en si). Esta banda solo se produce cuando el material de partida contiene ADN que comprende la region ORF 1a de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, ya que solo estos comprenden los 12 nucleotidos que no estan presentes en la ORF 1a de ANV1. Una representacion de la union especifica de los cebadores de SEQ ID NO: 30 y 31, en relacion con la localizacion de la region de 12 nucleotidos se presenta en la figura 4.

En dichos ensayos PCR, se determina la especificidad y la sensibilidad mediante los cebadores de PCR especificos empleados, en particular por la secuencia y longitud de los cebadores. Entonces, puede lograrse la optimizacion de la selectividad y sensibilidad adaptando las condiciones de reaccion y ciclacion, tales como la temperatura y la duracion de las etapas de reaccion, como es sabido por un experto en la materia.

Estas, y otras tecnicas de biologia molecular se explican en gran detalle en libros de texto convencionales, tales como Sambrook y Russel: "Molecular cloning: a laboratory manual" (2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN: 0879695773); Ausubel et al., en: Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley and Sons Inc, NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach y G. Dveksler: "PCR primers: a laboratory manual" (CSHL Press, ISBN 0879696540); y "PCR Protocols", por: J. Bartlett y D. Stirling (Humana press, ISBN: 0896036421).

De manera conveniente, la reaccion PCR que usa los cebadores de las SEQ ID NO: 30 y 31 se combina con, y sigue directamente a la reaccion de RT necesaria para producir ADNc; haciendo del ensayo combinado un ensayo de RT- PCR, tal como se describe en los ejemplos.

Un ensayo RT-PCR tal como se ha descrito, se ha aplicado por los inventores en diversas muestras; se obtuvo un resultado positivo con muestras de los aislados de los nuevos Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion; siendo un resultado de la PCR "positivo" la visualizacion de un producto de reaccion de aproximadamente 260 pares de bases tras la electroforesis, en relacion a muestras de control positivo y negativo adecuadas. Sin embargo, se observo consistentemente que las muestras de RT-PCR preparadas a partir de los Astrovirus aviares relacionados, ANV1 y Astrovirus de pollo 2 (CAstV2) eran negativas en la PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 30 y 31.

Un ejemplo de un resultado de ensayo PCR similar se representa en la figura 5, mostrando una fotografia de un gel de agarosa tenido con bromuro de etidio, iluminado con luz UV, sobre el cual se corrieron los productos de una PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 30 y 31. Solo una muestra de Aislado 19 tuvo una reaccion positiva; las muestras que contenian ANV1 o CAstV2 fueron negativas, asi como lo fueron los controles negativos.

Sorprendentemente, se observo un efecto patologico altamente destacable y sorprendente tras la infeccion e incubacion de huevos de ave embrionados con un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion: los embriones afectados mostraron una tincion rojo brillante de las patas y las puntas de las alas. Esto no se ha observado o descrito anteriormente. Ademas, los embriones infectados mostraron otras caracteristicas, pero menos distintivas: una tincion roja clara generalizada, edema en el abdomen, y un higado que estaba considerablemente inflamado y se habia vuelto rojo oscuro/purpura.

Esta patologia especifica se observo aproximadamente 2 - 7 dias despues de la infeccion de los huevos de pollo SPF embrionados, y practicamente siempre dio lugar a la muerte del embrion, dependiendo del titulo de virus que se inoculo.

Por comparacion, la inoculacion de ANV1 en huevos embrionados se efectuo conjuntamente, usando condiciones de ensayo similares. ANV1 tambien indujo inflamacion del higado, pero en ese caso los higados tuvieron un color aun mas oscuro, y el color general del embrion fue rojo oscuro. Sin embargo, ANV1 nunca indujo la coloracion roja brillante de las patas y las puntas de las alas que se observo para los aislados del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion.

Por lo tanto, en una realizacion adicional preferida, el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion se caracteriza por que es capaz de inducir una coloracion roja de las patas y las puntas de las alas de embriones de pollo, tras su inoculacion en los huevos de pollo SPF embrionados de aproximadamente 5 - 7 dias de edad, seguido de incubacion durante 2 - 7 dias, o incluso mas tiempo cuando sea adecuado.

Tal como se ha descrito, los huevos de pollo SPF embrionados y el equipo para su incubacion estan disponibles comercialmente. Tipicamente, la incubacion de los huevos de pollo embrionados se efectua a aproximadamente 35 - 39 °C, en incubadores de atmosfera humidificada.

La inoculacion puede ser mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo, la CAM, el saco vitelino o la ruta alantoica.

Como apreciaran los expertos en la materia, la coloracion roja brillante especifica de las patas y las puntas de las alas puede no llegar a ser visible en situaciones ocasionales en donde, por ejemplo, la cantidad de virus que se inoculo era extremadamente baja (no permitiendo el "asalto" del virus) o extremadamente alta (causando mortalidad

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antes de que pudiese aparecer la coloracion); o en los casos donde los embriones no tienen suficiente calidad como para permitir la replicacion virica. En general, la coloracion roja brillante puede observarse tras la incubacion de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 10A6 DIH50/huevo (DIH50 = 50 % de la dosis infecciosa en huevo).

Un aislado particular de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, denominado aislado 19, se purifico y amplifico adicionalmente para servir como muestra de referencia y depositarse. El aislado se purifico mediante dilucion limitante en celulas de hngado embrionario de pollo (CEL). En cada ocasion se paso la dilucion mayor que seguia induciendo cpe en las celulas CEL. A continuation este virus purificado se amplifico mediante tres rondas de amplification virica en la cavidad alantoica de huevos de pollo SPF embrionados. El fluido alantoico se recogio y almaceno congelado. Este virus purificado se titulo en huevos de pollo SPF embrionados, y se observo que tenia un titulo de 6,1 Log10 DIH50/ml. Este material se liofilizo en un tampon estabilizador convencional y se almaceno a -20 °C. Se confirmo la esterilidad. Las muestras de este material de virus se depositaron entonces en la "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (CNCM) del Institut Pasteur, en Paris, Francia, con el numero de deposito: CNCM I-3895, en 23 de Enero de 2008.

Por lo tanto, en una realization adicional preferida, el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion es un virus como el depositado con el numero CNCM I-3895 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), del Institut Pasteur en Paris, Francia.

Aunque la muestra que se purifico, amplifico, y deposito fue el aislado denominado "aislado 19", sin embargo, uno cualquiera de los aislados de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, descritos en la tabla 1, puede servir como muestra de referencia para el nuevo grupo de Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion.

Para el cultivo in vitro y para ensayar los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, pueden usarse varios sistemas de cultivo: por ejemplo, lineas celulares (aviares), tales como celulas primarias, como CEL o celulas de rinon embrionario de pollo (CEK), pueden usarse de manera ventajosa. La preparation de cultivos de celulas CEL o CEK de huevos de pollo SPF embrionados se conoce bien en la materia.

Especialmente, las celulas CEK son adecuadas para controlar el crecimiento viral, y medir la cantidad y viabilidad virica. Aunque es atipico el efecto citopatico (cpe) que el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion produce en estas celulas, las celulas infectadas pueden verse claramente como celulas redondeadas, que se encrespan a partir de la monocapa, y progresan hacia la lisis celular.

Por lo tanto, pueden disenarse ensayos de titulacion virica usando diluciones progresivas de muestras viricas, y puntuando la dilucion mas alta de virus que aun produce cpe. Entonces puede expresarse el titulo virico como el 50 % de la dosis infecciosa en cultivo tisular (DICT50) por mililitro, segun se calcula mediante el metodo Spearman- Karber (descrito en: D. Finney: Statistical method in biological assay, C. Griffin & Co., Londres, ISBN 0195205677). Dichas tecnicas se conocen bien por los expertos en la materia.

De este modo, el virus puede cultivarse en matraces de cultivo tisular o placas de microtitulacion para diversas pruebas y fines. Comunmente, es beneficioso para en primer lugar adaptar a los virus aislados en el campo al cultivo in vitro en celulas, aplicando unos pocos pases en dichas celulas, antes de su uso en pruebas o titulaciones viricas.

Como alternativa, las pruebas y las titulaciones pueden llevarse a cabo en huevos embrionados, preferentemente huevos de pollo SPF. Por ejemplo, puede efectuarse la titulacion virica inoculando muestras cada vez mas diluidas en el saco vitelino de huevos de pollo SPF embrionados de 6 dias de edad. Tras puntuar el numero de embriones infectados o muertos, el trtulo resultante de la muestra ensayada puede expresarse en DIH50 por mililitro, por ejemplo, usando el metodo de Spearman-Karber (anteriormente citado).

Para el virus depositado, se confirmo su capacidad para provocar patologias en pollos y pavos recien eclosionados en condiciones de laboratorio en una serie de pollos de pruebas experimentales. La inoculation fue a traves de multiples rutas: intramuscular, oral, y ocular. Varios de los pollos inoculados desarrollaron signos graves de enfermedad, mientras que los pollos infectados con simulado no tuvieron sintomas. Los sintomas observados fueron mortalidad, depresion general, y diarrea de leve a grave. Tras la histopatologia, se observaron nefritis y enteritis. No se observo enfermedad de las patas o articulaciones, aunque tampoco era de esperar ya que los pollos usados para estos experimentos eran demasiado jovenes (3 - 6 semanas), y/o no suficientemente pesados (pollos SPF de tipo ponedor) para manifestar dichos problemas.

En el presente documento se presentan secuencias de nucleotidos de regiones adicionales del virus depositado para su caracterizacion adicional: ORF 1b y ORF 2. Las secuencias de nucleotidos respectivas y de aminoacidos putativas se presentan en el presente documento como las SEQ ID NO: 5-8, vease la tabla 1.

Los diferentes cebadores que se usaron para determinar estas secuencias de nucleotidos adicionales se presentan en el presente documento como las SEQ ID NO: 32 - 34, y se describen en la tabla 4; por conveniencia, esta tabla incluye tambien los otros cebadores de PCR y secuenciacion descritos en el presente documento.

Tabla 4: Description de cebadores de PCR y de secuenciacion tal como se describen en el presente documento

SEQ ID NO:

Codigos de cebador de los inventores Hibrida con: Localization de la primera base en la SEQ ID NO: 1; direction Secuencia (5' ^ 3')

Cebador de reaction de RT

3

17 Region de extremo 3' de AAstV 6731, rev TCg WTS CTA CYC

Cebadores de detection

30

29 Orf 1 a del nuevo AAstV segun la invencion 2252, dir gTY CTY ACC gAR gAR gAR TAY C

31

30 2499, rev AAD gTT ATY CTC CTA RgB TKH C

Cebadores de secuenciacion

28

F-II Orf 1a de AAstV 2171, dir AAA ggK AAg ACD AAg ARR RAC Mg

29

R-II-3 2640, rev TCg CCT TCT ggA Agg TCT TCA

32

20 Orf 1b de AAstV 3721, dir Tgg HCM CCY TTY TTY ggH g

33

21 4020, rev RTT RTC MAC DgT KgT DgA RWA YTg

34

ORF2-R Orf 2 de AAstV 6622, rev TTA gAT CTg AAA gCg CCg gAg g

AAstV = Astrovirus aviar; rev = reverso; dir = directo

Un metodo adicional para proporcionar caracterizacion adicional de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invention, con la muestra de virus depositada como referencia, es mediante la determination de sus caracteristicas 5 inmunologicas mediante serotipado, preferentemente usando ensayos VN o IFT.

En todas las pruebas, el nuevo Astrovirus aviar demostro ser inmunologicamente distinto de otros virus aviares, ya que no pudo neutralizarse, y no se unio especificamente por anticuerpos especificos para otros diversos virus aviares: Reovirus, Adenovirus aviares (tipos 1, 2, 4, 5, y 8), virus de la bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad

10 de Newcastle, virus de la enfermedad bursal infecciosa, enterovirus aviar (aislados 1821/9 y FP3), sindrome de la puesta de huevos y virus de la gripe aviar. Este fue el caso tambien para anticuerpos especificos para los Astrovirus aviares ANV1 o CAstV2, mientras que estos sueros neutralizaron de manera eficaz a sus virus donante: ANV1 y CAstV2 hasta una dilucion de 1:640 o de 1:10240, respectivamente.

15 Sin embargo, se neutralizo de manera eficaz y selectiva una muestra del virus aislado 19 depositado por un antisuero de pollo generado contra el aislado 19 en pollos SPF que se infectaron experimentalmente con el virus del aislado 19. Despues de proporcionar inoculaciones de refuerzo, pudo obtenerse un antisuero especifico. La lectura usada para la neutralization del virus en este ensayo fue la prevention de la embriopatologia mediante la neutralizacion.

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Los resultados de los experimentos inmunologicos en los que los anticuerpos especificos solo reconocieron y neutralizaron a los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, demuestran que estos virus pertenecen a un serotipo viral nuevo y unico.

25 Esto puede ponerse en practica, por ejemplo, en una realization adicional preferida, en la que el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion se caracteriza por que dicho Astrovirus aviar puede neutralizarse en un ensayo de neutralizacion de virus, por anticuerpos dirigidos contra una muestra del Astrovirus depositado con el numero CNCM I-3895 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), del Institut Pasteur en Paris, Francia.

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Tambien es posible una estrategia alternativa para la generacion de anticuerpos usando el virus depositado de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, puede usarse una muestra de virus que se va a investigar por ser un (derivado de) Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion para inducir anticuerpos y dichos anticuerpos pueden a su vez ensayarse respecto de su capacidad para unirse o incluso para neutralizar un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion. Convenientemente, dichos anticuerpos pueden ensayarse en una muestra del virus depositado de acuerdo con la invencion.

Con este fin, puede inocularse el virus de ensayo o una fraccion o preparacion del mismo en un animal. El animal usado para la generacion de dichos anticuerpos puede ser, en principio, cualquier animal, pero se usa preferentemente un raton, rata, conejo, hamster, cabra o pollo. Los anticuerpos producidos de este modo pueden ensayarse respecto de la union o neutralizacion a un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, por ejemplo, convenientemente encargando una muestra del virus depositado de acuerdo con la invencion a la CNCM. Esta puede cultivarse, por ejemplo en huevos o celulas CEK o CEL, u otros sustratos, y finalmente incubarse con el anticuerpo provocado con la muestra de virus de ensayo. La deteccion de la union del anticuerpo puede efectuarse, por ejemplo, mediante ensayo IFT o VN.

Por lo tanto, esto constituye un metodo para la identificacion y caracterizacion de un virus vivo o inactivado, o de una fraccion o preparacion del mismo, como un Astrovirus aviar o un derivado de un Astrovirus aviar de de acuerdo con la invencion.

Por lo tanto, en una realization adicional preferida, la invencion proporciona un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, que se caracteriza por que dicho virus es capaz de inducir anticuerpos que pueden neutralizar una muestra de los Astrovirus depositados de acuerdo con la invencion en un ensayo VN.

Los protocolos para configurar un ensayo VN se conocen bien en la tecnica, y se encuentran dentro de las habilidades rutinarias de un experto en la materia. Las preferencias y detalles para los ensayos VN se han descrito anteriormente.

Tal como es evidente a partir de los resultados de los ensayos inmunologicos usando anticuerpos especificos para los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, la invencion tambien proporciona un anticuerpo que puede unirse y que puede neutralizar a un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion.

Por lo tanto, otro aspecto de la invencion es un anticuerpo o fragmento del mismo que puede neutralizar al Astrovirus aviar tal como se ha depositado con el numero CNCM I-3895 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), del Institut Pasteur en Paris, Francia, en un ensayo de neutralizacion de virus.

Dichos anticuerpos de acuerdo con la invencion pueden obtenerse y producirse mediante diversos modos, todos bien conocidos y disponibles para un experto en la materia. Por ejemplo, pueden producirse los anticuerpos en animales experimentales mediante inoculation (repetida) tal como se ha descrito anteriormente.

Como alternativa, pueden producirse anticuerpos por linfocitos B inmortalizados, como en la tecnologia de hibridoma. Las mejoras modernas de la tecnologia de hibridoma clasica han hecho que esta tecnica sea mas eficaz y productiva, por ejemplo, potenciando la cantidad deseada de esplenocitos antes de la fusion, mediante selection positiva (paneo), seguido de expansion en cultivo con una mezcla de citocinas. Asimismo, la tecnica de fusion se ha mejorado, cambiando de la fusion de polietilenglicol clasica, a electrofusion.

En una estrategia alternativa adicional, pueden obtenerse anticuerpos mediante el uso de tecnicas biologicas moleculares y expresion en sistemas de expresion recombinantes. Las tecnicas biologicas moleculares permiten la adaptation de dichos anticuerpos para emparejarse mejor con la firma de anticuerpos de las especies diana que se van a tratar, o el diseno de anticuerpo que portan dos regiones de union con especificidades diferentes. El desarrollo del sistema de expresion permite la configuration de sistemas de expresion de alto volumen, tales como expresion en plantas.

Tambien se conocen en la tecnica sistemas de expresion recombinante y usan por ejemplo: celulas bacterianas (por ejemplo, Escherichia coli, Salmonella, Bacillus, Caulobacter etc.), levadura (por ejemplo, Saccharomyces), insecto (Spodoptera, Trichoplusia), mamifero (por ejemplo, ovario de hamster chino), o vegetales (tabaco, patata, etc.). Estas celulas pueden transformarse con una construction de expresion que porta la secuencia heterologa que va a expresarse. Asimismo, se conocen sistemas combinados, que usan un microorganismo recombinante que comprende el acido nucleico que se va a expresar, pudiendo cultivarse dichos microorganismos en celulas in vitro para producir la proteina deseada a la escala deseada. Un ejemplo es el sistema de expresion de baculovirus/celula de insecto. Finalmente, estan disponibles los denominados sistemas de expresion sin celulas para la expresion sin celulas de una molecula de ADN recombinante adecuada.

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La expresion "un anticuerpo o fragmento del mismo" pretende indicar que tanto las moleculas de inmunoglobulina completas como partes de las mismas se consideran dentro del alcance del anticuerpo de acuerdo con la invencion. Los fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invencion son moleculas de proteina que aun pueden unirse a un epitopo de un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion. Los ejemplos son FAB, scFv, Fv, dAb, o fragmentos Fd, todos bien conocidos en la tecnica.

Dichos fragmentos pueden obtenerse a partir de anticuerpos intactos mediante, por ejemplo, digestion quimica o enzimatica. Como alternativa, dichos fragmentos pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de un sistema de expresion recombinante, por ejemplo, un sistema de presentation en fagos.

Tal como se conoce bien por los expertos en la materia, la union de un anticuerpo o fragmento del mismo a un virus abarca el reconocimiento de epitopos en la particula del virus. Con frecuencia, estos epitopos se forman mediante conformaciones lineales o tridimensionales de moleculas presentadas en la particula virica. Como resultado, las preparaciones de un virus o fracciones de los mismos pueden unirse por anticuerpos o fragmentos de los mismos de acuerdo con la invencion, en tanto que estas preparaciones o fracciones aun contengan y presenten los epitopos correctos en la forma correcta. En el caso del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, la proteina virica presentada mas prominentemente al sistema inmunitario es la proteina de la capsida codificada a partir de la ORF 2.

El experto en la materia tambien apreciara que cuando el anticuerpo de acuerdo con la invencion se produce mediante inoculation de un animal, el suero del animal obtenido es un antisuero policlonal, lo que significa que el anticuerpo contiene una mezcla de anticuerpos que pueden unirse a una gran variedad de epitopos. En la practica, esto proporciona multiples interacciones, que permiten la union eficaz de preparaciones o fragmentos de la proteina virica, aunque estas pueden no poseer, o pueden no presentar de manera adecuada, todos los epitopos que estan disponibles normalmente en una particula virica viva intacta.

Como alternativa, el anticuerpo de acuerdo con la invencion puede ser un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, tal como se produce mediante la tecnologia de hibridoma, o el anticuerpo de acuerdo con la invencion puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab. En este caso, el anticuerpo o fragmento tiene una capacidad muy reducida para reconocer diferentes epitopos, ya que normalmente solo se unira especificamente a un solo epitopo. Por consiguiente, cuando este epitopo particular no esta presente o no se presenta en el fragmento o preparation del virus, puede no unirse en absoluto a dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos de acuerdo con la invencion pueden usarse de diversos modos; para la caracterizacion de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, para diagnosticos, para terapia, y/o para fines de verification de calidad.

La invencion proporciona la production del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion a una escala industrial. Esto puede lograrse cultivando dicho virus en celulas hospedadoras en sistemas in vivo o in vitro. Los sistemas in vitro comprenden lineas celulares primarias o inmortalizadas. Los ejemplos de celulas primarias son celulas CEK o CEL. Un ejemplo de una linea celular inmortalizada es la linea celular LMH (Kawaguchi et al., Cancer Res., vol. 47, p. 4460-4464). Los ejemplos de sistemas in vivo son cultivo en huevos de aves embrionados, o en aves inoculadas. Especialmente, pueden escalarse convenientemente cultivos en celulas o huevos; por ejemplo, los cultivos celulares pueden mantenerse en contenedores de diversos tamanos, tales como matraces, botellas rotatorias, o incluso fermentadores. Las tecnicas y el equipamiento para la tecnologia de cultivo celular a cualquier escala se conocen bien y estan facilmente disponibles a traves de proveedores comerciales.

Por lo tanto, la invencion proporciona en un aspecto adicional una celula hospedadora infectada con un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion.

Asimismo, la invencion proporciona un metodo para producir un Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion que comprende la multiplication del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion en un sistema adecuado, y recoger el material virico.

Las caracterizaciones descritas en el presente documento del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion no solo se refieren a dichos Astrovirus aviares en una forma intacta, competente para replication. Como apreciara un experto en la materia, la presente invencion proporciona preparaciones de este virus en muchas formas diferentes. Estas comprenden, por ejemplo, preparaciones en las que el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion se ha inactivado, o preparaciones en las que dicho virus se ha fraccionado de una o mas maneras, (bio)quimicamente o fisicamente, por ejemplo, mediante extraction, lisado, digestion, homogenization, o sonicacion.

Los metodos para inactivar virus se conocen bien e incluyen, por ejemplo, inactivation quimica o fisica, tal como inactivation con formalina, beta-etanolamina, o beta-propiolactona; tambien calentamiento o irradiation con luz UV, rayos X, o radiation radiactiva.

Tambien se conocen multiples metodos de fraccionamiento, por ejemplo, extraccion o lisado con un detergente, tal como Triton® X-100; digestion con tripsina; homogenizacion mediante congelacion-descongelacion o prensa celular

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de French; o sonicacion mediante ultrasonidos.

El material de partida para dichas preparaciones puede ser un Astrovirus aviar purificado (vivo o inactivado) de acuerdo con la invencion, pero tambien una celula hospedadora de acuerdo con la invencion, o un cultivo celular o una parte del mismo que comprende una celula hospedadora o un astrovirus aviar de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, dicha parte de un cultivo celular puede ser un sobrenadante o un sedimento de un cultivo celular centrifugado. Evidentemente, estos cultivos celulares o partes de los mismos pueden a su vez convertirse en preparaciones, tales como un extracto, lisado, digestion, homogenizado, o sonicado, tal como se ha descrito.

Dichas preparaciones de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion contienen uno o mas antigenos y epitopos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invencion se refiere a una preparacion antigenica obtenible a partir del Astrovirus aviar en el que el Astrovirus aviar esta en forma inactivada.

La preparacion antigenica de acuerdo con la invencion puede unirse por anticuerpos o partes de los mismos de acuerdo con la invencion, o puede usarse en si para inducir la union o anticuerpos neutralizantes o partes de los mismos. Esto puede aplicarse ventajosamente en vacunas y diagnosticos tal como se describira mas adelante.

Las preparaciones antigenicas de acuerdo con la invencion son, por ejemplo, proteinas del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, o partes de dichas proteinas. Estas proteinas o partes de las mismas pueden obtenerse mediante aislamiento a partir de dicho virus. Sin embargo, estas proteinas o partes de las mismas tambien pueden producirse de manera conveniente mediante tecnicas de expresion de ADN recombinante usando acidos nucleicos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, pueden usarse secuencias de acidos nucleicos de parte de las regiones ORF 1a, tal como se describen en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26; tal como se ha descrito, estas secuencias de ADNc estan relacionadas en tanto que tienen identidad de secuencia de nucleotidos de al menos el 88 % con la SEQ ID NO: 4.

Por lo tanto, la invencion proporciona en un aspecto adicional una molecula de ADN que comprende una region que tiene una identidad de secuencia de nucleotidos de al menos el 88 % con la SEQ ID NO: 4.

Tambien pueden usarse acidos nucleicos de ORF 1b u ORF2 tal como se describen en las SEQ ID NO: 6 u 8.

Dichas secuencias de acido nucleico y fragmentos de ADNc pueden clonarse y expresarse usando tecnicas de ADN recombinante bien conocidas en la tecnica, por ejemplo, mediante subclonacion en una molecula de ADN recombinante para manipulacion adicional. La molecula de ADN recombinante puede ser un vector, tal como un plasmido bacteriano. Preferentemente, el acido nucleico del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion esta unido operativamente a una secuencia de control de la expresion, tal como un promotor, permitiendo su expresion en un sistema de expresion o celula hospedadora adecuada. Como alternativa, el acido nucleico, ADNc, o molecula de ADN recombinante puede introducirse en microorganismos portadores recombinantes, tales como bacterias o virus.

De manera analoga, basandose en las secuencias de aminoacidos putativas descritas en las SEQ ID NO: 5, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, y 27, y su relacion, la invencion proporciona en un aspecto adicional una proteina que comprende una region que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 93 % con la SEQ ID NO: 5.

Estas realizaciones tienen una gran utilidad practica y ventajosa en la aplicacion de vacunas y diagnosticos, tal como se describira mas adelante.

Puede prepararse una vacuna a partir de patogenos microbiologicos vivos o inactivados, tales como virus, o de fragmentos de dichos microorganismos. Dichos microorganismos se producen comunmente de manera industrial en volumenes menores o mayores, mediante incubacion en celulas, organos o tejidos, huevos embrionados, o en animales hospedadores. Despues de recoger una suspension que comprende el microorganismo, esta suspension se formula en una vacuna y se envasa el producto final. Despues de una comprobacion exhaustiva de la calidad, la cantidad y la esterilidad, dichos productos vacunales se liberan para su comercializacion.

Las tecnicas y consideraciones generales en la vacunologia se conocen bien en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las regulaciones gubernamentales y en libros de texto, tales como: "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681), y: "Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472).

En la tecnica se conoce comunmente que una vacuna presenta una composicion farmaceutica que comprende un compuesto inmunogenico en un vehiculo farmaceuticamente aceptable. El compuesto inmunogenico es un microorganismo vivo o inactivado, o una subunidad del mismo, capaz de inducir una activacion del sistema inmunitario de una diana.

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Sorprendentemente, se descubrio que el Astrovirus aviar de acuerdo con la invention, y las preparaciones antigenicas, celulas hospedadoras, anticuerpos, acidos nucleicos, protemas, as^ como los metodos para su preparation, cultivo, identification y cuantificacion pueden aplicarse en vacunas y con fines diagnosticos. Dichas vacunas sirven para proteger a un animal diana frente a la infection por el Astrovirus aviar, o reducir la replication de dicho virus o los sintomas de la enfermedad que causa. Dichos ensayos diagnosticos permiten la detection de los virus o sus antigenos, por ejemplo, en muestras de campo de animales o preparaciones viricas.

En combination, las vacunas y diagnosticos permiten la identificacion y la defensa contra la infeccion y/o enfermedad por el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion.

La capacidad de vacunacion se demostro mediante los experimentos animales descritos, en los que se inocularon pollos con el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion. Esto dio lugar a la production de anticuerpos altamente especificos. Ademas, se demostro que estos anticuerpos son capaces de neutralizar especificamente a los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion. Como se conoce en la tecnica, la induction de anticuerpos neutralizantes es una etapa importante en la factibilidad de una vacuna efectiva e inmunoprotectora.

Las inoculaciones repetidas de los animales de ensayo no solo proporcionaron un refuerzo para los niveles de anticuerpo producidos, sino que tambien sirvieron como infecciones de exposition, que pudieron tolerarse y superarse por un gran numero de las aves en el ensayo.

Los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, o partes de los mismos, pueden por lo tanto formularse en una composition farmaceutica adecuada, y pueden aplicarse a aves en forma de una vacuna.

Se encuentra dentro del alcance de un experto en la materia optimizar adicionalmente esta vacuna, por ejemplo, refinando la eficacia y seguridad de la vacuna, de tal forma que proporciona protection suficiente con un nivel aceptable de reaction a la vacuna. Esto puede efectuarse adaptando la dosis de vacuna, o usando la vacuna en otra forma o formulation, o adaptando los otros constituyentes de la vacuna (por ejemplo, el estabilizante o el adyuvante), o mediante aplicacion a traves de una ruta diferente.

Las variantes bien conocidas de una vacuna para la invencion pueden usar, por ejemplo, los nuevos Astrovirus aviares en una forma viva o inactivada; puede ser una vacuna de subunidad cuando se usa la preparacion antigenica y/o la proteina de acuerdo con la invencion; puede estar en forma de una vacuna pasiva cuando se usa el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invencion; o puede estar en la forma de una vacuna de ADN cuando se usa la molecula de ADN de acuerdo con la invencion.

Por lo tanto, otro aspecto de la invencion proporciona una vacuna que comprende el Astrovirus aviar tal como se ha depositado con el numero CNCM I-3895 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), del Institut Pasteur en Paris, Francia, o el anticuerpo o fragmento del mismo contra el Astrovirus depositado, o la preparacion antigenica del Astrovirus depositado, o la molecula de ADN, o la proteina de acuerdo con la invencion, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

De manera analoga, la invencion se refiere en aspectos adicionales a un compuesto o composicion para su uso en una vacuna para aves de corral, en el que el compuesto o composicion es el Astrovirus aviar tal como se deposito con el numero CNCM I-3895 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), del Institut Pasteur en Paris, Francia, o el anticuerpo o fragmento del mismo contra el Astrovirus depositado, o la preparacion antigenica del Astrovirus depositado, o la molecula de ADN, o la proteina de acuerdo con la invencion.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere al uso de un compuesto o composicion para la fabrication de una vacuna para aves de corral, en el que el compuesto o composicion es el Astrovirus aviar tal como se deposito con el numero CNCM I-3895 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), del Institut Pasteur en Paris, Francia, o el anticuerpo o fragmento del mismo contra el Astrovirus depositado, o la preparacion antigenica del Astrovirus depositado, o la molecula de ADN, o la proteina de acuerdo con la invencion.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un metodo para la fabricacion de una vacuna para aves de corral, en el que un compuesto o composicion se mezcla con un vehiculo farmaceutico adecuado, y en el que el compuesto o composicion es el Astrovirus aviar tal como se deposito con el numero CNCM I-3895 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), del Institut Pasteur en Paris, Francia, o el anticuerpo o fragmento del mismo contra el Astrovirus depositado, o la preparacion antigenica del Astrovirus depositado, o la molecula de ADN, o la proteina de acuerdo con la invencion.

Un "vehiculo farmaceuticamente aceptable" puede ser, por ejemplo, agua esteril, una solution salina fisiologica, o un tampon adecuado para el fin. En una forma mas compleja, el vehiculo puede comprender por si mismo otros compuestos, tales como un adyuvante, un antigeno adicional, una citocina, etc.

La vacuna de acuerdo con la invencion puede usarse para tratamiento tanto profilactico como terapeutico.

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El termino "vacuna" implica la presencia de una cantidad inmunologicamente eficaz del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, y la presencia de un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Lo que constituye una "cantidad inmunologicamente eficaz" para la vacuna de acuerdo con la invencion depende del efecto deseado y de las caracteristicas del Astrovirus aviar y del organismo diana. La determinacion de la cantidad eficaz se encuentra dentro de las capacidades de un practicante experto, por ejemplo, controlando la respuesta inmunologica despues de la vacunacion, o despues de exposition a la infection, por ejemplo, controlando los signos clinicos de enfermedad de la diana, parametros serologicos, o mediante re-aislamiento del patogeno, en comparacion con las respuestas observadas en los animales no vacunados.

El uso de cantidades muy altas del Astrovirus aviar, la preparation antigenica, el anticuerpo o fragmento del mismo, la molecula de ADN, o la proteina de acuerdo con la invencion en una vacuna aunque pueda ser inmunologicamente muy eficaz, sera menos atractivo por motivos comerciales. Una cantidad preferida de cualquiera de estos compuestos o composiciones de acuerdo con la invencion, comprendida en una vacuna de acuerdo con la invencion, es de entre el 0,1 y el 90 % del volumen final de la vacuna. Mas preferentemente, la cantidad es de entre el 1 y el 50 %, el 1 y el 25 %, y el 1 y el 10 %, en ese orden de preferencia.

En el caso de una vacuna inactivada o de subunidad, el compuesto o composition de acuerdo con la invencion puede expresarse en unidades de ELISA. Las cantidad de unidades de ELISA que son eficaces necesitan determinarse en relation a la unidad de ELISA de una muestra estandarizada que proporcione una eficacia determinada.

En el caso de una vacuna viva de acuerdo con la invencion, puede usarse una cantidad de ufp (unidades formadoras de placa), ufc (unidades formadoras de colonias), DICT50, DIH50 o DLE50 (50 % de la dosis letal embrionaria), dependiendo de que cual sea el modo conveniente de cuantificar la dosis de vacuna de Astrovirus aviar. Por ejemplo, puede usarse ventajosamente una dosis de vacuna de Astrovirus aviar en un intervalo entre 1 y 10A6 DIH50 por dosis de vacuna; preferentemente, un intervalo entre 10 y 10A5 DIH50/dosis, mas preferentemente entre 10A2 y 10A4 DIH50/dosis.

En una realization preferida, la invencion se refiere a una vacuna de acuerdo con la invencion en la que el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion esta en forma viva.

Las vacunas vivas en general tienen las propiedades ventajosas de que solo se requiere poca cantidad de inoculo, ya que el microorganismo se replica por si mismo. Asimismo, esto incluye generalmente una respuesta inmunitaria solida y eficaz, con una memoria inmunologica adecuada.

Tal como se conoce en la tecnica, las vacunas vivas pueden aplicarse convenientemente en forma de vacunas vivas atenuadas, lo que significa que el virus de vacuna tiene una virulencia o patogenicidad reducida en comparacion con el aislado virico original. Los metodos para la atenuacion virica se conocen en la tecnica y comprenden, por ejemplo: pase continuado a traves de animales o en cultivos celulares; atenuacion quimica; o atenuacion mediante tecnicas de biologia molecular.

En una realizacion preferida alternativa, la invencion se refiere a la vacuna de acuerdo con la invencion en la que el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion esta inactivado.

Los metodos y materiales para la inactivation virica se han descrito anteriormente. Dichas vacunas inactivadas tienen en general la ventaja de ser mas seguras que las vacunas vivas, ya que no exponen al hospedador a cualquier Astrovirus aviar vivo que se replique potencialmente patogeno.

En una realizacion preferida adicional, la vacuna de acuerdo con la invencion comprende ademas un adyuvante.

Un adyuvante es una sustancia inmunoestimuladora que refuerza la respuesta inmunitaria del hospedador de una manera no especifica. Se conocen en la tecnica muchos adyuvantes diferentes. Los ejemplos de adyuvantes usados frecuentemente son dipeptidos de muramilo, lipopolisacaridos, varios glucanos o glicanos, Carbopol®, hidroxido de aluminio (Al(OH)3). Estos pueden combinarse con diferentes emulsiones, tales como emulsiones de agua en aceite (ag./ac.), emulsiones ac./ag. y dobles emulsiones ag./ac./ag. Los adyuvantes oleosos adecuados para su uso en emulsiones oleosas son, por ejemplo, aceites minerales o aceites metabolizables. Los aceites minerales son, por ejemplo, Bayol®, Marcol® y Drakeol®; los aceites metabolizables son, por ejemplo, aceites vegetales, tales como aceite de cacahuete y aceite de soja, o aceites animales, tales como el escaleno de aceite de pescado. Como alternativa, puede usarse ventajosamente un solubilizado de vitamina E (tocoferol) tal como se describe en el documento Ep 382.271.

Las emulsiones de ac./ag. mas adecuadas, por ejemplo, se obtienen partiendo de una fase acuosa al 5-50 % p/p y adyuvante oleoso al 95-50 % p/p, mas preferentemente se usa una fase acuosa al 20-50 % p/p y un adyuvante oleoso al 80-50 % p/p.

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La cantidad de adyuvante anadida depende de la naturaleza del adyuvante en s^ y de la informacion con respecto a dichas cantidades proporcionadas por el fabricante.

Aunque es practica comun usar adyuvantes en combinacion con vacunas inactivadas, se ha demostrado que varias vacunas vivas tambien se benefician de la inclusion de un adyuvante. Por lo tanto, esta realizacion tambien se encuentra dentro del alcance de la invencion.

En una realizacion preferida adicional, la vacuna de acuerdo con la invencion comprende ademas un estabilizante.

Puede anadirse un estabilizante a la vacuna de acuerdo con la invencion, por ejemplo, para protegerla frente a la degradation, para potenciar la vida util, o para mejorar la eficacia de criodesecacion. Los estabilizantes utiles son, entre otros, SPGA (Bovarnik et al., 1950, J. Bacteriology, vol. 59, pag. 509), leche desnatada, gelatina, albumina de suero bovino, carbohidratos, por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidon, sacarosa, dextrano o glucosa, proteinas, tales como albumina o caseina o productos de degradacion de los mismos, tampones, tales como fosfatos de metal alcalino, y poliaminas, tales como espermina.

Tambien pueden anadirse conservantes, tales como timerosal, mertiolato, o gentamicina.

Ademas, la vacuna puede comprender uno o mas tensioactivos o emulsionantes adecuados, por ejemplo, Span® o Tween®.

La vacuna tambien puede comprender lo que se denomina un "vehiculo". Un vehiculo es un compuesto al que se adhiere el polipeptido o la proteina de acuerdo con la invencion, sin estar unido covalentemente a este. Dichos vehiculos son, entre otros, biomicrocapsulas, microalginatos, liposomas y macrosoles, todos conocidos en la tecnica. Una forma especial de dicho vehiculo es un complejo inmunoestimulador (ISCOM).

Es obvio senalar que tambien se encuentra dentro del alcance de la invencion la mezcla de otros estabilizantes, transportadores, diluyentes, emulsiones y similares a vacunas de acuerdo con la invencion. Dichos aditivos se describen en manuales bien conocidos, tales como: "Remington", y "Veterinary Vaccinology" (ambos citados anteriormente).

Es altamente eficaz formular la vacuna de acuerdo con la invencion en forma de una vacuna de combinacion, ya que de este modo pueden administrarse a la vez multiples agentes inmunologicos, proporcionando una reduction de los costes de tiempo y trabajo, asi como una reduccion del malestar para los animales diana vacunados.

Dichas vacunas de combinacion se logran combinando la vacuna de acuerdo con la invencion con otro compuesto antigenico, tal como un virus (vivo o inactivado), bacterias, parasitos, o partes de los mismos, tal como una proteina, un hidrato de carbono, o un acido nucleico capaz de codificar un antigeno. Ya que la vacuna de acuerdo con la invencion esta prevista para animales diana aviares, se combina ventajosamente con un antigeno adicional que es, o procede de, otro patogeno para aves de corral.

Por lo tanto, en una realizacion adicional preferida, la vacuna de acuerdo con la invencion comprende al menos un antigeno adicional obtenible de un microorganismo patogeno para las aves de corral.

Se conocen muchos patogenos aviares, sin embargo, algunos de los patogenos con mayor relevancia economica- veterinaria son:

- virus: virus de la bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, gripe aviar, Adenovirus, virus del sindrome de la puesta de huevos, virus de la enfermedad bursal infecciosa (es decir, Gmborovirus), virus de la anemia del pollo, virus de la encefalomielitis aviar, virus de la viruela aviar, virus de la rinotraqueitis del pavo, virus de la peste de los patos (virus de la enteritis del pato), virus de la viruela de la paloma, enfermedad de Marek, virus de la leucosis aviar, virus de la laringotraqueitis infecciosa, neumovirus aviar, y reovirus;

- bacterias: Escherichia coli, Salmonella spec., Ornitobacterium rhinitracheale, Haemophilis paragallinarum, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, Erysipelas spec., Mycoplasma spec. y Clostridium spec.;

- parasitos: Eimeria;

- hongos: por ejemplo, Aspergillus, etc.

Tambien es concebible la combinacion en la vacuna de acuerdo con la invencion de dos o mas Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, por ejemplo, para formar una vacuna de combinacion que sea mas ampliamente eficaz contra variantes de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion. Los ejemplos de Astrovirus aviares que pueden usarse para formar la vacuna de combinacion son los aislados descritos en la tabla 1.

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Una vacuna de acuerdo con la invencion puede adoptar cualquier forma que sea adecuada para su administracion a las aves de corral, y que coincida con la ruta de aplicacion deseada y con el efecto deseado.

La preparacion de una vacuna de acuerdo con la invencion se lleva a cabo por medios bien conocidos para los expertos en la materia. Preferentemente, la vacuna de acuerdo con la invencion se formula en una forma adecuada para inyeccion, tal como una suspension, solucion, dispersion, emulsion, y similares. Comunmente, dichas vacunas se preparan esteriles.

Pueden aplicarse muchos modos de administracion, todos conocidos en la tecnica. Las vacunas de acuerdo con la invencion, cuando estan inactivadas, se administran preferentemente mediante inyeccion; las vacunas vivas, se administran preferentemente mediante un metodo de aplicacion masiva, tal como a traves de la alimentacion, rociado o del agua de bebida.

El protocolo para la administracion de la vacuna de acuerdo con la invencion esta integrado idealmente en calendarios de vacunacion existentes de otras vacunas.

La diana preferida para la vacuna de acuerdo con la invencion es un animal aviar. Las dianas mas preferidas se seleccionan entre el grupo que consiste en pollos, pavos, patos y ocas. La diana mas preferida son pollos.

La pauta de dosificacion para aplicar la vacuna de acuerdo con la invencion a un organismo diana puede ser en dosis individuales o multiples, que pueden administrarse a la vez o secuencialmente, de un modo compatible con la formulacion de la vacuna, y en una cantidad tal que sera inmunologicamente eficaz.

La edad, peso, sexo, estado inmunologico, y otros parametros de la diana aviar que se va a vacunar no son criticos, aunque es evidentemente favorable vacunar a dianas sanas, y vacunar tan pronto como sea posible para evitar una infeccion de campo. Por ejemplo, puede vacunarse a las aves de corral en el dia de la eclosion, o incluso antes, cuando aun estan dentro del huevo, a los 3-4 dias antes de eclosionar; por ejemplo, a los 18 dias de desarrollo embrionario (ED) para pollos o a los 24 dias ED para pavos.

Por motivos de estabilidad o economia, puede criodesecarse una vacuna de acuerdo con la invencion. En general, esto permitira el almacenamiento a largo plazo a temperaturas por encima de cero °C, por ejemplo, a 4 °C. Los procedimientos para la criodesecacion son conocidos para las personas expertas en la materia, y hay disponible comercialmente equipamiento para la criodesecacion a diferentes escalas.

Por lo tanto, en una realizacion preferida, la vacuna de acuerdo con la invencion esta en una forma criodesecada.

Para reconstituir una composicion de vacuna criodesecada, se suspende en un diluyente fisiologicamente aceptable. Dicho diluyente puede ser, por ejemplo, tan simple como agua esteril, o una solucion fisiologica de sal, tal como suero salino (tamponado con fosfato), o el diluyente ya puede contener un compuesto adyuvante, tal como tocoferol, tal como se describe en el documento EP 382.271. En una forma mas compleja, la vacuna criodesecada puede suspenderse en una emulsion, por ejemplo, tal como se describe en el documento EP 1.140.152.

Por lo tanto, en una realizacion preferida adicional, la invencion se refiere a una composicion de vacuna obtenible mediante reconstitucion de una vacuna criodesecada de acuerdo con la invencion.

Ademas de los diversos usos de los compuestos y composiciones de acuerdo con la invencion en las vacunas, estos tambien pueden aplicarse ventajosamente en diagnosticos, para detectar el virus de acuerdo con la invencion o sus antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en muestras de animales de campo o preparaciones viricas.

Esto tambien se demuestra por los resultados de los experimentos de serotipado mediante ensayo IFT y VN, tal como se describe anteriormente, en los que se aplicaron los antisueros contra los Astrovirus aviares depositados de acuerdo con la invencion para discriminar entre virus que se encontraban dentro del alcance de la invencion (los aislados descritos en la tabla 1) y aquellos que no (entre muchos otros: ANV1, CAstV2, Reovirus etc.). Igualmente, los experimentos de PCR descritos demostraron la capacidad para identificar de manera selectiva el astrovirus aviar de acuerdo con la invencion.

Como apreciaran los expertos en la materia, esto no solo se aplica a los anticuerpos de acuerdo con la invencion, sino tambien para los demas compuestos y composiciones de acuerdo con la invencion. Dichos ensayos diagnosticos usan por ejemplo los anticuerpos o fragmentos de los mismos de acuerdo con la invencion para ensayar el antigeno; o el uso del antigeno (el virus, la preparacion antigenica, o la proteina de acuerdo con la invencion) respecto de antigenos contra los mismos; o usar acido nucleico (ARN del virus, o la molecula de ADN de acuerdo con la invencion) para configurar ensayos de hibridacion o de PCR.

La expresion "kit diagnostico" implica caracteristicas relacionadas a un paquete para venta comercial, por ejemplo, que comprende una serie de componentes y articulos desechables para efectuar una prueba diagnostica y un folleto con instrucciones; todos en una forma de envase comercialmente factible.

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Dicho kit diagnostico comprende, por lo tanto, los materiales necesarios para un ELISA de anticuerpos. En dicha prueba, por ejemplo, se recubren los pocillos de una placa de ELISA con el Astrovirus aviar de acuerdo con la invention, para formar un kit de ELISA de anticuerpo, para la detection de anticuerpos contra el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion o preparaciones o proteinas de los mismos. Tras la incubation con la muestra de ensayo, se anaden a los pocillos anticuerpos marcados reactivos con las inmunoglobulinas de la muestra de ensayo (en caso de que este presente). Entonces una reaction de color revela la presencia en la muestra de ensayo de anticuerpos especificos.

De manera similar, puede disenarse un kit de ELISA de antigeno, que comprende, por ejemplo, placas de microtitulacion recubiertas con el virus, la preparation antigenica, o la proteina de acuerdo con la invencion.

El diseno de dichos inmunoensayos puede variar. Por ejemplo, el inmunoensayo puede basarse en la competition, en lugar de la union directa. Ademas, dichas pruebas tambien pueden usar material en particulas o celular, en lugar del soporte solido de un dispositivo. La deteccion del complejo anticuerpo-antigeno formado en la prueba puede implicar el uso de anticuerpos marcados, en el que los marcadores pueden ser, por ejemplo, enzimas o moleculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o colorantes.

Ventajosamente, las vacunas y diagnosticos tal como se describen en el presente documento pueden usarse ahora en cooperation para disenar una estrategia para la erradicacion del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion en una determinada region o poblacion animal.

Leyenda de las figuras

Figura 1: muestra un alineamiento multiple de las secuencias de ADNc de una section de la ORF 1a de un numero seleccionado de aislados de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion. Referencia es la secuencia del Aislado 19. La referencia externa es la parte correspondiente de la secuencia de ADNc del genoma de un virus de referencia de ANV1 (SEQ ID NO: 1). El area recuadrada marca la region de 12 nucleotidos, que no esta presente en la ORF 1a de ANV1.

Figura 2: muestra un alineamiento multiple de las supuestas secuencias de aminoacidos, tal como se preparan mediante traduction informatizada de las secuencias de ADNc listadas en la figura 1. El area recuadrada marca los 4 aminoacidos, que no estan presentes en la proteina codificada por la ORF 1a de ANV1.

Figura 3: muestra un arbol dendrografico de los resultados de los alineamientos de secuencias de nucleotidos presentados en la figura 1.

Figura 4: presenta una representation grafica de las areas de hibridacion de los cebadores de las SEQ ID NO: 30 y 31, en relation a la localization de la region de 12 nucleotidos (representada en negrita) que es unica para los Astrovirus aviares de la invencion.

Figura 5: muestra una fotografia de un gel de agarosa tenido con bromuro de etidio, iluminado con luz UV, sobre el que se ejecuto la electroforesis de los productos de un ensayo PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 30 y 31 en una serie de muestras de ADNc. El producto esperado de una PCR positiva, una banda de aproximadamente 260 pares de bases es claramente visible, solo en el carril 5. Las reacciones RT precedentes se han efectuado con el cebador de SEQ ID NO: 3.

Carril 1: Control negativo (sin ADNc en la reaccion PCR)

Carril 2: Homogenizado de higado de pollos no infectados

Carril 3: ANV1; un aislado aleman de 1991, amplificado en 1 x CAM, 4 x saco vitelino, recogido en fluido alantoico. Carril 4: CAstV2; procedente del virus depositado en la CNCM con el numero CNCM I-2932, fluido alantoico.

Carril 5: Aislado 19 del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, fluido alantoico.

M: Carril de marcador de tamano de ADN: bandas a 200, 400, 600, 800, 1000 pb, etc.

La invencion se describira adicionalmente a continuation con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Aislamiento de un Astrovirus aviar de muestras de campo:

Se han aislado muchos aislados de Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion a partir de pollos y pavos, de diversas granjas en los Paises Bajos y Alemania. Como ejemplo tipico, en el presente documento se describe en detalle el aislamiento de la muestra n.° 161319 ("Aislado 19").

El Aislado 19 de Astrovirus se aislo a partir de un grupo de traqueas de 4 gallinas ponedoras de 36 semanas de edad, en una granja holandesa, que presentaban una reduction en el consumo de alimento, reduction en la production de huevos y un aumento de huevos de segunda calidad. Tambien padecian generalmente indigestion,

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diarrea, y problemas de movilidad.

Se mezclo tejido agrupado (0,5 - 1,0 g) de traqueas de los 4 pajaros con aproximadamente 10 ml de "medio de aclarado" (que contiene: 500 ml de HBSS [solucion salina basica de Hank] + 2 ml de Bencil penicilina sodica (1.000.000 E.I/ml) + 8 ml de estreptomicina (250 mg/ml) + 0,5 ml de Fungizona (2.000 |jg/ml) + 2 ml de NaHCO3 al 7,5%) y se homogenizaron usando un homogenizador durante 2 minutos. La suspension se centrifugo durante 15 minutos a 2000 x g a 2 - 8 °C. El sobrenadante se filtro entonces usando un filtro de 450 nm.

El fluido resultante se inoculo en la cavidad alantoica de cuatro huevos de pollo SPF embrionados de 8-9 dias (1 ml por huevo), la yema de cuatro huevos SPF embrionados de 5-6 dias (1 ml por huevo), y la CAM de cuatro huevos SPF embrionados de 9 dias (0,5 ml por huevo) y se incubaron a de 36,5 a 38,5 °C con una humedad del 40 al 55 %. Los huevos se inspeccionaron a trasluz a diario. La muerte embrionaria sucedida tras un dia de inoculacion se considero no especifica.

Los embriones de los huevos inoculados en el saco vitelino no mostraron anomalias a los 7 dias p.i. Sin embargo, se recogio fluido vitelino y se uso para un segundo pase.

Se mezclaron cuatro ml del fluido vitelino recogido del primer pase (1 ml por huevo) con 0,5 ml de "medio de pase" (que contiene: 90 ml de HBSS + 2 ml de bencil penicilina sodica (1.000.000 I.E./ml) + 8 ml de estreptomicina (250 mg/ml) + 0,5 ml de fungizona (2.000 pg/ml) + 2 ml de NaHCO3 al 7,5%). A partir de esta mezcla se inoculo 1 ml por huevo en la yema de cinco huevos SPF embrionados de 5 dias y se incubaron a de 36,5 a 38,5 °C con una humedad del 40 al 55 %. Los huevos se inspeccionaron a trasluz a diario.

En el sexto dia despues de la inoculacion, un embrion habia muerto y mostro enrojecimiento en el cuerpo. Se ensayo el fluido alantoico de este huevo respecto de Reovirus en un ensayo de precipitacion en gel de agar (AGP); fue negativo para Reovirus.

Se recogieron aproximadamente de 4 a 5 ml de la yema de este huevo con embrion anormal y se uso para pases adicionales, del mismo modo que el segundo pase.

En el tercer pase, en el quinto dia despues de la inoculacion, tres embriones habian muerto y dos de ellos mostraron enrojecimiento en el cuerpo. El fluido alantoico agrupado fue negativo en el AGP para Reovirus, y para Adenovirus de tipo 1.

En pases posteriores, aumento el titulo del aislado, ya que los embriones murieron o mostraron sintomas mas temprano tras la inoculacion. En el 6° y 7° pase la coloracion roja brillante tipica de las patas y las puntas de las alas se hizo evidente.

De manera consistente, el fluido alantoico fue negativo en pruebas de HA o AGP para IBDV, Reovirus, Adenovirus, NDV, AIV e IBV. Asimismo, un ensayo PCR para IBDV fue negativo.

Los fluidos CAM y alantoico recogidos se almacenaron congelados a -80 °C, y se usaron para caracterizacion adicional.

Ejemplo 2: Aislamiento de ARN virico:

Para el aislamiento del ARN virico total, se uso un kit QIAamp® Viral RNA mini (QiaGen™), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen: se mezclaron 140 jl de fluido que contenia virus, tal como fluido alantoico, o un homogenizado de tejido o de embrion (normalmente en cantidades de entre el 5 - 50% p/v), con tampon de extraccion preparado previamente y ARN portador. Esto se incubo a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuacion se anadio etanol puro (96 - 100 %), se mezclo, y la mezcla se aplico a una columna QIAamp Mini spin (en un tubo de recoleccion de 2 ml). Esto se centrifugo durante 1 min a 6000 x g. Se desecho el flujo pasante. La columna se lavo con tampon de lavado que contenia etanol puro. Finalmente, la columna se eluyo con 60 jl de tampon de elucion. Comunmente, el aislamiento de ARN fue seguido directamente de la production de ADNc mediante una reaction de RT.

La presencia de ARN astrovirico se verifico mediante electroforesis en gel de agarosa/formamida convencional de ARN.

Ejemplo 3: Produccion de ADNc mediante reaccion de RT:

La sintesis de la primera hebra de ADNc se efectuo usando perlas de primera hebra Ready-To-GO® You-Prime de Amersham-Pharmacia™, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen: 29 jl del ARN eluido a partir del aislamiento del ARN virico total se desnaturalizo durante 10 minutos a 65 °C, y 2 minutos sobre hielo. Esto se anadio a un tubo que contenia dos perlas, y se anadieron 4 jl de cebador 17 10 jM (SEQ ID NO: 3), hasta un volumen final de 33 jl. Esto se incubo durante 1 minuto a temperatura ambiente, se mezclo cuidadosamente

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pipeteando, y se incubo durante 1 hora a 37 °C. El ADNc se almaceno congelado a menos de -20 °C hasta su uso posterior.

Ejemplo 4: Reacciones PCR:

La PCR se uso para preparar ADN bicatenario (bc) a partir de ADNc de la reaccion de RT. Asimismo, la PCR se uso como un ensayo de detection de tipo diagnostico para identificar especificamente si los Astrovirus aviares de acuerdo con la invention estaban presentes en una muestra.

Los ingredientes de la reaccion PCR fueron de HT Biotechnology™ Ltd.: tampon Supertaq® (concentrado a 10 x) usado a una concentration 1x; enzima polimerasa Supertaq® Plus (5 U/|jl) usada a 1 U/|jl, y dNTP premezclados (10 mM), usados a 2 mM. Estos se mezclaron en agua destilada libre de RNasa.

Los cebadores usados fueron aquellos usados segun se listan en la tabla 4. Los cebadores se sintetizaron por Invitrogen™, Paises Bajos, y la solution madre de tampon se efectuo en tampon TE (pH 8,0) a 100 jM; la solution madre de trabajo estaba a una dilution de 10 jM para su uso directo.

Para una PCR estandar, se usaron los siguientes ingredientes: 27 jl de agua destilada, 5 jl de tampon Supertaq Plus 10x; 1 jl (igual a 1 unidad) de enzima Supertaq Plus; 5 jl de mezcla de dNTP 2Mm; 5 jl de cada uno del cebador directo e inverso (a 10 jM); y finalmente 2 jl de ADNc de la mezcla de reaccion de RT; alcanzando un volumen total de 50 |jl.

Las condiciones de reaccion tipicas, por ejemplo, para amplificar la ORF 1a con los cebadores F-II y R-II-3 (SEQ ID NO: 28, 29), o la ORF 1 b usando los cebadores 20 y 21 (SEQ ID NO: 32, 33) fueron:

- 1 min a 95 °C,

- 40 ciclos de: 30 s a 94 °C; 1 min a 48 °C; y 40 s a 72 °C,

- 10 min a 72 °C

- retention a 20 °C.

NB: todas las temperaturas PCR son ± aproximadamente 1 °C.

Durante las optimizaciones, se aplicaron algunas variaciones: 45 en lugar de 40 ciclos, y variaciones de la temperatura de hibridacion y tiempo en la etapa de ciclado: se usaron temperaturas entre 46 y 53 °C, a duraciones de 30 s o 1 minuto.

Para la deteccion especifica de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invencion, usando los cebadores 29 y 30 (SEQ ID NO: 30, 31) las condiciones optimas usadas para la fase de ciclado fueron: 45 ciclos, con una etapa de hibridacion de 30 s a 51 °C. Otras condiciones fueron como para la reaccion de los cebadores 20/21.

Las reacciones PCR para las reacciones de ciclo de secuenciacion tuvieron una configuration esencialmente diferente: 25 ciclos de: 10 s a 96 °C; 5 s a 50 °C; y 2 min a 60 °C, vease mas adelante.

Ejemplo 5: Analisis de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, purification y subclonacion:

Se uso electroforesis en gel de agarosa para la deteccion y visualization de los productos de la PCR producidos. Esto sirvio tambien para purificar productos PCR mediante escision y extraction, permitiendo la secuenciacion o subclonacion de estos productos aislados de la PCR.

En resumen, se prepararon geles de agarosa al 0,8 % (del tipo de baja electro-endoosmosis) en tampon TAE (pH 8,0), que contenia aproximadamente 50 jl de una solucion de bromuro de etidio a 0,5 mg/ml por 100 ml de solucion de agarosa. Se mezclo una muestra del producto de la PCR a 1:!0 con tampon de carga de muestra convencional (glicerol/SDS/azul de bromofenol). Tipicamente se incluyo un carril de marcador usando SmartLadder® de Eurogentec™ Electrophoresis, sumergido en tampon TAE, llevada a cabo normalmente durante 1 hora a 100 V para un gel de 20 x 20 x 1 cm, o hasta que el colorante azul alcanzo el extremo del agar. La visualizacion fue mediante luz UV. Los geles se fotografiaron con una camara digital.

La electroforesis en gel de agar se uso tambien para estimar la concentracion de ADN de una banda cortada y purificada; en ese caso se corrio una muestra junto con una serie de carriles que portaban diferentes cantidades de la escala de marcador de ADN.

La purificacion de bandas especificas de productos de la PCR de un gel de agarosa se efectuo usando el kit de extraccion de gel QIAquick® (QiaGen™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando bien una microcentrifugadora o el colector de vacio QIAvac®.

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Las bandas de ADN cortadas y purificadas a partir de un gel de agarosa se subclonaron en plasmidos bacterianos para su uso posterior, tal como ensayos de clonacion, secuenciacion, expresion o de deteccion de la hibridacion. Los fragmentos de ADN se clonaron en el plasmido pCR2.1 usando un vector TOPO-TA® y el kit de clonacion TOPO- TA® (Invitrogen™), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 6: Secuenciacion de ADN:

La secuenciacion de ADN se llevo a cabo mediante secuenciacion de ciclo de PCR convencional, usando una mezcla de reaccion Big Dye® Terminator Ready (ABI Prism™), y un aparato de secuenciacion automatizada ABI Prism™ 310, todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Tipicamente, se usaron de 20 a 70 ng de ADN (producto de la PCR purificado, o fragmento clonado en un vector) en una reaccion de secuenciacion, con 8 pl de mezcla de reaccion Big Dye® Terminator Ready, 1 pl de cebador 10 |jM, en agua destilada hasta un volumen total de 20 |jl. Los cebadores usados para la secuenciacion fueron normalmente los mismos que aquellos usados en la PCR para preparar el producto de ADN bc a partir del ADNc.

La PCR de ciclo de secuenciacion fue mediante 25 ciclos de: 10 s a 96 °C, 5 s a 50 °C, y 2 min a 60 °C.

Tras la PCR, las muestras se purificaron usando columnas de centrifugacion DyeEx® (QiaGen™), para la eliminacion del colorante-terminador, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando tubos Eppendorf® y una microcentrifugadora. El eluato final se resuspendio a 1:2 hasta un volumen total de 40 pl con agua destilada.

La determinacion de la secuencia se efectuo entonces mediante analisis en un analizador genetico ABI Prism® 310, con el programa informatico Data Collection version 1.0.4 y Sequence Analysis version 3.

El analisis de secuencia se efectuo usando una serie de programas, los mas usados fueron Sequencher® (Gene Codes™), y Clone Manager® (Sci. Ed. Software™). Las secuencias iniciales y finales se recortaron para eliminar lecturas de nucleotidos que se introdujeron basandose en los cebadores de la PCR desnaturalizados que se habian usado.

Las secuencias de ADN presentadas en el presente documento en las SEQ ID NO. 4 - 26 (numeros pares), son las secuencias consenso derivadas de multiples reacciones de secuenciacion. La mayor parte de las veces las secuencias se leyeron tambien a partir de ambas hebras, usando cebadores de secuenciacion directos e inversos; unicamente la SEQ ID NO: 8 se determino a partir de solo una hebra. La redundancia media fue de aproximadamente 4x por nucleotido.

Ejemplo 7: Titulacion de Astrovirus en huevos de pollo embrionados

Se inocularon diluciones en serie de factor diez de suspension de Astrovirus en el saco vitelino de huevos de pollo SPF embrionados de seis dias de edad usando una aguja 23G de 1". Posteriormente, los huevos se incubaron durante siete dias a 37 °C en una incubadora de huevos.

Los huevos se inspeccionaron a trasluz a diario. La mortalidad que sucedia a las 24 horas despues de la inoculacion se considero no especifica y por lo tanto, dichos huevos que contenian embriones muertos de manera temprana se descartaron y excluyeron del calculo del titulo de infectividad.

Los embriones que morian desde los dias 2 hasta 7 despues de la inoculacion se inspeccionaron respecto de la presencia de lesiones caracteristicas para la infeccion con el Astrovirus de acuerdo con la invencion; este fue el caso si los embriones muertos mostraban patas y puntas de las alas de color rojo brillante, e higado inflamado de color rojo oscuro. El titulo de infectividad se calculo usando un programa informatico basado en el metodo de Spearman y Karber y se expreso en DLE50 por ml.

Ejemplo 8: Produccion de Astrovirus en huevos de pollo embrionados

Los huevos de pollo SPF embrionados de nueve dias de edad se inocularon con 10A5 DLE50 de Astrovirus en el saco vitelino usando una aguja de 22G de W. Posteriormente, los huevos se incubaron a 37 °C en una incubadora de huevos.

Tras 24 horas de incubacion, los huevos se inspeccionaron a trasluz. La muerte sucedida tras las 24 horas se considero no especifica, descartandose estos huevos.

Tras 48 de incubacion, se recogio el fluido alantoico de todos los huevos restantes. El fluido se almaceno congelado a -60 °C.

El titulo de infectividad se establecio mediante titulacion en huevos de pollo embrionados o en celulas tal como se describe anteriormente.

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Ejemplo 9: Produccion de celulas primarias:

Las celulas CEL se prepararon a partir de huevos de pollo SPF embrionados de 14-16 dias de edad, aislando el higado del embrion. El higado se lavo con PBS/rojo de fenol, y se incubo durante 8-10 minutos a temperatura ambiente en una solucion que contenia tripsina en PBS. El sobrenadante se recoge a traves de una gasa de 100 |jm. Esto se repite dos veces mas, a continuacion se recogen las celulas mediante centrifugacion en un medio de cultivo rico adecuado que contenia suero de ternero fetal (FCS) al 5 %.

Las celulas CEK se prepararon de manera similar, usando los rinones de embriones de pollo SPF de aproximadamente 18 dias de edad. Los rinones se diseccionaron cuidadosamente, se lavaron, y se tripsinizaron una vez, durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuacion, las celulas CEK se filtraron y se recogieron en medio de cultivo +FCS.

Ejemplo 10: ensayo IFT:

Se usaron ensayos de inmunofluorescencia (IFG) para investigar la especificidad interespecifica de determinados antisueros, asi como para la titulacion virica. Normalmente, los IFT se llevaron a cabo en celulas primarias en placas de microtitulacion.

Cuando se usaron celulas CEK para un IFT, estas se sembraron a 10A5 celulas/100 jl en los pocillos de placas de microtitulacion de 96 pocillos. Las celulas estaban en un medio de cultivo rico convencional, con FCS al 2 % y antibioticos, y se incubaron a 37 °C en atmosfera de CO2 al 5 %. Al dia siguiente, se inoculo el virus a las celulas.

Con fines de titulacion, se usaron diluciones en serie de los virus. Las placas se incubaron entonces durante 2 dias adicionales. Entonces, se retiro el sobrenadante, y las celulas se fijaron con etanol puro a -70 °C. Las placas se pudieron almacenar a -20 °C hasta su uso. Para visualizar el virus para la titulacion, las placas se tineron con antisuero especifico. Por lo tanto, las placas se adaptaron a temperatura ambiente, se retiro el alcohol y las placas se lavaron con PBS. Se preparo una dilucion de suero anti-Astrovirus a una fuerza que se sabia que proporcionaba buena fluorescencia, pero no demasiado fondo. El primer antisuero se dispuso sobre las placas y se incubo durante 1 hora a 37 °C en una atmosfera humedecida. Entonces se lavaron las placas 3x con pBs. Despues se preparo el segundo conjugado de anticuerpo, un conjugado de IgG de cabra anti-pollo- FITC (Nordic™). Este se dispuso sobre las placas a la dilucion requerida, y se incubo de nuevo durante 1 hora a 37 °C. Tras esta incubacion se lavaron de nuevo las placas 3x con PBS, tras lo cual se anadio una mezcla 1:1 de PBS:glicerol. Entonces se almacenaron las placas en la oscuridad a 4 °C hasta su lectura mediante un microscopio de fluorescencia. Una senal positiva es la deteccion de fluorescencia especifica, que se correlaciona con signos de cpe en la capa celular.

Para la caracterizacion de suero, y las pruebas de reactividad cruzada entre especies, se prepararon placas de microtitulacion de un modo similar, usando celulas CEK o CEL. Al dia siguiente estas se infectaron con los diferentes virus que se iban a ensayar, por ejemplo, aislados de astrovirus de acuerdo con la invencion, pero tambien ANV1, y CAstV2, asi como otros patogenos aviares: Reovirus, IBV, NDV, FPV, Adenovirus, AIV, etc. La cantidad de virus fue una cantidad fija o una dilucion, segun fuese conveniente. Las placas se incubaron durante 2-3 dias.

Para probar la capacidad de un determinado antisuero para unirse a diferentes virus, el suero se incubo en las placas, y la senal se potencio mediante incubacion con conjugado. Para la optimization de la senal de union frente al fondo, se ensayo una serie de diluciones de los antisueros en PBS en diferentes diluciones de los diversos virus.

Ejemplo 11: Infection de pollos con Astrovirus

Se ensayo el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion en pollos en una configuration experimental para reproducir los sintomas de enfermedad observados en el campo, y para volver a aislar el microorganismo a partir de estos animales secundarios infectados. Esto sirvio para cumplir con los postulados de Koch para establecer que el aislado ensayado es un microorganismo patogeno y virulento y agente infeccioso causante de los sintomas observados en el campo.

Asimismo, se infecto a pollos repetidamente para ensayar la eficacia de la vacunacion por un inoculo vivo, frente a infecciones de exposition posteriores.

Finalmente, el suero total se aislo de pollos infectados experimentalmente para obtener antisuero policlonal especifico contra el Astrovirus inoculado.

Con este fin, se transfirieron pollos SPF de tipo ponedor, de raza Leghorn blanca de ambos sexos a un aislador de presion negativa a las tres semanas de edad. Los animales se asignaron a grupos de tratamiento mediante selection aleatoria, y se marcaron individualmente por medio de bandas dobles en las alas. Se les proporciono alimento convencional y agua para bebida a voluntad.

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Se tomaron muestras de sangre a intervalos regulares a lo largo del experimento, tambien en el dia cero, para determinar el estado inmunologico. A continuation se inoculo a 15 pollos a traves de tres rutas: con 0,2 ml cada uno por la ruta ocular e intramuscular, asi como con 0,5 ml por ruta oral, a 10A5 DIE50/dosis de 0,2 ml, y a 10A5,4 DIE50/dosis de 0,5 ml. El inoculo fue el Astrovirus de Aislado 19 depositado, resuspendido en agua para inyeccion. 5 pollos, colocados en el mismo aislador no fueron inoculados para servir como controles, y como centinelas. Los animales fueron inspeccionados diariamente respecto de signos clinicos de enfermedad o mortalidad.

A los 20 dias despues de la inoculation (p.i.), se desangro a un numero de pollos y se les remitio para examen histopatologico post mortem. En el dia 23 p.i. los demas pollos (previamente inoculados) recibieron un refuerzo con una dosis similar de inoculo. Tras otros 23 dias, el experimento termino, se desangro a los animales vivos y fueron examinados.

Algunas aves no fueron inoculadas inicialmente, pero se alojaron en los mismos aisladores que las aves inoculadas/infectadas; tal como se esperaba, estas aves se infectaron mediante difusion horizontal del Astrovirus.

Ejemplo 11a: Resultados de histopatologia:

Los resultados histopatologicos de los ensayos con animales fueron los siguientes: 2 pollos habian muerto, y 5 animales, de los cuales 3 eran controles tenian diarrea. Tras la histopatologia, varios animales mostraron una patologia mas o menos grave en el rinon y el tracto intestinal ya desde el dia 7 p.i. Los rinones presentaron una nefritis intersticial grave, y degeneracion tubular como signos mas destacados. El timo y la bursa mostraron linfocitosis; el pancreas mostro apoptosis y atrofia acinar; y el duodeno mostro vellos romos y fusionados.

La infection horizontal de los pollos de control no inoculados demostro la virulencia e infectividad del inoculo de Astrovirus.

Ejemplo 11b: Resultados de la PCR:

Se ensayaron muestras de rinon de todos los pollos mediante PCR respecto de senales del Astrovirus aviar de acuerdo con la invention. Tras la homogenization, y aislamiento de ARN, se prepararon muestras para RT. Estas se ensayaron mediante PCR con los cebadores de las SEQ ID NO: 30 y 31. Todas las muestras de los animales infectados fueron positivas en los ensayos, al presentar la banda de 260 pb especifica que identifica al Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion. Se incluyeron controles positivos y negativos adecuados.

Esto demostro que el agente causante de la mortalidad y signos histopatologicos fue el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion. Los sintomas observados, nefritis y diarrea, coincidieron con aquellos observados en el campo. Los problemas con las patas no pudieron reproducirse; lo mas probablemente, los pajaros usados tenian una complexion demasiado delgada como para mostrar dichos problemas, y/o las condiciones de los pollos SPF en un aislador no imitaron suficientemente la presion infectiva multiple que experimenta un pajaro en el campo.

Ejemplo 11 c: Resultados de VN:

Se incubaron cantidades fijas de aislado 19 de Astrovirus con antisueros de pollo del dia 0, dia 20 y dia 46 p.i., durante 1 hora a 37 °C. Estas muestras de virus se inocularon entonces en huevos SPF embrionados de 6 dias de edad, y se incubaron durante varios dias. A los 4 dias despues de la inoculacion del huevo, los embriones que recibieron virus tratados con suero del dia 0 habian muerto, y mostraron signos tipicos de infeccion por el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion.

Sin embargo, los virus incubados con suero tomado el dia 20, o suero del dia 46 no afectaron a los embriones. Esto demuestra que el virus del aislado 19 puede neutralizarse de manera eficaz mediante un antisuero de pollo especifico.

Esto tambien demuestra que pueden inducirse antisueros eficaces con capacidad VN en pollos tras la inoculacion con el Astrovirus aviar vivo de acuerdo con la invencion.

Ejemplo 11d: Resultados de IFT:

Los resultados de ensayos IFT de reaction cruzada usando los antisueros de pollo policlonales demostraron que un antisuero anti-aislado 19 no reconocio cualquier virus distinto de los aislados de virus del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion.

De manera similar, los antisueros especificos para ANV1 o para CAstV2 igualmente solo reconocieron al virus especifico contra el que se habian generado. Igualmente importante fue que ni el suero anti-ANV1 ni el anti-ChAstV2 se unieron a un aislado de virus del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion. Esto se aplica incluso con las cantidades de anticuerpo mas altas ensayadas (las muestras menos diluidas).

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Asimismo, ninguno de los antisueros contra otros patogenos aviares, de manera mas relevante Reovirus, pudo

unirse a los aislados de virus del Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion, o viceversa.

Esto demostro que el Astrovirus aviar de acuerdo con la invencion es un serogrupo nuevo y unico por si mismo, lo

que confirmo por lo tanto las diferencias moleculares biologicas unicas identificadas.

Las placas con celulas CEK se infectaron con Astrovirus de aislado 19, 3er pase, en diluciones en serie de factor 10

del virus. Tras dos dias, las placas se fijaron y tineron con diferentes antisueros:

- suero anti-aislado 19 agrupado del dia 33 despues de la inoculacion, 1:20 en PBS,

- anti ANV1 (cepa SE-027/2), generado en pollos; 1: 20 en PBS (el ANV1 es un aislado de ANV1 aleman, que tras la secuenciacion de ADN de regiones especificas, parecio estar mas estrechamente relacionado con la secuencia de ANV1 de referencia de GenBank, que se usa en el presente documento).

- anti CAstV2 (cepa TS9L), generado en pollos, 1: 500 en PBS (el CAstV1 derivo de la muestra que se habia depositado en la CNCM en Paris, Francia, con el numero de deposito I-2932).

- control negativo, solo PBS.

Despues de conjugacion con IgG de cabra anti-pollo, se leyeron las placas:

Virus ^ l Antisuero

Aislado 19 ANV1 CAstV2 Celulas CEK negativas

anti-aislado 19

Positivo Negativo Negativo Negativo

anti-ANV1

Negativo Positivo Negativo Negativo

anti-CAstV2

Negativo Negativo Positivo Negativo

negativo

Negativo Negativo Negativo Negativo

Ejemplo 12: Ensayos de vacunacion adicionales Vacuna inactivada:

Se vacunaran pavos y pollos con una vacuna adyuvada de Astrovirus inactivado de acuerdo con la invencion, para optimizar la dosis de antigeno.

El Astrovirus de aislado 19 se cultivo en CEL, tal como se ha descrito, y se inactiva usando beta-propiolactona (BPL) bajo el control de temperatura y pH, de acuerdo con protocolos convencionales. El Astrovirus inactivado se homogeniza en una emulsion de ag./ac. convencional que consiste en un aceite mineral ligero y emulsionantes adecuados, usando protocolos estandar.

Los pavos y pollos se alojaran en unidades aisladas: se asignaran 120 pavos comunes de dos semanas de edad a 6 grupos separados (grupo 1 - 6) segun lleguen de tal forma que cada grupo contiene 20 animales. A las tres semanas de edad, se vacunara a los pavos en los grupos 1 - 4 por ruta intramuscular con la vacuna de emulsion de ag./ac., que contiene aislado 19 de Astrovirus inactivado. Los pavos en el grupo 5 se vacunaran por ruta subcutanea con la misma vacuna de emulsion de ag./ac. y los pavos en el grupo 6 no se vacunaran para servir como controles.

De manera similar, se asignaran 180 pollos ponedores SPF de un dia de edad a 9 grupos separados (grupos 7 - - 15) segun lleguen de tal forma que cada grupo contiene 20 pollos. A las tres semanas de edad, se vacunara a los pollos en los grupos 7 - 10 por ruta intramuscular con una vacuna de emulsion de ag./ac., que contiene Astrovirus de tipo 3. Los pollos en los grupos 11 - 14 se vacunaran con la misma vacuna por la ruta subcutanea y los pollos en el grupo 15 no se vacunaran para servir como controles.

Antes del comienzo del experimento, y a las 4, 8, y 12 semanas despues de la vacunacion se extraeran muestras de sangre de todos los pavos y pollos. Los sueros se examinaran respecto de la presencia de anticuerpos especificos para los Astrovirus de acuerdo con la invencion y sus titulos, mediante IFT en celulas CEL, o mediante ensayo VN.

Este protocolo puede modificarse facilmente para incluir un estudio de duracion de la inmunidad en caso de que sea relevante, por ejemplo, manteniendo a las aves vacunadas en aisladores durante 6 - 12 meses adicionales y despues aplicando una infeccion de exposicion con un Astrovirus de acuerdo con la invencion.

Vacuna viva:

Se vacunara a polios con una dosis de Astrovirus vivo de acuerdo con la invencion, y posteriormente se les expondra a Astrovirus, para optimizar la ruta de aplicacion para una vacuna de Astrovirus vivo.

Se asignara a 100 pollos de engorde comerciales MDA+ (positivos a anticuerpos procedentes de la madre) de un dia de edad a 5 grupos separados de tal forma que cada grupo contiene 20 pollos. A la edad de un dia, se vacunara a los pollos en los grupos 1 - 4 con aislado 19 de Astrovirus vivo de fluido alantoico, mediante gotas oculares, rociado grueso, rociado de aerosol, o agua de bebida. Los pollos en el grupo 5 no seran inoculados para servir como 10 controles no vacunados. A las 4 semanas despues de la vacunacion se expondra a todos los pollos a un Astrovirus de acuerdo con la invencion. Durante las tres semanas despues de la exposicion se observara a todos los pollos diariamente respecto de la aparicion de signos clinicos de infeccion por Astrovirus y/o mortalidad. Veintiun dias despues de la exposicion se sacrificara todos los pollos restantes, y se les sometera a examen histopatologico.

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   REIVINDICACIONES

   1. Astrovirus aviar que tiene una region genomica de fase de lectura abierta (ORF) 1a, caracterizada por que la ORF 1a de dicho Astrovirus aviar, cuando se compara con la ORF 1a del virus de la nefritis aviar 1, contiene una insercion de 12 nucleotidos, estando localizada dicha insercion entre los nucleotidos correspondientes a los nucleotidos numerados 2485 y 2486 de la SEQ ID NO: 1.
2. 2. Astrovirus aviar de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que la insercion de 12 nucleotidos tiene una secuencia de acido nucleico como la presentada en la SEQ ID NO: 2.
3. 3. Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 2, caracterizado por que la ORF 1a de dicho Astrovirus aviar comprende una region que tiene una identidad de secuencia de nucleotidos de al menos el 88 % con la SEQ ID NO: 4.
4. 4. Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 3, caracterizado por que puede producirse un producto de PCR de aproximadamente 260 nucleotidos a partir de la ORF 1a de dicho Astrovirus aviar en un ensayo de PCR que usa un conjunto de cebadores representados en las SEQ ID NO: 30 y 31.
5. 5. Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 4, que es un virus como el depositado con el numero CNCM I-3895 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), del Institut Pasteur en Paris, Francia.
6. 6. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que puede neutralizar al Astrovirus aviar de la reivindicacion 5, en un ensayo de neutralizacion de virus.
7. 7. Preparacion antigenica obtenible a partir del Astrovirus aviar de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que el Astrovirus aviar esta en forma inactivada.
8. 8. Una molecula de ADN que comprende una region que tiene una identidad de secuencia de nucleotidos de al menos el 88 % con la SEQ ID NO: 4.
9. 9. Una proteina que comprende una region que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 93 % con la SEQ ID NO: 5.
10. 10. Una vacuna que comprende al Astrovirus aviar de acuerdo con la reivindicacion 5, el anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicacion 6, la preparacion antigenica de acuerdo con la reivindicacion 7 y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
11. 11. Vacuna de acuerdo con la reivindicacion 10, que comprende al menos un antigeno adicional obtenible de un microorganismo patogeno para las aves de corral.
12. 12. Compuesto o composicion para su uso en una vacuna para aves de corral, en donde el compuesto o la composicion son el Astrovirus aviar de acuerdo con la reivindicacion 5, el anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicacion 6 o la preparacion antigenica de acuerdo con la reivindicacion 7.
13. 13. Uso de un compuesto o de una composicion para la fabricacion de una vacuna para aves de corral, en donde el compuesto o la composicion son el Astrovirus aviar de acuerdo con la reivindicacion 5, el anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicacion 6 o la preparacion antigenica de acuerdo con la reivindicacion 7.
14. 14. Metodo para la fabricacion de una vacuna para aves de corral, en el que un compuesto o la composicion se mezclan con un vehiculo farmaceutico adecuado, y en el que el compuesto o la composicion son el Astrovirus aviar de acuerdo con la reivindicacion 5, el anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicacion 6 o la preparacion antigenica de acuerdo con la reivindicacion 7.