CN111041128B

CN111041128B - 一种基于实时荧光定量pcr检测鸭星状病毒3型用引物探针组、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN111041128B
Application number: CN202010047154.1A
Authority: CN
Inventors: 傅光华; 黄瑜; 傅秋玲; 程龙飞; 施少华; 万春和; 陈红梅; 刘荣昌; 林建生
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111041128A

Abstract

本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型用引物探针组，包括引物和探针、试剂盒及检测方法，涉及生物技术领域。本发明提供的引物和探针适用于荧光定量PCR扩增，并且准确地从鸭甲肝病毒、禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭呼肠孤病毒和鸭细小病毒中鉴别出鸭星状病毒3型，特异性达100％。本发明还提供了一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒方便准确地鉴定出鸭星状病毒3型的存在，操作简便，灵敏度高，检测限达21.3个拷贝，检测的组内变异系数为0.58～2.21％，组间变异系数0.68～2.53％重复性好。

Description

一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型用引物探针组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型用引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术

鸭星状病毒(Duck astrovirus，DAstV)是引起鸭病毒性肝炎的重要病原之一，为星状病毒科(astroviridae)禽星状病毒属(Avastrovirus)的成员，包括鸭星状病毒1型(DAstV-1)，鸭星状病毒2型(DAstV-2)及鸭星状病毒3 型(DAstV-3)。DAstV为无囊膜病毒，基因组为单股正链RNA、全长约7.4kb，包含3个主要的开放阅读框(ORFs)(ORF1a、ORF1b、ORF2)，编码病毒的两个非结构蛋白nsp1a、nsp1b，RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)及病毒的衣壳蛋白等，病毒基因组的5′端和3′端为非编码区，5′端非编码区长为19 nt，含有CCGAA基序，3′端非编码区为219nt，含有星状病毒共有序列s2m 基序，3′末端为poly(A)尾。

DAstV-1最早由Norfolk于1965年在英国的鸭肝炎病例中发现，当时被命名为血清2型鸭肝炎病毒(DHV-2)，随后于2005年被更名为DAstV-1。 2009年Todd等传统的血清3型鸭肝炎病毒(DHV-3)归为星状病毒属的成员，有学者鉴于其与DAstV-1M52株的序列同源性仅为64％-69％之间，建议将其暂定为DAstV-2。DAstV-3是近来在鸭群中发现的新型星状病毒，其确切的分类地位尚不明确，据该病毒基因序列与DAstV-1及DAstV-2同源性均较低，学者建议另外设立为DAstV-3。3种DAstV间的抗原性和基因组序列同源性差异比较明显。

鸭星状病毒感染可引起鸭发生病毒性肝炎，病雏鸭常呈现角弓反张、肝脏出血充血、肾脏肿大，鸭群病死率可达50％以上。近年来，尽管养鸭产业不断升级，集约化、规模化程度越来越高，鸭病毒性肝炎依然是严重威胁养鸭业健康发展的重要传染病之一。Liao和刘宁等多个研究团队分别在江西、广东、山西、北京、内蒙、安徽和山东等地开展DAstV-3流行病学调查，表明在不同品种、日龄的鸭粪样中均检测到该病毒核酸，阳性率30％-83.9％，即成年鸭是DAstV-3带毒者，并通过消化道途径向外排毒；在孵化过程中死亡的胚蛋及新生雏鸭也检测到不同程度的DAstV-3感染，提示该病毒可能经卵垂直传播，是引起鸭胚死亡的原因之一。

实时荧光定量PCR是一种通过测定荧光信号强度来达到对样品中目的基因含量进行检测的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。该方法在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

我国鸭群鸭星状病毒DAstV-3感染的分布范围较广，对养鸭业发展影响大，当前国内外主要采用病毒分离及常规PCR方法检测鸭星状病毒 DAstV-3，尚未见能够实时定量的荧光定量的引物、探针及其应用方法相关研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型用引物探针组、试剂盒及检测方法。本发明提供的方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好和快速的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型用引物探针组，包括引物和探针，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述探针具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述探针的5'末端标记有荧光报告基团FAM，3' 末端标记有荧光淬灭基团TAMRA。

本发明还提供了一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型的试剂盒，包括质粒标准品、上述技术方案所述的引物和探针。

优选地，所述引物的工作摩尔浓度为0.04～0.8μmol/L。

优选地，所述引物的工作摩尔浓度为0.2μmol/L。

优选地，所述探针的工作摩尔浓度为0.04～0.4μmol/L。

优选地，所述探针的工作摩尔浓度为0.2μmol/L。

优选地，所述质粒标准品的浓度为2.13×10⁷copies/μL。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂盒检测鸭星状病毒3型的检测方法，包括：以含鸭星状病毒3型序列的标准质粒为模板，用无菌水进行梯度稀释后，利用上述技术方案所述的引物和探针进行PCR扩增，得到荧光检测结果。

优选地，所述PCR扩增的扩增体系包括以下组分含量：Premix Ex Taq ^TM混合液12.5μL，10μmol/L正向引物0.5μL，10μmol/L反向引物0.5μL， 5μmol/L探针1μL，质粒标准品1μL，补足去离子水至25μL。

优选地，所述PCR扩增的扩增程序为95℃预变性30s；95℃ 5s，55℃ 10s， 72℃20s，40个循环。

本发明的有益效果：本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型用引物探针组，包括引物和探针，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述探针具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述探针的5'末端标记有荧光报告基团FAM，3'末端标记有荧光淬灭基团TAMRA。本发明提供的引物和探针适用于荧光定量PCR扩增，并且准确地从鸭甲肝病毒、禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭呼肠孤病毒和鸭细小病毒中鉴别出鸭星状病毒 3型，特异性达100％。

本发明还提供了一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒方便准确地鉴定出鸭星状病毒3型的存在，操作简便，灵敏度高，检测限达21.3个拷贝，检测的组内变异系数为 0.58～2.21％，组间变异系数0.68～2.53％重复性好。

附图说明

图1为鸭星状病毒3型(DAstV-3)荧光定量PCR方法的标准曲线；

图2为鸭星状病毒3型(DAstV-3)荧光定量PCR方法的敏感性分析的扩增曲线；对不同浓度参考品的线性与灵敏度进行实时荧光PCR检测分析，其中，1：2.13×10⁷copies/μL；2：2.13×10⁶copies/μL；3：2.13×10⁵copies/μL； 4：2.13×10⁴copies/μL；5：2.13×10³copies/μL；6：2.13×10²copies/μL；7：2.13×10¹copies/μL；

图3为鸭星状病毒3型(DAstV-3)荧光定量PCR方法的特异性分析的扩增曲线，其中，1：鸭星状病毒3型(DAstV-3)；2：H9亚型禽流感病毒；3：鸭坦布苏病毒；4：鸭瘟病毒；5：鸭呼肠孤病毒；6：番鸭细小病毒；7：鸭甲肝病毒。

具体实施方式

本发明根据鸭星状病毒3型(DAstV-3)非结构蛋白nsp1a的保守区域序列，应用引物设计软件Primer 5设计一对扩增目的片段为278bp的引物，其扩增产物用于制备标准品，在该标准品序列中选取一段保守序列，应用引物设计软件Beacon designer 7.5能扩增148bp的荧光定量PCR引物 (DAstV-3F1和DAstV-3R1)和TaqMan荧光探针(DAstV-3P)。

在本发明中，用于扩增制备标准品的引物具有如序列表中SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，所述SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为：TGTATGG ATAATGAAATTGATGATGAGGGCGCTGAAGAATGGTATGATGACATGGT TGCTGACACAATGCGCAATGAACAAATAGATCGGGAAATTGAAGCACA AATGGAGGAAGAAGGTTATTTCGCCCAGAAGAAAGCCCTTAAAACTTT AGCTAATCAGGCTCAGCAGCGAGTTCGTAAGACTTTTTGTGATCAGGC ACTCTTACACATTATTGAGATCCGCGAGGACAAAGTGAGAACTGTCAAAATTGAAACCCAAGAAGAGAGTGCTACTCA。

在本发明中，所述PCR扩增正向引物具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为：DAstV-3F1：5' -CGCAATGAACAAATAGATCGGG-3'；反向引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为：DAstV- 3R1：5'-ATGTGTAAGAGTGCCTGATCAC-3'；所述探针具有如序列表中SE Q IDNo.3所示的核苷酸序列，所述SEQ ID No.3所示的核苷酸序列：DA stV-3P：5'-FAM-TCGCCCAGAAGAAAGCCCTTAAAACT-TAMRA-3'，其中探针5'末端标记荧光报告基团FAM，3'末端标记荧光淬灭基团TAMRA。

在本发明中，所述引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。

本发明提供的试剂盒中包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物的工作摩尔浓度独立的优选为0.04～0.8μmol/L，更优选为0.2μmol/L。

本发明提供的试剂盒中包括探针，所述探针的工作摩尔浓度优选为0.04 ～0.4μmol/L，更优选为0.2μmol/L。

在本发明中，所述质粒标准品的制备方法优选包括：用DNA/RNA提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit)提取的鸭星状病毒DAstV-3核酸为模板，以上游引物DAstV-3F2和下游引物DAstV-3R2进行RT-PCR扩增，扩增片段大小为278bp，(该扩增片段含有实时荧光定量PCR检测的靶基因序列)。上述引物均在福州博尚生物技术有限公司合成。

在本发明中，所述上游引物DAstV-3F2的序列如序列表中SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；所述下游引物DAstV-3R2的序列如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述SEQ ID No.5所示的核苷酸序列为TGTATGGATAA TGAAATTGAT；所述SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为TGAGTAGCACT CTCTTCTTGGG。

在本发明中，所述RT-PCR扩增包括病毒第一链cDNA合成及目的片段的PCR扩增两部分。参照Vazyme公司HiScript第一链cDNA合成试剂盒说明书对鸭星状病毒DAstV-3基因组RNA进行反转录反应，获得病毒基因组cDNA。第一链cDNA合成反应体系为：2×RT混合物10μL；HiScript 酶混合物2μL；10μM的六碱基随机引物1μL；1pg^-1μg的RNA模板4 μL，用去离子水补充至20μL；反应程序为：25℃ 10min，50℃ 30min；最后85℃下灭活5min，反转录产物-20℃保存备用。

目的基因的PCR扩增参照Vazyme公司Phanta Max Super-Fidelity DN A聚合酶使用说明书进行。以获得的病毒第一链cDNA为模板进行目的基因片段扩增。反应体系为：2×PCR混合物25μL；Phanta Max DNA聚合酶 1μL；10μM的dNTPs 1μL；10μM的上下游引物(DAstV-3F2和DAstV- 3R2)各1μL；15ng/μL的模板cDNA 2μL，用去离子水补充至50μL；扩增条件为：95℃预变性3min，随后进入PCR循环(95℃ 30s、53℃ 30s、7 2℃ 35s)，35个循环，72℃延伸10min。反应结束后，取5μL扩增产物进行琼脂凝胶电泳，确定扩增效果及获得的产物是否符合预期大小。

在本发明中，所述PCR扩增获得的目的片段经1％的琼脂糖凝胶电泳纯化回收，回收产物克隆入pMD18-T载体中。克隆质粒经化学法转化DH5α感染体细胞后，通过蓝白斑随机挑取3个阳性克隆进行序列测定分析，取测序结果确定为鸭星状病毒DAstV-3序列的克隆进行扩大培养，应用商品化质粒提取试剂盒提取质粒，应用nanodrop2000测定获得的纯化质粒浓度，并以此作为质粒标准品。

在本发明中，所述纯化质粒浓度优选为2.13×10⁷拷贝/微升。

在本发明中，所述PCR扩增的扩增体系优选包括以下组分含量：Premix Ex Taq ^TM混合液12.5μL，10μmol/L正向引物0.5μL，10μmol/L反向引物 0.5μL，5μmol/L探针1μL，质粒标准品1μL，补足去离子水至25μL。

在本发明中，所述所述PCR扩增的扩增程序优选为95℃预变性30s；95℃ 5s，55℃10s，72℃ 20s，40个循环。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)DAstV-3荧光定量PCR引物及探针的设计与制备

参照鸭星状病毒DAstV-3非结构蛋白nsp1a的保守区域序列，应用引物设计软件Primer 5设计一对扩增目的片段为278bp的引物，其扩增产物用于制备标准品，在该标准品序列中选取一段保守序列，应用引物设计软件 Beacon designer 7.5能扩增148bp的荧光定量PCR引物(DAstV-3F1和 DAstV-3R1)和TaqMan荧光探针(DAstV-3P)，所述PCR扩增引物及探针的序列分别为：

上游引物DAstV-3F1：5'-CGCAATGAACAAATAGATCGGG-3'

下游引物DAstV-3R1：5'-ATGTGTAAGAGTGCCTGATCAC-3'

探针DAstV-3P为：5'-FAM-TCGCCCAGAAGAAAGCCCTTAAAA CT-TAMRA-3'，其中探针5'末端标记荧光报告基团FAM，3'末端标记荧光淬灭基团TAMRA。引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。

(2)制备阳性质粒标准品

设计标准样品扩增引物具体为参照鸭星状病毒DAstV-3非结构蛋白 nsp1a的保守区域序列，应用引物设计软件Primer 5设计一对扩增目的片段为278bp的引物，其扩增产物用于制备标准品，所述PCR扩增引物序列分别为：

上游引物DAstV-3F2：5'-TGTATGGATAATGAAATTGAT-3'

下游引物DAstV-3R2：5'-TGAGTAGCACTCTCTTCTTGGG-3'

参照北京全式金公司Easypure病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取鸭星状病毒DAstV-3病毒RNA，保存于-70℃冰箱备用。

参照Vazyme公司HiScript第一链cDNA合成试剂盒说明书对鸭星状病毒DAstV-3基因组RNA进行反转录反应，获得病毒基因组cDNA。具体过程为：首先配制20μL反应体系(2×RT混合物10μL；HiScript酶混合物2 μL；10μM的六碱基随机引物1μL；1pg-1μg的RNA模板4μL，最后用无 RNAase酶的去离子水补充至总体积20μL)，将配制的RT反应混合液放入 PCR仪中，参照以下程序进行反转录：首先于25℃孵育10min；继而在50℃条件下反转录30min；最后反应产物在85℃下灭活5min，反转录产物-20℃保存备用。

参照Vazyme公司Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶使用说明书，以鸭星状病毒DAstV-3病毒cDNA为模板进行PCR扩增反应，反应体系为： 2×PCR混合物25μL；PhantaMax Super-Fidelity DNA聚合酶1μL；10μM 的高纯度dNTPs 1μL；10μM的上下游引物(DAstV-3F2和DAstV-3R2)各 1μL；15ng/μL的模板cDNA2μL，最后用去离子水补充至总体积50μL；扩增条件为：95℃预变性3min，随后进入PCR循环(95℃30s、53℃30s、72℃ 35s)，35个循环，72℃延伸10min。反应结束后，取5μL扩增产物进行琼脂凝胶电泳，确定扩增效果及获得的产物是否符合预期大小。

制备阳性标准品质粒具体为将PCR扩增产物经回收纯化后，克隆到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑筛选法挑取疑似阳性质粒进行PCR鉴定，并进行序列测定复核。将序列测定确定为阳性标准品质粒的克隆株进行扩大培养并提取获得阳性标准品质粒。

(3)建立鸭星状病毒DAstV-3荧光定量PCR检测体系

实时荧光定量PCR反应体系以含鸭星状病毒DAstV-3序列的标准质粒为模板，用无菌水进行10倍梯度稀释(2.13×10⁷、2.13×10⁶、2.13×10⁵、2.13×10⁴、 2.13×10³、2.13×10²、2.13×10¹copies/μL)，在不同退火温度(51℃～61℃)、引物终浓度(0.04μM～0.8μM,即0.125μL～2μL)和探针终浓度(0.04μM ～0.4μM,即0.25μL～2μL)下进行PCR扩增，通过系统平台观察FAM信号强弱及扩增曲线，评估退火温度、时间、引物和探针浓度不同变量对鸭星状病毒DAstV-3实时荧光定量PCR检测效果的影响。

所述荧光定量PCR反应体系为25μL的反应体系，具体为：Premix Ex Taq ^TM混合液12.5，扩增引物DAstV-3F1/DAstV-3R1(10μM)各0.5μL、探针DAstV-3P(5μM)1μL，标准品模板1μL，补足去离子水至25μL。

所述荧光定量PCR反应程序为：首先95℃预变性30s，进入PCR循环 (95℃5s、55℃10s、72℃20s(收集荧光信号))，循环40次。

(4)荧光定量PCR检测体系标准曲线的制作

应用上述荧光定量PCR反应体系和反应条件对不同浓度的标准品进行实时荧光定量PCR扩增，获得不同浓度标准品的扩增曲线。以标准品起始浓度(C)的常用对数(logC)作为横坐标，以出现荧光的循环阈值(cycle threshold,Ct值)为纵坐标，获得该扩增方法的扩增曲线。根据以上结果推导出标准品起始拷贝数与循环阈值的线性回归方程，获得其敏感性实验数据。

以10¹copies/μL-10⁷copies/μL的鸭星状病毒DAstV-3的阳性标准品质粒分别作为模板进行PCR扩增反应，得到鸭星状病毒DAstV-3荧光定量PCR方法的标准曲线(图1)，由图可知每个反应体系中模板浓度在10¹copies/μL ～10⁷copies/μL的范围内有很好的线性关系，标准曲线的斜率为3.13，相关系数为0.997，扩增效率为1.09，符合实验设计的预期效果。图2为鸭星状病毒3 型(DAstV-3)荧光定量PCR方法的敏感性分析的扩增曲线；对不同浓度参考品的线性与灵敏度进行实时荧光PCR检测分析，其中，1： 2.13×10⁷copies/μL；2：2.13×10⁶copies/μL；3：2.13×10⁵copies/μL；4： 2.13×10⁴copies/μL；5：2.13×10³copies/μL；6：2.13×10²copies/μL；7： 2.13×10¹copies/μL。从图2上可以看出，本发明所建立的鸭新型星状病毒 DAstV-3实时荧光定量PCR检测方法的检测下限为21.3个拷贝。

(5)荧光定量PCR检测特异性

运用建立的荧光定量PCR检测方法，对鸭星状病毒DAstV-3及感染鸭的常见病毒，如H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒及鸭甲肝病毒进行检测，结果仅鸭星状病毒DAstV-3检测为阳性，其他病原未检测到荧光信号，结果见图3。

(6)重复性试验

实时荧光定量PCR方法检测标准阳性样品的组内变异系数为 0.58～2.21％，组间变异系数0.68～2.53％，结果见表1，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

表1实时荧光定量PCR变异系数

(7)临床应用

利用建立的鸭星状病毒DAstV-3实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法对临床收集的66份疑似鸭星状病毒DAstV-3感染样品进行检测后发现，检测到7份鸭星状病毒感染阳性，阳性率为10.6％，其他样本均未检出鸭星状病毒DAstV-3。将66份样本用普通RT-PCR方法进行验证，结果与本发明的方法一致，符合率为100％。进一步证明本发明方法的准确性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型用引物探针组、试剂盒及检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcaatgaac aaatagatcg gg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtgtaaga gtgcctgatc ac 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgcccagaa gaaagccctt aaaact 26

<210> 4

<211> 278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtatggata atgaaattga tgatgagggc gctgaagaat ggtatgatga catggttgct 60

gacacaatgc gcaatgaaca aatagatcgg gaaattgaag cacaaatgga ggaagaaggt 120

tatttcgccc agaagaaagc ccttaaaact ttagctaatc aggctcagca gcgagttcgt 180

aagacttttt gtgatcaggc actcttacac attattgaga tccgcgagga caaagtgaga 240

actgtcaaaa ttgaaaccca agaagagagt gctactca 278

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtatggata atgaaattga t 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgagtagcac tctcttcttg gg 22

Claims

1.一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型用引物探针组，包括引物和探针，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述探针具有如SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列；所述探针的5'末端标记有荧光报告基团FAM，3'末端标记有荧光淬灭基团TAMRA。

2.一种基于实时荧光定量PCR检测鸭星状病毒3型的试剂盒，其特征在于，包括质粒标准品、权利要求1所述的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的工作摩尔浓度为0.04~0.8μmol/L。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的工作摩尔浓度为0.2μmol/L。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的工作摩尔浓度为0.04~0.4μmol/L。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的工作摩尔浓度为0.2μmol/L。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒标准品的浓度为2.13×10⁷copies/μL。