CN109852733A - 一种检测鸭星状病毒的方法及其使用的试剂盒 - Google Patents

一种检测鸭星状病毒的方法及其使用的试剂盒 Download PDF

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CN109852733A CN201910259995.6A CN201910259995A CN109852733A CN 109852733 A CN109852733 A CN 109852733A CN 201910259995 A CN201910259995 A CN 201910259995A CN 109852733 A CN109852733 A CN 109852733A
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黄超杰
江遥
邹婧
蒋慧
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Abstract

本发明公开了一种检测鸭星状病毒的方法及其使用的试剂盒。该试剂盒含有由引物对丙和探针P3组成的成套试剂，引物对丙由引物F3和引物R3组成，引物对丙的靶序列含有特异DNA片段丙；特异DNA片段丙的核苷酸序列如序列表中序列17所示；探针P3为15‑30个核苷酸组成的单链DNA分子，与特异DNA片段丙中的部分区段反向互补或相同。采用本发明提供的试剂盒检测鸭星状病毒，不仅操作步骤简单、检测周期缩短，而且精密度高、特异性好且灵敏度高。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种检测鸭星状病毒的方法及其使用的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测鸭星状病毒的方法及其使用的试剂盒。
背景技术
实时荧光定量PCR技术(Realtime fluorescence quantitative PCR，q-PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量分子检测技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。由于实时荧光定量PCR技术的扩增及分析等全过程可以在单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果，同时该技术可以通过在统一体系中添加标记不同荧光基团的探针实现多重检测，因此实时荧光定量PCR技术是一种具有实时、准确、快速、简便等特点的分子检测技术。
鸭病毒性肝炎(Duck Viral hepatitis，DVH)是危害养鸭业的主要疾病之一，该病主要由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)引起。DHV曾经分为三个血清型，即鸭肝炎病毒1型(DHV-1)、鸭肝炎病毒2型(DHV-2)、鸭肝炎病毒3型(DHV-3)。DHV-1已更名为鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A Virus，DHAV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝病毒属(Avihepatovirus)，呈世界范围分布，目前已发现的DHAV又可分为3个基因型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，其中DHAV-1呈世界范围分布，DHAV-2仅在中国台湾省有报道，DHAV-3流行于韩国、越南和中国大陆。鸭肝炎病毒2型和3型均属于星状病毒科禽星状病毒属，现已分别更名为鸭星状病毒1型(Duck astrovirus type1，DastV-1)和鸭星状病毒2型(Duckastrovirus type2，DastV-2)，这两种鸭星状病毒在我国均有检出报道。此外，2013年北京发现了鸭星状病毒3型(Duck astrovirus type3，DastV-3)，DastV-3的GenBank登录号为KT725224.1，这为鸭病毒性肝炎的检测工作又增添一层的困难。
目前关于鸭星状病毒的检测技术和方法已经远远满足不了鸭星状病毒引起的肝炎疫情需求。首先现有用于鸭星状病毒检测的多重RT-PCR技术需要两步法PCR扩增，再经过琼脂糖凝胶电泳才能进行结果判读，不仅周期长，整个扩增检测环节需要4-5h，而且操作复杂，同时需要人工介入的步骤多，多次的开盖操作很容易造成检测环境的气溶胶污染，影响结果的判读；其次多重RT-PCR技术检测由于需要添加多对引物在同一体系中进行扩增，由于引物之间的交叉影响，多重RT-PCR的灵敏度要比单重RT-PCR低得多，容易造成一些早期感染样品的漏检，满足不了现代分子检测技术的要求；再者，市面上关于鸭星状病毒检测的技术仅针对于最常见的鸭星状病毒亚型(如DastV-1、DastV-2)的检测技术，很容易造成由其它亚型引起的疫情时(如DastV-3)的漏检或诊断的困难，远远满足不了市场和实际的需求。迄今为止，还没有一种能够覆盖鸭星状病毒全部亚型(DastV-1、DastV-2和DastV-3)的检测试剂盒或检测方法。
发明内容
本发明的目的是检测鸭星状病毒的全部亚型DastV-1、DastV-2和DastV-3。
本发明首先保护检测鸭星状病毒的成套试剂；所述成套试剂可由引物对丙和探针P3组成；所述引物对丙可由引物F3和引物R3组成；所述引物对丙的靶序列可含有特异DNA片段丙；所述特异DNA片段丙可为如下y1)或y2)：
y1)序列表中序列17所示的DNA分子；
y2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述探针P3可为15-30个(如15-21个、21-30个、15个、21个或30个)核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段丙中的部分区段反向互补或相同。
所述引物F3可为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；
a2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物R3可为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列8所示的单链DNA分子；
b2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的单链DNA分子。
所述探针P3可为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；
c2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的单链DNA分子。
上述任一所述探针P3的一端具有荧光标记，另一端具有荧光淬灭基团。
所述荧光标记可为FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或Texas Red。
所述荧光淬灭基团可为MGB、BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTM RQ或LowaBlackTM FQ。
本发明还保护上述任一所述成套试剂中的引物对丙。
本发明还保护上述任一所述成套试剂的制备方法，可为将上述任一所述引物对丙和上述任一探针P3分别单独包装。
本发明还保护上述任一所述引物对丙的制备方法，可为将上述任一所述引物F3和上述任一引物R3分别单独包装。
本发明还保护上述任一所述成套试剂或上述任一所述引物对丙的应用，可为如下d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒；
d2)制备用于检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒的试剂盒；
d3)鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒；
d3)制备用于鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒的试剂盒。
本发明还保护含有上述任一所述成套试剂或上述任一所述引物对丙的试剂盒。
所述试剂盒还可包括内标。所述内标可为重组质粒甲。所述重组质粒甲可为将双链DNA分子I和克隆载体(如pUC57载体)连接得到的重组质粒。所述双链DNA分子I可为人β-Actin基因特异型保守序列。所述双链DNA分子I的核苷酸序列可如序列表中序列13所示。
所述试剂盒还可包括阴性质控品。所述阴性质控品具体可为无菌的TE缓冲液。
所述试剂盒还可包括阳性质控品。所述阳性质控品可为重组质粒乙。重组质粒乙可为将双链DNA分子II和克隆载体(如pUC57载体)连接得到的重组质粒。所述双链DNA分子II可为通用型鸭星状病毒特异性保守序列，即在DastV-1、DastV-2和DastV-3中均完全一致的序列。所述双链DNA分子II的核苷酸序列可如序列表中序列14所示。
所述试剂盒具体可由上述任一所述成套试剂(或上述任一所述引物对丙)、内标、阴性质控品和阳性质控品组成。
本发明还保护上述任一所述试剂盒的应用，可为如下d1)或d3)：
d1)检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒；
d3)鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒。
本发明还保护一种检测待测样品是否含有或疑似含有鸭星状病毒的方法，具体可为A1)或A2)或A3)。
A1)以待测样品的RNA/DNA为模板，以上述任一所述成套试剂进行qPCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述RNA/DNA的qPCR，则待测样品中含有或疑似含有鸭星状病毒；如果所述成套试剂不能实现对所述RNA/DNA的qPCR，则所述待测样品不含有或疑似不含有鸭星状病毒。
A2)以待测样品的cDNA为模板，以上述任一所述引物对丙进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对丙可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测样品中含有或疑似含有鸭星状病毒；如果所述引物对丙不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则所述待测样品不含有或疑似不含有鸭星状病毒。
A3)检测待测样品的cDNA中是否含有特异DNA片段丙，然后进行如下评判：如果待测样品的cDNA中含有特异DNA片段丙，则待测样品中含有或疑似含有鸭星状病毒；如果待测样品的cDNA中不含有特异DNA片段丙，则所述待测样品不含有或疑似不含有鸭星状病毒；
所述特异DNA片段丙为如下y1)或y2)：
y1)序列表中序列17所示的DNA分子；
y2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子。
上述任一所述方法中，所述待测样品可为动物粪便样本、病毒的灭活疫苗样本或病毒。所述动物粪便样本可为鸭粪便样本。所述鸭粪便样本具体可为感染了鸭星状病毒的鸭粪便样本。所述病毒的灭活疫苗样本具体可为禽流感病毒H5亚型的灭活疫苗样本、禽流感病毒H7亚型的灭活疫苗样本、禽流感病毒H9亚型的灭活疫苗样本、鸭甲型肝炎病毒的灭活疫苗样本、鸡痘病毒的灭活疫苗样本或新城疫病毒的灭活疫苗样本。所述病毒可为DastV-1、DastV-2、DastV-3、禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H9亚型、鸭甲型肝炎病毒、鸡痘病毒或新城疫病毒。
本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒的方法，具体可为B1)或B2)或B3)。
B1)以待测病毒的RNA/DNA为模板，以上述任一所述成套试剂进行qPCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述RNA/DNA的qPCR，则待测病毒为候选的鸭星状病毒；如果所述成套试剂不能实现对所述RNA/DNA的qPCR，则待测病毒为候选的非鸭星状病毒。
B2)以待测病毒的cDNA为模板，以上述任一所述引物对丙进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对丙可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的鸭星状病毒；如果所述引物对丙不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的非鸭星状病毒；
B3)检测待测病毒的cDNA中是否含有特异DNA片段丙，然后进行如下评判：如果待测病毒的cDNA中含有特异DNA片段丙，则待测病毒为候选的鸭星状病毒；如果待测病毒的cDNA中不含有特异DNA片段丙，则待测病毒为候选的非鸭星状病毒；
所述特异DNA片段丙为如下y1)或y2)：
y1)序列表中序列17所示的DNA分子；
y2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子。
上述任一所述方法中，所述待测病毒可为DastV-1、DastV-2、DastV-3、禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H9亚型、鸭甲型肝炎病毒、鸡痘病毒或新城疫病毒。
上述任一所述方法中，所述进行qPCR的反应体系可包括qPCR反应液、酶混合液、内标溶液和模板。所述模板可为待测样品的RNA/DNA或待测病毒的RNA/DNA。
上述任一所述方法中，所述进行qPCR的反应体系具体可由qPCR反应液、酶混合液、内标溶液和模板组成。所述模板可为待测样品的RNA/DNA或待测病毒的RNA/DNA。
上述任一所述方法中，所述进行qPCR的反应体系具体可为40μL，由20μLqPCR反应液、5μL酶混合液、5μL内标溶液和10μL模板组成。所述模板可为待测样品的RNA/DNA或待测病毒的RNA/DNA。
上述任一所述qPCR反应液可由dNTP、上述任一所述成套试剂、内标引物F、内标引物R、内标探针和含Mg2+的缓冲液组成。qPCR反应液中，dNTP的浓度可为200μM，内标引物F的浓度可为200mM、内标引物R的浓度可为200mM、内标探针的浓度可为100mM，引物F3的浓度可为400mM，引物R3的浓度可为400mM，探针P3的浓度可为200mM。
所述内标引物F的核苷酸序列如序列表中序列10所示。
所述内标引物R的核苷酸序列如序列表中序列11所示。
所述内标探针的核苷酸序列如序列表中序列12所示。
所述内标探针的一端具有荧光标记且与探针P3的荧光标记不同，另一端具有荧光淬灭基团(可与探针P3的荧光淬灭基团相同，也可以不同)。在本发明的实施例中，探针P3的5’末端具有FAM荧光标记，内标探针的5’末端具有ROX荧光标记。探针P3和内标探针的3’末端均具有荧光淬灭基团MGB。
所述酶混合液由热启动的Taq DNA聚合酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂(RNasin)和含50％(v/v)甘油的Tris缓冲液组成。酶混合液中，热启动的Taq DNA聚合酶的浓度为1U/μL，M-MLV逆转录酶的浓度为40U/μL，RNA酶抑制剂(RNasin)的浓度为5U/μL。
所述内标溶液为上述任一所述重组质粒甲的TE缓冲液。内标溶液中，重组质粒甲的浓度可为1.0×105copies/mL。
上文中，对qPCR的结果可进行如下分析：
(1)以循环数为横坐标，荧光信号强度为纵坐标，分别绘制探针P3的荧光标记所在通道(简称通道甲)的扩增曲线和内标探针的荧光标记所在通道(简称通道乙)的扩增曲线；
(2)根据分析后图像调节基线的Start值、Stop值以及阈值的Value值(根据实际情况自行调整，Start值可为3-15、Stop值可为5-20，阴性对照扩增曲线平直或低于阈值线)；
(3)质量控制
(3-1)阳性对照：通道甲和通道乙均显示“S型”扩增曲线且Ct值≤32。
(3-2)阴性对照：通道甲不显示“S型”扩增曲线，通道乙显示“S型”曲线且Ct值≤32。
(3-1)和(3-2)的两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，实验无效，需要重新进行实验。
(4)结果判读
(4-1)如果通道甲和通道乙均显示“S型”扩增曲线且Ct值≤37，则待测样品的RNA/DNA中鸭星状病毒RNA阳性，即待测样品含有鸭星状病毒(如果待测样品为病毒，则该病毒为鸭星状病毒)；
(4-2)如果通道甲不显示“S型”扩增曲线且Ct值显示为Undet或No Ct，通道乙显示“S型”扩增曲线且Ct值≤37，则待测样品的RNA/DNA中鸭星状病毒RNA阴性，即待测样品不含有鸭星状病毒(如果待测样品为病毒，则该病毒不为鸭星状病毒)；
(4-3)如果通道甲显示“S型”扩增曲线且37＜Ct值≤40，通道乙显示“S型”扩增曲线且Ct值≤37，则重复1次实验，然后进行如下判断：如果通道甲显示“S型”扩增曲线，则待测样品的RNA/DNA中鸭星状病毒RNA阳性，即待测样品含有鸭星状病毒(如果待测样品为病毒，则该病毒为鸭星状病毒)；如果通道甲不显示“S型”扩增曲线，则待测样品的RNA/DNA中鸭星状病毒RNA阴性，即待测样品不含有鸭星状病毒(如果待测样品为病毒，则该病毒不为鸭星状病毒)；
(4-4)如果通道甲和通道乙均不显示“S型”扩增曲线且Ct值显示为Undet或No Ct，则实验无效，建议更换一批试剂重新实验。
上文中，qPCR指实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)。
上述任一所述鸭星状病毒可为DastV-1、DastV-2和DastV-3中的至少一种。
本发明提供的方法具有如下优点：1、操作步骤简化，检测周期缩短，2h即可获得检测结果；2、采用闭管操作，解决气溶胶污染问题，保证结果的可靠性；3、可一次性检测鸭星状病毒的3种亚型，杜绝漏检，进一步提高检出率；4、反应体系中添加内标引物和内标探针，可以监控从核酸提取到扩增全过程，使检测结果容易判读；5、精密度高；6、特异性好(可从禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H9亚型、鸡痘病毒、新城疫病毒和鸭甲型肝炎病毒中准确鉴定出鸭星状病毒)；7、灵敏度高(检测鸭星状病毒的最小检出限为1.0×103copies/mL，即达到10copies/反应体系)。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例3中步骤一的实验结果。
图2为实施例3中步骤二的实验结果。
图3为线性实验中FAM通道的扩增曲线。
图4为线性实验中绘制的标准曲线。
图5为最低检出限实验的结果。
图6为精密度实验的结果。
图7为特异性实验的结果。
图8为RT-PCR检测的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，RT-PCR指反转录PCR(Reverse transcription PCR)，qPCR指实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)。
下述实施例中，采用的引物和探针均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，热启动的Taq DNA聚合酶为TaKaRa公司的Ex Taq Hot Start Version(货号为：RR006)，M-MLV逆转录酶为TaKaRa公司的MMLV Reverse Transcriptase(货号为：639574)，MGIEasy病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)为深圳华大智造科技有限公司的产品。含Mg2+的缓冲液为TaKaRa公司的产品，货号为9152A。
下述实施例中的TE缓冲液均为含0.5mMpH8.0的EDTA、10mM的Tris-HCl缓冲液。
Ct值(cycle threshold，Ct)为：每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。阈值的设定一般是将其设定为恰好可以覆盖住阴性对照的荧光值处，可以很好的去除反应管荧光值即背景。
实施例1、检测鸭星状病毒的试剂盒的制备
一、检测鸭星状病毒的成套试剂的制备
鸭星状病毒不同亚型的基因组保守区域在个别位置同样存在一定的突变率。本发明的发明人根据鸭星状病毒基因组的核苷酸序列，设计并合成成套试剂甲、成套试剂乙和成套试剂丙。成套试剂甲、成套试剂乙和成套试剂丙均可以扩增鸭星状病毒。
成套试剂甲由引物对甲和探针P1组成。引物对甲由引物F1和引物R1组成。探针P1的5′末端具有FAM荧光标记，3′末端具有荧光淬灭基团MGB。引物F1和引物R1的靶序列如序列表中序列15所示。
成套试剂乙由引物对乙和探针P2组成。引物对乙由引物F2和引物R2组成。探针P2的5′末端具有FAM荧光标记，3′末端具有荧光淬灭基团MGB。引物F2和引物R2的靶序列如序列表中序列16所示。
成套试剂丙由引物对丙和探针P3组成。引物对丙由引物F3和引物R3组成。探针P3的5′末端具有FAM荧光标记，3′末端具有荧光淬灭基团MGB。引物F3和引物R3的靶序列如序列表中序列17所示。
引物和探针的基本信息详见表1。
表1
注：FAM表示FAM荧光标记，ROX表示ROX荧光标记，MGB表示荧光淬灭基团MGB，W表示A/T，R表示A/G，“-”表示不存在。
二、检测鸭星状病毒的试剂盒的制备
1、qPCR反应液
qPCR反应液由dNTP(dATP、dUTP、dGTP和dCTP的混合物)、成套试剂(成套试剂甲、成套试剂乙或成套试剂丙)、内标引物F、内标引物R、内标探针和含Mg2+的缓冲液组成。内标引物F、内标引物R和内标探针的基本信息见表1。qPCR反应液中，dNTP的浓度为200μM，内标引物F的浓度为200mM、内标引物R的浓度为200mM、内标探针的浓度为100mM，成套试剂中的上游引物(即引物名称中含有“F”的引物)的浓度为400mM，成套试剂中的下游引物(即引物名称中含有“R”的引物)的浓度为400mM，成套试剂中的探针的浓度为200mM。
2、酶混合液
酶混合液由热启动的Taq DNA聚合酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂(RNasin)和含50％(v/v)甘油的Tris缓冲液组成。酶混合液中，热启动的Taq DNA聚合酶的浓度为1U/μL，M-MLV逆转录酶的浓度为40U/μL，RNA酶抑制剂(RNasin)的浓度为5U/μL。
3、内标溶液
内标溶液为重组质粒甲的TE缓冲液。内标溶液中，重组质粒甲的浓度为1.0×105copies/mL。
重组质粒甲为将双链DNA分子I和pUC57载体连接得到的重组质粒。双链DNA分子I为人β-Actin基因特异型保守序列。双链DNA分子I的核苷酸序列为：5′-CGAGCATGGCTATAGGTTCACCACCATGGCCGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATCAAAGAGAAGCTGTGCTATGTTGCCCTGGACTTCGAGCAGGAGATGGCCACGGCGGCCTCCAGCTCCTCCCTAGAGAAGAGCTACGAGCTGCCCGATGGCCAGGTCATCACCATCGGCAACGAGCGGTTCCGCTGCC-3′(序列表中序列13)。
4、阴性质控品
阴性质控品为无菌的TE缓冲液。
5、阳性质控品
阳性质控品为含重组质粒乙的TE缓冲液。阳性质控品中，重组质粒乙的浓度为1.0×106copies/mL。
重组质粒乙为将双链DNA分子II和pUC57载体连接得到的重组质粒。双链DNA分子II为通用型鸭星状病毒特异性保守序列，即在DastV-1、DastV-2和DastV-3中均完全一致的序列。双链DNA分子II的核苷酸序列为：5′GTGAGAGGWTGATGWTGGAGAAGGCCTTGGGGGGCACCTCACAACCTCTCGTCCGSTTTRAGAAGGGTGGACAATGGGAGCAACCATCTGGCTCCAGCAGCCGTGGCCACGCCGAGTAGGATCGAGGGTACARCTGC-3′(序列表中序列14)。
6、检测鸭星状病毒的试剂盒为将qPCR反应液、酶混合液、内标溶液、阴性质控品和阳性质控品组装在一起得到的产品(qPCR反应液、酶混合液、内标溶液、阴性质控品和阳性质控品均为独立包装)。
实施例2、检测鸭星状病毒的方法的建立
1、待测样品的RNA/DNA的提取
用MGIEasy病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)提取待测样品的RNA/DNA，得到待测样品的RNA/DNA。
2、配制反应体系
反应体系甲为40μL，由20μLqPCR反应液、5μL酶混合液、5μL内标溶液和10μL待测样品的RNA/DNA组成。
反应体系乙(作为阴性对照)为40μL，用等体积的阴性质控品代替待测样品的RNA/DNA，其它同反应体系甲。
反应体系乙(作为阳性对照)为40μL，用等体积的阳性质控品代替待测样品的RNA/DNA，其它同反应体系甲。
3、qPCR扩增
将反应体系(反应体系甲、反应体系乙或反应体系丙)进行qPCR扩增。以循环数为横坐标，荧光信号强度为纵坐标，绘制FAM通道的扩增曲线。
反应程序见表2。
表2
4、结果分析
(1)根据分析后图像调节基线的Start值、Stop值以及阈值的Value值(根据实际情况自行调整，Start值可为3-15、Stop值可为5-20，阴性对照扩增曲线平直或低于阈值线)。
(2)质量控制
(2-1)阳性对照：FAM通道和ROX通道均显示“S型”扩增曲线且Ct值≤32。
(2-2)阴性对照：FAM通道不显示“S型”扩增曲线，ROX通道显示“S型”曲线且Ct值≤32。
(2-1)和(2-2)的两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，实验无效，需要重新进行实验。
(3)结果判读
(3-1)如果FAM通道和ROX通道均显示“S型”扩增曲线且Ct值≤37，则待测样品的RNA/DNA中鸭星状病毒RNA阳性，即待测样品含有鸭星状病毒；
(3-2)如果FAM通道不显示“S型”扩增曲线且Ct值显示为Undet或No Ct，ROX通道显示“S型”扩增曲线且Ct值≤37，则待测样品的RNA/DNA中鸭星状病毒RNA阴性，即待测样品不含有鸭星状病毒；
(3-3)如果FAM通道显示“S型”扩增曲线且37＜Ct值≤40，ROX通道显示“S型”扩增曲线且Ct值≤37，则重复1次实验，然后进行如下判断：如果FAM通道显示“S型”扩增曲线，则待测样品的RNA/DNA中鸭星状病毒RNA阳性，即待测样品含有鸭星状病毒；如果FAM通道不显示“S型”扩增曲线，则待测样品的RNA/DNA中鸭星状病毒RNA阴性，即待测样品不含有鸭星状病毒；
(3-4)如果FAM通道和ROX通道均不显示“S型”扩增曲线且Ct值显示为Undet或NoCt，则实验无效，建议更换一批试剂重新实验。
实施例3、实施例1制备的试剂盒的筛选
对实施例1制备的试剂盒进行筛选，实质即对实施例1制备的成套试剂甲、成套试剂乙和成套试剂丙进行筛选。
一、根据不同浓度的模板进行筛选
1、DastV-1的总RNA的提取
用MGIEasy病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)提取DastV-1的RNA，然后进行5倍梯度稀释，得到核酸浓度为0.2ng/μL的溶液1、核酸浓度为0.04ng/μL的溶液2和核酸浓度为0.008ng/μL的溶液3。
2、将实施例2中步骤2的“待测样品的总RNA”替换为溶液1、溶液2或溶液3，其它步骤均不变。
3、同实施例2中步骤3。
实验结果见图1(第1对引物组合为成套试剂甲，第2对引物组合为成套试剂乙，第3对引物组合为成套试剂丙)。结果表明，成套试剂甲、成套试剂乙和成套试剂丙虽然可以对不同浓度的DastV-1的RNA进行扩增，但成套试剂丙的扩增效率最高，效果最好。
二、根据模板类型进行筛选
1、用MGIEasy病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)提取DastV-3的RNA，得到DastV-3的RNA。DastV-3的RNA的核酸浓度为0.5ng/μL。
2、将实施例2中步骤2的“待测样品的总RNA”替换为“DastV-3的RNA”，其它步骤均不变。
3、同实施例2中步骤3。
实验结果见图2(第1对引物组合为成套试剂甲，第2对引物组合为成套试剂乙，第3对引物组合为成套试剂丙)。结果表明，成套试剂甲、成套试剂乙和成套试剂丙虽然可以对DastV-3的RNA进行扩增，但成套试剂丙的扩增效果最好。
根据上述实验结果，选择成套试剂丙进行后续实验。
实施例4、线性实验
1、取重组质粒乙，用TE缓冲液进行梯度稀释，分别得到浓度为1.0×109copies/mL的溶液A1、浓度为1.0×108copies/mL的溶液A2、浓度为1.0×107copies/mL的溶液A3、浓度为1.0×106copies/mL的溶液A4、浓度为1.0×105copies/mL的溶液A5、浓度为1.0×104copies/mL的溶液A6、浓度为1.0×103copies/mL的溶液A7和浓度为1.0×102copies/mL的溶液A8。
2、将实施例2中步骤2的“待测样品的总RNA”替换为“线性参比品(溶液A1、溶液A2、溶液A3、溶液A4、溶液A5、溶液A6、溶液A7或溶液A8)”，其它步骤均不变。每个线性参比品做3个平行样。
3、同实施例2中步骤3。
FAM通道的扩增曲线见图3。以线性参比品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线见图4。结果表明，实施例1制备的检测鸭星状病毒的试剂盒(其中的成套试剂为成套试剂丙)在1.0×103copies/mL-1.0×109copies/mL之间具有很好的线性关系，同时该试剂盒拟合的线性方程为：y＝-3.6274x+47.438(R2＝0.9998)，其中y代表Ct值，x代表线性参比品浓度的对数值。
实施例5、最低检出限实验
1、取重组质粒乙，用TE缓冲液进行梯度稀释，分别得到浓度为1.0×104copies/mL的溶液A6、浓度为1.0×103copies/mL的溶液A7和浓度为1.0×102copies/mL的溶液A8。
2、将实施例2中步骤2的“待测样品的总RNA”替换为“检出限参比品(溶液A6、溶液A7或溶液A8)”，其它步骤均不变。每个检出限参比品做20个平行样。
3、同实施例2中步骤3。
如果FAM通道显示“S型”扩增曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来；如果FAM通道不显示“S型”扩增曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
FAM通道的扩增曲线见图5。结果表明，当检出限参比品为溶液A6或溶液A7的时候，FAM通道均显示“S型”扩增曲线；当检出限参比品为溶液A8的时候，20个平行样中，7个样品的FAM通道显示“S型”扩增曲线，13个样品的FAM通道不显示“S型”扩增曲线。结果表明，实施例1制备的检测鸭星状病毒的试剂盒(其中的成套试剂为成套试剂丙)检测鸭星状病毒的最小检出限为1.0×103copies/mL，即达到10copies/反应体系。
以上结果表明，本发明提供的试剂盒(其中的成套试剂为成套试剂丙)具有较高的灵敏度。
实施例6、精密度实验
1、取重组质粒乙，用TE缓冲液进行梯度稀释，分别得到浓度为1.0×107copies/mL的溶液A3和浓度为1.0×104copies/mL的溶液A6。
2、将实施例2中步骤2的“待测样品的总RNA”替换为“精密度参比品(溶液A3或溶液A6)”，其它步骤均不变。每个精密度参比品做10个平行样。
3、同实施例2中步骤3。
FAM通道的扩增曲线见图6。循环数的统计结果见表3。结果表明，两个浓度的数据变异系数均小于5％(溶液A3的数据变异系数为2.28％，溶液A6的数据变异系数为2.16％。变异系数＝(循环数的标准偏差/循环数的平均值)×100％。
表3
以上结果表明，本发明提供的试剂盒(其中的成套试剂为成套试剂丙)具有较高的精密度。
实施例7、特异性实验
禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H9亚型、鸡痘病毒、新城疫病毒和鸭甲型肝炎病毒为与鸭星状病毒具有相同感染部位的常见病毒。
待测样本1：禽流感病毒H5亚型的灭活疫苗样本。
待测样本2：禽流感病毒H7亚型的灭活疫苗样本。
待测样本3：禽流感病毒H9亚型的灭活疫苗样本。
待测样本4：鸡痘病毒的灭活疫苗样本。
待测样本5：新城疫病毒的灭活疫苗样本。
待测样本6：鸭甲型肝炎病毒的灭活疫苗样本。
待测样本7：鸭星状病毒1型。
待测样本8：鸭星状病毒2型。
待测样本9：鸭星状病毒3型。
1、用MGIEasy病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)提取待测样本的DNA/RNA，得到模板。
2、将实施例2中步骤2的“待测样品的总RNA”替换为“步骤1提取的待测样本的DNA/RNA”，其它步骤均不变。
3、同实施例2中步骤3。
FAM通道的扩增曲线见图7(DastV-1为鸭星状病毒1型，DastV-2为鸭星状病毒2型，DastV-3为鸭星状病毒3型)。结果表明，当待测样本为待测样本7、8、9的时候，FAM通道显示“S型”扩增曲线。当待测样本为待测样本1、2、3、4、5、6的时候，FAM通道均不显示“S型”扩增曲线。
以上结果表明，本发明提供的试剂盒(其中的成套试剂为成套试剂丙)对鸭星状病毒1型、鸭星状病毒2型和鸭星状病毒3型具有很高的特异性。
实施例8、与RT-PCR检测的结果比较
1、用MGIEasy病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)提取感染鸭星状病毒(DastV-1、DastV-2或DastV-3)的鸭粪便样本的RNA；然后用RNase free ddH2O稀释，得到鸭星状病毒浓度为1.0×104copies/mL的RNA溶液。
2、采用本发明提供的试剂盒(其中的成套试剂为成套试剂丙)检测
(1)将实施例2中步骤2的“待测样品的总RNA”替换为“步骤1得到的RNA溶液”，其它步骤均不变。
(2)同实施例2中步骤3。
(3)同实施例2中步骤4。
结果表明，DastV-1、DastV-2和DastV-3的FAM通道均显示“S型”扩增曲线。
3、RT-PCR技术检测
(1)取步骤1得到的RNA溶液，采用引物F3和引物R3为引物进行RT-PCR，得到PCR扩增产物。
(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳。
实验结果见图8(1为DastV-1，2为DastV-2，3为DastV-3)。
结果表明，采用RT-PCR检测鸭星状病毒，由于检测灵敏度低而出现漏检现象。
<110> 深圳华大智造科技有限公司
<120> 一种检测鸭星状病毒的方法及其使用的试剂盒
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gtgagaggat gttgttggag aa 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
agttgtaccc tcgatcctac tc 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
cctctcgtcc ggtttgaga 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gtgagaggat gttgttggag a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gttgtaccct cgatcctact c 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
aacctctcgt ccggtttga 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<220>
<221> misc_feature
<222> （11）
<223> W is A or T
<400> 7
gaggatgatg wtggagaagg c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
gcagttgtac cctcgatcct 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<220>
<221> misc_feature
<222> （11）
<223> R is A or G
<400> 9
aacctctcgt ccggtttra 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
cgagcatggc tataggttca cc 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
ggcagctcgt agctcttctc tag 23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
ttgatgtcac gcacgatttc ccgct 25
<210> 13
<211> 191
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
cgagcatggc tataggttca ccaccatggc cgagcgggaa atcgtgcgtg acatcaaaga 60
gaagctgtgc tatgttgccc tggacttcga gcaggagatg gccacggcgg cctccagctc 120
ctccctagag aagagctacg agctgcccga tggccaggtc atcaccatcg gcaacgagcg 180
gttccgctgc c 191
<210> 14
<211> 137
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<220>
<221> misc_feature
<222> （9，15）
<223> W is A or T
<220>
<221> misc_feature
<222> （60，133）
<223> R is A or G
<220>
<221> misc_feature
<222> （56）
<223> S is G or C
<400> 14
gtgagaggwt gatgwtggag aaggccttgg ggggcacctc acaacctctc gtccgstttr 60
agaagggtgg acaatgggag caaccatctg gctccagcag ccgtggccac gccgagtagg 120
atcgagggta carctgc 137
<210> 15
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<220>
<221> misc_feature
<222> （9，15）
<223> W is A or T
<220>
<221> misc_feature
<222> （60，133）
<223> R is A or G
<220>
<221> misc_feature
<222> （56）
<223> S is G or C
<400> 15
gtgagaggwt gatgwtggag aaggccttgg ggggcacctc acaacctctc gtccgstttr 60
agaagggtgg acaatgggag caaccatctg gctccagcag ccgtggccac gccgagtagg 120
atcgagggta carct 135
<210> 16
<211> 134
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<220>
<221> misc_feature
<222> （9，15）
<223> W is A or T
<220>
<221> misc_feature
<222> （60，133）
<223> R is A or G
<220>
<221> misc_feature
<222> （56）
<223> S is G or C
<400> 16
gtgagaggwt gatgwtggag aaggccttgg ggggcacctc acaacctctc gtccgstttr 60
agaagggtgg acaatgggag caaccatctg gctccagcag ccgtggccac gccgagtagg 120
atcgagggta carc 134
<210> 17
<211> 133
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
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<221> misc_feature
<222> （5，11）
<223> W is A or T
<220>
<221> misc_feature
<222> （56，129）
<223> R is A or G
<220>
<221> misc_feature
<222> （52）
<223> S is G or C
<400> 17
gaggwtgatg wtggagaagg ccttgggggg cacctcacaa cctctcgtcc gstttragaa 60
gggtggacaa tgggagcaac catctggctc cagcagccgt ggccacgccg agtaggatcg 120
agggtacarc tgc 133

Claims (10)

1.检测鸭星状病毒的成套试剂；所述成套试剂由引物对丙和探针P3组成；所述引物对丙由引物F3和引物R3组成；所述引物对丙的靶序列含有特异DNA片段丙；所述特异DNA片段丙为如下y1)或y2)：
y1)序列表中序列17所示的DNA分子；
y2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述探针P3为15-30个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段丙中的部分区段反向互补或相同。
2.如权利要求1所述成套试剂，其特征在于：
所述引物F3为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；
a2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物R3为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列8所示的单链DNA分子；
b2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的单链DNA分子；
所述探针P3为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；
c2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的单链DNA分子。
3.如权利要求1或2所述成套试剂，其特征在于：所述探针P3的一端具有荧光标记，另一端具有荧光淬灭基团。
4.如权利要求3所述成套试剂，其特征在于：所述荧光标记为FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或Texas Red；所述荧光淬灭基团为MGB、BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTM RQ或LowaBlackTM FQ。
5.权利要求1或2所述成套试剂中的引物对丙。
6.权利要求1至4任一所述成套试剂或权利要求5所述引物对丙的应用，为如下d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒；
d2)制备用于检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒的试剂盒；
d3)鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒；
d3)制备用于鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒的试剂盒。
7.含有权利要求1至4任一所述成套试剂或权利要求5所述引物对丙的试剂盒。
8.权利要求7所述试剂盒的应用，为如下d1)或d3)：
d1)检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒；
d3)鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒。
9.一种检测待测样品是否含有或疑似含有鸭星状病毒的方法，为A1)或A2)或A3)：
A1)以待测样品的RNA/DNA为模板，以权利要求1至4任一所述成套试剂进行qPCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述RNA/DNA的qPCR，则待测样品中含有或疑似含有鸭星状病毒；如果所述成套试剂不能实现对所述RNA/DNA的qPCR，则所述待测样品不含有或疑似不含有鸭星状病毒；
A2)以待测样品的cDNA为模板，以权利要求5所述引物对丙进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对丙可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测样品中含有或疑似含有鸭星状病毒；如果所述引物对丙不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则所述待测样品不含有或疑似不含有鸭星状病毒；
A3)检测待测样品的cDNA中是否含有特异DNA片段丙，然后进行如下评判：如果待测样品的cDNA中含有特异DNA片段丙，则待测样品中含有或疑似含有鸭星状病毒；如果待测样品的cDNA中不含有特异DNA片段丙，则所述待测样品不含有或疑似不含有鸭星状病毒；
所述特异DNA片段丙为如下y1)或y2)：
y1)序列表中序列17所示的DNA分子；
y2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子。
10.一种鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒的方法，为B1)或B2)或B3)：
B1)以待测病毒的RNA/DNA为模板，以权利要求1至4任一所述成套试剂进行qPCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述RNA/DNA的qPCR，则待测病毒为候选的鸭星状病毒；如果所述成套试剂不能实现对所述RNA/DNA的qPCR，则待测病毒为候选的非鸭星状病毒；
B2)以待测病毒的cDNA为模板，以权利要求5所述引物对丙进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对丙可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的鸭星状病毒；如果所述引物对丙不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的非鸭星状病毒；
B3)检测待测病毒的cDNA中是否含有特异DNA片段丙，然后进行如下评判：如果待测病毒的cDNA中含有特异DNA片段丙，则待测病毒为候选的鸭星状病毒；如果待测病毒的cDNA中不含有特异DNA片段丙，则待测病毒为候选的非鸭星状病毒；
所述特异DNA片段丙为如下y1)或y2)：
y1)序列表中序列17所示的DNA分子；
y2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111041128A (zh) * 2020-01-16 2020-04-21 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种基于实时荧光定量pcr检测鸭星状病毒3型用引物探针组、试剂盒及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120087932A1 (en) * 2009-04-01 2012-04-12 Agri-Food Biosciences Institute Diagnostic test for virus
CN105256073A (zh) * 2015-11-17 2016-01-20 四川农业大学 3型鸭甲肝病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120087932A1 (en) * 2009-04-01 2012-04-12 Agri-Food Biosciences Institute Diagnostic test for virus
CN105256073A (zh) * 2015-11-17 2016-01-20 四川农业大学 3型鸭甲肝病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QINFENG LIAO等: "Genetic characterization of a novel astrovirus in Pekin ducks", 《INFECTION, GENETICS AND EVOLUTION》 *
张大丙: "鸭甲肝病毒的分子生物学研究进展", 《中国兽医杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111041128A (zh) * 2020-01-16 2020-04-21 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种基于实时荧光定量pcr检测鸭星状病毒3型用引物探针组、试剂盒及检测方法
CN111041128B (zh) * 2020-01-16 2022-05-17 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种基于实时荧光定量pcr检测鸭星状病毒3型用引物探针组、试剂盒及检测方法

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