CN105112564A - 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒 - Google Patents

一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105112564A
CN105112564A CN201510553343.5A CN201510553343A CN105112564A CN 105112564 A CN105112564 A CN 105112564A CN 201510553343 A CN201510553343 A CN 201510553343A CN 105112564 A CN105112564 A CN 105112564A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
hpv
probe
ligase enzyme
e7mrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510553343.5A
Other languages
English (en)
Inventor
陈华云
陈嘉昌
刘淑园
肖湘文
赵丽
彭俊然
方凤银
叶映玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd filed Critical GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201510553343.5A priority Critical patent/CN105112564A/zh
Publication of CN105112564A publication Critical patent/CN105112564A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种运用连接酶检测高危型HPV？E6/E7？mRNA的方法及试剂盒。本发明方法的技术要点在于，特异性连接引物在连接酶作用下连接成与HPV？E6/E7？mRNA靶序列互补的cDNA片段，后期的荧光PCR反应体系中的一对通用引物即可扩增成功连接的cDNA片段，即本发明应用单重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中检测18种可引起宫颈癌的高危型HPV，有效解决了引物过多导致的扩增效率低下及灵敏度低等问题。且本发明检测HPV？E6、E7？mRNA的目的在于筛查出已经发生HPV感染人群中的高危群体，相对现有的HPV基因组L1区分型检测更具有临床诊断意义。

Description

一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种高危型HPV荧光检测试剂盒，特别涉及一种运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的方法及试剂盒。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。宫颈癌的早期发现和治疗是有效治疗宫颈癌的关键。
现有研究表明，宫颈癌的主要病因是由高危型人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）的持续感染或反复感染所致。人乳头瘤病毒检测在世界范围内多个国家已经成为宫颈癌筛查和健康管理的一个重要部分。人乳头瘤病毒属于乳头瘤病毒科的乳头瘤病毒属，为球形无包膜的双链DNA病毒，直径为52～55nm。病毒基因组为双链环状DNA，约7.8～8.0kb，其中包括8个早期开放读码框架（E1-E8）、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，E6、E7基因编码的E6、E7蛋白分别与人体细胞基因组中抑癌基因p53和Rb结合，引起细胞增殖失控，抑癌基因对DNA的损伤修复功能丧失，导致癌前病变及癌症的发生。而晚期读码框架L1和L2基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。
人乳头瘤病毒有多种基因型，依据不同型别致宫颈癌发生危险性的高低可将其分为低危型和高危型HPV。99.7%的宫颈癌与高危型HPV感染有关，其中80%的高危型HPV感染为无致癌风险的一过性感染，两年内将自行消退；20%高危型HPV感染为有潜在致癌风险的持续性/整合感染，但只有伴随持续性E6、E7mRNA转录，产生E6、E7癌蛋白，才会最终致癌。E6、E7mRNA是目前宫颈癌最佳的风险评估指标。检测高危型HPVE6/E7mRNA的意义在于：1）高危型HPV病毒癌基因E6、E7mRNA转录和表达是宫颈癌的关键病因。2）筛查出因高危型HPV感染而可能发生细胞学异常的人群。有E6、E7mRNA转录的就是高危人群，无E6、E7mRNA转录的如果细胞学检测结果正常就不是高危人群。通过E6、E7mRNA转录筛查可以筛查出已经发生HPV感染人群中的高危群体，进而筛查出将来可能进一步进展的宫颈癌高危人群，对细胞学检测结果进行补充更为特异。
现有的运用荧光PCR方法进行高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的技术的缺点有：①一般是针对HPV基因组的L1基因进行检测，检测结果不如E6/E7基因的检测结果有临床诊断意义。②前期一般都需要经过步骤繁琐的HPV核酸提取；③核酸提取完成后运用普通Taqman探针的方法进行多重PCR扩增，意味着一个反应管含有多条引物，引物间的相互干扰导致扩增灵敏度低且耗时长；④一般都是FAM和HEX两个荧光通道检测，无法具体区分高危HPV型别，难以满足实际使用的需要。
开发出可以快速、高效检测高危型HPVE6/E7mRNA的方法及试剂盒，具有非常实际的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的方法及试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的技术包括如下步骤：
1）针对需要检测的每个高危型HPVE6/E7mRNA序列设计其相应的上下游连接引物、特异性荧光探针及一对荧光PCR通用引物，上游连接引物为普通引物，下游连接引物为5’磷酸化标记引物；
2）上下游连接引物与样本提取后的RNA靶片段互补配对，在连接酶的作用下，上下游连接引物连接成与靶片段完全互补配对的cDNA序列；
3）将连接后的cDNA序列作为荧光PCR反应的模板，仅一对通用引物即可扩增所有型别连接后的cDNA序列，检测反应体系的荧光变化，达到对样本高危型HPV基因检测的目的。
运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，包括连接反应管、荧光PCR反应管、阴性对照和阳性对照，其中，连接反应管含连接体系（含连接酶系统和上下游连接引物），荧光PCR反应管含荧光PCR体系（含热启动Taq酶系统、通用引物及各型别对应的荧光探针），荧光PCR体系中的荧光探针为HPV特异性MGB探针。
连接引物的序列如下：
序列编号 名称 序列（5’→3’）
SEQ ID NO：1 引物1 GGATGCCTTGGCTTCTCACTTTGTACGCACAACCGAAGCG
SEQ ID NO：2 引物2 TAGAGTCACACTTGCAACCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：3 引物3 GGATGCCTTGGCTTCTCACTTACTGCTGGGATGCACACC
SEQ ID NO：4 引物4 ACGGACACACAAAGGACAGCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：5 引物5 GGATGCCTTGGCTTCTCATTGCATGCAGCATACGGACTC
SEQ ID NO：6 引物6 CTATCTCTATATACTACTCTTACGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：7 引物7 GGATGCCTTGGCTTCTCAGGGCACACGATTCCAAATG
SEQ ID NO：8 引物8 AGCCCATTAACAGCTCTTGCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：9 引物9 GGATGCCTTGGCTTCTCACTGTGGCTGGTTGTGCTTG
SEQ ID NO：10 引物10 TCCATCTGGCCGGTCCAAGCCCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：11 引物11 GGATGCCTTGGCTTCTCAATATACCTCACTCCGCTGTAA
SEQ ID NO：12 引物12 TTCTTGTTTGCAGTATACACGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：13 引物13 GGATGCCTTGGCTTCTCACACTAAATGCAAATTCATAT
SEQ ID NO：14 引物14 ACCTCGGTTTGCTGTAGTGGTCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：15 引物15 GGATGCCTTGGCTTCTCACAAAGAACCAGCCATTAC
SEQ ID NO：16 引物16 ACCCCGTTCCCTCCCCGTCGCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：17 引物17 GGATGCCTTGGCTTCTCATGTAGTACCATACACAGACC
SEQ ID NO：18 引物18 TGCTATAACGTCTATACTCTCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：19 引物19 GGATGCCTTGGCTTCTCATCAGGACATAATGGAGTTTG
SEQ ID NO：20 引物20 ACAAATTATACATCTAATAGCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：21 引物21 GGATGCCTTGGCTTCTCAAGCTGTCAATGCCTTCTTGC
SEQ ID NO：22 引物22 AGAACACACAGCCAAGTTGCCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：23 引物23 GGATGCCTTGGCTTCTCATTTAATTCAGTGCATGCAAA
SEQ ID NO：24 引物24 ATTATATACCTCAGCACGTGTCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：25 引物25 GGATGCCTTGGCTTCTCATATTCTTAAATCTGCAAATGTA
SEQ ID NO：26 引物26 AAGTCATATACCTCAGATCCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：27 引物27 GGATGCCTTGGCTTCTCAATGCAGAGGAATATTCAATG
SEQ ID NO：28 引物28 TTGTGCTCAAGTCAGGCAGTCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：29 引物29 GGATGCCTTGGCTTCTCATACCTCGCTCAGATGGTGCA
SEQ ID NO：30 引物30 GGCTTCGTGGACGTTCCTGTCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：31 引物31 GGATGCCTTGGCTTCTCAATTTAAGTCGCCAAAGGCAA
SEQ ID NO：32 引物32 ATTCATATACCTCTGTCCGTCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：33 引物33 GGATGCCTTGGCTTCTCAATTCACTTCGTCACATAACG
SEQ ID NO：34 引物34 CTTGTAGCTTGTATGGTCGTCGAACCTGGAAGAGCACAC
SEQ ID NO：35 引物35 GGATGCCTTGGCTTCTCAAGCACCATACACAGACCTAC
SEQ ID NO：36 引物36 TATACCTTCTGTATTCTCTACGAACCTGGAAGAGCACAC
通用引物的序列如下：
序列编号 名称 序列（5’→3’）
SEQ ID NO：37 引物37 GGATGCCTTGGCTTCTCA
SEQ ID NO：38 引物38 GTGTGCTCTTCCAGGTTCG
优选的，通用引物序列的特征表现为：一条与上游连接引物的5’端部分序列完全一致，另一条与下游连接引物的3’端部分序列互补配对，通用引物的长度在20～30bp。
HPV特异性MGB探针的序列如下：
序列编号 名称 序列（5’→3’）
SEQ ID NO：39 探针1 CGCACAACCGAAGCGTAGAG
SEQ ID NO：40 探针2 CTTACTGCTGGGATGCACACC
SEQ ID NO：41 探针3 AGCATACGGACTCCTATCTCTAT
SEQ ID NO：42 探针4 CACGATTCCAAATGAGCCCA
SEQ ID NO：43 探针5 CTGTGGCTGGTTGTGCTTGT
SEQ ID NO：44 探针6 ACTCCGCTGTAATTCTTGTTTGCA
SEQ ID NO：45 探针7 GCAAATTCATATACCTCGGTTTG
SEQ ID NO：46 探针8 ACCAGCCATTACACCCCGTT
SEQ ID NO：47 探针9 CATACACAGACCTGCTATAACG
SEQ ID NO：48 探针10 ACATAATGGAGTTTGACAAAT
SEQ ID NO：49 探针11 CAATGCCTTCTTGCAGAACACA
SEQ ID NO：50 探针12 AGTGCATGCAAAATTATATACC
SEQ ID NO：51 探针13 TCTGCAAATGTAAAGTCATA
SEQ ID NO：52 探针14 ATATTCAATGTTGTGCTCAA
SEQ ID NO：53 探针15 TCAGATGGTGCAGGCTTCGTGGA
SEQ ID NO：54 探针16 TCGCCAAAGGCAAATTCATA
SEQ ID NO：55 探针17 TCACATAACGCTTGTAGCTTGT
SEQ ID NO：56 探针18 CACAGACCTACTATACCTTCT
上述探针的3’端连接有MGB，5’端连接有荧光基团，其中，探针1用于检测常见高危型HPV基因型16型；探针2用于检测常见高危型HPV基因型18型；探针3～18分别用于检测另外13种常见高危型HPV基因型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82和3种少见高危型HPV基因型26、53、73。
优选的，上述连接酶系统中的连接酶仅能以RNA为模板进行连接反应，且每人份连接体系中连接酶用量为1U。
优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统中添加有UDG酶，能有效防污染，使得本发明试剂盒的灵敏度更高，最低检出量为1.0E+03拷贝/反应。
优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为5U，dNTPs为0.2mmol/L，UDG酶为0.3U。
优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒还设有RNA提取液，RNA提取液的组成成分为EDTA的浓度为0.001mol/L、Tris的浓度为0.01mol/L。
优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒中所使用的探针1连接的荧光基团不同于探针2，3～18连接的荧光基团。
优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒中所使用的探针2连接的荧光基团不同于探针1，3～18连接的荧光基团。
本发明的有益效果是：
1)本发明的试剂盒适用于定性检测宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中18种可引起宫颈癌的高危型HPVE6/E7mRNA。
2)应用本发明的试剂盒中的RNA提取液可省去前期对样本进行提取的繁琐步骤。
3)本发明应用单重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中检测18种HPV基因型。在同时检测13种常见高危型HPV基因型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）和三种少见高风险HPV基因型（26、53、73）之外，同时还能具体分型高危型HPV基因型16型和18型。
4)本发明中的荧光PCR体系只有一对通用引物，即可扩增在连接酶系统中成功连接的18种高危型HPV基因型的cDNA靶片段，有效解决了引物过多导致的扩增效率低下及灵敏度低等问题。
5)本发明的检测试剂盒，检测通量高，大大降低了筛查成本。
附图说明
图1～3为本发明技术的反应原理图，图4～7为本试剂盒检测范围内的HPV型别检测结果示意图：
图1为连接引物与通用引物示意图，如图所示：上游通用引物序列与上游连接引物的5’端部分序列完全一致，而下游通用引物序列则与下游连接引物的3’端部分序列完全反向互补配对；
图2为连接反应示意图，如图所示：上游连接引物的部分序列（非与上游通用引物序列一致的部分）与靶片段mRNA（targetmRNA）互补配对，下游连接引物的部分序列（非与下游通用引物序列反向互补配对的部分）与靶片段mRNA互补配对，上下游连接引物在连接酶作用下连接成与靶片段mRNA完全互补配对的cDNA序列，即连接产物（ligatedproduct）；
图3为通用引物PCR反应示意图，如图所示：首先，下游通用引物与连接产物3’端反向互补配对结合，在Taq酶作用下，下游通用引物PCR扩增产生双链DNA片段；之后，双链DNA片段变性为两条单链DNA，上下游通用引物分别与两条单链DNA片段反向互补配对结合，即开始常规的单重对称PCR过程，产生大量双链DNA片段；
图4为HPV16型单一型别感染样本检测结果图；
图5为HPV18型单一型别感染样本检测结果图；
图6为HPV66型单一型别感染样本检测结果图；
图7为HPV三种型别（16，18，45型）混合感染样本检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明。以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
实施例1：本发明试剂盒的组成及主要原材料的厂商和规格
1.运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒组成如下：
组成成分 规格 数量 主要成分
RNA提取液 1300ul/管 1管 Tris、EDTA
连接反应管 10ul/管 24管 各型别上下游连接引物、连接酶
荧光PCR反应管 30ul/管 24管 热启动Taq酶、UDG酶、通用引物、各型别特异性荧光探针
阴性质控品 100ul/管 1管 灭菌纯化水
阳性质控品 100ul/管 1管 HPV-18型样本
其中，连接引物包括上述SEQIDNO：1～36序列，通用引物包括上述SEQIDNO：37～38序列，荧光探针包括上述SEQIDNO：39～56序列。
上述探针1～18的3’端连接有MGB，5’端连接有荧光基团，其中，探针1连接的荧光基团为HEX，探针2连接的荧光基团为TEXASRED，3～18连接的荧光基团为FAM。
上述运用连接酶检测高危型HPV的试剂盒中所使用的连接酶系统中，每人份体系含连接酶1U。
上述运用连接酶检测高危型HPV的试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为5U，dNTPs为0.2mmol/L，UDG酶为0.3U。
上述运用连接酶检测高危型HPV的试剂盒还设有RNA提取液，RNA提取液的组成成分为EDTA的浓度为0.001mol/L，Tris的浓度为0.01mol/L。
2.本发明试剂盒主要原材料的厂商和规格
名称 厂商 规格 备注
连接引物 英潍捷基（贸易）上海有限公司 10nmol/管 /
通用引物 英潍捷基（贸易）上海有限公司 10nmol/管 /
荧光探针 英潍捷基（贸易）上海有限公司 5nmol/管 /
连接酶 New England Biolabs 25U/ul，6250U/管 /
Taq酶 广州市益缪诺生物科技有限公司 10U/ul，10000U/管 /
UDG酶 Promega公司 1U/ul，1000U/管 /
dNTPs 上海兆维科技发展有限公司 1ml/管 各dNTP单体浓度比例为：A:T:C:G:U=1：1：1：1：1。
实施例2：本发明试剂盒的使用方法
1.样本处理与RNA提取
1）向宫颈刷保存管中加入2ml灭菌生理盐水（务必使拭子头完全浸入液体中），震荡60秒（使细胞充分落入液体，灭菌生理盐水变浑浊），将全部洗涤液转至相应编号的2ml离心管；
2）编好号的样品10,000rpm离心3分钟，弃上清；
3）样品沉淀中加入1ml灭菌生理盐水，洗涤沉淀，10,000rpm离心3分钟，弃上清；
4）样品沉淀中加入50μlRNA提取液，震荡60秒，充分悬浮细胞沉淀，备用；
RNA的提取也可以使用其他公知的方法进行。
5）质控品处理
取装有HPV阳性质控品和阴性质控品的离心管，10,000rpm离心30秒，然后按（2）～（4）的提取步骤操作。
2.连接试剂准备（试剂准备区，冰上操作）
1）从试剂盒中取出连接反应管，瞬时离心备用；
2）往上述反应管中分别加入提取后的待测样本核酸10μl（如样本不足10μl，请用灭菌纯化水补足10μl后加样）、提取后的阴性质控品10μl及提取后的阳性质控品10μl。盖紧管盖，5000rpm离心30秒后转移至扩增检测区。
3.连接条件（PCR仪上操作）
PCR仪设置参数为：
37℃，5min；
65℃，20min。
反应条件结束后，取出连接酶反应管（连接产物）置于2-8℃保存（连接产物如需长期保存，可置于-20±5℃）。
4.核酸扩增试剂准备（试剂准备区，冰上操作）
1）从试剂盒中取出荧光PCR反应管，瞬时离心备用；
2）往上述反应管中加入连接产物10μl（包括连接后的阴性质控品和阳性质控品）。盖紧管盖，5000rpm离心30秒后转移至扩增检测区。
5.PCR扩增
PCR仪设置参数为：
50℃，3min；95℃，5min；
95℃，5s，55℃，31s，循环45次。
在55℃时测定荧光值。
根据荧光值变化曲线，确定检测结果。
质量控制
样品名称 FAM通道 HEX通道 TEXAS RED通道 结果
阴性质控品 无明显对数扩增曲线 无明显对数扩增曲线 无明显对数扩增曲线 阴性
HPV阳性质控品 无明显对数扩增曲线 无明显对数扩增曲线 有明显对数扩增曲线，Ct≤37 HPV 18型阳性
使用本试剂盒和对照试剂盒对临床样本进行检测，两者不符的使用复核试剂盒进行检测，并根据对照与复核检测结果将样本分为阳性组和阴性组，对比本试剂盒检测的Ct值，从而确定本试剂盒参考值，当本试剂盒Ct值大于37时，均属于阴性组，当本试剂盒Ct值小于等于37时，均属于阳性组。因此，将Ct值大于37作为为本试剂盒的参考值（CUTOFF值）。
使用本发明检测试剂盒的检测结果示意图如图4～7所示。从图中可以清楚地看出，本发明的检测试剂盒可以有效地检测出高危型HPVE6/E7mRNA，检测结果准确可靠。
SEQUENCELISTING
<110>广州和实生物技术有限公司
<120>一种运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的方法及试剂盒
<130>
<160>56
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ggatgccttggcttctcactttgtacgcacaaccgaagcg40
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tagagtcacacttgcaaccgaacctggaagagcacac37
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ggatgccttggcttctcacttactgctgggatgcacacc39
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
acggacacacaaaggacagcgaacctggaagagcacac38
<210>5
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ggatgccttggcttctcattgcatgcagcatacggactc39
<210>6
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ctatctctatatactactcttacgaacctggaagagcacac41
<210>7
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ggatgccttggcttctcagggcacacgattccaaatg37
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
agcccattaacagctcttgcgaacctggaagagcacac38
<210>9
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ggatgccttggcttctcactgtggctggttgtgcttg37
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
tccatctggccggtccaagcccgaacctggaagagcacac40
<210>11
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ggatgccttggcttctcaatatacctcactccgctgtaa39
<210>12
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ttcttgtttgcagtatacacgaacctggaagagcacac38
<210>13
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
ggatgccttggcttctcacactaaatgcaaattcatat38
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
acctcggtttgctgtagtggtcgaacctggaagagcacac40
<210>15
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ggatgccttggcttctcacaaagaaccagccattac36
<210>16
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
accccgttccctccccgtcgcgaacctggaagagcacac39
<210>17
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
ggatgccttggcttctcatgtagtaccatacacagacc38
<210>18
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tgctataacgtctatactctcgaacctggaagagcacac39
<210>19
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
ggatgccttggcttctcatcaggacataatggagtttg38
<210>20
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
acaaattatacatctaatagcgaacctggaagagcacac39
<210>21
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
ggatgccttggcttctcaagctgtcaatgccttcttgc38
<210>22
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
agaacacacagccaagttgccgaacctggaagagcacac39
<210>23
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
ggatgccttggcttctcatttaattcagtgcatgcaaa38
<210>24
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
attatatacctcagcacgtgtcgaacctggaagagcacac40
<210>25
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
ggatgccttggcttctcatattcttaaatctgcaaatgta40
<210>26
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
aagtcatatacctcagatccgaacctggaagagcacac38
<210>27
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
ggatgccttggcttctcaatgcagaggaatattcaatg38
<210>28
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
ttgtgctcaagtcaggcagtcgaacctggaagagcacac39
<210>29
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
ggatgccttggcttctcatacctcgctcagatggtgca38
<210>30
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
ggcttcgtggacgttcctgtcgaacctggaagagcacac39
<210>31
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
ggatgccttggcttctcaatttaagtcgccaaaggcaa38
<210>32
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
attcatatacctctgtccgtcgaacctggaagagcacac39
<210>33
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
ggatgccttggcttctcaattcacttcgtcacataacg38
<210>34
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
cttgtagcttgtatggtcgtcgaacctggaagagcacac39
<210>35
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
ggatgccttggcttctcaagcaccatacacagacctac38
<210>36
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
tataccttctgtattctctacgaacctggaagagcacac39
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
ggatgccttggcttctca18
<210>38
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
gtgtgctcttccaggttcg19
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
cgcacaaccgaagcgtagag20
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
cttactgctgggatgcacacc21
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
agcatacggactcctatctctat23
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
cacgattccaaatgagccca20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
ctgtggctggttgtgcttgt20
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
actccgctgtaattcttgtttgca24
<210>45
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
gcaaattcatatacctcggtttg23
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
accagccattacaccccgtt20
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
catacacagacctgctataacg22
<210>48
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
acataatggagtttgacaaat21
<210>49
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
caatgccttcttgcagaacaca22
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
agtgcatgcaaaattatatacc22
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
tctgcaaatgtaaagtcata20
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
atattcaatgttgtgctcaa20
<210>53
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
tcagatggtgcaggcttcgtgga23
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
tcgccaaaggcaaattcata20
<210>55
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
tcacataacgcttgtagcttgt22
<210>56
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
cacagacctactataccttct21

Claims (10)

1.运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的方法及试剂盒，所采取的技术方案为：
1）针对需要检测的每个高危型HPVE6/E7mRNA序列设计相应的连接引物、一对荧光PCR通用引物及各高危型别的特异性荧光探针，上游连接引物为普通引物，下游连接引物为5’磷酸化标记，
2）上下游连接引物与样本提取后的RNA靶片段互补配对，在连接酶的作用下，上下游连接引物连接成与靶片段完全互补配对的cDNA序列，
3）将连接后的cDNA序列作为荧光PCR反应的模板，仅一对通用引物即可扩增所有型别连接后的cDNA序列，检测反应体系的荧光变化，达到对样本高危HPV基因分型检测的目的。
2.根据权利要求1所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，包括连接反应管、荧光PCR反应管、阴性对照和阳性对照，其中，连接反应管由连接酶系统和连接引物组成，荧光PCR反应管由热启动Taq酶系统、通用引物及各型别对应的荧光探针组成，荧光探针为HPV特异性MGB探针，
通用引物的序列如下：
。
3.根据权利要求1或2所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，通用引物序列的特征表现为：一条与上游连接引物的5’端部分序列完全一致，另一条与下游连接引物的3’端部分序列互补配对，通用引物的长度在20～30bp。
4.根据权利要求1或2所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，HPV特异性MGB探针的序列如下：
上述探针的3’端连接有MGB，5’端连接有荧光基团。
5.权利要求1或2所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，其连接酶系统中的连接酶仅能以RNA为模板进行连接反应，且每人份连接体系中连接酶用量为1U。
6.权利要求1或2所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，所使用的热启动Taq酶系统中添加有UDG酶。
7.权利要求1或2所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，所使用的热启动Taq酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为5U，dNTPs为0.2mmol/L，UDG酶为0.3U。
8.优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒还设有RNA提取液，RNA提取液的组成成分为EDTA的浓度为0.001mol/L、Tris的浓度为0.01mol/L。
9.权利要求4所述的HPV特异性MGB探针，探针1连接的荧光基团不同于探针2，3～18连接的荧光基团。
10.权利要求4所述的HPV特异性MGB探针，探针2连接的荧光基团不同于探针1，3～18连接的荧光基团。
CN201510553343.5A 2015-09-02 2015-09-02 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒 Pending CN105112564A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510553343.5A CN105112564A (zh) 2015-09-02 2015-09-02 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510553343.5A CN105112564A (zh) 2015-09-02 2015-09-02 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105112564A true CN105112564A (zh) 2015-12-02

Family

ID=54660666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510553343.5A Pending CN105112564A (zh) 2015-09-02 2015-09-02 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105112564A (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834547A (zh) * 2017-03-27 2017-06-13 杭州迪安生物技术有限公司 一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒e6/e7基因检测的试剂盒及其应用
CN106868225A (zh) * 2017-04-26 2017-06-20 广州和实生物技术有限公司 一种运用连接酶检测甲型流感病毒系列的方法及试剂盒
CN107267663A (zh) * 2017-05-08 2017-10-20 常州金麦格生物技术有限公司 Hpv检测方法和试剂盒
CN107841576A (zh) * 2017-12-07 2018-03-27 广州凯普医药科技有限公司 14种高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA检测试剂盒
WO2018059581A1 (zh) * 2016-09-30 2018-04-05 广州易活生物科技有限公司 一种基于efirm技术的hpv病毒分型检测的探针、试剂盒及应用
CN108359742A (zh) * 2017-11-16 2018-08-03 杭州迪安生物技术有限公司 一种高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测用引物、试剂盒及其检测方法
CN109161544A (zh) * 2018-09-19 2019-01-08 迈克生物股份有限公司 探针和引物组合物及其试剂盒和应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101017141A (zh) * 2006-02-09 2007-08-15 港龙生物技术（深圳）有限公司 诊断人类乳头状病毒（hpv）感染的荧光聚合酶链式反应（pcr）的方法和试剂盒
CN101624632A (zh) * 2008-07-08 2010-01-13 天津生物芯片技术有限责任公司 人乳头瘤病毒基因芯片、制备方法、应用及检测用试剂盒与应用
CN102367487A (zh) * 2011-09-09 2012-03-07 中国医学科学院病原生物学研究所 一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法
CN102703606A (zh) * 2012-05-16 2012-10-03 王新宇 Hr-hpv e6/e7基因snp检测的固相芯片和探针以及检测试剂盒
CN104032031A (zh) * 2014-07-04 2014-09-10 华东理工大学 一种rna聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的pcr分析方法
CN203999583U (zh) * 2014-07-31 2014-12-10 北京海思特临床检验所有限公司 用于检测HPV感染细胞产生E6、E7 mRNA的试剂盒
CN104271768A (zh) * 2012-02-14 2015-01-07 约翰霍普金斯大学 miRNA分析方法
CN104561274A (zh) * 2014-12-16 2015-04-29 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种检测待测液中microRNA含量的方法
CN104593496A (zh) * 2015-01-14 2015-05-06 湖南大学 基于杂交连接法检测非编码rna转录水平的方法
CN104726548A (zh) * 2013-12-20 2015-06-24 深圳先进技术研究院 一种基于杂交链式反应的dna、rna或蛋白质检测探针、检测方法及试剂盒

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101017141A (zh) * 2006-02-09 2007-08-15 港龙生物技术（深圳）有限公司 诊断人类乳头状病毒（hpv）感染的荧光聚合酶链式反应（pcr）的方法和试剂盒
CN101624632A (zh) * 2008-07-08 2010-01-13 天津生物芯片技术有限责任公司 人乳头瘤病毒基因芯片、制备方法、应用及检测用试剂盒与应用
CN102367487A (zh) * 2011-09-09 2012-03-07 中国医学科学院病原生物学研究所 一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法
CN104271768A (zh) * 2012-02-14 2015-01-07 约翰霍普金斯大学 miRNA分析方法
CN102703606A (zh) * 2012-05-16 2012-10-03 王新宇 Hr-hpv e6/e7基因snp检测的固相芯片和探针以及检测试剂盒
CN104726548A (zh) * 2013-12-20 2015-06-24 深圳先进技术研究院 一种基于杂交链式反应的dna、rna或蛋白质检测探针、检测方法及试剂盒
CN104032031A (zh) * 2014-07-04 2014-09-10 华东理工大学 一种rna聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的pcr分析方法
CN203999583U (zh) * 2014-07-31 2014-12-10 北京海思特临床检验所有限公司 用于检测HPV感染细胞产生E6、E7 mRNA的试剂盒
CN104561274A (zh) * 2014-12-16 2015-04-29 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种检测待测液中microRNA含量的方法
CN104593496A (zh) * 2015-01-14 2015-05-06 湖南大学 基于杂交连接法检测非编码rna转录水平的方法

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018059581A1 (zh) * 2016-09-30 2018-04-05 广州易活生物科技有限公司 一种基于efirm技术的hpv病毒分型检测的探针、试剂盒及应用
CN106834547A (zh) * 2017-03-27 2017-06-13 杭州迪安生物技术有限公司 一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒e6/e7基因检测的试剂盒及其应用
CN106834547B (zh) * 2017-03-27 2021-01-05 杭州迪安生物技术有限公司 一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒e6/e7基因检测的试剂盒及其应用
CN106868225A (zh) * 2017-04-26 2017-06-20 广州和实生物技术有限公司 一种运用连接酶检测甲型流感病毒系列的方法及试剂盒
CN107267663A (zh) * 2017-05-08 2017-10-20 常州金麦格生物技术有限公司 Hpv检测方法和试剂盒
CN108359742A (zh) * 2017-11-16 2018-08-03 杭州迪安生物技术有限公司 一种高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测用引物、试剂盒及其检测方法
CN107841576A (zh) * 2017-12-07 2018-03-27 广州凯普医药科技有限公司 14种高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA检测试剂盒
CN109161544A (zh) * 2018-09-19 2019-01-08 迈克生物股份有限公司 探针和引物组合物及其试剂盒和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105112564A (zh) 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒
CN100469895C (zh) 用于乙肝病毒的荧光定量pcr检测试剂盒
CN106957927A (zh) 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN103397107B (zh) 牛病毒性腹泻病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN105018647B (zh) 一种基于数字pcr精准定量分型检测hpv16/18的试剂盒及其检测方法
CN104046704A (zh) 一种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法
CN108018378A (zh) 一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
CN104099428B (zh) 一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光pcr引物、探针和试剂盒
CN105256073A (zh) 3型鸭甲肝病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及方法
CN104195247B (zh) 多色高危hpv荧光检测试剂盒
CN103509880A (zh) 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的lamp检测试剂盒
CN106048097A (zh) 一种实时荧光定量pcr检测番茄褪绿病毒的特异引物及方法
CN117660702A (zh) 检测丽水穿山甲病毒的荧光定量pcr引物组及方法
CN101886137B (zh) 荧光定量pcr定性检测高危型hpv的试剂盒
CN106048080B (zh) 一种快速筛查hpv亚型的引物和方法
CN107858453A (zh) 猪脑心肌炎病毒lamp检测引物对、检测方法及应用
CN108424977B (zh) 肠道病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法
CN115747361A (zh) 检测海豚链球菌的实时荧光mira和mira-lfd引物组及检测方法
CN108085419A (zh) 探针及引物组合物
CN109777888A (zh) 一种同时检测多种a组人类肠道病毒的引物组合及其应用
CN107267666A (zh) 一种基于猪非典型瘟病毒e2基因的荧光定量rt‑pcr检测试剂盒
CN109576394B (zh) 一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物及应用
CN103014180A (zh) 一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法
CN106755567B (zh) 猴srv病毒实时荧光定量pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
CN106367529B (zh) 一种快速显色一步法检测美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征的rt-lamp试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 510665, A8, building fourth, building 11, Kaiyuan Avenue, Science City, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, Guangdong,

Applicant after: GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Address before: 510665 room 19, No. 216 incense Hill Road, Science City, Guangzhou economic and Technological Development Zone, Guangdong, China

Applicant before: GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

CB02 Change of applicant information

Address after: 510535, A8, building fourth, building 11, Kaiyuan Avenue, Science City, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, Guangdong,

Applicant after: GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Address before: 510665, A8, building fourth, building 11, Kaiyuan Avenue, Science City, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, Guangdong,

Applicant before: GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

CB02 Change of applicant information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20151202

RJ01 Rejection of invention patent application after publication