CN108823333A - 一种鹅源肾型星状病毒GoAstV快速诊断引物探针组、检测方法及应用 - Google Patents

一种鹅源肾型星状病毒GoAstV快速诊断引物探针组、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种鹅源肾型星状病毒GoAstV快速诊断引物探针组、检测方法及应用。一种鹅源肾型星状病毒GoAstV快速诊断引物探针组，包括以下序列的探针引物组：GoAstV‑F：5'TGGTGGTGGTGCGGTTTT 3'；GoAstV‑R：5'GGGCAACGTACCATCATAACG 3'；以及TaqMan MGB探针：5'FAM TGTAGAGACGGACTGGAC MGB 3'；所述探针标记5'端为荧光基团，3'端为淬灭荧光基团。本发明提供的引物探针组具备更高的敏感性、特异性、重复性好，快速、高通量、污染少等优点，使其成为基础研究、应用研究等领域有用而强大的技术。

Description

一种鹅源肾型星状病毒GoAstV快速诊断引物探针组、检测方 法及应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种鹅源肾型星状病毒GoAstV快速诊断引物探针组、检测方法及应用。
背景技术
星状病毒(Astrovirus）是一种属于星状病毒科的单股正链RNA病毒，基因组长度在6.4~7.9kb不等。星状病毒科根据感染宿主的不同可分为哺乳动物属和禽类属，其中哺乳动物属根据宿主的不同又分为人星状病毒、猫星状病毒、猪星状病毒、绵羊星状病毒以及貂星状病毒；禽类星状病毒属包括鸭星状病毒（DAstV）、火鸡星状病毒（TAstV）、禽肾炎病毒（ANV）和鸡星状病毒（CAstV）。2017年下半年以来，山东地区陆续从鹅病料中分离到新型的鹅源星状病毒。遗传进化分析发现，该新发病毒与之前报道的所有禽类星状病毒的基因型差异较大，与其他禽类的星状病毒同源性仅在30%-50.5%之间，属于新型的鹅源肾型星状病毒GoAstV。该病可引起病鹅的关节肿大，死淘率可达30%以上；剖解可见肾脏有明显的尿酸盐析出。关于该病毒的诊断，传统的病毒分离鉴定，费时费力，不适合临床使用，而且该病毒无血凝性，在鸡胚、鸭胚上不生长，在鹅胚上的繁殖能力也不高。目前最常见的是应用普通RT-PCR方法检测GoAstV，但该方法易造成标本间的交叉污染，而且需要进行凝胶电泳进行判断，亦不适合临床大批样品进行检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鹅源肾型星状病毒GoAstV快速诊断引物探针组、检测方法及应用。
本发明还提供了一种利用上述探针引物组的检测方法及应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
一种鹅源肾型星状病毒GoAstV快速诊断引物探针组，包括以下序列的探针引物组：
GoAstV-F：5' TGGTGGTGGTGCGGTTTT 3'；
GoAstV-R：5' GGGCAACGTACCATCATAACG 3'；
以及TaqMan MGB探针：5' FAM TGTAGAGACGGACTGGAC MGB 3'；
所述探针标记5'端为荧光基团，3'端为淬灭荧光基团。
优选地，所述荧光基团为FAM，所述淬灭荧光基团为MGB。
一种利用上述引物探针组进行的检测方法，包括以下步骤：
（1）RNA提取及反转录；
（2）标准曲线的绘制及敏感性检测。
优选地，所述敏感性检测的方法为：将构建的质粒AstV393通过Nano Drop微量分光光度计测定质粒浓度，以所提取的质粒10倍稀释系列进行敏感性检测；其中所述AstV393质粒构建方法为：将GoAstV 1b蛋白片段克隆至PMD18T筛选的阳性质粒。
优选地，所述AstV393质粒构建的具体步骤如下：Premix Ex Taq 12.5μL 、20 μM上下游引物1b-F和1b-R 各1μL 、 cDNA 模板2μL、 ddH2O 8.5μL；反应过程：94℃ 15S、50℃20S、72℃ 30S进行35个循环，最后72℃延伸7min。
进一步地，所述上下游引物的序列为：1b-F ：5' CGGTGGAATACATCAGCGAGTA 3'；
1b-R：5'CCTTCCTTATTGACACAAGCCTAT3'。
上述引物探针组在快速鉴别诊断鹅源肾型星状病毒GoAstV中的应用。
有益效果
（1）本发明提供的引物探针组具备更高的敏感性（最低的模板检测量可到52.5拷贝/μL）、特异性（只有GoAstV得到扩增）、重复性好（每份样品至少重复3次，检测结果一致），快速、高通量、污染少等优点，使其成为基础研究、应用研究等领域有用而强大的技术。
（2）本研究的MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，同时探针上还连接有MGB修饰基团，可将探针的Tm值提高10°C左，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。（3）本研究用荧光探针定量PCR扩增技术实现快速对不同的GoAstV进行鉴别诊断；可以快速可视化判断出检测结果，检测灵敏度高，特异性强，此研究可实现对鹅源肾型星状病毒GoAstV的快速鉴别诊断，非常适合临床和基层实验室的检测应用。
（4）本检测方法不仅能够评价鹅源肾型星状病毒GoAstV的感染情况，同时也为鹅源肾型星状病毒的流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。
附图说明
图1 为GoAstV的敏感性检测结果；
图2 为GoAstV检测标准曲线的建立；
图3为GoAstV的FQ-PCR扩增结果；
图4为GoAstV的FQ-PCR扩增后凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
1.材料与方法
1.1材料：试验所用毒株：GoAstV代表性毒株SD18，为本中心分离鉴定。
1.2 方法
1.2.1探针和引物设计合成：
根据GoAstV 1b蛋白序列（Genbank No：MF576430）利用Primer ExPress3.0软件设计扩增引物和TaqMan MGB探针；
探针引物组的序列为：
GoAstV-F：5' TGGTGGTGGTGCGGTTTT 3'；
GoAstV-R：5' GGGCAACGTACCATCATAACG 3'；
Probe：5' FAM TGTAGAGACGGACTGGAC MGB 3'；
TaqMan MGB探针标记5'端为荧光基团，3'端为淬灭荧光基团；
所述荧光基团为FAM，所述淬灭荧光基团为MGB。
1.2.2病毒RNA的提取
GoAstV毒株SD18病毒RNA的提取按照博日生物Simple RNA kit操作进行，提取RNA立即使用或超低温-86℃保存。
1.2.3 RT反转录过程
反转录体系：5×PrimeScript Buffer (for qPCR) 4 μL、PrimeScript RT EnzymeMix （含RNase Inhibitor）、Specific Primer(50 μM) 0.5 μL、RNA模板100pg～1μg、RNase Free H2O补至20μL。反应条件为： 42℃ 15 min、85℃2 min、4℃结束。所得cDNA -20℃保存。
1.2.4标准曲线的绘制和敏感性检测
使用AstV393质粒作为标准品，进行标准曲线的制备。AstV393构建方法为：将GoAstV1b蛋白（Genbank No：MF576430）片段克隆至PMD18T（Takara公司）筛选的阳性质粒。具体步骤如下Premix Ex Taq 12.5μL 、20 μM上游引物1b-F: 5' CGGTGGAATACATCAGCGAGTA 3' 1μL，20 μM下游引物1b-R：5'CCTTCCTTATTGACACAAGCCTAT3' 1μL、cDNA模板2μL、ddH2O 8.5μL。94℃ 15S、50℃ 20S、72℃ 30S进行35个循环，最后72℃延伸7min。取5µL反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检验。以DL2000的Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5V/cm）电泳40min，凝胶成像系统观察结果。回收PCR产物，随后PCR 产物与T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，从平板上分别挑取转化子，用2mL相应抗性的LB培养过夜，用PCR法进行鉴定，筛选到阳性重组质粒AstV393。通过Nano Drop微量分光光度计测定质粒浓度。以所提取的质粒10倍稀释系列进行标准曲线的绘制和敏感性检测。所述标准曲线的制备方法为：将浓度为5.25×106 Copies/μL阳性重组质粒AstV393进行10倍系列稀释直至5.25Copies/μL进行敏感性试验。具体如下：2×Premix Ex (for qPCR) 10 μL、GoAstV-F（10μM）0.2μL、GoAstV-R（10 μM）0.2μL、TaqMan MGB探针（10μM）0.5 μL、样品 2μL 补dd H2O至20μL；其中GoAstV-F：5' TGGTGGTGGTGCGGTTTT 3'；GoAstV-R：5' GGGCAACGTACCATCATAACG 3'；TaqMan MGB探针：5' FAM TGTAGAGACGGACTGGAC MGB 3'；反应过程：95℃ 2min，94℃ 5s、60℃ 30s进行40cycles，60℃收集荧光信号，样品设3个重复。FQ-PCR软件系统同时建立FQ-PCR方法的标准曲线。
1.2.5临床应用
2017-2018年收集的临床9份疑似星状病毒感染鹅组织样品，用本研究建立的快速检测方法进行鉴定。并且同时用普通RT- PCR试验和序列测定进行结果的验证，以确定此次建立的方法是否可以特异准确的鉴别新型的GoAstV（分离的GoAstV与目前已知的其他禽类的星状病毒同源性仅在30%-50.5%之间）。
2 结果
2.1 标准曲线的绘制和敏感性检测
将阳性重组质粒AstV393（浓度5.25×106 Copies/μL）进行10倍系列稀释直至5.25Copies/μL，每个稀释度均设3个重复，按优化的反应条件进行敏感性试验，同时建立FQ-PCR方法的标准曲线。10倍系列稀释质粒标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所述，其中横坐标代表PCR反应循环数，纵坐标代表荧光信号值。图1中1-7 分别代表质粒原液、10、102、103、104、105、106倍比稀释，根据所得CT值（循环阈值）作为纵坐标与其对应的标准品的对数值作为横坐标，绘制的AstV393实时荧光定量PCR检测的标准曲线见图2。标准曲线方程为y＝-3.033logX+38.438，标准曲线的相关系数R2为0.999，斜率为-3.033，截距为38.438。标准曲线显示，本发明建立的AstV393探针法实时荧光定量PCR检测方法有6个数量级的现行检测范围；检测结果当模板为52.5拷贝/μL时可以得到有效扩增，进一步说明该检测方法具有非常高的灵敏度。
2.2 GoAstV TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR的反应结果
GoAstV代表性毒株SD18（3份重复样品），同时设NDV、H9N2 AIV、Duck AstV作为对照；扩增条件为：2×Premix Ex (for qPCR) 10 μL、GoAstV-F（10 μM）0.2μL、GoAstV-R（10 μM）0.2μL、TaqMan MGB探针（10 μM）0.5 μL、样品cDNA 2μL 补dd H2O至20μL。反应过程： 95℃2min， 94℃5 s、60℃30s进行40cycles， 60℃ 收集荧光信号。GoAstV代表性毒株SD18（3份重复样品）的FQ-PCR反应体系通道出现3条特定的扩增曲线，且Ct值在20-21之间，则可判定为样品为阳性。NDV、H9N2 AIV、Duck AstV作为对照均未出现扩增（图3）。样品电泳图见图4，Marker为 DL500：大小依次为500、400、300、200、150、100、50bp，目的条带为60bp；1、2、3为阳性样品，4、5、6分别为NDV、H9N2 AIV、Duck AstV。结果说明：本发明用于对GoAstV实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan MGB探针的特异性良好。
2.3 临床应用
2017-2018年收集的临床9份疑似鹅组织样品，用该方法可快速鉴定出5份阳性样品，后期序列测定验证了上述结果。普通RT- PCR试验只检测到4份阳性病料，结果表明：实时荧光定量PCR的敏感性要高于普通PCR。
由于本病为新发疫病，目前针对这种新型的鹅源星状病毒的研究很少（Genbank只能检索5个部分基因片段）。该病可引起病鹅的关节肿大，行走困难，死淘率可达30%以上；剖解可见肾脏有明显的尿酸盐析出。在鸡胚、鸭胚不生长，仅在鹅胚内生长。遗传进化分析发现，该新发病毒与与其他禽类的星状病毒同源性仅在30%-50.5%之间。鉴于本病发展速度很快，本文所建立的荧光定量PCR检测技术可以对新发的鹅源星状病毒进行快速、特异、定量的测定，与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点，非常适合实验室的临床应用检测。

Claims (7)

1.一种鹅源肾型星状病毒GoAstV快速诊断引物探针组，其特征在于，包括以下序列的探针引物组：
GoAstV-F：5' TGGTGGTGGTGCGGTTTT 3'；
GoAstV-R：5' GGGCAACGTACCATCATAACG 3'；
以及TaqMan MGB探针：5' FAM TGTAGAGACGGACTGGAC MGB 3'；
所述探针标记5'端为荧光基团，3'端为淬灭荧光基团。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭荧光基团为MGB。
3.一种利用权利要求1或2所述的引物探针组进行的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）RNA提取及反转录；
（2）标准曲线的绘制及敏感性检测。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述敏感性检测的方法为：将构建的质粒AstV393通过Nano Drop微量分光光度计测定质粒浓度，以所提取的质粒10倍稀释系列进行敏感性检测；其中所述AstV393质粒构建方法为：将GoAstV 1b蛋白片段克隆至PMD18T筛选的阳性质粒。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述AstV393质粒构建的具体步骤如下：Premix Ex Taq 12.5μL 、20 μM上下游引物1b-F和1b-R 各1μL 、 cDNA 模板2μL、ddH2O 8.5μL；反应过程：94℃ 15S、50℃ 20S、72℃ 30S进行35个循环，最后72℃延伸7min。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述 上下游引物的序列为：1b-F ：5'CGGTGGAATACATCAGCGAGTA 3'；
1b-R：5'CCTTCCTTATTGACACAAGCCTAT3'。
7.权利要求1或2所述的引物探针组在快速鉴别诊断鹅源肾型星状病毒GoAstV中的应用。
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