CN105671196B

CN105671196B - 扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR引物及探针

Info

Publication number: CN105671196B
Application number: CN201610244771.4A
Authority: CN
Inventors: 张华�; 胡白石
Original assignee: WUXI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Current assignee: WUXI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Priority date: 2016-04-19
Filing date: 2016-04-19
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2036-04-19
Also published as: CN105671196A

Abstract

本发明涉及一种扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR引物及探针，其特征是：所述引物包括SEQ ID No：1所示的上游引物histone H3‑F和SEQ ID No：1所示的下游引物histone H3‑R组成的引物对。所述用于检测扁桃拟茎点霉的探针，包括SEQ ID No：1所示的探针histone H3‑P。所述探针histone H3‑P的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光猝灭基团TAMRA。所述检测扁桃拟茎点霉的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）合成上游引物histone H3‑F、下游引物histone H3‑R和探针histone H3‑P，并对探针histone H3‑P进行标记；（2）提取待检测样品的基因组DNA，以上游引物histone H3‑F和下游引物histone H3‑R进行扩增，得到扩增产物；（3）采用荧光定量PCR检测体系对待测样品进行检测。本发明适用于扁桃拟茎点霉Taqman荧光定量PCR检测，快速、灵敏、简便。

Description

扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR引物及探针

技术领域

本发明涉及一种扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR引物及探针，属于生物技术领域，适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

背景技术

扁桃拟茎点霉（无性态：Phomopsis amygdali，有性态：Diaporthe amygdali）是重要的植物病原菌，对桃、红叶李、花梅、梨和杏等多种蔷薇科植物均有致病性，但在桃树上引起的桃缢缩溃疡病尤为严重。常表现为在桃树新梢嫩枝的基部形成环状褐色病斑，致使枝条病部以上叶片快速枯萎脱落，病害蔓延扩展迅速，可造成20~50%的产量损失，严重的致使桃树整株死亡。自1905年起，Delacroix等首次报道了法国发生桃树溃疡病之后，意大利、美国、日本等地也相继发现该病。在中国，桃溃疡病出现的相对较晚，直到20世纪80年代后期才有有关该病发生流行的报道，并且起初该病只在辽宁、云南、山东、河南的局部地区发现，危害范围较小。2008年之后，桃溃疡病在江苏无锡、常州和浙江嘉兴等我国南方桃区相继发生且逐年加重。尤其在2013年，江苏无锡桃溃疡病大暴发，给当地桃产业造成了严重的损失，严重影响了桃农生产的积极性，已逐渐成为阻碍我国桃产业持续健康快速发展的重要因素之一。

对于扁桃拟茎点霉进行早期检测可以及时采取防治措施，控制病害的进一步扩展。目前，扁桃拟茎点霉的检测技术主要为传统检测法和常规PCR检测方法。传统检测法是对病健交界处进行组织分离培养，观察病原菌形态、培养性状并回接到寄主植物观察致病性的过程，但其费时费力，不适合病害的早期检测。随着分子生物学的快速发展，戴富明等将常规PCR检测法引入到桃溃疡病病菌的检测中，灵敏度达到100 fg/L，且花费时间短，检测效率高。

TaqMan荧光定量PCR法是在常规PCR的基础上，增加1条双荧光标记的特异性核酸杂交探针，通过检测荧光信号强弱来监测PCR反应过程中扩增产物量的变化。与常规PCR相比荧光探针杂交信号不需经过琼脂糖凝胶电泳，有效避免了交叉污染和假阳性的产生，具有省时省力、灵敏度高、特异性强、重复性好及病原定量等优点，已成为病原定量检测的重要方法。张甜甜等将表现植原体症状的野豌豆植株同时进行巢式PCR和荧光定量PCR检测，结果显示巢式PCR检测时有目的条带，但测序分析并非植原体，这与荧光定量PCR检测中未发现荧光信号的增加结果相符。王恒波等利用荧光定量PCR法对甘蔗宿根矮化病菌（Leifsonia xyli subsp. xyli）样品进行检测，结果显示荧光定量PCR阳性检出率达到常规PCR检出率的两倍。以上研究表明，荧光定量PCR法能够提供较常规PCR更高的专化性和灵敏度。迄今，尚未有利用TaqMan荧光定量PCR方法对扁桃拟茎点霉进行检测的报道。

病原生物的分子生物学检测技术是当今的发展方向，检测的效果和性能，很大程度上取决于分子检测靶标的筛选。前期研发的分子检测技术，由于缺乏基因组学的支持，分子检测靶标没有经过系统筛选，往往造成检测结果的可信度出现问题。研究随着基因组学的发展，越来越多的生物基因组被测序，人们已经注意到，分子检测靶标基因必须是病原生物的核心基因。因此，本发明的重点之一是利用比较基因组学的方法，筛选出可供作为检测靶标的核心基因。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR引物及探针，适用于扁桃拟茎点霉Taqman荧光定量PCR检测，快速、灵敏、简便。

按照本发明提供的技术方案，所述扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR引物，其特征是：所述引物包括SEQ ID No：1所示的上游引物histone H3-F和SEQ ID No：2所示的下游引物histone H3-R组成的引物对。

所述用于检测扁桃拟茎点霉的探针，其特征是：包括SEQ ID No：3所示的探针histone H3-P。

进一步的，所述探针histone H3-P的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光猝灭基团TAMRA。

所述检测扁桃拟茎点霉的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）合成上游引物histone H3-F、下游引物histone H3-R和探针histone H3-P，并对探针histone H3-P进行标记；

（2）提取待检测样品的基因组DNA，以上游引物histone H3-F和下游引物histoneH3-R进行扩增，得到扩增产物；

（3）采用荧光定量PCR检测体系对待测样品进行检测。

本发明所述扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR检测引物及探针，适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。基于该引引物及探针建立的荧光定量PCR检测体系可用于桃溃疡的检测，检测方法易于操作，检测结果可靠。

附图说明

图1为TaqMan荧光定量PCR标准曲线。

图2为TaqMan荧光定量PCR特异性检测。

图3为TaqMan荧光定量PCR标准品质粒灵敏度检测。

图4为常规PCR DNA灵敏度检测。

图5为TaqMan荧光定量PCR孢子灵敏度检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

1、菌株材料：选用56株参试菌株，包括不同年份，不同果园采集的25株扁桃拟茎点霉（P. amygdali）及31株其他参试菌株，如表1所示。

表1

表1中，25株Phomopsis amygdali中，11株于2014年在江苏无锡进行分离，9株于2015年在江苏无锡进行分离，2株于2014年在上海进行分离，3株于2014年在浙江嘉兴进行分离。

表1中NJAU代表Nanjing Agricultural University（南京农业大学），JSCIQ代表Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau（江苏出入境检验检疫局）。

2、检测样品：结合桃缢缩溃疡病的田间发病症状，于2015年在江苏无锡多个桃园采集了50份疑似发病样品。

3、实验试剂与仪器：

荧光定量PCR所用引物及探针由上海Invitrogen有限公司合成，荧光定量PCR和普通PCR所用试剂、pMD19-T vector连接试剂盒、质粒提取纯化试剂盒均购于大连宝生物公司，真菌基因组DNA提取试剂盒购于OMEGA公司，美国ABI-7500实时荧光PCR扩增仪、ThermoNannodrop 1000 分光光度计、Eppendorf Mastercycler pro 384 梯度PCR扩增仪、DYY-8C双稳定时电泳仪（北京六一仪器厂）、培清JS-780全自动凝胶成像分析系统。

4、检测方法：

（1）核酸提取：扁桃拟茎点霉、参试近缘菌株及实际样品检测中病样的基因组DNA均由OMEGA公司的真菌基因组DNA小量制备试剂盒提取，具体步骤详见说明书。

（2）特异性引物探针的设计合成：根据GenBank登录的扁桃拟茎点霉histone H3基因（登录号：KC343503）的保守区域，利用Bioedit软件进行序列比对分析，设计荧光定量检测引物（histone H3-F、histone H3-R）和探针（histone H3-P），探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光猝灭基团TAMRA，扩增目的片段大小为130bp。引物和探针均委托上海Invitrogen有限公司合成并纯化，引物和探针的的序列如表2所示。

表2 引物及探针序列

（3）标准质粒的构建：以提取的扁桃拟茎点霉DNA为模板，用荧光定量引物（histone H3-F、histone H3-R）扩增相应片段。回收目的片段与pMD19-T simple vector连接试剂盒连接，转化DH5α感受态细胞，利用Amp抗性挑选阳性克隆子。将阳性克隆接种到LB培养基（含Amp100 mg/L），37℃摇菌过夜，使用质粒小量提取试剂盒提取质粒，经PCR鉴定后委托上海Invitrogen有限公司测序验证。

经PCR鉴定，重组质粒的扩增产物大小为130 bp，与预期大小一致，表明histoneH3基因已正确插入载体pMD19-T中，其测序结果在NCBI经Blast分析显示，与参考序列（登录号：KC343503）的同源性达99%，由此确定重组质粒已成功构建。将该重组质粒作为标准品，经分光光度计测定A260/A280比值为1.88，其浓度为124.6μg/μL，根据公式：标准质粒的拷贝数=（质量数×6.023×10²³）/（质粒碱基对数×660），计算质粒拷贝数量约为4×10¹⁰copies/μL。

（4）荧光定量PCR的建立和条件优化：参照TAKARA试剂盒说明书建立20μL扩增体系：Premix Ex Taq（2×）10μL，上、下游引物分别为（10μM）0.4μL，TaqMan探针（5μM）0.8μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.2μL，双蒸水7.2μL，模板1.0μL。反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，共40个循环。对实时荧光定量PCR反应体系中各组分浓度和退火延伸温度进行优化，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值。

荧光定量PCR引物和探针浓度筛选结果表明，采用10μM的引物浓度和5μM的探针浓度进行检测时，可获得较高的荧光强度增加值和较小的Ct值。循环条件优化结果表明，60℃为最佳退火温度。

（5）标准曲线制作：将已知标准品质粒进行10倍倍比稀释，得到4×10⁷~4×10¹copies/μL系列标准模板，采用优化好的检测体系进行荧光定量PCR，得到各自的Ct值，以Ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数lgX为横坐标制作标准曲线y=－3.512x+40.24，y为Ct值，x为lgX，如图1所示。

以10倍倍比稀释得到的4×10⁷~4×10¹ copies/μL的重组质粒为标准模板，同时以空质粒为阴性对照进行荧光定量PCR扩增。如图1所示，模板浓度与可检测到的荧光信号的循环数负相关，相关系数R²=0.999表明不同梯度模板的对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系，可用于模板浓度的测定。扩增效率E=92.76%，在80%~120%之间说明扩增效率理想。

（6）特异性实验：根据上述检测体系对56株供试菌株（如表1所示）进行检测，通过荧光定量PCR结果验证引物及探针的特异性。

供试的25株扁桃拟茎点霉P.amygdali及31种参试菌株（详见表1）在相同条件下进行TaqMan荧光定量PCR检测。如图2所示，选取的25株扁桃拟茎点霉均有明显的扩增曲线生成，而所有的其他参试菌株及空白对照均无扩增。说明该TaqMan荧光定量PCR法具有很好的种属特异性。

（7）灵敏度实验：

将标准品质粒进行10倍倍比稀释，得到4×10⁷~4×10¹ copies/μL7个浓度后，对标准品质粒各稀释度进行TaqMan荧光定量PCR检测，同时将P.amygdali基因组DNA进行10倍倍比稀释，得到1×10²~1×10^-4 pg/μL系列浓度，用引物对Pa-F2、Pa-R2（如表2所示）进行常规PCR，比较二者检测灵敏度的差异。结果显示所建立的荧光定量PCR最低可检测到4×10¹copies（如图3所示，图3中各个曲线分别对应于7个浓度和一个NC空白样），相当于0.1 fg/μL的DNA能被检测到。常规PCR最低可检测到100 fg/μL，由此可见，所建立的荧光定量PCR方法的灵敏度明显高于常规PCR，是常规PCR的1000倍。

P.amygdali在培养基上常会有分生孢子组成黄色粘液从分生孢子器器口泌出，取该黄色粘液悬浮于无菌水中，采用血球计数板对孢子进行计数。将孢子悬浮液进行10×倍比稀释，得到2×10⁴~2×10⁰ 个/μL 5个浓度后，对P.amygdali孢子各稀释梯度进行TaqMan荧光定量PCR和常规PCR检测，比较二者检测灵敏度的差异（图5中各个曲线分别对应5个浓度）。如图5所示，结果显示所建立的荧光定量PCR最低可检测到2×10⁰ 个/μL。常规PCR最低可检测到2×10¹ 个/μL，由此可见，所建立的荧光定量PCR方法的灵敏度高于常规PCR，是常规PCR的10倍。

在同一个实验中，每个浓度重复3次以分析组内差异；在不同时间段进行3次实验，同一次实验每个浓度重复3次，进行组间差异分析。根据获得的Ct值计算平均Ct值、标准差（SD）和变异系数（CV），来评价本方法的重复性。具体为：以3个浓度梯度（4×10⁷、4×10⁵、4×10³ copies/μL）的标准品质粒进行3次组内及3次组间重复测定。通过统计分析可知，组内重复测定其CV值在0.3~0.8%之间，组间重复测定其CV值在0.4~0.6%之间（如表3所示），CV值均小于1，说明本研究所建立的扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR检测方法的重复性和稳定性良好。

（8）实际样品检测：利用分离培养法、常规PCR法和荧光定量PCR方法对田间采集的50份样品进行检测，检验该荧光定量PCR方法的实用性。

表3 TaqMan荧光定量PCR重复性实验结果

表3中SD代表Standard Deviation（标准差），CV代表Coefficient of Variation（变异系数）。

实施例 2：实际样品检测

利用分离培养法、常规PCR法和荧光定量PCR法对田间采集的50份样品进行检测。结果显示，在TaqMan荧光定量PCR中有43份样品呈现明显扩增曲线，检出率达86%；在常规PCR中有39份为阳性，检出率达78%；而培养法中只有36份成功分离出扁桃拟茎点霉，检出率为72%（如表4所示），因此可认为荧光定量PCR检测样本的灵敏度高于培养法和常规PCR。同时分离培养法实验周期长，整个检测过程需要72h，任务量大，且易受腐生菌的干扰造成实验结果的偏差，不适用于样品的快速检测；常规PCR虽然在灵敏度和特异性方面较培养法得到大幅提升，但检测效率仍低于荧光定量PCR。综上所述，TaqMan荧光定量PCR法不仅能特异性的检测出扁桃拟茎点霉，检出率高，而且省时省力，可以运用到实际样品的检测中。

表4 分离培养法、常规PCR法和荧光定量PCR法对样品的检测

<160> 5

<210> SEQ ID No：1

<211> 23

<212> 上游引物histone H3-F

<213>

<400> 1

cgtcgcccct ccccacaggc atg;

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 21

<212> 下游引物histone H3-R

<213>

<400> 2

ccgatggcgg aggactggaa g；

<210> SEQ ID NO: 3

<211> 29

<212> 探针histone H3-P

<213>

<400> 3

tcaatcgccg cgcatccaac taactcttc；

<210> SEQ ID NO: 4

<211> 15

<212> 引物Pa-F2

<213>

<400> 4

gccggccccc ttctg；

<210> SEQ ID NO: 5

<211> 20

<212> 引物Pa-R2

<213>

<400> 5

gcctgcctcg tttttacaca；

Claims

1.用于检测扁桃拟茎点霉的探针，其特征是：具体为SEQ ID No：3所示的探针histoneH3-P，用于扁桃拟茎点霉TaqMan荧光定量PCR检测。

2.如权利要求1所述的探针，其特征是：所述探针histone H3-P的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光猝灭基团TAMRA。

3.一种检测扁桃拟茎点霉的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）合成SEQ ID No：1所示上游引物histone H3-F、SEQ ID No：2所示下游引物histoneH3-R和SEQ ID No：3所示探针histone H3-P，并对探针histone H3-P进行标记；

（2）提取待检测样品的基因组DNA，以所述上游引物histone H3-F和下游引物histoneH3-R进行扩增，得到扩增产物；

（3）采用荧光定量PCR检测体系对待测样品进行检测。

4.如权利要求3所述的检测扁桃拟茎点霉的方法，其特征是：所述探针histone H3-P的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光猝灭基团TAMRA。