CN113718051B - 一种桃枝枯病菌的特异性pcr检测方法 - Google Patents

一种桃枝枯病菌的特异性pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法。采用特异性PCR引物组对该病菌特异性基因进行PCR扩增，反应体系包括：特异性PCR引物组、Green Taq Mix、菌丝基因组DNA、ddH2O；反应产物进行凝胶电泳分析，得到510bp目的片段为阳性，为桃枝枯病菌桃拟茎点霉(P.amygdali)。本发明所提供的桃枝枯病菌的特异性PCR鉴定方法，可以作为一种区别桃枝枯病菌及其属内、属外其他真菌的有效手段，优点在于快速、准确、灵敏、操作简便，具有非常高的实用价值。

Description

一种桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术，特别涉及一种桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法。
背景技术
桃枝枯病已经成为桃的主要病害之一，发病桃树产量平均损失20-50％，严重时甚至整株枯死，给桃农带来巨大的经济损失，严重威胁着桃产业的健康发展。
截止目前，桃拟茎点霉(P.amygdali)是引起中国南方桃产区桃枝枯病的主要病原菌，除侵染桃外，还可侵染多种蔷薇科植物，如红叶李、翠冠梨、杏、苹果等；该病原菌也能侵染桃果，引起桃实腐病。此外，Botryosphaeria dothidea、Diaporthe eres、Phomopsisliquidambaris、Botryosphaeria obtuse、Leucostoma persoonia、Cytospora sp.等真菌也可引起该病害。为了预防和有效防控该病菌引起的桃枝枯病，迫切需要对该病原菌进行鉴定。形态学鉴定由于其不可靠、成本高、识别时间较长的缘故，使得该方法在很大程度上的检测是无效的，因此从分子水平建立对该病菌精确快速的检测方法，对于该病害的诊断以及防治具有非常重要的现实意义和应用价值。
虽然2011年上海农业科学院已经利用ITS作为靶标序列筛选出一对引物作为桃枝枯病菌P.amygdali的特异性PCR引物，但是这对引物仅区分了P.amygdali和P.sp.，因此非常有必要获得新的特异性引物组将其与拟茎点霉属内及属外其他真菌区分开，从而获得更加准确的信息，为病害的有效防控和预测提供实用价值。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种快速、简便的桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法。
技术方案：本发明提供一种桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)桃枝枯病菌特异性基因的筛选；
(2)上述基因特异性PCR引物的筛选。
进一步地，所述桃枝枯病菌特异性基因号为GME6801，序列为SEQ ID NO.1。
进一步地，所述特异性PCR引物组为：
正引物Pa6801F：5’-acattgatcctaccgtgtttctc-3’；
反引物Pa6801R：5’-gcttggtcgggttgactttctta-3’。
进一步地，所述桃枝枯病菌的病原菌为桃拟茎点霉(P.amygdali)。
具体地，包括如下步骤：
(1)筛选该病菌特异性基因。
(2)筛选特异性PCR引物。
(3)提取真菌菌丝基因组DNA；
(4)按照反应体系配制溶液进行扩增，反应体系包括：特异性PCR引物组、菌丝基因组DNA、Green Taq Mix、ddH2O；
(5)将上述扩增产物进行凝胶电泳分析，得到510bp目的片段为阳性，为桃枝枯病菌桃拟茎点霉(P.amygdali)，无条带为阴性对照。
所述真菌菌丝基因组DNA的提取，使用真菌基因组提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)。
本发明从水蜜桃实腐病的病果和桃枝枯病的病枝上分离到桃拟茎点霉(P.amygdali)，并通过连续多年的病害流行学测定，发现该病原物是引起桃枝枯病的主要病原菌，为了将其与其他病原菌精确区分开，主要从分子水平进行鉴别。本发明针对桃枝枯病菌桃拟茎点霉(P.amygdali)来设计特异性PCR检测引物组，用于快速鉴定该病菌引起的桃枝枯病。
本发明的第一个目的是提供用于检测桃拟茎点霉(P.amygdali)引起的桃枝枯病的特异性靶向序列(如图1所示)。第二个目的是提供一组用于检测桃拟茎点霉(P.amygdali)的特异性PCR反应引物。本发明提供桃桃枝枯病田间快速检测的引物，包括两条引物，分别为上游引物Pa6801F和下游引物Pa6801R，上游引物Pa6801F：5’-acattgatcctaccgtgtttctc-3’；下游引物Pa6801R：5’-gcttggtcgggttgactttctta-3’。
本发明的检测法，能够鉴别桃树枝条和果实上的桃拟茎点霉(P.amygdali)，对于其他属内、属外真菌均无法检测，鉴别快速，完成时间仅需2-3h；传统的形态学鉴定方法所需时间较长。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：该方法可以在很短的时间内，不需要复杂的实验条件，通过凝胶电泳指示出是否存在桃枝枯病菌，准确率和灵敏度高、耗时短。对及时展开病害的防治工作，保证桃产量、质量有重要的意义，克服传统技术中检测耗时、工作量大的等问题。
附图说明
图1为桃枝枯病菌桃拟茎点霉(P.amygdali)的特异性基因序列及PCR引物对应的位置(加粗处)；
图2为该PCR引物对桃枝枯病菌桃拟茎点霉(P.amygdali)的2株菌株ZN32和TBF-17-01与12个拟茎点霉属外其他真菌的特异性检测电泳图；
图3为该PCR引物对桃枝枯病菌桃拟茎点霉(P.amygdali)和5个拟茎点霉属属内其他真菌的特异性检测电泳图。
具体实施方式
实施例1、筛选特异性基因
将桃拟茎点霉P.amygdali ZN32全基因组序列与大豆拟茎点种腐病菌Phomopsislongicolla TWH P74，禾谷镰刀菌Fusurium graminearum PH-1，胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides SMCG1、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae 70-15全基因组序列进行比对分析，筛选出175个桃拟茎点霉特异性基因。随机选择其中的5个特异性基因设计特异性PCR引物，发现GME6801的引物特异性最好(图一加粗两条引物)。
实施例2、PCR检测方法
以下实施例中使用的主要试剂及仪器，Green Taq Mix(诺唯赞)、去离子水、DNAMaker(TSINGKE生物科技公司)、PCR仪(BIO-RAD)。
以下所用的所有病原菌，均运用形态学和ITS序列证明其准确性。
(1)提取真菌菌丝基因组DNA。
(2)配制反应体系溶液，所述反应体系(25μl)包括：
正反引物组各0.5μl、DNA(GME6801)模板1μl、Green Taq Mix酶(诺唯赞)12.5μl、ddH2O补足至25μl。PCR扩增条件为：95℃3min，95℃30s，57℃30s，72℃30s，35循环，72℃10min。
(3)扩增产物进行1％凝胶电泳分析，得到510bp目的片段为阳性，说明是桃枝枯病菌桃拟茎点霉(P.amygdali)，无条带为阴性对照，说明不是桃拟茎点霉。
实施例3、PCR特异性验证：
为了验证LAMP方法的特异性，以桃拟茎点霉2株菌株及12种拟茎点霉属外真菌、5种属内其他真菌为供试材料，PCR产物通过1％凝胶电泳检测结果显示桃枝枯病桃拟茎点霉(P.amygdali)的2株菌株均含有目的大小为510bp的条带，而与桃拟茎点霉(P.amygdali)属内不同种、不同属的其他真菌和阴性对照均没有能够扩增出目的条带(图2，图3)，其中图2中的缩略语：缩略语：P.amygdali(Phomopsis amygdali)，Mfructicola(Moniliniafructicola)，A.armeniacae(Alternaria armeniacae)，R.stolonifera(Rhizopusstolonifera)，M.oryzae(Magnaporthe oryzae)，C.gloeosporioides(Colletotrichumgloeosporioides)，E.sp.(Epicoccum sp.)，P.disseminate(Pestalotiopsisdisseminate)，A.pullulans(Aureobasidium pullulans)，P.capitalensis(Phyllostictacapitalensis)，C.globosum(Chaetomium globosum)，F.solani(Fusarium solani)，B.dothidea(Botryosphaeria dothidea).其中图3中的缩略语：P.amygdali(Phomopsisamygdali)，P.sp.(Phomopsis sp.)，D.nitschke(Diaporthe nitschke)，P.liquidambaris(Phomopsis liquidambaris)，D.eres(Diaporthe eres)，P.phaseoli(Phomopsisphaseoli).
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1560
<212> DNA
<213> 桃拟茎点霉(P.amygdali)
<400> 1
atggcgcccc ttgcgtcgta tgttggagcc tggctcatca cggcctcact ggcccgcgct 60
gctcttccgg tgcagtctcg ccagacgaca agcaccttca cttcgactgg aaatcccatc 120
ttggccgatg gctcgatcta ctcggcagat ccagcaccaa ttgtggtcaa tgatacggtc 180
tatattctag ccggtcgcga tgaggccggg ccggacgaga ataacttcat catgaaccag 240
tggcagatat ttgagtccaa gagcgcaacg ccttctggag gagagtggac tctgcatcaa 300
gatatcgcag aaccacagac actgttcaaa tgggcgagcc agggcactgc ctatgccagc 360
caaatcgttc ttggtcccga tggccgttac tatctctatg ctcctgtcac tcaggccaat 420
tcgcccaact cggatccatt tgctatcggc gttgctgttg cgagcagccc tcttggccct 480
ttcacagacg ctcatccgtc cggccctatt atatcagaga gtgtgccgtc accagggaac 540
aacatccaaa acattgatcc taccgtgttt ctcgataccg acggtaaagt gtacctctac 600
tgggggacat tcgggcagtt gaggggtatt gaactggaca cagacatggt cacggtgaag 660
agcagcactc tggtgaccgt caactccctc acaggtttct tcgaagcacc ttggttgatg 720
aagcgcaaag acacgtacta catgctctac gccgggaaca acgctggccc aaactcgccg 780
tgcacgccaa ccagctatca tgcgtgcatc gcctatggta ccgcttcaaa ccctctcggc 840
ccatggacct accgcggcat cgcattggat atcgtctctt ccacaacttc acaccccggt 900
gtctttgagc aacctgcagg ttcaggaaaa tacttcctcg tctatcacac ccgtgatgcc 960
gctaatggaa ctcatttccg ccgaagtgtt gcattcgacc agctgaactg ggatgacacc 1020
acgacgcccc cgtctattaa gaaagtcaac ccgaccaagc gccctggacc gccgcgcacg 1080
ccaacccgca atattgcacc cgcggcaagc ccatcgtcgg cgaacggcac accaattcag 1140
tattgggtgg cggccatcaa cgacggccgc gtagaggcca accctctccc accggattat 1200
tggagctcgt gggctgacaa gtcaccgtcc aacaatacct tgacatatac gtggaacaca 1260
acagtgcagc tcaacggtgc ggccatcgct ttctttgcag actcgcccgc cggcgcgact 1320
gcaggtgtgg cacctccggc ttcgtggtgg gtcgagtatc ttgcggacaa cggacagtgg 1380
tctcgagtgg cgaatagctc tgcattctcg actgcggtta ctgacactcc tgctgagact 1440
aaattcacaa cggtctcgac gaagtctatc agggccatcc tcaacccctc gggtaggagt 1500
ggagcctatg ccgctgttgg tgtcaaggaa tggttcgcat tccagcctac tgcctcgtaa 1560

Claims (1)

1.一种桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法，其特征在于：
（1）桃枝枯病菌特异性基因的筛选：所述桃枝枯病菌的病原菌为桃拟茎点霉（P. amygdali），筛选出的桃枝枯病菌特异性基因号为GME6801，序列为SEQ ID NO.1；
（2）上述基因特异性PCR引物组的筛选：所述引物组序列为：
正引物Pa6801F：5’-acattgatcctaccgtgtttctc-3’；
反引物Pa6801R：5’-gcttggtcgggttgactttctta-3’。
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