CN105219879B - 用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用 - Google Patents

用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用，其中引物组合物包括正向外引物TS‑F3，反向外引物TS‑B3，正向内引物TS‑FIP，反向内引物TS‑BIP，环引物TS‑LB。试剂盒包括上述引物组合物、dNTPs、DNA聚合酶、反应缓冲液。本发明的引物组合物及由其组成的试剂盒可应用于柑橘半穿刺线虫的快速诊断和鉴别，具有检测灵敏度高、特异性好、操作简便快捷等优势。

Description

用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及其应用、由其组成 的试剂盒及试剂盒的应用
技术领域
本发明涉及农业科学技术领域，尤其涉及一种用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。
背景技术
柑橘半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)是柑橘上重要的定居型半内寄生线虫，广泛分布于全世界柑橘产区，能引起柑橘慢衰病(Citrus slow decline disease)，可造成极大的经济损失。柑橘受害后一般减产30％～50％，严重时减产达100％；福建省5个重要柑橘产区柑橘半穿刺线虫果园发病率为74.6％，发病果园病株发病率为5％～100％；湖南省永州市柑橘半穿刺线虫平均发生率为82.1％，土壤中的线虫群体密度最高可达3077条/100mL，严重影响了柑橘的产量与品质。
柑橘慢衰病的症状不易与缺肥、缺水、生长不良或其它病原引起的黄化症状区分开，尤其是在柑橘种植区的基层，常被误诊为柑橘黄龙病，而进行抛荒、砍伐或挖除，对柑橘产业造成了重大的经济损失。快速、准确地诊断柑橘慢衰病，对柑橘半穿刺线虫的有效防控至关重要。柑橘慢衰病最主要的诊断方法就是鉴定柑橘根际土壤中是否存在柑橘半穿刺线虫。
目前，柑橘半穿刺线虫的鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和以PCR为基础的分子鉴定。虽然PCR方法在一定程度上克服了传统形态学鉴定上的缺陷，但需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统等较昂贵的仪器设备、较高的检测费用和较复杂的步骤。另外，这两种方法，都需要将线虫从待检测的土壤样品中进行分离和在显微镜下进行初步的形态观察及挑虫等过程，既费时费力，又需要操作人员具备专业的技能和丰富的经验，不能满足快速检测的需要，不利于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi等开发的一种新型恒温核酸扩增方法，针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在恒温60～65℃条件下保温30～90min，即可实现核酸的大量扩增。产物检测可通过肉眼观察反应过程中产生的焦磷酸镁白色浑浊沉淀，即可判断是否发生扩增反应，也可通过向其扩增产物中加入荧光染料利用颜色变化来判定结果。由于LAMP不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或简单的恒温器中即可完成，具有简单、快速、特异性强、灵敏度高、产物易检测、成本低等优点，已广泛应用于病毒、细菌、真菌、寄生虫等方面的检测。
目前还没有通过直接提取土壤DNA而快速检测柑橘半穿刺线虫的LAMP方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及在检测柑橘半穿刺线虫中的应用；还提供了一种包括上述引物组合物的试剂盒及该试剂盒在检测柑橘半穿刺线虫中的应用。
为解决上述技术问题，提供了一种用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物，包括正向外引物TS-F3，反向外引物TS-B3，正向内引物TS-FIP，反向内引物TS-BIP，环引物TS-LB，所述正向外引物TS-F3的DNA序列为SEQ ID NO.1所述的DNA序列，所述反向外引物TS-B3的DNA序列为SEQ ID NO.2所述的DNA序列，所述正向内引物TS-FIP的DNA序列为SEQ IDNO.3所述的DNA序列，所述反向内引物TS-BIP的DNA序列为SEQ ID NO.4所述的DNA序列，所述环引物TS-LB的DNA序列为SEQ ID NO.5所述的DNA序列。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述引物组合物在检测柑橘半穿刺线虫中的应用。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种试剂盒，包括上述的引物组合物、dNTPs、DNA聚合酶和反应缓冲液。
上述的试剂盒，优选的，所述引物组合物包括0.5μM的正向外引物TS-F3、0.5μM的反向外引物TS-B3、4μM的正向内引物TS-FIP、4μM的反向内引物TS-BIP和1.0μM的环引物TS-LB。
上述的试剂盒，优选的，所述反应缓冲液包括200mM的Tris-HCl、100mM的KCl、100mM的(NH4)SO4、60mM的MgSO4、1wt％的Triton X-100。
上述的试剂盒，优选的，所述dNTPs的浓度为10mM。
上述的试剂盒，优选的，所述DNA聚合酶的浓度为8U/μL。
上述的试剂盒，优选的，还包括显色剂，所述显色剂包括体积比为1∶9的SYBRgreen I和DMSO(二甲基亚砜)。进一步优选的，所述DMSO为PCR级DMSO。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种权利要求3或4所述试剂盒在检测柑橘半穿刺线虫中的应用。
上述的应用，优选的，所述应用方法为：
(1)提取待检样品的土壤DNA；
(2)以提取的土壤DNA为模板，利用试剂盒进行LAMP扩增得到扩增产物；
(3)检测扩增产物中是否含有柑橘半穿刺线虫。
上述的应用，优选的，LAMP扩增条件具体为：在60～65℃温育30～90min，然后82℃保温5min终止反应。
上述的应用，优选的，步骤(3)中所述检测方法为以下A、B中的一种或两种：
A：向扩增产物中加入显色剂，轻甩离心管后观察颜色变化，如果显示为绿色表示检测为阳性，表明土壤样品中含有柑橘半穿刺线虫，如果显示为红褐色表示检测结果为阴性，则土壤样品中不含有柑橘半穿刺线虫；
B：取扩增产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下检测结果，如果显示梯状条带，表明土壤样品中含有柑橘半穿刺线虫，如果不显示梯状条带，则土壤样品中不含有柑橘半穿刺线虫。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物，是根据柑橘半穿刺线虫rDNA-ITS的六个不同区域设计出5条引物，特异性比常规仅用两条引物的PCR方法要强。
(2)本发明提供了一种用于检测柑橘半穿刺线虫的试剂盒，用于柑橘半穿刺线虫的LAMP检测，灵敏度高、特异性强。采用该试剂盒，在0.5g土壤中对柑橘半穿刺线虫的检测灵敏度可达到0.01条2龄幼虫，比常规PCR的检测灵敏度高10倍。
(3)本发明提供了试剂盒在检测柑橘半穿刺线虫中的应用，DNA提取简便快速，不需要对待检测的土壤样品进行线虫分离和在显微镜下进行形态鉴定及挑虫等过程，直接提取土壤DNA进行快速检测，从提取土壤DNA到获得检测结果仅需要2h左右。检测快速、时间短。
(4)本发明提供了试剂盒在检测柑橘半穿刺线虫中的应用，设备简单，不需要显微镜、PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个简单的恒温器或水浴锅即可完成检测，有利于现场检测和基层应用。同时，操作简便，结果易于观察；整个操作过程不需要复杂的仪器和设备，一般技术人员即可完成；结果清晰明显，通过不同颜色，肉眼观察即可判定结果。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为柑橘半穿刺线虫ITS序列的LAMP引物设计示意图。
图2为本发明实施例3中荧光检测结果图。
图3为本发明实施例3中电泳检测结果图。
图4为本发明实施例4中荧光检测结果图。
图5为本发明实施例4中电泳检测结果图。
图6为本发明实施例5中采用LAMP方法的荧光检测结果图。
图7为本发明实施例5中采用LAMP方法的电泳检测结果图。
图8为本发明实施例5中采用PCR方法的电泳检测结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的用于检测柑橘半穿刺线虫DNA的引物组合物，该引物组合物根据柑橘半穿刺线虫ITS序列的测序结果，利用在线引物设计软件Primer Explorer V4设计并筛选得到，具体的的步骤如下：
(1)柑橘半穿刺线虫DNA的提取：
挑取单条线虫放入含有8μL ddH2O和1μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)的200μL PCR管中，放入液氮中冷冻1min后，置于95℃下热激2min。重复冻融5次。然后向PCR管中加入1μL浓度为1mg/mL蛋白酶K，65℃温育15min，95℃反应10min，获得DNA提取液。前述DNA提取液可直接用于LAMP和PCR反应。
(2)柑橘半穿刺线虫rDNA-ITS扩增：
利用线虫rDNA-ITS区的通用引物rDNA1(5＇-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3＇)和rDNA2(5＇-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3＇)扩增前述DNA提取液中柑橘半穿刺线虫ITS区片段。
PCR扩增反应体系(25μL)：
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。得到PCR扩增产物。
(3)测序：将步骤(2)中得到的PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析后，回收、克隆并测序。
测序结果参见SEQ ID NO.1，具体为：
序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
(4)LAMP引物设计：根据柑橘半穿刺线虫ITS序列的测序结果，利用在线引物设计软件Primer Explorer V4设计并筛选下述LAMP引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。图1为柑橘半穿刺线虫ITS序列的LAMP引物设计示意图。
各引物序列如下：
正向外引物TS-F3：5＇-CCAGGTTGAGCAGAGTTCTT-3＇(SEQ ID No.2)；
反向外引物TS-B3：5＇-GCCGTTTTCGCCTGTAGTC-3＇(SEQ ID No.3)；
正向内引物TS-FIP：
5＇-CAGATGCCAGAAGCAGCGACAGGCACATCGGGTGAAGAG-3＇(SEQ ID No.4)；
反向内引物TS-BIP：
5＇-TGGTCATACTTCCTCTGCCGCTGGGTAAGAGCCGAGAAGGA-3＇(SEQ ID No.5)；
环引物TS-LB：5＇-GAGGAAGGGGTACTGAGCTT-3＇(SEQ ID No.6)。
本实施例的引物组合物可作为LAMP检测试剂盒的引物组合物，用于鉴定和检测柑橘半穿刺线虫。
同时，本实施例中的正向外引物TS-F3，反向外引物TS-B3还可以作为PCR的引物，通过PCR扩增，用于鉴定和检测柑橘半穿刺线虫。
实施例2：
一种本发明的用于检测柑橘半穿刺线虫的LAMP检测试剂盒，包括：
(1)引物组合物：0.5μM的正向外引物TS-F3、0.5μM的反向外引物TS-B3、4μM的正向内引物TS-FIP、4μM的反向内引物TS-BIP，1.0μM的环引物TS-LB；
(2)8U/μL的DNA聚合酶；
(3)反应缓冲液：200mM的Tris-HCl(pH 8.8)、100mM的KCl、100mM的(NH4)SO4、60mM的MgSO4、1wt％的Triton X-100。
其制备方法为：取1μL引物混合液、2.5μL反应缓冲液、3μL dNTPs、1μL Bst DNA聚合酶混合，用灭菌双蒸馏水补足体积至24μL。
实施例3：
一种本发明实施例2的LAMP检测试剂盒在检测土壤中柑橘半穿刺线虫中的应用，其具体的应用方法包括以下步骤：
(1)提取土壤DNA：采取柑橘根际土壤，使用MP Biomedicals公司的FastSpin Kit for Soil试剂盒提取土壤DNA(具体操作方法参见试剂盒说明书)；
(2)制备LAMP反应体系：取1μL步骤(1)中的土壤DNA，加入到24μL实施例2的LAMP检测试剂盒中，混匀得到25μL LAMP反应体系。
(3)LAMP反应：将步骤(2)中得到的反应体系置于63℃(60℃～65℃均可实施)恒温水浴中等温扩增75min(30～90min均可实施)，然后在82℃下保温5min终止反应，得到扩增产物。
(4)荧光检测：向步骤(3)中得到的扩增产物中加入2μL显色剂(显色剂为SYBRgreen I与PCR级DMSO的混合物，体积比为1∶9)。轻甩离心管后观察颜色变化。
空白对照：用1μL灭菌双蒸馏水替代1μL土壤DNA，按照上述相同的方法进行LAMP反应。
检测结果参见图2，从图2中可知：从土壤中提取的DNA，经过LAMP扩增后得到的扩增产物，显示为绿色，证明样本中含有柑橘半穿刺线虫；而空白对照管中显示为红褐色，证明样本中不含有柑橘半穿刺线虫。
(5)电泳检测：取2μL步骤(3)中得到的扩增产物，于2％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下检测结果。
检测结果参见图3，从图3中可知：从土壤中提取的DNA，经过LAMP扩增后得到的扩增产物，在凝胶电泳中显示梯状条带，表明样品中含有柑橘半穿刺线虫；而空白对照经琼脂糖凝胶电泳后，不显示梯状条带，证明样本中不含有柑橘半穿刺线虫。
LAMP扩增反应结束后既可以进行荧光检测，也可以进行电泳检测，或者两种方法可以同时进行。通过荧光检测可以肉眼鉴别样品中是否含有柑橘半穿刺线虫，而电泳检测一方面可以鉴别样品中是否含有柑橘半穿刺线虫，还可以验证荧光检测的可靠性。
实施例4：柑橘半穿刺线虫LAMP特异性检测
收集北方根结线虫、咖啡短体线虫、双宫螺旋线虫、燕麦滑刃线虫、丝尾垫刃线虫、拟滑刃线虫、小杆目线虫、南方根结线虫、隐皮孢囊线虫、矮化线虫、旱稻孢囊线虫、松材线虫，分别提取其DNA作为模板与柑橘半穿刺线虫DNA模板，按照实施例3的方法进行LAMP检测，以验证柑橘半穿刺线虫LAMP检测方法的特异性。表1为各供试样本的植物线虫群体种类及来源。
表1：供试的全部植物线虫群体种类及来源
编号 群体种类 寄主植物 采样地点
1 柑橘半穿刺线虫Tylenchulus semipenetrans 柑橘 湖南永州
2 北方根结线虫Meloidogyne hapla 柑橘 湖南永州
3 咖啡短体线虫Pratylenchus coffeae 柑橘 湖南永州
4 双宫螺旋线虫Helicotylenchus dihystera 柑橘 湖南永州
5 燕麦滑刃线虫Aphelenchus avenae 柑橘 湖南永州
6 丝尾垫刃线虫Filenchus sp. 柑橘 湖南永州
7 拟滑刃线虫Aphelenchoides sp. 柑橘 湖南永州
8 小杆目线虫Rhabditis 柑橘 湖南永州
9 南方根结线虫M.incognita 辣椒 湖南湘西
10 隐皮孢囊线虫Cryphodera sp. 苎麻 湖南沅江
11 矮化线虫Tylenchorhynchus sp. 苎麻 湖南沅江
12 旱稻孢囊线虫Heterodera elachista 水稻 湖南长沙
13 松材线虫Bursaphelenchus xylophilus 黑松 本实验室保存
图4为荧光检测结果，其中编号1至13采用表1中的供试样本，编号14为阴性对照。从图4中可知：仅有第1管中(柑橘半穿刺线虫)显示为绿色，其余12个样本和阴性对照均为红褐色。
图5为电泳检测结果，其中编号1至13采用表1中的供试样本，编号14为阴性对照。从图5中可知：第1泳道(柑橘半穿刺线虫)出现LAMP特征性梯状条带，其它泳道均未出现扩增条带。
结果表明本发明所述的LAMP引物和LAMP检测方法在检测柑橘半穿刺线虫是具有很高的特异性。
实施例5：柑橘半穿刺线虫LAMP灵敏度检测。
取0.5g土壤，该土壤中含有100条柑橘半穿刺线虫2龄幼虫。按照实施例3的方法获得土壤总DNA，按10倍梯度稀释成9个浓度，则每0.5g土壤中分别含有100～1.0×10-6条2龄幼虫。取各浓度的DNA 1μL做为LAMP反应模板，按照实施例3的操作步骤进行LAMP扩增反应得到LAMP扩增产物。
同时以上述梯度稀释的DNA为模板，以TS-F3和TS-B3为引物，进行常规PCR检测，体系如下：10×EasyTaq Buffer(含Mg2+)：3μL；2.5mM dNTPs：2μL；引物TS-F3和TS-B3(10μmol/L)各1μL；5U/μL EasyTaq DNA Polymerase：0.5μL；模板DNA：1μL；补足ddH2O至25μL。PCR扩增条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。得到PCR扩增产物。
分别将LAMP扩增产物按照实施例3的方法进行荧光检测和电泳检测。
荧光检测结果参见图6，其中1～10分别为：100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和阴性对照，从图6中可知：第1～5管均可以观察到绿色荧光，其它管和阴性对照均为红褐色。
琼脂糖凝胶电泳结果参见图7，其中1～10分别为：100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和阴性对照，从图7中可知：第1～5泳道均出现LAMP特征性梯状条带，其它泳道均未出现扩增条带。
从图6和图7中可知：采用LAMP方法检测柑橘半穿刺线虫，其灵敏度检测能达到0.01条线虫。
分别将PCR扩增产物按照相同的方法进行脂糖凝胶电泳检测，检测结果参见图8，图8中1～10分别为：100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和阴性对照。从图8中可知：在DNA稀释至0.1条线虫时，能够观察到扩增条带，继续稀释时则观察不到扩增条带表明常规PCR检测灵敏度为0.1条线虫。
图中，M表示Trans2K Plus II DNA Marker。
以上结果说明：本发明所述的LAMP引物和LAMP检测方法在0.5g土壤中能够检测到0.01条柑橘半穿刺线虫。具有极高的灵敏度，比常规PCR灵敏度高10倍。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (9)

1.一种用于检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物组合物，其特征在于，包括正向外引物TS-F3，反向外引物TS-B3，正向内引物TS-FIP，反向内引物TS-BIP，环引物TS-LB；所述正向外引物TS-F3序列为SEQ ID NO.2所示，所述反向外引物TS-B3序列为SEQ ID NO.3所示，所述正向内引物TS-FIP序列为SEQ ID NO.4所示，所述反向内引物TS-BIP序列为SEQ IDNO.5所示，所述环引物TS-LB序列为SEQ ID NO.6所示。
2.一种权利要求1所述的环等温扩增引物组合物在检测土壤中柑橘半穿刺线虫中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的环等温扩增引物组合物、dNTPs、DNA聚合酶、反应缓冲液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述环等温扩增引物组合物包括0.5 μM的正向外引物TS-F3和0.5 μM的反向外引物TS-B3、4 μM的正向内引物TS-FIP、4 μM的反向内引物TS-BIP和1.0 μM的环引物TS-LB。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs的浓度为10 mM；所述DNA聚合酶的浓度为8U/μL。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括显色剂，所述显色剂包括体积比为1∶9 的SYBR green I和DMSO。
7.一种权利要求3至6中任一项所述的试剂盒在检测土壤中柑橘半穿刺线虫中的应用，其特征在于，所述应用方法为：
（1）提取待检样品的土壤DNA；
（2）以提取的土壤DNA为模板，利用权利要求3至6中任一项所述的试剂盒进行LAMP扩增得到扩增产物；
（3）检测土壤样品中是否含有柑橘半穿刺线虫。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，LAMP扩增条件具体为：在60～65℃温育30～90 min，然后82℃保温5 min终止反应。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中所述检测方法为以下A、B中的一种或两种：
A：向扩增产物中加入显色剂，轻甩离心管后观察颜色变化，如果显示为绿色表示检测为阳性，表明土壤样品中含有柑橘半穿刺线虫，如果显示为红褐色表示检测结果为阴性，则土壤样品中不含有柑橘半穿刺线虫；
B：取扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下检测结果，如果显示梯状条带，表明土壤样品中含有柑橘半穿刺线虫，如果不显示梯状条带，则土壤样品中不含有柑橘半穿刺线虫。
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