CN110423748A

CN110423748A - 一种快速检测爪哇根结线虫的lamp引物及其应用、检测方法

Info

Publication number: CN110423748A
Application number: CN201910864455.0A
Authority: CN
Inventors: 宋志强; 梅时勇; 杨喜爱; 张晓伟; 肖清明; 肖爱平; 冷娟
Original assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Current assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Priority date: 2019-09-12
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2019-11-08

Abstract

本发明涉及植物病原检测技术领域，特别涉及一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用和检测方法。所述引物包括正向外引物Mj‑F3、反向外引物Mj‑B3、正向内引物Mj‑FIP和反向内引物Mj‑BIP；引物核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2～5所示。基于该引物建立了LAMP检测方法，可应用于线虫样品、植物根组织样品和土壤样品中爪哇根结线虫的快速检测和鉴定，具有特异性强、灵敏度高、仪器设备简单、操作简便、快速高效、结果判定可视化等优点，在爪哇根结线虫现场快速检测和爪哇根结线虫病的早期诊断及指导科学用药等方面具有很高的推广应用价值。

Description

一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用、检测方法

技术领域

本发明涉及植物病原检测技术领域，特别涉及一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用和检测方法。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类世界性分布的威胁农业生产的植物根系专性内寄生线虫，可侵染114个科3000多种植物，每年因其危害可造成世界农作物减产至少5％。目前，世界上报道根结线虫的种类已超过100个种，其中，爪哇根结线虫(M.javanica)是分布最广、危害最重、最常见的根结线虫种类之一，具有非常广泛的寄主范围，可侵染蔬菜、果树、药材、花卉、林木等植物，给我国农业生产造成了重大的经济损失。快速、准确地鉴定和检测根结线虫的种类，对根结线虫病害的田间检测和监测及选择有效的防控方法至关重要。

根结线虫种类鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和以PCR为基础的分子诊断方法。形态学鉴定主要以2龄幼虫和雄虫头部、尾部及雌虫会阴花纹形态作为鉴别的主要依据，但由于根结线虫种类较多，各种类在种间的形态学特征上非常相似，在种内又存在着较大的变异，通过形态学特征难以准确鉴定，并且该方法耗时、费力，需要专业的技能和丰富的线虫形态学鉴定经验，难以达到快速诊断和检测的目的。虽然PCR检测方法在一定程度上克服了形态学鉴定上的缺陷，但需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统等昂贵的仪器设备，检测过程复杂、时间较长，不利于现场快速检测及基层普及应用。

目前还没有通过直接提取土壤DNA和反应完成后无需开盖而快速可视化检测土壤中爪哇根结线虫的LAMP方法。

发明内容

有鉴于此，本发明克服现有爪哇根结线虫检测鉴定技术的不足，提供一种可以从植物组织样品和土壤样品中快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物和简便实用的检测方法。该方法仅需要使用恒温水浴即可完成检测，通过肉眼观察即可准确、高效、简便和快速地判定样品中是否含有爪哇根结线虫。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了引物组合，包括正向外引物Mj-F3、反向外引物Mj-B3、正向内引物Mj-FIP和反向内引物Mj-BIP；

所述正向外引物Mj-F3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述反向外引物Mj-B3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述正向内引物Mj-FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述反向内引物Mj-BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amp lification，LAMP)是一种新型的体外等温扩增核酸技术，该技术依赖于能识别靶基因序列上6～8个区域的4～6条特异性引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件下(60～65℃)保温30～90min，就可快速完成核酸的大量扩增。扩增产物可以通过荧光目测比色、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸镁浊度、横向流动试纸条等方法检测。由于该技术不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或简单的恒温器中即可完成，具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高、检测方便等优点，已广泛应用于真菌、细菌、病毒、寄生虫等方面的检测。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物组合在检测爪哇根结线虫中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，待测样品为线虫样品、植物根组织样品和/或土壤样品。

本发明还提供了所述的引物组合在制备爪哇根结线虫检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种爪哇根结线虫的LAMP检测方法，包括以下步骤：

步骤1、提取待测样品的DNA；

步骤2、以所述待测样品的DNA为模板，利用本发明所述的引物组合，建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；

步骤3、根据步骤2中LAMP扩增的反应结果判定所述待测样品中是否含有爪哇根结线虫；

所述判定标准为：

(1)向所述LAMP扩增的产物中加入显色剂，如果所述LAMP扩增的产物呈绿色，则检测结果为阳性，表明所述待测样品中含有爪哇根结线虫；如果所述LAMP扩增的产物呈橙色，则检测结果为阴性，表明所述待测样品中不含有爪哇根结线虫；或

(2)取所述LAMP扩增的产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下进行检测，如果出现梯状条带，表明所述待测样品中含有爪哇根结线虫；如果未出现梯状条带，表明所述待测样品中不含有爪哇根结线虫。

在本发明的一些具体实施方案中，所述LAMP反应体系为25μL，包括1μL DNA模板，0.2μmol/L正向外引物(Mj-F3)，0.2μmol/L反向外引物(Mj-F3)，1.6μmol/L正向内引物(Mj-FIP)，1.6μmol/L反向内引物(Mj-FIP)，1.2mmol/L dNTPs，6mmol/L MgSO₄，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton X-100，8U Bst DNA聚合酶，余量用ddH₂O补足。

在本发明的一些具体实施方案中，所述显色剂包括体积比为1:9的SYBR green I与PCR级DMSO的混合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述显色剂的加入时机为：步骤2中所述建立LAMP反应体系之后、LAMP扩增之前，在PCR管内盖上加入1μL显色剂。

在本发明的一些具体实施方案中，所述LAMP扩增的反应条件为：60℃～65℃保温30～90min。

本发明还提供了一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP试剂盒，包括如权利要求1所述的引物组合。

本发明具有以下有益效果：

(1)特异性强。本发明提供了一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物，该引物是根据爪哇根结线虫SCAR标记序列中的6个不同区域设计筛选出4条特异性引物，比仅识别靶序列2个区域的常规PCR检测方法特异性强。

(2)灵敏度高。本发明建立的爪哇根结线虫LAMP检测方法灵敏度高，可检测到0.0001头爪哇根结线虫雌虫，以及在0.5g土壤中可检测到0.01条爪哇根结线虫2龄幼虫，比常规PCR的检测灵敏度高10～100倍。

(3)检测快速、简便易行。本发明建立的爪哇根结线虫LAMP检测方法可以直接检测植物组织和土壤样品中的爪哇根结线虫。DNA提取简便快速，不需要对待检测的植物组织和土壤样品进行线虫分离、形态学鉴定及挑虫等步骤，直接提取植物组织和土壤样品DNA进行快速检测，从提取DNA到获得检测结果仅需要2h左右。

(4)设备简单，方法操作简便。本发明建立的爪哇根结线虫LAMP检测方法对仪器设备要求低，不需要显微镜、PCR仪、凝胶电泳和成像系统等昂贵仪器，只需要一个简单的恒温器或水浴锅即可完成检测，利于现场快速检测和基层应用。

(5)结果判定可视化。本发明建立的爪哇根结线虫LAMP检测方法采用扩增反应前在PCR管内盖上加入荧光染料，反应结束后通过离心与扩增产物混合，通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，实现了无需开盖的样品快速可视化检测，避免了反应完成后，开盖加入荧光染料而造成的气溶胶污染问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为三组爪哇根结线虫LAMP引物在不同反应温度条件下的扩增结果图；

图2为爪哇根结线虫SCAR标记序列的最佳LAMP引物设计示意图；

图3为本发明实施例2中LAMP荧光检测结果图；

图4为本发明实施例2中LAMP电泳检测结果图；

图5为本发明实施例3中爪哇根结线虫LAMP特异性荧光检测结果图；

图6为本发明实施例3中爪哇根结线虫LAMP特异性电泳检测结果图；

图7为本发明实施例4中土壤中爪哇根结线虫2龄幼虫LAMP灵敏度荧光检测结果图；

图8为本发明实施例4中土壤中爪哇根结线虫2龄幼虫LAMP灵敏度电泳检测结果图；

图9为本发明实施例4中土壤中爪哇根结线虫2龄幼虫常规PCR灵敏度荧光检测结果图；

图10为本发明实施例4中爪哇根结线虫雌虫LAMP灵敏度荧光检测结果图；

图11为本发明实施例4中爪哇根结线虫雌虫LAMP灵敏度电泳检测结果图；

图12为本发明实施例4中爪哇根结线虫雌虫常规PCR灵敏度电泳检测结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用和检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的目的是提供一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物。

本发明的另一目的是提供一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP方法。

本发明上述目的可通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物，包括正向外引物Mj-F3、反向外引物Mj-B3、正向内引物Mj-FIP和反向内引物Mj-BIP；引物核苷酸序列依次如SEQ IDNO.2～5所示。

所述LAMP引物在检测爪哇根结线虫方面的应用，以及在制备爪哇根结线虫检测试剂或试剂盒方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以待测样品DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物，建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；

(3)根据LAMP扩增反应结果判定待测样品中是否含有爪哇根结线虫。

优选地，所述待测样品DNA可从线虫样品、植物根组织和/或土壤样品中提取。

优选地，所述LAMP反应体系为25μL，包括1μL DNA模板，0.2μmol/L正向外引物Mj-F3，0.2μmol/L反向外引物Mj-F3，1.6μmol/L正向内引物Mj-FIP，1.6μmol/L反向内引物Mj-FIP，1.2mmol/L dNTPs，6mmol/L MgSO₄，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton X-100，8U Bst DNA聚合酶，余量用ddH₂O补足。

优选地，所述显色剂包括体积比为1:9的SYBR green I与PCR级DMSO的混合物。

优选地，扩增反应前，在PCR管内盖上加入1μL显色剂，反应结束后瞬时离心，将显色剂与反应液混匀后观察颜色变化。

优选地，所述LAMP扩增的反应条件为：60℃～65℃保温30～90min。

所述LAMP扩增反应结果判定方法为：

(1)向扩增产物中加入显色剂，如果肉眼观察扩增产物呈绿色表示检测结果为阳性，表明待测样品中含有爪哇根结线虫；如果肉眼观察扩增产物呈橙色表示检测结果为阴性，则待测样品中不含有爪哇根结线虫；

(2)取扩增产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下进行检测，如果出现梯状条带，表明待测样品中含有爪哇根结线虫；如果未出现梯状条带，则待测样品中不含有爪哇根结线虫。

一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP试剂盒，包含有上述LAMP引物。

所述LAMP试剂盒使用方法为上述LAMP方法。

上述LAMP方法或LAMP试剂盒在检测爪哇根结线虫方面的应用也都在本发明的保护范围之内。

本发明提供的快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用和检测方法中所用材料及试剂除非特别说明均可以由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1爪哇根结线虫SCAR标记序列扩增

(1)爪哇根结线虫DNA的提取：

在体视显微镜下，用挑针挑取单条线虫放入含有8μL ddH₂O和1μL 10×PCRbuffer(Mg²⁺ free)的0.2mL PCR管中；将PCR管放入液氮中冷冻1min后，再置于85℃下2min，重复5次；向PCR管中加入1μL 1mg/mL蛋白酶K，56℃温育15min，95℃加热10min，获得DNA提取液。前述DNA提取液可直接用于LAMP和PCR扩增反应。

(2)爪哇根结线虫SCAR标记序列扩增：

利用爪哇根结线虫SCAR标记特异性引物MJ-F(5’-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3’)和MJ-R(5’-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3’)扩增前述DNA提取液中爪哇根结线虫SCAR标记序列(如SEQ ID No.1所示)。

PCR扩增反应采用25μL体系：

PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

(3)测序：PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收、纯化后，与克隆载体pEASY-T1连接，再转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中后，挑取阳性克隆送至北京擎科生物科技有限公司湖南分公司测序。序列测定结果参见SEQ ID No.1。

实施例2 LAMP技术检测爪哇根结线虫方法的建立

2.1 LAMP引物设计

根据爪哇根结线虫SCAR标记序列的测序结果，利用在线引物设计软件PrimerExplorer V5设计了多组引物组，通过初步筛选得到下述三组LAMP引物，包括Mj-F3/Mj-B3/Mj-FIP/Mj-BIP、Mj-F3-A/Mj-B3-A/Mj-FIP-A/Mj-BIP-A和Mj-F3-B/Mj-B3-B/Mj-FIP-B/Mj-BIP-B。引物由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成。

设计的三组引物组及其序列如下：

正向外引物Mj-F3(SEQ ID No.2)：5’-AAGTTGGACGGTTTTCCGG-3’；

反向外引物Mj-B3(SEQ ID No.3)：5’-TTTACAAAGGGGGCAGTTCC-3’；

正向内引物Mj-FIP(SEQ ID No.4)：5’-TCCAGACGATTCTGTGCTAGTTAAAGCTGTTCCCATGTTTTAAGC-3’；

反向内引物Mj-BIP(SEQ ID No.5)：5’-AAGGACATTTCATCCTCTCTCCACAGGAATGTCAAACTCTGAGG-3’；

对照引物组：

引物Mj-F3-A(SEQ ID No.6)：5’-CGCTAGAATTCGACCCTGGT-3’；

引物Mj-B3-A(SEQ ID No.7)：5’-CCGTCCAACTTTTGAAGCAT-3’；

引物Mj-FIP-A(SEQ ID No.8)：

5’-TTGCTTCTATCGGACGAATCTTACTGACCAAATTTATAAAAATAC-3’；

引物Mj-BIP-A(SEQ ID No.9)：

5’-ATTGCGTTTAAGATGGAATGTGTATCATTATTTTGACGATTTT-3’；

引物Mj-F3-B(SEQ ID No.10)：5’-GCGTTTAAGATGGAATGTAAT-3’；

引物Mj-B3-B(SEQ ID No.11)：5’-GGAGAGAGGATGAAATGTCC-3’；

引物Mj-FIP-B(SEQ ID No.12)：

5’-CTCCAACTTTTGAAGCATTGTATCTAATTTGGCTGATTACTGAC-3’；

引物Mj-BIP-B(SEQ ID No.13)：

5’-GCACAGAATCGTCTGGATCTAATATATTTCAAGTTTGTTTTTAG-3’；

2.2 LAMP反应体系组成：

2.3LAMP引物的筛选

将含有三组引物的混合LAMP反应体系分别置于61℃、63℃和65℃恒温水浴中等温扩增60min，反应结束后，分别取4μL扩增产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下进行检测。

检测结果参见图1，其中1～3泳道分别为引物组

Mj-F3/Mj-B3/Mj-FIP/Mj-BIP在61℃、63℃和65℃条件下的扩增结果，4～6泳道分别为引物组Mj-F3-A/Mj-B3-A/Mj-FIP-A/Mj-BIP-A在61℃、63℃和65℃条件下的扩增结果，7～9泳道分别为引物组

Mj-F3-B/Mj-B3-B/Mj-FIP-B/Mj-BIP-B在61℃、63℃和65℃条件下的扩增结果，10泳道为阴性对照。结果显示，只有引物组Mj-F3/Mj-B3/Mj-FIP/Mj-BIP在61℃、63℃和65℃条件下均能扩增出典型的梯状条带，其它两组引物组和阴性对照未扩增出任何条带。

结果表明，引物组Mj-F3/Mj-B3/Mj-FIP/Mj-BIP为本发明最终筛选获得的LAMP引物，并选择63℃作为最佳反应温度。图2为爪哇根结线虫SCAR标记序列的最佳LAMP引物设计示意图。

2.4 LAMP反应扩增条件：将以上各组分加入PCR管中混合并瞬时离心后，在PCR管内盖上加入1μL显色剂，缓慢盖上PCR管盖，置于63℃恒温水浴中等温扩增60min，得到扩增产物。

2.5 LAMP扩增反应结果判定：

(1)荧光检测：反应结束后瞬时离心，将显色剂与反应液混匀后观察颜色变化。若肉眼观察扩增产物呈绿色，检测结果为阳性，表明待测样品中含有爪哇根结线虫；若肉眼观察扩增产物呈橙色，则检测结果为阴性，表明待测样品中不含有爪哇根结线虫。

检测结果参见图3，从图3中可知：第1管含有爪哇根结线虫DNA，可以观察到绿色荧光；第2管为阴性对照，则显示橙色。

(2)电泳检测：取扩增产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下进行检测，若出现梯状条带，检测结果为阳性，表明待测样品中含有爪哇根结线虫；若未出现梯状条带，则检测结果为阴性，表明待测样品中不含有爪哇根结线虫。

检测结果参见图4，从图4中可知：第1泳道含有爪哇根结线虫DNA，可以观察到梯状条带；第2泳道为阴性对照，无梯状条带出现。

实施例3爪哇根结线虫LAMP特异性检测

收集爪哇根结线虫、南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、象耳豆根结线虫、拟禾本科根结线虫、柑橘半穿刺线虫、咖啡短体线虫、水稻潜根线虫、中华隐皮孢囊线虫和加德拟鞘线虫，分别提取其DNA作为模板，按照实施例2中的方法进行LAMP检测，以验证爪哇根结线虫LAMP检测方法的特异性。表1为各供试样本的植物线虫群体种类及来源。

表1 供试的植物线虫群体种类及来源

编号	群体种类	寄主植物	采样地点
				1	爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)	工业大麻	云南西双版纳傣族自治州
2	爪哇根结线虫(M.javanica)	三七	云南普洱
				3	南方根结线虫(M.incognita)	西瓜	河北保定
4	南方根结线虫(M.incognita)	茄子	湖南益阳
				5	花生根结线虫(M.arenaria)	烟草	云南玉溪
6	北方根结线虫(M.hapla)	三七	云南普洱
				7	北方根结线虫(M.hapla)	柑橘	湖南永州
8	象耳豆根结线虫(M.enterolobii)	辣椒	湖南永州
				9	拟禾本科根结线虫(M.graminicola)	水稻	湖南长沙
10	拟禾本科根结线虫(M.graminicola)	水稻	湖南益阳
				11	柑橘半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)	柑橘	湖南长沙
12	咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)	柑橘	湖南益阳
				13	水稻潜根线虫(Hirschmanniella oryzae)	水稻	湖南长沙
14	中华隐皮孢囊线虫(Cryphodera sinensis)	苎麻	湖南益阳
				15	加德拟鞘线虫(Hemicriconemoides gaddi)	苎麻	湖南益阳

图5为荧光检测结果，其中编号1至15采用表1中的供试样本，编号16为阴性对照。结果显示：仅有第1管和第2管含有爪哇根结线虫DNA，可以观察到绿色荧光，其它14个管的样本和阴性对照均为橙色。

图6为电泳检测结果，其中编号1至15采用表1中的供试样本，编号16为阴性对照。结果显示：仅有第1泳道和第2泳道(爪哇根结线虫)出现梯状条带，其它14个泳道均未出现梯状条带。

结果说明本发明所述的LAMP引物和LAMP检测方法在检测爪哇根结线虫时具有高度的特异性。

实施例4爪哇根结线虫LAMP灵敏度检测

4.1土壤中爪哇根结线虫2龄幼虫LAMP灵敏度检测

取0.5g含有100条爪哇根结线虫2龄幼虫的土壤，使用MP Biomedicals公司的FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒提取土壤总DNA(具体操作方法参见试剂盒说明书)，按10倍梯度稀释成7个浓度，则每0.5g土壤中分别含有100～1.0×10^-4条2龄幼虫，将各个浓度梯度各取1μL作为模板，按照实施例2中的方法进行LAMP检测。

同时以上述各个浓度梯度的DNA为模板，以Mj-F3和Mj-B3为引物，进行常规PCR检测。PCR扩增反应采用25μL体系：10×EasyTaq buffer(含Mg²⁺)3μL，2.5mmol/L dNTPs 2μL，10μmol/L引物Mj-F3和Mj-B3各1μL，5U/μL EasyTaq DNA Polymerase 0.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

LAMP荧光检测结果参见图7，其中1～8管分别为：0.5g土壤中分别含有100、10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4条2龄幼虫和阴性对照。结果显示：第1～5管均可以观察到绿色荧光，其它管和阴性对照则显示橙色。

LAMP电泳检测结果参见图8，其中1～8泳道分别为：0.5g土壤中分别含有100、10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4条2龄幼虫和阴性对照。结果显示：第1～5泳道均出现梯状条带，其它3个泳道均未出现梯状条带。

图7和图8结果表明，采用LAMP方法检测土壤中的爪哇根结线虫，其检测灵敏度可达到0.01条2龄幼虫。

常规PCR电泳检测结果参见图9，其中1～8泳道分别为：0.5g土壤中分别含有100、10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4条2龄幼虫和阴性对照。结果显示：当DNA浓度稀释至0.1条2龄幼虫时，可观察到扩增条带，继续稀释时则不能观察到扩增条带，表明常规PCR检测灵敏度为0.1条2龄幼虫。

上述结果说明，本发明所述的LAMP引物及其检测方法可在0.5g土壤中检测到0.01条爪哇根结线虫2龄幼虫，比常规PCR的检测灵敏度高10倍，具有极高的检测灵敏度。

4.2爪哇根结线虫雌虫LAMP灵敏度检测

提取单头爪哇根结线虫雌虫DNA，并按10倍梯度稀释成7个浓度，则分别含有1～1.0×10^-6头雌虫，将各个浓度梯度各取1μL作为模板，按照实施例4.1中的方法分别进行LAMP和常规PCR检测。

LAMP荧光检测结果参见图10，其中1～8管分别为：1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6头雌虫和阴性对照。结果显示：第1～5管均可以观察到绿色荧光，其它管和阴性对照则显示橙色。

LAMP电泳检测结果参见图11，其中1～8泳道分别为：1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6头雌虫和阴性对照。结果显示：第1～5泳道均出现梯状条带，其它3个泳道均未出现梯状条带。

图10和图11结果表明，采用LAMP方法检测爪哇根结线虫的雌虫，其检测灵敏度可达到0.0001头雌虫。

常规PCR电泳检测结果参见图12，其中1～8泳道分别为：1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6头雌虫和阴性对照。结果显示：当DNA浓度稀释至0.01头雌虫时，可观察到微弱的扩增条带，继续稀释时则不能观察到扩增条带，表明常规PCR检测灵敏度为0.01条2龄幼虫。

上述结果说明，本发明所述的LAMP引物及其检测方法可检测到0.0001头爪哇根结线虫雌虫，比常规PCR的检测灵敏度高100倍，具有极高的检测灵敏度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院麻类研究所

<120> 一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用、检测方法

<130> MP1923339

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 517

<212> DNA

<213> 爪哇根结线虫(Meloidogyne javanicaSCAR标记序列SCAR marker sequenceof Meloidogyne javanica )

<400> 1

acgctagaat tcgaccctgg tgactgacca aatttataaa aatactacat aatttttggg 60

ttatctaaaa ataagattcg tccgatagaa gcaaaaaagg gttataaaat tgagaccaaa 120

aaatatatac ctaataattg cgtttaagat ggaatgtaat ttggctgatt actgacaaaa 180

aaatcgtcaa aataatgata caatgcttca aaagttggac ggttttccgg ttgctgttcc 240

catgttttaa gcattacttg ttcataaatt cgtttaacta gcacagaatc gtctggatct 300

aaaataaaaa ttttttcaac gaattttaac taaaaacaaa cttgaaatat aaggacattt 360

catcctctct ccattttcaa tttttacaag aacctcagag tttgacattc ctgcatatgg 420

aactgccccc tttgtaaata tttcataaag gagaattcca taggaccaca catccgattt 480

tacagtaaaa atctttagca tggctgcttc tggtacc 517

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagttggacg gttttccgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttacaaagg gggcagttcc 20

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccagacgat tctgtgctag ttaaagctgt tcccatgttt taagc 45

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaggacattt catcctctct ccacaggaat gtcaaactct gagg 44

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgctagaatt cgaccctggt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgtccaact tttgaagcat 20

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgcttctat cggacgaatc ttactgacca aatttataaa aatac 45

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attgcgttta agatggaatg tgtatcatta ttttgacgat ttt 43

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgtttaaga tggaatgtaa t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggagagagga tgaaatgtcc 20

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctccaacttt tgaagcattg tatctaattt ggctgattac tgac 44

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcacagaatc gtctggatct aatatatttc aagtttgttt ttag 44

Claims

1.引物组合，其特征在于，包括正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物；

所述正向外引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述反向外引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述正向内引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述反向内引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

2.如权利要求1所述的引物组合在检测爪哇根结线虫中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，待测样品为线虫样品、植物根组织样品和/或土壤样品。

4.如权利要求1所述的引物组合在制备爪哇根结线虫检测试剂或试剂盒中的应用。

5.一种爪哇根结线虫的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、提取待测样品的DNA；

步骤2、以所述待测样品的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物组合，建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；

所述判定标准为：

6.如权利要求5所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP反应体系为25μL，包括1μLDNA模板，0.2μmol/L正向外引物，0.2μmol/L反向外引物，1.6μmol/L正向内引物，1.6μmol/L反向内引物，1.2mmol/LdNTPs，6mmol/L MgSO₄，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/LKCl，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton X-100，8U Bst DNA聚合酶，余量用ddH₂O补足。

7.如权利要求5或6所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述显色剂包括体积比为1:9的SYBR green I与PCR级DMSO的混合物。

8.如权利要求5至7任一项所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述显色剂的加入时机为：步骤2中所述建立LAMP反应体系之后、LAMP扩增之前，在PCR管内盖上加入1μL显色剂。

9.如权利要求5至8任一项所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增的反应条件为：60℃～65℃保温30～90min。

10.一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合。