CN109022596A

CN109022596A - 用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用

Info

Publication number: CN109022596A
Application number: CN201811059163.1A
Authority: CN
Inventors: 成飞雪; 刘勇; 张德咏; 何清聪; 王剑; 王东伟; 宋志强
Original assignee: Institute Of Plant Prot Hunan Province; Institute Of Plant Protection Hunan Province
Current assignee: Institute Of Plant Prot Hunan Province; Institute Of Plant Protection Hunan Province
Priority date: 2018-09-12
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明公开了一种用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。其中，引物组合物包括正向外引物Mg‑F3，反向外引物Mg‑B3，正向内引物Mg‑FIP‑Biotin，反向内引物Mg‑BIP和特异性探针Mg‑HP‑FITC。试剂盒包括上述引物组合物、dNTPs、DNA聚合酶、反应缓冲液、检测缓冲液和横向流动试纸条。试剂盒可应用于水稻根以及水稻田土壤中拟禾本科根结线虫的快速诊断和鉴别，具有检测灵敏度高、特异性好、操作简便快捷、结果可视化等优点，可应用于实际生产中的现场检测以及基层农技人员使用操作，对水稻根结线虫病的早期预警和防控具有极其重要意义。

Description

用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，尤其涉及一种用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。

背景技术

植物寄生线虫是水稻生产上的重要病原物，其中危害最为严重的是拟禾本科根结线虫（Meloidogynegraminicola）。该线虫是水稻上重要的内寄生线虫，广泛分布于南亚、东南亚、非洲、美洲和欧洲等国家的水稻产区，引起水稻根结线虫病（Rice Root-KnotDisease），通常造成水稻减产11%至80%（Mantelin et al.，2017），甚至达100%，严重影响水稻的稳定生产。近年来，随着国内耕作模式的改变，特别是直播水稻田面积的逐年增加，由拟禾本科根结线虫引起的水稻根结线虫病发生危害也越来越严重。2016年至2018年，我国湖南、湖北、江西、江苏、海南、广西等多地水稻根结线虫病发生严重，引起水稻大面积减产。拟禾本科根结线虫寄主范围广，危害隐蔽，防治极其困难。目前常用的低毒杀线虫剂大多用于旱地作物其他种类线虫的防治，而直接用于水田根结线虫病害防控的安全有效、低成本的防治措施非常有限，特别是作物定植之后再进行水稻根结线虫病害防治尤其困难。所以，开展水稻根及其水田土壤样品中拟禾本科根结线虫病原快速、准确的检测鉴定，对水稻根结线虫病的早期预警和实施有效的防控具有极其重要的意义。

目前，拟禾本科根结线虫病原鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和以PCR为基础的分子生物学鉴定。虽然PCR方法在一定程度上克服了传统形态学鉴定上的缺陷，但需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统等较昂贵的仪器设备、较高的检测费用和较复杂的操作步骤。另外，这两种方法，都需要将线虫从待检测的土壤样品中进行分离和在显微镜下进行初步的形态学观察及挑取线虫等过程，既费时费力，又需要操作人员具备专业的技能和丰富的经验，不能满足快速检测的需要，不利于现场快速检测以及基层普及应用。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等开发的一种新型恒温核酸扩增方法，针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温60～65℃条件下保温30～90 min，即可实现核酸的大量扩增。扩增产物检测可通过肉眼观察反应过程中产生的焦磷酸镁白色浑浊沉淀或是通过向其扩增产物中加入荧光染料等，利用颜色变化来直接判定结果。由于LAMP不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或简单的恒温器中即可完成，具有简单、快速、特异性强、灵敏度高、产物易检测、成本低等优点，已广泛应用于病毒、细菌、真菌、寄生虫等方面的检测。但目前还没有通过直接提取土壤中拟禾本科根结线虫的DNA而快速检测水稻田拟禾本科根结线虫的LAMP方法。

虽然LAMP技术在检测动植物病原物上表现出了极大的优势而被多个领域应用，但是该技术在结果呈现方面仍然表现出一定不足和缺陷。其主要是利用焦磷酸镁白色浑浊沉淀或是荧光染料显色时有可能会因显色不明显而造成肉眼观察不便捷或误判等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。试剂盒用于拟禾本科根结线虫的LAMP-LFD检测，特异性强，灵敏度高，可应用于检测拟禾本科根结线虫，总DNA提取简便快速，直接提取土壤DNA进行快速检测，设备简单，耗时短。

为解决上述技术问题，提供了一种用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，包括正向外引物Mg-F3，反向外引物Mg-B3，正向内引物Mg-FIP-Biotin，反向内引物Mg-BIP和特异性探针Mg-HP-FITC；所述正向外引物Mg-F3的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列，所述反向外引物Mg-B3的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的DNA序列，所述正向内引物Mg-FIP-Biotin的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的DNA序列，所述反向内引物Mg-BIP的DNA序列为SEQID NO.5所示的DNA序列，所述探针Mg-HP-FITC的DNA序列为SEQ ID NO.6所示的DNA序列。

作为一个总的技术构思，本发明提供了一种试剂盒，包括上述的引物组合物、dNTPs、DNA聚合酶、反应缓冲液。

上述的试剂盒，优选的，所述引物组合物中，所述引物组合物中，所正向述外引物Mg-F3和所述反向外引物Mg-B3的浓度均为0.2 μM，所述正向内引物Mg-FIP-Biotin和所述反向内引物Mg-BIP的浓度均为1.6 μM；所述特异性探针Mg-HP-FITC浓度为20 pM。

上述的试剂盒，优选的，所述dNTPs的浓度为1.2 mM。

上述的试剂盒，优选的，所述DNA聚合酶的浓度为8 U。

上述的试剂盒，优选的，所述反应缓冲液包括20 mM Tris-HCl、10 mM KCl、10 mM（NH₄）SO₄、6 mM MgSO₄和0.1 wt % Triton X-100。

上述的试剂盒，优选的，还包括横向流动试纸条和检测缓冲液。

上述的试剂盒，优选的，所述检测缓冲液包括137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.0 mMNa₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄和0.1 wt % Tween 20，pH7.4。

作为一个总的技术构思，本发明提供了一种上述试剂盒在检测水稻根或根围土壤中拟禾本科根结线虫中的应用。

上述的应用，优选的，所述应用方法为：

（1）提取待检土壤或水稻根样品的DNA；

（2）以提取的土壤或水稻根DNA为模板，利用所述试剂盒进行LAMP扩增得到扩增产物；

（3）检测所述扩增产物，判断所检样品中是否含有拟禾本科根结线虫。

上述的应用，优选的，所述LAMP扩增条件具体为：在60～65℃温育30～90 min，然后80～85℃保温5 min终止反应。

上述的应用，优选的，所述（3）步骤中检测方法为：将LAMP扩增产物加入20 pM的探针Mg-HP-FITC进行杂交，63℃温育5 min得到杂交液，将所述杂交液与所述检测缓冲液混匀得到混合液，将横向流动试纸条垂直浸入所述混合液中进行显色反应，试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，表明检测样品中含有拟禾本科根结线虫；试纸条只有出现有质控线，则检测结果为阴性，表明检测样品中不含有拟禾本科根结线虫；若只检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。进一步的，所述杂交液与所述检测缓冲液的体积比为1:9。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明提供了一种用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，该引物组合物是根据拟禾本科根结线虫SCAR序列测定结果中6个不同区域设计筛选出4条引物及探针，比常规仅用两条引物的PCR方法特异性强、灵敏度高。在0.5 g土壤中对拟禾本科根结线虫的检测灵敏度可达到0.01条J2幼虫，比常规PCR的检测灵敏度高10倍。

（2）本发明提供了一种用于检测拟禾本科根结线虫的试剂盒。将LAMP技术与LFD技术进行结合形成的LAMP-LFD检测试剂盒，特异性强、灵敏度高，快速方便、成本低，设备简单以及产物易检等优势。横向流动试纸条技术（Lateral flow dipstick，LFD）为生物素标记的扩增产物与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的特异探针杂交，将杂交后的复合物滴加到试纸条上或是将试纸条垂直放入混有复合物的检测缓冲液中，复合物通过层析膜扩散，当复合物扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被试纸条上的生物素配体所捕获，从而形成能用肉眼观察到的具有颜色的检测线。而不被捕获的复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的指控线。该技术结合了严格的碱基互补配对原则、抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高灵敏性，并融合了免疫层析技术和分子生物学手段。其检测DNA的量只要5 pg就能被检测到，整个检测过程5～15 min就能完成。采用LAMP-LFD检测技术，可避免LAMP检测过程中由于显色问题而产生的误判，使检测结果明显直观，通过肉眼即可辨认，实现扩增产物现场检测的可视化。

（3）本发明提供了一种试剂盒在检测拟禾本科根结线虫中的应用，总DNA提取简便快速，不需要对待检测的土壤样品进行线虫分离和在显微镜下进行形态鉴定及挑虫等过程，直接提取土壤DNA进行快速检测，从提取土壤总DNA到获得检测结果仅需要2 h左右，时间短。

（4）本发明提供了一种试剂盒在检测拟禾本科根结线虫中的应用，设备简单，易于操作，有利于现场快速检测和基层应用。检测不需要昂贵的显微镜、PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需一个简单的恒温加热器或水浴锅即可完成检测。同时，操作简便，结果清晰明显，易于观察，通过试纸条上的检测线和质控线，肉眼观察即可判定结果，整个操作过程不需要强的专业知识技能，一般技术人员即可完成。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为拟禾本科根结线虫SCAR序列的LAMP引物设计示意图。

图2为本发明实施例3中LAMP-LFD检测结果图。

图3为本发明实施例4中LAMP-LFD检测结果图。

图4为本发明实施例5中LAMP-LFD检测结果图。

图5为本发明实施例5中采用PCR方法的电泳检测结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1：

一种本发明的用于检测水稻根或根围土壤中拟禾本科根结线虫DNA的引物组合物，该引物组合物包括：

正向外引物Mg-F3：5’- AAGATGAGGATGAGGAGGA -3’（SEQ ID No. 2）；

反向外引物Mg-B3：5’- GAATAAGGATCTGGAACTTGTT -3’（SEQ ID No. 3）；

正向内引物Mg-FIP-Biotin：

5’- CCTTGATCTCCG TGAACAGC-GGGTTATGATGGTGGAGGT -3’（SEQ ID No. 4）；

反向内引物Mg-BIP：

5’- GGCATCTTCACATCATCATTCCT-GTTTTCTTTTTACTTTTGCGTCC -3’（SEQ ID No. 5）；

探针Mg-HP-FITC：5’- GCCATAAAAAGAAGGGACGC -3’（SEQ ID No. 6）。

本发明的引物组合物是根据拟禾本科根结线虫SCAR区域序列的测序结果，利用在线引物设计软件Primer Explorer V4设计并通过试验筛选得到，具体的步骤如下：

（1）拟禾本科根结线虫DNA的提取：

挑取单条线虫放入含有8 μL ddH₂O和1 μL 10×PCR Buffer（Mg²⁺ free）的200 μL PCR管中，放入液氮中冷冻1 min后，置于95℃下热激2 min。重复冷冻、热激步骤5次。然后向PCR管中加入1 μL浓度为1 mg/mL蛋白酶K，在65℃温育15 min，95℃反应10 min，获得DNA提取液。前述DNA提取液可直接用于LAMP和PCR反应。

（2）拟禾本科根结线虫SCAR序列扩增：利用已报道拟禾本科根结线虫PCR方法，进行PCR扩增并进行序列测定，得到拟禾本科根结线虫SCAR序列。具体包括以下步骤：

2.1 PCR扩增引物为SCAR-MgFW（5’- GGGGAAGACATTTAATTGATGATCAAC-3’）和SCAR-MgRev（5’-GGTACCGAAACTTAGGGAAAG-3’）。

2.2 以（1）步骤中的DNA提取液为模板，以2.1步骤中的引物，扩增前述DNA提取液中拟禾本科根结线虫SCAR区片段，得到PCR扩增产物。

PCR扩增反应体系（25 μL）：

10×EasyTaq Buffer（含Mg²⁺）： 2.5 μL；

2.5 mM dNTPs ： 2.0 μL；

SCAR-MgFW（10 μM）： 1.0 μL；

SCAR-MgRev（10 μM）： 1.0 μL；

5 U/μL EasyTaq DNA Polymerase： 0.5 μL；

模板DNA （即DNA提取液）： 5.0 μL；

补足ddH₂O至25 μL。

PCR扩增条件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

（3）测序：将步骤（2）中得到的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后，回收、克隆并测序。序列测定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

序列测定结果参见SEQ ID NO. 1，具体为：

GGGGAAGACA TTTAATTGAT GATCAACAAG TTGATTCAAT GCAAGATGAG GATGAGGAGGAAGAGGGTTA TGATGGTGGA GGTTATTTAG AAGGAATGGG AGAAGCTGTT CACGGAGATC AAGGTATTTATATATATTTT TAATTAAATA TTCTTTTCTT AAGGTGATGA CTTTTCGGCA TCTTCACATC ATCATTCCTCCAGAAAAGGC CATAAAAAGA AGGGACGCAA AAGTAAAAAG AAAACTACGG CAATAGGACG TGAACAAGTTCCAGATCCTT ATTCAAATAG CAGTGCTGAT TTATGCCAAA TGCTTGACCT AAATGATGTC CAATTTGAATATACAGAGGA GGATTTTGAG AATATTTCAT CTGGAAAGGT TTATTTGTAA TTGGAAATAT AAATTTATTTTGATGCTTTC TAGTCCTTTA ATGCACGTTT TCGTCAAACA TTTCAAGATA TGAATCCAAC AGCAAGTTGGGCACGTGTTC ATGCAGTGAT GGTAGCAAAA TACAATGAAT ACCAGGTATT TAATTGCACA ACATTTGGGAACAAAAGGCT AGGAAAAGGT GGGAATTCGG GATTTTTGCG ACATGTTTTG ACTTAATGTT TCGAAAGTCTTTCCCTAAGT TTCGGTACC。

（4）LAMP引物设计：根据测序结果，利用在线引物设计软件Primer Explorer V4设计并通过试验筛选得到下述LAMP引物。图1为拟禾本科线虫SCAR序列的LAMP引物设计示意图。

设计筛选获得的引物序列如下：

正向外引物Mg-F3：5’- AAGATGAGGATGAGGAGGA -3’；

反向外引物Mg-B3：5’- GAATAAGGATCTGGAACTTGTT -3’；

正向内引物Mg-FIP-Biotin：

5’- CCTTGATCTCCGTGAACAGC-GGGTTATGATGGTGGAGGT -3’；

反向内引物Mg-BIP：

5’- GGCATCTTCACATCATCATTCCT-GTTTTCTTTTTACTTTTGCGTCC -3’；

探针Mg-HP-FITC：5’- GCCATAAAAAGAAGGGACGC -3’。

实施例2：

一种本发明的用于检测拟禾本科根结线虫的LAMP-LFD检测试剂盒，包括LAMP反应体系和LFD检测体系。

（1）LAMP反应体系的总体积为10～25 μL，包括以下成分：引物混合液、反应混合液和灭菌双蒸水体积共为9～24 μL，DNA 1 μL。

其中，引物混合液的成分为：0.2 μM 正向外引物Mg-F3、0.2 μM 反向外引物Mg-B3、1.6 μM 正向内引物Mg-FIP-Biotin、1.6 μM 反向内引物Mg-BIP。

反应混合液的成分为：1.2 mM dNTPs、20 mM Tris-HCl（pH 8.8）、10 mM KCl、10mM（NH₄）SO₄、6 mM MgSO₄、0.1 wt % Triton X-100、8 U BstDNA聚合酶。

（2）LFD检测体系：包括20 pM 特异性探针Mg-HP-FITC、横向流动试纸条和检测缓冲液。

其中，检测缓冲液的成分为：137 mM NaCl、2.7mM KCl、4.0 mM Na₂HPO₄、1.8 mMKH₂PO₄、0.1 wt % Tween 20，pH7.4。

实施例3：

一种本发明实施例2的LAMP-LFD检测试剂盒在检测土壤中拟禾本科根结线虫中的应用，其具体的应用方法包括以下步骤：

（1）提取土壤DNA：取历年水稻根结线虫病发生田块水稻根围土壤，使用MPBiomedicals公司的Fast DNA^® Spin Kit for Soil试剂盒提取土壤DNA（具体操作方法参见试剂盒说明书）。

（2）制备LAMP反应体系：取1 μL步骤（1）中的土壤DNA，加入到实施例2的LAMP检测试剂盒配制的体系，LAMP检测试剂盒配制的体系（10～25 μL）：0.2 μM Mg-F3、0.2 μM Mg-B3、1.6 μM Mg-FIP-Biotin、1.6 μM Mg-BIP、1.2 mM dNTPs、20 mM Tris-HCl（pH 8.8）、10mM KCl、10 mM（NH₄）SO₄、6 mM MgSO₄、0.1 wt % Triton X-100和8 U BstDNA聚合酶）中，混匀得到LAMP反应体系。

（3）LAMP反应：将步骤（2）中得到的LAMP反应体系置于63℃恒温水浴中等温扩增60min，然后在82℃下保温5 min终止反应，得到扩增产物。

（4）LFD检测：LAMP反应结束后加入特异性探针Mg-HP-FITC，使终浓度为20 pM，63℃恒温水浴中杂交5 min。杂交反应结束后室温冷确，取10 μL杂交反应液加入90 μL检测缓冲液并混匀，将横向流动试纸条侵入混合液中，反应5 min后观察检测结果。

（5）结果判断：试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，表明检测样品中含有拟禾本科根结线虫。试纸条只有出现有质控线，则检测结果为阴性，表明检测样品中不含有拟禾本科根结线虫。若只检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。

检测结果参见图2，从图2中可知：从土壤中提取的DNA，经过LAMP扩增后得到的产物，经试纸条检测后，出现有质控线和检测线，证明样本中含有拟禾本科根结线虫；而空白对照显示只有质控线，证明样本中不含有拟禾本科根结线虫。

实施例4：拟禾本科根结线虫LAMP-LFD特异性检测

收集南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫、咖啡短体线虫、矮化线虫、松材线虫、柑橘半穿刺线虫、旱稻孢囊线虫、甘薯茎线虫和水稻干尖线虫，分别提取其DNA作为模板与拟禾本科根结线虫DNA模板，按照实施例3的方法进行LAMP-LFD检测，以验证拟禾本科根结线虫LAMP-LFD检测试剂盒的特异性。表1为各供试样本的植物线虫群体种类及来源。

表1：供试的全部植物线虫群体种类及来源表

图3为LAMP-LFD检测结果，其中编号1至12采用表1中的供试样本，编号13为阴性对照。从图3中可知：仅有第1个样品（拟禾本科根结线虫）显示有质控线和检测线，其余11个样本和阴性对照均只有控制线。

结果表明本发明所述的LAMP引物和LAMP-LFD检测试剂盒在检测拟禾本科根结线虫具有高度的特异性。

实施例5： LAMP-LFD方法在检测拟禾本科根结线虫的灵敏度试验

取0.5 g土壤，该土壤中含有100条拟禾本科根结线虫J2幼虫。按照实施例3的方法获得土壤总DNA，按10倍梯度稀释成9个浓度，则每0.5 g土壤中分别含有100～1.0×10^-6条J2幼虫。取各浓度的DNA 1 μL做为LAMP反应模板，按照实施例3的操作步骤进行LAMP扩增反应得到LAMP扩增产物。

同时以上述梯度稀释的土壤总DNA为模板，以Mg-F3和Mg-B3为引物，进行常规PCR检测，体系如下：10×EasyTaq Buffer（含Mg²⁺）：3 μL；2.5 mM dNTPs：2 μL；引物Mg-F3和Mg-B3（10 μmol/L）各1 μL；5 U/μL EasyTaq DNA Polymerase ：0.5 μL；模板DNA：1 μL；补足ddH₂O至25 μL。PCR扩增条件为94℃预变性4 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。得到PCR扩增产物。

分别将LAMP扩增产物按照实施例3的方法进行LFD检测。

LFD检测结果参见图4，其中1～10分别为：100、10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和阴性对照，从图4中可知：第1～5管均可以观察到质控线和检测线，其它管和阴性对照均只有质控线。表明采用LAMP-LFD方法检测拟禾本科根结线虫，其灵敏度检测能达到0.01条线虫。

分别将PCR扩增产物按照相同的方法进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果参见图5，图5中1～10分别为：100、10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和阴性对照，M表示Trans2KPlus II DNA Marker。从图5中可知：在DNA稀释至0.1条线虫时，能够观察到扩增条带，继续稀释时则观察不到扩增条带，表明常规PCR检测灵敏度为0.1条线虫。

以上结果说明：本发明所述的LAMP引物和LAMP-LFD检测方法在0.5 g土壤中能够检测到0.01条拟禾本科根结线虫。具有极高的灵敏度，比常规PCR灵敏度高10倍。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

序列表

<110> 湖南省植物保护研究所

<120> 用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 639

<212> DNA

<213> 拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)

<400> 1

ggggaagaca tttaattgat gatcaacaag ttgattcaat gcaagatgag gatgaggagg 60

aagagggtta tgatggtgga ggttatttag aaggaatggg agaagctgtt cacggagatc 120

aaggtattta tatatatttt taattaaata ttcttttctt aaggtgatga cttttcggca 180

tcttcacatc atcattcctc cagaaaaggc cataaaaaga agggacgcaa aagtaaaaag 240

aaaactacgg caataggacg tgaacaagtt ccagatcctt attcaaatag cagtgctgat 300

ttatgccaaa tgcttgacct aaatgatgtc caatttgaat atacagagga ggattttgag 360

aatatttcat ctggaaaggt ttatttgtaa ttggaaatat aaatttattt tgatgctttc 420

tagtccttta atgcacgttt tcgtcaaaca tttcaagata tgaatccaac agcaagttgg 480

gcacgtgttc atgcagtgat ggtagcaaaa tacaatgaat accaggtatt taattgcaca 540

acatttggga acaaaaggct aggaaaaggt gggaattcgg gatttttgcg acatgttttg 600

acttaatgtt tcgaaagtct ttccctaagt ttcggtacc 639

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagatgagga tgaggagga 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaataaggat ctggaacttg tt 22

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccttgatctc cgtgaacagc gggttatgat ggtggaggt 39

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcatcttca catcatcatt cctgttttct ttttactttt gcgtcc 46

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccataaaaa gaagggacgc 20

Claims

1.一种用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，其特征在于，包括正向外引物Mg-F3，反向外引物Mg-B3，正向内引物Mg-FIP-Biotin，反向内引物Mg-BIP和特异性探针Mg-HP-FITC；所述正向外引物Mg-F3的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列，所述反向外引物Mg-B3的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的DNA序列，所述正向内引物Mg-FIP-Biotin的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的DNA序列，所述反向内引物Mg-BIP的DNA序列为SEQ ID NO.5所示的DNA序列，所述探针Mg-HP-FITC的DNA序列为SEQ ID NO.6所示的DNA序列。

2.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合物、dNTPs、DNA聚合酶、反应缓冲液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组合物中，所正向述外引物Mg-F3和所述反向外引物Mg-B3的浓度均为0.2 μM，所述正向内引物Mg-FIP-Biotin和所述反向内引物Mg-BIP的浓度均为1.6 μM；所述特异性探针Mg-HP-FITC浓度为20 pM；

和/或，所述dNTPs的浓度为1.2 mM；

和/或，所述DNA聚合酶的浓度为8 U。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括20 mM Tris-HCl、10 mM KCl、10 mM（NH₄）SO₄、6 mM MgSO₄和0.1wt % Triton X-100。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测缓冲液和横向流动试纸条。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测缓冲液包括137 mM NaCl、2.7mM KCl、4.0 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄和0.1wt % Tween 20，pH 7.4。

7.一种权利要求2至6中任一项所述试剂盒在检测水稻根或根围土壤中拟禾本科根结线虫中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用方法为：

（1）提取待检土壤或水稻根样品的DNA；

（2）以提取的土壤或水稻根DNA为模板，利用所述的试剂盒进行LAMP扩增得到扩增产物；

（3）检测所述扩增产物中是否含有拟禾本科根结线虫。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述LAMP扩增反应条件具体为：在60～65℃温育30～90 min，然后82℃保温5 min终止反应。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述（3）步骤中检测方法为：将LAMP扩增产物加入终浓度为20 pM的探针Mg-HP-FITC进行杂交，63℃温育5 min得到杂交液，将所述杂交液与所述检测缓冲液以1:9的体积比混匀得到混合液，将横向流动试纸条垂直浸入所述混合液中进行显色反应，试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，表明检测样品中含有拟禾本科根结线虫；试纸条只有质控线出现条带，则检测结果为阴性，表明检测样品中不含有拟禾本科根结线虫；若只有检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。