TW201920684A - 甘藍（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）植物之異型檢出法 - Google Patents

甘藍（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）植物之異型檢出法 Download PDF

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Abstract

本發明的課題為提供一種將有時發生在甘藍(Brassica oleracea)品種之異型(染色體非整倍體)，於種子之品質管理或育種研究的過程，在具有一般之分子生物學手法之實驗室等，可簡便正確且迅速檢定之方法。本發明的解決手段為本發明係關於一種方法，其係甘藍植物之非整倍體的檢出方法，包含將從源自被檢驗之甘藍植物的樣品所萃取之DNA作為模板(Template)，於甘藍植物之2以上的染色體每一個使用特異性DNA標記(marker)，從進行即時PCR所得之DNA標記間之增殖量的相對差檢出染色體之非整倍性而成。

Description

甘藍(Brassica oleracea)植物之異型檢出法
本發明係關於甘藍(Brassica oleracea)作物之異型(染色體非整倍體(aneuploid))的檢出方法。詳細而言，本發明係關於在甘藍(以下，有時簡稱為「B.oleracea」)作物，對於將非整倍體作為原因顯示各式各樣異常形態的個體，將此等即使在任何生長階段，亦可藉由分子生物學的手法正確且迅速進行分類而檢出的方法。
十字花科植物係起源於中近東或地中海沿岸之植物種，蕓苔(Brassica)屬植物中包含農業上極為重要之作物。其中，甘藍種係包含B.oleracea var.capitata(甘藍)、B.oleracea var.italica(青花菜)、B.oleracea var.botrytis(花椰菜)、B.oleracea var.gemmifera(球芽甘藍)、B.oleracea var.gongyloides(苤藍)、B.oleracea var.acephara(葉牡丹、羽衣甘藍)及B.oleracea var.albograbra(芥藍)等極為重要之植物種。
一般而言，在甘藍作物，已育種有利用自交不親和性(self incompatibility,SI)或細胞質雄性不稔性 (cytoplasmic male sterility,CMS)之性質的雜種第一代交配(F1)植物。F1品種與原生品種或固定種相比，由於顯示適應環境之優異能力或品種內之高均一性，商業性利用價值高被多數國家利用。
另一方面，已報告有儘管是繼承雙親基因之F1品種，顯示與通常不同之形態的個體亦以一定的頻度出現(文獻V.Ruffio-Chable et al.,(2000)(非專利文獻1))。這樣的異型個體通常作為農產品的價值極為低，通常不能作為青果物之出貨對象。又，顯示這樣的異型之個體於商品種子當中大量發生時，由於可能會在商業上發展成為一個大問題，種苗公司有時亦有必要進行丟棄該批(lot)等之對應。
針對這樣的異型發生原因，長時間並未被解明，只能作出是否採種時或在青果栽培的環境受到影響，或受到突變、表觀遺傳突變等影響之各種猜測。
又，前述之異型問題即使在對農家販賣種子之種苗公司的品質管理現場，亦為極為麻煩的問題。生產暨販賣F1種子之種苗公司，將商品種子的純度檢定作為目的，實施利用DNA標記或同功酶(Isozyme)之檢定。然而，此等之異型個體由於展示F1型作為基因型，通常無法檢出。因此，在檢査現場，期待有長時間檢定手法的開發。
進而，即使在育種研究，亦需要以這樣的異型個體不會多產生的方式來改良品種特性。然而，這樣的異型於幼苗期從外觀係難以判斷。因此，為了正確計數異 型之發生率，需要在苗圃大規模展開，有熟練之育種者仔細調查各體的特性。惟，這樣的出芽(grow-out)檢定有一方面取決於主觀，會有因判定人而導致使結果變動之懸念。進而，依植物之生長階段或栽培環境的不同，假設即使為熟練之育種者，亦難以正確判斷，從這樣的背景來看，在種苗公司長時間期望於幼苗之簡易檢定法的開發。
例如，於文獻V.Chable et al.,(2009)(非專利文獻2)，描述有在花椰菜F1品種所出現之異常形態有起因於非整倍體的可能性。作為檢出這樣的非整倍體之一般的方法，報告有幾個使用流式細胞儀之實驗例。
然而，使用流式細胞儀之手法，正確檢出染色體1條之差並不容易，即使放置內部對照，如文獻N.Roux et al.,(2003)(非專利文獻3)所示之數據般，可引起判斷變困難的情況。又，染色體的大小有差異，最大染色體與最小染色體之基因體(Genome)量比有時達到接近2倍。附加比較小之染色體時，由於表示正常個體與非整倍體之峰值的差極為小，難以判斷，檢出感度對結果之信賴性所給予的影響較大。
因此，使用流式細胞儀之手法，有無法於通常之實驗室實施大規模檢定等之問題。
又，在使用流式細胞儀之手法，假設即使組合信賴度高之實驗系，於複數個染色體產生非整倍性之植物時，例如組合第1染色體三倍體(Trisomy)與第2染色體單倍體(Monosomy)之非整倍體時，結果上，由於18條染色體 包含核，導致有判定成正常個體等之問題。
進而，於使用流式細胞儀之簡易檢定，鑑定哪個染色體產生非整倍性有困難。藉由成為三倍體之染色體，如青花菜之第2、第7染色體三倍體，或花椰菜之第1、第2、第7染色體三倍體般，亦有雖成熟期加減偏移，但可沒問題收穫青果物之型，亦有雖為非整倍體，但與立即減低商品價值無關的情況。因此，於現場，可個別判別三倍體之型變重要。又，從推進育種的觀點來看，由於哪個染色體容易進行三倍體化亦成為重要之訊息，故期望簡便且可解析每條染色體詳細之非整倍性的檢定手法之開發。
在植物，目前為止報告有使用利用PCR之DNA標記的基因型之判別方法。例如日本專利第3836451號(專利文獻1)中揭示有參與辣椒屬植物之辛味成分的生產之基因型的判定法。然而，對十字花科植物之異型的檢定法之適用，據本發明者等所知，目前為止並未有報告。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第3836451號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]V. Ruffio-Chable et al., ISHS Acta Horticulturae 539(2000)p89, Developmentally “Aberrant” plants in F1 hybrids of Brassica oleracea.
[非專利文獻2]V. Chable et al., Euphytica 170(2009) p275, “Aberrant” plants in cauliflower: 2. Aneuploidy and global DNA methylation.
[非專利文獻3]N. Roux et al., Plant Cell Report 21(2003) p483, Rapid detection of aneuploidy in Musa using flow cytometry.
[非專利文獻4]I. Parkin et al., Genetics 171(2005) p765, Segmental structure of the Brassica napus genome based on comparative analysis with Arabidopsis thaliana.
[非專利文獻5]X. Cheng et al., Theoretical Applied Genetics 118(2009) p1121, Development and genetic mapping of microsatellite markers from genome survey sequences in Brassica napus
本發明之目的為提供一種方法，其係將如上述般之以往的問題點，即有時發生在甘藍品種之異型(染色體非整倍體)，於種子之品質管理或育種研究的過程，可簡便正確且迅速檢定之方法。又，這樣的方法，係在具有一般之分子生物學手法之實驗室等，可簡易實施者。
本發明者們現在，為了因應來自種子之品質管理及育種研究雙方之高度要求經努力研究的結果，在甘藍種，成功藉由使用即時PCR，正確且迅速檢定全染色體之非整倍體。根據此方法，若為具有即時PCR之研究室，即可輕易實施，可簡易檢出異型。又，此方法對於將非整倍體作為原因顯示各式各樣異常形態的個體，將此等即使在任何生育階段，亦可藉由分子生物學的手法正確且迅速進行分類而檢出。
亦即，根據本發明，提供以下之發明。
<1>一種方法，其係甘藍植物之非整倍體的檢出方法，包含將從源自被檢驗之甘藍植物的樣品所萃取之DNA作為模板，於甘藍植物之2以上的染色體的每一個使用特異性DNA標記，從進行即時PCR所得之DNA標記間之增殖量的相對差檢出染色體之非整倍性而成。
<2>如前述<1>之方法，其係包含於從甘藍植物之第1染色體至第9染色體之全染色體的每一個使用特異性DNA標記來作為前述DNA標記，判定被檢驗之植物對於全染色體內之哪一個染色體為非整倍體。
<3>如前述<1>或<2>之方法，其中，作為前述DNA標記，其係使用僅對甘藍植物之任一種染色體DNA有特異性，存在該染色體DNA時，可生成藉由PCR反應之增殖產物的引子(Primer)。
<4>如前述<1>~<3>中任一項之方法，其中，作為前述DNA標記，其係使用： (i)僅對甘藍植物之任一種染色體DNA有特異性，存在該染色體DNA時，可生成藉由PCR反應之增殖產物的引子與(ii)使用對與前述(i)之任一種染色體DNA相同之染色體DNA有特異性，可檢出基於前述(i)之引子藉由PCR反應之增殖產物的探針。
<5>如前述<3>或<4>之方法，其係使用與藉由PCR反應合成之雙鏈DNA鍵結而發出螢光之嵌入劑，或使用以藉由PCR伸長反應發出螢光的方式由螢光色素所修飾之探針。
<6>如前述<1>~<5>中任一項之方法，其中，作為檢出染色體之非整倍體的指標，係使用由即時PCR所得之螢光訊號的增加。
<7>如前述<1>~<6>中任一項之方法，其中，作為前述DNA標記，係使用1種以上具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子。
<8>如前述<1>~<7>中任一項之方法，其中，作為前述DNA標記，係使用具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子之1種以上、與具有序列編號19~27所示之鹼基序列的探針之1種以上。
<9>一種甘藍植物之非整倍體檢出用引子套組，其係至少包含1種以上具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子。
<10>一種甘藍植物之非整倍體檢出用之引 子及探針的套組，其係包含：具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子之至少1種以上、與具有序列編號19~27所示之鹼基序列之藉由螢光色素所修飾之探針的至少1種以上。
<11>一種甘藍作物之育種方法，其係包含：藉由使用如前述<1>~<8>中任一項之非整倍體之檢出方法，對甘藍植物之每一系統，評估其各染色體之非整倍體發生頻度，來選拔非整倍體發生率較少之系統的步驟。
<12>一種甘藍種子之品質管理方法，其係包含：使用如前述<1>~<8>中任一項之非整倍體之檢出方法，來檢定甘藍植物之種子所包含之非整倍體的混入率。
<13>一種甘藍植物之品質管理方法，其係包含：使用如前述<1>~<8>中任一項之非整倍體之檢出方法，來檢定甘藍植物所包含之非整倍體的混入率。
根據本發明之檢定方法，可簡便且正確特定異型發生率及各異型之將來的形態，可檢定商品種子的純度檢定及各育種系統之異型發生頻度。其結果，變成可有效率地且迅速、早期提供一種品質良好之種子的安定供給及育成性質良好之系統之手段。
[圖1]表示從青花菜的品種所發生之非整倍體(aneuploid)的表現型。圖中，分別為(A)表示正常的個體(Normal)，(B)表示第1染色體三倍體(Trisomy)(+C1)，(C)表示第2染色體三倍體(+C2)，(D)表示第3染色體三倍體(+C3)，(E)表示第4染色體三倍體(+C4)，(F)表示第5染色體三倍體(+C5)，(G)表示第6染色體三倍體(+C6)，(H)表示第7染色體三倍體(+C7)，(I)表示第8染色體三倍體(+C8)及(J)表示第9染色體三倍體(+C9)。
[圖2]表示進行藉由即時PCR之定量解析時之增幅曲線的圖像圖。圖係將第6染色三倍體的情況作為例子。若加在PCR之反應液的模板之DNA量為一定，例如為第6染色體三倍體(Trisomy)時，瞭解到座落在第6染色體之標記的增殖曲線較正常個體(Normal)更早提昇。
[圖3]表示非整倍體之檢出例。亦即，根據藉由實施即時PCR所得之染色體標記的增幅，表示相對定量之計算結果的一例。如圖，將青花菜F1品種96個體作為材料，進行藉由第4染色體標記及第6染色體標記之multiplex PCR，來實施試驗時，將第4染色體上之標記作為基準，相對定量第6染色體上之標記的結果，可鑑定第6染色體三倍體及第4染色體三倍體。
[圖4]表示於三倍體植物之花粉母細胞所觀察之染色 體的顯微鏡照片。如圖，以顯微鏡觀察花粉母細胞減數分裂第一分裂中期之細胞的結果，相對於正常型(Normal)之染色體(2n=18)觀察到為9條之二價染色體，三倍體植物之染色體(2n+1)觀察到9條之二價染色體加上1條之染色體(箭頭)。
[圖5]表示從花椰菜的品種所發生之非整倍體的表現型。圖中，分別為(A)表示正常的個體(Normal)，(B)表示第1染色體三倍體(+C1)，(C)表示第2染色體三倍體(+C2)，(D)表示第4染色體三倍體(+C4)，(E)表示第6染色體三倍體(+C6)，(F)表示第7染色體三倍體(+C7)及(G)表示第9染色體三倍體(+C9)。
[圖6]表示從甘藍的品種所發生之異型。圖中，分別為(A)表示正常的個體(Normal)，(B)表示第1染色體三倍體(+C1)，(C)表示第2染色體三倍體(+C2)，(D)表示第4染色體三倍體(+C4)，(E)表示第5染色體三倍體(+C5)，(F)表示第6染色體三倍體(+C6)，(G)表示第7染色體三倍體(+C7)，(H)表示第8染色體三倍體(+C8)及(I)表示第9染色體三倍體(+C9)。又，(J)表示於第1染色體及第2染色體產生非整倍性的個體(+C1,+C2)，(K)表示於第1染色體及第8染色體產生非整倍性的個體(+C1,+C8)及(L)表示於第5染色體及第8染色體產生非整倍性的個體(+C5,+C8)。
[圖7]表示從青花菜、花椰菜及甘藍的各品種所發生之非整倍體的表現型之特徵。惟，此等之特徵係關於針對於此所採用之各品種在這次之實施例的試驗所觀察之表現 型的特徵之一部分，針對植物種或非整倍體的每一個，並非一定一般化不能被表徵者。
以下，針對本發明進行詳細說明。
本發明如前述，係關於一種方法，其係甘藍植物之非整倍體的檢出方法，包含將從源自被檢驗之甘藍植物的樣品所萃取之DNA作為模板，於甘藍植物之2以上的染色體每一個使用特異性DNA標記(marker)，從進行即時PCR所得之DNA標記間之增殖量的相對差檢出染色體之非整倍性而成。根據本發明較佳之態樣，使用檢出方法所使用之染色體數為3以上，按更佳之順序，為4以上、5以上、6以上、7以上、8以上，最佳為針對9個全染色體的標記。
因此，較佳為本發明之方法係包含於從甘藍植物之第1染色體至第9染色體之全染色體每一個使用特異性DNA標記來作為前述DNA標記，判定被檢驗之植物對於全染色體內之哪一個染色體為非整倍體。
在本發明，所謂甘藍(Brassica oleracea)植物，係意指蕓苔屬植物之甘藍種的植物，於此，包含有B.oleracea var.capitata(甘藍)、B.oleracea var.italica(青花菜)、B.oleracea var.botrytis(花椰菜)、B.oleracea var.gemmifera(球芽甘藍)、B.oleracea var.gongyloides(苤藍)、B.oleracea var.acephara(葉牡丹、羽衣甘藍)及B. oleracea var.albograbra(芥藍)等。較佳為在本發明，Brassica oleracea植物為青花菜、花椰菜、甘藍。
於此所謂「非整倍體」或「異型」，係意指在甘藍植物之任一個染色體數有異常者，亦即染色體數的異常(aneuploidy)。由於甘藍植物之染色體為2n=18，為正常植物時，於1細胞中各存在2條9種染色體。另一方面，非整倍體亦即非整倍性植物，例如為第1染色體三倍體(trisomy)時，變成第1染色體已增加為3條，第1染色體有異常。因非整倍體的個體，因植物種或生育狀況等，雖亦有作為農產物或青果物可容許的情況，但通常異型個體，作為農產物之價值極為低的情況較多，無法作為青果物之出貨對象較多。因此，可迅速且簡便實施非整倍體的檢出之方法變重要。
在本發明之檢出方法，首先，準備欲判斷是否為非整倍體之被檢驗之甘藍植物，從源自此被檢驗之甘藍植物的樣品萃取DNA，將此作為在PCR之模板使用。
於此，DNA之萃取方法作為核酸萃取法，若為對本發明領域具有通常知識者所周知之方法，無論哪種方法都可以使用。於本發明，雖可將經萃取之crude的DNA直接作為PCR的模板使用，但例如可使用酚/氯仿法、藉由界面活性劑之細胞溶解或藉由蛋白酶之細胞溶解、藉由玻璃珠之物理性破壞方法、重複處理凍結熔融之方法及此等之組合，來進行DNA之萃取。又，可使用由試藥廠商所販賣之各種DNA萃取套件，例如使用QIAGEN Plant mini Kit(QIAGEN GmbH公司製)等。藉由此等之方法所萃取之DNA，較佳為以適合作為PCR的模板使用的狀態保持，例如較佳為溶解在適當之緩衝液並於低溫下保管。所得之DNA的純度可藉由使用分光光度計，測定230、260及280nm的吸光度來檢定。除了進行PCR之外，較佳為260/230nm的吸光度比為2.0以上，260/280nm的吸光度比為1.8~2.0。又，針對所得之DNA溶液，可確認使用對於植物所共通持有之內在性基因的引子對(Primer pair)，來進行PCR，而引起增殖。
在本發明之檢出方法，將從源自被檢驗之甘藍植物的樣品所萃取之DNA作為模板，使用可增殖甘藍植物之各染色體的一部分之DNA標記，來實施即時PCR。詳細而言，作為DNA標記，於甘藍植物之2以上的染色體每一個使用特異性2種以上之DNA標記，來實施即時PCR。更詳細而言，作為DNA標記，從甘藍植物之第1染色體至第9染色體的全染色體當中，2以上之染色體每一個使用特異性2種以上之DNA標記，來實施即時PCR。
作為於此使用之DNA標記，係座落在甘藍植物之任一個染色體者，若為於染色體基因體內作為單一複本(single-copy)存在，不受到存在於其他染色體上之序列的影響的標記，則並未特別限制。於本發明，藉由使用這樣的標記，實施藉由即時PCR之相對定量，對於甘藍之各種作物，變成可實施非整倍體的檢定。
據此，亦即該標記係期望僅對甘藍植物之任 一種染色體DNA有特異性，存在該染色體DNA時，可生成藉由PCR反應之增殖產物的引子。於此，所謂僅對甘藍植物之任一種染色體DNA有特異性，係意指僅對9種染色體之任一種染色體有特異性，對其他染色體並無特異性，染色體DNA存在其特異性時，引子可生成藉由PCR反應之增殖產物。例如，使用之DNA標記中，可包含僅對第1染色體之DNA有特異性，其第1染色體DNA存在時，可藉由PCR反應生成增殖產物。
於此，針對使用之引子的設計，僅對甘藍植物之任一種染色體DNA有特異性，其染色體DNA存在時，以可生成藉由PCR反應之增殖產物的方式，若為本發明領域具有通常知識者，可適當作成。藉由列舉具體例，參照後述之實施例1之記載，本發明領域具有通常知識者可適當製作所期望之引子。
在本發明，雖藉由使用具有如上述之性質的引子，實施即時PCR，使得非整倍體檢定變可能，但作為一個較佳之態樣，可列舉嵌入劑法。在嵌入劑法，加在PCR反應液之嵌入劑，鍵結在藉由PCR反應所合成之雙鏈DNA，發出螢光後，引起因引子導致之伸長反應，生成增殖產物時，發出螢光。藉由檢出此，可測定於DNA標記間之增殖量的相對差。
作為嵌入劑，例如可使用SYBR Green I。
作為嵌入劑法之具體的態樣，將(i)僅對甘藍植物之任一種染色體DNA有特異性，存 在該染色體DNA時，可生成藉由PCR反應之增殖產物的引子與(ii)嵌入劑加在PCR反應液，每循環測定在PCR之伸長反應的階段所發出之螢光訊號，進行相對定量之計算。藉此，可測定於DNA標記間之增殖量的相對差。
作為在本發明之另一個較佳之態樣，可列舉根據具有如上述之性質的引子，使用可檢出藉由PCR反應所產生之增殖產物的探針之探針法。作為可使用之探針，若為可作為目的之增殖產物的檢出，雖並未特別限制，但較佳為以藉由PCR伸長反應發出螢光的方式，使用藉由螢光色素所修飾之標識探針。針對相對定量之計算法，藉由測定PCR之伸長反應時所發出之螢光，可用與嵌入劑法相同之原理進行。又，與嵌入劑法進行比較，於探針法，導致檢出非特異性PCR產物，可降低風險。
作為探針法之具體的態樣，使用(i)僅對甘藍植物之任一種染色體DNA有特異性，存在該染色體DNA時，可生成藉由PCR反應之增殖產物的引子與(ii)對與前述(i)之任一種染色體DNA相同之染色體DNA有特異性，根據前述(i)之引子，可檢出藉由PCR反應之增殖產物的探針，每循環測定在PCR之伸長反應的階段所發出之螢光訊號，進行相對定量的計算。藉此，可測定於DNA標記間之增殖量的相對差。
作為螢光標識探針，較佳為以螢光物質與消光物質二重標識之TaqMan探針。TaqMan探針通常將核酸探針之5’末端以螢光物質(報導螢光色素)修飾，將3’末端以消光物質(淬滅體螢光色素)修飾。作為報導螢光色素之例，可列舉Cy3、Cy5、6-FAM(6-羧基螢光素)、TET(6-羧基-4,7,2’,7’-四氯螢光素)、HEX(6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯螢光素)等之螢光素(fluorescein)系螢光色素。作為淬滅體螢光色素之例，雖亦有使用6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)等之羅丹明系螢光色素的情況，但實施Multiplex PCR時，較佳為選擇BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、Eclipse等之Dark quencher者。在本發明，例如可適合使用於5’末端以FAM、HEX、Cy5之3種類螢光色素標識，於3’末端以BHQ-1、BHQ-3之2種類淬滅體標識之水解探針。
據此，在本發明之檢出方法，較佳為使用鍵結在藉由PCR反應所合成之雙鏈DNA，發出螢光之嵌入劑，或使用以藉由PCR伸長反應發出螢光的方式藉由螢光色素修飾之探針。
使用藉由螢光色素修飾之探針時，可利用標籤不同種類之螢光色素的探針，混合數種類之標記來實施multiplex PCR。與前述之方法相同，雖可從各螢光探針所發出螢光訊號，針對被驗樣品各個體及各標記，測定於DNA標記間之增殖量的相對差，但此時，multiplex PCR的情況，同樣可使得將反應液中之1個標記設定在內部對照 之相對定量的計算變可能，藉由減少實驗誤差，可提昇結果的信賴性。
據此，根據本發明之進一步較佳的態樣，來實施藉由探針法之multiplex PCR。
因此，根據本發明之一個較佳的態樣，於本發明之檢出方法，作為檢出染色體之非整倍體的指標，使用藉由即時PCR所得之螢光訊號的增加。
尚，成為引子或探針之寡核苷酸，作為寡核苷酸之合成法，可藉由本發明所屬之技術範圍所周知之方法，例如藉由磷酸三乙基(Phosphotriethyl)法、磷酸二酯(Phosphodiester)法等，利用通常所使用之DNA自動合成裝置來合成。
根據本發明之更佳的態樣，作為DNA標記，可使用具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子之一種以上，更佳為可使用後述之表1所記載之引子的一種以上。又，根據本發明之另一更佳的態樣，可使用具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子之一種以上、與具有序列編號19~27所示之鹼基序列的探針之一種以上，更佳為可使用表1所記載之引子的一種以上、與表2所記載之探針的一種以上。此等標記係對應第1~第9之9種類的染色體之標記。
於此，所謂DNA標記「具有」鹼基序列，係指該標記可具有其鹼基序列。在本發明，DNA標記係如前述，由於對指定之染色體的DNA有特異性，只要具有作為 其標記之性質，DNA標記係意指可取代、缺失、附加或削除所對應之鹼基序列內的鹼基之任一個或數個(例如1、2或3個，較佳為1或2個，更佳為1個)，或可為將所對應之鹼基序列作為一部分包含且保持指定性質的序列。這樣的情況下，所謂「具有」之用語可改說是「包含」。又，針對可容許1個鹼基之取代、缺失、附加或削除的情況，可將「具有」改說成「實質上由...構成」。
根據本發明之另一更佳的態樣，作為DNA標記，可使用具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子對之一種以上，更佳為可使用後述之表1所記載之引子對的一種以上。又，根據本發明之另一更佳的態樣，可具有使用序列編號1~18所示之鹼基序列的引子對之一種以上、與具有對應其之序列編號19~27所示之鹼基序列的探針，更佳為可使用表1所記載之引子對的一種以上、與表2所記載之探針的一種以上。
根據本發明之進一步更佳的態樣，藉由DNA標記分成以下之3個組使用，可實施更正確且安定的檢定。
．第6染色體標記、第4染色體標記及第2染色體標記、．第9染色體標記、第3染色體標記及第8染色體標記以及．第1染色體標記、第5染色體標記及第7染色體標記。
在本發明，即時PCR法除了使用上述之引子對與探針之外，例如根據由實驗醫學另一冊原理可充分瞭 解之即時PCR實驗指南(羊土社)、Saiki RK,et al.,Science,230：1350-1354(1985)或植物細胞工學別冊、植物之PCR實驗方案、島本功暨佐佐木卓治監修(1995年)等所記載之通常的方法，使用市售之即時PCR套件或即時PCR裝置，依該等所附加之操作說明書進行即可。
作為即時PCR裝置，例如可使用LightCycler 480 System II(Roche公司製)等。又，此時，作為反應試藥，例如雖可使用「Premix Ex Taq(Perfect Real Time)」(Takara Bio公司製)等，但並非被特別限定於此。
首先，將於上述之操作所得之DNA試料作為模板，使用在本發明之指定的引子或引子對進行PCR。PCR增殖除了使用前述之引子或引子對之外並未特別限制，可依照常法進行。PCR條件(改質、退火、伸長之各階段的溫度及時間以及循環數等)、PCR反應液的組成(模板DNA量、緩衝液的種類、引子濃度、DNA聚合酶的種類或濃度、dNTP濃度、氯化鎂濃度等)，在使用前述之引子或引子對的PCR，將如以所期望之高感度得到PCR增殖產物般的條件藉由預備實驗等，若為本發明領域具有通常知識者，可適當選擇及設定。又，由於市售有DNA聚合酶、dNTP濃度、氯化鎂濃度等幾乎最適化之即時PCR用Master Mix，可適當利用此等。
如前述，由於甘藍之染色體為2n=18，為正常之植物時，於1細胞中各存在2條9種染色體。另一方面，非整倍性植物例如為第1染色體三倍體時，第1染色體 增加至3條。將從此等之植物所萃取之DNA作為模板，使用表1、或表1與表2所記載之DNA標記，來實施即時PCR時，正確統一加在反應液之DNA量時，於第1染色體三倍體，相對於正常個體，座落在第1染色體之標記的增殖曲線以快速循環提昇，亦即成為低Threshold cycle值(Ct值、從螢光強度所得之標記的增殖曲線、與以某一定基準設定之Threshold line的交點)。
表示具體例時，亦如圖2所示，若加在PCR之反應液的模板之DNA量為一定，例如為第6染色體三倍體(Trisomy)時，座落在第6染色體之標記的增殖曲線較正常個體(Normal)更快速提昇。
然而，於實際之檢定現場，正確收集多數被驗樣品之DNA量有困難。因此，並非收集DNA量，而是可相對定量各染色體之標記的增殖，從該等之相對差，推定各染色體之數，變成可判定三倍體等之非整倍性。
為了將此手法範圍廣泛地適用在甘藍種，雖需要於甘藍種內於不存在SNPs之共通區域設計PCR用之引子等，但本發明者們進行努力研究的結果，成功地設計可範圍廣泛地應用在甘藍種，且變成可實施藉由multiplex PCR之有效率的檢定之DNA標記。藉此，而發明了本發明之檢出方法。
據此，於本發明之檢出方法，如前述，係於染色體使用特異性DNA標記，進行即時PCR，從所得之DNA標記間之增殖量的相對差，檢出染色體之非整倍性。
於此，所得之DNA標記間之增殖量的相對差，係針對於被檢驗之甘藍植物之2以上之染色體每一個特異性DNA標記，進行即時PCR之結果，可藉由比較每一染色體標記之相對性增殖量來確認。亦即，針對對於複數之染色體標記之增殖量，藉由進行相對定量，對於其任一個染色體有異常時，於藉由其染色體之標記的增殖量、與藉由其以外之正常染色體的標記的增殖量之間，非常清楚變成產生差異，由此，變成可檢出非整倍體的存在。
針對標記之增殖量，可利用標記之增殖曲線進行確認。標記之增殖曲線可根據藉由PCR反應所測定之螢光強度輕易作成。
增殖量之相對差的測定，亦即進行相對定量時，較佳為利用對於標記所得之增殖曲線。例如，藉由將增殖曲線、與以某一定基準設定之Threshold line的交點作為Threshold cycle值(Ct值)，與表示其他染色體之標記的Ct值進行比較，可推定目的之染色體數。又，從求出更安定之結果的觀點來看，藉由2次微分增殖曲線，採用成為最大值之部分的循環值，將此與表示其他染色體之標記的值進行比較，可推定目的之染色體數(2次微分法)。
在本發明，針對表示被驗樣品各個體及各標記之Ct值，如上述進行，採用藉由2次微分法所算出之值，可根據由△△Ct法之相對定量，推定作為對象之基因體區域的複本數比。
將藉由本發明之檢出方法的較佳之態樣的一 部分，換言之，具體而言，亦可作為如以下之(a)法及(b)法表現。
(a)於PCR反應液混合SYBR Green I等之螢光色素，分別以PCR增殖各染色體之標記。從SYBR Green I等之螢光色素所發出之訊號，檢出被驗樣品各個體及各標記之Ct值，根據由△△Ct法之相對定量，推定作為對象之基因體區域的複本數比之方法。
(b)利用標籤不同種類之螢光色素的探針，混合數種類之標記，來實施multiplex PCR。從螢光探針所發出之螢光訊號，檢出被驗樣品各個體及各標記之Ct值，根據由△△Ct法之相對定量，推定作為對象之基因體區域的複本數比之方法。
尚，於此前述(a)法除了可用比較便宜之試藥實施之外，由於分別實施全染色體之PCR，有增加試驗次數的傾向。前述(b)法雖需要合成螢光探針，但變成可另外將內部對照作為基準來實施相對定量，亦可減低實驗次數。
上述之引子、引子對及探針亦可進行套件化。本發明之套件若至少包含上述引子或引子對、或引子或引子對與探針即可，如有必要亦可包含：包含成為PCR之陽性對照之標的序列的DNA分子、DNA萃取用試藥、PCR用緩衝液或DNA聚合酶等之PCR用試藥、標識物質、說明書等。
因此，根據本發明之另一較佳的態樣，提供 一種甘藍植物之非整倍體檢出用引子套組，其係至少包含1種以上具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子。又，根據本發明之進而另一較佳的態樣，提供一種甘藍植物之非整倍體檢出用之引子及探針之套組，其係包含具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子之至少1種以上、與具有序列編號19~27所示之鹼基序列的藉由螢光色素修飾之探針之至少1種以上。
藉由使用本發明之非整倍體的檢出方法，可對每一甘藍植物之系統評估其各染色體之非整倍體發生頻度。藉由利用這點，進而藉由本發明，可提供一種甘藍作物之育種方法，其係包含選拔非整倍體發生率較少之系統的步驟。
又，藉由使用由本發明之非整倍體的檢出方法，可提供一種甘藍種子之品質管理方法，其係包含檢定甘藍植物之種子所包含之非整倍體的混入率。
以往由於藉由出芽檢定來檢定種子所包含之非整倍體率，故需要用以栽培之大規模苗圃面積與數個月之生育期間。進而，必須為熟練之檢定者，否則無法導出正確之結果。根據藉由本發明之種子的品質管理方法，可將非整倍體率之檢定以節省空間實施，可得到迅速且正確之結果。
藉由使用由本發明之非整倍體的檢出方法，可提供一種甘藍植物之品質管理方法，其係包含檢定甘藍植物所包含之非整倍體的混入率。
根據藉由本發明之甘藍植物之品質管理方法，亦可將 剛發芽之子葉作為材料檢定。進而，若實施非整倍體檢定至定植階段，變成可僅選定正常個體栽培，其結果，可從幾乎全部植物體收穫正常之青果物。
[實施例]
雖藉由下述之實施例具體說明本發明，但本發明並非因此等之實施例而有任何限定者。例如萃取DNA之被驗樣品，可為任何生育階段，可使用種子、子葉、本葉、根、任何組織無妨。針對DNA之萃取法不需要特別之方法，可純化至無問題實施PCR的程度即可。針對螢光色素，若為於即時PCR法使用之一般色素，可使用任何螢光色素皆無妨。
尚，本發明之方法係如在以下之實施例所示，表示即使在不同作物之青花菜、花椰菜及甘藍，亦可用共通之標記，檢出非整倍體，證明為通用性高之標記。又，本發明者們已確認即使在此等實施例以外，在多數之系統亦可實施本法，本法並非對以下之實施例所使用之系統有任何限定者。
實施例1：標記之製作
藉由使用OPERON公司之RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)引子(10mer)及本發明者們所設計之SRAP(Sequence Related Amplified polymorphism)引子，將青花菜F2集團之DNA作為模板來實施PCR，來建構甘藍之 連鎖圖(Linkage map)。
其次，藉由比較本發明者們所建構之連鎖圖、與文獻I.Parkin et al.,Genetics 171(2005)p765(非專利文獻4)、文獻X.Cheng et al.,Theoretical Applied Genetics 118(2009)p1121(非專利文獻5)及NCBI所註冊之公開訊息，解析座落在各Linkage Group之標記與公開之連鎖圖的關係。
進而，座落在各染色體之標記，由於有必要改變成如即使對於所有甘藍種亦可利用般，從甘藍、青花菜、花椰菜範圍廣泛之遺傳資源選定特徵性系統，將該等之DNA作為模板，鑑定不存在SNPs之區域，再設計引子。
使用此等之標記，將於標記製作之過程所鑑定之第1染色體~第9染色體之各染色體成為三倍體之9種三倍體的植物(圖1)作為模板，來實施PCR，確認無來自對判定帶來影響之其他染色體的非特異性增殖後，對各染色體視為特異性標記。
進而，為了實施更簡便且安定的multiplex螢光探針法，旨在設計以FAM、HEX、Cy5之3種類螢光色素標籤之水解探針，將3種標記混合在1個反應液，亦即即使混合6種類引子與3種類探針，亦可如不互相干擾地出現安定的結果般之引子及探針的設計。一般而言，實施multiplex PCR時，引起引子雙體之形成、或對增殖DNA斷片之其他引子的退火等複雜的反應，難以對於crude之模板DNA，建構安定檢出染色體數2條與3條的差異(1.5倍量 的差)之系統。然而，本發明者們，重複標記序列的改良，進行努力研究的結果，成功設計了表1及表2所示之標記。
進而，藉由將所得之9種類染色體的標記分成3種類3組，可實施更正確且安定之檢定(參照後述之實施例4)。
圖2係表示關於利用即時PCR之相對定量的基本原理。
若加在PCR之反應液的模板之DNA量為一定，例如為第6染色體三倍體時，座落在第6染色體之標記的增殖曲線 較正常個體更快提昇。進行相對定量時，藉由將此增殖曲線、與以某一定基準設定之Threshold line的交點作為Ct值，與其他染色體之標記所表示之Ct值進行比較，可推定目的之染色體數。
圖3係表示藉由實施即時PCR所得之相對定量的計算結果之一例。於此之試驗中，將青花菜F1品種96個體作為材料，使用第4染色體標記及第6染色體標記，實施藉由螢光探針法之multiplex PCR。使用Roche公司之「LightCycler 480 System II」作為即時PCR機，使用Takara Bio公司之「Premix Ex Taq(Perfect Real Time)」作為反應試藥。圖中之X軸表示個體編號，Y軸表示將第4染色體標記作為基準，將第6染色體標記之相對定量藉由△△Ct法計算之值。
供試之96個體當中，88個體之正常型雖表示1附近之值，5個體之第6染色體三倍體表示1.4附近，3個體之第4染色體三倍體表示0.7附近之值。將PCR之增殖效率每1循環定為2倍時之理論值，由於第6染色體三倍體為1.5，第4染色體三倍體為0.66，實測值成為接近此之值。
實施例2 青花菜之三倍體植物之染色體觀察
以即時PCR判定為三倍體之植物當中，將第6染色體三倍體、第7染色體三倍體及第2染色體三倍體作為材料，來觀察染色體。
從長度為1~2mm之青花菜花蕾取出花藥，在1%乙酸 苔紅溶液進行染色，觀察花粉母細胞之減數分裂第一分裂中期(MI期)的染色體。
結果係如圖4所示。
如圖4所示，相對於正常個體之染色體(2n=18)觀察到9條二價染色體，三倍體植物之染色體(2n+1)觀察到9條之二價染色體加上1條之染色體(箭頭)。
實施例3 在青花菜之異型檢出例
將坂田之種子股份有限公司開發中之青花菜F1品種「SBR-48」的種子播種在育苗托盤，從已發芽之445個體的子葉萃取DNA，對各染色體使用特異性標記，實施藉由SYBR法之即時PCR。
具體而言，對各染色體，使用具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子作為特異性標記，於通常之PCR反應液以最終濃度成為1/20000的方式加入SYBR GreenI(由Roche公司取得)作為嵌入劑，來實施PCR。即時PCR中使用Roche公司之「LightCycler 480 System II」，PCR條件係於95℃培育1分鐘後將95℃ 15秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒之3階段PCR作為40循環。SYBR GreenI之訊號測定中，使用激發波長465nm、檢出波長510nm之過濾器。
將藉由2次微分法所得之Ct值為底，將第9染色體之標記作為基準，進行藉由△△Ct法之相對定量的計算。
結果係如表3所示。
接著，將此等表3之結果總結在另一染色體的結果，瞭解到以如表4的比率包含各非整倍體。
尚，在本實施例雖未出現第3染色體三倍體，如圖1表示，第3染色體三倍體亦很少出現(針對各染色體三倍體之表現型的特徵係如圖7所示)。尚，本發明者們亦包含第3染色體三倍體已在其他途徑確認設計之標記沒有問題。
實施例4 在花椰菜之異型檢出例
將坂田之種子股份有限公司開發中之花椰菜F1品種「SCF-30」的種子播種在育苗托盤，從已發芽之654個體的子葉萃取DNA，對各染色體使用特異性標記，實施藉由螢光探針法之即時PCR。
具體而言，係如以下進行。
來自花椰菜之子葉的DNA之萃取係與前述之實施例3同樣進行。
於染色體作為特異性標記，係分成以下之3個組合，實施PCR試驗。
．第6染色體標記、第4染色體標記及第2染色體標記之triplex、．第9染色體標記、第3染色體標記及第8染色體標記之triplex以及．第1染色體標記、第5染色體標記及第7染色體標記之 triplex。
尚，於此使用之染色體標記對於各染色體係使用表1及表2所示之引子及探針。例如第1染色體標記，係使用具有序列編號1及2所示之序列的引子、與具有序列編號19所示之序列的探針。
對於即時PCR，與實施例3使用同機種，PCR條件係於95℃培育1分鐘後，將95℃ 15秒、60℃ 45秒之2階段PCR作為40循環。FAM、HEX、Cy5之訊號測定中，分別使用激發波長465nm、533nm、618nm、檢出波長510nm、580nm、660nm之過濾器。
將藉由2次微分法所得之Ct值為底，分別將第2染色體、第8染色體、第7染色體之各標記作為內部對照，進行藉由△△Ct法之相對定量的計算。
結果係如表5所示。
接著，總結此等表5的結果，瞭解到以如表6之比率包含各非整倍體。
進而，針對於此實驗推定為非整倍體之植物，為了調査之後的表現型，而在苗圃栽培。其結果，與青花菜相同，各非整倍體分別表示特徵的外觀(圖5)(針對各染色體三倍體之表現型的特徵係如圖7所示)。
由以上之結果，瞭解到即使在花椰菜亦與青花菜相同出現非整倍體，該手法係用以檢出此等非整倍體的有效手段。
實施例5 在甘藍之異型檢出例
從坂田之種子股份有限公司開發中之甘藍F1品種「SCB-81」的栽培苗圃，選拔在收穫期之外觀展示與正常不同的形態的個體，從成葉萃取DNA，以與前述實施例4完全相同之方法，進行非整倍體的分析。
結果係如表7所示。
其結果，瞭解到第3染色體以外之三倍體植物全部被檢驗之出，即使在甘藍，異型個體的大部分原因是染色體之非整倍性。
由此等，證明藉由本發明之方法不僅青花菜或花椰菜，對於甘藍之異型個體分析亦有效。
圖6係拍攝各種非整倍體的外觀(針對各染色體三倍體之表現型的特徵係如圖7所示)。如圖6或表7所示，代表性之三倍體之外，於複數之染色體亦存在產生非 整倍性的個體。
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Claims (13)

  1. 一種方法，其係甘藍(Brassica oleracea)植物之非整倍體的檢出方法，包含將從源自被檢驗之甘藍植物的樣品所萃取之DNA作為模板，於甘藍植物之2以上的染色體的每一個使用特異性DNA標記(marker)，從進行即時PCR所得之DNA標記間之增殖量的相對差檢出染色體之非整倍性而成。
  2. 如請求項1之方法，其係包含於甘藍植物之第1染色體至第9染色體之全染色體的每一個使用特異性DNA標記來作為前述DNA標記，判定被檢驗之植物之全染色體內之哪一個染色體為非整倍體。
  3. 如請求項1或2之方法，其中，作為前述DNA標記，其係使用僅對甘藍植物之任一種染色體DNA有特異性，存在該染色體DNA時，可生成藉由PCR反應之增殖產物的引子(Primer)。
  4. 如請求項1~3中任一項之方法，其中，作為前述DNA標記，其係使用：(i)僅對甘藍植物之任一種染色體DNA有特異性，存在該染色體DNA時，可生成藉由PCR反應之增殖產物的引子，與 (ii)使用對與前述(i)之任一種染色體DNA相同之染色體DNA有特異性，可檢出基於前述(i)之引子藉由PCR反應之增殖產物的探針。
  5. 如請求項3或4之方法，其係使用與藉由PCR反應而合成之雙鏈DNA鍵結發出螢光之嵌入劑，或使用以藉由PCR伸長反應發出螢光的方式由螢光色素所修飾之探針。
  6. 如請求項1~5中任一項之方法，其中，作為檢出染色體之非整倍體的指標，係使用由即時PCR所得之螢光訊號的增加。
  7. 如請求項1~6中任一項之方法，其中，作為前述DNA標記，係使用1種以上具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子。
  8. 如請求項1~7中任一項之方法，其中，作為前述DNA標記，係使用具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子之1種以上、與具有序列編號19~27所示之鹼基序列的探針之1種以上。
  9. 一種甘藍植物之非整倍體檢出用引子套組，其係至少包含1種以上具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子。
  10. 一種甘藍植物之非整倍體檢出用之引子及探針的套組，其係包含：具有序列編號1~18所示之鹼基序列的引子之至少1種以上、與具有序列編號19~27所示之鹼基序列之藉由螢光色素所修飾之探針的至少1種以上。
  11. 一種甘藍作物之育種方法，其係包含：藉由使用如請求項1~8中任一項之非整倍體之檢出方法，對甘藍植物之每一系統，評估其各染色體之非整倍體發生頻度，來選拔非整倍體發生率較少之系統的步驟。
  12. 一種甘藍種子之品質管理方法，其係包含：使用如請求項1~8中任一項之非整倍體之檢出方法，來檢定甘藍植物之種子所包含之非整倍體的混入率。
  13. 一種甘藍植物之品質管理方法，其係包含：使用如請求項1~8中任一項之非整倍體之檢出方法，來檢定甘藍植物所包含之非整倍體的混入率。
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