CN101323878B - 利用水稻dna插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物鉴别技术领域，具体为一种利用水稻DNA插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法。本发明利用籼稻品种(93-11)和粳稻品种(日本晴)全基因组DNA序列的比对而获得InDel差异片段所设计的34对特异DNA引物。对目标水稻品种进行DNA提取、DNA片段扩增和电泳分离以及电泳图谱的分析和统计来鉴定籼稻和粳稻品种。具体而言，利用34对InDel引物组合，基于聚合酶链式反应和凝胶垂直板电泳获得的指纹图谱进行分析和统计，根据34个InDel位点上的籼稻型等位基因和粳稻型等位基因出现的平均频率(F_i或F_j)，计算出被测水稻样品的籼稻或粳稻特性。本发明需用检测样品量少，方法简便快捷，鉴定结果准确，具有良好的推广应用前景。

Description

利用水稻DNA插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法

技术领域

本发明属于生物鉴别技术领域，具体涉及一种鉴定籼稻和粳稻的方法。

技术背景

籼稻和粳稻是亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)的两个最重要的遗传分化类群。典型的籼稻和典型的粳稻之间已形成了明显的生殖隔离，故在分类上通常将籼稻和粳稻作为两个亚种处理，即：籼稻亚种(O.sativa subsp.indica)和粳稻亚种(O.sativa subsp.iaponica)。籼稻和粳稻在形态、生理生化性状和品质方面都已经产生了较大的差异，在对不同生态环境的适应性方面也有所不同，籼稻适合于低纬度和低海拔的热带和亚热带环境，而粳稻更适合于高纬度和高海拔的冷凉环境。由于籼稻和粳稻的遗传分化以及这些特征特性，利用籼稻和粳稻进行有性杂交不仅可以产生很多新的遗传重组类型供育种家选择，进而培育出优异的水稻品种。而且，籼稻和粳稻之间的强大杂种优势，在杂交稻的培育中也具有重要的价值。因此对于籼稻和粳稻的准确鉴定，在水稻选育和遗传改良的育种材料和种质资源正确选用中具有非常重要的应用价值，至关重要，同时在水稻的进化和遗传研究中也具有重大的理论意义。

由于籼稻和粳稻的不同类型在形态上和生理生化特征上有很大的变异，而且籼稻和粳稻品种之间存在着明显的有性杂交和遗传渐渗，导致一些中间类型的出现。虽然籼稻和粳稻的准确鉴定极为重要，但是一直以来，对籼稻和粳稻的准确鉴定都存在较大的问题。目前用来鉴定籼稻和粳稻最有效的常规方法是以形态鉴定为基础的“程氏指数法”，(包括六个性状：稃毛、酚反应、穗节长、稻壳色、叶毛和谷粒长宽比)。这个方法的最大缺点：一是由于形态性状受环境的影响较大而易导致检测的结果不准确；二是形态测量必须要栽种被测水稻样品，从播种到成熟一般需要3-5个月，耗时长；三是形态测量需要一定的样本群体，故需要较多的水稻样品；这样就大大影响了籼稻和粳稻鉴定的效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种精确和快速区分鉴定水稻的籼稻和粳稻的方法。

本发明提出的鉴定水稻中籼稻和粳稻的方法，是一种利用插入或缺失(InDel)分子标记鉴定水稻品种的方法。具体来说是利用水稻亚种间DNA序列的特异性差异片断，设计扩增引物组合及其衍生物，对籼稻型等位基因(I)和粳稻型等位基因(J)频率(F_i或F_j)进行计算，并根据这些频率来确定籼稻和粳稻的方法。

本发明用于鉴定籼稻和粳稻的InDel特异引物一共有34对，具体如下：

表1

编号	引物对名称	正向引物DNA序列(5’-3’)	反向引物DNA序列(5’-3’)
				1	R1M7	ATTCCTGGTTCTACATTACTTA	CGCCTCACTAGAATATCGGA
2	R1M30	AAGGGGCCCTAATTTATCTA	TGTTTACTTTGTTCTTGGACTG
				3	R1M37	ATAGTTCGCCATCGTCAT	ACACGCCATAGCAAGGAA
4	R1M47	AATAGAATTACTGATGAAACCTTA	GCCCGTTACCGCTTATGT
				5	R2M10	CCCAGTCTGCTGCCATCT	GAATGTATTTCAGTTCCAGTAAG
6	R2M24	GGGCAACAACGGCTCTG	AGGGAATAAGGCGATACGG
				7	R2M26	GCAGCAAAGTGCGGAGTA	CAGGTGAATTGCCAATTT
8	R2M50	CCTGAAGGAAATGATAGCAATAG	GTTTTGTATGCTCTTCACTTGTC
				9	R3M10	CCGAGTACCATTGCTTTC	CTGCCATAGTTACTGCTCTGTT
10	R3M23	TGCTTACAAGGGTCCAAT	GGAGGTGCCTACCAAGAG
				11	R3M30	AGGCTAAGTGAAGAAATAATAAG	CTCCGTATTCATTACTGGTTG
12	R3M53	ACACTGGCTACGGCAAAG	TTTGTTCGGGAATAATGATGC
				13	R4M13	TACACGGTAGACATCCAACA	ATGATTTAACCGTAGATTGG
14	R4M17	AGTGCTCGGTTTTGTTTTC	GTCAGATATAATTGATGGATGTA
				15	R4M43	CTTGAACCTGAGTGAGTGG	CGATGAAAATGATGTCTA
16	R5M13	GAGAAAGAGTGGAAGGAG	AGTATCGTCAGGAGGGTC
				17	R5M30	CTCAATTTCACCCATCCC	CGCTCCGTCTCCAACCTC
18	R6M14	AAATGTCCATGTGTTTGCTTC	CATGTGTGGAATGTGGTTG
				19	R6M44	TTAGGAATAAAGGCTGGATA	TTACCGTTAATAGGTGGAA
20	R7M7	ACCTTCCCTCCCCTTTTGAT	AACTTGGTCTTCCTGTTTTATTG
				21	R7M37	CAGCCCTAAATCTAAATACCC	ACGTTGAGACAGGCGAGC
22	R8M23	CCTATTCACTCTACCGACAT	GTTTAGTTCCCATTGCTTT
				23	R8M33	CGAAAGAGGAGAGGGGTAGT	CGAAAACGAGAAACAAATA
24	R8M46	CAGCAGAGTCCAGAGAAGAT	GCATAAGATGGCGAGTGA
				25	R9M10	CTTTGGATTCAGGGGGA	AACTTGAAACGGAGGCAG
26	R9M42	CTATAAGACCAAAACGAAAACT	GAAAACCATTGTGTCACTGTA

27	R10M17	TGAACAATAAACCACAGAAGCA	CCCTTTATTCCCTCCTTTG
				28	R10M30	CCCTAAAAATAGAGCAACCT	ACCCATAATACTACCAATCAAC
29	R10M40	GTCCCTAGGCCATCTCTTG	GCGAATAGGGGTGGACAG
				30	R11M23	AAGGTTGACAAGGACAGAAG	TCGCAGGAATGGATAAAA
31	R11M40	AAGAAAAATATCTATTGAGGAGTG	GGAGGACCATAAATGACGG
				32	R12M10	ATCATTTCAGCCTGTGCC	AGCTTAATAGGGGGGACG
33	R12M27	ATTTCATTGCCATCAGTT	GTAATCTTCTATCCGTTCA
				34	R12M43	CCGCCGAGAAGAAACAAA	CCCAAGAACAGGATTACA

从水稻植株的任何器官或组织(包括种子、幼苗、成株、茎、叶等)DN样品，并对样品DNA进行聚合酶链扩增。本发明使用的聚合酶链式扩增体系为常规PCR体系，不需要特殊的PCR仪和特殊的反应试剂，任何公司生产的PCR仪和任何生物试剂公司生产的试剂均可以使用而达到目的。

PCR反应条件和程序如下：(20μl体系)：

1)10×PCR缓冲液(含25mM MgCl₂)    2μl

2)2.5 mM dNTP Mixture            1.6μl

3)10μM PCR引物                  1μl

4)1U Taq DNA Polymerase          0.2μl

5)DNA模板                        20ng

6)ddH₂O(双蒸水)                  补足至20μl

PCR反应程序：

1)90-96℃预变性3-6分钟

2)90-96℃变性35-50秒

3)退火温度：48-55℃，退火时间：25-35秒

4)70-75℃延伸35-45秒

5)循环步骤为2)3)4)，36个循环

6)70-75℃延伸8-13分钟。

电泳检测：

4％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳和改进的银染程序(200-400ml 0.1M AgNO₃溶液中染色10-15分钟)检测PCR产物。含有水稻DNA的样品在前述合成引物组合(6-34对)时能分别在不同位点(引物对)上扩增出现籼、粳稻的不同基因型。水稻样品扩增的电泳产物为：1)纯合籼稻型基因型(II)，与基因组测序水稻品种93-11一致，2)纯合粳稻型基因型(JJ)，与基因组测序水稻品种日本晴一致，或3)籼-粳杂合基因型(IJ)，分别具有籼稻型和粳稻型的电泳条带。从这34对引物可以任意抽取6-34对进行组合，均可对水稻样本进行鉴定。引物的数目越多，鉴定就越准确。

基因频率的计算：

根据PCR产物的电泳结果和读取记录电泳结果中样品在各特异位点上的基因型结果，使用下述公式来计算样本各特异位点的平均籼稻型或粳稻型基因频率(F_i或F_j)，其变化在0-100％之间：

籼稻型基因频率(％)： $F_i=\frac{2\underset{1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{X}_{\mathrm{ii}}+\underset{1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{X}_{\mathrm{ij}}}{2N}$

粳稻型基因频率(％)： $F_j=\frac{2\underset{1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{X}_{\mathrm{jj}}+\underset{1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{X}_{\mathrm{ij}}}{2N}$

式中：X_ii为样本某一特异位点的纯合籼稻基因型，

X_jj为样本某一特异位点的纯合粳稻基因型，

X_ii为样本某一特异位点的籼-粳稻杂合基因型，

N为使用引物对的数目；

籼稻和粳稻的确定：

根据检测样品中各特异位点(6-34)的平均基因频率(F_i或F_j)，确定水稻样品为籼稻或粳稻。具体判断标准如下：

本发明利用水稻全基因组特异位点上的InDel片段差异设计的特异引物，籼稻基因型、粳稻基因型和籼-粳稻杂合基因型的确定，以及籼稻型等位基因频率和粳稻型等位基因频率的计算来鉴定籼稻和粳稻，方法简便，准确性高，速度快。基于PCR扩增反应，利用籼-粳稻全基因组上34个位点上的InDel片段序列的差异和PCR反应的快速高效性，在短时间内能精确鉴定水稻样本的籼、粳属性。同时，由于本发明利用了来自水稻基因组不同染色体上的34个InDel位点，不仅能够准确鉴定典型的籼稻和典型的粳稻、籼稻和粳稻，而且还能够鉴定籼-粳分化程度不高的偏籼和偏粳的类型以及中间类型，大大提高了鉴定的精确度。本发明方法简便，效果快捷高效，有很好的推广应用前景。

附图说明

图1为水稻34个位点的电泳结果。

图2为同一引物不同水稻品种的电泳结果。

具体实施方式

实施例1：

利用InDel分子标记鉴定以“程氏指数法”为标准而确定的典型籼稻和典型粳稻水稻品种各10个。

表1.实施例1鉴定实验材料：

使用反应体系如下：

PCR反应条件和程序如下：(20μl体系)：

1)10×PCR缓冲液(含25mM MgCl₂)      2μl

2)2.5 mM dNTP Mixture              1.6μl

3)10μM PCR引物                    1μl

4)1U Taq DNA Polymerase            0.2μl

5)DNA模板                          20ng

6)ddH₂O(双蒸水)                    补足至20μl

PCR反应程序：

1)94℃预变性4分钟

2)94℃变性40秒

3)退火温度：52-58℃，退火时间：30-45秒

4)72℃延伸40秒

5)循环步骤为2)3)4)，36个循环

6)72℃延伸10分钟

电泳检测：

4％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳和改进的银染程序(200-400ml 0.1M AgNO₃溶液中染色10-15分钟)检测PCR产物。含有水稻DNA的样品在权利要求1中合成引物组合(6-34对)时能分别在不同位点(引物对)上扩增出现籼、粳稻的不同基因型。水稻样品扩增的电泳产物为：1)纯合籼稻型基因型(II)，与基因组测序水稻品种93-11一致；2)纯合粳稻型基因型(JJ)，与基因组测序水稻品种日本晴一致；或3)籼-粳杂合基因型(IJ)，分别具有籼稻型和粳稻型的电泳条带。

图1.不同稻水样品在R1M37位点的PCR和电泳结果。示与测序水稻品种“93-11”一致的纯合籼稻基因型(II)，与测序水稻品种“日本晴”一致的纯合粳稻基因型(JJ)，以及籼-粳稻杂合基因型(IJ)。

各水稻不同样品的基因型读取和分析结果见附表-1(实施例1)，基因频率的计算结果以及水稻样品的籼-粳鉴定结果见表1。

由上述实验结果可见，同一水稻样品在34个InDel特异位点上表现出的籼稻和粳稻基因型是不一样的，通过对所有特异位点基因型的读取记录和统计，可以计算出该样品在34个特异位点上的籼稻型和粳稻型等位基因频率(Fi或F_j)，最后由此确定样品属于籼稻或粳稻。对20个以“程氏指数法”所鉴定的水稻品种样本进行InDel分子标记检测的结果是基本一致的。

实施例2：

利用InDel分子标记鉴定未知籼、粳稻特性的水稻品种。从中国、孟加拉国、印度、日本、老挝、泰国和马来西亚等国随机抽取了20个样本来对其进行籼稻或粳稻的鉴定。

表2.实施例2鉴定实验材料：

使用反应体系如下：

PCR反应条件和程序如下：(20μl体系)：

1)10×PCR缓冲液(含25mM MgCl₂)    2μl

2)2.5mM dNTP Mixture             1.6μl

3)10μM PCR引物                  1μl

4)1U Taq DNA Polymerase          0.2μl

5)DNA模板                        20ng

6)ddH₂O(双蒸水)                  补足至20μl

PCR反应程序：

1)94℃预变性4分钟

2)94℃变性40秒

3)退火温度：52-58℃，退火时间：30-45秒

4)72℃延伸40秒

5)循环步骤为2)3)4)，36个循环

6)72℃延伸10分钟

电泳检测：

4％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳和改进的银染程序(200-400ml 0.1M AgNO₃溶液中染色10-15分钟)检测PCR产物。含有水稻DNA的样品在权利要求1中合成引物组合(6-34对)时能分别在不同位点(引物对)上扩增出现籼、粳稻的不同基因型。水稻样品扩增的电泳产物为：1)纯合籼稻型基因型(II)，与基因组测序水稻品种93-11一致，2)纯合粳稻型基因型(JJ)，与基因组测序水稻品种日本晴一致，或3)籼-粳杂合基因型(IJ)，分别具有籼稻型和粳稻型的电泳条带。

各水稻不同样品的基因型读取和分析结果见附表2(实施例2)，基因频率的计算结果以及水稻样品的籼-粳鉴定结果见表2。

图2.不同稻水样品在R1M37位点的PCR和电泳结果。示与测序水稻品种“93-11”一致的纯合籼稻基因型(II)以及与测序水稻品种“日本晴”一致的纯合粳稻基因型(JJ)。

由上述实验结果可见，同一水稻样品在34个InDel特异位点上表现出的籼稻和粳稻基因型是不一样的，通过对所有特异位点基因型的读取记录和统计，可以计算出该样品在34个特异位点上的籼稻型和粳稻型等位基因频率(Fi或F_j)，最后由此确定样品属于籼稻或粳稻。对20个来源于不同国家和地区随机选取的20个未知水稻品种样品进行InDel分子标记检测的结果表明：4个样品是典型籼稻，1个样品是典型粳稻，1个样品是籼稻，7个样品是粳稻，6个样品是具籼稻血缘的粳稻，1个样品是中间类型。

Claims (1)

1.一种利用插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)从水稻植株的任何器官或组织提取DNA样品；

(2)用34对特异引物对对提取的水稻DNA样品进行PCR扩增；

(3)电泳检测PCR产物；

(4)计算基因频率：

根据PCR产物的电泳结果和读取记录电泳结果中样品在各特异位点上的基因型结果，使用下述公式来计算样本各特异位点的平均籼稻型基因频率F_i或粳稻型基因频率F_j，其变化在0-100％之间：

籼稻型基因频率(％)： $F_i=\frac{2\underset{1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{X}_{\mathrm{ii}}+\underset{1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{X}_{\mathrm{ij}}}{2N}$

粳稻型基因频率(％)： $F_j=\frac{2\underset{1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{X}_{\mathrm{jj}}+\underset{1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{X}_{\mathrm{ij}}}{2N}$

式中：X_ii为样本某一特异位点的纯合籼稻基因型，

X_jj为样本某一特异位点的纯合粳稻基因型，

X_ij为样本某一特异位点的籼-粳稻杂合基因型，

N为使用引物对的数目；

(5)确定籼稻和粳稻：

根据检测样品中各特异位点的平均基因频率F_i或F_j，确定水稻样品为籼稻或粳稻，具体判断标准如下：

；

所述的34对特异引物列表如下：

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